WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

  На правах  рукописи

 

Скотникова Татьяна  Анатольевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ  ТЕХНОЛОГИИ  ПРОИЗВОДСТВА  И  СПОСОБОВ
ПРИМЕНЕНИЯ  ВАКЦИН  ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ  БОЛЕЗНИ

03.00.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии),
  биологические науки
 

 

  АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
  доктора биологических наук

Щелково – 2010 г.

Работа  выполнена  в ГНУ «Всероссийский  научно-исследовательский и технологический институт  биологической  промышленности»  Российской  академии  сельскохозяйственных  наук.

Научный  консультант:
академик  РАСХН, 
доктор ветеринарных наук, профессор,

лауреат Государственной премии РФ,

Заслуженный деятель наук РФ  Анатолий Яковлевич  Самуйленко 

Официальные  оппоненты:
доктор биологических наук, профессор,
лауреат Государственной премии,

Заслуженный ветеринарный врач РФСР  Николай Данилович Скичко

доктор ветеринарных наук, профессор,
Заслуженный деятель науки РФ Борис Филлиппович Бессарабов

доктор ветеринарных наук  Виктор Васильевич Соболев


Ведущая  организация
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» 

Защита  состоится  25 июня  2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета  Д 006.069.01  по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по  адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности.

Автореферат разослан  __________________ 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук Фролов Ю.Д.

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1.

Актуальность темы.  Птицеводство в Российской Федерации (РФ) является  наиболее развитой и наукоемкой отраслью сельскохозяйственного производства, в состав которой входят промышленные, фермерские и лично-подсобные хозяйства (Фисинин В.И., 2008, 2009).
В птицеводстве существует реальная угроза заболевания птиц ньюкаслской болезнью (НБ), что заставляет промышленные  предприятия вакцинировать все поголовье куриных против этой инфекции (Бакулов И.А., 2008; Джавадов Э. Д., 2008). Частные хозяйства в непосредственной близости от промышленных предприятий усугубляют ситуацию, так как синантропные птицы  могут  способствовать переносу возбудителя НБ. Для этих хозяйств необходимо разрабатывать вакцины против НБ в мелкой дозировке, удобные в применении (Венгеренко Л.А., 2006).
Отечественные производители выпускают живые вакцины против НБ из штаммов «В1», «Ла-Сота», «Бор-74 ВГНКИ», «Н», «ГАМ-61» (Сюрин В.Н.,1958, 1963; Лагуткин Н.А.,1975; Сафонов Г.А.,1984; Креймер Ю.Х.,1986; Смоленский В.И., Руденко Т.В., 1999; Сергеев В.А. с соавт., 2007), доля которых  составляет около 23 % в общем  объеме  производства вакцин для профилактики инфекционных болезней птиц в РФ. 
Традиционная технология приготовления живых аттенуированных вакцин против НБ имеет резервы для совершенствования (Lancaster D., 1988; Cameron J.,1990; Смоленский В.И., 2001, 2007; Тихонов И.В. с соавт., 2008). Требуют совершенствования способы концентрирования  и очистки  вируса от балластных белков; повышения  стабильности вакцины и ее оценки; технологического контроля производства вакцины; гармонизации  методов контроля  с  международными требованиями (Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И., 2007).
Концентрирование и очистка вируса НБ является важнейшим технологическим элементом получения более эффективных и безопасных препаратов, поскольку для конструирования ассоциированных и инактивированных вакцин важно иметь вируссодержащий  материал (ВСМ) с высокой антигенной и иммуногенной  активностью в минимальных объемах. 
  Перспективным компонентом для  создания ассоциированных вакцин, с эпизоотологической точки зрения, является вирус инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ).  В ряде регионов РФ  ИЛТ встречается в ассоциации с НБ, нанося значительный экономический ущерб при выращивании цыплят-бройлеров (Кулаков В.Ю. с соавт., 2007).
  Проблема повышения стабильности препаратов актуальна для птицеводства, поскольку доля препаратов для птиц составляет 95 % мирового рынка препаратов для животных.  Требования к углубленному изучению стабильности лекарственных средств (ЛС) содержатся в Правилах GMP. Наиболее перспективным для оценки стабильности биологических препаратов различной природы считается метод «ускоренного старения» (Мешковский А.П., 2000; 2008).
Эффективность вакцинации во многом определяется дозой антигенного материала. Существует зависимость между силой антигенного раздражения и интенсивностью иммунного ответа при введении вакцины в организм. Большие дозы вакцины угнетают иммуногенез до развития иммунологической толерантности; малые же дозы не вызывают иммунологической перестройки в организме  и синтеза защитного уровня антител (Лагуткин Н.А. с соавт., 1997; Alexander  D.E., 1997).
Интенсивное развитие мясного птицеводства требует совершенствования технологии вакцинации цыплят против НБ с использованием специального оборудования, обеспечивающего экологическую безопасность для персонала и окружающей среды. Особенно важной  является защита человека от контактов с вирусом  НБ, поскольку он относится к зоонозам (ВОЗ, СТД № 682.,1985).
  Выполнение требований стандартов менеджмента качества (ГОСТ Р ИСО 9001-2008) и Правил GMР (ГОСТ Р 52249-2009) способствует повышению качества вакцин. Технологический контроль становится главным инструментом, обеспечивающим основные составляющие качества биопрепаратов: безопасность, эффективность и стабильность. Постоянный  мониторинг показателей качества в критических контрольных точках предупреждает возможность появления  дефектов продукции. Рекомендуемый стандартами процессный подход связан не только с документированием, но и с детальным анализом и вмешательством в технологические процессы, которые рассматриваются в том числе, с точки зрения бизнес-процессов.
1.2. Цель и задачи исследований.  Цель работы состояла в совершенствовании технологии производства вакцины против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота», разработке новых вакцин на основе концентрированного вируса и экологически безопасных технологий вакцинации цыплят-бройлеров в условиях промышленного птицеводства.
Для  реализации  поставленной  цели  нами  были  определены следующие задачи:
- изучить кинетику термоинактивации биологической  активности вируса НБ, разработать методы оценки стабильности  вакцины  против НБ на всех этапах ее жизненного цикла  и определить возможность прогнозирования сроков годности вакцины;
- научно обосновать и количественно определить  оптимальную иммунизирующую дозу вакцины против НБ из штамма «Ла-Сота»;
- разработать технологический процесс  получения  концентрированного вируссодержащего материала для изготовления вакцин;
- разработать технологию изготовления  моновакцины из концентрированного вируса; 
- разработать технологию изготовления ассоциированной вакцины против НБ и ИЛТ птиц;
- разработать экологически безопасные технологии крупнокапельной и камерной аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров  против НБ;
- оценить технологический процесс производства вакцины против НБ и возможность его совершенствования с учетом требований международных стандартов ИСО серии 9000:2008 и Правил GMP (ГОСТ Р 52249-2009).
1.3. Научная новизна. Применение линейной модели для изучения изотермической кинетики инактивации  вакцины против НБ (сложного многокомпонентного по составу иммунобиологического препарата) позволяет обоснованно перейти к количественной оценке стабильности биологической активности препаратов и прогнозированию их сроков годности. В  качестве критерия оценки эффективности мероприятий по совершенствованию технологических процессов производства вакцины из штаммов «Ла-Сота», «В1», «Бор-74 ВГНКИ», «Н» и «ГАМ-61» применен тест «ускоренного старения».
  Количественный метод оценки стабильности вакцины против НБ  применен в процессе разработки  новой  защитной  среды (патент РФ «Защитная среда для приготовления сухой вирусной вакцины» № 1212045 с приор. от 24.01.84 г., А.С. «Способ подбора стабилизатора для сухой вирусной вакцины» № 1314679 с приор. от 15.08.84 г. в соавторстве),
  Впервые в отечественной ветеринарной практике научно обоснована и количественно определена оптимальная  иммунизирующая доза вакцины против НБ из штамма «Ла-Сота». 
Разработана технология получения  вакцины  против НБ на основе концентрированного методом ультрафильтрации на полых волокнах  вирусного материала (ВСМ) штамм «Ла-Сота» с гемагглютинирующей активностью которого не ниже 2048 ГАЕ/см3, что позволяет получать стабильный  при хранении препарат с содержанием доз во флаконе от 20 и выше. В качестве стабилизатора  применена защитная среда на основе белкового гидролизата определенного  пептидного состава  (патент РФ «Вакцина против болезни Ньюкасла птиц и способ ее применения» № 2035917  с приор. от  28.12.92 г., А.С. «Способ изготовления ферментативного гидролизата тканей куриного эмбриона для приготовления защитных сред при производстве сухих вирусных вакцин»  № 1277457  с приор. от 12.09.85 г. в соавторстве).
Разработана технология изготовления живой комбинированной вакцины (против НБ и ИЛТ) на основе концентрированного ВСМ штамм «Ла-Сота», использование которого позволяет избежать разбавления второго компонента вакцины ВСМ  ИЛТ, не подлежащего концентрированию, и уменьшить объем вакцинальной дозы (патент РФ «Способ получения комбинированной вакцины против ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц» № 2106152  с приор. от 16.06.93 г. в соавторстве).
Разработана схема камерной экологически безопасной аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров однодневного возраста против НБ, которая исключает выброс вируса в окружающую среду. Определена  доза вакцины против НБ из штамма Ла-Сота, которая не обладает реактогенностью при аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров с различным уровнем материнских антител  и обеспечивает  необходимую защиту при контрольном заражении  (Патент РФ «Способ профилактики болезни Ньюкасла» № 2035915 приор. от 28.12.92 г. в соавторстве).
1.4. Практическая ценность работы. Результаты исследований использованы при усовершенствовании действующих и разработке новых технологий  биопрепаратов против НБ и среды защитной для вирусных вакцин.
  При непосредственном участии автора на ФГУП «Курская биофабрика» в 1993г. внедрена вакцина сухая против НБ из штамма «Ла-Сота». Производство  осуществляется  в соответствии с НД на вакцину (Инструкция, утв. ГУВ 29.08.1990 г., ТУ 10-19-212-86 и ТУ-10-19.45-88 «Среда защитная (СПЛФ-жидкая) для вирусных препаратов»).  Предприятием выпущено 4,8 млрд. доз вакцины против НБ штамм «Ла-Сота» неизменно высокого качества.
В 1994 г. организовано опытное производство ВНИТИБП. Выпущено и реализовано вакцины против НБ из штаммов «Ла-Сота», «В1», «Бор-74 ВГНКИ», «Н» и «ГАМ-61»  272,36 млн. доз.
  Разработан в соавторстве  и внедрен ОСТ 100083-95 «Продукция агробиологической промышленности. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, построения, согласования и утверждения.».  В 2009 г. основные положения ОСТа пересмотрены с учетом требований  ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» и включены  в проект ГОСТ Р «Средства лекарственные для животных. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, согласования и утверждения».
Разработан  комплект методических рекомендаций по вопросам внедрения системы менеджмента качества на предприятиях агропромышленного комплекса. Материалы документов используются  с 2004 г.при проведении планового обучения специалистов предприятий РОАО «Росагробиопром» (ФГУП «Щелковский биокомбинат», «Орловская биофабрика», ОАО «Покровский завод биопрепаратов») и  входят в системы документации этих предприятий.
1.5.  Основные  положения диссертационной работы,  которые выносятся на защиту:
- результаты исследования кинетики термоинактивации  вируса НБ; методики определения стабильности вирусных вакцин по тесту «ускоренного старения» и  количественной оценки стабильности живых  вирусных вакцин и  применение их на этапах жизненного цикла вакцины; 
- результаты экспериментальных исследований по определению оптимальной дозы вакцины против НБ штамм «Ла-Сота»; 
- результаты исследований  по разработке технологического  процесса  концентрирования вируссодержащего материала;
-  технология  производства, методы биологического контроля моновакцины из концентрированного вируса, результаты комиссионных испытаний  опытно-промышленных  серий препарата;
- технология  изготовления ассоцииированной вакцины против НБ и ИЛТ птиц;
-  результаты исследований по разработке экологически безопасных технологий  крупнокапельной и  камерной аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров  против НБ;
-  результаты анализа технологического процесса производства вакцины против НБ (в соответствии с требованиями стандартов ИСО с.9000 и Правил GMP) в условиях опытного производства ВНИТИБП.
1.6. Апробация работы. Основные материалы диссертации  доложены и обсуждены:
на заседаниях ученого совета и методической комиссии ВНИТИБП (1975 - 2009 гг.)  в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий; ветеринарной секции НТС Минсельхоза СССР (17.10. 1984 г.); секции «Ветеринарная биотехнология»» Отделения ветеринарной медицины РАСХН  (2002, 2004-2009 гг.); на 5-ти Международных конгрессах и симпозиумах: ХХI Всемирный ветеринарный  конгресс (Москва, 1979 г.); І Болгаро-Советский симпозиум «Свободные радикалы и биостабилизаторы» (София, 1987 г.); Российско-американский  конгресс «Экологическая инициатива» (Воронеж, 1996 г.); XI International congress оf the World Veterinary poultry association(Будапешт,1997 г.); І Международный ветеринарный конгресс по птицеводству (Москва, 2005 г.); на 37 Всесоюзных,  Республиканских, Международных и Всероссийских конференциях, посвященных научным и практическим проблемам технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов, проводившихся:  в Москве, Минске, Риге, Киеве, Харькове, Алуште, Воронеже, Ст. Петербурге, Саранске, Владимире, Новосибирске, Екатеринбурге, Ставрополе,  Краснодаре, Курске, Щелково  (1977 – 2009 гг.).
Разработки по материалам диссертационной работы удостоены: серебряной медали ВДНХ СССР, 2-х  медалей «Лауреат ВВЦ» и нагрудного знака «Участник ВВЦ» (пост. № 678-Н от 13/ІХ-88 г.; № 2682 от 11.ХІІ.2002 г.;  № 685 от 12.10.09 г.; № 157 от 24.10.06 г.).
1.7. Публикации. Основные положения диссертационной работы  опубликованы в 86 научных работах, в том числе в 7 статьях  в изданиях по перечню, рекомендованному  ВАК  Минобрнауки  России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований  получено 6 патентов  и авторских свидетельств, разработаны и утверждены 1 отраслевой стандарт и 7 методических рекомендаций. На разработанные и внедренные препараты утверждены нормативные документы в установленном порядке.
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 398 стр. машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, материалы и методы, обсуждение, выводы и практические предложения, содержит 35 таблиц  и  15 рисунков.  Список литературы включает 580 источников. В приложении представлены сводные таблицы исходных данных и копии документов, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
  1.9. Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке целей и задач исследований, теоретическом и методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов.  Автор лично принимала участие в апробации и промышленном производстве разработанных препаратов, подготавливала публикации.
1.10. Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ВНИТИБП, академику РАСХН  А.Я. Самуйленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники института  Э.Ф. Токарик, Н.С.Шевырев, Л.А. Неминущая, А.А. Нежута, Б.Е. Блехерман, Б.И. Токарик, С.М. Панферова, В.В. Панферов, Л.А. Елисеева, Ю.Д. Фролов, В.И. Еремец, С.В. Кузнецова, Е.И. Ярыгина,  а также сотрудники ВГНКИ:  В.И. Смоленский Т.В., Руденко; ВНИВИП  М.И. Слободенюк, Р.Г. Айрапетов; ВНИТИП В.И. Филоненко, В.Г., Шоль, И.П. Салеева, Д.В. Шешенин за что приносим им сердечную благодарность.

2. МАТЕРИАЛЫ  И  МЕТОДЫ 
Работа выполнена в 1975-2009 гг. во ВНИТИБП и в его опытном производстве. Часть исследований проводилась совместно с  сотрудниками ВГНКИ, ВНИВИП и ВНИТИП. Эксперименты, касающиеся практической реализации научно-исследовательских разработок, осуществляли на базе ряда предприятий отрасли,  экспериментального бройлерного хозяйства  ВНИТИП.
В качестве материалов для исследований использованы: вакцинные и контрольные штаммы вирусов НБ и ИЛТ; вируссодержащий материал (ВСМ), полученный в лабораторных и производственных условиях; образцы опытных и производственных серий вакцины из штамма «Ла-Сота», «В1», «Бор-74 ВГНКИ», «Н», ГАМ-61»; опытные серии сухой комбинированной вакцины против  НБ и ИЛТ, вакцины «Моновак-НБ-форте», вакцины «Оровак НБ». Для получения ВСМ использовали инкубационное яйцо от невакцинированных против НБ кур (из хозяйств, благополучных по болезням птиц), с 1997г. SPF куриное  яйцо (ФРГ, «Lomann Tierzucht») и SPF- эмбрионы кур  9-10-сут возраста производства ФГУП «Щелковский биокомбинат». Вакцинные штаммы  ВНБ характеризовали по показателям: среднее время гибели КЭ (МТD); индекс интрацеребральной патогенности для однодневных цыплят (ICPI);  индекс интравенозной патогенности для 6-ти недельных цыплят (IVPI); стабильность вирусных гемагглютининов при +560С; стабильность инфекционности вируса при рН 2,8-3,0; агглютинабельность вируса по отношению к эритроцитам петуха,лошади и крупного рогатого скота. Морфологию вируса исследовали методом электронной микроскопии. Инфекционную активность вируса НБ и образцов вакцин определяли титрованием на 9-10 суточных  КЭ и рассчитывали по методу Кербера, титр гемагглютининов - в реакции гемагглютинации. Инфекционную активность вируса ИЛТ штамм «ВНИИБП» определяли в реакции нейтрализации.  Применяли растворители: 10%-ный раствор глицерина в дистиллированной воде;  растворитель для сухой вирусвакцины против болезни Марека (2%-ный раствор пептона в 2-х молярном глициновом буферном растворе) - ТУ 46-21-58-74; АР 1 - Авистим (ТУ 10.07-025-93) – растворитель для живых сухих вакцин против НБ.
В качестве компонентов защитной среды для высушивания вакцины против НБ применяли пептон производства Семипалатинского завода  и ГКЭ – гидролизат куриных эмбрионов. 
Использовали цыплят и кур различных возрастов мясных и яичных пород и кроссов: цыплята- бройлеры «Гибро - 6»; кросс «Конкурент»; «Бройлер-6»; «Беларусь-9»;  породы белый леггорн и кросс «Хайсекс белый. Вакцинацию проводили интраназально, окулярно, перорально (выпаиванием ), крупнокапельным распылением и аэрозольно в камере специальной конструкции. Безвредность и реактогенность вакцин определяли общепринятыми методами. Материнские  и специфические  сывороточные антитела определяли в РЗГА по общепринятой методике. Эффективность вакцинации оценивали по напряженности иммунитета  и по уровню защиты птицы при контрольном заражении. Рассчитывали  ЭД50 и ЭД95 (50% и 95% защитные дозы).
Для исследования термостабильности использовали термостаты и ультратермостаты (± 0,50).Исследовали воздействие градиента температур, начиная с  +400С  (интервал  50), и постоянной температуры (от +40 до +700С) на биологическую активность вируса НБ в течение времени, выбранного так, чтобы снижение активности вируса было достоверным. Образцы сухой вакцины после прогревания хранили при  температуре - 400С не более 10 дней.
Методом гельфильтрации  исследовали процесс разделения ВСМ  на полых волокнах и пептидный состав гидролизатов белка – основы защитных сред (гель «Toуpearl» HW – 50  F1  Япония) на колонке 2,640 см; элюирование проводили фосфатным буферным раствором (0,15 М, рН 7,2). Белок определяли  методом Къельдаля, содержание растворимого белка - по методу Лоури,  аминный  и общий азот - известными методами.
Статистические  методы. Опыты проводили с числом повторов 3, достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по методу Стьюдента-Фишера при уровне значимости р = 0,05. Результаты исследований по термоинактивации обрабатывали  методом регрессионного анализа и с применением коэффициента корреляции. Для построения линий прогноза использовали Аррениусовскую  температурную зависимость ln KT  от  1/T,  прогнозирование сроков годности вакцин осуществляли методом экстраполяции. Для оценки точности и стабильности технологического процесса производства вакцины применяли метод гистограмм. Ретроспективную оценку стабильности технологического процесса проводили с помощью контрольной карты Шухарта для средних значений и размаха (, R).

  3. РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1. Совершенствование технологии производства вакцины  против НБ
1.1. Разработка количественного метода оценки стабильности вакцины.
Кинетика термоинактивации биологической активности вируса НБ в жидкой и сухой вакцине. Успешная профилактика заболеваний птиц с помощью живых вирусных вакцин зависит от ряда факторов, одним из которых является стабильность свойств биологического агента в процессе производства, хранения, транспортировки и применения. Повышение стабильности биологических препаратов является одним из приоритетных направлений в обеспечении их качества. Изучение стабильности рекомендовано проводить до маркетинга и в пострегистрационный период. В комплект документов, представляемых для регистрации в РФ ветеринарных лекарственных средств, должен быть включен отчет по изучению стабильности, на основании которого устанавливают срок годности, условия хранения и транспортирования данного препарата.
С 1976 года ученые ВНИТИБП при непосредственном участии автора решали проблемы стабилизации биообъектов на модели вакцины против НБ,  успех которых зависел от разработки методов количественной оценки достигнутого эффекта стабилизации. Были проведены исследования  кинетики  термоинактивации биологической активности вируса. Применяли метод оценки стабильности биообъектов в сложных системах, основанный на двух теоретических положениях.
Первое состоит в том, что процесс тепловой инактивации биообъекта может быть описан кинетически уравнением первого порядка:
lg Y  =  lg Y0  -  Кt,  где Y0  - исходная активность биообъекта; Y - величина активности через время t; К  - константа скорости инактивации  (1/ ед. времени).
В координатах  lg У  от  t  данное уравнение – прямая линия с тангенсом угла наклона к оси Х, равным константе скорости инактивации.
Второе положение – для описания зависимости константы скорости инактивации от температуры применяется уравнение Аррениуса:
K  =  A-Ea/RT или  lnk  = Ea/RT  +  lnA , где  К – константа скорости инактивации (1/ ед. времени); T – абсолютная температура (0 К);  R= 1,987 кал/градмоль (газовая постоянная Больцмана); Ea – эмпирическая энергия активации (кал/моль); А – предэкспоненциальный множитель.
На основании предварительных исследований подобраны такие температуры, при воздействии которых на объект снижение биологической активности было статистически значимым. Для изучения кинетики  инактивации  вирусных  гемагглютининов  (ГА) выбрана температура +520С. Установлен линейный  характер снижения  ГА-активности  вируса в эмбриональной жидкости при этой температуре, средний коэффициент корреляции (n= 3) составил - 0,86.
Статистическая обработка результатов  показала, что при температуре +370С снижение  ИА вируса в эмбриональной жидкости от исходной активности  до уровня 3,0 – 4,0 lg ЭИД50/см3 также носит линейный характер и описывается кинетическим уравнением первого порядка, коэффициент  корреляции – 0,87. Это позволяет нам применять константы скорости инактивации (КТ)  биологической активности вируса для количественной оценки  его  стабильности в эмбриональной жидкости – исходном сырье для приготовления  вакцины.
Для изучения кинетики инактивации  ИА вируса в сухой вакцине выбран спектр  температур: +700, +550,  +370, +200  и +40С. Снижение ИА вируса имело общий характер, наиболее быстро активность снижалась при +700 и медленнее всего при +40С. Кинетические кривые инактивации вируса, высушенного без защитной среды, состояли из двух компонент (рис.1-А). Первая компонента «быстрая» отражала начальный ускоренный период термоинактивации ИА вируса, вторая «медленная»  период относительной стабилизации оставшейся активности. Смена механизмов инактивации вирусной активности происходила на уровне 2,3 – 4,4 lg ЭИД50/см3.
А

Б

Рис.1. Кинетика инактивации инфекционной активности вируса НБ при 370С: А) в эмбриональной жидкости; Б) в сухой вакцине  ( 1- среда на основе пептона, 2- ОМ) 

При инактивации вируса, высушенного с защитными средами, получены однокомпонентные кривые.  Среды на основе пептона, по сравнению с производственной средой  обезжиренное молоко (ОМ), были более эффективными (рис. 1-Б). Зависимость изменения активности вируса в сухой вакцине от времени при каждой из температур – линейная, поэтому величины КТ вируса являются количественным выражением стабильности вакцины и при соответствующей постановке экспериментов могут быть использованы для оценки вклада различных факторов в ее стабильность. Так эффективность защитных сред, используемых при изготовлении вакцины, оценивали отношением констант скоростей инактивации вируса.
  Для разработки экспресс-теста контроля стабильности вакцины определяли наличие и характер связи между величинами снижения титра ИА вируса в условиях «ускоренного старения» (7 суток - 370С) и при низких температурах (200 и 40С). Анализ экспериментальных данных  методами биологической статистики подтвердил наличие линейной связи между величинами 37 и 20, 37 и 4, что позволило предложить в качестве экспресс-теста стабильности вакцины против НБ величину снижения титра ее инфекционной активности за 7 суток при 370С - (37).
Прогнозирование сроков хранения сухой вирусвакцины против НБ. Для составления прогнозов сроков годности исследуемых серий вакцины использованы КТ  и  уравнение Аррениуса. В аррениусовских координатах InКТ и данное уравнение изображается прямой линией, тангенс угла наклона которой определяет энергию активации. Полученные экспериментальные данные по кинетике термоинактивации обрабатывали методом наименьших квадратов, при этом была подтверждена линейная зависимость между Y = ln KT и  X = 103. Она представлена прямой линией в координатах (ln KТ от 1/Т) и является уравнением прогноза срока годности и изменения активности вакцины,  с помощью которого методом экстраполяции можно определять величины  KТ при интересующих нас температурах. Рассчитана энергия активации (Еа) процесса потери активности вируса в сухой вакцине при повышенных температурах (Еа= 28,3 ккал/моль). Комиссионная апробация экспресс-метода определения сроков годности сухой вакцины против НБ подтвердила его пригодность в условиях производства.
1.2.  Определение прививной дозы вакцины против НБ штамм «Ла-Сота». 
Вопросы эффективности и безопасности  применяемых вакцин тесно взаимосвязаны, зависят от многих факторов, в том числе от количества (дозы) вводимого антигена.
На начало проведения исследований в наставлениях по применению вакцин против НБ доза вируса выражалась в инфекционных единицах (ЭИД50) только для  аэрозольной иммунизации, для интраназальной и пероральной вакцинации - в объемных.  При таких методах вакцинации наблюдалось изменение дозы в 100 раз, что приводило к существенному занижению или завышению ее при крайних значениях (8,0-10,0 lg ЭИД50/см3) ИА вируса и, как следствие, к неудовлетворительным результатам. В связи с этим необходимо было обосновать выбор эффективной дозы вакцины из штамма «Ла-Сота» и перевести ее из объемных единиц в количественные  (ЭИД50).
Проведена статистическая обработка данных лабораторных опытов 1980-1989 гг. Исследована иммуногенность 64 опытных и промышленных серий вакцины (3500 цыплят породы белый леггорн).  Установлено, что для цыплят 15-20 суточного возраста надежная назальная доза (80-100% защита от 1000 ЛД50 вирулентного вируса НБ) находилась в диапазоне от 3,0 до 6,3 lg ЭИД50/см3 (титры  сывороточных антител 3,0 – 9,0 lоg2). Наиболее часто встречаемая доза 4,3 lg ЭИД50/см3  (рис.2).  Для цыплят 5 суточного возраста (с материнскими антителами) эффективная доза равна 6,3 lg ЭИД50/см3, с учетом стандартной средней ошибки* титрования (при десятикратном разведении)  вируса (± 0,4 lg ЭИД50/см3),  она равна 6,7 lg ЭИД50/см3 или 5 000 000 ЭИД50.
* получена  в результате многократного (в течение 2-х лет, п = 100) определения инфекционности вируса эталонной серии вакцины против НБ штамм «Ла-Сота».
Вакцина в дозах от 1 до 5 млн. ЭИД50  у 5 и 20 суточных цыплят обеспечивала защиту от 2 млн. ЛД50  вирулентного вируса НБ. При введении  вакцины в дозе 5 000 000 ЭИД50  антитела  в сыворотке крови цыплят появлялись на 3- 4 сутки  после вакцинации, титр составлял 3,0 – 4,0 lоg2. На 4 сутки птица была на 70% защищена от 1000 ЛД50 вирулентного штамма вируса НБ, на 6-й день  на 90%  (титры антител 5,0 lоg2), на 7-8-е сутки  птица полностью защищена  (титры антител 5,0-6,0 lоg2), к 14 дню титр антител  составлял 6,0 -9,0 lоg2. Максимальное накопление  сывороточных антител наблюдалось через 30 дней  после вакцинации, к 120 дню титр сывороточных антител снижался до 3,0 – 2,0 lоg2. Через три  месяца после вакцинации  было защищено 92-100 % птицы,  а через 5 месяцев 70 - 85% (по результатам контрольного заражения).

Рис. 2. Ретроспективный анализ экспериментальных данных об эффективности
прививных доз вакцины против НБ штамм «Ла-Сота». 
Результаты  опытов  по определению иммуногенности  промышленных и экспериментальных серий вакцины из штамма «Ла-Сота» для  цыплят кроссов Хайсекс белый и Бройлер-6, иммунизированных интраназально и выпаиванием  в возрасте 15 и 40 суток с последующим серологическим контролем до 120 дней, также подтвердили
эффективность предлагаемой дозы.
Согласно НД 1 см3 вируссодержащего материала (ВСМ) с титром инфекционности  8,0 - 10,0 lg ЭИД50/см3 содержит 250 доз. Тогда как, только при титре инфекционности вируса 9,5± 0,4 lg ЭИД50/см3 в 1 мл вакцины количество доз составляет 250. Отсутствие стандартной дозировки вакцины требовало внесения  изменений в НД по изготовлению, контролю  и по применению вакцины  с целью стандартизации ее по активности и  повышения гарантий  эффективности при применении в ветеринарной практике.
  Испытания эффективности  назальной дозы вакцины «штамм Ла-Сота»  5 000 000 ЭИД50 проведены в условиях промышленного птицеводства. Птицу яичного  направления породы белый леггорн кросса «Беларусь-9» (9000 гол.) вакцинировали  в возрасте 12-15 дней и  ревакцинировали в 45 дней  (одной назальной дозой) производственной серии вакцины,  выпущенной в новой дозировке. Уровень материнских антител составлял 3,2 lоg2. Контрольную группу птицы (36000 гол.) вакцинировали и ревакцинировали интраназально (согласно действующему наставлению) вакциной с активностью 9,0 lg ЭИД50/см3  того же производства. Растворитель - дистиллированная вода. Динамику титра антител в сыворотках крови птицы обеих групп определяли в РТГА. После вакцинации уровень сывороточных антител в опытной и контрольной группах составил 5,9 и 5,5 lоg2, соответственно;  после ревакцинации  - 5,0 и 5,2 lоg2; перед контрольным  заражением - 3,5 и  3,4 lоg2. Контрольное заражение (10000 ЛД50), проведенное через три месяца после ревакцинации, показало 100%  защиту птицы в опытной и контрольной группах  при 100% гибели  невакцинированной птицы (15 гол.).
Таким образом, в условиях  промышленного птицеводства  подтверждена эффективность назальной  дозы вакцины  5 000 000 ЭИД50. 
1.3. Разработка технологического процесса получения концентрированной эмбриональной  жидкости куриных эмбрионов, содержащей вирус НБ.  Для исследований использовали вируссодержащий материал (ВСМ) развивающихся куриных эмбрионов (РЭК), содержащий  вирус НБ штамм «Ла-Сота». Продолжительность инкубирования РЭК до сбора эмбриональной жидкости (14-15 суток) определена опытным путем. Для этого учитывались: максимальная ИА вируса, минимальное  количество белка в ВСМ, максимальный объем жидкости, собранной с эмбриона.
Для очистки и концентрирования ВСМ проводили сравнительные испытания ядерных мембран (ЯМ; диаметр пор 0,05-0,08 мкм), фторопластовых мембран  (МФФ; 0,05-0,08 мкм) и полых волокон (ПВ; 0,02 мкм). Предварительную очистку ВСМ от механических крупнодисперсных примесей проводили на установке УСФ-293-7 с использованием картона фильтровального для биологических жидкостей (КФБЖ). ВСМ концентрировали на ультрафильтрационных  (УФ) мембранах в ячейках ФМ-02-200 или ФМ-02-1000, УФ на полых волокнах (ВПУ-15ПА) проводили на установке УПВ-6,0. Эффективность мембран оценивали: по кратности концентрирования ВСМ по объему, биологической активности вируса и ее сохранности в концентрате ВСМ, очистке материала по белку, скорости фильтрации и селективности.  Количество белка определяли  спектрофотометрически (длина волны 280 нм) и по методу Лоури.
Во всех опытах отмечено  повышение  ИА и ГА-активности в ВСМ. На  МФФ потери вируса были наибольшими - титр ИА фильтрата составлял 3,5lg ЭИД50/см3.  Максимальное увеличение ГА-активности  (1: 8192) получено при использовании ПВ. Применение КФБЖ способствовало повышению пропускной способности мембран в 2-3 раза. Все испытанные мембраны частично пропускали белок  в фильтрат. При концентрировании ВСМ в 8-10 раз по объему кратность концентрирования по белку составляла 1,4-3,5 раза, то есть происходила частичная очистка вируса от сопутствующих белков. При этом степень очистки вируса по белку была выше на ЯМ, чем на ПВ:  86,8 %  и  65,2 %, соответственно.
Исследования показали, что более технологичным является метод концентрирования ультрафильтрацией на ПВ, характеризующийся низкими энергоемкостью и эксплуатационными затратами. УФ на ПВ позволяет работать с большими объемами вирусного материала, сохранить структуру биологически активного вещества, обеспечить герметичность и асептические условия процесса. Очистка и концентрирование ВСМ проводились практически в одну стадию. Установлены следующие параметры концентрирования вируса: рабочее давление  0,08-0,12 МПа, линейная скорость потока жидкости 0,1-0,8 м/с.
В процессе концентрирования на ПВ  выявлена зависимость селективности  ПВ мембраны от срока хранения ВСМ до концентрирования.  При использовании ВСМ с малым сроком хранения получали мутные концентраты, содержащие коагулированные белки. Статистическая обработка данных подтвердила значимое влияние срока хранения ВСМ на селективность мембран (до 4 суток - 11-22 %;  до 25-26 суток - 63-67 %) и на стандартность характеристик полученного жидкого концентрата. Срок хранения ВСМ перед концентрированием должен составлять не менее 10 суток.
Апробация в опытно-промышленных условиях  подтвердила воспроизводимость и надежность  разработанного метода ультрафильтрации. Полученный биологический материал  был стерилен и содержал морфологически полноценный вирус (по результатам электронной микроскопии). Скопления вирионов характеризовались четко выраженными пепломерами, повреждающего действия  процесса очистки и концентрирования на вирус НБ не наблюдалось. 
Процесс разделения ВСМ на ПВ контролировали гельфильтрацией в пробах (исходная, концентрат и фильтрат). Гельхроматограммы подтверждают прохождение процесса концентрирования.  Содержание  белковых примесей в концентрированном ВСМ  существенно ниже, чем в исходным материале, низкомолекулярные фракции полностью отсутствуют (рис.3).

Рис.3. Гельхроматограмма вируссодержащего материала.
В процессе ультрафильтрации объем ВСМ уменьшался в 8-12 раз (по сравнению с начальным объемом), содержание общего белка снижалось на 65%, в среднем. Величина ИА вируса в концентрате составляла 9,9-11,0 lg ЭИД50/см3, гемагглютинирующая активность варьировала от 11,0 до13,0 lоg2.  Можно предположить, что значительное увеличение ГА-активности вируса связано с удалением в процессе ультрафильтрации ингибиторов гемагглютининов. 

  Титры инфекционности и  ГА-активности вируса в концентрате не снижались  через 4 часа хранения при комнатной температуре и через 45 дней хранения при 4-60С (срок наблюдения).
Глава 2. Разработка новых препаратов на основе концентрированного вируса НБ

2.1. Разработка технологии изготовления и контроля вакцины на основе концентрированного вируса НБ. Разработка новой вакцины была вызвана необходимостью  иммунизировать против НБ  птицу подсобных и фермерских хозяйств в районах расположения птицефабрик, для создания буферных иммунных зон. Ориентировочно в 2009 г. поголовье такой птицы было около 37,9 млн. голов. Дозировка коммерческих вакцин против НБ составляет, как правило, не менее 1000 доз во флаконе, что не удовлетворяет численности поголовья этих хозяйств. Для частных  потребителей  необходимо выпускать вакцину, расфасованную  в малых дозах.
Скрининговые  исследования показали, что простым разведением ВСМ не удается получить стабильный препарат в малой дозировке, поскольку вирус в разведении 100 доз во флаконе и ниже имеет большие потери активности при замораживании-высушивании и обладает очень низкой ГА-активностью. Литературные данные свидетельствовали в пользу предположения, что цель может быть достигнута использованием для изготовления вакцины концентрированного вируса, так как  основой гуморального иммунитета против вируса НБ является наличие в крови специфических антител, уровень которых зависит от гемагглютинирующей активности вакцинного штамма.
Экспериментальные серии вакцины  (с содержанием доз во флаконе 50, 100 и 250) готовили  исходя из того, что в 1 см3  ВСМ с титром инфекционности  9,5 lg ЭИД50/см3  содержится  250 назальных доз.  Вирусный  концентрат разводили  с учетом величины назальной дозы. Конечная концентрация основных ингредиентов защитной среды (пептон и лактоза) составляла 5% (табл. 1).
Концентрированный вирус обладает высокой иммуногенностью: прививная назальная доза для 15-суточных цыплят составляет в среднем 800000 ЭИД50  против  5000000 ЭИД50 в коммерческой вакцине, приготовленной по ТУ 10-19-212-86. Более высокая иммуногенность вакцины из ПВ - концентрата вируса НБ, возможно, объясняется очисткой от ГА-ингибитора. Варьирование содержания концентрированного вируса в двух мл вакцины позволяет  получать препарат с различным содержанием доз во флаконе (от 20 и выше).

Таблица 1.Биологическая активность и стабильность ВНБ экспериментальных серий вакцины

Кол-во
доз

ВСМ
ЗС

ЗС

  Инфекционная активность lg ЭИД50/ мл

Концентрат ВСМ  (nv ~10 раз)

Исходный  ВСМ

после
сушки

7 суток – 370С

37

после
сушки

7 суток – 370С

37

50

1:9

5%

9,1

8,2

0,9

8,9

7,4

1,5

100

1:4

7,5%

9,5

8,7

0,8

8.8

7,5

1,3

250

1:1

10%

9,7

8,6

0,9

8,4

8,0

0.4

В качестве стабилизатора применяли защитную среду (ЗС)  на основе гидролизата белков (пептона), содержащего пептиды, мас.%: высокомолекулярные (30000-80000g) – 10-15; среднемолекулярные (5000-20000g) – 68-70; низкомолекулярные (5000g) – остальное.
Полученная вакцина безвредна и не реактогенна, стабильна при хранении. Комиссионные испытания  во ВНИТИБП  и в одном из предприятий биологической промышленности подтвердили эти результаты. Вакцина, приготовленная из очищенного и концентрированного ВСМ, обладает высокой биологической активностью: титры ГА (8,0 lоg2, в контроле – 6,0 lоg2)и иммуногенность  (lg ЭД50/см3равен 6,5,  в контроле lg ЭД50/см3- 4,9) (Р >0,05).
Для устранения побочного эффекта процесса ультрафильтрации (агрегация вирусных частиц в концентрате, приводящая к получению заниженных данных о титрах вируса, особенно после длительного хранения) предложено использовать специальный растворитель, обладающий дезагрегирующей активностью («Авистим Р1»), в состав которого входят пептон, фосфатно-буферная система, трилон Б и твин-80.  Новую вакцину против НБ из очищенного и концентрированного вируса штамма «Ла-Сота» назвали «Моновак-НБ-форте».
Испытания вакцины «Моновак-НБ-форте» опытно-промышленной серии  проводили в условиях прмышленного птицеводства на птице (9 тыс. голов) породы леггорн кросса «Беларусь-9». Птицу вакцинировали в возрасте 17-19 суток и ревакцинировали спустя 30 дней интраназально с использованием растворителя «Авистим – Р1». Прививная доза равнялась 5 000 000 ЭИД50мл. Через три месяца после ревакцинации проводили контрольное заражение (10 000 ЛД50 вирулентного вируса НБ).  Титр сывороточных антител перед заражением составил 3,86 log2. Вакцинированная птица в течение срока наблюдения (10 дней) не проявила клиники НБ и выжила (100%-ная защита от контрольного заражения). Вся невакцинированная птица погибла.
В НД на вакцину  введены следующие дополнительные контроли готовой продукции: отсутствие контаминации  микоплазмами; определение идентичности  вакцинного вируса;  гемагглютинирующая  активность вируса, термостабильность вакцины, расчет количества  доз во флаконе.
Вакцина предназначена для иммунизации птицы в условиях промышленного птицеводства  и в хозяйствах с малым поголовьем (фермерские хозяйства и декоративное птицеводство). Вакцина может  применяться интраназально, перорально (выпаиванием) и аэрозольно, в том числе для камерной вакцинации цыплят в однодневном возрасте. Интраназально и аэрозольно вакцина применяется с растворителем «Авистим – Р1».
2.2. Разработка  технологии изготовления ассоциированной вакцины против НБ и ИЛТ. Исследования проводились в рамках Договора о творческом сотрудничестве между ВНИВИП и ВНИТИБП, заключенного по «Плану комплексных исследований по изучению и созданию ассоциированных вакцин (живых и инактивированных) против болезней птиц при научно-техническом сотрудничестве ВНИВИП и фирмы Рон-Мерьё (Франция)».
Для изучения возможности одновременного использования в составе вакцины вирусов  ИЛТ штамм «ВНИИБП» и НБ штамм «Ла-Сота» проведено два модельных опыта. При одновременной  инокуляции цыплятам вакцинных штаммов вирусов НБ и ИЛТ не выявлено повышение  реактогенности. Совместное культивирование  вирусов в КЭ в следующих дозах: вирус  ИЛТ -  3000 ЭИД50/0,1см3 и вирус НБ – 10, 100, 1000 и 3000 ЭИД50/0,1 см3;  вирус НБ - 3000 ЭИД50/0,1см3 и вирус  ИЛТ - 10, 100, 1000 и 3000 ЭИД50/0,1 см3  не вызывает интерференции  между ними.  Показатели гуморального иммунитета и устойчивости цыплят к контрольному заражению статистически достоверно не отличаются от этих показателей при  использовании  моновакцин.
Для конструирования ассоциированной живой вакцины против НБ и ИЛТ накопление вирусов проводили  раздельно с использованием технологий получения моновакцин с последующим концентрированием  ВСМ  НБ (см.1.3.). Использование концентрата вируса НБ позволяет избежать разбавления ВСМ  ИЛТ (гомогенизированные хориоаллантоисные оболочки вместе с экстраэмбриональной жидкостью РЭК), не подлежащего концентрированию.
Соотношение вирусов НБ и ИЛТ  в вакцине определено с учетом  их активности до и после сублимационного высушивания и оптимальных величин доз этих вирусов в зависимости от предполагаемого способа применения вакцины. Количество доз вакцины рассчитывали по биологической активности вируса ИЛТ. ВСМ объединяли из расчета 1 ЭИД50 вакцинного вируса ИЛТ плюс 4000 ЭИД50 вакцинного вируса НБ.
При выборе защитной среды для высушивания вакцины сравнивали две: СПЛФ  (ВНИТИБП) и  среду ВНИВИП. Определение биологической активности вирусов НБ и ИЛТ после высушивания показало отсутствие статистически достоверных различий. Выбор был сделан в пользу СПЛФ, которая к тому времени была внедрена и использовалась в биологическом производстве, в том числе в процессе промышленного изготовления сухой вакцины против ИЛТ птиц из штамма «ВНИВИП». Совместно с сотрудниками лаборатории сублимационного высушивания ВНИТИБП разработан режим замораживания-высушивания вакцины, определен допустимый уровень остаточной  влажности после высушивания  4%.  Стабильность биологической активности вирусов  в образцах сухой вакцины определяли  экспресс-тестом (+370 С-7 суток) и долгосрочным хранением при температуре + 4+60С.  По результатам определения стабильности установлено, что при  изготовлении вакцины титр ИА вируса НБ должен быть 9,75-10,0 lg ЭИД50/ см3;  вируса ИЛТ  5,5 -5,7 lg ЭИД50/ см3.
  Опытным путем подтверждены безвредность и отсутствие реактогенности 10-кратной дозы вакцины  для цыплят 15-17- дневного возраста. Изучение иммуногенных свойств  вакцины проводили на цыплятах того же возраста породы белый леггорн. При окулярном способе вакцинации цыплятам наносили на конъюнктиву по 1 дозе вакцины, содержащей 1000 ЭИД50 вируса ИЛТ и 4 000 000 ЭИД50 вируса НБ. Вакцина индуцировала у 100% цыплят напряженный иммунитет к вирусу НБ (титр антител по группам 5,0 - 6,5 log2) и обеспечивала 100% защиту от 1000 ЛД50  вирулентного вируса. При окулярной иммунизации ассоциированной вакциной  по сравнению с соответствующей моновакциной титр гемагглютининов и устойчивость цыплят к контрольному заражению 1000 ЛД50  вируса НБ значимо не отличались друг от друга (таблица 2).
Таблица 2.  Иммуногенность вакцины при окулярнома) и энтеральномб) методах вакцинации


п/п

Вак-
цина

Кол-во
птиц

Титр анти-ГА
( log2) к 
вирусу НБ

Устойчивость к 1000 ЛД50
вирулентного
вируса НБ

Титр вируснейтрализующих антител к 
вирусу ИЛТ

Устойчивость к 1000 ИД50
вирулентного
вируса ИЛТ

До вак-ци-
на-
ции

Через
15
дней

Забо-
лело

r*

Р

До
вак-
ци-
на
-ции

Через
15
дней

Забо-лело

r*

Р

1а)

НБ и
ИЛТ

91

2,0

6,5

0/31

- 1,0

<0,05


0,3


2,16


5/60


-0,85


<0,05

2а)

НБ

20

2,0

6,3

0/20

- 1,0

<0,05

0,3

0,3

-

-

-

3а)

ИЛТ

47

2,0

2,0

-

-

-

0,3

2,34

3/47

-0,90

<0.05

4а)

Конт-
роль

40

2,0

2,0

0/20

-

-

0,3

0,3

20/20

-

-

1б)

НБ и
ИЛТ

56

2,0

5.2

2/21

- 0,9

<0,05

0,5


2,20


3/35


-0.89


<0.05

2б)

НБ

53

2,0

5,5

0/20

-1,0

<0,05

0,5

0,5

-

-

-

3б)

ИЛТ

20

2,0

2,0

-

-

-

0,5

2,20

4/53

-0,89

<0,05

4б)

Конт-
роль

60

2,0

2,0

20/20

-

-

0,5

0,5

39/40

-

-

r* -коэффициент корреляции, Р – достоверность
К вирусу  ИЛТ вакцина индуцировала выработку вируснейтрализующих антител со среднегеометрически титром, равным  2,16, а при применении моновакцины  2,34. Коэффициенты  корреляции устойчивости к вирулентным вирусам составили: к вирулентному штамму  вируса НБ  - 1,0 (для ассоциированной и моновакцины);  к вирулентному вирусу ИЛТ  (1000 ИД50) штамма «24а» - 0,85 и – 0,9  (для ассоциированной и моновакцины, соответственно).
Иммуногенность вакцины при энтеральном методе введения определяли путем выпаивания птицам  по  4  дозы (4000 ЭИД50) вируса ИЛТ и 16 000 000 ЭИД50 вируса НБ  (таблица 2). Титр сывороточных антител  к вирусу НБ при применении ассоциированной вакцины  5,2 log2, а при применении моновакцины -5,5 log2. При контрольном заражении цыплят, вакцинированных ассоциированной вакциной, коэффициент корреляции устойчивости к контрольному заражению вирулентным вирусом НБ (1000 ЛД50) равнялся -0,90, а при применении моновакцины -1,0. Аналогичные результаты получены в отношении вируса ИЛТ (1000 ИД50).
При нанесении ассоциированной вакцины на конъюнктиву глаза птицы и при пероральном (с питьевой водой) применении формировался напряженный  иммунитет со 100% защитой цыплят при заражении вирулентными вирусами. 
Глава 3. Разработка высокоэффективных и экологически безопасных способов
  (технологий) вакцинации  цыплят-бройлеров против ньюкаслской болезни
3.1. Разработка спрей метода вакцинации цыплят-бройлеров против НБ. Спрей состоит из относительно крупных капель (250 µ и выше) по сравнению с диаметром капель в аэрозоле (около 50 µ). Этим основным различием обусловливается разница между распылением и аэрозольным введением в потерях суспензии вакцины,  в эффективности и безопасности процедуры вакцинации. Крупнокапельное распыление особенно эффективно для введения вакцин против респираторных вирусов. Для успешной вакцинации необходимо знание принципов ее проведения, а также точное и надежное оборудование.
Исследования проводили на базе ЭПХ  ВНИТИП с целью определения возможности  применения спрей - метода вакцинации против НБ  цыплят-бройлеров в условиях промышленного птицеводства. Решались задачи: разработать режим спрей-вакцинации птицы с учетом факторов (возраст птицы, доза вакцины, количество растворителя), влияющих на эффективность вакцинации.
Для вакцинации применяли спрейер «GLORIA» с ручным приводом  Рrima 5 Тур 42Е (Германия), который при максимальных: объеме 5 л; давлении  3 атм. (0,3 МПа); температуре + 400С обеспечивал дисперсность частиц: 100-300µ – 17%, 400-700µ – 55,5%, 800µ и более 27,5%. Угол распыления (град.) составлял – 60, а диаметр факела – 0,9 м.
Использована вакцина против НБ  штамм «Ла-Сота» (ТУ 10-19-212-86) опытного производства ВНИТИБП. Инфекционная активность вакцины в момент применения  9,0 lg ЭИД50/см3, назальная доза составляла 6,7 lg ЭИД50/см3.
Вакцинировали птицу  (кросс Конкурент) утром до кормления, общее поголовье 26774. Птица находилась в клетках (цыплята-бройлеры) и на полу (ремонтный молодняк).
В предварительных исследованиях  на цыплятах-бройлерах (390 голов) определено соотношение количества вакцины(1, 5 и 10 назальных доз) и объема растворителя – дистиллированная вода  (5 и 10 мл на голову), обеспечивающее напряженный иммунитет у вакцинируемой птицы (в процессе наблюдения). Величина титра сывороточных антител (по РТГА) не зависела от дозы вакцины и количества растворителя и варьировала от 8,3 lоg2 в группе цыплят, вакцинированных 1 назальной дозой и 5,4-5,7 lоg2 в остальных группах.
В дальнейшем для первой вакцинации цыплят ремонтного молодняка (12584 головы – возраст 24 дня) применяли 0,5 назальной дозы в объеме растворителя 1 мл на голову. Спустя 15 дней средний титр антител составлял 5,1 lоg2. Ревакцинацию проводили той же дозой в возрасте 50 дней, к концу срока наблюдения (74 дня) титр антител составлял в среднем 4,2 lоg2.
  В таблице 3 приведены  обобщенные данные по уровню сывороточных антител у цыплят-бройлеров, вакцинированных 0,5 и 1 назальной дозой в возрасте 18 и 24 дня  и ревакцинированных в возрасте 50 и 54 дня (0,5 назальных доз).
Таблица 3. Динамика титра антител у цыплят  в процессе иммуногенеза: *- уровень материнских антител, **-  средний титр сывороточных антител (24 пробы).

п/п
опыт-
ных
групп

Пого-
ловье

Воз-
раст

Вакцинация

  Титр сывороточных антител**
  (log2)

Ревакцина-
ция

Кол-во
наза-
льных
доз
вакци-
ны

Кол-во
раст-
вори-
теля

МАТ*

Через
14 су-
ток
после
вакци-
нации

Возраст птицы

Кол-во на-
зальных
доз
вак-
цины/
/возраст

40

50

60

74

96

1

2100

18

1

2,5

1,4

4,0

4,5

4,0

4,0

6,25

5,0



0,5/ 54

2

1600

18

1

1,0

1,4

4,6

3

1300

18

0,5

1,0

1,4

4,5

4

1950

18

1

1,0

1,4

5,0

5

1800

18

1

1,0

1,4

5,7

6

1300

18

1

1,0

1,4

3,3

7

1950

18

1

1,0

1,4

7.0

8

12584

24

0,5

1,0

1,0

5,1

5,0

6,5

6.4

4,2

-

0,5/ 50

9

1800

18

0,5

1,0

1,0

5.7

4,5

4,3

3,4

-

-

-


Данные табл. 3 подтверждают эффективность  вакцинации цыплят-бройлеров крупнокапельным  распылением (спрей - метод) в случае применения вакцины против НБ  штамм «Ла-Сота». Только в одном из опытов (10% вакцинированной птицы)  титр антител был 3,3 lоg2, тогда как у остальной птицы он был в пределах от 4,0 до 7,0  lоg2. Опытным путем определено соотношение  доза вакцины / объем растворителя (0,5-1 доза/1см3), обеспечивающее напряженный иммунитет у вакцинируемой птицы (в процессе наблюдения)  для первой  и повторной вакцинации. Проведен сравнительный анализ различных способов вакцинации птицы по показателям: эффективность, преимущества/недостатки и затраты (табл. 4).
Интраназальный способ (индивидуальный). Преимущества: индивидуальное дозирование; ровная напряженность иммунитета в стаде; низкий расход вакцины. Недостатки: стрессовая ситуация и травматизм птицы, связанные с отловом;  трудоемкость (8 человек вакцинируют 12000 голов в течение 8 часов). Оральный способ – выпаивание (массовый). Преимущества: легкий, нетрудоемкий процесс (3 человека вакцинируют 12000 голов за 2 часа). Недостатки: повышенный расход вакцины; неровный иммунитет в стаде; в случае инактивации вакцинного вируса в системе выпаивания, как следствие, низкая напряженность иммунитета. Крупнокапельный аэрозольный способ (массовый). Преимущества: низкий расход вакцины; отсутствие стрессовой ситуации и травматизма, связанных с отловом; высокий уровень антител. Недостатки: вероятность неровного уровня иммунитета в стаде.
Таблица 4. Финансовые затраты на проведение вакцинации ( *- в ценах 2003 г.)


Показатели

Способ вакцинации

Интраназальный

Оральный

Крупнокапельный
  спрей

Титр антител  log2.

3,0

4,0

  4,5

Затраты на вакцинацию 1000 голов (руб.)*

 
75


  150


15


Сравнительный анализ различных способов вакцинации подтвердил преимущества спрей-метода (крупнокапельного распыления).

3.2. Разработка камерной аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров против НБ. Исследования проводили во ВНИТИБП и на базе ЭПХ ВНИТИП с целью разработки экологически безопасной технологии вакцинации цыплят-бройлеров при переводе их из инкубатория в птичник, которая включает в себя: использование специального оборудования, режимы вакцинации, препараты, условия вакцинации (возраст птицы, материнские антитела, доза вакцины и растворитель).
Для разработки исходных требований на герметичную камерную установку  проведена серия опытов в экспериментальной камере конструкции  НКС ВНИТИП. Использовали вакцину против НБ штамм «Ла-Сота», с активностью  9,0 lg ЭИД50/см3 и  растворитель 10%-ный р-р глицерина в дистиллированной воде. Испытывали разведения вакцины 1:10, 1:100, 1:500, 1:1000,1:5000 и экспозицию вакцинации 1 и 2 минуты. Распыление проводили  генераторами  микроСАГ и ДАГ.
Установлено, что при вакцинации цыплят с низкими титрами материнских антител (МАТ) 3,0-6,0 lоg2 и экспозиции 1 минута,  разведения вакцины  1:500, 1:1000 и 1:5000 недостаточны для создания иммунитета (напряженность иммунитета – 0%, уровень защиты, соответственно  67, 34, 50%). Разведение вакцины  1:100  обеспечивает 100%-ный уровень защиты против 1000 ЛД50;  разведение вакцины  1:16 приводит к увеличению расхода вакцины и дает  результаты, аналогичные группе с 1:100.
При вакцинации цыплят с высоким уровнем МАТ (5,0-7,0 lоg2): экспозиция 1 минута при разведении вакцины  1:100 была недостаточной; 100%-ная защита от 1000 ЛД50/0,2 см3 достигалась при этом разведении и экспозиции  2 минуты.
Анализ результатов опытов в экспериментальной камере показал возможность вакцинации цыплят-бройлеров в возрасте 1 суток независимо от уровня МАТ. Применение  вакцины с ИА 9,0-9,5 lg ЭИД50/см3 обеспечивает 100%-ный уровень защиты птицы при контрольном заражении ( разведение вакцины 1:100, экспозиция - 2 минуты с использованием микроСАГа). На основе полученных данных  разработаны исходные требования на герметичную камеру и во ВНИТИП изготовлена опытно-промышленная установка для камерной вакцинации.
При испытании камеры подтверждена ее герметичность.  Использование микроСАГа обеспечивало параметры распыления вакцины,  необходимые для эффективной вакцинации: расход вакцины  2-4 см3/мин, содержание частиц аэрозоля размером 0,5 – 9,0 мкм - 99%, ИА вируса в аэрозоле равномерна по всему объему 4,0 ± 0,4 lg ЭИД 50/см3. Определена иммунизирующая доза для цыпленка в возрасте 1 сутки, которая составила  200 ЭИД50.
  Проведено сравнительное испытание эффективности вакцин: коммерческой (ТУ 10-19-212-86) и новой Моновак-НБ-форте (ТУ 10.07-026-93). Испытуемые вакцины обладали одинаковой активностью 9,0  lg ЭИД50/мл. Параметры  вакцинации в камере: разведение вакцины 1: 100;  растворитель  10%-ный раствор глицерина в дистиллированной воде; экспозиция вакцинации  2 минуты; генераторы  2 микроСАГа.
Установлена более высокая  активность  вируса в аэрозоле вакцины «Моновак-НБ-форте», чем в коммерческой вакцине,  при одинаковой исходной активности. Обе  вакцины  обеспечивали  необходимый уровень (80-100%) защиты птицы при контрольном заражении 1000 и 10000 ЛД50  вирулентного вируса НБ независимо от уровня МАТ.
  У вакцины «Моновак-НБ-форте»  в отличие от коммерческой вакцины отсутствовала реактогенность.  При использовании «Моновак-НБ-форте» наблюдали  одинаковый характер динамики антител у цыплят с разным уровнем МАТ.  Разведение вакцины 1:100 обеспечивает при 2- минутной экспозиции  вакцинальную дозу 200 ЭИД 50 и 100%-ную защиту (против 1000 ЛД 50 вирулентного вируса)  цыплят в возрасте 8 недель с низким уровнем МАТ 3,0 – 6,0 lоg2  (несмотря на отсутствие  антител) и  с высоким уровнем МАТ 5,0 – 7,0 lоg2 (титр специфических антител 3,0 lоg2). В контрольной группе после заражения вся птица погибла.
В проведенных опытах не наблюдалось поствакцинальных осложнений. Проявление реактогенности коммерческой вакцины колебалось от полного ее отсутствия до легкой респираторной реакции в зависимости от уровня МАТ и дозы вакцины, чем выше МАТ и ниже доза вакцины, тем слабее респираторная реакция. Такой уровень защиты птицы от заражения даже при низком уровне антител можно объяснить тем, что аэрозольная вакцинация живыми вакцинами стимулирует все системы иммунитета: гуморальный (антитела: нейтрализующие, комплементсвязывающие, антигемагглютинирующие), клеточный, секреторный иммунитет респираторного и желудочно-кишечного трактов, выработку интерферона. 
Для ревакцинации цыплят-бройлеров на случай  угрожающей эпизоотической ситуации проводили ревакцинацию  (перорально - выпаиванием). Опытным путем установлено, что  у всех  вакцинированных цыплят напряженность иммунитета через 2 и 3 недели составиляет 100%.  К  4 неделе у вакцинированной птицы происходит  значительное снижение титров антител и напряженности иммунитета до 50%. Ревакцинация птицы  в  возрасте 4-х  недель приводит к повышению напряженности иммунитета, который в 6 и 8 недель составляет 80% и 80%,  соответственно.  Контрольное заражение птицы в 56 дней 10000 ЛД50 вирулентного штамма  вируса НБ показало  наличие 100% защиты вакцинированной птицы при 100%  гибели птицы контрольной группы.
  Глава 4. Опытное производство ВНИТИБП, управление технологическим процессом производства вакцины против НБ (в соответствии с требованиями стандартов ИСО с.9000 и Правил GMP).
Опытное производство. Во ВНИТИБП на базе отдела обеспечения качества создано опытное производство эмбриональных вакцин против НБ из штаммов «Ла-Сота», «В1», «Бор-74 ВГНКИ», «Н» и «ГАМ-61» . Выпускаемая продукция соответствует требованиям нормативных документов, сертифицирована в Системе сертификации ГОСТ Р. Аттестат ВГНКИ  № 257 от 01.06.98 г. Общий объем реализованной вакцины против НБ - 273,86 млн. доз.
Стабильное качество вакцины обеспечивается соблюдением технологической дисциплины в процессе производства и контроля. Для высушивания вакцины используется защитная среда на основе гидролизата белка (пептона), эффект защиты которой при высушивании и хранении готового препарата по отношению к обезжиренному молоку  2,5. Контроль стабильности вакцины осуществляется при помощи экспресс – теста по величине  (37). При определении титра ИА вируса в качестве контроля применяют образцы лабораторной эталонной серии вакцины. Длительное хранение препаратов в условиях лаборатории контроля  подтверждает сохранность активности  в течение одного года при +40С (срок годности по НД) и более (табл. 5).

Таблица5. Результаты длительного хранения выборочных серий вакцины против НБ

Штамм
ВНБ

Инфекционная активность lg ЭИД50/см3 *

После
высуши-
вания

После
370С -
7 дней

370С

Хранение (лет)

Разрешено
применять

1

2

2,5

3

«В1»

9,0

8,0

1,0

9,0

-

-

-

8,5

«Ла-Сота»

9,5

9,1

0,4

9,5

9,0

-

8.3

8,5

«Бор-74 ВГНКИ»

9,75

9,3

0,45

9.5

9,1

-

-

8,5

«Н»

9,0

8,0

1.0

9,0

8,3

8,0

-

7,0

«ГАМ-61»

9.5

9,0

0,5

9,3

-

-

-

9,0

* -  для вакцин из лентогенных штаммов;  для вакцин из мезогенных штаммов - lg ЛД50/см3.
Документирование технологического процесса. Технологический регламент производства вакцины против НБ, включает блок-схемы технологического процесса (ТП) и контроля качества вакцины в процессе производства. ТП состоит из 15-ти основных стадий,10-ти подготовительных и  9-ти стадий вспомогательных  работ. Разработаны: Спецификации (внутренние документы предприятия, подробно описывающие  требования  к используемым или получаемым в процессе производства материалам и продукции) и Маршрутная карта, в которой отражаются все необходимые параметры производственного процесса и  стадии получения продукта.
  Составлена таблица  контрольных точек (КТ) производства вакцины с указанием контролируемых показателей. Всего определено  57 КТ, общее число контролируемых показателей в этих точках 93. Показатели систематизированы по группам: физические - 12, микробиологические- 2, физико-химические - 7 и биологические - 9.
Составлен перечень критических зон и процессов. Семь процессов признаны критическими по отношению к безопасности продукта. Таким образом, из 57 КТ (общее количество)  9 являются  критическими  (ККТ), так как относятся к контролю критических процессов, из них  восемь точек – это контроль стерильности и микробного загрязнения. Для ККТ установлены критические пределы, что позволяет своевременно изолировать  несоответствующий продукт. 
Микробиологический мониторинг производства. На протяжении  ТП контроль стерильности и микробного загрязнения проводится в 25-ти точках. Определены критические зоны, для которых обязательным является микробиологический мониторинг производственной среды, основная цель которого - гарантия стабильности асептических условий производства, выявление начальных отклонений и выработка корректирующих действий до возникновения ситуаций, приводящих к выявлению нестерильной (несоответствующей) продукции. В нашей практике применяется  прямой метод осаждения микроорганизмов на поверхность чашек Петри, методы смыва и отпечатков. За уровень тревоги принят такой уровень КОЕ (колониеобразующих единиц), который соответствует потенциальному дрейфу в сторону увеличения от нормальных условий производства.
Вирусологические характеристики производственных вакцинных штаммов НБ. Важнейшим требованием, предъявляемым  к  вирусным вакцинам, является  безопасность. Один из этапов ее  обеспечения - строгое соблюдение  регламентируемого  количественного  и качественного  состава препарата. Нами проведены исследования производственных штаммов вируса НБ по показателям,  рекомендованным ВОЗ. Установлено, что по основным характеристикам (среднее время гибели КЭ; индексы патогенности вируса  для цыплят однодневного и 6- недельного возраста при интрацеребральном и интравенозном введениях, соответственно; стабильность ИА вируса при рН 2,8-3,0; термостабильность ГА вируса при +560С; агглютинабельность  вируса по отношению к эритроцитам петуха, крупного рогатого скота и лошади)  вирус НБ указанных штаммов  соответствует требованиям ВОЗ для лентогенных и мезогенных штаммов.
  При электронномикроскопическом исследовании подтверждена морфология и полноценность вирусных  частиц исследуемых штаммов. Контаминации чужеродными вирусами не установлена. Результаты свидетельствуют о качестве вакцинных штаммов вируса НБ.
Оценка стабильности производства вакцины против НБ. Методы математической статистики – важный элемент современного подхода для управления качеством на производстве. Под статистическими методами управления качеством продукции понимаются выборочные методы контроля, при которых решения об объеме выборки и ее характеристиках, приемлемости контролируемых процессов и продукции основываются на теории вероятности и математической статистики. С их помощью по ограниченному числу испытаний можно проводить анализ точности и стабильности технологических процессов и их регулирование, выборочный приемочный контроль и оценку общего уровня качества продукции. Классическая модель обеспечения качества продукции в процессе производства: постоянное наблюдение своевременное выявление дефектов устранение причины дефектов принятие мер по их устранению. В этом залог стабильности производства и, как следствие, качества выпускаемой продукции.
В нашей работе методы статистической обработки данных использованы в качестве инструмента управления ТП изготовления вакцины. Для оценки точности и стабильности производства вакцины против НБ по основному показателю качества (инфекционная активность  вируса) применяли  метод построения гистограмм распределения и  контрольные карты Шухарта.
Форма полученных гистограмм с двусторонней симметрией и распределение накопленной частоты свидетельствуют о нормальном распределении данных и позволяют сделать вывод о стабильности технологического процесса.
  Для выявления особых причин повышенной вариабельности продукции служат карты Шухарта, которые графически изображают динамику процесса производства: изменение показателей качества во времени и применяются для регулирования и анализа технологических процессов. Для оценки контрольных границ карты (границ регулирования) применяют трехкратное среднее квадратическое (стандартное) отклонение. В нашей работе используется карта средних значений инфекционной активности вакцины и их размаха (, R).
Таким образом, разработана технологическая документация производства вакцины против НБ; система микробиологического мониторинга; с применением методов статистической обработки данных проведена оценка точности основного показателя качества (инфекционной активности  вируса) и стабильности технологического процесса.

 

4. ВЫВОДЫ:

1. В качестве модели для исследования современных возможностей совершенствования производства и применения иммунобиологических препаратов избрана вакцина против ньюкаслской болезни (НБ), доля которой составляет в Российской Федерации 23% от общего объема выпускаемых вакцин против инфекционных болезней птиц.
На избранной модели усовершенствованы и разработаны методы и технологические процессы, направленные на обеспечение основных составляющих качество вакцины (стабильность, эффективность, безопасность), а также эффективные и экологически безопасные способы ее применения.
2. Исследована кинетика термоинактивации биологической активности вируса НБ в жидкой и сухой вакцинах. Показан линейный характер процесса термоинактивации, характеристикой которого является константа скорости инактивации (КТ), что позволяет обоснованно перейти к количественной оценке стабильности биологической активности иммунобиологических препаратов. Предложен экспресс-тест оценки стабильности инфекционной активности вируса (+370С- 7 суток). Показана возможность использования уравнения Аррениуса для прогнозирования сроков годности вакцины при температурах хранения.
3. Научно обоснована и определена в экспериментальных и производственных условиях иммунизирующая доза вакцины против НБ штамм «Ла-Сота» для птицы различного возраста при интраназальной и пероральной вакцинации. В опытах прямого заражения 10000 ЛД50 вирулентного вируса НБ штамм «Т-53» установлена 100%-ная профилактическая эффективность дозы вакцины.
4. Исследована эффективность микрофильтрационных методов (ядерных и фторопластовых мембран, ультрафильтрации на полых волокнах) для оценки и концентрирования вируса НБ. Наиболее технологичным признан метод концентрирования ультрафильтрацией на полых волокнах, характеризующийся низкими энергоемкостью и эксплуатационными расходами. Применение метода обеспечивает получение концентрированного вируса НБ с высокой биологической активностью: гемагглютинирующая – 11,0-13,0 log2 , инфекционная – 9,9-11,0 lgЭИД50/см3. Концентрирование вируссодержащей жидкости в 8-12 раз по объему сопровождается частичной очисткой по белку (содержание общего белка в концентрате снижено на 65% в среднем).
Установлены следующие параметры концентрирования на полых волокнах: рабочее давление 0,08-0,12 МПа, линейная скорость потока жидкости 0,1-0,8 м/с.
5. На основе концентрированного вируса НБ разработана технология изготовления и контроля вакцины («Моновак-НБ-форте») для иммунизации птицы в промышленном птицеводстве и в подсобных и фермерских хозяйствах с целью создания буферных иммунных зон. Вакцина не реактогенна и стабильна при хранении. В производственных условиях показано, что предлагаемая технология позволяет обеспечить  высокий титр гемагглютинирующей активности (8,0 log2 против 6,0 log2  в контроле) и иммуногенность (100%-ная защита от контрольного заражения). Вакцина предназначена для применения: интраназально, перорально (с питьевой водой) и аэрозольно, в том числе для камерной вакцинации.
6. Разработана технология изготовления ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ) птиц. В модельных опытах установлено, что одновременное использование в составе вакцины вирусов  НБ и ИЛТ не вызывает интерференции между ними и не повышает реактогенности вакцины. Показатели измеряемого иммунитета (титры специфических антител) у вакцинированной птицы не отличаются от таковых при моновакцинации. Определены оптимальные соотношения вирусов в составе вакцины и защитная среда для высушивания. При изготовлении вакцины титры инфекционной активности вирусов должны составлять: для вируса НБ 9,75-10,0 lg ЭИД50/ см3;  для вируса ИЛТ  5,5 -5,7 lg ЭИД50/ см3. Вакцина обладает высокой иммуногенностью. При нанесении вакцины  на конъюнктиву глаза и при пероральном применении (с питьевой водой) формируется напряженный иммунитет со 100% защитой птицы при заражении вирулентными вирусами НБ и ИЛТ.
7. В экспериментальных условиях установлена эффективность вакцинации цыплят-бройлеров (в однодневном возрасте и старше) крупнокапельным распылением вакцины  при дисперсности частиц: 100-300µ – 17%, 400-700µ – 55,5%, 800µ и более 27,5%. Определено соотношение  доза вакцины/объем растворителя, при котором обеспечивается напряженный иммунитет у птицы после первой вакцинации и ревакцинации.
В производственных условиях проведен сравнительный анализ способов вакцинации: интраназального, перорального (выпаиванием) и крупнокапельного распыления по критериям эффективность, преимущества/недостатки, затраты. Показано, что уровень затрат на вакцинацию 1000 голов методом крупнокапельного распыления в 5 и 10 раз меньше по сравнению с интраназальным способом и пероральным, соответственно.
8. Разработан экологически безопасный способ аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров однодневного возраста в малогабаритной герметичной камере специальной конструкции, который является альтернативой традиционному аэрозольному методу вакцинации. Метод  удачно вписывается в общую поточную технологию производства бройлеров, при этом исключается выброс вакцинного вируса в окружающую среду.
Определена доза вакцины против НБ из штамма «Ла-Сота» - 200 ЭИД50, которая не вызывает реактогенности при вакцинации, обеспечивает необходимый уровень защиты цыплят-бройлеров с уровнем материнских антител от (0 до 7,0 log2) при контрольном заражении.
Сочетание аэрозольной вакцинации с  ревакцинацией (пероральным методом) позволяет повысить эффективность специфической защиты цыплят против НБ.
9. С использованием результатов проведенных исследований и разработок  на базе отдела обеспечения качества организовано опытное производство эмбриональных вакцин против НБ из штаммов «Ла-Сота», «В1», «Бор-74 ВГНКИ», «Н» и «ГАМ-61», в деятельности которого реализуются основные принципы обеспечения качества лекарственных средств  для животных, требуемые стандартами ИСО серии 9000 и Правилами GMP.  Производство аттестовано ВГНКИ (аттестат № 257 от 01. 06. 98 г.), общий объем реализованной вакцины против НБ  273,86 млн. доз.
10.  Для обеспечения основных показателей качества вакцин (стабильность, эффективность, безопасность) и управления технологическим процессом в опытном производстве:
- разработан полный комплект технологической документации;
- определены основные характеристики вакцинных штаммов вируса НБ согласно требованиям ВОЗ для лентогенных и мезогенных штаммов;
- организован микробиологический мониторинг производства;
- для оценки точности основного показателя качества (инфекционной активности вакцины) и стабильности технологического процесса использован метод гистограмм, а для регулирования этих процессов – контрольные карты Шухарта.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ:
  Для практического использования предложены:
  Комплекты  нормативной документации:
- по изготовлению и контролю сухой вакцины против НБ штамм «Ла-Сота», утв. ГУВ  (4 наименования);
- по изготовлению и контролю сухой вакцины против НБ штамм «Бор-74 ВГНКИ», утв. ГУВ 21. 08. 1990 г.  (2 наименования);
- по изготовлению, контролю и применению  вирусвакцины сухой комбинированной против НБ  штамм «Ла-Сота» и ИЛТ птиц  штамм «ВНИИБП», утв. ГУВ 19. 02. 1996 г. (3 наименования);
- по контролю и применению вакцины «МОНОВАК-НБ-ФОРТЕ» (2 наименования);
- по изготовлению и применению Среда защитная (СПЛФ - жидкая), утв. ГУВ Госагропрома СССР 10 ноября 1988 г. (2 наименования);
- Временное наставление  по аэрозольной вакцинации против ньюкаслской болезни цыплят-бройлеров в камерной установке ВНИТИП (в порядке производственного опыта), №22-4/43, утв. ГУВ Минсельхоза России 25 июня 1992 г. 
- Методические рекомендации по разработке режимов замораживания-высушивания биологических препаратов /утв. Главбиопромом Минсельхоза СССР 1.10.1980 г., опубликованы в качестве пособия в 1981 г., Профиздат, 34 с.;
- ОСТ 100083-95 Продукция агробиологической промышленности. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, построения, согласования и утверждения. - 1994, 100 с.;
- Методические рекомендации. Технология камерной аэрозольной вакцинации цыплят против ньюкаслской болезни  /РАСХН – ВНИиТИБП - ВНИТИП – Вирусологический центр НИИ микробиологии МОРФ.- Сергиев Посад, -ВНИВИП, 1996 г. -  53 с.;
- Руководство по разработке системы технологической документации на предприятии биологической промышленности или опытном производстве соответствующего профиля (утв. РАСХН 2004г.)// Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины,  ч. 2.  Методы  исследований в области паразитологии, эпизоотического мониторинга, биотехнологии. РАСХН отд.е вет. медицины, Москва, 2006, с. 312-348;
- Методические рекомендации по исследованию стабильности иммунобиопрепаратов на этапе разработки и в условиях действующего производства.  (утв. РАСХН - 28.03.08 г.)//М.- 2009г - 32 с.
- Методические рекомендации по реализации процессного подхода на биофармпредприятиях агробиологической промышленности в системе целевых мероприятий по внедрению системы менеджмента качества по требованиям международного стандарта ИСО 9001:2000 (утв. РАСХН ноябрь 2006г.), 2006, 28 с.;
- Требования к производству вакцины против ньюкаслской болезни (  1-я редакция). утв. РАСХН ноябрь  2005 г.;
- Руководство по обследованию предприятия биологической промышленности или опытного производства при организации соответствующего профиля на соответствие современным требования менеджмента качества. утв. РАСХН  ноябрь  2005 г.;
- Методические рекомендации по проведению крупнокапельной вакцинации цыплят-бройлеров (спрей – метод) против ньюкаслской болезни. утв. РАСХН  2005г.
 
5. Список основных публикаций по теме диссертации:
  1. Статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК:

1. Токарик Э.Ф. Стандартизация дозы вирусвакцины против ньюкаслской болезни /Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Айрапетов Р.Г., Слободенюк М.И., Доценко В.В., Виниченко В.А //Ветеринария.- 1991.- №5.- с.22-24.
2. Сербис Е.С. Взаимосвязь некоторых показателей качества биопрепаратов, высушенных методом сублимационной сушки / Сербис Е.С., Нежута А.А., Самуйленко А.Я. Еремец В.И., Скотникова Т.А //Вестник Академии сельскохозяйственных наук.- 2002.- №4.- с.65-66.
3. Скотникова Т.А. Теоретические предпосылки и методические подходы к определению стабильности иммунологических лекарственных средств для животных/ Ветеринария и кормление.- 2009.- №3.- с.12-13.
4. Самуйленко А.Я. Эффективная вакцинация цыплят-бройлеров против ньюкаслской болезни/ Самуйленко А.Я. , Скотникова Т.А., Неминущая Л.А. //Труды Кубанского государственного аграрного университета (серия: Ветеринарные науки).- 2009.- № 1 (ч.1).- с. 89-90.
5. Самуйленко А.Я. Стабильные  иммунобиопрепараты – залог  успешной вакцинопрофилактики птиц / Самуйленко А.Я., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А.// Труды Кубанского государственного аграрного университета (серия: Ветеринарные науки).- 2009.- № 1(ч.1).- с. 91-92.
  6. Скотникова Т.А. Методы мембранного разделения вируссодержащей суспензии при производстве вакцин против болезней птиц/ Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я.// Сельскохозяйственная биология.- 2009.- № 6.- с.23-24.
7. Скотникова Т.А. Совершенствование технологического процесса производства иммунобиологических препаратов (на модели вакцины против ньюкаслской болезни) // Ветеринария и кормление.- 2010.- № 2.-  с.14-15.
2. Патенты:
8. Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Нежута А.А., Кузнецова С.В.  Защитная среда для приготовления сухой вирусной вакцины. Патент РФ №1212045 , приоритет от 24.01.84.
9. Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Панферов В.В., Скотникова Т.А., Лихтенштейн Г.И., Кочетков В.В. Способ подбора стабилизатора для сухой вирусной вакцины. А.С. № 1314679, приоритет от 15.08.84.
10. Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Прихожай Л.А., Головина О.П. Способ изготовления ферментативного гидролизата тканей куриного эмбриона для приготовления защитных сред при производстве сухих вирусных вакцин. А.С. №1277457, приоритет от 12.09.85.
11. Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Елисеева Л.А., Смоленский В.И., Филоненко В.И. Способ профилактики болезни Ньюкасла. Патент РФ №2035915, приоритет от 28.12.92.
12. Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Смоленский В.И., Шевырев Н.С., Самуйленко А.Я. Вакцина против болезни Ньюкасла и способ ее применения. Патент РФ №2035917, приоритет от 28.12.92.
13. Слободенюк М.И., Айрапетов Р.Г., Малушко В.В., Коровин Р.Н., Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Смоленский В.И. Способ получения комбинированной вакцины против ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц. Патент РФ  №  2106152, приоритет от 16.06.93.
3. Публикации в других изданиях:
14. Скотникова Т.А. Применение  теста ускоренной термоинактивации  для  характеристики  стабильности биопрепаратов /Скотникова Т.А., Слепенко Т.Б. // ЭИ Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. – М.-1977.- №1-2.- с.25-29.
15. Токарик Э.Ф. Исследование эвтектических температур для обоснования режимов замораживания и высушивания биологических препаратов / Токарик Э.Ф., Авдеева Т.А., Нежута А.А., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А. // «Механизмы криоповреждений и криозащиты биологических структур» Киев.- 1977.- с.102-104.
16. Токарик Э.Ф. К научному обоснованию конструирования защитных сред при консервировании биопрепаратов методом сублимационного обезвоживания / Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Геворкян Н.А., Алкеев Н.В. //«Механизмы криоповреждений и криозащиты биологических структур» Киев.- 1977.- с.165-167.
17. Скотникова Т.А. Применение теста ускоренной термоинактивации для прогнозирования стабильности биопрепаратов/ Скотникова Т.А., Слепенко Т.Б.//ЭИ Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности.- 1978.- №2.- с.5-9.
18. Скотникова Т.А. К вопросу о стабильности сухой вирусвакцины против болезни Ньюкасла // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов: Тезисы докладов Всесоюзной конференции.- М.- 1978.- с.148-149.
19. Токарик Э.Ф. Стабилизация и прогнозирование сроков хранения сухой вирусвакцины  против болезни  Ньюкасла /Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А. // Резюме ХХI  Всемирного ветеринарного конгресса.- М.- 1979.- книга 6.- разд.13.- с.48.
20. Фролов Ю.Д. Стабилизация эритроцитов для постановки РГА и РЗГА с вирусом ньюкаслской болезни/ Фролов Ю.Д., Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф. //ЭИ Передовой научно-производственный  опыт в биологической промышленности.- М.- 1980.- №4.- с.11-14.
21. Скотникова Т.А. Определение и прогнозирование стабильности сухой вирусвакцины против ньюкаслской болезни (штамм Ла-Сота) // автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М.- 1981.- 16 с.
22. Ковальская Л.А. Эффективность новой защитной среды для сухой вирусвакцины против болезни Ньюкасла/ Ковальская Л.А., Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Фролов Ю.Д., Нежута А.А., Желтов В.В., Дмитриева Т.А., Скичко Л.А.// «Разработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов»: тез. докл. всесоюз. научн. конф.- 1981.- с.56.
23. Скотникова Т.А. Апробация экспресс-метода определения сроков годности сухой вирусвакцины против ньюкаслской болезни/ Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф., Желтов В.В., Скичко Л.А., Дмитриева Т.А. // «Разработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов»: тез. докл. всесоюз. научн. конф.- 1981.-  с.73.
24. Скотникова Т.А. Экспресс-метод определения сроков годности сухой вирусвакцины против ньюкаслской болезни птиц (штамм Ла-Сота)/ Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф., Алкеев Н.В., Константинов В.М. //Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов: тезисы докладов Второй Всесоюзной конференции.- М.- 1981.- с.102-103.
25. Звягин И.В. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания-высушивания биологических препаратов/ Звягин И.В., Хорьков И.А., Токарик Э.Ф. , Нежута А.А., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Фролов Ю.Д., Никитина Р.А.//.- М., 1981.- 34с.
26. Ковальская Л.А. Эффективность новой защитной среды для сухой вирусвакцины против болезни Ньюкасла/ Ковальская Л.А., Токарик  Э.Ф., Скотникова Т.А., Нежута А.А.// «Разработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов»: тез. докл. Всесоюз. конф. М.-1982.- с.14-15.
27. Токарик Э.Ф. Повышение стабильности биологической активности и иммуногенности сухой вирусвакцины против Ньюкаслской болезни птиц из лентогенных штаммов/ Токарик Э.Ф., Звягин И.В., Скотникова Т.А., Нежута А.А. // тез.докл. Всесоюз. Конф. ВИЭВ.- М.- 1982. – с.
28. Фролов Ю.Д. Типирование вируса ньюкаслской болезни лентогенных вакцинных штаммов / Фролов Ю.Д., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Токарик Э.Ф., Скичко Л.А.//ЭИ Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности.- М.- 1983.- №.3. - с.11-16.
29. Токарик Э.Ф. Оценка достоверности экспресс-метода определения стабильности вирусвакцины против ньюкаслской болезни птиц / Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А. //Система мероприятий по обеспечению эпизоотического благополучия и рентабельности птицеводческих предприятий: тезисы докладов научно-производственной конференции.- Ломоносов.- 1985.- т.2.-с.18-20.
30. Токарик Э.Ф. Экспресс-оценка стабильности биологических препаратов / Токарик Э.Ф., Сапегина Е.П., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А. Александрова М.Л., Елисеева Л.А.// 5 Всесоюзный биохимический съезд АН СССР: Тезисы стендовых сообщений.- 1985.- с.170.
31. Токарик Э.Ф. Повышение  стабильности биологической активности сухой вирусвакцины против ньюкаслской болезни из лентогенных штаммов/ Токарик Э.Ф., Звягин И.В., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Фролов Ю.Д., Нежута А.А., Скичко Л.А. // Вопросы ветеринарной иммунологии.- М.- 1986.- с.172-174.
32. Токарик Э.Ф. Методические подходы к конструированию защитных сред  для живых вирусных и бактериальных вакцин. Сообщение первое. Анализ и использование патентной  информации / Токарик Э.Ф., Константинов В.М., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Львова Т.В., Корнута Т.С.//ЭИ Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности.- М.- 1986.- №11.- с.3-5.
33. Ковальская Л.А. Методические подходы к конструированию защитных сред для живых вирусных и бактериальных вакцин. Сообщение 2. Отбор компонентов защитных сред по технологическим параметрам/ Ковальская Л.А., Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А. // ЭИ Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности.- М.- 1986.- №7.- с.1-4.
34. Скотникова Т.А. Методические подходы к конструированию защитных сред для живых вирусных и бактериальных вакцин. Сообщение 3. Количественная оценка стабильности биологической активности сухих вирусных вакцин/ Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Токарик Э.Ф. // ЭИ Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности.- М.- 1987.- №1.-с.1-6.
35. Токарик Э.Ф. Теоретические предпосылки и методические подходы к стабилизации активности биологических препаратов/ Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Нежута А.А., Ковальская Л.А., Панферов В.В.,  Блехерман Б.Е., Константинов В.М., Лихтенштейн Г.И., Кочетков В.В. // Научные  основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов: тезисы докладов Третьей Всесоюзной конференции.- М.- 1987.- с.165-167.
36. Прихожай Л.А. К технологии изготовления гидролизата белка – основы защитных сред  для вирусных вакцин/ Прихожай Л.А., Головина О.П., Панферова С.М., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Доценко В.В., Рахманов В.А.// Научные  основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов: тезисы докладов Третьей Всесоюзной конференции.- М.- 1987.-  с.189-190.
37. Токарик Э.Ф. Принципы  методического подхода к конструированию защитных сред для вирусных вакцин/ Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Нежута А.А., Константинов В.М.//«Свободные радикалы и биостабилизаторы»: тез. докл. І-го Болгаро-Советского симпозиума.-  София.- 1987.- с.136.
38. Токарик Э.Ф. Методы статистического анализа в исследованиях по стабилизации вирусных вакцин / Токарик Э.Ф. Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Нежута А.А., Константинов В.М //«Свободные радикалы и биостабилизаторы»: тез. докл. І-го Болгаро-Советского симпозиума.-  София.- 1987.- с.139.
39. Токарик Э.Ф. Гидролизат белка (пептон) – основа защитных сред для вирусных вакцин/ Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Иванова Н.А., Львова Т.В. //«Методы получения и анализа биохимических  реактивов»: тез. докл. 5 Всесоюз. конф. - Рига.- 1987.- с.188.
40. Токарик Э.Ф.Методические  подходы к конструированию защитных сред  для живых вирусных вакцин/ Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Константинов В.М. // Научные основы производства ветеринарных препаратов: сб. науч. тр. - М.- 1989.- с.17-22.
41. Головина О.П. Сравнительная оценка ИФА и РТГА для определения уровня гуморальных антител против вируса ньюкаслской болезни птиц // Головина О.П., Силаева Н.В., Шкварук Т.Я., Сазанова Э.Я., Скотникова Т.А., Белоусов В.И. /Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: тезисы докладов научно-теоретической конференции молодых ученых.- Владимир.- 1990.- с.43-44.
42. Скотникова Т.А. Усовершенствование вакцины против ньюкаслской болезни/ Скотникова Т.А., Панферова С.М., Головина О.П., Воронина Г.А., Токарик Э.Ф. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов: тезисы докладов Четвертой Всесоюзной конференции.- М.- 1991.- с.44-45.
43. Горшкова Т.К. Инактивированная вакцина против ньюкаслской болезни птиц из очищенного и концентрированного вируса/ Горшкова Т.К., Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Панферова С.М., Сазанова Э.Я., Воронина Г.А. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов: тезисы докладов Четвертой Всесоюзной конференции.- М.- 1991.- с.46-47.
44. Скотникова Т.А. Стандартизация и повышение эффективности вакцины против ньюкаслской болезни/ Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Токарик Э.Ф., Смоленский В.И., Слободенюк М.И.// тез. докл. 3  Всесоюзн. конф. по эпизоотологии.- Новосибирск- 1991.- с.405-407.
45. Токарик Э.Ф. О подготовке предприятий биологической промышленности к сертификации продукции, производства и систем качества/ Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Скотникова Т.А. // « Качество, экология и рынок»: тез. докл.3 конф.- М.- 1994.- с.12.
46. Скотникова Т.А. К вопросу о гармонизации международных и национальных требований к показателям качества и методам их определения/ Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Иванова Н.А.// «Вирусные болезни с/х животных»: тез докл. Всерос. научно-практ. конф.- Владимир.- 1995.-с.185.
47. Токарик Э.Ф. ОСТ 100089-95. Продукция агробиологической промышленности. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, построения, согласования и утверждения/ Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Иванова Н.А., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А. // М.- 1995.- 100 с.
48.Токарик Э.Ф. О гармонизации отечественной нормативно- технической документации на производство лекарственных средств  для ветеринарии с международными требованиями/ Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Чернявская О.А. //«Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов»: тез. докл. 5 Всерос. конф.- Щелково.- 1996.- с.281-282.
49. Скотникова Т.А. Результаты испытаний эффективности вирусвакцины против ньюкаслской болезни из штамма Ла-Сота в новой дозировке / Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Слободенюк М.И., Смоленский В.И., Макагон В.Ф. //«Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов»: тез. докл.5 Всерос. конф.- Щелково.- 1996.- с.20-21.
50. Панферова С.М. Концентрирование и очистка вируса ньюкаслской болезни методом микрофильтрации/ Панферова С.М., Скотникова Т.А., Иванова Н.А., Люлькова Л.С.//«Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов»: тез. докл. 5 Всерос. конф.- Щелково.- 1996.- с.22-23.
51. Ковальская Л.А., Новые препараты (биофармкомплекс) и способ их применения для профилактики ньюкаслской болезни / Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Елисеева Л.А., Марыгина А.Ф., Галибина Н.В., Токарик Э.Ф., Смоленский В.И., Филоненко А.И., Григоренко А.И. //«Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов»: тез. докл. 5 Всерос. конф.- Щелково.- 1996.- с.24-25.
52. Skotnikova T.А. Technoloqy problem on the safe preparation production for animal profection/ Skotnikova T.А., Tokarik E.F., SamylenkoA.Y., Shol W.I. // «Экологическая инициатива» Секция: Сельское хозяйство. Охрана окружающей среды»: доклады Российско-американского конгресса.- Воронеж.- 22-26 сентября.-1996.- с.4-5.
53. Скотникова Т.А. Обзор факторов, влияющих на качество вакцины против ньюкаслской болезни//100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России: тезисы докладов научно-производственной конференции.- Курск.- 1996.- с.287-289.
54. Филоненко В.И.  Технология камерной аэрозольной вакцинации цыплят против ньюкаслской болезни/ Филоненко В.И.,  Шоль В.Г., Фисинин В.И., Спирина С.И., Присяжный Г.И., Офицеров В.А., Королева Н.А., Филоненко Н.Н., Вострякова Г.В., Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Елисеева Л.А., Смоленский В.И.,  Григоренко А.И., Власов Н.Г., Ананьевский С.М., Королев Б.М., Бильдев Н.П.// Методические рекомендации (РАСХН –ВНИиТИБП –ВНИТИП –Вирусолог.Центр НИИ микробиологии МО РФ).- Сергиев Посад.- 1996.- 53с.
55. Skotnikova T.A. Newcastle disease vaccin : perfection and applikation method/ Skotnikova T.A., Kovalskaya L.A., Eliseeva L.A., Samvilenko A.Y., Smolensky V.I.// XI –th International congress оf the World Vеterinary poultry association.- Budapest.- 18-22 August.- 1997.- p.213.
56. Токарик Э.Ф. Документирование  технологических процессов производства лекарственных  средств  для ветеринарии и животноводства/ Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Самуйленко А.Я., Еремец В.И. //«Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» (14 июля 1997г.): тез. докл. Всерос. научно-практич. конф.- Щелково.- 1998.- с.6-7.
57. Еремец Н.К. Научно-методическое обеспечение управления  качеством  лекарственных средств для ветеринарии и животноводства / Еремец Н.К., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я. //«Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» (14 июля 1997г.): тез. докл. Всерос. научно-практич. конф.- Щелково.- 1998.-  с.8-9.
58. Скотникова Т.А. Вопросы технологии производства безопасных лекарственных средств  для ветеринарии и животноводства/ Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Еремец  Н.К., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я.//«Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» (24 декабря 1998г.): тез. докл. Всерос. научно-практич. конф.- Щелково.-1998.- с.42-43.
59. Скотникова Т.А. Эффективная и экологически безопасная технология вакцинации цыплят-бройлеров против ньюкаслской болезни/ Скотникова Т.А., Елисеева Л.А., Ковальская Л.А., Шоль В.Г. //«Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»:тез. докл. Всерос. научно-практической конференции, посвящ. 30-летию института, 8-9 июня 2000 г.- Щелково.- 2000.- с.45-47.
60. Ипатов А.В. Влияние дисперсности и концентрации аэрозоля вакцины на эффективность вакцинации против ньюкаслской болезни/ Ипатов А.В., Скотникова Т.А., Шешенин Д.В.// сб. докл. Межд. конф. молодых ученых , 5-6 июня 2001,. – Щелково.- 2001.- с.28-32.
61. Токарик Э.Ф. Вакцинация цыплят-бройлеров против ньюкаслской болезни спрей-методом/ Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Скотникова Т.А., Ипатов А.И., Шешенин В.В. // сб. докл. Межд. конф. молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», 5-6 декабря, 2002.- Щелково.- 2002.- с.17-21.
62. Токарик Э.Ф. О структуре системы технологической документации биопредприятий / Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Еремец В.И. //Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: мат. междун. научно-практич. конференции 24-25 апреля 2003г.- Щелково.- 2003.- ч.1.- с.12-16.
63. Скотникова Т.А. Современные подходы к контролю процессов стерилизации лекарственных средств и питательных сред // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: мат. междун. научно-практич. конференции 24-25 апреля 2003г.- Щелково.- 2003.- ч.1.-  с.30-32.
64. Ковальская Л.А. Метод оценки стабильности и точности технологических процессов и операций производства лекарственных  средств  для животных / Ковальская Л.А., Скотникова Т.А.,  Еремец Н.К., Токарик Э.Ф., Безгин В.М. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: мат. междун. научно-практич. конференции 24-25 апреля 2003г.- Щелково.- 2003.- ч.1.- с.33-39.
65. Скотникова Т.А. Некоторые аспекты производства и применения вакцин против ньюкаслской болезни/ Скотникова Т.А., Еремец В.И. //«Современные вопросы патологии с/ х животных»: мат. междун. научн.- практич. конференции 23-24 октября 2003.- Минск. 2003.- с.135.
66. Скотникова Т.А. Крупнокапельная вакцинация (спрей-метод) цыплят-бройлеров против ньюкаслской болезни/ Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Салеева И.П., Шешенин  В.Д. //Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц  в промышленном  птицеводстве: мат. межд. юбил. научно - практич. конф.- С.-Петербург, Ломоносов, 14-16 сентября 2004.- с.86-87.
67. Скотникова Т.А. Вакцинация против ньюкаслской болезни – опыт производства и применения/ Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Еремец В.И. // Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц  в промышленном  птицеводстве: мат. межд. юбил. научно - практич. конф.- С.-Петербург, Ломоносов, 14-16 сентября 2004.-  с. 85 - 86.
68. Зуев Е.Т. Применение метода гистограмм для статистического контроля производственных процессов в пищевой и биологической промышленности/ Зуев Е.Т., Гурьев В.И., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А. // Ветеринарна медицина. Межведомст. тематич. научн. сб.- Харьков.- 2004.-  т.84 - с.823-827.
69. Самуйленко А.Я., Некоторые вопросы технического регулирования в сфере разработки и производства лекарственных средств  для животных в АПК России/ Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Токарик Э.Ф.,  Еремец Н.К., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А. // Ветеринарна медицина. Межведомст. тематич. научн. сб.- Харьков.- 2004.-  т.84 - с.850-851.
70. Скотникова Т.А. Крупнокапельная вакцинация цыплят-бройлеров (спрей-метод) против ньюкаслской болезни/ Скотникова Т.А. Ипатов А.И., Шешенин В.В. // Ветеринарна медицина. Межведомст. тематич. научн. сб.- Харьков.- 2004.-  т.84 - с.855-857.
71. Скотникова Т.А. Лабораторный рабочий эталонный материал: назначение, принципы приготовления, характеристика и калибровка/ Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П. //1 Международный ветеринарный конгресс по птицеводству (18-22 апреля 2005).- Москва.- 2005.- с.147-152.
72. Скотникова Т.А. Опыт изготовления и применения вакцины против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» в декоративном птицеводстве/ Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Еремец Н.К., Еремец В.И., Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П.//Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных: мат. межд. научно-практической конференции, посвященной 75-летию УГАВМ.- 19-20 мая  2005г.- г. Троицк.- 2005.- с.144-146.
73. Шурыгин А.И. Модель  системы менеджмента качества предприятия агробиологической промышленности/ Шурыгин А.И.,Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А. //Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Мат. межд. научно-практической конференции, посвященной 35-летию института, 26-27 мая 2005, Щелково – 2005.- с.33-41.
74. Скотникова Т.А. Подходы к исследованию стабильности лекарственных средств на этапе разработки и в условиях действующего производства// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Мат. межд. научно-практической конференции, посвященной 35-летию института, 26-27 мая 2005, Щелково – 2005.- с.41-46.
75. Еремец В.И. Руководство по разработке системы технологической документации на предприятии биологической промышленности или опытном производстве при организациях соответствующего профиля (утв. РАСХН, 2004г.)/ Еремец В.И., Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Скотникова Т.А., Неминущая Л.А. // Сб. «Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины»,  ч. 2.  Методы исследований в области паразитологии, эпизоотического мониторинга, биотехнологии), РАСХН отд. ветеринарной медицины, Москва, 2006, с.312-348.
76. Скотникова Т.А. Способы реализации процессного и проектного подходов в системе целевых мероприятий по внедрению системы менеджмента качества на предприятиях АПК/ Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф., Неминущая Л.А., Еремец В.И., Еремец Н.К. Самуйленко А.Я. //Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: мат. межд. научн – практической  конф., посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова.- 2006.- с.32-35.
77. Неминущая Л.А. Интегрированная система менеджмента  биофармпредприятия агробиологической промышленности. Управление рисками при производстве лекарственных средств/ Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Спиридонов А.В. // Мат. межд. юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России, 21-22 июня 2006г.- Курск.- 2006.- с.27-42.
78. Скотникова Т.А. Интегрированная система менеджмента качества биофармпредприятия агробиологической промышленности. Базовые стандарты  ИСО 9000 и Правила СМР/ Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Люлина Н.В. //Мат. межд. юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России, 21-22 июня 2006г.- Курск.- 2006.- с.42-51.
79. Скотникова Т.А.  Вопросы  обеспечения безопасности производства иммунобиотехнологических ветеринарных препаратов/ Скотникова Т.А.,Неминущая Л.А., Еремец Н.К., Самуйленко А.Я., Кржижановская Е.В., Чулков А.К.//III Международный ветеринарный конгресс по птицеводству, 10-13 апреля 2007.- г. Москва.- с.58-59.
80. Еремец В.И. Информационно-справочные документы системы менеджмента качества для предприятий агропромышленного комплекса/ Еремец В.И., Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Еремец Н.К. Неминущая Л.А., Самуйленко А.Я. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: мат. междун. научно-практической конференции (20-21 декабря 2007г.).- Щелково.- 2007.- с.10-14.
81. Скотникова Т.А. Опыт производства и применения вакцины против ньюкаслской болезни / Скотникова Т.А. Неминущая Л.А., Еремец Н.К., Самуйленко А.Я. , Еремец В.И.// «Актуальные проблемы ветеринарной медицины»: мат. междунар. научно-произв. конф., посвещ. 125-летию ветеринарии Курской области Курск, 22-23 мая 2008г.- с.370-371.
82.  Скотникова Т.А. Методические рекомендации по исследованию стабильности иммунобиопрепаратов на этапе разработки и в условиях действующего производства/ СкотниковаТ.А., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Еремец Н.К.// (ВНИТИБП, утв. РАСХН  - 28.03.08 г.)// М.- 2009г. - 32 с.
83. Токарик Э.Ф.  Разработка и оптимизация параметров технологического процесса сублимационной сушки биоматериалов: современный взгляд на достижения и перспективы научного направления / Токарик Э.Ф., Нежута А.А., Скотникова Т.А., Неминущая Л.А.,Панферов В.В.//«Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: мат. междун. научно – практ. конф., посвящ. 40-летию института ( 9-10 декабря 2009г.).- Щелково.- 2009.- с.49 -56.
84. Скотникова Т.А. Ньюкаслская болезнь: совершенствование классической вакцины, разработка новых препаратов и способов применения / Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Нежута А.А ., Самуйленко А.Я., Еремец В.И.//«Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: мат. междун. научно – практ. конф., посвящ. 40-летию института ( 9-10 декабря 2009г.).- Щелково.- 2009.- с. 56 – 63.
85. Скотникова Т.А. Роль стабильности в обеспечении качества лекарственных средств (иммунобиологических препаратов) для животных / Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Сапегина Е.П., Самуйленко А.Я. //«Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: мат. междун. научно – практ. конф., посвящ. 40-летию института ( 9-10 декабря 2009г.).- Щелково.- 2009.-с. 656 – 662.
86. Скотникова Т.А. Системы обеспечения качества лекарственных средств для животных на предприятиях агропромышленного комплекса/ Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Еремец Н.К.,  Еремец В.И., Самуйленко А.Я.//«Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: мат. междун. научно – практ. конф., посвящ. 40-летию института (9-10 декабря 2009г.).- Щелково.- 2009.- с. 90 – 95.










 







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.