WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ГРИНЬ

Светлана Анатольевна

СОВРЕМЕННЫЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ  И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПРИ ПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.23 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Щелково – 2008 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН.

  Научный консультант  кандидат технических наук,  доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Рубан Евгений Александрович

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Смоленский Владимир Иванович, ВГНКИ

доктор биологических наук, профессор   Тихонов Игорь Владимирович, МГАВМиБ

доктор ветеринарных наук  Колбасов Денис Владимирович, ВНИИВВиМ

Ведущая организация ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной  ветеринарии Я. Р. Коваленко»

Защита состоится  5 марта 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская обл., Щелковский р-н, пос. Биокомбинат, п/о Кашинцево.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан « » февраля  2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.

Актуальность темы. Современная биотехнология занимает ведущее положение в системе биологических, медицинских, ветеринарных и зоотехнических исследований и представляет собой современную прогрессивную форму промышленной технологии, основу которой составляют биологические объекты – человек, животные, растения, микроорганизмы, клетки и вирусы.

Фундаментом современной биотехнологии являются микробиология, вирусология, генетика, биохимия, биофизика, технология, приборостроение. Сочетанное использование основных элементов указанных дисциплин позволяет создавать производственные системы для выпуска биологических препаратов, предназначенных для индикации возбудителей, диагностики, профилактики инфекционных болезней и лечения животных (Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., 2000).

Основы биотехнологии у нас в стране отражены в работах Иерусалимским Н.Д. (1963), Работновой И.А. (1957, 1974, 1976), Печуркиным Н.С. (1978), Помозговой И.Н. (1979), Дьяконовым Л.П. (1998), Сергеевым В.А. (1983), Бекером М.Е. (1978), Кофаровым В.В. (1979), Басникьян И.А. (1992), Бирюковым В.В. (1985), Рубаном Е.А. (1995, 2000, 2008), Самуйленко А.Я. (2000, 2008), Калунянцем К.А. и др. (1987); за рубежом – Monod I. (1942), Aiba S. (1961, 1975), Novick A. (1959), Herbert D. (1958, 1961), Pert S. (1975), Metzner A. (1960), Hamer G. (1982), Janessens J. (1984).

Современные биотехнологические производства представляют собой сложный комплекс взаимосвязанных биохимических, физико-химических и биологических процессов, оптимизация которых возможна на клеточном, популяционном, биоценотическом и аппаратурно-технологическом уровне.

Успехи отечественной ветеринарной науки и практики в проведении специфической профилактики инфекционных болезней связаны с крупными научными открытиями, сделанными в конце ХIХ и начале ХХ столетий (Воронин Е.С., Сюрин В.Н., 2000; Панин А.Н., 2001-2006).

В течение 40 лет сотрудниками ВНИТИБП накоплен большой опыт в создании новой высокоэффективной техники и биотехнологии получения вакцин, диагностикумов, специфических антигенов вирусного и микробного происхождения, гипериммунных сывороток, методов очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов, выделении специфического антигена и методов их оценки.

Разработаны суспензионные методы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов (Рубан Е.А., Раевский А.А., Соловьев Б.В., 1985-2000).

Обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами – одна из главных задач биотехнологии.

Впервые о получении трансгенных сельскохозяйственных животных сообщили две лаборатории в США и Германии (Hammer et al., 1985; Brem et al., 1985). В обоих случаях для переноса генных конструкций в эмбриональные линии был использован метод микроинъекции. Этот метод и сегодня остается наиболее широко используемым для трансгенеза в животноводстве (Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2006).

Таким образом, использование при разработке новых и совершенствование существующих промышленных биотехнологий производства биопрепаратов с использованием современного оборудования (биореакторов, сепараторов, разделительных центрифуг, фильтров и т.д.), иммунобиологических методов будет способствовать повышению их эффективности и улучшению эпизоотической, экологической и социальной обстановки в стране.

1.2. Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в совершенствовании и разработке современных биотехнологических процессов и иммунобиологических методов при промышленном производстве ветеринарных препаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать с использованием современного оборудования методы и биотехнологические процессы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов и репродукции культур клеток (включая сперматогонии с генетическим вектором нужной направленности.

2. Разработать современные методы получения специфических антигенов микробного и вирусного происхождения при производстве биопрепаратов.

3. Разработать метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре при промышленном изготовлении диагностикумов и лечебных сывороток и для получения гипериммунных сывороток.

  4. Разработать современные биотехнологические процессы производства препаратов (диагностикумов, вакцин, лечебных сывороток) и иммунологические методы их оценки (ИФА, ПЦР).

5. Оценить экологическую, экономическую и социальную эффективность использования предложенных методов и биотехнологий и иммунологических методов.

1.3. Научная новизна. Усовершенствованы и разработаны

- биотехнологические процессы и современные иммунобиологические методы анализа при промышленном производстве ветеринарных препаратов, включающие:

- впервые разработан «Набор для ретроспективной ИФА-диагностики инфекционного ринотрахеита КРС»;

- впервые разработан «Набор для ранней ИФА-диагностики ринотрахеита КРС»;

- впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса бешенства, штамм «Щелково-51», репродуцированного в культуре клеток ВНК-21;

- впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса ИРТ, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80 для КРС, изучены свойства вируса и определены условия и сроки его хранения без потери биологической активности;

- разработаны схемы иммунизации лабораторных животных, обеспечивающие получение высокоактивных и специфических гипериммунных сывороток к вирусу ИРТ КРС и анти-IgG мыши сывороток при разработке тест-системы для индикации антигенов вирусов бешенства и ИРТ КРС;

- впервые разработан метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов на первичнотрипсинизированных культурах клеток при изготовлении гипериммунных диагностических и лечебных сывороток;

- впервые получена гипериммунная сыворотка для создания пассивного иммунитета у свиней против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза с использованием волов как продуцентов, а в качестве антигенов бралась культура Pasterella multocida серовариантов А штамм 1231, В штамм 681 и Д штамм Т-80, Haemophilus pleuropneumoniae серовара I штамм ГУ-19 и серовара П штамм 5870 и Streptococcus suis серовара II (штамм Касли);

- впервые изобретен способ размножения стромальных клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов, включающий в себя их выделение, адаптацию и культивирование вне организма, а также интеграцию (вшивание) в них генетического вектора. Размножение осуществляли в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота, энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма;

- впервые установлено, что кормление перепелок сбалансированным рационом с добавлением циалитов значительно увеличивает выход культур клеток из перепелиных эмбрионов.

Новизна полученных результатов подтверждена 6 патентами, в т.ч. 2 заявками (Патент № 2184568 от 10.07.20002г., Патент № 2196336 от 10.01.2003г.,  Патент № 2196609 от 20.01.2003г., Патент № 2196820 от 20.01.2003г. и Заявки на патент № 2007123692 от 20.06.2007г. и №2007142025 от 15.11.2007г.).

1.4. Практическая ценность работы. Результаты проведенных исследований вошли в НТД производства диагностикумов и лечебных  ассоциированных сывороток. 

Результаты проведенных исследований использованы при разработке технологии биопрепаратов и включены в 6 нормативных документов на изготовление, контроль и применение диагностикумов ИРТ, ПГ-3, бешенства и хламидиоза, ИФА, РСК, РИФ, РДП и ассоциированных сывороток против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза.

Все препараты внедрены в производство и ветеринарную практику или производятся и применяются в ветеринарной практике в порядке широкого производственного опыта за период 2001-2007 гг.

За период с 2001 по 2007 гг. выпущены для практического применения в АПК России диагностикумы против вирусов ИРТ ИФА – 500, бешенства РДП – 3500, РИФ – 4000 и хламидиоза РСК – 15000 наборов.
1.5. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Результаты усовершенствования и разработки биотехнологических процессов с использованием современного оборудования и современных иммунобиологических методов при промышленном культивировании микроорганизмов, культур клеток и вирусов и контроля репродукции вирусов и микроорганизмов при промышленном выпуске ветеринарных биопрепаратов.

2. Результаты исследований по использованию при промышленном производстве ветеринарных препаратов современных  методов и оборудования для разделения, очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов  и выделение специфических антигенов и методы их оценки.

3. По результатам оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре клеток и практическое использование этого метода для получения гипериммунных сывороток в процессе разработки и промышленного выпуска диагностикумов ИФА ИРТ, РДП и РИФ бешенства, ИРТ, ПГ-3, хламидиоза и ассоциированных лечебных сывороток (гемофилез, стрептококкоз и пастереллез).

1.6. Апробация. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международных научных конференциях - Москва (1999-2001 гг.), Киев (2001 г.); Всероссийской научно-практической конференции - Щелково (2000г.); Всероссийской научно-производственной конференции - Ставрополь, (2000г.); Международных научно-практических конференциях  - Покров (2000-2002гг.), Новосибирск (2002 г.), Щелково (2003, 2005, 2006 гг.), Москва (2003, 2006 гг.), Крым (2007 г.); Международной биологической научно-практической конференции – Москва (2000г.); Международных научно-практических конференциях молодых ученых – Щелково (2001, 2002, 2004 гг.); заседании секции ветеринарной медицины и биотехнологии - Щелково (2006-2007гг.);  на заседаниях ученого совета ВНИТИБП - Щелково (2000-2007гг.).

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 68 научные работы, в том числе  6 патентов (из них 2 заявки на патент) и 3 монографии.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 28 таблиц и 36 рисунков. Список литературы включает 612 наименований, из которых 132 отечественных и 480 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие Л.К. Эрнст, Е.Э. Школьников, Б.В. Соловьев, В.С. Иванов, А.И Гуславский, Э.Я. Сазанова, сотрудники отделов молекулярная биология и иммунология и оказывали практическую и консультативную помощь, за что приносим им сердечную благодарность. Выражаем искреннюю признательность за помощь сотрудникам, перечисленным в качестве соавторов в списке публикаций по теме.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

2.1.1. Культуры клеток и эмбрионы птиц. В работе использовались перевиваемая линия клеток ПТ-80 (почки теленка) и ТАУЭР, культура клеток ВНК 21/13,  первичные культуры клеток СП (селезенки поросенка) и семенников, нормальных и обработанных ретровирусом, перевиваемые линии клеток СПЭВ, первичнотрипсинизированные культуры клеток почки, легкого и трахеи эмбриона коровы. Использовали СПФ-яйцо, производимое на ФГУП «Щелковский биокомбинат». Инкубирование яиц проводили в промышленных или лабораторных инкубаторах.

2.1.2. Животные. Использовали морских свинок, мышей, кроликов разных возрастов, свиней, овец и крупный рогатый скот.

2.1.3. Питательные среды и растворы. Использовали культуральные среды Игла, Эрла, 199, полную среду Игла модифицированную Дульбеко (ДМЕМ) (Gibco, Панэко), бессывороточная среда Хенкса с 0,5% лактальбумином; сыворотка КРС, фетальная сыворотка телят и коров (НПО «Вектор», Панэко). Фосфатно-буферный раствор  (ФБР)  в различных модификациях готовили по стандартным технологиям, растворы бикарбоната натрия, трипсина («Дифко»), 2,5% лактальбумин, ферменты, гормоны, полиэтиленгликоль (ПЭГ) разной концентрации, физраствор.

2.1.4. Масла и эмульгаторы. Использовали масла: вакцинное, ТУ 38101307-72, основы РМ (ГОСТ 15819-70) и АМГ-10 (ГОСТ 6794-75), Ангарское, Маркол 52 (фирма «Эссо», США) и эмульгаторы: ланолин, ФС 42-2520-88, сорбитанолеат, ТУ 18-16-9-81, Монтанид 888 и 103 (фирма «Сеппик», Франция).

2.1.5. Штаммы. Использовали фиксированного вируса бешенства штамм «Щелково-51», вируса ИРТ КРС штамм «ТК А» (ВИЭВ) В2, вируса хламидийного штамм «Улетово», культуры Pasterella multocida серовариантов А «штамм 1231», В «штамм 681» и Д «штамм Т-80», Haemophilus pleuropneumoniae серовара I «штамм ГУ-19» и серовара П «штамм 5870» и Streptococcus suis серовара II («штамм Касли»), респираторно-синцитиального вируса штамм «Randall», вируса ПГ-3 штамм «3КСМ».

2.1.6. Оборудование, технология и технологические средства контроля

Для проведения экспериментов по суспензионному культивированию клеточных культур использовали газовый стерилизатор питательных сред ЕТО фирмы Pharmatec (Германия), спиннеры магнитного типа с блоком управления (t, рН, рО2, рСО2) с перемешиванием фирмы Bellco Biotechnology (США), установка для увеличения клеточной культуры фирмы Pharmatec (Германия), счетчик колонии клеток «Bacfronic» фирмы NBS (США), сосуды Дюара фирмы Forma Scientific, Ins (США) и  низкотемпературный холодильник фирмы Forma Scientific, Ins (США), биореакторы АНКУМ-2 (Россия) и «Электролюкс» (Швеция), микропроцессорные управляющие комплексы «Биоцикл МП 01.01»; микроносители Cytodex-3 (НПО «Биолар», г. Олайне) и ВИ-3, изготовляемых во ВНИТИБП по разработанной технологии (Патент РФ № 1255026).

В процессе суспензионного культивирования культур микроорганизмов, клеток и вирусов автоматически контролировались и регулировались основные физико-химические параметры – температура культивирования (tк) и стерилизации биореактора, арматуры и трубопроводов, рН, рО2, еН, давление и вакуум.

В процессе исследований контролировали стерильность питательных сред и растворов общепринятыми методами на МППБ, МПБ, МПА и среде Сабуро.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Культивирование культур клеток и вирусов в биореакторах

в суспензии и на микроносителях

Глубинное суспензионное культивирование в биореакторе

Управляемое суспензионное культивирование клеток ПТ-80, ВНК-21/13 проводили в биореакторе емкостью 25 л, разработки ИркутскНИИхиммаш в комплекте с микропроцессорными управляющими комплексами «Биоцикл» и ин­дивидуальными модулями технологической обвязки и управления, разработки и изготовления ВНИТИБП и НПО «Промавтометика».

Контроль и регулирование процесса культивирования осуществлялся по основным техно­логическим параметрам, приведенным в табл. 1.

Использовали традиционные питательные среды. Индекс пролиферации клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 был соответственно 2-4 и 3-6, а накопление клеток в 1 см3 – 0,9-1,3⋅106.

Таблица 1

Основные  контролируемые и регулируемые параметры глубинного 

процессов культивирования клеток животных в биореакторах

  Наименование

параметра

  Единица

  измерения

Текущее

значение

Допустимые

отклонения

Температура культивирования

Температура стерилизации

Температура в термостате

Расход воздуха

рН, ед⋅рН

Скорость вращения

мешалки

Концентрация СО2

Резерв

еН

рО2

рСО2

Давление в биореакторе

Давление в рубашке

биореактора

  Град0С

  «

  «

об/об мил

об/мин

 

%

мв

кПа

кПа

ати

ати

37,35

122,00

38,05

  0,5-2,0

  7,20

  45,84

  1,16

63,60

  16,01

5,71

0,29

0,128

  +0,50С

  +1,00С

  +0,30С

  +1%

+0,1ед рН

  +1%

 

+0,05

+10 мв

  +10 %

  +10 %

  +5%

  +10%

Культивирование клеток в биореакторе на микроносителях

При крупномасштабном выращивании культур клеток и вирусов основным критерием продуктивности процесса является обеспечение физиологических потребностей культур клеток, которые зависят от применяемого способа культивирования. Во ВНИТИБП разработаны процессы крупномасштабного культивирования клеток в биореакторах различных конструкций с модулем технологической обвязки и блоком автоматического управления основными параметрами (tк, tст, рН, еН, рО2, рСО2, давление, расход воздуха на аэрации и др.). На автоматизированных блочно-модульных установках отработаны оптимизированные режимы выращивания клеток линии ПТ-80 на микроносителе «Cytodex» (табл. 2).

Таблица 2

Средняя продуктивность  различных систем

  №

п/п

Системы культивирования

  Съем клеток с

1 мл питательной 

среды

1

Биореактор с перемешиванием и протоком среды

5⋅106

2

Эрлифтный биореактор

5⋅106

3

Биореактор с биофильтром и протоком среды

7⋅106

4

Культивирование в микрокапсулах, микроносителях типа «Cytodex»

107 (перфузия)

5

Биореактор с пористыми ячейками

108 (перфузия)

6

Биореактор с полыми волокнами

108 (перфузия)

7

Мембранные биореакторы (керамический модуль)

109 (перфузия)

культивирования клеток животных

Для практической реализации процесса культивирования клеток животных и вирусов выбран метод культивирования на микрокапсулах и микроносителях. 

В результате 5-ти культивирований перевиваемых клеток ПТ-80 на микроносителе «Cytodex-3» при  среднем времени культивирования 72 ч средний индекс пролиферации был равен 2.

В целях масштабирования процессов культивирования стадию адсорбции клеток на микроносителе осуществляли непосред­ственно в биореакторах. При отработке промышленной технологической схемы адсорбции клеток на микроносителе в 25 л биореакторе установлено, что опти­мальной посевной концентрацией клеток ПТ-80 является 8-12 кл на микроносителе. Рас­пределение клеток на поверхности микроносителя в конце стадии адсорбции через 2,5-3 часа после добавления в биореактор клеточной суспензии оказалось более равномерным при посевной концентрации 10-12 кл на микроносителе. При этом количест­во прикрепившихся к микроносителю клеток составляло около 95%. Теоретически рас­считанный при такой посевной концентрации индекс пролиферации клеток ПТ-80 может достигать 6-8, максимальный, полученный в наших опытах, со­ставлял 4,2.

Особое внимание при выборе конструкции биореактора для куль­тивирования клеток животных и вирусов уделяли харак­теристикам их конструктивных соотношений, материалам узлов биореактора и гидродинамическим условиям культивирования при гарантированном соблюдении асептических условий при дли­тельном культивировании путем сравнения существующих систем культивирования.

2.2.2. Изучение основных факторов, влияющих на гибель клеток при глубинном культивировании в биореакторах

Гибель клеток является основной проблемой при глубинном суспен­зионном культивировании в биореакторах. Гибель клеток в биореакторе, при прочих равных условиях, может быть вызвана гидродинамическими силами, которые могут быть объяснены влиянием аэрации с использованием барботажных устройств. Процесс аэрации является необходимым для снабжения клеток достаточных количест­вом кислорода и углекислого газа. Влияние аэрации можно разделить на влияние са­мих перемешиваемых потоков среды и поверхности раздела фаз газ-жидкость. Основ­ные потоки перемешивания создаются за счет поднятия газовых пузырьков. Кроме влияния  потоков  при перемешивании, образовании поверхности контакта газ-жидкость и ее разрушение происходит в процессе образования пузырьков при диспер­гировании газа и, соответственно, при переходе пузырька в поток жидкости. Также, разрушение пузырька происходит и при образовании пены.

Если пузырьки образуются в месте барботирования, первоначально они не покрыты защитной пленкой (поверхностно-активных веществ-ПАВ). В период образова­ния и подъема пузырьков, ПАВ адсорбируется на поверхность пузырька.

До достижения критического положения взаимодействие клеток-пузырьков приводит к немедленной гибели клеток. Чем больше молекул ПАВ адсор­бируется пузырьком, тем насыщенней он становится и клетки могут далее быть адсор­бируемыми пузырьком не будут поврежденными. Адсорбированные клетки могут передвигаться по поверхности пузырька. Если пузырек полностью насыщен, то новые клетки больше не смогут примкнуть к нему, а уже адсорбированные пузырьком поднимаются вместе с пузырьком на поверхность, где они могут затем погиб­нуть, если пузырек лопнет.

Скорость гибели клеток является простой линейной функцией от интенсивности аэрации F/V(F – скорость потока газа, V – рабочий объем биореактора), для пузырьков диаметром от 4 до 5,5 мм. Эксперименты по барботированию, при которых варьировалось время пребывания пузырьков в куль­туральной жидкости, четко показали, что гибель клеток в биореакторе не всегда вызывается всплыванием пузырьков. Влияние размера пузырьков и их слияния на скорость гибели клеток требует дальнейшего изучения. Хорошее защитное действие ПАВ от гидроди­намических напряжений сдвига при барботировании так же эффективно, как и при пе­ремешивании, предлагается в качестве основного метода и при масштабировании про­цесса выращивания клеточных культур в биореакторах.

2.2.3. Культивирование клеток сперматогоний

Предложена и испытана четырехпериодная система суспензионного культивирования сперматогоний свиньи.

В первом периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 100 мл, при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза клеток составляла 5-106 кл/мл.

Культивирование во втором периоде суспензионного культивирования осуществлялось в спиннере емкостью 200 мл, при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза клеток составляла 109 кл/мл.

В третьем периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 500 мл при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза жизнеспособных клеток составила 107 кл/мл.

Прежде, чем приступить к четвертому периоду суспензионного культивирования сперматидов, было проведено концентрирование их заданной дозы на установке BDF-1 с использованием биофильтра Sulzer с 1010 кл/мл до концентрации 5х1015 кл/мл, что соответствует приведенной технологической схеме процесса сперматогенеза клеток семенника поросенка. После концентрирования суспензионное культивирование осуществлялось на спиннере емкостью 1000 мл, коэффициент заполнения 0,5. Концентрация сперматидов составила 5x1015 кл/мл.

Контролируемыми и регулируемыми параметрами явились: температура культивирования, скорость вращения мешалки, рН, еН, рО2, рСО2  и концентрация сперматогоний. Алгоритм управления приведен в табл. 3.

Наиболее сложным и определяющим является четвертый период сперматогенеза в культуральной системе.

С целью создания трансгенных свиней оптимизированные параметры культивирования позволяли получать 5-10% живых клеток, включая сперматогонии, несущие дополнительную информацию.

Таким образом, показана принципиальная возможность поэтапного суспензионного культивирования клеток семенника поросенка в процессе сперматогенеза.

Таблица 3

  Алгоритмы управления процессом  суспензионного 

культивирования сперматидов

  Период 

сперматогенеза

Параметр

  Уровень

  поддержания

Первый период

Температура

рН

  еН

рО2

рСО2

  35+0,5°С

7,0-7,1+0,01

  -200мв+10% 

  40% нас. + 10%

5%нac. + 10%

Второй период

Температура

рН

  еН

рО2

рСО2

35+0,5°С

  7,2+0,01

  -100мв+10%

  40% нас. +10% 

  5%нас.+ 10%

Третий период

Температура

рН

  еН

рО2

  рСО2

35+0,5°С

  7,1+0,01

  -200мв+10%

  60% нас. + 10%

  7%нac.+ 10%

Четвертый период

Температура

рН

  еН

рО2

  рСО2

35+0,5°С

  7,2+0,01

-200мв+10% 

60%нас.+10%

  7%нас.+ 10%

Кроме того, работы по оптимизации питательных сред на втором периоде и особенно на третьем и четвертом периодах сперматогенеза, осуществляемого нами способом суспензионного культивирования, являются более сложными и требуют дальнейшего изучения.

2.2.4. Культивирование и накопление вирусов бешенства, ИРТ, ПГ-3 при глубинном культивировании в биореакторах

При культивировании вирусов ИРТ, ПГ-3 и бешенства с использованием культур клеток ПТ-80 и ВНК 21/13 в биореакторах по отработанным оптимальным параметрам в отделах вирусологии и молекулярной биологии в 2001-2004 гг. были получены данные, представленные в таблице 4.

Таблица 4

Результаты накопления вирусов при их культивировании

в биореакторах суспензионным способом

Культура

клеток

Вирус

n

Титр в

ИФА

lg LD50/мл

ПТ-80

ИРТ

5

1:512

6,9+0,2

ПГ-3

5

1:563

7,4+0,1

ВНК 21/13

бешенства

7

1:512

6,3+0,2

Результаты свидетельствуют о высоком накоплении вирусных антигенов, полученных при культивировании в биореакторах суспензионным способом.

2.2.5. Культивирование пастерелл, гемофилл и стрептококков в биореакторах

В работе использовали производственные штаммы Pasteurella multocida А-1231, В-681 и Д-Т-80, Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae №5870 и ГУ-19, Streptococcus zooepidemicus П-2082 и Streptococcus suis "Касли", Salmonella typhimurium № 415 и Salmonella choleraesuis № 370. Питательные среды для выращивания вакцинных штаммов готовили по дей­ствующим инструкциям на монопрепараты, а их выращивание осуществляли по разработанным нами режимам культивирования в лабораторных фермен­терах АНКУМ-2М, оснащенных системами автоматического контроля и регу­лирования основных параметров культивирования (температура, рН, еН и рО2).

В процессе работы культуры пастерелл, гемофильных бактерий и стреп­тококков исследовали по следующим показателям: морфология, культуральные свойства, оптическая плотность.

Культуры гемофильных бактерий инактивировали формалином в ко­нечной концентрации 0,2% при температуре 18-22°С в течение 5-6 суток и концентрировали до концентрации 20 млрд.м.т/мл методом центрифугирова­ния.

Культивирование пастерелл (P. multocida серовариантов А (шт. 1231), В (шт.681) и Д (шт. Т-80)) проводили реакторным способом на Щел­ковском биокомбинате в соответствии с режимом, разработанным сотрудни­ками отдела микробиологии ВНИТИБП.

Штамм P. multocida 115-й, получен­ный из ВГНКИ, культивировали в усовершенст­вованной питательной среде на основе перевара Хоттингера (ПХ).

Концентрация культур производственных штаммов по окончании про­цесса выращивания (10-12 час) была 22 ± 2 млрд.м.т./мл.

Культуры пастерелл инактивировали формалином в конечной концен­трации 0,3% при температуре 37°С в течение 24 часов и концентрировали ме­тодом центрифугирования на центрифуге ОТР 101 - К1 при q = 12000.

В таблице 5 и на рисунке 1 представлена динамика накопления H.pleuropneumoniae (шт. 5870 и ГУ-19) в процессе культивирования.

Таблица 5

Динамика накопления гемофилъных бактерий в процессе

  культивирования (n = 3)

Время культивирования (час)

  Концентрация микробных клеток млрд.м.т./мл

шт. 5870

шт. ГУ-19

1

2345678

0,7 ± 0,2 1,0 ±0,1

4,5 ±3,6 7,4 ± 2,0 9,3 ± 0,2

  10,4 ±0,9 

10,7 ±0,7 

10,7 ±0,7

0,5±0,1

0,9 ±0,1

1,8 ±0,3

6,7 ±1,2

9,7 ±1,6

11,9 ±2,1

11,9 ±2,1

11,9 ±2,1

Фаза логарифмического роста начинается с 2-х часов и заканчивается к 5-ти часам культивирования. К 6-7 часам культуры вступают в стационарную фазу роста.

14

12 

10 

8

6 2-

4  -1

1 2 3  4  5  6  7  8

  Рис. 1. Динамика накопления гемофил штамм ГУ-19 (1) и штамм 5870 (2) в процессе культивирования.

Культуры штаммов 5870 и ГУ-19 имели типичную для своего вида микроорганизмов морфологию, культуральные и биохимические свойства. У гемофильных бактерий наблюдали выраженную капсулу.

Результаты исследований отражены в табл. 6, из которой видно, что при управляемом по еН, рН, рО2 и концентрации глюкозы культивировании длительность фазы приспособления как по оптической плотности, так и по количеству живых бак­терий значительно короче, максимальная удельная скорость роста выше, чем при культивировании по методике выращива­ния пастерелл, предложенной ВНИВИП (контроль). Макси­мальное накопление жизнеспособных бактерий при управляе­мом выращивании наблюдалось через 8 ч роста (по методике ВНИВИП - через 10-12 ч) и составило в среднем: 38,4 млрд/см3, что почти в З раза выше максимального накоп­ления, полученного при контрольном режиме выращивания (13,7 млрд/см3). Изучение морфологии и ультраструктуры пастерелл по­зволило сделать вывод о наличии коррелятивных связей между режимом, продолжительностью культивирования и анатомическими особенностями микробных клеток в по­пуляции.

Культуральные и биохимические свойства были типичными для пастерелл штамма 115: при росте в бульоне наблюдалось равномерное помутнение среды, на агаре - мелкие просвечи­вающие колонии. На средах

Таблица 6

Показатели процесса периодического культивирования пастерелл штамма № 115

Условия культивирования

Показатели

Продолжительность фаз роста, ч

Максимальная удельная ско-рость роста, ч-1

Максимальное накопление, млрд/см3

лаг-фаза

оп

живые микр.кл.

оп

живые микр.кл.

оп

живые микр.кл.

оп

живые микр.кл.

Усовершенствованная питательная среда на основе ПХ и экпериментальный режим

Среднее значение

Контроль (методика ВНИВИП)

Среднее значение

1,00

0,25

0,60

0,55

0,60

2,25

2,35

2,30

1,00

1,00

2,00

1,75

1,44

2,40

1,90

2,15

3,25

3,25

3,05

3,05

3,15

3,50

2,90

2,15

3,50

3,00

2,70

2,00

2,80

4,10

3,55

3,82

1,20

1,38

1,23

1,35

1,29

0,92

1,15

1,03

1,68

1,47

1,73

1,61

1,62

1,15

1,15

1,15

1,25

16,50

20,50

16,40

16,16

4,75

4,80

4,81

42,10

42,10

48,90

20,60

38,40

16,50

10,90

13,70

Гисса отмечалась ферментация глюкозы, сахарозы, сорбита, маннита без образования газа и отсутствие ферментации лактозы. Пастереллы образовывали индол и сероводород.

С целью повышения продуктивности процесса получения бактери­альной массы использовали непрерывное (хемостатное) культивирование.

Условия культивирования - температуру, рН и рО2 поддерживали на оптимальных, ранее определенных нами уровнях.

При другом режиме выращивания (скорость разбавления - 0,7 1/час и So= 3 г/л) культура пастерелл была ''растущей", более крупной, чем при скорости разбавления 0,4 1/час, в основном, эллипсоидной формы.

Во всех исследованных режимах непрерывного культивирования рост пастерелл был лимитирован глюкозой, а биохимические свойства со­ответствовали паспортным данным.

После 4 ч культивирования сальмонелл шт. ТС-177 по ранее действовавшей НТД наблюдалась фаза замедления роста. После подключения мембранного биологического реактора (МБР) концентрация жизнеспособных сальмонелл возрастала еще на протяжении 8 ч. Выращивание культивирования позволяло продлить рост и увеличить накопление жизнеспособных сальмонелл в 3-4 раза.

После этого в МБР поддерживался оптимальный режим культивирования, что позволило еще на 4 ч продлить активную фазу роста и увеличить концентрацию жизнеспособных сальмонелл еще более чем в 7 раз. Коэффициент разбавления питательной средой при этом поддерживался в пределах 0,5-0,7 1/ч.

2.2.6. Современные оборудование и методы очистки и концентрирования питательных  сред, антигенов, вирусов и микроорганизмов

Использовались высокоэффективные аппараты для разделения, очистки и концентрирования полидисперсных жидких систем методами сепарирования, центрифугирования, фильтрования и ультрафильтрования. Использованы новые жидкостные сепараторы и осадительно-фильтрующие центрифуги на бесприводной основе с высокими технико-экономическими показателями. Теоретически и практически подтверждено, что применение фильтрующих перегородок в роторе и осадительно-фильтрующей центрифуги и сепаратора-разделителя позволяет улучшить качество разделения жидких биологических систем.

Очистка и концентрирование на примере вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита

При проведении физико-химических исследований структуры вирусов, создания диагностикумов, получения специфических антисывороток, проведения генно-инженерных работ необходимы очищенные и концентрированные препараты.

С целью определения оптимальных условий очистки и концент­рирования культурального вируса бешенства был испытан ряд мето­дов.

Определяли условия осаждения вируса ПЭГ с молекулярной массой 1000, 3000, 6000 и 20000 Дальтон в различных концентрациях: 2,5, 5,0, 7,5 и 10,0.

Для концентрирования вируса применяли метод ультрафильтрации, позволяющий свести к минимуму необходимость использовать дорогостоящее оборудование. Он дает возможность работать с большими объемами вирусного материала. Метод основывается на отделение вируса от культуральной жидкости с помощью полупроницаемых мембран с определенной степенью пористости.

Наиболее широко применяемым способом получения вирусов в чистом виде является центрифугирование дифференциальное, равновесное и в градиенте плотности. При высокоскоростном центрифугировании 90 тыс.g. полное осаждение вируса происходило за 6 часов.

Для концентрирования вируса бешенства использовали равновесное центрифугирование на «подушке» сахарозы(55%), хлористого цезия (22%) и глицерина (80%). Проводили центрифугирование при 161 тыс.g на ультрацентрифуге в течение 4 ч.

На основании полученных результатов была составленна схема получения очищенных и концентрированных препаратов вируса бешенства. По предлагаемой схеме очистки и концентрирования вируса бешенства удается получить высокоочищенный  на 99,99% вирус.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса ИРТ КРС были испытаны те же принципы выделения вирусов из суспензий.

Результаты получены аналогичные как при выделении вируса бешенства.

2.2.7. Инактивация вируса бешенства

В работе был использован вирус бешенства, штамм «Щелково-51», репрдуцированный в культуре клеток ВНК-21/13. Вирус инактивировали при различной температуре, фенолом и β-пропиолактоном.

Термическая инактивация

Прогревание при +560С оказывало влияние на гемагглютинирующую активность вируса. Через 3 ч после начала обработки титр гемагглютинирующей активности снижался с 1:16 (в исходном вирусном материале) до 1:12. К 4-му часу инактивации он снижался в 2 раза (до 1:8) и далее к 5-му часу - до 1:4. На комплементсвязывающую и преципитирующую активности прогревание при температуре 56°С в течение 6-ти часов не оказывало влияния. Биологические свойства вируса, помещенного в условия температуры 62°С, проверяли через 5, 10, 15 и 30 минут и далее через каждые 30 минут до 4 ч инкубации, а затем через 5 и 6 часов с момента начала обработки. Было установлено, что в результате воздействия температуры 62°С инактивация вируса шла быстрее, чем при 56 С. Уже через 45 минут происходила полная потеря инфекционности вируса бешенства. Кроме того, наблюдалось резкое снижение гемагглютинирующей активности препарата. Титр гемагглютинирующей активности снижался с 1:16 в исходном вирусе до 1:4 в прогретом препарате. При дальнейшем прогревании титр гемагглютинирующей активности постепенно снижался и к 210-240 минуте после начала обработки был равен 0. Комплементсвязывающая и преципитирующая активности вируса в течение всего опыта оставались неизменны.

Как видно из приведенных данных, скорость тепловой инактивации препаратов культурального вируса бешенства зависела от температуры.

Химическая инактивация

При изучении влияния фенола на комплементсвязывающую активность вируса бешенства было установлено, что активность вируса в этой реакции, по сравнению с инактивированным вирусом, в течение 72 ч не изменялась при +4°С. С повышением температуры до 20°С через 24ч инкубации наблюдалось снижение титра комплементсвяывающей активности в 2 раза. Через 48 и 72 ч дальнейшего понижения титра не наблюдалось как при +20°, так и при +37°С.

Концентрация фенола и температура инактивации не влияли на титры гемаггрлютинирующий активности вируса бешенства. Титры сохранялись в пределах 1:12-1:16.

Титр преципитирующей активности оказывает влияние увеличение концентрации фенола. Если через 24 ч инкубации при концентрации фенола 0,25% титр не изменялся и был равен исходному 1:28, то при добавлении фенола в концентрации 0,5%-0,75%- 1,0% титр снижался до 1:10, 1:8 и 1:4, соответственно, при всех температурах. Титр преципитирующей активности, снижающийся с 1:28 до 1:4 при обработке 1,0% фенолом в течение 24 ч, далее оставался неизменным. При обработке препаратов вируса всеми концентрациями фенола преципитирущая активность снижалась к 72 ч до 1:12-1:4 при всех температурах.

На основании полученных нами данных были установлены оптимальные режимы инактивации вируса бешенства фенолом: 0,75% концентрация при температуре +20°С в течение 48 ч или при +37°С в течение 24 ч.

Результаты опытов показали, что иммуногенность препаратов, инактивированных 0,75% фенолом при температуре +20°С в течение 48 ч, в 2 раза превышает иммуногенность препаратов, обработанных при +37°С фенолом в такой же концентрации и индекс иммуногенности соответственно равнялись 0,68+0,07 и 0,30+0,10 (n=9).

Полученный препарат гемагглютинина обрабатывали β-пропиолактоном в тех же условиях, что и цельный вирус, учитывая период полураспада пропиолакто-на в водном растворе (при +37°С 24-32 мин, +25°С 210 мин, +4°С от 16 до 20 часов), β-пропиолактон в максимальной концентрации 1:2000 при темпера­туре +37°С в интервале 15-120 минут не влиял на ГА-активность гемагглютинина, которая оставалась на уровне исходной. При инактивации вируса в условиях температуры +4° и +20°С также не наблюдалось потери ГА-активности белкового компонента в течение всего срока наблюдения. Ранее мы установили, что используя β-пропиолактон в концентрации 0.05% (1:2000), можно получить неинфекционные и иммуногенные препараты вируса бешенства.

На основании полученных данных мы предположили, что β-пропиолактон, используемый для инактивации вируса бешенства в макси- мальной концентрации 0.05%, взаимодействует с основаниями РНК, лишая тем самым вирус инфекционности. Были проведены опыты по выяснение взаимодействия β-пропиолактона с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями РНК: аденозином, гуанозином, цитидином и уридином.

Контроль за ходом реакции осуществляли хроматографически и спектрофотометрически (по изменению характера спектра реакционной смеси во времени) при длине волны 200-350 нм. В качестве контрольного спектра использовали спектр немодифицированного аденозина.

Для характеристики продукта реакции β-пропиолактона с аденозином полу­ченное вещество выделяли методом препаративной тонкослойной хроматографии в системах А, В и С. Вещество характеризовалось хроматографической подвижностью Rf на SiО2.

β-пропиолактон инактивирует культуральный вирус бешешнства полностью и необратимо. На выделенный структурный компонент вируса бешенства – гемагглютинин, ответственный за иммуногенность, β-пропиолактон не оказывает влияния. Он взаимодействует с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями вирусной РНК. Изменения в РНК, вызываемые взаимодействием β-проипиолактона с основаниями, приводит к ее инактивации.

2.2.8. Биологические свойства культурального вируса бешенства

В настоящей работе представлены результаты изучения биологических свойств культурального вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, штамм Щелково-51 вируса: гемагглютинирующие (ГА), комплементсвязывающие (КС), преципитируюшие (Пр) и иммуногенные (Им), а также влияния таких физико-химических факторов, как обработка вируса ферментами РНК-аза, трипсин и рН среды.

Для сохранения биологических свойств вируса бешенства  оптимальными являются пределы рН 6,0-8,0. Вирус обладает комплементсвязывающей активностью при рН 6,0-8,0, гемагглютиниру- ющей -  при рН 3,0-9,0, преципитирующей - при рН 5,0-9,0.

  Препараты вируса обрабатывали трипсином в концентрации 0,05, 0,10 и 0,15% и РНК-азой в концентрации 0,05, 0,02 и 0,01%. Инкубацию проводили 30 минут при +37 С. Затем в обработанных ферментами препаратах вируса определяли титр инфекционности, комплементсвязывающей, гемагглютинирующей и преципитирующей активности.

Трипсин и РНК-аза оказывают влияние на инфекционность вируса бешенства. Трипсин в концентрации 0,05% практически не снижает инфекционность вируса. С повышением концентрации фермента до 0,10% титр инфекционности снижается на 1,75 lg, а при обработке вируса 0,15% трипсином происходит снижение его до 0. РНК-аза существенно снижает инфекционность в пределах более 2 lg (с 6,25 до 4,00 lg) при всех изученных концентрациях.

Оба эти фермента не влияют на его гемагглютинирующую и преципитирующую активность. РНК-аза не снижает также и комплементсвязывающую активность, в то время как трипсин разрушает ее.

2.2.9. Очистка Ig

Иммуноглобулин G из сыворотки крови животных выделяли осаждением 33 % сернокислым аммонием. Полученную глобулиновую фракцию сыворотки обессоливали гельфильтрацией на сефадексе G-25 в колонке К 26х70, уравновешенным 10 мМ трис-HCI буфером, рН 8,0.

Выход фракций контролировали спектрофотометрически по оптической плотности при длине волны λ=280 нм (ОП280) и объединяли фракции с ОП280 больше 1,0. Затем объединенные фракции наносили на DEAE-Toyopearl 650 М, уравновешенный 25 мМ трис-HCI, рН 8,3 (колонка К 26х40).

Выход иммуноглобулина G КРС определяли, исходя из величины ОП280 объединенного элюата, по формуле:

ОП280

Выход IgG в мг = Vх--------  ,

1,31

где V – объем объединенного элюата;

ОП280 – оптическая плотность объединенного элюата;

1,31 – экстинкция раствора Ig G с концентрацией 1 мг/мл.

Выход очищенного иммуноглобулина составил 160 мг/мл. Чистоту препарата Ig G проверяли диск-электрофорезом в полиакриламидном геле – 7,5 % в трис-HCI буфере, рН 8,3.

Однородность и специфичность проверяли иммуноэлектрофорезом в слое 1 % агара «Дифко» на веронал-мединаловом буфере, рН 8,6.

Преципитирующую активность определяли по Оухтерлони. Полученный нами препарат давал полосу преципитации в разведении 1:256-1:512 и выше.

Таким образом, методом ионообменной хроматографии, получен высокоочищенный препарат Ig G КРС, необходимый для последующей гипериммунизации кроликов, с целью получения антисыворотки к Ig G КРС.

2.2.10. Разработка метода определения токсичности масляных адъювантов и их компонентов

При исследовании токсичности различных масляных адъювантов и их компонентов с помощью разработанного нами способа в сравнении со способом с использованием белых мышей, как более близкого к количественному способу оценки токсичности. В результате  проведенных  исследований  получили  результаты  токсичности различных масел, эмульгаторов и эмульсий, используемых в производстве биопрепаратов, на белых мышах и культуре клеток СП, представленных в таблицах 7-9.

Таблица 7

Токсичность эмульгаторов при исследовании на мышах и культуре клеток в монослое

Наименование

Результаты оценки на  мышах

ТЦД50/мл

пп

эмульгатора

АПМТ, г

ОПМТ,%

на культуре 

  клеток (lg)

1

Ланолин

6,6±0,4

70,2+4,5

2,1+0,2

2

Сорбитанололеат

6,1+0,3

59,4+3,2

3,4+0,1

3

Монтанид 888

7,1 ±0,4

75,5+4,3

1,6+0,1

4

Монтанид 103

7,3+0,4

77,7+4,3

1,5+0,1

5

Физ. раствор (контроль)

9,4+0,5

100,0±2,0

Таблица 8

Результаты реактогенности масла на мышатах и его токсичность на культуре клеток в монослое

№ пп

Наименование 

масла

Процент отека опытных лап (М+m), n = 5

На культуре кле-ток СП ТЦД50 (lg)

1

2

3

4

1

Вакцинное

83,0+2,0

1,8±0,2

2

Основа РМ

155,0+10,0

3,1+0,3

1

2

3

4

3

Основа АМГ-10

  165,0+7,0

3,4+0,3

4

Ангарское

80,0+2,0

1,7+0,2

5

Маркол 52

31,0±4,0

1,1±0,1

Таблица 9

Результаты реактогенности масляных компонентов в опыте на мышах и их токсичность на культуре клеток СП

№ пп

Наименование 

компонента масло+эмуль-

  гатор

Соотношение компонентов в адъюванте, %

Процент отека опыт­ных лап мышей (М + m, n = 5)

ТЦД50 lg

на культуре клеток СП

1

Ангарское Монтанид 103

90

  10

68,0+5,0

1,6+0,1

2

Ангарское Ланолин

85

15

68,0±4,0

2,0+0,2

3

Ангарское Сорбитанолеат

  90

10

83,0+6,0

3,1+0,3

4

Маркол 52 Монтанид 103

90

10

40,0+4,0

1,4+0,1

5

Маркол 52 Ланолин

85 15

41,0+4,0

1,8+0,2

6

Маркол 52 Сорбитанолеат

90

10

46+3,0

3,0+0,3

Из полученных результатов этих исследований видно, что между двумя способами оценки токсичности масляных адъювантов и их компонентов, с использованием белых мышек и культуры клеток СП в пробирках с монослоем, существует корреляция. Причем способ оценки токсичности с использованием культуры клеток СП в монослое в пробирках на один-два порядка чувствительней, чем в случае исследований на белых мышках.

2.2.11. Получение специфических гипериммунных сывороток для изготовления диагностикумов с использованием подобранных адъювантов по токсичности, которую определяли на культуре клеток

При получении специфических гипериммунных сывороток с целью изготовления из них диагностикумов использовали масляные адъюванты. Отбор менее токсичных, но обладающих высокой иммунизирующей активностью, проводили с использованием разработанного нами метода с использованием пробирок с культурой клеток СП в монослое. В таблице  10 приведены данные активности гипериммунных сывороток, полученных с применением отобранных адъювантов, при иммунизации вирусами ИРТ, ПГ-3, бешенства, РС, ящура, а также хламидиозными антигенами.

Таблица 10

Результаты активности гипериммунных сывороток

Вид животных

Кол-во голов

Антигены

Гипериммунные сыворотки

Опр. активность

Методы

КРС

5

Вирусов ИРТ

25600+6000

ИФА

КРС

5

ПГ-3

1:12800+2000

ИФА

Овцы

63

Бешенство

1:480+7

РСК

КРС

5

РС

1:12800+2000

ИФА

КРС*

5

Ящура тип А22

3,2+0,1 lg

РН

Овцы

45

хламидиоза

1:256-1:1024

РСК

Примечание:*- с вирусом ящура изучали иммуногенную активность вакцин с масляным адъювантом при ревакцинации животных.

Полученные данные позволили получать высокоэффективные специфические гипериммунные сыворотки для изготовления диагностикумов с использованием отобранных адъювантов на разных видах животных без заметных клинических изменений.

2.2.12. Способы получения лечебной ассоциированной гипериммуной сыворотки против пастереллеза, гемофилеза и стрептококкоза свиней с использованием различных видов животных

В последние ноды за рубежом изготавливается целый ряд вакцинных и сывороточных препаратов против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза, в том числе  и ассоциированных.

В нашей стране сывороточные препараты против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза не разработаны.

Значительный экономический ущерб, наносимый свиноводству гемофилезом, пастереллезом и стрептококкозом, и отсутствие эффективных специфических средств лечения и профилактики этих заболеваний послужило основанием для выполнения работы по разработке нового препарата – гипериммунной сыворотки против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза свиней.

Исследования по отработке схемы гипериммунизации и получению опытных партий сывороток против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза свиней проводили на Армавирской биофабрике.

Для этого были сформированы пять групп свиней по пять голов в каждой.

Гипериммунизацию свиней проводили путем внутримышечных инъекций возрастающих доз инактивированных концентрированных  гемофилезного, пастереллезного и стрептококкозного антигенов с интервалом в 2-3 дня. При этом антигены вводили раздельно в разные участки тела животного. Через 7-10 дней у свиней брали кровь, получали сыворотку и определяли ее активность в реакции агглютинации (РА). Были испытаны пять схем, отличающихся дозой антигенов и количеством инъекций (таблица 13).

Как показывает таблица 11 (схема 1) гипериммунизация свиней путем 10-ти внутримышечных инъекций в возрастающих дозах инактивированного концентрированного пастереллезного и гемофиллезного антигенов в общем количестве по 1000 млрд. микробных тел (м.т.) каждого антигена, стрептококкового – в общей дозе 1255 млрд.м.т. позволяет получить сыворотку с титрами антител в РА: к P. multocida A, D – 1:400, B – 1:800, к H. pleuropneumoniae 5870 – 1:320, ГУ – 19 – 1:640, к Str. suis Касли – 1:200.

Увеличение числа инъекций больше 10-ти и количества антигенов пастереллезного и гемофилезного больше 1000 млрд.м.т., стрептококкового больше 1255 млрд.м.т. (схема 2, 3) не привело к дольнейшему повышению титра антител сыворотки в РА.

Увеличение количества антигенов и числа инъекций нецелесообразно, так как оказывает дополнительную нагрузку на иммунную систему продуцентов и не выгодна с экономической точки зрения.

Таблица 11

Активность в РА сывороток против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней, полученных разными способами

Схема

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

6

Количество инъекций

10

11

12

8

7

Количество (млрд.микробных тел)

Пастереллы

Гемофилы

Стрептококки

1000

1000

1255

1220

1220

1475

1470

1470

1725

645

800

1000

510

700

800

1

2

3

4

5

6

Активность сыворотки в РА

P. multocida  A

В

D

H. pleuropneumoniae  5870

ГУ-19

Str. suis Касли

1:400

1:800

1:400

1:320

1:640

1:200

1:400

1:800

1:400

1:320

1:640

1:200

1:400

1:800

1:400

1:320

1:640

1:200

1:400

1:800

1:400

1:320

1:640

1:200

1:200

1:400

1:200

1:160

1:160

1:100

Уменьшение числа инъекций до 8-ми (схема 4) при уменьшении общего количества вводимых антигенов: пастереллезного до  645 млрд.м.т., гемофилезного – до 800 млрд.м.т., стрептококкового – до 1000 млрд.м.т., не привело к снижению титра антител в сыворотке.

Уменьшение числа инъекций до 7-ми (схема 5) при уменьшении общего количества вводимых антигенов пастереллезного – до 510 млрд.м.т., гемофилезного – до 700 млрд.м.т., стрептококкового – до 800 млрд.м.т. привело к снижению титров антител в полученной сыворотке в 2 раза.

Таким образом, сравнительная оценка 5-ти схем гипериммунизации свиней для получения сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней позволило предложить схему гипериммунизации путем 8-10-ти инъекций антигенов в общей дозе пастереллезного – 645-1000 млрд.м.т., гемофилезного – до 800-1000 млрд.м.т. и стрептококкового – 1000-1255 млрд.м.т. с интервалом в 2-3 дня. В виду разной реактивности продуцентов целесообразно проводить гипериммунизацию по циклам: 1-й цикл  - 8 инъекций, 2-й цикл – 2 инъекции. Животных, давших активную сыворотку после 1-го цикла, переводят в эксплуатационную группу, остальных подвергают второму циклу гипериммунизации, что экономически оправдано.

Предложенный способ апробирован с положительными результатами в производственных условиях на Армавирской биофабрике.

Разработку способа получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза,  стрептококкоза и пастереллеза свиней, включающего приготовление антигена из инактивированных и концентрированных культур Pasterella multocida серовариантов А, В и Д и Haemophilus pleuropneumoniae сероваров I и II,  Streptococcus suis серовара II (штамм Касли), грундиммунизацию и гипериммунизацию возрастающими дозами антигена с последующим крововзятием и выделением целевого продукта, отличающегося тем, что в качестве продуцентов использовали волов, при этом гипериммунизацию проводили 7-10-кратными внутримышечными инъекциями в общей дозе каждого антигена 1800-2400 миллиардов микробных тел с интервалом 2-3 дня, а грундиммунизацию осуществляют подкожно в разные участки тела двукратно сначала по 10-15 млрд микр. тел, а через 14 дней по 20-25 млрд микр. тел с добавлением 10 см3 гидроокиси алюминия. Промышленные серии лечебных сывороток на волах имели следующую активность, гарантирующую высокую лечебную эффективность.

Титры антител зависели от антигена и индивидуальных особенностей продуцентов. Средние титры антител в РА в отношении H. Pleuropneumoniae (шт. 5870 и ГУ-19) и Str. suis (Касли) составили 1:474 (1:80-1:640); 1:640 (1:320-1:1280) и 1:200 (1:100-1:400), соответственно.

Наибольший титр в РПГА наблюдался в сыворотках в отношении П. мультоцида серовариантв В 1:700 (1:320-1:1600). Титры антител в отношении П. мультоцида серовариантоа А и Д были 1:130 (1:40-1:256) и 1:139 (1:64-1:240), соответственно.

В процессе эксплуатации 10 продуцентов было получено 3 сыворотки-сырца, которые были объеденены в одну опытную серию объемом 75 л.

В таблице 12 представлены титры антител в РА и РПГА опытной серии сыворотки в сравнении с показателями ТУ.

Таблица 12

Титры антител в РА и РПГА опытной серии

П. мультоцида

Pleuropneumoniae

(РА)

Str. Suis

(РА)

А  В  Д

5870 ГУ-19

Касли

серия

1:120 1:512 1:120

1:320  1:320

1:300

ТУ

1:32  1:128  1:32

1:100  1:100

1:100

Опытная серия сыворотки была стерильна и безвредна.

Таким образом, контроль сыворотки показал, что по показателям стерильности, безвредности, активности полученная опытная серия сыворотки соответствует ТУ на препарат.

2.2.13. Динамика изготовления диагностических наборов в промышленных условиях

В течение последних 7 лет по нашим разработкам во ВНИТИБП были изготовлены и выпущены диагностикумы, представленные в таблице 13.

Таблица 13

Объем выпуска диагностикумов за 2001-2007 гг.

Наименова-ние диагнос-тикумов

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

1. Набор для диагностики бешенства в РДП

374

500

270

456

415

402

443

2. Глобулин флюоресцирующий

330

500

485

616

520

71

598

3. Набор для диагностики хламидиоза с/х ж-х

2150

3100

2400

2693

2000

649

2306

4. Набор для диагностики ИРТ КРС ИФА «Диарин-С»

200

229

230

408

120

120

120

2.2.14. Экономический и экологический эффект

Улучшение экологической обстановки происходило за счет уменьшения опасности распространения инфекционного материала с учетом усовершенствования промышленных технологий изготовления биопрепаратов и своевременной улучшенной диагностики, приводившей к более быстрому и точному диагнозу инфекций ИРТ, ПГ-3, бешенства, хламидиоза, и за счет проведения своевременных срочных ветеринарно-санитарных мероприятий, а также при лечении животных с использованием ассоциированной лечебной сыворотки против пастереллеза, гемофилеза и стрептококкоза.

Экономический эффект расчитывали при промышленном производстве биопрепаратов с учетом способа, описанного в монографии И.В. Тихонова (2007 г.), и расчитанного по методу М.г. Таршиса Т.А. Ломакиной (1991 г.) и составил 12 млн руб. в год.

3. Выводы

    1. Усовершенствованы и разработаны с использованием современного оборудования и технических средств механизации и автоматизации биотехнологические процессы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов производства высокоэффективных диагностикумов в ИФА для нужд ветеринарии.
    2. Использование современных автоматизированных биореакторов и методов оптимизации позволило при суспензионном культивировании культур клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 получать их в концентрации до 3 млн кл в мл, а при псевдосуспензионном на 1-2 порядка выше.
    3. Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволяет получать в высоких концентрациях вирусы (бешенство – в титрах 108-9ТЦД50, ИРТ - 108ТЦД50) и микроорганизмы (пастереллы, гемофилы и стрептококки до 20-40 млрд кл в мл).
    4. Использование высокоэффективных методов и аппаратов (жидкостных сепараторов и осадительно-фильтрующих центрифуг на бесприводной основе с высокими технико-экономическими показателям) для разделения, очистки и концентрирования вирусов и микроорганизмов методами сепарирования, центрифугирования, фильтрования и ультроцентрифугирования позволяет получать очищенные специфические антигены при промышленном производстве биопрепаратов (диагностикумы, лечебные сыворотки и др.).
    5. Разработан высокоэффективный способ оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов с использованием первичнотрипсинизированных и перевиваемых культур клеток в 10-100 раз по чувствительности выше, чем с использованием белых мышей, что позволило повысить эффективность биопрепаратов при их применении при промышленном производстве лечебных сывороток и диагностикумов (бешенство, ИРТ, хламидиоз, респираторно-синцитиальная инфекция, ящур, болезнь Марека и другие) в процессе изготовлении гипериммунных сывороток.
    6. Установлено, что наиболее сложным и определяющим является четвертый период сперматогенеза в культуральной системе. С целью создания трансгенных свиней к оптимизации параметров культивирования для получения живых клеток, включая сперматогонии, необходимы дальнейшие исследования.

3.7.  Теоретически обосновано и практически подтверждено наличие гепототического объема гибели клеток линии ВНК 21/13 в биореакторах при суспензионном культивировании в зависимости от уровня аэрации, размера пузырьков, силиконового пеногасителя (пропинол Б-400), а также при культивировании на микроносителях и установлена константа гибели клеток, которая в зависимости от времени культивирования колебалась от 2,7х10-6 сек-1 до 22,3х10-6сек-1.

    1. Разработаны методы очистки, инактивации и концентрирования вирусов бешенства и инфекционного ринотрахеита и изучены их биологические свойства, которые сохранялись при получении специфических антигенов, используемых для получения гипериммунных сывороток при промышленном производстве диагностикумов.
    2. Усовершенствованы способы получения и очистки специфических антител и моноклональных антител при промышленной технологии разработки и производства для практического применения диагностикумов.

4. Практические предложения

1.Разработан способ оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов с использованием первичнотрипсинизированных и перевиваемых культур клеток (2002), утвержденный А.М. Смирновым в отделе ветеринарной медицины РАСХН.

  2.За период с 2001 по 2007 гг. выпущены для практического применения в АПК России диагностикумы против вирусов ИРТ ИФА – 500, бешенства РДП – 3500, РИФ – 4000 и хламидиоза РСК – 15000 наборов.
3.Разработаны и утверждены:

  - Инструкция по изготовлению диагностикума ИФА против вируса ИРТ (2007), утвержденная директором ВНИТИБП.

  - Инструкция по изготовлению диагностикума РДП против вируса бешенства (2001), утвержденная директором ВНИТИБП.

  - Дополнение к инструкции по изготовлению диагностикума РИФ против вируса бешенства (2004), утвержденная директором ВНИТИБП и согласованная с Руководителем Департамента ветеринарии и директором ВГНКИ.

  - Инструкция  по изготовлению набора для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК (2002), утвержденная директором ВНИТИБП.

  - Инструкция по изготовлению ассоциированных лечебных сывороток против пастереллеза, гемофилеза и стрептококкоза свиней (2007), утвержденная директором ВНИТИБП.

  5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Эрнст Л.Н., Моисеева Н.А., Самуйленко С.А. Особенности иммунной системы у трансгенных свиней.// Международная конференция, посвященная 80-летию Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии  им. К.И. Скрябина. - Москва.-1999.-с.67.
  2. Эрнст Л.К., Самуйленко С.А., Соловьев Б.В., Самуйленко А.Я. Об использовании клеточных систем поддержания и культивирования сперматогониев in vitro.// Всероссийская научно-практическая конференция «Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов», посвященная 30-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности. – Щелково.-2000.-с.118-119.
  3. Эрнст Л.К., Самуйленко С.А., Зиновьева Н.А. Оценка эффективности использования ретровирусных векторов для переноса генов у сельскохозяйственных животных  in vivo.// Всероссийская научно-практическая конференция “Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов”, посвященная 30-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности. – Щелково.-2000.-с.119-120.
  4. Самуйленко С.А. Достижения биотехнологии в области создания трансгенных животных.// Всероссийская научно-производственная конференция «Разработка и освоение производства нового поколения лекарственных средств для животных и их применение в ветеринарной практике» в Федеральном государственном унитарном предприятии «Ставропольской биофабрике». – Ставрополь.-2000.-с.63.
  5. Бобровская И.В., Самуйленко С.А. Перспективы использования полимеразной цепной реакции (ПЦР) для типирования вируса болезни Марека.// Международная научно-практическая конференция «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии. – Покров.-2000.-с.221-224.
  6. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Гунин М.А., Самуйленко С.А. Исследование гибели клеток в процессе аэрации при глубинном культивировании в биореакторе.// Международная научно-практическая конференция «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии. – Покров.-2000.-с.199-203.
  7. Эрнст Л.К., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Самуйленко С.А. Культуры микроорганизмов и клеток животных-продуцентов биологически активных веществ.// Международная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии. – Москва.-2000.
  8. Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Самуйленко С.А., Самуйленко А.Я., Клюкина В.И. Некоторые проблемы глубинного культивирования клеток животных в биореакторах.// Биологическая научно-практическая конференция ВГНКИ. – Москва. – 2000.
  9. Самуйленко А.Я., Самуйленко С.А., Клюкина В.И., Рубан Е.А. Технология производства генноинженерных вакцин.// Биологическая научно-практическая конференция ВГНКИ. – Москва. – 2000.
  10. Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Скичко Н.Д.. Яковлев А.Е., Самуйленко С.А., Казаков М.А. Получение противоящурных гипериммунных сывороток на использованных морских свинках.// Науковий вiсник Национального аграрного унiверситету. – Киев.-2001.-с. 264-265.
  11. Кузнецов Д.П., Самуйленко А.Я., Белоусов В.И., Кузнецова С.В., Самуйленко С.А. Тест-система для ранней иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.// Науковий вiсник Национального аграрного унiверситету. – Киев.-2001.-с.269-271.
  12. Самуйленко С.А., Кузнецов Д.П. Функция лимфоцитов и макрофагов в клеточноопосредованном иммунитете при инфекционном  ринотрахеите КРС.// Материалы международной конференции молодых ученых. – Щелково.-2001.-с. 15-18.
  13. Самуйленко С.А., Бобровская И.В., Кузнецов Д.П. Очистка индивидуальных гликопротеинов вируса инфекционного ринотрахеита с помощью моноклональных антител.// Материалы международной конференции молодых ученых. – Щелково.-2001.-с. 35-37
  14. Романенко М.Н., Бирюков А.Г., Клюкина В.И., Самуйленко С.А. Современное состояние диагностики и типирования лиссавирусов.// Материалы международной конференции молодых ученых. – Щелково.-2001.-с. 174-176.
  15. Самуйленко С.А., Бобровская И.В., Кузнецов Д.П. Исследование иммуногенных свойств отдельных гликопротеинов вируса ИРТ КРС.// Материалы международной конференции молодых ученых. – Щелково.-2001.-с. 38-41.
  16. Романенко М.Н., Клюкина В.И., Бирюков А.Г., Самуйленко С.А. Получение и применение альбумин-родамина конъюгата в диагностике бешенства животных методом флюоресцирующих антител.// Материалы международной конференции молодых ученых. – Щелково.-2001.-с. 50-52.
  17. Яковлев А.Е., Самуйленко С.А., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Скичко Н.Д., Казаков М.А., Большакова М.В. Получение афтозного материала от морских свинок, зараженных вирусом ящура типов А, О  и С.// Материалы международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2001.-с. 182-184.
  18. Тетеричев В.И., Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Белоусов В.И., Бирюков А.Г., Самуйленко С.А. Эпизоотическая ситуация по бешенству в Тульской области и смежных областях Российской Федерации.// Материалы международной научно-практической конференции «Нейроинфекции: бешенство, гупкообразная энцефалопатия крупного рогатого  скота, Крейтфелдта-Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена». – Покров.-2001.-с. 10-14.
  19. Тетеричев В.И., Самуйленко А.Я., Белоусов В.И., Солодилов А.Н., Бирюков А.Г., Самуйленко С.А., Рубан Е.А., Иванов В.С. Современное состояние заболеваемости бешенством домашних и диких животных в Тульской области.// Материалы международной научно-практической конференции «Нейроинфекции: бешенство, гупкообразная энцефалопатия крупного рогатого  скота, Крейтфелдта-Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена». – Покров.-2001.-с. 14-17.
  20. Самуйленко А.Я., Албулов А.И., Уша Б.В., Бирюков А.Г., Фролов Ю.Д., Моисеев А.В., Самуйленко С.А., Моисеева Н.А., Зацерковная Е.Б., Ершов П.Б., Шинкарев С.М. Разработка новых технологий и расширение сферы применения биологически активных препаратов (БАП) из гидробионтов.// Материалы шестой международной конференции «Новые перспективы применения хитозана и хитина». – Москва.-2001.-с. 56.
  21. Самуйленко С.А., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Бирюков А.Г., Албулов А.И., Большакова М.В., Васенина Т.И., Дадасян А.Я. «Способ определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов и их составляющих компонентов». Патент №2184568 от 10.07.2002г.
  22. Яковлев А.Е., Самуйленко С.А., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Скичко Н.Д., Казаков М.А. Активность и специфичность в РСК гипериммунных сывороток, полученных высокоэффективным способом.// Материалы международной научно-практической конференции «Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей». – Покров.-2002.-с. 323-324.
  23. Яковлев А.Е., Бирюков А.Г., Фролов Ю.Д., Самуйленко С.А., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Скичко Н.Д., Казаков М.А. Оценка комплемент связывающей активности (РСК) вируса ящура типов А, О и С, репродуцированного в различных биологических системах, с использованием экспериментальных серий гипериммунной сыворотки.// Материалы второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». – Новосибирск.-2002.-с. 169.
  24. Самуйленко С.А., Кузнецова С.В., Кузнецов Д.П. Получение очищенных и концентрированных препаратов вируса бешенства.// Материалы международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. – Щелково.-2002.-с. 25-27.
  25. Самуйленко А.Я., Сюрин В.Н., Воронин Е.С., Ямникова С.С., Сапегина Е.П., Соловьев Б.В., Фомина Н.В., Белоусова Р.В., Белоусов В.И., Еремец В.И., Самуйленко С.А., Моисеев А.В., Фомин К.Ю. Инфекционная патология животных. Хламидиозы (том V). – Монография. – Москва.-2003.
  26. Кузнецов Д.П., Самуйленко А.Я., Белоусов В.И., Кузнецова С.В., Самуйленко С.А. «Набор для ранней иммуноферментной диагностики  инфекционного ринотрахеита». Патент №2196336 от 10.01.2003г.
  27. Эрнст Л.К., Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Самуйленко С.А.,  Еремец В.И. «Способ размножения стромальных клеток тестикул (семенников), мужских половых зародышевых клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов». Патент №2196820 от 20.01.2003г.
  28. Кузнецов Д.П., Самуйленко А.Я., Белоусов В.И., Кузнецова С.В., Самуйленко С.А. «Набор для ретроспективной иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита животных». Патент №2196609 от 20.01.2003г.
  29. Самуйленко С.А. Использование флюоресцирующих  моноклональных антител для выявления вируса бешенства.// Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2003.-с. 51-53.
  30. Самуйленко С.А., Яковлев А.Е., Самуйленко А.Я., Казаков М.А. Анализ эффективности противоящурных вакцин по дополнительному показателю с помощью ИФА.// Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2003.-с. 56-58.
  31. Самуйленко С.А., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я. Влияние концентрации парциального давления СО2 на жизнедеятельность микроорганизмов и клеток животных.// Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2003.-с.80-85.
  32. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Самуйленко С.А. Влияние растворенного кислорода на рост культур микроорганизмов и клеток животных.// Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2003.-с. 77-80.
  33. Истомина С.В., Кузнецова С.В., Сазанова Э.Я., Кузнецов Д.П., Маслов Е.В. Тест-система для индикации вируса бешенства и антирабических антител методом ИФА.// XI Московский международный ветеринарный конгресс.– Москва.-2003.-с.244-245.
  34. Истомина С.В., Сазанова Э.Я.,  Кузнецова С.В., Кузнецов Д.П. Гемагглютинин вируса бешенства.// XI Московский международный ветеринарный конгресс.– Москва.-2003.-с.245-246.
  35. Самуйленко С.А., Истомина С.В., Сазанова Э.Я.,  Кузнецова С.В., Кузнецов Д.П. Инактивирующее действие bete-пропиолактона на вирус бешенства.// XI Московский международный ветеринарный конгресс.– Москва.-2003.-с.247-2468.
  36. Самуйленко А.Я., Яковлев А.Е., Самуйленко С.А., Казаков М.А. Использованеи иммуноферментного анализа для изучения поствакцинального иммунитета при ящуре.// Статья в  журнале «Ветеринарная патология», № 1(5).– Москва.-2003.-с. 96-97.
  37. Самуйленко С.А., Сазанова Э.Я.,  Кузнецова С.В., Кузнецов Д.П. Гликопротеин вируса бешенства и протеин Ф (Staphylococcus aureus) в титровании методом ИФА антирабических антител.// Статья из сборника научных трудов, посвященная 75-летию Научно-исследовательского института микробиологии Московской области Российской Федерации. – Киров.-2003.-с.113-114.
  38. Самуйленко С.А., Сазанова Э.Я.,  Кузнецова С.В., Кузнецов Д.П. Температура в инактивации вируса бешенства.// Статья в журнале «Вестник РАСХН», №1. – Москва.-2004.-с.61-63.
  39. Самуйленко С.А., Сазанова Э.Я.,  Кузнецова С.В., Кузнецов Д.П. Влияние фенола на биологические свойства вируса бешенства.// Статья в журнале «Вестник РАСХН», №4. – Москва.-2004.-с.78-80.
  40. Самуйленко С.А., Сазанова Э.Я.,  Кузнецова С.В., Кузнецов Д.П. Действие β-пропиолактона на гемагглютинин и РНК вируса бешенства.// Статья в журнале «Вестник РАСХН», №6. – Москва.-2004.-с.68-70.
  41. Акиньшина Т.В., Сазанова Э.Я., Самуйленко С.А., Кузнецова С.В., Кузнецов Д.П. Некоторые аспекты инактивации вируса бешенства химическими агентами.// Статья в материалах Международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических  препаратов». – Щелково.-2004.-с.6-11.
  42. Гринь С.А., Кузнецова С.В., Кузнецов Д.П., Сазанова Э.Я., Акиньшина Т.В. Гуморальный иммунитет при вакцинации культуральной антирабической вакциной.// Статья в журнале «Ветеринария и кормление», №5. – Москва.-2005.-с.14-15.
  43. Гринь С.А., Сазанова Э.Я., Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В., Акиньшина Т.В. Клеточный иммунитет при культуральной антирабической вакцинации.// Статья в журнале «Вестник РАСХН», №2. – Москва.-2004.-с.76-78.
  44. Клюкина В.И., Кочетов А.И., Гринь С.А. Изучение фракционного состава антирабических ФИТЦ-конъюгатов методом хроматографии.// Статья в материалах Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2005.-с.92-94.
  45. Акиньшина Т.В., Гринь С.А., Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В., Сазанова Э.Я. Поликлональные антиидиотипические антитела к антигенам культурального вируса бешенства.// Статья в материалах Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2005.-с.261-266.
  46. Матвеева И.Н., Гринь С.А., Кузнецов Д.П., Мальгин Ю.А., Мальгина Т.А., Попова В.М. Выделение биологически активного протеина А для использования в биологических исследованиях.// Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию института «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково. – 2005. - с. 421-423.
  47. Матвеева И.Н., Гринь С.А., Кузнецов Д.П., Мальгин Ю.А., Мальгина Т.А., Попова В.М. Получение биологически активного протеина А для золотистого стафилококка.// Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию института «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково. – 2005. - с. 423-425.
  48. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Дадасян А.Я., Гринь С.А. Перспектива развития биотехнологии прозводства ветеринарных препаратов.// Статья в журнале «Ветеринария и кормление»-2005.- №2.-с. 12-13.
  1. Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Непоклонов Е.А., Воронин Е.С., Фомина Н.В., Гринь С.А., Белоусов В.И., Мельник Н.В., Рубан Е.А., Еремец В.И., Сапегина Е.П., Ямникова С.С., Цыбанов С.Ж. Инфекционная патология животных. – Монография (I и II том). – Москва. – 2006.
  2. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Гринь С.А. Изучение репродукции респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота.// Статья в материалах международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных». – Москва.-2006.-с.277-278.
  3. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Гринь С.А. Промышленный способ получения биологически активного протеина А.// Статья в материалах международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных». – Москва.-2006.-с.275-276.
  4. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Гринь С.А. Разработка тест-системы для детекции антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота.// Статья в материалах Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных». – Москва.-2006.-с.279-281.
  5. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В., Гринь С.А. Разработка тест-системы для детекции антител к вирусу парагриппа-3 крупного рогатого скота.// Статья в материалах Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных». – Москва.-2006.-с.284-286.
  6. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Гринь С.А. Очистка и концентрирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота.// Статья в материалах Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных». – Москва.-2006.-с.282-283.
  7. Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В., Сазанова Э.Я., Гринь С.А. Иммуногенные свойства отдельных гликопротеидов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.// Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова  «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково. – 2006. - с. 75-77.
  8. Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В., Сазанова Э.Я., Гринь С.А. Гибридомы, продуцирующие антитела к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.// Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова  «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково. – 2006. -  с. 77-80.
  9. Кочиш И.И., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Филиппов С.Ю., Чулков А.К., Кржижановская Е.В. Разработка тест-системы ИФА для диагностики респираторно-синцитиальной инфекции.// Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы молекулярной диагностики в ветеринарной медицине и биологии». – Крым.-2007.-с.116-119.
  10. Кочиш И.И., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Филиппов С.Ю., Чулков А.К., Кржижановская Е.В. Тест-система ИФА для диагностики парагриппа-3.// Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы молекулярной диагностики в ветеринарной медицине и биологии». – Крым.-2007.-с.120-122.
  11. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Гринь С.А., Кржижановская Е.В., Чулков А.К. Производство культуральной вакцины против гриппа птиц с использованием блочно-модульных гибких технологических линий.// Материалы научно-практической конференции «Грипп птиц: профилактика и меры борьбы». – Москва.-2007.-с.75-79.
  12. Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Шегидевич Э.А., Ставцева Л.Я., Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Панин А.Н., Малик Е.В., Кржижановская Е.В., Чулков А.К. «Способ получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней». Заявка на патент №2007123692 от 20.06.2007г.
  13. Скичко Н.Д., Гуславский А.И., Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Красуткин С.Н., Чипиус Ю.Г., Висящая Т.Ф., Гринь С.А., Кржижановская Е.В., Чулков А.К. «Способ увеличения выхода культуры клеток из перепелиных эмбрионов». Заявка на патент №2007142025 от 15.11.2007г.
  14. Гринь С.А., Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., Меньшенин В.В., Кржижановская Е.В., Чулков А.К., Скородумов Д.И., Старцева Л.Я., Малик Е.В. Изучение гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней на продуцентах-свиньях.// Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».-Щелково-2007. с. 249-253  .
  15. Клюкина В.И., Гринь С.А., Рахманин П.В., Проничев А.Б. Получение и изучение иммунохимических свойств компонентов вируса бешенства.// Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».-Щелково-2007. с. 86-90.
  16. Филиппов С.Ю., Гринь С.А., Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В. Поверхностные антигены вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».-Щелково-2007. с. 111-115.
  17. Матвеева И.Н., Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Изучение репродукции вируса аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».-Щелково-2007. с. 110-121.
  18. Матвеева И.Н., Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Кржижановская Е.В., Чулков А.К. Концентрирование и очистка вируса аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».-Щелково-2007. с. 122-125.
  19. Сивков Г.В., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Кржижановская Е.В., Чулков А.К. Разработка компонентов тест-системы ИФА для определения уровня антител к возбудителю аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».-Щелково-2007. с. 125-130.
  20. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Еремец В.И., Гринь С.А.. Клюкина В.И., Люлькова Л.С., Матвеева И.Н., Павленко В.С., Лехошерстова С.В. Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов (диагностикумов). Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».-Щелково-2007. с. 5-6 .





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.