WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

  УДК 612.43; 591.434

СЛЕСАРЕВ СЕРГЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

Эпифизарная и тканевая регуляции

временнй организации пролиферации

обновляющихся тканей

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва

2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» Федерального агентства по образованию

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Антохин Александр Иванович

доктор медицинских наук, профессор Хайруллин Радик Магзинурович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна

доктор биологических наук, профессор Доронин Юрий Константинович

доктор биологических наук Григорян Элеонора Норайровна

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится «___»___________2009 года на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при Российском государственном медицинском университете (117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского госу-дарственного медицинского университета (117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1).

Автореферат разослан «____»____________2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор                                А.И. Щеголев

общая характеристика работы

Актуальность работы.  В основе организации живых систем лежит ритмичность их функционирования. Суточная периодичность физиологических процессов представляет собой одно из проявлений многочисленных приспособительных реакций организма, направленных на поддержание его устойчивости. Из всех абиотических факторов стабильно во времени изменяется только продолжительность световго дня. Поэтому сформировавшиеся в ходе эволюции циркадианные ритмы организмов синхронизированы с продолжительностью фотопериодов. Являясь фундаментальным свойством живой материи, биоритмы проявляются в функционировании всех систем организма. Циркадианные ритмы обладают высокой чувствительностью к различным видам внешних воздействий, а их нарушения могут служить первыми симптомами начинающихся отклонений в жизнедеятельности организма в целом (Хильдебрандт и др., 2006). Десинхроноз может завершаться формированием определенной патологии, а также усугубить течение имеющихся заболеваний, что диктует необходимость изучения биоритмов функционирования различных органов и систем организма, а также факторов и уровней их регуляции (Анисимов, 2007).

Вопрос о суточной периодичности репродукции клеток является частью общей проблемы биологических ритмов. Изучение механизмов формирования циркадианного ритма пролиферации необходимо для понимания процессов онтогенетического развития, физиологической и репаративной регенерации, поддержания структурного гомеостаза тканей, а также определения закономерностей развития злокачественных новообразований. Выяснение хронобиологических особенностей деления клеток и механизмов контроля пролиферации позволяет осуществлять её направленную регуляцию.

По современным представлениям пролиферирующие или потенциально способные к пролиферации клетки и соответствующие механизмы регуляции пролиферации в комплексе составляют пролиферативную систему тканей. Иерархическая структура механизмов регуляции репродукции клеток включает в себя как организменные, так и тканевые регуляторы (Романов, 2000). На организменном уровне формирование циркадианных и сезонных ритмов, в том числе и циркадианного ритма пролиферации, осуществляется при участии эпифиза, продуцирующего гормон мелатонин и комплекс биологически активных пептидов (Арав и др., 2004; Casson et al., 2008). В настоящее время ритмогенную функцию эпифиза связывают с выработкой мелатонина, синтез и секреция которого имеет циркадианный характер (Кветная и др., 2005). Однако вопрос эпифизарной регуляции биоритмов пролиферации до сих пор является дискуссионным, и ряд принципиальных положений всё ещё не находит объяснения. Причина этого кроется, с одной стороны, во множественном характере влияния мелатонина на пролиферацию, затрудняющем анализ его действия, а с другой стороны, в неизученности ритмогенной роли биологически активных пептидов эпифиза.

Основным внутрисистемным регулятором биоритмов митотической активности определенного вида тканей является кейлон-антикейлонная система, представляющая собой всеобщую систему регуляции структурного гомеостаза (Антохин, 1979; Романов, 1984; Смирнов, 1998). Изучение взаимосвязи организменного и тканевого уровней регуляции биоритмов пролиферации имеет существенный теоретический и практический интерес. В ряду нерешенных проблем остается неизученным аспект взаимосвязи эпифизарной и тканевой регуляций биоритмов пролиферации. Механизмы эпифизарной регуляции ритмичности функционирования пролиферативной системы организма и их универсальность для тканей, развивающихся из различных эмбриональных листков не определены.

Цель исследования: установление механизмов эпифизарной регуляции биоритмов пролиферации обновляющихся тканей.

Задачи исследования:

  1. изучить суточную динамику пролиферации эпителиев пищевода, тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатических узелков трахеобронхиальных лимфатических узлов интактных беспородных белых крыс;
  2. разработать пути анатомического доступа к эпифизу беспородных белых крыс и методику его экстирпации;
  3. установить влияние эпифизэктомии и последующего введения биологически активных веществ эпифиза (пептидов и мелатонина) эпифизэктомированным беспородным белым крысам на суточную динамику пролиферации эпителиев пищевода, тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатических узелков трахеобронхиальных лимфатических узлов;
  4. исследовать суточную динамику продукции тканевых регуляторов пролиферации интактных беспородных белых крыс;
  5. определить влияние эпифизэктомии и последующего введения биологически активных пептидов эпифиза эпифизэктомированным беспородным белым крысам на суточную динамику продукции тканевых регуляторов пролиферации;
  6. выявить взаимосвязь эпифизарной и тканевой регуляций биоритмов пролиферации.

Научная новизна.  Впервые установлен универсальный характер эпифизарной регуляции циркадианного ритма пролиферации обновляющихся тканей беспородных белых крыс. Показано, что ткани, развивающиеся из различных эмбриональных листков (эпителии пищевода, тощей кишки и клетки герминативного центра лимфатических узелков трахеобронхиальных лимфатических узлов) утрачивают циркадианный ритм пролиферации после эпифизэктомии и восстанавливают его после введения биологически активных пептидов эпифиза. Впервые выявлено, что эпифиз-эктомия вызывает исчезновение циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации беспородных белых крыс. Показана регуляторная роль пептидов эпифиза в формировании циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации (кейлонов и антикейлонов). Впервые установлена взаимосвязь эпифизарной и тканевой регуляций циркадианного ритма пролиферации, которая заключается в синхронизирующем влиянии биологически активных пептидов эпифиза на продукцию тканевых регуляторов пролиферации.

Научно-практическая значимость работы.  Выполненное исследование носит фундаментально-прикладной характер и посвящено изучению гуморальной регуляции функционирования различных органов и тканей. В работе представлены данные, с одной стороны, демонстрирующие универсальность эпифизарной регуляции циркадианного ритма пролиферации различных тканей, а с другой, раскрывающие механизм такого влияния. Научно-теоретическая значимость диссертации определяется тем, что полученные данные о роли эпифиза в формировании циркадианного ритма пролиферации существенно расширяют представления о регуляции циркадианных ритмов функций организма в целом. Практическое значение работы заключается в возможности использования полученных данных для разработки методов применения биологически активных пептидов эпифиза в клинической практике с целью коррекции нарушений пролиферативных процессов, стимулирования регенерации, коррекции десинхронозов. Особое значение приобретает установленный в ходе исследования факт недостаточности однократного в течение суток введения мелатонина для формирования суточного ритма пролиферации, что указывает на необходимость создания форм пролонгированного действия мелатонина. Разработаны пути анатомического доступа к эпифизу беспородных белых крыс и методика его экстирпации. Предлагаемый метод является хирургическим методом удаления эпифиза у беспородных белых крыс и других грызунов. Метод позволяет прооперировать в сжатые сроки значительное количество животных, надежен и не сложен в исполнении, что определяет возможность его широкого использования в хронобиологических исследованиях. На основе методов спектрального анализа и наименьших квадратов разработаны компьютерные программы для выявления биоритмов пролиферации и определения их периодов, которые могут быть использованы для выявления периодических процессов в любых биологических системах. Результаты исследования могут быть внедрены в учебный процесс при преподавании дисциплин медико-биологического профиля, включающих разделы «Цитология», «Эндокринная система».

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Эпифизарная регуляция циркадианного ритма пролиферации является универсальной для обновляющихся тканей беспородных белых крыс при сохраняющейся органной специфичности.
  2. Эпиталамин, как препарат комплекса биологически активных пептидов эпифиза восстанавливает циркадианный ритм пролиферации обновляющихся тканей (эпителиев пищевода, тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатических узелков трахеобронхиальных лимфатических узлов) беспородных белых крыс после эпифизэктомии.
  3. Эпифизэктомия вызывает исчезновение циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации (кейлонов и антикейлонов) беспородных белых крыс при сохраняющемся ультрадианном ритме их продукции.
  4. Введение биологически активных пептидов эпифиза (эпиталамина) эпифизэктомированным беспородным белым крысам приводит к восстановлению циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации (кейлонов и антикейлонов).
  5. Предложенный анатомический доступ к эпифизу беспородных белых крыс и разработанный на его основе метод эпифизэктомии является оптимальным для использования в хронобиологических исследованиях.

Внедрение результатов исследования в практику.  Результаты исследования используются в учебном процессе при обучении студентов специальностей “Лечебное дело”, “Педиатрия”, “Стоматология”, “Сестринское дело”, “Медицинская биохимия”, “Медицинская биофизика”, “Медицинская кибернетика” в преподавании дисциплин медико-биологического профиля: “Гистология, эмбриология, цитология”, “Анатомия человека”, “Биология” на кафедре биологии медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета, кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Ярославской государственной медицинской академии, кафедре анатомии и гистологии Белгородского государственного университета, кафедре гистологии Башкирского государственного медицинского университета. Результаты диссертационной работы внедрены также в работу лаборатории эмбрионального гистогенеза ГУ НИИ морфологии человека РАМН.

Апробация работы.  Основные положения и результаты диссертационного исследования представлены на V и VI международных научно-технических конференциях “Математическое моделирование физических, экономических, технических, социальных систем и процессов” (Ульяновск, 2003, 2005), Всероссийской научной конференции “Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы” (Москва, 2003), V Всероссийской научно-технической конференции “Современные проблемы математики и естествознания” (Нижний Новгород, 2003), выездном пленуме НОГР “Новые горизонты гастроэнтерологии” (Новосибирск, 2004), VII интернациональном конгрессе морфологии позвоночных (Флорида, 2004), II международном симпозиуме “Проблемы ритмов в естествознании” (Москва, 2004), V общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004), VIII конгрессе международной ассоциации морфологов (Орел, 2006), Всероссийской конференции с международным участием “Медико-физиологические проблемы экологии человека” (Ульяновск, 2007), научно-практической конференции, посвященной 45-летию образования Медико-биологического факультета РГМУ “Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины” (Москва, 2008), международной научно-практической конференции “Актуальные вопросы аграрной науки и образования. Новое в морфологии живых организмов (норма и патология)” (Ульяновск, 2008), международной научно-практической конференции “Аграрная наука и образование на современном этапе развития. Актуальные вопросы ветеринарной медицины, биологии и экологии” (Ульяновск, 2009), III съезде Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009) и на совместной научно-практической конференции кафедры биологии Медико-биологического факультета, кафедры биологии педиатрического факультета, кафедры морфологии Медико-биологического факультета, кафедры эндокринологии факультета усовершенствования врачей, лаборатории медицинских клеточных технологий, лаборатории молекулярной и клеточной биологии Российского государственного медицинского университета, кафедры общей биологии экологического факультета, кафедры морфологии медицинского факультета и кафедры анатомии человека медицинского факультета Ульяновского государственного университета.

Публикации.  По материалам диссертации опубликовано 33 научные работы, в том числе 10 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК; 1 монография.

Объем и структура диссертации.  Диссертационная работа изложена на 281 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственного исследования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы содержит 420 работ, в том числе 225 отечественных и 195 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 132 рисунками (фотографии, графики, фазограммы) и 34 таблицами.

Содержание работы

Материал и методы исследования

Материал исследования.  Эксперименты выполнены на 670 самцах беспородных белых крыс массой 160-200 г и 80 самцах беспородных белых мышей массой 18-22 г. В соответствии с правилами GCP диссертационная работа прошла этическую экспертизу и была одобрена этическим комитетом ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (протокол №81 от 23 июня 2008 года). Распределение животных в экспериментальных группах показано в таблице 1.

Животные в течение 20 дней адаптировались к режиму освещенность:темнота=12:12 (освещение с 6 до 18 часов). На всем протяжении опыта доступ к пище и воде был свободным. Принимая во внимание данные литературы, в схему эксперимента не были включены группы ложнооперированных, а также интактных животных, которым вводили биологически активные вещества эпифиза (Арушанян и др., 1993; Хавинсон, 2001; Перцов, 2006; Abbasoglu et al., 1995). Исследования проводились на 40-й день после эпифизэктомии, в период, когда происходило полное заживление раны и оперированные животные не отличались от интактных.

Для изучения роли биологически активных веществ эпифиза в формировании биоритмов пролиферации, эпифизэктомированным животным ежедневно с 26-го по 41-й день после эпифизэктомии в 18 часов (время смены фоторежима со световой фазы на темновую) подкожно вводили мелатонин (10 мг/кг), эпиталамин (2,5 мг/кг), одновременно эпиталамин
(2,5 мг/кг) и мелатонин (10 мг/кг). Кроме того, 50-ти эпифизэктомированным животным подкожно вводили эпиталамин (2,5 мг/кг) в 6 часов (время смены фоторежима с темновой фазы на световую). Эпиталамин – препарат полипептидной природы, очищенный от индоламинов, получаемый путем экстракции из эпиталамо-эпифизарной области мозга крупного рогатого скота. Для изучения роли эпифиза в формировании биоритмов продукции тканевых регуляторов пролиферации, одной группе эпифизэктомированных животных ежедневно с 26-го по 41-й день после эпифизэктомии в
18 часов подкожно вводили эпиталамин (2,5 мг/кг). Второй группе эпифиз-эктомированных животных подкожно вводили эпиталамин (2,5 мг/кг) в 6 часов. При выборе доз руководствовались соответствующими данными литературы (Батурин и др., 1990; Lewinski et al., 1991; Anisimov et al., 2000).

Таблица 1

Распределение животных в экспериментальных группах

Серия

экспериментов

Экспериментальная группа

Число животных

1. Исследование роли эпифиза в формировании биоритмов пролиферации обновляющихся тканей.

1. Интактные контрольные.

2. Эпифизэктомированные.

3.Эпифизэктомированные с последующей инъекцией мелатонина.

4. Эпифизэктомированные с последующей инъекцией пептидов эпифиза.

5. Эпифизэктомированные с последующей одновременной инъекцией пептидов эпифиза и мелатонина.

90

90

90

90+50

60

2. Исследование роли эпифиза в формировании биоритмов продукции тканевых регуляторов пролиферации.

1. Интактные контрольные.

2. Эпифизэктомированные.

3. Эпифизэктомированные с последующей инъекцией пептидов эпифиза.

50

50

50+50

3. Оценка биологической активности кейлон-антикейлон-ных препаратов.

1. Животные, получавшие кейлон-анти-кейлонный препарат, выделенный у интактных контрольных крыс.

2. Животные, получавшие кейлон-анти-кейлонный препарат, выделенный у эпифизэктомированных крыс.

3. Животные, получавшие кейлон-анти-кейлонный препарат, выделенный у эпифизэктомированных с последующей инъекцией пептидов эпифиза крыс.

20

20

20+20

Выведение животных из эксперимента производили под эфирным наркозом на 40 – 41-й день после эпифизэктомии через каждые три часа. Исследование роли эпифиза в регуляции биоритмов пролиферации обновляющихся тканей проводили в течение двух суток. Исследование роли эпифиза в формировании биоритмов продукции тканевых регуляторов пролиферации интактных, эпифизэктомированных и эпифизэктомированных с последующим введением пептидов эпифиза животных проводили в течение суток. Влияние утреннего (6 часов) введения пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным на формирование циркадианного ритма пролиферации также изучалось в течение суток.

Методика эпифизэктомии.  Исследование биологической роли эпифиза базируется преимущественно на двух экспериментальных подходах – полной или частичной эпифизэктомии и введении в организм биологически активных веществ эпифиза. В некоторых работах эффект “функциональной эпифизэктомии” достигается путем содержания животных в условиях круглосуточного освещения, что вызывает нарушение биоритмов активности ферментных систем эпифиза и, как следствие, нарушение биоритмов продукции основных его гормонов (Бекчанов и др., 1998). Вместе с тем данный метод не позволяет полностью исключить влияние биологически активных веществ эпифиза на организм. Проводимая рядом исследователей электрокоагуляция пинеальной железы не может гарантировать полного её разрушения (Арушанян и др., 1993), поэтому более надежными следует признать хирургические методы её удаления, которые и получили наиболее широкое распространение (Ованесов, 1987; Хавинсон и др., 2000).

С учетом вышеизложенного, а также на основе анализа существующих методических приемов нами был разработан оригинальный метод эпифизэктомии. Основные результативные исследования были выполнены на основе указанного метода. Предлагаемый нами метод является хирургическим методом удаления эпифиза у белых крыс и других грызунов. Наркоз осуществляли путем внутрибрюшинного введения тиопентала натрия в дозе 50 мг/кг. Голова животного жестко фиксировалась на операционном столике за ушные проходы и верхнюю челюсть. В области предполагаемого разреза кожи удаляли шерстный покров, а освобожденную поверхность дезинфицировали этиловым спиртом. В области срединной линии головы производили разрез кожи длинной 1,5 см. После обнажения крыши черепа в межтеменной кости на расстоянии 4 мм каудальнее от пересечения сагиттального и теменно-межтеменного швов высверливали отверстие диаметром 3 мм, в которое затем вводили препаровальную иглу и рассекали твердую мозговую оболочку. Удаление эпифиза осуществляли путем резекции участка межтеменной и теменных костей  с подлежащим эпифизом (рис.1). С целью предотвращения последующего сращения соединительной ткани с тканью мозга на отверстие в костях крыши черепа накладывалась стерильная вощеная бумага, после чего рана зашивалась.

Рис. 1. Операционное поле. 1 – костный лоскут с эпифизом

Контроль удаления эпифиза осуществлялся визуально (рис.2). Эпифизэктомированных животных продолжали содержать при режиме освещенность:темнота = 12:12 (освещение с 6 до 18 часов).

Рис. 2. Костный лоскут с эпифизом. 1 – костный лоскут; 2 - эпифиз

Существующие хирургические методы эпифизэктомии занимают больше времени, т.к. непосредственное удаление эпифиза производится после удаления костного лоскута и остановки кровотечения. В предложенном нами методе удаление участка кости с подлежащим эпифизом производится одновременно, а затем осуществляется остановка кровотечения. Во время остановки кровотечения проводится эпифизэктомия у следующего животного.

В хронобиологических исследованиях используется большое количество животных, эпифизэктомия у которых должна производиться за короткий промежуток времени. Это невозможно выполнить существующими методами эпифизэктомии. Предлагаемый нами метод позволяет проводить до 50 операций в день, оперируя за две недели до 500 животных. Выживаемость животных после операции составила 60%. Таким образом, предлагаемый метод эпифизэктомии является оптимальным для использования в хронобиологических исследованиях.

Модели изучения биоритмов пролиферации. В качестве моделей для изучения роли эпифиза в формировании биоритмов пролиферации были выбраны эпителии пищевода и крипт тощей кишки, а также клетки герминативного центра лимфатических узелков трахеобронхиальных лимфатических узлов, которые являются классическими моделями изучения физиологической регенерации.

Определение антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени. В качестве модели для изучения роли эпифиза в формировании биоритмов продукции тканевых регуляторов пролиферации служила печень белых крыс. Антирадикальная активность кейлон-антикейлонной системы печени изучалась у интактных (n=50), эпифизэктомированных (n=50) и эпифизэктомированных с последующей инъекцией пептидов эпифиза (n=100) животных. Последним вводили пептиды эпифиза в 6 (n=50) или 18 часов (n=50). После декапитации и вскрытия беспородных белых крыс извлеченную печень замораживали в жидком азоте и хранили в морозильной камере. Для получения комплексных экстрактов печеночных кейлона и антикейлона доли печени очищали от соединительнотканной капсулы, а ткань гомогенизировали. Дистиллированной водой из ткани печени извлекали водорастворимые компоненты, которые подвергали центрифугированию и спиртовому фракционированию охлажденным до +40С этанолом. Использовалась фракция, полученная при осаждении между 70 и 87% насыщения. Антирадикальную активность препаратов определяли на модифицированном хемилюминометре
ХЛМ 1Ц-01 (Пашков, 1991) по степени гашения хемилюминесценции в системе, генерирующей свободные радикалы и выражали в условных единицах на 1 мг белка. Получение препаратов и определение их антирадикальной активности проводили на базе кафедры биологии с экологией  Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко (зав. – профессор А.Н. Пашков). Для концентрирования и хранения кейлон-антикейлонных препаратов их лиофилизировали.

Для исследования биологических свойств кейлон-антикейлонных препаратов лиофилизированные фракции, полученные от крыс, декапитированных в дневные и ночные часы, вводили частично гепатэктомированным мышам внутрибрюшинно однократно в 18 часов. Выбор оптимальной дозы (5 мг/мышь) осуществляли на основе анализа данных литературы (Смирнов, 1998). Животных предварительно подвергали частичной гепатэктомии под эфирным наркозом по общепринятой методике (Stewart, 1979). В эксперименте использовались кейлон-антикейлонные препараты печени, полученные от крыс, декапитированных в 2100, 2400, 300 (группа 1) и 900, 1200, 1500 (группа 2). Контролем служили частично гепатэктомированные животные. На гистологических препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, осуществляли подсчет фигур митоза на 5000 гепатоцитов и выражали в ‰.

Гистологическая техника. Для исследования брали среднюю треть пищевода, проксимальный участок тощей кишки и трахеобронхиальные лимфатические узлы. Органы фиксировали в течение 1 часа в жидкости Карнуа, обезвоживали в спиртах и заключали в парафин. Серийные срезы пищевода и тощей кишки окрашивали гематоксилин-эозином. Срезы лимфатических узлов окрашивали пиронином-метиловым зеленым по Браше с докраской гематоксилином. Окрашенные срезы заключали в канадский бальзам.

Учет количества делящихся клеток производили в базальном слое многослойного плоского неороговевающего эпителия пищевода, концевых отделах продольно срезанных крипт тощей кишки на участке размером в 25 клеток с каждой стороны крипты от её дна и герминативном центре лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов. Митотический индекс (МИ) в промилле вычисляли как отношение количества делящихся клеток к 5000 изученных клеток эпителия пищевода, 1000 клеток эпителия тощей кишки и 2000 клеток герминативного центра. Статистическую обработку результатов проводили с использованием метода Фишера – Стьюдента.

Выявление и характеристика биоритмов. Выявление биоритмов пролиферации и продукции тканевых регуляторов деления клеток, а также определение их периодов осуществлялось методом наименьших квадратов и спектральным анализом значений МИ или антирадикальной активности. Компьютерные программы данных методов разработаны совместно с сотрудниками кафедр прикладной математики (д.ф.-м.н., профессор А.А. Бутов, к.ф.-м.н., доцент И.А. Санников) и теоретической физики (д.ф.-м.н., профессор В.М. Журавлев) Ульяновского государственного университета. Анализ циркадианных ритмов пролиферации обновляющихся тканей и антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени беспородных белых крыс проводили с использованием графически-параметрического метода (Романов и др., 1979; Филиппович, 1980).

Результаты и их обсуждение

  1. Исследование роли эпифиза в формировании биоритмов

пролиферации обновляющихся тканей

Времення организация пролиферации обновляющихся тканей интактных беспородных белых крыс. Важным моментом оценки влияния биологически активных веществ эпифиза на пролиферацию является изучение ритма деления клеток интактных животных и животных, освобожденных от каких-либо воздействий со стороны эпифиза. Суточная динамика пролиферации эпителия пищевода интактных беспородных белых крыс представлена на рисунке 3.

У интактных животных наблюдалось периодическое изменение МИ эпителия пищевода, которое характеризовалось монофазным ритмом на протяжении суток. Результаты графически-параметрического анализа динамики МИ указывают на то, что изменения МИ интактных животных скоррелированы с режимом освещения.

Рис. 3. Динамика МИ эпителия пищевода интактных беспородных белых крыс; ( МИ, ---- сглаженная кривая)

Аналогичный характер присущ суточной динамике пролиферации эпителия крипт тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов интактных беспородных белых крыс. Однако имеется органная специфика пролиферативных процессов, которая выражается в различии акрофаз ритма, абсолютной и относительной амплитуд, коэффициента синхронизации и ряда других параметров циркадианного ритма пролиферации (табл.2).

Отличие в положении акрофаз циркадианного ритма пролиферации различных обновляющихся тканей указывает на определенную лабильность параметров циркадианного ритма пролиферации. Положение акрофаз выявленных ритмов не является строго фиксированным и может смещаться в пределах 24-х часовой шкалы. Промежуток смещения акрофаз в пределах временнй шкалы предложено называть “зоной блуждания акрофазы”. Наиболее выраженные изменения положения акрофазы ритма отмечаются в процессе роста и развития организма, а также во время смены сезонов года. Тем не менее, взаимосвязь подъема митотической активности с определенным временем суток сохраняется, что было продемонстрировано нами для ряда обновляющихся тканей. Для максимума митотической активности эпителиев пищевода и тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатических узлов расположение “зоны блуждания” приходится на вторую половину темновго - начало световго периода суток. Таким образом, циркадианный биоритм пролиферации характеризуется лабильностью в определенной “зоне блуждания”, которая соответствует условиям фоторежима.

Таблица 2

Параметры циркадианных ритмов МИ эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов интактных беспородных белых крыс

Параметр

Пищевод

Кишечник

Лимфатический узел

1 сутки

2 сутки

1 сутки

2 сутки

1 сутки

2 сутки

Мезор,‰

9.27±1.36

61.4±2.2

25.8±1.68

Акрофаза,ч

900

600

2100

300

900

900

АФ,ч

300-1700

300-1100

1800-300

2400-600

500-1200

500-1200

Длительность АФ,ч

14

8

9

6

7

7

Середина

АФ,ч

1000

700

2230

300

1230

1230

АА,‰

16.8

15

22

25.8

22.24

20.62

ОА,‰

8.63

4.94

1.39

1.49

2.38

2.11

КС,1/ч

0.95

0.82

0.15

0.16

0.39

0.35

РМср,‰

75.21±12.7

1466.7±29.7

205.7±50.2

РМАФср,‰

45±9.8

530.15±116.14

68.7±0.2

Примечание: АФ - активная фаза ритма, АА - абсолютная амплитуда, ОА - относительная амплитуда, КС - коэффициент синхронизации МИ в ритме,
РМср - пул делящихся клеток в течение суток (среднее за двое суток),
РМАФср - пул делящихся клеток в течение АФ ритма (среднее за двое суток).

Данные спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов динамик МИ свидетельствуют о ритмической организации митотической активности эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов интактных животных с периодом, приближающимся к 24 часам. Кроме того, во всех указанных тканях выявлен ультрадианный ритм пролиферации c периодом около 9 часов. Совокупность биологических ритмов функций организма с различными периодами является одним из видов временнй организации живых систем (Романов, 1995). Вероятно, первичными следует считать эндогенные ультрадианные ритмы. Внешние синхронизаторы, координируя работу регуляторных систем, формируют на их основе циркадианные ритмы. Возникновение ультрадианных биоритмов обусловлено цикличностью метаболических процессов в ткани (Бродский и др., 2006).

Времення организация пролиферации обновляющихся тканей беспородных белых крыс после эпифизэктомии. Эпифиз является необходимым звеном формирования циркадианных ритмов ряда функций организма. Он осуществляет преобразование нервных импульсов в гормональный сигнал. В системе управления циркадианными ритмами комплекс “супрахиазматические ядра – эпифиз” обеспечивает гармоничную адаптацию к меняющимся средовым факторам, в частности, к свету. Результаты нашего эксперимента подтверждают упомянутую функциональную схему, свидетельствуя о важной роли эпифиза в фотопериодическом контроле циркадианного ритма пролиферативной активности тканей организма. С целью выявления роли эпифиза в регуляции циркадианного ритма пролиферации была проведена экстирпация железы и изучена динамика МИ обновляющихся тканей эпифизэктомированных животных.

Эпифизэктомия привела к исчезновению циркадианного ритма пролиферации всех изучавшихся тканей. Результаты спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов показали отсутствие циркадианного ритма МИ. В то же время обнаружился выраженный ультрадианный ритм репродукции клеток с периодом от 7 до 13 часов.

На рисунке 4 представлена суточная динамика пролиферации эпителия пищевода эпифизэктомированных беспородных белых крыс. Колебания МИ на протяжении двух суток не обнаружили какой-либо связи с фоторежимом. Уровень пролиферации эпителия пищевода эпифизэктомированных животных был таким же, как у интактных, что выражалось в отсутствии различий (Р>0,05) между: 1) среднесуточными значениями МИ (8,45±0,97‰ и 9,27±1,36‰); 2) суточными пулами пролиферирующих клеток (66,4±16,2‰ и 75,2±12,7‰) животных обеих групп.

Рис. 4. Динамика МИ эпителия пищевода эпифизэктомированных беспородных белых крыс; ( МИ, ---- сглаженная кривая)

Аналогичный характер присущ суточной динамике пролиферации эпителия крипт тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов. Пролиферативная активность эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатических узлов в световой и темновой фазах фотопериода не имела статистически достоверных (Р>0,05) отличий. Таким образом, удаление эпифиза привело к рассогласованию циркадианной составляющей деятельности пролиферативной системы с условиями освещенности, и исчезновению циркадианного ритма пролиферации всех изученных тканей на 40-е сутки после эпифизэктомии. У эпифизэктомированных животных динамика митотической активности характеризуется наличием только ультрадианного ритма, периоды которого составили 11 часов в эпителии пищевода, 9 часов в эпителии крипт тощей кишки, 7 и 13 часов для клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов. Это указывает на важную роль эпифиза в фотопериодическом контроле циркадианного ритма пролиферации. Регуляторная роль эпифиза установлена нами на различных моделях репродукции клеток. Кроме представленных в работе данных, нами показано исчезновение циркадианного ритма пролиферации сперматогоний беспородных белых крыс после эпифизэктомии (Слесарева и др., 2005).

Эпифизэктомия не вызывает морфологических изменений эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов (рис.5-7) беспородных белых крыс.

Исчезновение циркадианного ритма пролиферации у эпифизэктомированных животных позволяет предполагать участие биологически активных веществ эпифиза в его формировании. В настоящее время ритмогенную функцию эпифиза связывают с продукцией мелатонина, синтез и секреция которого имеет циркадианный характер (Кветная и др., 2005). Способность мелатонина подавлять пролиферацию различных тканей отмечена как в культуре, так и in vivo (Blask et al., 2005; Pizarro et al., 2008). Наличие рецепторов к мелатонину продемонстрировано для большинства клеток тканей организма (Korf et al., 2006). Однако вопрос о роли мелатонина в регуляции циркадианного ритма пролиферации продолжает оставаться дискуссионным.

Рис. 5. Многослойный плоский неороговевающий эпителий пищевода интактных (а) и эпифизэктомированных (б) беспородных белых крыс. Окраска гематоксилин-эозином. х1000. 1 – фигура митоза, 2 – ядра клеток,
находящихся в интерфазе.

Рис. 6. Эпителий крипт тощей кишки интактных (а) и эпифизэктомированных (б) беспородных белых крыс. Окраска гематоксилин-эозином. х1000.
1 – фигуры митоза, 2 – клетки, находящиеся в интерфазе.

Рис. 7. Герминативный центр лимфатического узелка трахеобронхиально-го лимфатического узла интактных (а) и эпифизэктомированных (б) беспородных белых крыс. Окраска пиронином-метиловым зеленым по Браше. х1000. 1 – фигура митоза, 2 – ядра клеток, находящихся в интерфазе.

Влияние мелатонина на суточную динамику пролиферации обновляющихся тканей эпифизэктомированных животных. Результаты проведенного исследования указывают на отсутствие ритмогенного эффекта мелатонина при его разовом в течение суток  введении эпифизэктомированным животным (10 мг/кг, 18 часов, 14 дней). Суточная динамика пролиферации эпителиев пищевода и крипт тощей кишки характеризовалась только ультрадианными колебаниями с периодом около 12 часов в эпителии пищевода и около 9 часов в эпителии крипт тощей кишки.

На отсутствие циркадианного ритма пролиферации эпителия пищевода эпифизэктомированных животных, которым вводили мелатонин, указывает характер сглаженной кривой динамики МИ (рис.8).

Рис. 8. Динамика МИ эпителия пищевода эпифизэктомированных беспородных белых крыс после введения мелатонина; ( МИ, ---- сглаженная кривая)

По отношению к сглаженной кривой динамики МИ эпителия пищевода интактных животных (рис.3) на протяжении двух суток она утратила вид синусоиды. Увеличение митотической активности (Р<0,05) приходилось как на темновой, так и световой периоды, что указывает на отсутствие синхронизации колебаний митотической активности с суточным свето-темновым циклом. Среднесуточное значение МИ составило 9,5±0,77‰, а суточный пул делящихся клеток – 71,64±34‰. Оба показателя существенно не отличались (Р>0,05) от значений соответствующих показателей интактных и эпифизэктомированных животных.

Однократное в течение суток введение мелатонина эпифизэктомированным животным также не привело к восстановлению циркадианного ритма пролиферации эпителия крипт тощей кишки. Суточная динамика пролиферации эпителия крипт тощей кишки эпифизэктомированных животных после введения мелатонина была аналогична таковой эпителия пищевода. Пролиферативная активность эпителиев пищевода и крипт тощей кишки эпифизэктомированных животных, которым вводили мелатонин, также как у эпифизэктомированных животных, в течение световой и темновой фаз фотопериода не имела достоверных (Р>0,05) отличий. Суточная динамика пролиферации у животных рассмотренных экспериментальных групп соответствует в целом изменениям митотической активности эпифизэктомированных животных и характеризуется ультрадианной ритмичностью.

Введение мелатонина привело к формированию циркадианного ритма пролиферации клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов беспородных белых крыс. Динамика МИ клеток герминативного центра лимфатических узлов эпифизэктомированных животных, которым вводили мелатонин, представлена на рисунке 9.

В отличие от сглаженной кривой суточной динамики МИ эпителиев пищевода (рис.8) и крипт тощей кишки, сглаженная кривая суточной динамики МИ клеток герминативного центра имеет вид синусоиды с высокой амплитудой колебаний. Данные спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов показали, что динамика изменений МИ клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов эпифизэктомированных животных после введения мелатонина характеризовалась колебаниями с циркадианной (период около 24 часов) и ультрадианной (период около 10 часов) составляющими. Значение МИ в светлое время суток (36,58±3‰) было достоверно выше (P<0,05), чем в темное (18±2,1‰). Среднее значение МИ клеток герминативного центра составило 24,29±2,65‰, что не отличалось от уровня пролиферативной активности интактных животных (Р>0,05).

Рис. 9. Динамика МИ клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов эпифизэктомированных беспородных белых крыс после введения мелатонина; ( МИ, ---- сглаженная кривая)

Реакция клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов на эпифизэктомию и введение мелатонина имеет специфические особенности. В отличие от реакции эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, эпифизэктомия обусловила увеличение митотической активности клеток герминативного центра. По данным В.Х. Хавинсона (2001) эпифизэктомия вызывает увеличение пролиферативной активности лимфоидных клеток в герминативном центре лимфатических узелков селезенки белых крыс. Это соответствует представлениям об ингибирующем влиянии эпифиза на пролиферативные процессы лимфоидной и сперматогенной тканей. Максимальный уровень пролиферации в органах иммунной системы лабораторных грызунов отмечается на фоне сниженной концентрации глюкокортикоидных гормонов и уменьшения активности ферментных систем эпифиза, приводящей к снижению уровня мелатонина в крови. В темный период суток в плазме крови, с одной стороны, содержится наименьшее количество гормонов тимуса, соматотропного, тиреотропного гормонов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток иммунной системы, а с другой, повышена концентрация глюкокортикоидов, оказывающих иммуносупрессивный эффект.

Тот факт, что введение мелатонина эпифизэктомированным животным не привело к восстановлению циркадианного ритма пролиферации эпителиев пищевода и крипт тощей кишки указывает на то, что формирование циркадианного ритма МИ клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов эпифизэктомированных животных с последующей инъекцией мелатонина вызвано не ритмогенным эффектом последнего, а выделением глюкокортикоидов в ответ на процедуру введения гормона. По-видимому, периодические инъекции (в одно и то же время в течение 14 дней) обусловили формирование биоритма функциональной активности надпочечников и щитовидной железы, гормоны которых оказывают влияние на пролиферацию клеток иммунной системы.

В реализации эффектов мелатонина наиболее существенны такие факторы как время суток и сезон года, когда вводится препарат, а также доза, режим и способ введения. В нашем эксперименте введение мелатонина эпифизэктомированным животным производилось непосредственно перед сменой фоторежима со световой фазы на темновую, что должно смоделировать ночной подъем уровня мелатонина у интактных животных. В литературе отмечается, что введение мелатонина экспериментальным животным и человеку в дневные часы приводит, как правило, к нарушению поведенческих реакций, вызывает сонливость и снижение температуры тела.

Важное значение в реализации эффектов мелатонина имеет выбор дозы вводимого препарата. В частности, антипролиферативный эффект действия мелатонина в отношение некоторых типов опухолей не выявлялся при введении его в высоких надфизиологических концентрациях, тогда как в физиологических дозах он тормозил рост новообразований.

Заслуживающим внимания является тот факт, что действие мелатонина зависит не только от уровня гормона в крови, но и от продолжительности его секреции в течение ночи, так как время циркуляции мелатонина в кровотоке не превышает 30 минут. На это указывают также данные о кратковременном (в течение часа) цитостатическом эффекте мелатонина на пролиферацию эпителия роговицы после его однократного введения.

Таким образом, непродолжительная циркуляция мелатонина в кровотоке, с одной стороны, однократное в течение суток введение гормона, с другой, могли стать основными причинами, из-за которых не произошло восстановления циркадианного ритма пролиферации эпителиев пищевода и крипт тощей кишки эпифизэктомированных животных. Отсутствие ритмогенного эффекта мелатонина также продемонстрировано нами при изучении его влияния на пролиферацию сперматогоний эпифизэктомированных беспородных белых крыс (Арав и др., 2006). По-видимому, условием для формирования циркадианного ритма пролиферации является поддержание стабильной концентрации мелатонина в течение всего темновго периода фоторежима. Отмеченное может рассматриваться обоснованием необходимости разработки форм и способов обеспечения пролонгированного действия мелатонина.

Влияние пептидов эпифиза на суточную динамику пролиферации обновляющихся тканей эпифизэктомированных животных. Суточная динамика продукции биологически активных пептидов эпифизом продолжает оставаться неизученной. В связи с этим при исследовании роли пептидов эпифиза в регуляции биоритмов пролиферации одной группе эпифизэктомированных животных вводили эпиталамин в 18, а второй в
6 часов. В первом случае суточная динамика пролиферации эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов исследовалась в течение двух суток. Изучение влияния утреннего (6 часов) введения пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным на восстановление циркадианного ритма пролиферации эпителия пищевода проводилось в течение суток.

Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным в
18 часов привело к восстановлению циркадианного ритма пролиферации эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов. На рисунке 10 представлена суточная динамика пролиферации эпителия пищевода эпифизэктомированных беспородных белых крыс после введения пептидов эпифиза.

Рис. 10. Динамика МИ эпителия пищевода эпифизэктомированных беспородных белых крыс после введения пептидов эпифиза в 18 часов; ( МИ, ---- сглаженная кривая)

Циркадианный ритм пролиферации эпителия пищевода эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза в 18 часов имел характер монофазного ритма. Смещение активной фазы ритма по отношению к таковой интактных животных составило 4 часа в первые сутки и
3 часа во вторые сутки опыта. Смещение акрофазы на 3 часа наблюдалось только во вторые сутки эксперимента. Обращает на себя внимание тот факт, что значения амплитудных показателей ритма и коэффициента синхронизации ритма МИ у эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза были выше по сравнению с таковыми интактных животных (табл.2,3).

Аналогичный характер присущ суточной динамике пролиферации эпителия крипт тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов эпифизэктомированных с последующим введением пептидов эпифиза беспородных белых крыс.

Посредством спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов были выявлены две составляющие ритма пролиферации всех изучавшихся тканей эпифизэктомированных животных, которым вводили пептиды эпифиза, с периодами, приближающимися к 24 и 9 часам. Особенности суточной динамики пролиферации всех видов тканей обнаруживали сходство с таковыми интактных животных, что подтверждается характером сглаженных кривых и результатами графически-параметрического анализа циркадианных ритмов пролиферации. У эпифизэктомированных животных, которым вводили пептиды эпифиза среднесуточное значение МИ и суточный пул пролиферирующих клеток эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра не имели статистически достоверных отличий (Р>0,05) от значений соответствующих показателей для интактных животных (табл.2,3).

Несмотря на общность временнй организации пролиферации изученных тканей, которая выражается в наличии монофазного циркадианного и ультрадианного ритмов МИ, имеется органная специфика пролиферативных процессов, которая выражается в различии акрофаз ритма, абсолютной и относительной амплитуд, коэффициента синхронизации и ряда других параметров (табл.3).

Таблица 3

Параметры циркадианных ритмов МИ эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов эпифизэктомированных беспородных белых крыс после введения пептидов эпифиза

Параметр

Пищевод

Кишечник

Лимфатический узел

1 сутки

2 сутки

1 сутки

2 сутки

1 сутки

2 сутки

Мезор,‰

7±1.1

68.8±4.22

24±2.35

Акрофаза,ч

900

900

2400

2400

1200

1200

АФ,ч

700-1400

600-1400

2000-200

2000-500

800-1700

800-1700

Длительность АФ,ч

7

8

6

9

9

9

Середина

АФ,ч

1030

1000

2300

030

1230

1230

АА,‰

12

13.6

54.75

38.17

32.4

29.2

ОА,‰

5.38

5.25

2

1.7

3.8

3.9

КС,1/ч

0.59

0.87

0.33

0.11

0.63

0.65

РМср,‰

54.25±7.7

1636±34

196±44

РМАФср,‰

26.25±0.6

654±84.1

99.8±7

Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным в
6 часов также привело к формированию циркадианного ритма пролиферации эпителия пищевода. Циркадианный ритм МИ эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза в 6 часов имел характер монофазного ритма с максимумом деления клеток в 21 и минимумом в 9 часов (Р<0,001). Возрастание митотической активности происходило в ночные часы. Длительность активной фазы ритма восстановилась до уровня близкого к показателям животных контрольной группы. Акрофаза ритма наблюдалась в начале темновго периода фоторежима. Смещение активной фазы ритма по отношению к таковой интактных животных составило 10 часов. Смещение акрофазы – 12 часов. Значения амплитудных показателей и коэффициента синхронизации ритма эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза в 6 часов были близкими к таковым интактных животных. Кривая динамики МИ эпителия пищевода эпифизэктомированных животных, которым вводили пептиды эпифиза в 6 часов имеет вид синусоиды инвертированной по отношению к таковой в контроле.

Результаты многочисленных исследований последних лет свидетельствуют о высокой биологической активности пептидного препарата эпифиза эпиталамина в отношении нейроэндокринной, репродуктивной и иммунной систем. Неоднократно демонстрировалось ингибирующее влияние пептидов эпифиза на функциональную активность гонад, коры надпочечников, гипофиза. Физиологические эффекты мелатонина и пептидов эпифиза обнаруживают частичное функциональное сходство, в частности, отмечается их антигонадотропное, противоопухолевое, иммуномодулирующее и антиоксидантное действие (Ryzhak et al., 2007; Kozina et al., 2007; Konturek et al., 2008). В связи с тем, что физиологические эффекты мелатонина и пептидов эпифиза зачастую оказываются сходными, неоднократно высказывалось предположение о возможности реализации физиологических свойств эпифизарных пептидов через изменение синтеза мелатонина. Изучение характера синтеза мелатонина у крыс, самок макак резусов и человека показало, что введение в вечернее время эпиталамина, а также эпиталона (синтетического аналога эпиталамина), оказывает значительное стимулирующее действие на синтез мелатонина (Korkushko et al., 2004, 2007). Однако приведенные выше результаты собственного исследования, многообразие пептидов эпифиза, а также дистантность их действия и функциональная специфичность свидетельствуют о проявлении пептидами свойств гормонов. Восстановление циркадианного ритма пролиферации обновляющихся тканей эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза указывает на то, что пептиды эпифиза обладают собственными ритмогенными свойствами, не связанными с влиянием на продукцию мелатонина.

Времення организация пролиферации обновляющихся тканей эпифизэктомированных беспородных белых крыс после совместного введения пептидов эпифиза и мелатонина. Совместное введение пептидов эпифиза и мелатонина эпифизэктомированным животным обуславливает формирование монофазного циркадианного ритма пролиферации эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов. По большинству параметров суточного ритма МИ экспериментальные животные незначительно отличаются от интактных. Длительность активной фазы ритма, а также величины амплитудных показателей ритма (коэффициент синхронизации, абсолютная и относительная амплитуды) не выходили за пределы значений для интактных животных. Суточный пул делящихся клеток не имел статистически достоверных отличий (Р>0,05) от аналогичного показателя интактных животных. Посредством спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов показано наличие циркадианного (период около 24 часов) и ультрадианного (период 7-9 часов) ритмов пролиферации обновляющихся тканей эпифизэктомированных животных, одновременно получавших пептиды эпифиза и мелатонин.

Суточная динамика пролиферации эпифизэктомированных животных, которым одновременно вводили пептиды эпифиза и мелатонин сходна с суточной динамикой пролиферации эпифизэктомированных животных, которым вводили только пептиды эпифиза. Это выражается в наличии монофазного циркадианного ритма клеточной репродукции с близкими периодами и подтверждает ритмогенные свойства пептидов эпифиза.

  1. Исследование роли эпифиза в формировании биоритмов

продукции тканевых регуляторов пролиферации

Времення организация антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени интактных беспородных белых крыс. Ритмичность функционирования пролиферативной системы контролируется на различных уровнях, но действие любого фактора в конечном итоге реализуется посредством тканевых регуляторов, на что указывает наличие органной и тканевой специфичности ритмов пролиферации. На тканевом уровне деление клеток контролируется кейлон-антикейлонной системой, в которой кейлоны подавляют, а антикейлоны стимулируют размножение клеток. Соотношение их концентраций в ткани определяет уровень её пролиферативной активности и обеспечивает структурный гомеостаз.

Формирование биоритмов пролиферации осуществляется посредством ритмической продукции тканевых регуляторов деления клеток. Продукция кейлонов в тканях различной локализации характеризуется циркадианной ритмичностью. Показано, что изменения концентрации эпидермального G2-кейлона в эпителии языка и пищевода крыс носят выраженный ритмический характер с активной фазой ритма в дневное время. Наличие циркадианного ритма биосинтеза кейлонов отмечается также в препаратах асцитной опухоли Эрлиха (Антохин, 1979; Машанова, 2003), причем ритмический характер продукции свойственен всем компонентам (G1-, S- и G2-) кейлонсодержащего препарата. Продукция факторов роста также характеризуется циркадианной ритмичностью (Haus et al., 1999).

Антирадикальная активность кейлон-антикейлонной системы печени крыс изучалась на протяжении одних суток. Данные спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов свидетельствуют о ритмической организации антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени интактных животных с периодом, приближающимся к 24 и 7 часам.

У интактных животных наблюдалось периодическое изменение антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени, которое характеризовалось монофазным ритмом на протяжении суток. Его активная фаза приходилась на ночные часы. Значения антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени были максимальными в 21 час, достоверно превышая минимальные значения в 14 часов (Р<0,05). Изменения антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени интактных животных скоррелированы с режимом освещения (табл.4). Антирадикальная активность в темновой фазе фотопериода превышала (Р<0,05) таковую в световой фазе (рис.11).

Рис. 11. Средние значения антирадикальной активности (усл. ед/мг белка) кейлон-антикейлонной системы печени в световую и темновую фазы фотопериода

С целью выявления роли эпифиза в формировании циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени была проведена экстирпация железы и изучена динамика антиради-

кальной активности кейлон-антикейлонной системы печени эпифизэктомированных беспородных белых крыс. Эпифизэктомия привела к исчезновению циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикей-лонной системы печени. Результаты спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов показали отсутствие циркадианного ритма. В то же время обнаружился выраженный ультрадианный ритм антирадикальной активности с периодом около 9,5 часов.

Колебания антирадикальной активности на протяжении суток не имели какой-либо связи с фоторежимом. На общем монотонном фоне изменений антирадикальной активности наблюдалось два статистически недостоверных подъема (Р>0,05) с максимумами в 24 и 9 часов. Антирадикальная активность кейлон-антикейлонной системы печени в световой и темновой фазах фотопериода не имела статистически достоверных (Р>0,05) отличий (рис.11).

Таким образом, удаление эпифиза привело к рассогласованию циркадианной составляющей деятельности кейлон-антикейлонной системы печени с условиями освещенности, и исчезновению циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации на 40-е сутки после эпифизэктомии. У эпифизэктомированных животных динамика антирадикальной активности характеризуется только ультрадианной ритмичностью.

Для решения вопроса о взаимосвязи организменного (эпифизарного) и тканевого уровней регуляции биоритмов пролиферации было изучено влияние введения пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным на формирование циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени. Пептиды эпифиза вводили одной группе эпифизэктомированных животных в 6 часов, другой группе в 18 часов в дозе 2.5 мг/кг ежедневно с 24 по 41 день после эпифизэктомии.

Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным как в 6, так и в 18 часов привело к формированию циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени. Посредством спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов были выявлены циркадианный ритм антирадикальной активности с периодом, приближающимся к 24 часам и ультрадианный с периодом около
8 часов.

Циркадианный ритм антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза имел характер монофазного ритма. Возрастание антирадикальной активности отмечалось в дневное время при введении пептидов эпифиза в 6 часов и в ночное время при их введении в 18 часов. Длительность активной фазы ритма восстановилась до уровня близкого к показателям животных контрольной группы (табл.4). При введении пептидов эпифиза в 6 часов акрофаза ритма наблюдалась в начале светов-го периода фоторежима. Максимум антирадикальной активности отмечался в 9 и минимум в 3 часа (Р<0,05). При введении пептидов эпифиза в
18 часов акрофаза ритма наблюдалась в начале темновго периода. Максимум антирадикальной активности отмечался в 21 и минимум в 9 часов (Р<0,05). Смещение активной фазы ритма по отношению к таковой интактных животных составило 11 часов при введении пептидов эпифиза в 6 часов и 1 час при их введении в 18 часов. Смещение акрофазы на 12 часов наблюдалось только при введении пептидов эпифиза в 6 часов. Значения амплитудных показателей и коэффициента синхронизации ритма антирадикальной активности эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза были близкими к таковым интактных животных (табл.4).

Таблица 4

Параметры циркадианных ритмов антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени интактных, эпифизэктомированных и эпифизэктомированных с последующим введением пептидов эпифиза животных

Параметр

Интактный контроль

Эпифиз-эктомия

Эпиталамин (18 часов)

Эпиталамин (6 часов)

Мезор,

усл. ед/мг белка

324.5±46.88

541±37

605±64

628.7±71.5

Акрофаза,ч

2100

Ритм

отсутст-вует

2100

900

АФ,ч

1900-500

1800-500

600-1600

Длительность АФ,ч

10

9

10

Середина АФ,ч

2400

2230

1100

АА,

усл. ед/мг белка

308.6

471

607

ОА,

усл. ед/мг белка

2.55

2.25

2.5

КС,1/ч

0.17

0.18

0.41

У эпифизэктомированных животных, которым вводили пептиды эпифиза среднесуточные значения антирадикальной активности не имели статистически достоверных отличий (Р>0,05) от значений соответствующих показателей для интактных и эпифизэктомированных животных. В то же время динамика антирадикальной активности, в отличие от эпифизэктомированных животных, характеризовалась наличием циркадианного ритма. Антирадикальная активность в световой фазе фотопериода (Р<0,05) превышала таковую в темновой фазе при введении пептидов эпифиза в 6 часов (рис.11). Введение пептидов эпифиза в 18 часов обусловило превышение (Р<0,05) антирадикальной активности в темновой фазе фотопериода (рис.11). Результаты графически-параметрического анализа указывают на сходство биоритмологической организации кейлон-антикейлонной системы печени интактных и эпифизэктомированных животных, получавших пептиды эпифиза в 18 часов. Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным в 6 часов привело к формированию инвертированного циркадианного ритма антирадикальной активности.

III. Оценка биологической активности кейлон-антикейлонных препаратов интактных, эпифизэктомированных и эпифизэктомированных с последующим введением пептидов эпифиза беспородных белых крыс

Для оценки биологической активности препарата системы кейлон-антикейлон интактных, эпифизэктомированных и эпифизэктомированных с последующим введением пептидов эпифиза крыс частично гепатэктомированным мышам вводили комплексный экстракт тканевых регуляторов пролиферации, полученный в дневные или ночные часы.

Проверка биологической активности кейлон-антикейлонного препарата, полученного от интактных беспородных белых крыс показала выраженную митозингибирующую активность его дневных фракций и способность ночных фракций усиливать пролиферацию гепатоцитов частично гепатэткомированных мышей. Это свидетельствует о том, что дневные фракции кейлон-антикейлонного препарата печени содержат преимущественно его кейлонный компонент, в то время как ночные фракции – антикейлонный. Дневные и ночные фракции препарата, выделенные у эпифиз-эктомированных животных не оказывают влияние на репродукцию клеток.

Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным белым крысам привело к восстановлению циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени. Его активные фазы отмечались в разное время суток в зависимости от времени введения пептидов эпифиза. Исследование биологической активности дневных и ночных фракций кейлон-антикейлонного препарата, полученного из печени эпифизэктомированных крыс, которым вводили пептиды эпифиза в 6 часов показало, что введение частично гепатэктомированным мышам ночной фракции препарата приводит к уменьшению МИ гепатоцитов, а введение его дневной фракции повышает митотическую активность гепатоцитов, оказывая инвертированное действие по сравнению с препаратами, полученными от интактных животных. Введение препаратов, полученных от эпифизэктомированных беспородных белых крыс, которым вводили пептиды эпифиза в 18 часов, оказывает аналогичное действие с препаратами, полученными от интактных животных.

Кейлон-антикейлонная система печени белых крыс является динамической системой, в которой на протяжении суток поддерживается баланс между стимулятором и ингибитором пролиферации. В норме у белых крыс баланс между кейлоном и антикейлоном в ночные часы смещен в сторону последнего, что приводит к усилению митотической активности. У эпифизэктомированных крыс происходит исчезновение циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации, что определяет аналогичность эффектов введения, как ночных, так и дневных фракций препарата на пролиферацию. Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным привело к восстановлению циркадианного биоритма продукции тканевых регуляторов пролиферации. В результате эффект введения дневных и ночных фракций препарата кейлона и антикейлона приобретает сходство с эффектом введения такового, полученного от интактных животных. Последнее свойственно для кейлон-антикейлонного препарата, полученного от эпифизэктомированных животных с введением пептидов эпифиза в 18 часов.

Наши исследования показывают, что реализация ритмогенных эффектов эпифиза осуществляется через тканевые регуляторы пролиферации. Это подтверждается исчезновением циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени после эпифизэктомии и его восстановлением в результате введения эпифизэктомированным животным пептидов эпифиза. В то же время возникновение ультрадианных биоритмов пролиферации связано, по-видимому, с цикличностью метаболических процессов в тканях и ультрадианным ритмом продукции тканевых регуляторов пролиферации. Это подтверждается тем, что у эпифизэктомированных животных динамика антирадикальной активности характеризуется только ультрадианной ритмичностью. Тот факт, что введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным в момент смены фоторежима с темновой фазы на световую (6 часов) привело к формированию инвертированного циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени указывает на то, что продукция эпифизом биологически активных пептидов, контролирующих ритмичность функционирования кейлон-антикейлонной системы, должна происходить в ночные часы.

Таким образом, система регуляции пролиферативных процессов представляет собой многоуровневый комплекс, в основе которого лежит регуляция деления отдельной клетки. На основании результатов собственного исследования и принимая во внимание данные литературы, можно заключить, что формирование циркадианного ритма пролиферации обеспечивается участием следующих структур: 1) супрахиазматические ядра, воспринимающие информацию от сетчатки глаза о режиме освещения и задающие ритм секреторной активности эпифиза; 2) эпифиз, трансформирующий нервный импульс в эндокринный сигнал; 3) периферические эндокринные железы, модулирующие параметры ритма; 4) эндогенные тканевые регуляторы пролиферации – кейлоны и антикейлоны, формирующие биоритм пролиферации конкретной ткани; 5) внутриклеточные регуляторы пролиферации.

Эпифизарная регуляция биоритмов пролиферации заключается в формировании сезонного и циркадианного ритмов митотической активности и не затрагивает ультрадианную составляющую. Действие биологически активных веществ эпифиза на пролиферацию может быть опосредовано периферическими эндокринными железами и кейлон-антикейлонной системой, а также осуществляться непосредственным воздействием на ткань. В последнем случае мелатонин задерживает клетки в G1- или
G2-периодах клеточного цикла. Продукция эпифизом мелатонина носит циркадианный характер. Концентрация мелатонина в крови достигает максимума к середине ночи, что соответствует пассивной фазе ритма пролиферации. Увеличение митотической активности начинается, как правило, во второй половине темновго периода, когда наблюдаются падение активности ферментных систем эпифиза и снижение уровня мелатонина в крови. Действие биологически активных пептидов эпифиза на формирование циркадианного ритма пролиферации осуществляется через кейлон-антикейлонную систему. Продукция тканевых регуляторов пролиферации характеризуется циркадианной ритмичностью с активной фазой ритма продукции кейлонов в дневные и антикейлонов в ночные часы.

Таким образом, механизм формирования эпифизом циркадианного ритма пролиферации может быть следующим (рис.12):

Рис.12. Фазограмма циркадианных ритмов продукции биологически активных веществ эпифизом, концентрации кейлона в ткани и чувствительности клеток к действию кейлона. (Отрезками показаны активные фазы ритма.  — суточная динамика пролиферации ткани)

Выделяющийся с наступлением темноты мелатонин, обладает цитостатическим эффектом и тормозит пролиферацию клеток. Вместе с тем, он повышает проницаемость клеточных мембран пинеалоцитов для синтезированных в них олигопептидов, облегчая тем самым попадание последних в кровоток. Выделяющиеся пептиды эпифиза подавляют продукцию кейлонов, изменяя баланс кейлон-антикейлонной системы ткани в пользу последних. На фоне прекращения синтеза мелатонина и повышения уровня антикейлонов во второй половине темновго периода происходит увеличение митотической активности ткани. В дальнейшем при отсутствии мелатонина и пептидов эпифиза повышается продукция кейлонов, что вызывает снижение пролиферативной активности. Последующий синтез биологически активных веществ эпифизом в ночные часы приводит к повторению описанных выше процессов в результате чего и происходит формирование циркадианного ритма пролиферации.

Выводы

  1. Разработанный способ анатомического доступа к эпифизу беспородных белых крыс и основанный на нем метод эпифизэктомии является оптимальным для использования в хронобиологических исследованиях.
  2. Эпифизэктомия вызывает исчезновение циркадианного ритма пролиферации эпителиев пищевода, крипт тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов беспородных белых крыс и не влияет на ультрадианный биоритм митотической активности указанных тканей.
  3. Однократное в течение суток введение мелатонина эпифизэктомированным беспородным белым крысам в начале темновго периода в течение 14 суток не привело к восстановлению циркадианного ритма пролиферации эпителиев пищевода и крипт тощей кишки.
  4. Эпиталамин, как препарат комплекса биологически активных пептидов эпифиза восстанавливает циркадианный ритм пролиферации обновляющихся тканей (эпителиев пищевода, тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов беспородных белых крыс) после эпифизэктомии.
  5. В результате эпифизэктомии у беспородных белых крыс происходит исчезновение циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации – кейлонов и антикейлонов с сохранением ультрадианного ритма их выработки.
  6. Введение биологически активных пептидов эпифиза (эпиталамина) эпифизэктомированным беспородным белым крысам приводит к восстановлению циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации (кейлонов и антикейлонов).
  7. Регуляция циркадианного ритма митотической активности осуществляется при участии пептидов эпифиза, которые формируют циркадианный ритм продукции тканевых регуляторов пролиферации.

Практические рекомендации

  1. Результаты исследования рекомендуются для использования в учебном процессе на соответствующих кафедрах для преподавания дисциплин медико-биологического профиля, включающих разделы «Цитология», «Эндокринная система», «Организм и факторы среды».
  2. Разработанный метод эпифизэктомии у крыс рекомендуется использовать для изучения роли эпифиза в регуляции биоритмов функций организма.
  3. Для использования мелатонина в качестве адаптогена для коррекции нарушений циркадианного ритма пролиферации необходима разработка и дальнейшее исследование форм и способов обеспечения пролонгированного действия мелатонина.
  4. Результаты исследования позволяют рекомендовать пептиды эпифиза для дальнейшего их изучения в качестве потенциальных адаптогенов для коррекции нарушений биоритмов пролиферации у человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Слесарев С.М., Железняк Е.В. / Влияние пептидов эпифиза на клеточную пролиферацию. // Сборник материалов II Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине. - Тула, 2003. – С.130-131.
  2. Слесарев С.М., Сыч В.Ф., Арав В.И. / О роли биологически активных веществ эпифиза в формировании циркадианного ритма пролиферации. // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - Ульяновск, 2003. – С.48-49.
  3. Арав В.И., Сыч В.Ф., Слесарев С.М., Железняк Е.В. / Эпифизарная регуляция циркадианных ритмов клеточной репродукции. // Материал пятой Всероссийской научно-технической конференции «Современные проблемы математики и естествознания». - Нижний Новгород, 2003. – С.15-16.
  4. Арав В.И., Сыч В.Ф., Слесарев С.М. / Пептиды эпифиза и суточный ритм пролиферации эпителия крипт тощей кишки. // Материалы Всероссийской научной конференции “Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы”. - Москва, 2003. – С.101-102.
  1. Арав В.И., Сыч В.Ф., Слесарев С.М. / Эпифиз и регуляция циркадианного ритма клеточной пролиферации. // Ученые записки Ульяновского государственного университета. Серия биологическая и медицинская. - Ульяновск, 2003. – Вып.1(7). – С.25-31.
  2. Сыч В.Ф., Арав В.И., Слесарев С.М., Железняк Е.В., Журавлев В.М., Бутов А.А., Санников И.А. / Выявление скрытых периодичностей в биологических процессах.
    // Труды Пятой Международной конференции “Математическое моделирование физических, экономических, технических, социальных систем и процессов”. - Ульяновск, 2003. – С.181-182.
  3. Арав В.И., Слесарев С.М., Железняк Е.В. / Эпифизарная регуляция циркадианного ритма пролиферации. // Материалы второго международного симпозиума “Проблемы ритмов в естествознании”. - Москва, 2004. – С.44-46.
  4. Слесарев С.М., Сыч В.Ф., Арав В.И., Железняк Е.В. / Роль эпифиза в формировании циркадианного биоритма пролиферации. // Сборник докладов XVIII любищевских чтений «Современные проблемы эволюции». - Ульяновск, 2004. – С.353-356.
  5. Слесарев С.М., Арав В.И., Сыч В.Ф. / Эпифизарная регуляция циркадианного биоритма пролиферации. Тезисы V общероссийского съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. // Морфологические ведомости (приложение). – 2004. - №1-2. – С.94.
  6. Sych V.F., Arav V.I., Slesarev S.M. / Pineal Gland and the Regulation of Cell Proliferation. 7th International Congress of Vertebrate Morphology. // Journal of Morphology. – 2004. – Volume 260, Number 3. – P.333.
  7. Сыч В.Ф., Арав В.И., Слесарев С.М., Слесарева Е.В. / Выявление периодичности функционирования биологических систем. // Труды Шестой Международной конференции «Математическое моделирование физических, технических, экономических, социальных систем и процессов». - Ульяновск, 2005. – С.122-123.
  8. Школа Н.П., Арав В.И., Слесарев С.М., Слесарева Е.В. / Эпифизарная регуляция циркадианного биоритма пролиферации эпителия пищевода белых крыс. // Материалы Всероссийской конференции с международным участием “Медико-физиологические проблемы экологии человека”. – Ульяновск, 2007. – С.285-287.
  9. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И. / Попытка формирования циркадианного ритма пролиферации соматических и половых клеток путем введения мелатонина.
    // Морфологические ведомости. – 2007. - №3-4. – С.60-62.
  10. Слесарев С.М., Арав В.И., Слесарева Е.В., Пашков А.Н. / Взаимосвязь эпифизарной и тканевой регуляции циркадианного биоритма пролиферации. // Труды международного форума по проблемам науки, техники и образования. - Москва, 2007. – С.168-169.
  11. Слесарев С.М., Слесарева Е.В. / Роль пептидов эпифиза в формировании циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени белых крыс. // Материалы 2 международной научной конференции молодых ученых-медиков. – Курск, 2008. – С.114-115.
  12. Слесарев С.М., Слесарева Е.В. / Эпифизарная регуляция циркадианного ритма пролиферации эпителия пищевода белых крыс. // Материалы 2 международной научной конференции молодых ученых-медиков. – Курск, 2008. – С.116-117.
  13. Слесарев С.М., Слесарева Е.В. / Влияние эпифизэктомии на суточную динамику пролиферации клеток герминативного центра лимфатических узлов. // Материалы 2 международной научной конференции молодых ученых-медиков. – Курск, 2008. – С.118-119.
  14. Слесарев С.М., Арав В.И., Слесарева Е.В. / Перспективы использования биологически активных пептидов эпифиза в качестве хрономодулирующего средства при нарушениях циркадианного биоритма пролиферации. // Материалы межрегиональной научно-практической юбилейной конференции «Проблемы здоровьесбережения школьников и студентов. Новые научные тенденции в медицине и фармации». - Воронеж, 2008, - С.410-412.
  15. Слесарев С.М., Арав В.И., Слесарева Е.В. / Циркадианный ритм пролиферации эпителия пищевода белых крыс и его эпифизарная регуляция. // XXII Любищевские чтения. Современные проблемы эволюции. - Ульяновск, 2008. - С.284-287.
  16. Слесарев С.М., Арав В.И. / Взаимосвязь эпифизарной и тканевой регуляции циркадианного ритма пролиферации. // XXII Любищевские чтения. Современные проблемы эволюции. - Ульяновск, 2008. - С.287-290.
  17. Слесарева Е.В., Слесарев С.М., Арав В.И. / Временная организация пролиферации соматических и половых клеток и её эпифизарная регуляция. // Материалы 4 международной научно-практической конференции «Составляющие научно-технического прогресса». - Тамбов, 2008. - С.114-115.
  18. Антохин А.И., Козлова А.Ю., Жаркова Н.А., Слесарев С.М., Попова Н.Я., Машанова О.Г., Евстафьев В.В., Романов Ю.А. / Механизмы формирования пространственно-временной организации пролиферативной системы тканей. // Материалы научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины», посвященной 45-летию Медико-биологического факультета РГМУ. – Москва, 2008. – С.20.
  19. Слесарева Е.В., Арав В.И., Слесарев С.М. / Эпифизарная регуляция циркадианного биоритма. Материалы Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации». - Оренбург, 2008. // – Морфология. – 2008. - №5. – С.92.
  20. Арав В.И., Слесарев С.М., Слесарева Е.В. / Эпифизарная регуляция временной организации пролиферации. // Актуальные вопросы аграрной науки и образования. Материалы Международной научно-практической конференции. - Ульяновск, 2008. - С.6-8.
  21. Arav V.I., Slesareva E.V., Slesarev S.M. / Pineal Gland and Circadian Rhythm Regulation // Progress in Circadian Rhythm Research – New York: Nova Biomedical Books, - 2008. – 254p.
  22. Арав В.И., Слесарев С.М., Слесарева Е.В. / Метод экстирпации эпифиза у белых крыс. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – №9. – С.385-387.
  23. Слесарев С.М., Арав В.И. / Эпифизарная регуляция циркадианного ритма пролиферации клеток герминативного центра лимфатического фолликула трахеобронхиальных лимфатических узлов белых крыс. // Вестник новых медицинских технологий. – 2008. - №1. – С.21-22.
  24. Слесарев С.М., Антохин А.И., Арав В.И. / Эпифизарная регуляция временнй организации пролиферации эпителия крипт тощей кишки у белых крыс. // Вестник РГМУ. – 2008. - №6. – С.86-88.
  25. Слесарев С.М., Арав В.И. / Влияние эпифизэктомии на суточную динамику пролиферации эпителия пищевода белых крыс. // Морфологические ведомости. – 2008. - №1-2. – С.98-99.
  26. Слесарев С.М., Арав В.И., Антохин А.И., Пашков А.Н. / Влияние эпифизэктомии на суточную динамику антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени белых крыс. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. - №9. – С.333-335.
  27. Слесарев С.М., Арав В.И., Слесарева Е.В. / Пролиферативный ритм эпителия тощей кишки при эпифизэктомии в эксперименте. // Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии». – Самара, 2009. – С.462-464.
  28. Слесарев С.М., Арав В.И., Слесарева Е.В. / Пептиды эпифиза в формировании циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени белых крыс. // Вестник новых медицинских технологий. – 2009. - №1. – С.22-24.
  29. Слесарев С.М. / Роль пептидов эпифиза в регуляции циркадианного ритма пролиферации эпителия пищевода. // Вестник РГМУ. – 2009. - №2. – С.62-64.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.