WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Андреева Алла Михайловна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

БЕЛКОВ  КРОВИ И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ

ЖИДКОСТЕЙ РЫБ

03.00.10 – ихтиология

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2008

Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод

им. И.Д. Папанина РАН

Официальные оппоненты :

доктор биологических наук,  Немова Нина Николаевна

профессор, чл.- корр. РАН

доктор биологических наук,  Микодина Екатерина Викторовна

профессор

доктор биологических наук Бурлаков Александр Борисович

Ведущая организация: Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН

Защита состоится  «_4_»  _апреля_  2008 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.53 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д.1, стр.12, биологический факультет, ауд. 557.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «___» 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.б.н.  Т.И. Куга

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эволюция рыб охватывает несколько геологических эпох. Пережив глобальные изменения климата Земли, рыбы заняли господствующую позицию в Мировом океане, превзойдя по числу видов все другие группы позвоночных (Берг, 1938; Никольский, 1963; Расс, 1977). Эволюционный и экологический успех рыб обеспечен, прежде всего, эффективными механизмами стабилизации внутренней жидкой среды организма, включающей плазму крови, интерстициальную и некоторые другие внеклеточные жидкости (Gamble, 1954; Строганов, 1962; Thorson et al., 1967; lutz, Robertson, 1971; Шмидт-Ниельсен, 1982; Немова, 1992; Новиков, 2000; Озернюк, 2003).

Основной функцией внутренней жидкой среды организма является поддержание оптимальных осмотических отношений внутри организма и с внешней средой. Роль осмотически активных компонентов крови рыб выполняют соли, мочевина и триметиламиноксид  (Строганов, 1962; Хлебович, 1974; Наточин, 1979; Шмидт-Ниельсен, 1982; Hegar, Hanke, 1982; Aas-Hansen et al., 2005; Veillette et al., 2005). Белки плазмы крови обеспечивают распределение внеклеточной жидкости организма между внутри- и внесосудистым компартментами и, помимо специфических функций, участвуют в пластическом обмене и транспорте ряда соединений (Строганов, 1962; Share, Claybaugh, 1972; Уайт и др., 1981; Wells et al., 2003).

Современные представления о белках плазмы крови и их транскапиллярном обмене у высших позвоночных основаны на модели крупных белков-мономеров (Klotz et al., 1975; Шульц, Ширмер, 1982), способных проникать в интерстициальное пространство в некоторых отделах микроциркуляционного русла ввиду функциональной разнокачественности капилляров в отношении белков (Pappenheimer, 1953; Landis, Pappenheimer, 1963; Zweifach, Intaglietta, 1968; Peterson et al., 1972; Поленов, Дворецкий, 1976; Осборн, 1978).

Белки крови рыб поставлены в условия постоянного осмотического взаимодействия с жидкостями организма и внешней среды, уровень минерализации которой, особенно в случае пресных вод, может существенно колебаться (Шилов, 1985). Поэтому способ организации белков крови и их распределение во внеклеточной жидкости организма подчинены цели быстрой стабилизации водного обмена in situ. Несмотря на то, что исследования физико-химических свойств отдельных белков крови охватывают представителей разных отрядов рыб (Herschberger, 1970; Valenta et al., 1976, 1977; Купер, 1980; Чихачев, 1982; Кирпичников, 1987; Зорин и др., 1994; Mestel, 1996), сведения об участии белков в стабилизации водного обмена немногочисленны (Строганов, 1962; Чихачев, Цветненко 1979; Цветненко, 1986, 1989, 1990; Чалов, Лукьяненко, 1989), а систематических исследований способов организации и интеграции белков крови на рыбах не проводилось. Между тем, выявленные особенности организации геномов высших позвоночных и рыб (Volff, 2005) косвенно позволяют предположить существенные различия их белков, так как организация белковых систем отражает характер генома (Патрушев, 2004).

Изучение структурно-функциональных особенностей белков крови и некоторых других внеклеточных жидкостей рыб дополнит имеющиеся представления о способах организации и интеграции белков крови, а также их участии в стабилизации водного и пластического обмена как у рыб, так и у позвоночных в целом.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в исследовании структурно-функциональной организации и механизмов интеграции белков крови и некоторых других внеклеточных жидкостей организма у рыб из разных таксономических и экологических групп.

В работе решались следующие задачи:

1. Оценить структурно-функциональное разнообразие белков крови и некоторых других внеклеточных жидкостей организма на разных этапах онтогенеза, в разных таксономических и экологических группах рыб.

2. Выявить механизмы формирования структурно-функционального разнообразия белков крови у рыб с разным таксономическим и экологическим статусом.

3. Рассмотреть факторы внешней и внутренней среды, влияющие на организацию белков (мономеры/олигомеры) и уровень их специализации.

4. Исследовать механизмы интеграции белков внутренней жидкой среды организма на примере костистых рыб.

5. Оценить значение появления в эволюции Pisces у костистых рыб мобильных белковых систем крови, состоящих из белков, способных к межмолекулярным взаимодействиям с образованием комплексов, диссоциирующих на полипептидные цепи в ходе транскапиллярного обмена при адаптациях к солености.

Основные положения работы, выносимые на защиту

1. В период раннего развития до появления кровеносной системы и интраваскулярных белков внеклеточный белок липовителлин может участвовать в формировании внутренней жидкой среды зародыша как пластический и регуляторный белок.

2. Структурно-функциональная организация интраваскулярных белков у рыб из разных таксономических групп имеет множественный характер. Способ организации белковых систем крови обусловлен такими факторами внешней и внутренней среды как уровень минерализации водной среды обитания и особенности молекулярной организации гемоглобина соответственно.

  3. Стабилизация водного обмена у костистых рыб достигается при участии белковых комплексов плазмы крови, способных к диссоциации на составляющие их полипептидные цепи в ходе транскапиллярного обмена, а также за счет других механизмов, в том числе, избирательной проницаемости стенок капилляров для разных белков плазмы крови.

Теоретическое значение и научная новизна работы

Обоснована концепция о существенных структурно-функциональных отличиях белков крови высших позвоночных и рыб, а также высоком уровне структурно-функционального разнообразия белков крови у Pisces : у рыб из первичных таксонов белки представлены специализированными мономерами; у костистых рыб – полифункциональными мономерами и олигомерами, способными к межмолекулярным взаимодействиям и проникающими с помощью механизма избирательной проницаемости через стенку капилляра в интерстициальное пространство, претерпевая при этом структурные преобразования. Выявлен универсальный алгоритм структурных трансформаций альбуминового комплекса при адаптациях у костистых рыб.

Установлено, что внешним фактором, способствующим появлению белков-олигомеров в крови пресноводных костистых рыб, могут быть колебания уровня минерализации воды; внутренним фактором, определяющим снижение специализации белков, является неустойчивость структуры гемоглобина к дестабилизирующим факторам.

Аргументируется подход к белку желтка липовителлину не только как внеклеточному резервному и пластическому белку, но и как регулятору

раннего развития, оказывающему влияние на характер проявления зародышевых генов.

Обоснована концепция стабилизации водного обмена у пресноводных костистых рыб за счет трех основных механизмов: 1. поддержания функциональной однородности капилляров разного типа, формирующих тканевые жидкости по типу фильтратов плазмы, 2. избирательной проницаемости стенок капилляров для разных белков с учетом физиологических условий и специфики метаболизма клеток тканей in situ, и 3. структурных преобразований белкового олигомерного комплекса, названного нами «челнок», по типу диссоциации в ходе транскапиллярного обмена.

Предложена модель стабилизации водного обмена у рыб, предусматривающая первоначальное существование у предковых форм во внеклеточной жидкой среде отдельных полипептидных цепей, которые в ходе освоения рыбами пресных вод объединялись в белковые комплексы.

Практическое значение работы

Результаты и выводы работы могут быть использованы для развития фундаментальных исследований водного обмена у позвоночных, а также для работ в сфере рационального природопользования, в практике рыборазведения и при разработке систем контроля и мониторинга. Экспресс-метод определения устойчивости гемоглобина к дегидратации можно использовать в качестве критерия принадлежности хрящевых ганоидов к проходным и туводным формам, метод выявления структурных преобразований комплекса сывороточных альбуминов - в качестве теста на подготовленность производителей к нересту и контроля условий содержания рыб, анализ режима кроветворения – для разработки оптимальных условий содержания рыб. Материалы о структурно-функциональном разнообразии белков рыб и механизмах стабилизации их водного обмена могут использоваться в курсах лекций для студентов.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались и обсуждались на VI Всесоюзной Конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Вильнюс, 1985), Всероссийской  Конференции  «Возрастная и экологическая  физиология рыб» (Борок, 1998), IX  Всесоюзном  Совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986), I Симпозиуме по экологической биохимии рыб (Ярославль-Ростов, 1987), IX Международном Европейском Конгрессе Ихтиологов (Триест, 1997), X Международном Европейском Конгрессе Ихтиологов (Прага, 2001), Всероссийской Конференции «Современные проблемы  водной токсикологии» (Борок, 2002), Всероссийской научно-практической Конференции «Экологические проблемы уникальных природных и антропогенных  ландшафтов» (Ярославль, 2006), 2-ой научной Конференции Стран СНГ «Современные проблемы  физиологии  и  биохимии  водных организмов» (Петрозаводск, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, из них 8 статей в рецензируемых научных журналах, утвержденных ВАК. 1 статья по коэффициенту цитирования вошла в БД CSA.

Личный вклад автора. Все диссертационные материалы получены непосредственно автором или под руководством автора. Оригинальные

подходы к интерпретации данных, обобщение и систематизация результатов выполнены автором полностью.

Работа выполнена на базе ЦКП «Молекулярные технологии» ИБВВ РАН. Считаю своим долгом выразить признательность д.б.н., проф. В.И. Лукьяненко за предложенную тему исследований по идентификации белков крови рыб и к.б.н. Ю.В. Слынько за организацию работ по получению отдаленных гибридов рыб, а также искреннюю благодарность  Г.Г. Новикову  , Н.Д. Озернюку, В.Н. Яковлеву, Н.Б. Гусеву и Л.И. Корочкину за проявленное внимание к работе и поддержку.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, 6 глав,  заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на  271  страницах и включает  90  рисунков и 10 таблиц. Список литературы содержит 342 источников, из них 142  на английском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Материалы и методы исследований.

Видовой состав рыб. В качестве объектов исследования использовали 27 видов рыб, представителей 2 классов Pisces - Хрящевых (Chondroichthyes) и Костных (Osteichthyes) рыб, 2 подклассов - Пластиножаберных (Elasmobranchii) и Лучеперых (Actinopterygii), 9 отрядов, 14 семейств, 18 родов, число исследованных экземпляров указано в скобках: Хрящевые рыбы - катран Squalus acanthias L. (10), скаты морская лисица Raja clavata L. (3), морской кот Dasyatis pastinaca  L. (2); Костные рыбы – хрящевые ганоиды стерлядь Aсipenser  ruthenus L. (50), севрюга A.. stellatus Pall. (50), русский осетр A.gueldenstaedtii B. (50), белуга Huso huso L. (50); костистые рыбы щука обыкновенная Esox lucius L. (15), лещ Abramis brama L. (более 2000), синец Abramis ballerus L. (более 300), уклейка Alburnus alburnus L. (5), густера Blicca bjoerkna L. (20), карась серебряный Carassius auratus L. (156), карась золотой Carassius carassius L. (5), карп обыкновенный Cyprinus carpio L. (5), язь Leuciscus idus L. (10), чехонь Pelecus cultratus L. (5), плотва Rutilus rutilus L. (свыше 2000), судак обыкновенный Stizostedion lucioperca L. (50), берш St. volgense G. (5), пелядь Coregonus peled G. (3), зубатка полосатая Anarhichas lupus L. (1), керчак Myoxocephalus scorpius L. (3), камбала полярная Liopsetta glacialis P. (1), треска Gadus morhua L. (6), тюлька черноморско-каспийская Clupeonella cultriventris N. (25), бычок-цуцик Proterorhinus marmoratus P. (4)  –  всего свыше 4500 экземпляров.

Возрастной состав рыб. В работе использовали зародышей, молодь и половозрелых рыб. Зародыши получали в виде потомства F1 от индивидуальных внутривидовых и межродовых реципрокных скрещиваний леща, плотвы и синца в период 1999-2007 гг.; всего было поставлено 31 серий скрещиваний, в том числе 20 внутривидовых и 11 межродовых (Лещ х Плотва, Плотва х Лещ, Плотва х Синец, Синец х Плотва) (Слынько, 2000; Андреева и др., 2000; Лапушкина, 2002; Андреева, 2005, 2007). Зародышей для анализа белков отбирали на стадиях 1. образования перивителлинового пространства и бластодиска, 2. дробления, 3. бластулы, 4. гаструляции, 5. начала сегментации туловища (3-5 сегментов), 6. сегментации туловища (18-23 сегментов), 7. окончания сегментации и установления кровообращения, 8. массового выклева, 9. этапе «свободного эмбриона», 10. смешанного питания, 11. рассасывания желточного мешка и перехода на внешнее питание, 12. малька (Крыжановский 1949; Васнецов, 1953; Ланге, Дмитриева 1981).

Белки. Анализировали альбумины, трансферрины, гаптоглобины, пероксидазы, γ-глобулины, гемоглобины и другие белки и белковые фракции;  липовителлин и водорастворимые ферменты зародыша 6-фосфоглюконатдегидрогеназу 6-PGD (К.Ф.1.1.1.44), малатдегидрогеназу-НАДФ-зависимую (маликэнзим) МЕ (К.Ф.1.1.1.40), лактатдегидрогеназу LDH (К.Ф.1.1.1.27), аспартатаминотрансферазу ААТ (К.Ф.2.6.1.1), изоцитратдегидрогеназу IDH (К.Ф.1.1.1.42), β-эстеразу β-EST (К.Ф.3.1.1.1, 3.1.1.2.), ацетил- AHE (К.Ф.3.1.1.7) и бутирилхолинэстеразу BuHE (К.Ф.3.1.1.8).

ДНК. ДНК из крови рыб выделяли по прописи (Mathew, 1984).

Структурно-функциональные показатели белков. Изучали способ организации (мономер/олигомер) белков крови, особенности их поверхностной структуры (по наличию ковалентно связанных с белком углеводов, прочности связи сиаловых кислот с белком, влиянию на белки 8М мочевины) и уровень их специализации (по связыванию красителей и продуктов деструкции гемоглобина). Для этого определяли электрофоретическую подвижность, молекулярную массу нативных молекул и субъединиц; ковалентно и нековалентно связанные с белком углеводы, устойчивость гликопротеидов к действию нейраминидазы; поверхностные SH-группы; λмакс комплексов белков с альбуминспецифичным красителем бромкрезоловым пурпурным, связывание белков с бромфеноловым синим и синим Эванса; связывание белков с  гемоглобином, гемином и Fe3+ ; прочность связи гем-глобин и связей между субъединицами гемоглобина; форму и размеры кристаллов гемоглобина; устойчивость гемоглобина, ДНК и липопротеидов к дестабилизирующим факторам; прочность связи сиаловых кислот с белками.

Отбор биологических жидкостей. Кровь у крупных рыб (белуга, севрюга, русский осетр) отбирали из жаберных, у остальных рыб - из хвостовых сосудов. Водорастворимые ферменты получали при криогенном лизисе клеток зародыша и желточного мешка (Андреева, 2005, 2007). В качестве аналога интерстициальной использовали тканевые жидкости белых мышц, печени, почки, мозга, верхней трети желудочно-кишечного тракта и перитонеальную жидкость (Андреева и др., 2007).

Электрофоретический анализ белков. Использовали диск- (Davis 1964; Ornstein 1964) и SDS-электрофорез (Laemmli, 1970), электрофорез в градиенте концентраций (5-40%) ПААГ (Kopperschlander et al. 1969) и градиенте мочевины (0-8М), двухмерные системы (фингерпринты); препаративный электрофорез, электроэлюцию (Андреева, 1997); электрофорез ДНК в агарозе (Маниатис и др., 1984).

Хроматографические методы. Белки фракционировали на колонках с сефадексом G-100 и G-200 (Детерман, 1970; Мешкова, Северин, 1979).

Определение величин молекулярных масс белков. Молекулярные массы белков определяли в SDS- и градиенте концентраций ПААГ,  на колонке с сефадексом G-100 и G-200 с использованием как минимум пяти соответствующих маркеров с известной молекулярной массой: полимерные формы сывороточного альбумина быка или человека (ММ мономера 67 kDa), овальбумин (45 kDa), трипсин (23 kDa), тропонины T, I, C (38; 24; 18,5 kDa), цитохром С (12 kDa), ферритин (440 kDa).

Определение функциональных групп белков.  SH-группы альбуминов определяли колориметрическим методом с помощью ДТНБ ( 5,5/ - дитиобис (2-нитробензойной кислоты)) (Ellman, 1959; Веревкина и др., 1977).

Основные статистические методы обработки. Результаты обрабатывались статистически с помощью пакета прикладных программ для персонального компьютера Exel, "STATISTICA for Windows", R. 5.0-A (1995), программного модуля "Basic Statistics" и программных пакетов OneDscan и Scion-95.

Выделение и очистка сывороточных белков. В работе использовали неочищенные белки в составе сыворотки и плазмы крови, а также очищенные фракции и белки. Фракцию γ-глобулинов получали спиртовым осаждением (Андреева, 2001). Очищенные альбумины стерляди, севрюги, белуги, леща получали с помощью электроэлюции или препаративного электрофореза (Андреева, 1997, 1999), очищенные трансферрины - с помощью риванолового метода и колоночной хроматографии на сефадексе G-200 (Palmour, Sutton, 1971). Трансферрин стерляди получен в виде микрокристаллов розового цвета. Очищенные трансферрины стерляди и леща прошли электрофоретический, спектрофотометрический (Андреева, 1987, 1997) и иммунологический (стерлядь)  (Субботкин, Субботкина, 2003) контроли. Получены кристаллы гемоглобинов катрана, стерляди, севрюги, белуги, русского осетра, леща (Андреева, 1987, 2006).

Список используемых сокращений

ММ - молекулярная масса

Rf  - электрофоретическая подвижность

НМБ, НМФ – низкомолекулярный белок, низкомолекулярная фракция

ВМА – высокомолекулярный агрегат

БКП, БФС - красители бромкрезоловый пурпурный, бромфеноловый синий

Hb, Hp, Tf  - белки гемоглобин, гаптоглобин и трансферрин

ЛВ, Vtg – белки липовителлин и вителлогенин

ЧСА, БСА, ОА – сывороточные альбумины человека и быка, овальбумин

ПК, СК, ИЖ – плазма крови, сыворотка крови, интерстициальная жидкость

СА – сульфат аммония

Результаты и обсуждение

Глава 2. Внеклеточные белки в раннем развитии рыб.

Внеклеточные белки зародыша до появления белков плазмы крови представлены на 90% и выше липовителлином (Naoshi et al., 2002), выполняющим функции резервного и пластического белка (Нейфах, Тимофеева, 1977, 1978). Первичные системы транспорта питательных соединений в зародыше обеспечены токами цитоплазмы, пронизывающими желток (Oppenheimer, 1947; Светлов и др, 1975; Баранов  др., 1977) и «транзитом» молекул из желтка через перибласт и бластоцель к клеткам (Tuft, 1965; Зотин, 1961; Kostellow, Morril, 1968; Slack et al., 1973; Альбертс и др., 1987), позднее – мышечной моторикой зародыша (Дислер, 1957; Смирнов, 1975). Мы рассматривали липовителлин в качестве возможного участника транспортной системы и активного компонента внутренней среды зародыша на этапе, предшествующем формированию кровеносной системы.

Идентификация липовителлина.  ЛВ обнаружен нами в составе глыбок желтка, что характеризует его как осмотически неактивный белок. При анализе водорастворимой фракции, полученной путем криогенного лизиса клеток и желточного мешка зародыша в 20%-ной сахарозе, на электрофореграмме выявлен компонент, на долю которого приходилось до 95% общего белка. Компонент имел видоспецифичные значения Rf : 0,093 у плотвы и 0,08 у леща и синца; у межродовых реципрокных гибридов значения Rf подчинялись «материнскому эффекту», что идентифицирует компонент как ЛВ (Рис.1) (Андреева, Карабанов, 2003). В качестве контроля использовали неоплодотворенные икринки текучих самок, содержащие ЛВ (Andreeva, Slynko, 2001), сыворотку крови самок производителей, содержащей «половую фракцию» (Vtg) и ЛВ, описанные у разных видов рыб (Новиков, Решетников, 1969; Воропаев, Новиков, 1970;  Новиков, 1970, 1999; Шатуновский, Новиков, 1971; Новиков, Шатуновский, 1976; Yao, Crim, 1996; Андреева, 2001) и белые мышцы производителей, не содержащие ЛВ (Рис.1).

1  2  3  4  5  6 7 8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19

Рис.1. Диск-электрофорез водорастворимых белков из мышц леща (1-4) и плотвы (5-8); неоплодотворенной икры леща (9-11) и плотвы (12-16); зародышей плотвы (17), синца (18) и леща (19) на стадии бластулы.

ЛВ зародыша был представлен двумя компонентами с ММ 200 и 335 kDa (Рис.2), в SDS-ПААГ одним компонентом с ММ 180 kDa (Andreeva, Slynko, 2001), что совпадает с данными других авторов, в том числе и для карповых рыб (Wang et al., 2000), и также идентифицирует белок как ЛВ.

Участие липовителлина в пластическом обмене. Относительное содержание ЛВ падало по мере рассасывания желтка, а низкомолекулярных белков – росло  (Рис.3).

Данную динамику можно объяснить действием на ЛВ желточных протеаз (Нейфах, Давидов, 1964; Немова, 1982, 1992, 1994). Исчезновение ЛВ на электрофореграмме совпадало с полным рассасыванием желтка. Параллельно нарастанию содержания молекул с меньшей, чем у ЛВ, ММ, происходило изменение качественного состава образующихся молекул, что свидетельствует, вероятно, о последовательной деградации уже образовавшихся продуктов протеолиза ЛВ на более мелкие фрагменты (Табл.1).

Таблица 1. Значения ММ (kDa) водорастворимых белков зародышей плотвы 

на стадиях развития от 2 бластомеров (2бл.) до 12-108 часов после выклева.

Стадия

2бл.

Бластула

Начало

кровообр.

Выклев

12 ч.

36 ч.

60 ч.

108 ч.

ММ

330

335

300

305

301

300

301

280

260

279

235

248

239

235

237

209

200

202

159

166

153

151

156

158

78

123

118

112

111

116

95

90

84

83

70

76

73

72

70

59

53

38

Регуляторная функция липовителлина. Анализ связи динамики деградации ЛВ с характером проявления зародышевых генов с разным временем активации у межродовых реципрокных гибридов F1 леща, плотвы и синца позволил предположить регуляторные свойства ЛВ (Andreeva, Slynko, 2001). Мы анализировали связь между временем и характером проявления зародышевых генов на стадиях, «богатых» ЛВ, и стадиях с частично или полностью исчерпанными запасами ЛВ. Активацию зародышевых генов регистрировали по времени первого проявления отцовских аллелей у зародышей гибридов (Корочкин, 1976; Чадов, 2002; Rubidge, Taylor, 2004; Simonsen et al., 2004; Hanfling et al., 2005).

LDH.  При одинаковом сочетании родительских генотипов по LDH (Ldh-B x Ldh-B / ), имевшем место при внутривидовом скрещивании плотвы (Рис.4, вар.3) и межродовом скрещивании леща и плотвы (Рис.4, вар.4), в потомстве гибридов обнаружено отставание времени первого проявления отцовских аллелей (стадия «предличинки») по сравнению с «чистой» плотвой (дробление). Отставание имело место и у реципрокных гибридов (Рис.4).

Рис.4. Формирование изоферментных спектров LDH в потомстве от скрещиваний леща и плотвы. Плотва и Плотва / - родители плотвы гомозиготной по быстрому (В) и медленному (В/) аллелям локуса Ldh-B. н/о – неоплодотворенная икра, 1-11 – стадии развития от бластодиска (1) до полного рассасывания желточного мешка (11).

Раннее проявление Ldh-B у «чистых» видов позволяет отнести LDH к ферментам с ранней активацией. Торможение появления у гибридов отцовских В-субъединиц по сравнению с материнскими характеризует проявление Ldh-B у гибридов как асинхронное по материнскому типу (Андреева, 2005).

ME. У зародышей во всех экспериментальных группах проявление Ме-1 и Ме-2 имело место на стадии «предличинки» (Ме-2) и у сеголетков (Ме-1). Характер проявления  Ме-1 был синхронный, для Ме-2 его установить не удалось по причине совпадения изоферментов у леща и плотвы.

6-PGD. У зародышей леща первое проявление зародышевых генов 6-Pgd приходилось на гаструляцию, у плотвы – на начало сегментации, у гибридов Плотва х Лещ в виде продукции материнских аллелей - на начало сегментации (отцовские аллели проявлялись после выклева), у гибридов Лещ х Плотва в виде продукции материнских аллелей - на гаструляцию (отцовские аллели проявлялись после рассасывания желтка). Таким образом, 6-PGD является ферментом с ранней активацией. Характер проявления 6-Pgd у гибридов асинхронный по материнскому типу.

β-EST. Первое проявление зародышевых генов b-Est – 1, 2, 3 у плотвы и леща приходилось на стадию установления кровообращения и выклева соответственно. У синца и гибридов Синец х Плотва имело место раннее проявление -Est-1 (гаструляция). Полные изоферментные спектры b-EST у всех зародышей формировались на этапе массового вылупления.  Принимая во внимание раннюю экспрессию b-EST-1 синца и более позднюю у плотвы и леща, можно с большой долей уверенности предположить, что на стадии гаструляции у гибридов Синец х Плотва проявляется -Est-1 синца. В этом случае характер проявления -Est-1 у гибридов считали асинхронным по материнскому типу, переходящим в синхронный на этапе вылупления.

ААТ. У зародышей синца и Синец х Плотва первое проявление Aat-1 приходилось на гаструляцию; у плотвы, Плотва х Синец, Плотва х Лещ - на окончание сегментации; у леща и Лещ х Плотва – на вылупление. Это позволило считать ААТ синца и гибридов Синец х Плотва ферментом с ранней, а в других группах зародышей - с поздней активацией.  При раннем проявлении Aat-1 имела место асинхронная активация родительских аллелей  Aat-1  по  материнскому  типу, при  позднем проявлении - синхронная.

Таким образом, у гибридов при ранней активации локусов родительские аллели проявлялись асинхронно по материнскому типу; при поздней активации – синхронно. Характер связи сохранялся при разной температуре инкубации зародышей (Андреева, 2007) и коррелировал с динамикой деградации ЛВ: асинхронное проявление зародышевых генов приходилось на стадии, «богатые» ЛВ, синхронное проявление  генов  -  на стадии с частично или полностью  исчерпанными запасами ЛВ. Вероятно, на ранних стадиях развития ЛВ и загруженные на его поверхность оогенетические  ферменты принимали участие в формировании внутренней среды, способствующей преимущественной активации материнских по происхождению аллелей зародышевых генов, что проявлялось в их асинхронной экспрессии. На более поздних этапах материнские белки были в той  или  иной  степени исчерпаны и не играли ключевую роль в формировании внутренней среды, и родительские аллели с поздним проявлением экспрессировались в ней одновременно. Проведенный анализ динамики деградации ЛВ и характера проявления зародышевых генов у гибридов позволяет рассматривать ЛВ в качестве участника транспортной системы зародыша на этапе, предшествующем появлению кровеносной системы, и как возможный  регулятор  раннего  развития.

Глава 3. Принципы структурно-функциональной организации

белков крови хрящевых и костных рыб.

Истинные белки внутренней среды организма - белки плазмы крови появляются в сформированной внутренней среде зародыша, разделенной на сосудистый и внесосудистый компартменты (Уайт и др., 1981); помимо специфических, они выполняют функции осмотически активных, пластических и транспортных молекул.

Структурно-функциональная организация альбуминов. Универсальный тип организации сывороточных альбуминов высших позвоночных предполагает их мономерную (из одной полипептидной цепи) структуру с ММ 67 kDa, отсутствие углеводов, ковалентно связанных с белком, наличие свободной поверхностной SH-группы и выполнение функций осмотически активных, транспортных и пластических молекул (Klotz et al., 1975; Уайт и др., 1981). У хрящевых рыб альбумины отсутствуют (Irisava et al., 1954; Woods et al., 1958; Drilhon et al., 1959; Drilhon, 1960), хотя не все данные согласуются с этой точкой зрения (Cordier et al., 1957; Saito, 1957; Ипатов, Лукьяненко, 1979; Андреева, 1997); у костистых рыб отличаются по структуре от альбуминов высших позвоночных (Строганов, 1962; Кирпичников, 1987). Мы изучали особенности организации альбуминов в разных таксономических и экологических группах рыб.

Альбуминоподобные белки хрящевых рыб. Обнаружена обширная фракция НМБ в сыворотке крови катрана. Самый  подвижный в диск-электрофорезе компонент в градиенте ПААГ разделялся на 11-12 компонентов, из них три имели ММ 58-60 kDa, остальные – 64-70 kDa (Рис.5).

В SDS-ПААГ НМБ были представлены одним компонентом (48 kDa), содержащим ковалентно связанный углевод. НМБ катрана связывали гемин, синий Эванса и БКП. У скатов НМБ не обнаружены (Андреева, 1986, 1999).

Альбумины хрящевых ганоидов.  Альбумины стерляди, белуги, русского осетра и севрюги представлены мономерными белками с ММ 67 kDa (Рис. 6).

Альбумины не содержали ковалентно связанный с белком углевод, имели одну поверхностную свободную SH-группу, специфически связывали альбуминспецифичный краситель БКП, синий Эванса и БФС; не связывали гемин, гемоглобин и Fe3+, окрашивались на липо- (кроме альбумина стерляди) и гликопротеиды (Андреева, 1985, 1986, 1997, 1999).

а  б

Альбумины костистых рыб. Роль генетических и негенетических факторов в создании структурного разнообразия белков. Альбумины пресноводных рыб включают белки низкомолекулярной фракции НМФ и белковый комплекс “челнок” (Андреева, 1999) (Рис.7).

1 2  3  4  5 6 7  8

 

  а б

Рис.7. Диск-электрофорез сывороточных белков леща (1, 2, 5-8) и судака (3, 4) в летний период (а) и перед нерестом (б). Пояснения в тексте.

  

Анализ изменчивости и подвижности белков НМФ у леща позволил предположить их ген-детерминацию тремя независимыми локусами A, B и C. Продукты локуса А часто замаскированы «челноком», продукты локуса С чаще инвариантны, а продукты локуса В различаются по подвижности. По характеру изменчивости продукции локуса В предложена двухаллельная гипотеза ген-детерминации, стандартная проверка гипотезы по соответствию распределению Харди-Вайнберга подтвердила ее справедливость (Андреева, 1999). Количество и характер окрашивания полос у вероятных гетерозигот по локусу В свидетельствуют в пользу мономерной структуры белка, кодируемого локусом В. Сопоставление величин ММ неденатурированных и денатурированных молекул альбумина не противоречит представлениям о мономерной структуре белка: в денатурирующих условиях ММ белков В и С составила около 50 kDa, в неденатурирующих условиях 67 kDa и выше. Высокие показатели ММ неденатурированных молекул могут поддерживаться за счет транспортируемых белком углеводов и липидов, выявляемых окрашиванием реактивом Шиффа и суданом черным Б. Кроме того, в структуре альбуминов выявлены ковалентно связанные с белком углеводы. При связывании красителя БКП сдвиг λмакс отличался от специфического.

«Челнок» представлен на электрофореграмме в виде пятна, часто принимаемого за артефакт (Кирпичников, 1987). Он связывал красители, Fe3+, гемин, Hb, окрашивался на глико- и липопротеиды. В ПААГ с 8М мочевиной и в SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях он распадался на 10-13 субъединиц (Рис.8).

   

 

Рис.8. Фингерпринты белков сыворотки крови леща в неденатурирующих (а) и денатурирующих условиях 8М мочевины (б) и SDS-ПААГ (в). Горизонтальная стрелка указывает направление диск-, вертикальная – градиентного (а), с мочевиной (б) и SDS (в) электрофорезов, маленькие вертикальные стрелки - дорожку «челнока».

Данное обстоятельство характеризует «челнок» как олигомерный комплекс и позволяет предположить, что полипептидные цепи в составе «челнока» стабилизированы нековалентными взаимодействиями. В SDS-ПААГ ММ субъединиц «челнока» составила от 18,5 до 73 kDa, в их числе выявлен макрокомпонент с ММ 67 kDa, имеющий в структуре ковалентно связанный с белком углевод.

Анализ организации альбуминов у пресноводных костистых рыб позволил условно разделить их на две группы: I - альбумины по типу леща (карповые рыбы) и II - альбумины по типу судака (судак, берш, щука). В первой группе количество компонентов НМФ не превышало шести и имелся один компонент «челнока», для альбуминов второй группы число компонентов НМФ было выше шести и имелось 1-2 компонента «челнока».

НМФ сывороточных белков морских костистых рыб были также гетерогенны по заряду и величине ММ, но не содержали белковых комплексов: выявлено до 10 белков в НМФ у полярной камбалы и семь белков у керчака с ММ в диапазоне от 30 до 90 kDa,  4-5 белков у полярной трески с ММ от 45 до 80 kDa. У солоноватоводных видов бычка-цуцика в плазме не обнаружено белков с ММ ниже 67 kDa (в неденатурирующих условиях), а у тюльки выявлены 2 низкомолекулярных белка с ММ ниже 67 kDa.

Универсальный алгоритм структурных трансформаций комплекса сывороточных альбуминов. Для альбуминов пресноводных костистых рыб характерны выраженные структурные перестройки, коррелирующие с уровнем обменных процессов. Алгоритм таких перестроек заключается в резком изменении величин ММ (с 130-160 до 90 kDa) и Rf (с 0,55 до 0,7) комплекса «челнок» и появлении на электрофореграмме нового белка с высокими значениями подвижности Rf 0,83 (Рис.7 б). Такие перестройки альбуминового комплекса выявлены не только у половозрелых рыб (лещ, плотва, синец, чехонь, уклейка, густера, щука, судак, берш,) накануне нереста (Андреева, 1999), но и у экспериментальной плотвы 1+, содержавшейся при высокой температуре (22,50) в зимнее время. В их основе лежат, вероятно, задаваемые температурой изменения уровня обменных процессов, приводящие к деградации альбуминов, в ходе которой формируется пул аминокислот для последующего биосинтеза белков (Кирсипуу, Лаугасте, 1979). Поэтому два дискретных структурных типа альбуминов мы обозначили как базовый (Рис.7 а) и пластический (Рис.7 б).  Дискретный характер структурных преобразований «челнока» обусловлен и облегчен его олигомерной структурой, включающей несколько полипептидных цепей, стабилизированных нековалентными связями, что наглядно демонстрирует динамика деструкции комплекса под действием возрастающих концентраций мочевины (Рис.9).

  2 1 

Сравнительный анализ альбуминов хрящевых и костных рыб. Выявляемое структурное разнообразие альбуминов обеспечено не только механизмами генетической детерминации, но и негенетическими механизмами, в частности, сложной поверхностной структурой белков и перестройками. Наличие в структуре альбуминов костистых рыб ковалентно связанных с белком углеводов, вероятно, обеспечивает регуляцию времени жизни и утилизации клетками молекул альбумина, а также является способом «наращивания» размеров молекул (Уайт и др., 1981; Шульц, Ширмер, 1982). Специализированные альбумины-мономеры выявлены у хрящевых ганоидов, слабоспециализированные альбуминовые комплексы из белков-мономеров и олигомеров - у костистых рыб. Низкий уровень специализации альбуминов костистых рыб обусловлен связыванием ими гемина, железа и гемоглобина. Полученные данные согласуются с информацией о слабой антигенной идентичности альбуминов рыб из разных таксономических групп (Зорин и др., 1994), что может свидетельствовать об отсутствии гомологии между ними или о ее потере в процессе эволюции (Чихачев, 1982).

Структурно-функциональное разнообразие глобулинов.

γ-глобулины. К γ-глобулинам относятся иммуноглобулины Ig - структурно родственные белки (H2L2)n , где Н и L - соответственно тяжелые и легкие цепи, связанные S-S связями, n - уровень структурной организации молекулы (Гауровиц, 1969; Баранов, 1982). Мы оценивали структурное разнообразие γ-глобулинов. О наличии Ig  судили  по обнаружению на SDS-ПААГ компонентов с ММ около 20 kDa.

Хрящевые ганоиды. Нативные γ-глобулины костных рыб были представлены широким спектром форм (Рис.10).

У самок накануне нереста среди γ-глобулинов обнаружен вителлогенин Vtg с ММ около 500 kDa  (Рис.11).

γ-глобулины окрашивались на липо- (кроме стерляди) и гликопротеиды, в градиенте ПААГ они были дифференцированы на белки с ММ от 200 до 950 kDa и выше (Рис.10). В SDS-ПААГ γ-глобулины были дифференцированы на  субъединицы с ММ около 20 kDa, 56, 60, 65 и 70 kDa.

Костистые рыбы. С колонки с сефадексом  γ-глобулины выходили в 2 пиках соответственно γ1- и γ2-глобулинов (Рис.12).

В первом пике в свободном объеме выходили высокомолекулярные агрегаты с ММ выше 1000 kDa, образованные γ1-глобулинами  с ММ около 180, 280 и 320 kDa, во втором пике - γ2-глобулины с ММ 200 kDa, которые в градиенте ПААГ выявляли в виде агрегатов с ММ 510, 710 и 950 kDa (Рис.10).

Среди γ1-глобулинов обнаружен гемин-связывающий белок. γ2-глобулины многих костистых рыб нековалентно связывали Hb и проявляли пероксидазную активность, связывание носило случайный характер (Андреева, 2001а). В SDS-ПААГ выявлены цепи с ММ около 20 kDa, 50, 65, 75, 80 kDa и выше (Рис.13).

Анализ данных колоночной хроматографии на сефадексе G-200 и фингерпринтов в градиенте концентраций ПААГ позволили предположить, что структурное разнообразие γ-глобулинов обусловлено агрегацией различных молекул со сходными показателями ММ от 180 до 200 kDa, а также углеводами и липидами, входящими в состав глико- и липопротеидов γ-глобулинов.

 

Роль небелковых соединений в создании структурного разнообразия сывороточных белков.

Липиды и углеводы. У катрана выявлен 1 липопротеидный комплекс (ЛПК) в зоне подвижности альбуминоподобного белка, у хрящевых ганоидов 1-2 ЛПК (β-глобулин у стерляди, α2-макроглобулин («желтый пигмент») у осетра, β-глобулин и альбумин у севрюги, α2-макроглобулин и альбумин у белуги), у костистых 5 ЛПК летом (γ1-, α1-, α2-глобулины, «челнок», альбумины) и 1-2 зимой (α2-глобулины, альбумины). Разные ЛПК отличались прочностью: двукратное замораживание выдерживали ЛПК только у проходных белуги и севрюги.

  Гликопротеидами у хрящевых рыб являются два белка (α2-глобулины, альбумины), у хрящевых ганоидов - три (стерлядь),  пять (осетр, белуга) и семь (севрюга) компонентов, а у костистых рыб - все сывороточные белки.

  У костистых рыб комплекс «челнок» является липо- и гликопротеидом. Колебания его относительного содержания в 4-5 раз в течение года (Андреева, 1997), сопровождаются изменениями ММ и Rf, а также степенью загруженности липидами и углеводами, что указывает на его участие в обменных процессах. Примером участия липидов и углеводов в создании структурного разнообразия белков являются альбумины катрана, электрофоретическая множественность которых (12 компонентов) устраняется в денатурирующих условиях.

Роль сиаловых кислот в создании структурного разнообразия белков. Гетерогенность β-глобулину трансферрину свыше трех компонентов в электрофорезе придают сиаловые кислоты (Кирпичников,1987). Только у катрана выявлен один компонент Tf, у костных рыб в неденатурирующих условиях от двух и выше, в основном до четырех компонентов. Полученные препараты очищенного трансферрина стерляди и леща (Андреева, 1987 в, г, 1997), содержащие по 4 компонента трансферрина, использовали для определения в них сиаловых кислот. У стерляди их содержание не превышало 6,73 М на 1М белка (Андреева, 1987 в, г). При обработке нейраминидазой удалось устранить гетерогенность Тf стерляди. α2-нейроаминогликопротеин (около 200 kDa) из сыворотки стерляди после обработки нейраминидазой исчезал с электрофореграммы ввиду существенного снижения ММ. У костистых рыб белки оказались устойчивыми к действию нейраминидазы.

Сравнительный анализ структурно-функциональной

организации белков крови Pisces

Белки хрящевых и костных рыб. По степени дифференциации белков по заряду и ММ хрящевые ганоиды уступали костистым и превосходили хрящевых рыб. На фингерпринтах неденатурированных белков стерляди, севрюги и белуги выявлялось до 28 компонентов; количество субъединиц составило около 41, у катрана на 20 белков приходилось 14 субъединиц. У большинства костистых рыб степень дифференциации денатурированных белков превышала 40 компонентов, достигая 96, что мы связываем, прежде всего, с наличием в крови костистых рыб белков-олигомеров. Особенностью белков крови рыб является наличие ковалентно связанных с ними углеводов. Различия в поверхностной структуре белков хрящевых ганоидов и костистых рыб выявляются в дифференцированном действии на них нейраминидазы, а также 6-8М мочевины, последняя вызывает диссоциацию олигомерных комплексов в крови костистых рыб, а у стерляди способствует агрегации НМФ и диссоциации агрегированных γ-глобулинов.

Белки диплоидных и полиплоидных видов. При анализе степени дифференциации белков костистых рыб по заряду и ММ учитывали полиплоидное происхождение карпа, серебряного карася и пеляди (Васильев, 1985), проявляющееся на фингерпринтах их белков. У тетраплоидной пеляди в градиенте и SDS-ПААГ выявлены характерные «дуплексы» (Рис. 14) в отличие  от диплоидных рыб (Рис.15).

  а  б

Рис.14. Схема фингерпринтов белков плазмы пеляди: а - в градиенте концентраций ПААГ, б – в SDS-ПААГ. Горизонтальная стрелка показывает направление диск-, вертикальная – градиентного (а) и SDS-электрофореза (б). 

 

  а б

Рис.15. Схема фингерпринтов сыворотки крови керчака (а) и леща (б) в SDS-ПААГ. Горизонтальная и вертикальныя стрелки показывают направление диск- и SDS-электрофореза.

В целом, по степени дифференциации белков полиплоидные виды были сопоставимы с диплоидными, не превосходя последних по количеству компонентов на фингерпринтах как денатурированных, так и неденатурированных белков.

Белки пресноводных и морских костистых рыб. По количеству субъединиц пресноводные виды превосходили морские: у первых максимальное число субъединиц достигало 96, у вторых - 43 (для диплоидных видов) (Рис.15). 

У большинства пресноводных костистых рыб на один белок приходилось от 1,4-2 до 4 полипептидных цепей, у морских костистых не более двух. Таким образом, наиболее сложно организованными оказались белки пресноводных рыб. Приведенные выше данные объясняют это усложнение не вкладом полиплоидных видов, а наличием в крови пресноводных костистых рыб белковых комплексов.

Глава 4. Структурно-функциональная организация гемоглобина.

Адаптации гемоглобина Hb к изменениям среды предполагают, прежде всего, сохранение его структурной целостности. Между тем, изменения солености воды у морских хрящевых рыб вызывают компенсаторные изменения концентрации мочевины в полостных жидкостях организма, у осетровых - мочевины и солей, способные дестабилизировать Hb (Андреева, 2006). В наибольшей степени действию дестабилизирующих факторов подвержены Hb проходных форм (Никольский, 1963). Мы изучали устойчивость гемоглобина к дегидратации, замораживанию и 6-8М мочевине, действующих на систему слабых связей (Александров, 1985) у рыб из разных таксономических и экологических групп. Экологические последствия устойчивости Hb к дестабилизирующим факторам рассмотрены в гл. 5. При изучении влияния дегидратации на Hb значение концентрации сульфата аммония, при котором белок начинал выпадать в осадок, считали критической концентрацией преципитации (ККП) (Андреева, 2006). Устойчивым считали Hb с высокой ККП, способный после действия фактора образовывать правильные кристаллы и оставаться в окси-форме.

Влияние дестабилизирующих факторов на гемоглобин рыб.

Хрящевые рыбы (туводные морские). Степень дифференциации в диск-

электрофорезе для Hb катрана и морской лисицы составила 6-8, морского кота - 12 компонентов. Hb катрана был представлен мономерами, димерами, тетрамерами и не содержащим гем ВМА. У скатов агрегированных форм Hb не выявлено. 

В отсутствие мочевины тетрамерный Hb катрана, в отличие от Hb скатов, распадался на димеры. Замораживание нарушало кристаллообразование. Дегидратация гемоглобина происходила при всех концентрациях СА (Андреева, 2006). Кристаллы Hb – короткие гексагональные призмы с углами основания, повторяющимися через два,  с D около 100 мкм (Рис.16).

  

а  в  с

Рис.16.  Кристаллы гемоглобина в сульфате аммония : а – катрана (схема), в, с – стерляди (фото). D – диаметр основания  кристалла. Увеличение Х800.

Хрящевые ганоиды. Hb представлены тетрамерами, кристаллы - тетра- и  гексагональными призмами: у стерляди и осетра – мелкими, короткими с диаметром основания около 100 мкм (Рис.16), часто с дефектами структуры в виде скошенных призм, двойников прорастания и других форм; у севрюги и белуги - крупными, правильной формы с D=1200 мкм.

У Hb стерляди и осетра  ККП составила 20-25%, у севрюги и белуги 35-40% (Рис.17).  У белуги и севрюги при всех значениях насыщения сульфата аммония преобладали окси- и дезокси-Hb, а у стерляди и осетра мет-Hb. Экспресс-тест на устойчивость Hb к дегидратации (75% насыщения СА) выдерживали Hb только проходных рыб. После замораживания правильные кристаллы формировали только Hb севрюги и белуги. Деструкция Hb проходила по типу распада тетрамера на димеры и мономеры.

Костистые рыбы. Hb представлены исключительно тетрамерами, способными in vitro к полимеризации в октамеры. Кристаллы – мелкие тетра- и гексагональные призмы, часто неправильной и усеченной формы с D=100 мкм. Замораживание приводило к нарушению кристаллообразования. По устойчивости к дегидратации у Hb имела место значительная вариабельность: от низкой устойчивости (ККП=5%) у морских видов полярной камбалы и полярной трески, до ККП=20%-35% у большинства пресноводных видов и тюльки и высокой устойчивости у щуки (ККП выше 50%). Деструкция Hb пресноводных видов происходила по связи гем – глобин.

%  насыщения сульфата аммония 

  1  2

Рис.17. Кривые высаливания гемоглобинов рыб сульфатом аммония:  1 – севрюги, 2 – стерляди. ABS – поглощение гемоглобина в условных единицах.

Действие длительного голодания на устойчивость структурно-функциональных показателей Hb серебряных карасей. Голодание для рыб не является экстремальным фактором, так как значительные периоды в своем жизненном цикле рыбы голодают (Солдатов, 2005), но, когда голодание накладывается на сезонную динамику летне-осеннего периода с высоким уровнем обменных процессов, задаваемых температурой, фактор голодания выступает как экстремальный дестабилизирующий (Андреева и др., 2006 а, б).

При добавлении к крови голодающих в течение 3 летних месяцев рыб раствора ЭДТА (10:1) был зарегистрирован случай спонтанного гемолиза эритроцитов, Hb при этом находился в мет-форме. У питающихся и остальных голодающих рыб добавление ЭДТА не провоцировало гемолиз эритроцитов, Hb находился в окси- и дезоксиформе. На мазках цельной крови голодных рыб одноразмерные зрелые эритроциты составили около 98.3+0,39% от общего количества клеток эритроидного ряда, у питающихся рыб были выявлены клетки всех стадий эритроидного ряда: 10.3+1,16% составили незрелые формы, 3.8+0,82% - делящиеся формы и 85.9+1,23 % - зрелые эритроциты.

Электрофоретический анализ тотальной ДНК из крови голодного карася, чьи эритроциты гемолизировали, выявил апоптотические спектры деградации ДНК. У других рыб ДНК была без следов фрагментации (Рис.18).

Характерные признаки программируемой гибели могли быть следствием переустановки организменного гомеостаза у рыб с режима перманентного эритропоэза к режиму дискретного эритропоэза и апоптоза в условиях экстремального сочетания факторов (Андреева и др., 2006 а, б). Способы «утилизации» образующихся продуктов деструкции гемоглобина в виде мет-гемоглобина, глобина, гема и Fe3+ рассмотрены в гл. 5.

Роль экологической дифференциации видов в формировании структурно-функциональной разнокачественности гемоглобинов. Дифференциация Hb по устойчивости к дестабилизирующим факторам не совпадала с дифференциацией рыб по таксономическому признаку. Выявленные различия можно объяснить особенностями внутренней среды и условий обитания видов. Поскольку колебания солености среды морскими хрящевыми рыбами выдерживаются за счет компенсаторных колебаний концентрации мочевины внутренней среды, достигающей в крови 0,3-0,4М (Шилов, 1985), то можно предположить, что и Hb хрящевых рыб также должен выдерживать значительные колебания концентрации мочевины и быть устойчивым к ним, что мы и наблюдали у катрана. При действии высоких концентраций мочевины на Hb хрящевых ганоидов имело место разрушение тетрамера на димеры. Деструкцию Hb в этом случае можно также объяснить особенностями внутренней среды организма, содержащей мочевину в концентрациях, в 10-50 раз меньших, чем у хрящевых морских видов, и поэтому более чувствительной к ней. Концентрация солей в крови костистых и ряда осетровых рыб в отличие от акул, колеблется (Шилов, 1985; Мартемьянов, 2001). Различия в устойчивости Hb к дегидратации у пресноводных костистых можно объяснить их принадлежностью к разным экологическим группам: морским и пресноводным, хищным и бентофагам и др. Дифференцированное действие дестабилизирующих факторов на Hb наглядно демонстрируют осетровые рыбы, включающие проходные и туводные формы. Только у проходных севрюги и белуги Hb был устойчив к дегидратации и замораживанию. Таким образом, структурная устойчивость Hb определяется особенностями образа жизни рыб и носит адаптивный характер.

Глава 5. Функциональная организация белков плазмы крови рыб. Сывороточные пероксидазы.

Среди пресноводных костистых рыб у видов, имеющих быстро деградирующий гемоглобин и склонные к внутрисосудистому гемолизу эритроциты, выстроена система оперативного связывания как Hb, так и продуктов его деградации, не только специализированными белками гаптоглобином, гемопексином и трансферрином, но и всеми белками плазмы (Андреева, 1997, 1999, 2001 а, б). Эта система связывания достаточно емкая, так как выдерживает нагрузку в виде массированного выброса мет-Hb из спонтанно гемолизирующих в результате апоптоза эритроцитов (Андреева, 2006 а, б). Связывание железосодержащих лигандов белками приводит к появлению у них пероксидазной активности. У катрана пероксидазную активность проявляли трансферрин и комплекс гемин-гемопексин, у стерляди – трансферрин и α1-глобулин, у пресноводных костистых рыб - практически все сывороточные белки: комплексы иммуноглобулин-Hb, гаптоглобин-Hb, гемопексин-гемин, «челнок»-гемин, «челнок»-Hb, «челнок»-Fe3+ и НМФ-гемин (Андреева, 2001 б). Связывание Hb и продуктов его деструкции с большинством белков, кроме специализированных, носило случайный характер. Неустойчивость Hb и склонность эритроцитов к внутрисосудистому гемолизу у пресноводных костистых рыб, вероятно, стали причиной появления в этой группе рыб специализированного белка гаптоглобина, связывающего Hb (Андреева, 1997, 2001 б). Особое место среди белков крови занимает комплекс «челнок», «дублирующий» функции специализированных белков: трансферрина, гемопексина и гаптоглобина. Рост числа белков, связывающих Hb и продукты его деструкции, вероятно, обусловлен физиологической стратегией организма на предотвращение потерь железа, что и определило низкий уровень специализации белков пресноводных костистых рыб.

Глава 6. Особенности интеграции белков крови рыб в единую систему.

Современные представления о транскапиллярном обмене белков плазмы крови базируются на фильтрационно-реабсорбционной гипотезе Старлинга (Starling, 1895), однако, в отличие от нее, допускают возможность проникновения белков плазмы в интерстициальное пространство (Landis, Pappenheimer, 1963). В распределении белков крови во внеклеточной жидкости организма важная роль отводится структуре белков (Андреева и др., 2007) и свойствам мембран эндотелия (Болдырев и др., 2006). Фильтрация белков плазмы в тканевое пространство в некоторых отделах капиллярного русла объясняется разной проницаемостью капилляров для белков (Zweifach, Intaglietta, 1968). Мы анализировали фракционный состав и организацию белков крови и тканевой жидкости у леща, плотвы, карпа, серебряного карася и тюльки при адаптациях к разным условиям (голодания и разной солености).

Сравнение фракционного состава белков сыворотки крови и интерстициальной жидкости у лещей при адаптациях к солености. У лещей из пресной и соленой (8 и 10%о) воды степень дифференциации белков СК в ПААГ была одинакова. Изменения относительного содержания выявлены в СК для комплекса «челнок»  при солености выше 10%о. В ИЖ снижение относительного содержания при 11,5%о отмечено для белков с ММ 60-70 kDa и комплекса «челнок»; относительное содержание НМФ росло за счет трех белков с ММ 20-40 kDa, в том числе белка с ММ 34-37 kDa, встречающихся только в ИЖ  (Рис.19).

Аналогичные изменения выявлены у плотвы, карпа и карася, у полиплоидных видов  НМФ в ИЖ включала до 6 компонентов.

а

б

Рис.19. Относительное содержание белкового комплекса «челнок» и белков из низкомолекулярных фракций НМФ (с ММ 60-70 и 34 kDa) в сыворотке крови (а) и интерстициальной жидкости мышц (б) лещей 2+ при адаптациях к солености: 1 – пресная вода, 2 – 8%0, 3 – 10%0 , 4 – 11,5%0 . Разной заливкой выделены НМФ, белки с ММ 60-70 kDa, белок с ММ 34 kDa и комплекс «челнок».

Сравнение фракционного состава белков плазмы крови и интерстициальной жидкости у серебряных карасей при голодании. При снижении общего белка в ПК голодающих карасей в 1,57 раз по сравнению с питающимися, относительное содержание альбуминов сохранялось на стабильном уровне:  16,0+1,9% (у питающихся) и 15,9+3,9% (у голодных); в ИЖ - 5,41+0,35% (у питающихся) и 7,90+1,33% (у голодных).

Перераспределение фракций сывороточных альбуминов в ходе адаптаций рыб  in situНМФ белков плазмы крови лещей и карасей была представлена в градиенте ПААГ компонентами А1 и А2 с ММ соответственно 67 и 71 kDa (лещ), 57,8 и 66,5 kDa (карась). Отношение  концентраций А2/А1 в ПК и ИЖ менялось при адаптациях к солености и разному режиму питания, при голодании увеличивалось в ПК, а в ИЖ белых мышц поддерживалось на относительно стабильном уровне. При адаптациях к солености отношение А2/А1 во всех типах тканевой жидкости падало до 0 за счет исчезновения компонента А2, кроме ИЖ белых мышц, в которой отношение А2/А1 возрастало почти в 6 раз (Табл.2).

Таблица 2. Отношение содержания компонентов альбуминовой системы А2 и А1 (А2/А1) в разных внеклеточных жидкостях организма у  леща и серебряного карася, находящихся в разных экспериментальных условиях.

Тип тканевой жидкости

лещ

карась

пресная

вода

соленая

11,5%о

питание

голод

Плазма крови

0,46

0/12=0

0,56

1,2

ИЖ мозга

0,39

0/15=0

ИЖ белых мышц

1,25

7,67

0,64

0,66

Перитонеальная

0,50

0,075

ИЖ печени

0,45

0/14=0

ИЖ кишечника

0,58

0,075

У тюльки распределение компонентов А1 и А2 было прямо противоположным наблюдаемому у леща. Вероятно, характер перераспределения альбуминов между плазмой крови и интерстициальной жидкостью отражает специфику формирования капиллярами тканевой жидкости in situ и обусловлен приоритетами как осморегуляции, так и транспорта, кроме того, в отсутствие экзогенных источников пищи сами альбумины могут использоваться как пластическое сырье  (Morgan, 1966, 1969; Mouridsen, 1969).

Избирательная проницаемость стенок капилляров для белков плазмы крови. Все исследованные образцы ИЖ являлись фильтратами ПК: их фракционный состав совпадал с ПК. Отличия касались относительного содержания отдельных фракций, в том числе, транспортных липо- и гликопротеидов (Андреева, 1997), наиболее выраженных в ИЖ белых мышц. Для белков ПК карпа рассчитаны коэффициенты пропускания r  через стенку капилляра и средний для белков ПК коэффициент пропускания r (Рис.20).

Анализ коэффициентов r и величин ММ белков не выявил связи между ними: компоненты 11 (62,3 kDa) и 16 (119 kDa) были практически равновесно распределены между ПК и ИЖ мышц, самый подвижный компонент 9 (25,4 kDa) имел r=2,88, стартовый γ2-глобулин 27 имел r=0,61, что сопоставимо с величиной r для НМБ 13 (72,5 kDa) (Рис.20). Таким образом, стенки капилляров мышечного типа свойство молекулярного сита не проявляют. Проведенный сравнительный анализ величин  r (r) белков половозрелого карпа и сеголетков выявил их различия: у сеголетков значение r=1,34, у половозрелых r=0,805 (Андреева и др., 2007).

Обнаружение избирательной проницаемости капилляров для разных белков плазмы крови характеризует транскапиллярный обмен белков как активный транспорт. Различия параметров r и r для белков взрослых рыб и сеголетков отражают динамичный характер водного и в силу эффекта Гиббса-Доннана солевого обмена. У хрящевых ганоидов формирующие интерстициальную жидкость капилляры обладали одинаковой проницаемостью для всех белков плазмы (Цветненко, 1986).

1-8  9 10 11-14 15-17 18 19 2026 27 

   

  9  10  11/-13 / 14 15-1718 19 -24 25 26  27

Рис.20. Коэффициенты пропускания r и r белков плазмы крови капиллярами мышечного типа у половозрелого карпа. 9 - 27 – нумерация белков интерстициальной жидкости ИЖ  на оси абсцисс и белков  плазмы крови на электрофореграмме в градиенте ПААГ.  1-8 НМБ из ИЖ. Стрелка показывает направление электрофореза.

Структурные трансформации комплекса «челнок» как источник формирования пула низкомолекулярных белков в интерстициальной жидкости. Анализ перестроек компонентов низкомолекулярных фракций в ходе адаптаций к солености у представителей карповых и тюльки позволил выявить противоположные особенности в распределении белков альбуминового комплекса по обе стороны стенки капилляра мышечного типа Распределение белков альбуминового комплекса у солоноватоводной тюльки является универсальным для пресной и соленой в условиях эксперимента воды. Его особенностью является отсутствие в ИЖ комплекса «челнок» (Рис.21). У пресноводных карповых рыб распределение альбуминов резко различается для пресной и соленой в условиях эксперимента воды. Отсутствие в интерстициальной жидкости комплекса «челнок» наблюдается только при солености выше 10%0. Кроме того, распределение альбуминов А1 и А2 в ИЖ мышц карповых рыб прямо противоположно таковому у тюльки: и в пресной и в соленой воде для интерстициальной жидкости карповых характерно преобладание компонента А2 (Рис.21).

ЛЕЩ

ТЮЛЬКА

Рис. 21. Электрофорез в градиенте ПААГ альбуминов (А1, А2, «челнок») плазмы крови (ПК) и интерстициальной жидкости белых мышц (ИЖМ) у леща 3. и тюльки, содержавшихся в пресной и соленой (экспериментальной, 20%о) воде. НМБ – низкомолекулярный белок, К –  стенка капилляра.

Поскольку современные пресноводные костистые рыбы в своей истории прошли длительную фазу жизни в море (Ромер, Парсонс, 1992), тип распределения белков крови тюльки кажется более универсальным. Исходя из него можно предположить, что формирование белковых олигомерных комплексов, подобных «челноку», было вторичным, такие комплексы могли формироваться из отдельных полипептидных цепей в связи с опреснением среды обитания, как средство для уменьшения онкотического давления внутренних жидкостей организма. 

Перестройки альбуминового комплекса как источник формирования пула низкомолекулярных белков в ИЖ. Происхождение характерного для интерстициальной жидкости белка c ММ около 34 kDa определяли по фингерпринтам в градиенте ПААГ, показавшим его локализацию на дорожке «челнока» (Рис. 22).

   

Таким образом, анализ распределения белков крови во внеклеточной жидкости организма рыб показал, что интеграция белков в ходе транскапиллярного обмена достигается за счет функциональной однородности разных отделов капилляров, формирующих тканевые жидкости по типу фильтратов плазмы; появления у стенок капилляров пресноводных костистых рыб избирательной проницаемости для белков; и структурных преобразований альбуминов, в ходе которых может происходить диссоциация олигомерного комплекса «челнок» на полипептидные цепи, имеющих особенности в разных экологических группах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сравнение особенностей организации и интеграции белков плазмы крови у рыб и высших позвоночных выявило их существенные различия. У млекопитающих низкомолекулярная фракция плазмы крови представлена крупными специализированными белками, состоящими из 1 полипептидной цепи - мономерами, которые фильтруются через стенку капилляра в определенных отделах капиллярного русла. У рыб организация белков крови и их распределение по внеклеточным жидким компартментам формировались в соответствии с особенностями их внутренней среды и среды обитания. Для водных животных одним из основных лимитирующих факторов является соленость (Одум, 1975). Поэтому белковые системы крови рыб организованы в соответствии, прежде всего, с уровнем минерализации внешней водной среды и солевым составом внутренней жидкой среды (Хлебович, 1974). У хрящевых рыб и хрящевых ганоидов сформировались высокодифференцированные белковые системы крови, состоящие из специализированных белков, их низкомолекулярные фракции представлены исключительно мономерными белками. У пресноводных костистых рыб белковые системы крови сформированы из полифункциональных мономерных и олигомерных белков, состоящих из 10 и более полипептидных цепей; белки способны проникать через стенку капилляра с помощью механизма избирательной проницаемости в тканевые жидкости, в которых олигомеры могут диссоциировать на полипептидные цепи при адаптациях к пограничным для пресноводных рыб показателям солености. Поскольку белкам пресноводных рыб в силу гипертоничности внутренних биологических жидкостей в пресных водах не угрожает дегидратация, а наоборот, организм постоянно откачивает лишнюю воду, то образование белковых комплексов регулирует распределение внеклеточной жидкости организма, что способствует быстрой стабилизации водного обмена. В крови морских костистых рыб белковых комплексов не обнаружено. Морским видам в условиях гипертоничной внешней среды для удержания воды в организме, возможно, «выгоднее» иметь в крови больше небольших белков–мономеров, так как образование белковых агрегатов снизило бы онкотическое давление крови.

Приобретение пресноводными костистыми рыбами механизма быстрой «подгонки» онкотического давления внеклеточных жидкостей организма до оптимальных in situ показателей за счет диссоциации олигомерных комплексов, несомненно, не могло не способствовать высокой приспособляемости этой группы рыб и освоению ими новых экологических ниш. С другой стороны, учитывая историческое прошлое костистых рыб, предположительно связанное с длительной фазой жизни в море и дальнейшим освоением пресных вод (Ромер, Парсонс, 1992), а также предположение о формировании первичных биохимических систем при солености выше 5-8%0, но близкой к ней (Хлебович, 1974), более вероятно принять в качестве исходной модели существование во внеклеточной жидкой среде рыб отдельных полипептидных цепей, которые в ходе освоения рыбами пресных вод объединялись в белковые комплексы. Данная точка зрения подкрепляется обнаружением универсального типа распределения белков крови у тюльки, заключающегося в отсутствии белковых комплексов в интерстициальной жидкости и их сохранении в плазме крови.

Среди Pisces костистые рыбы занимают особое положение, которое определяется их биологическими особенностями, такими как высокая плодовитость и приспособляемость, многообразие экологических ниш. Эти особенности требуют высокого уровня генетической изменчивости, свободной рекомбинации генов, возможной при их слабом сцеплении (Кирпичников, 1987). Обнаруженная нами у белков костистых рыб способность к межмолекулярным взаимодействиям и структурным перестройкам, а также низкий уровень специализации белков, не исключают преобразований во взаимных отношениях структурных генов в сторону ослабления их сцепления. Данное предположение косвенно подтверждают сведения о наличии в геномах костистых рыб множественных семейств транспозонов, индуцирующих генетические перестройки (Volff, 2005), определяющих динамичный характер геномов костистых рыб. Поскольку организация белков так или иначе отражает характер генома (Патрушев, 2004), то динамичные белковые системы костистых рыб вполне могут быть следствием динамичной организации их геномов. Однако, фундаментальные проблемы взаимосвязи характера генома и организации белковых систем требуют специального рассмотрения. Тем не менее, благодаря динамичным и способным перестраиваться белковым системам крови, костистые рыбы максимально оптимизировали свой водно-солевой и пластический обмен, что не могло не увеличить шансы этой группы рыб на освоение новых ниш и в целом определить их экологический и эволюционный успех.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена множественность типов структурно-функциональной организации белковых систем крови у рыб: белковые системы у хрящевых рыб и хрящевых ганоидов высокодифференцированы, и состоят из специализированных мономерных белков, у костистых рыб – высокодифференцированы и состоят из слабоспециализированных белков с мономерной и олигомерной организацией.

2. Наиболее сложно организованы белковые системы крови у пресноводных костистых рыб. Они состоят из полифункциональных белков-мономеров и олигомеров со сложной поверхностной структурой, способных к межмолекулярным взаимодействиям с образованием комплексов и перестройкам при адаптациях in situ, что характеризует их как динамичные системы.

3. Внешним фактором, способствующим появлению в крови пресноводных костистых рыб белков-олигомеров, является колебание уровня солености воды. Внутренним фактором, определяющим снижение специализации белков, являются особенности молекулярной организации гемоглобина.

4. Основным внеклеточным белком зародыша до появления кровеносной системы является липовителлин, который участвует в формировании внутренней среды зародыша как резервный, питательный и регуляторный белок.

5. Транскапиллярный обмен белков плазмы крови у пресноводных костистых рыб обеспечен особенностями стенок капилляров, которые не обладают свойством молекулярного сита, но проявляют избирательную проницаемость для различных белков плазмы.

6. В стабилизации водного обмена у пресноводных костистых рыб принимают участие белковые комплексы плазмы крови, способные к перестройкам в ходе транскапиллярного обмена.

7. Выявлен универсальный алгоритм структурных трансформаций олигомерного комплекса крови в ходе транскапиллярного обмена при подготовке карповых рыб к нересту и адаптациях к солености, заключающийся в процессах диссоциации комплекса на составляющие его полипептидные цепи.

8. Организацию альбуминовой фракции интерстициальной жидкости тюльки в виде отдельных полипептидных цепей - мономеров, объединенных во внутрисосудистом пространстве в белковые комплексы, можно рассматривать в качестве исходной модели организации внеклеточных белков у костистых рыб.

Список основных публикаций по теме диссертации:

  1. Андреева А.М. Идентификация сывороточного альбумина и изучение некоторых его физико-химических свойств у представителей семейств Acipenseridae и Cyprinidae // Инф.Бюлл.ИБВВ АН СССР. 1986. 69. С.36-39.
  2. Андреева А.М. Физико-химические свойства сывороточных белков хрящевых рыб на примере катрана // Тезисы сообщ. IX Всесозн. совещ. по эволюц.физиологии. Л.: Наука. 1986. С.13-14.
  3. Андреева А.М. О структуре гемоглобина некоторых видов семейства Асipenseridae // Инф.Бюлл.ИБВВ АН СССР. 1987. 75. С.33-36.
  4. Андреева А.М. Устойчивость гемоглобина осетровых рыб к  дегидратирующему действию сульфата аммония // Инф.Бюлл.ИБВВ АН СССР. 1987. 76.С.56-59.
  5. Андреева А.М. Идентификация сывороточных трансферринов леща и стерляди // Материалы I Симп.по экол.биох.рыб. Ярославль. 1987. С.8-10.
  6. Андреева А.М. О роли сиаловых кислот в создании гетерогенности трансферринов стерляди и леща // Материалы I Симп. по экол.биох.рыб. Ярославль. 1987. С.10-11.
  7. Андреева А.М. Физико-химические свойства сывороточного альбумина крови осетрообразных и карпообразных рыб на примере  стерляди и леща // Физиология и биохимия гидробионтов. Ярославль. 1987. С.108-114.
  8. Andreeva A.M. Ecological diversity of physico-chemical properties of proteins blood of fishes// 9th Intern.Congress of European Ichth.”Fish Biodiversity”.Trieste.1997.P.7-8.
  9. Андреева А.М. Структурно-функциональная организация альбуминовой системы крови рыб //  Вопр. ихтиологии. 1999. Т. 39.N0 6. С. 825-832.
  10. Andreeva A.M., Slynko Y.V. Role of vitelline in initiation of nuclear genome//Book of Abstracts X European congress of ichthyology. Prague.2001. Р. 142.
  11. Андреева А.М. Сывороточные пероксидазы  рыб. Вопр.ихтиологии. 2001. Т. 41. N01. С. 113-121.
  12. Андреева А.М. Сывороточные γ-глобулины рыб  Вопр. ихтилогии. 2001. Т. 41. N04. С. 550-556.
  13. Андреева А.М. Изменения белковой системы крови леща накануне  нереста // Экологические проблемы онтогенеза рыб: физиолого-биохимические аспекты. М.: МГУ. 2001. С. 35-46.
  14. Андреева А.М. Особенности проявления генов лактатдегидрогеназы в раннем развитии леща Abramis brama (L)., плотвы Rutilus rutilus (L.) и их реципрокных гибридов F1 // Вопр. ихтиологии. 2005. Т.45. №3. С.411-417.
  15. Андреева А.М. Особенности формирования изоферментных спектров лактатдегидрогеназы в раннем развитии плотвы Rutilus rutilus (L.) // Вопр. ихтиологии. 2005. Т.45.  №2. С..277-282.
  16. Андреева А.М. Особенности проявления генов аспартатаминотрансферазы в раннем развитии леща Abramis brama (L). плотвы Rutilus rutilus (L.), синца (A.balltrus (L.) и их  межродовых гибридов F1 // Онтогенез. 2007. Т.38.№1.С.1-8.
  17. Андреева А.М. Влияние дестабилизирующих факторов на структурно-функциональные показатели гемоглобина туводных и проходных рыб // Журн. эвол. биохимии и физиологии. 2006.Т.42. №6. С.537-543.
  18. Андреева А.М. Оценка устойчивости структурно-функциональной организации некоторых белков крови рыб к действию дестабилизирующих факторов, моделирующих средовые воздействия // Мат. Всерос. науч.-практ. конф. «Экол. пробл. Уник. прир. и антроп. ландшафтов». Ярославль: ЯрГУ. 2006. С.121-125.
  19. Андреева А.М., Юркова М.С., Рябцева И.П., Лукьяненко В.В., Шарапова О.А., Кузьмина В.А. Поддержание организменного гомеостаза серебряного карася Carassius auratus gibellio (Bloch) в условиях неблагоприятного сочетания некоторых факторов // Актуальные проблемы гидроэкологии. Казань: Отечество. 2006. С.215-220.
  20. Андреева А.М., Юркова М.С., Рябцева И.П., Лукьяненко В.В., Шарапова О.А., Кузьмина В.А. Оценка влияния обеспеченности пищей на регуляцию кроветворения у серебряного карася Carassius auratus gibellio (Bloch) // Мат. Всерос. науч.-практ. конф. «Экол. Пробл. уникальных прир. и антропогенных ландшафтов». Ярославль: ЯрГУ. 2006. С.125-130.
  21. Андреева А.М., Чалов Ю.П., Рябцева И.П. Особенности распределения белков плазмы между специализированными компартментами внутренней среды на примере карпа  Сyprinus carpio (L.) // Журн.эвол.биох и физиол. 2007. Т. 43. №6. С.501-504.
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.