WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

  На правах рукописи

БЕЛЖЕЛАРСКАЯ

Светлана Николаевна

"Системы клонирования и экспрессии  целевых  генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков"

03.01.03-молекулярная биология

 

Автореферат диссертации

  на соискание ученой степени

  доктора биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии

Учреждения Российской академии наук

Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Официальные оппоненты:

доктор биологических  наук, проф., Чумаков П.М.

чл.корр. АН Татарии, доктор биологических  наук, проф.  Ильинская О.Н.

доктор биологических  наук, проф Тишков В.И.

Ведущая организация:

Филиал ИБХ (Института Биоорганической Химии РАН)  г. Пущино

Защита состоится «  » 2011  г  в часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу 119991, г.Москва, ул.Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан «  »  2011  г

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук А.М.Крицын

Общая характеристика работы

 

Актуальность проблемы. Оптимизация и дальнейшее совершенствование различных используемых, а также разработка новых систем доставки и экспрессии рекомбинантных генов, в зависимости от типа клеток-мишеней и спектра задач, представляет собой важную функциональную  научную задачу и имеет практическое значение в области медицины. Конструирование векторных ДНК для введения целевых последовательностей в геномы микроорганизмов,  дрожжей, растений, насекомых, млекопитающих находит практическое применение  для решении широкого спектра задач. На сегодняшний день используются различные методы для  введения чужеродных генов в клетки про- и эукариот при помощи  физико-химических способов доставки  (электропорации, бомбардировки микрочастицами золота или вольфрама и т.д.) и  при помощи различных вариантов биологической доставки (липидных коньюгатов – липосом, рекомбинантных вирусов и т.д). Введение  рекомбинантных гибридных молекул ДНК  в прокариотические и эукариотические клетки с помощью векторов имеет массу преимуществ и вышло на первый план при решении этой задачи и разработка на их основе различных систем экспрессии, обеспечивающих эффективную продукцию белков in vitro и in vivo, постоянно совершенствуется,  расширяется круг задач, при решении которых они  применяются.

Кишечная палочка E. coli - наиболее генетически, биохимически и физиологически изученный микроорганизм, поэтому основные работы по гетерологичной экспрессии выполняются на этих клетках. Однако E. coli относится  к условно-патогенным для человека микроорганизмом, что может создавать определенные трудности при получении на ее основе, например,  фармацевтических препаратов. Сегодня  E. coli часто используют в качестве «промежуточной» системы клонирования при конструировании гибридных молекул  ДНК для других типов клеток. Так, в новых бакуловирусных  системах для получения рекомбинантного вируса  используются  клетки E. coli на промежуточной стадии  для поддержания и размножения вирусной ДНК  в виде кольцевой формы, с последующей репликацией бакуловируса в клетках насекомых.

  Бактерия Bacillus subtilis по степени популярности и изученности следует за  E .coli:  на ее основе также конструируют штаммы-продуценты, секретирующие чужеродные белки из клеток. B. subtilis безопасна для человека и животных и успешно освоена микробиологической промышленностью.

Из низших  эукариот хорошо изучены дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Первый штамм–продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В был создан именно на S. cerevisiae. Дрожжи представляют собой один из важнейших промышленных микроорганизмов, поэтому  интенсивная разработка исследований по созданию векторной дрожжевой системы продолжает быть актуальной и в настоящее время.

Системы клеток бактерий и дрожжей имеют свои особенности при использовании в генетической инженерии и при создании  векторов для клонирования и экспрессии генов, для  секвенирования  ДНК и  в качестве модельных систем для изучения генетических процессов,  которые применяются в фундаментальной и прикладной биомедицине. Получены штаммы бактерий и дрожжей,  для клонирования и экспрессии генов с высокой эффективностью синтезирующие гетерологичные белки человека и животных. Каждая из систем клонирования и экспрессии имеет свои недостатки и преимущества. Системы клонирования и экспрессии генов в клетках бактерий и дрожжей не позволяют экспрессировать несплайсированные гены.  Кроме того, в них невозможен сложный посттрансляционный процессинг полипептидов, происходящий в клетках млекопитающих. Поэтому все большую актуальность приобретает проблема экспрессии мультимерных белков эукариот, которые требуют для проявления своей биологической активности специфических посттрансляционных модификаций и сборки из различных субъединиц.  В  этих случаях используют экспрессирующие системы на основе клеток высших эукариот, которые обеспечивают синтез белков, структурно и функционально близких к своим природным аналогам. В последние два десятилетия предложено большое число векторов, в качестве которых выступают  различные вирусы для введения чужеродных генов в клетки-мишени.  С помощью вирусов - естественных переносчиков чужеродной ДНК в клетки млекопитающих - удается обеспечить эффективное проникновение генетического материала в клетки-мишени, достичь высокого уровня трансфекции клеток in vitro  и in vivo и  высокого уровня  экспрессии внесеннных генов. Однако существование врожденного иммунитета у человека к большинству  таких векторов может ограничить их применение.

Одним из подходов к преодолению этой проблемы  является создание рекомбинантных вирусов, не патогенных  для человека,  в качестве векторов для переноса генов. Например, у человека отсутствует врожденная гуморальная и клеточная иммунная память по отношению  к  бакуловирусам. Поэтому бакуловирусная система экспрессии на основе клеток насекомых отряда Spodoptera, которая обеспечивает сверхпродукцию рекомбинантных белков в эукариотических клетках, популярна в настоящее время. Бакуловирусная система (БЭС) позволяет экспрессировать несплайсированные гены, а особенности  структуры капсидной оболочки бакуловирусов позволяют упаковывать в нее очень большие гены. Рост интереса к  этим системам экспрессии связан также с возможностью использования бакуловирусных векторов для доставки и экспрессии  гетерологичных генов  в клетках млекопитающих. Экспрессионная система на основе бкуловирусов, позволяющая синтезировать полноценные эукариотические белки в различных клетках млекопитающих in vitro, ex vivo и in vivo, рассматривается в качестве  перспективной альтернативы векторам на основе вирусов человека. Оптимизация  такой системы, в зависимости от типа клеток-мишеней, является актуальной задачей современных исследований  в области биомедицины. 

Цель работы: Сравнительный анализ различных векторных систем, клонирование и экспрессия целевых рекомбинантных генов в клетках про- и эукариот и их применение для решения научных и прикладных задач. Оптимизация системы доставки и экспрессии генов в клетках насекомых и млекопитающих на основе бакуловирусных векторов. 

 

Основные задачи исследования: Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

  1.  С использованием бактериальных систем клонирования и экспрессии: 

Получить  библиотеки бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномных РНК вируса штриховатой мозаики ячменя  (ВШМЯ) и вируса картофеля (ХВК), для изучения структуры вирусных геномов.

Разработать тест-систему для функциональной селекции библиотек мутантных  рибозимов  в клетках Bacillus subtilis с целью изучения механизмов функционирования синтезированных рибозимов in vivo.

  2.  С использованием систем экспрессии в клетках  листьев табака, ооцитов:

Создать генетические конструкции  для  доставки и экспрессии  гена серотонинового рецептора мозга мыши 5HT1c в клетках  листьев табака, ооцитах ксенопуса и клетках насекомых  для  изучения роли серотониновой системы в реакции  различных типов клеток на стрессорные сигналы.

3.  С использованием дрожжевой системы экспрессии:

  Создать набор векторных конструкций, содержащих делеционные варианты  промотора

кислой фосфатазы PHO5,  для экспрессии и секреции генов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

4. С использованием  бакуловирусной системы экспрессии на основе клеток насекомых и

млекопитающих:

Создать  набор мультипромоторных  векторов экспрессии для клеток насекомых, содержащих промоторы поздних генов  вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), которые обеспечивают одновременную экспрессию нескольких генов в одной инфицированной клетке насекомого.

  Сконструировать трансфер-векторы на основе бакуловирусов, содержащие  регуляторные элементы, используемые ферментативными системами клеток млекопитающих,  для экспрессии клонированных целевых генов в культуре клеток млекопитающих.

  Получить рекомбинантные вирусы и линии клеток насекомых, синтезирующие иммунологически активные - и -субъединицы хорионгонадотропина (ХГ) и CD4 рецептора.

  Получить рекомбинантную  функционально-активную стероид-21-гидроксилазу человека и мутантный вариант этого фермента с высоким уровнем экспрессии в клетках насекомых Sf9 и Hi5 с использованием бакуловирусов и провести функциональный анализ мутантного фермента in vitro.

  Получить структурные белки и вирусоподобные частицы  вируса гепатита С (ВГС ) в клетках насекомых и клетках млекопитающих с помощью бакуловирусной системы экспрессии и исследовать их функциональные характеристики.

  Исследовать морфогенез вируса гепатита C: изучить влияние гликозилирования оболочечных белков ВГС на их экспрессию и процессинг и формирование вирусоподобных частиц ВГС  в клетках  насекомых.

  Исследовать влияние новых синтетических ингибиторов гликозилирования белков на  процессинг структурных белков и формирование вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых и млекопитающих.

 

Научная новизна и практическая ценность работы  заключается в разработке и совершенствовании систем экспрессии, с помощью  которых можно эффективно получать in vitro и  in vivo  гетерологичные белки, имеющие практическое значение.

Предложена схема организации фрагментированного генома вируса штриховатой мозаики ячменя, показано, что исследуемые штаммы ВШМЯ являются близкородственными. Впервые получена библиотека бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии  геномной РНК ВШМЯ.

Предложена бактериальная система селекции рибозимов на основе B. subtilis, которая  может быть применена для функционального скрининга библиотек мутантных рибозимов.

  Предложенная векторная система дрожжей  с использованием промотора гена PHO5 может быть использована  для секреции гетерологичных белков в клетках S. cerevisiae.

Разработанные условия синтеза серотонинового рецептора 5HT1c мозга мыши в клетках растений и его функциональной активности в клетках растений и в ооцитах  Xenopus laevis могут быть использованы для анализа  клеточной системы преобразования внешнего стимулирования во внутриклеточные сигналы в клетках растений.

  Новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии на основе бакуловирусов позволят в одной инфицированной клетке насекомого экспрессировать одновременно несколько генов  и получать мультимерные белки, функционально близкие природным аналогам.

  Предложенный роллерный метод препаративного выращивания рекомбинантных бакуловирусов может использоваться для получения штаммов-продуцентов белков, имеющих практическое значение.

  Новые бакуловирусные векторы  с экспрессирующими кассетами под контролем промотора, функционирующего в клетках млекопитающих, и разработанные условия доставки модифицированных векторов в клетки млекопитающих могут быть успешно использованы для эффективнго переноса и экспрессии целевых генов как in vitro, так и in vivo.

  Разработанные условия синтеза  CYP21A2 с большим выходом в бакуловирусной системе, могут быть использованы для функционального анализа мутаций стероид-21-гидроксилазы. Данные о влиянии мутаций на свойства стероид-21 - гидроксилазы, полученные in vitro, могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести течения  классической формы адреногенитального синдрома.

Мультисубъединичные вирусоподобные частицы вируса гепатита С (ВГС), полученные в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы могут использоваться для иммунологических и терапевтических  исследований, для получения вакцин, для поиска новых соединений с антивирусной активностью, а также  в качестве модельной системы для изучения взаимодействия ВГС с клетками, механизмов размножения вируса.

Исследование N-гликозилирования оболочечных белков Е1 и Е2  ВГС в клетках насекомых позволит уточнить роль углеводных цепей в образовании комплекса Е1Е2 и его функционировании  в инфекционном цикле вируса. 

  Воздействие новых синтетических N-алкилированных DNJ на вирусный морфогенез ВГС  может быть использовано в качестве альтернативного подхода к существующим стратегиям блокирования вируса гепатита С.

Личный вклад автора.  Основные результаты работы получены лично автором,  под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы.  Результаты исследований представлены на  IV Международном симпозиуме СССР-ФРГ (Ереван, 1981), VI Международном симпозиуме СССР-Франция (Цхалтубо, 1982), Всесоюзном совещании «Геном вирусов растений» (Владивосток, 1982),  Международной конференции (Jena, GDR, 1983), 16 конференции  FEBS ( Москва, 1984), конференции “ Генная и клеточная инженерия” (Москва, 1993), Международной конференции, посвященной памяти акад. А.А.Баева (Москва, 1996), V Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Москва, 2001), VII Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Суздаль, 2004), 30-том Конгрессе FEBS (Будапешт, 2005). XVII Зимней школе для молодых ученых (Москва, 2005), XI Международной конференции для молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2005), на XХII Зимней молодежной научной  школе «Перспективные направления физико-химической  биологии и биотехнологии» (Москва, 2010). Отдельные материалы диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории молекулярной эндокринологии, Лаборатории популярных основ действия физиологически активных соединений и обьединенном семинаре нескольких научных подразделений биологической направленности Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта. 

Публикации.  По теме диссертации, помимо тезисов конференций (20), опубликовано 20 статей в рецензируемых научных журналах и 1 статья принята к печати.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения и выводов, списка литературы по теме диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах, содержит  46 рисунков и 8 таблиц.

 

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

  В работе представлена  разработка  различных систем клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций белков, полученных с использованием этих систем,  начиная с бактериальных и завершая бакуловирусной системой экспрессии в клетках насекомых и млекопитающих.  Наиболее полно и подробно представлена эффективная бакуловирусная система экспрессии биологически активных белков, активно используемая в современной фундаментальной и практической молекулярной биологии.

Работа состоит из следующих основных разделов:

 

1. Изучение структурной организации геномов РНК-содержащих фитопатогенных вирусов, представляющих интерес для биотехнологии, вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и Х-вируса картофеля (ХВК).

1.1. Структурная организация генома вируса штриховатой мозаики ячменя ВШМЯ. Вирус штриховатой мозаики ячменя, представляющий группу гордеивирусов, РНК-содержащий вирус с функционально фрагментированным  геномом. Различные штаммы вируса различаются по количеству вирионных РНК.

  1.1.1.   Анализ геномных РНК разных штаммов вируса методом олигонуклеотидного картирования.

Методом фракционирования TI-олигонуклеотидов, продуктов полного гидролиза РНК рибонуклеазой TI, в системе двумерного электрофореза в ПААГ,  проведен сравнительный анализ олигонуклеотидных карт геномных вирионных РНК ВШМЯ штаммов: Русский, Типичный, N (Norvich), ND18 (North Dakota) и AM (Argentina mild). Олигонуклеотидный анализ выявил значительное структурное сходство тотальных вирионных РНК исследуемых штаммов вируса. Кроме гомологичных последовательностей в геномных РНК разных штаммов, обнаружены штаммоспецифические олигонуклеотиды. Препараты вирусной РНК разных штаммов ВШМЯ при электрофоретическом анализе разделяются на две, три или четыре зоны, обозначенные как РНК1, РНК2, РНК3 и РНК4. Исходя из этих данных определили двух-, трех- и четырехкомпонентные штаммы, а анализ индивидуальных геномных РНК сравниваемых штаммов вируса выявил их степень сложности и гомологию. Показано, что РНК4 является делеционным вариантом третьего геномного компонента вируса. Наличие такой делеции впоследствии подтверждено Афанасьевым Б.Н. и Рупасовым В.В в лаборатории Ю.В.Козлова (ИМБ РАН) при определении первичной структуры РНК3 и РНК4, после получения клонированных ДНК-копий генома ВШМЯ. Таким образом, сравниваемые штаммы, несмотря на различия в количестве  геномных  компонентов,  имеют высокую степень гомологии геномов и являются эволюционно  близкородственными. Предложена схема организации функционально фрагментированного генома  ВШМЯ (Рис.1).

Рис. 1.  Схема организации  генома вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ). Прямоугольниками обозначены гены, кодирующие вирусные белки. Заштрихованные участки обозначают области гомологии между вирусными белками.

  1.1.2. Получение бактериальных клонов, содержащих последовательности генома ВШМЯ  и их анализ.

В реакции обратной транскрипции на нативных и искусственно полиаденилированных РНК ВШМЯ синтезированы одноцепочечные кДНК, комплементарные индивидуальным РНК генома вируса. Сравнительный анализ продуктов рестрикции кДНК индивидуальных фрагментов генома вируса показал, что кДНК всех четырех компонентов генома  ВШМЯ штамма Аргентинский мягкий различаются по структуре. Двуспиральные ДНК получали с помощью ДНК-полимеразы I

E. coli, встраивали в плазмидную ДНК с помощью синтетических линкеров и трансформировали ими  клетки E. coli.  В результате был получен набор бактериальных клонов, содержащих  ДНК-копии четырех отдельных компонентов генома ВШМЯ. Весь набор ДНК вставок охватывал последовательности 3’- концевой половины каждой из четырех вирионных РНК ВШМЯ.

Таким образом, была получена библиотека бактериальных клонов для использования их при  исследовании последовательности клонированных ДНК-копий, что дает информацию о структуре отдельных участков геномной РНК.  Показано, что, независимо от числа РНК-компонентов, геномы всех исследуемых штаммов ВШМЯ содержат гомологичные последовательности, что все геномные РНК вируса содержат идентичные последовательности, локализованные в 3’-концевой  некодирующей области, что РНК4 является делеционным вариантом третьего компонента генома ВШМЯ - РНК3, и что 120К белок, кодируемый геномной РНК1 ВШМЯ, имеет гомологию с неструктурными белками других РНК-содержащих вирусов.

1.2. Первичная структура и организация генома X-вируса картофеля (ХВК).  Х-вирус картофеля – типичный представитель группы потекс-вирусов,  содержащих одноцепочечную  (+)РНК. На 5’-конце РНК находится «кэп»-структура, а на 3’-конце – поли(А)- последовательность. Группой авторов, при участии автора настоящей диссертации, установлена полная последовательность нуклеотидов ДНК, эквивалентных геномной РНК ХВК. По результатам компьютерного анализа этой последовательности предложена схема организации генома вируса.

Для секвенирования использовано шесть ДНК – копий  клонированных фрагментов вирусной РНК, перекрывающихся между собой и комплементарных району генома ХВК, кодирующему невирионные белки и захватывающему часть гена белка оболочки. ХВК- специфические вставки из рекомбинантных плазмид или их субфрагменты клонировали в векторе M13mp19 или mp8 по Sma1-сайту и секвенировали по методу Сэнгера. Кроме универсальной секвенирующей затравки, использовали синтетические 15- и 16-членные олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные или идентичные последовательностям вирионной РНК ХВК. Полученные данные позволили установить полную последовательность нуклеотидов РНК ХВК из 6435 н., не считая поли (А)-блока. Эта последовательность, а также схема предполагаемой организации генома ХВК представлены  в опубликованной статье (Доклады АНСССР. 300, 711-716).

2.  Использование бактериальной системы селекции на основе Bacillus subtilis для отбора

мутантных рибозимов, эффективно функционирующих в физиологических  условиях.

Предлагаемая система селекции основана на том, что рост клеток B. subtilis в присутствии

макролидного антибиотика тилозина зависит от активности рибозима, синтезируемого в клетках бактерий. Выживаемость каждого клона зависит от того, насколько эффективно рибозим расщепит лидерную последовательность РНК гена ermC, кодирующего метилазу, придающую клеткам резистентность к тилозину. Обычно метилаза вырабатывается в клетках в количестве, недостаточном для придания устойчивости к тилозину, поскольку AUG-кодон, необходимый для инициации синтеза метилазы, скрыт во вторичной структуре лидерной последовательности  РНК гена ermC. В естественных условиях резистентность к тилозину проявляется в присутствии субингибиторных концентраций другого макролидного антибиотика – эритромицина, который, связываясь с рибосомой, изменяет вторичную структуру лидерной последовательности РНК гена ermC, высвобождая AUG-кодон, что приводит к синтезу метилазы. В предложенной системе Дубноу и Крамера [170,171] реорганизация лидерной последовательности мРНК ermC происходит в результате расщепления мРНК в определенном сайте под действием мутантного рибозима, что ведет к освобождению иницирующего кодона AUG (Рис.2).

Рис. 2. Схема структурной реорганизации лидерной последовательности мРНК гена ermC под действием эритромицина (а) и при расщеплении рибозимом (б); (в) - структура рибозима, связанного с субстратом мРНК ermC; d - сайты связывания с рибосомой  для синтеза метилазы.

  Для изучения функционирования синтезированных мутантных рибозимов в селекционной бактериальной системе на основе Bacillus subtilis мы использовали сконструированные ранее Крамером и Лизарди рибозимные последовательности, способные расщеплять лидерную последовательность  мРНК ermC, проклонированные в плазмиде и введенные  в специально модифицированный штамм B. subtilis. Последовательность мутантного рибозима состоит из двух областей (Рис 2, в).  Первая кодирует собственно рибозим, расщепляющий лидерную последовательность транскрипта гена ermC по встроенному участку GUC. Вторая область содержит последовательность, соответствующую терминатору транскрипции гена comG B. subtilis. Двутяжевой фрагмент ДНК, содержащий  рибозим и терминатор транскрипции, клонирован Дубнау и др. в плазмиде pHK005, которая  содержит промотор SPAC, направляющий транскрипцию, и введен в B. subtilis. В качестве контроля сконструирована плазмида pHK001,  отличающаяся от pHK005 заменами, инактивирующими каталитический домен рибозима. Была сконструирована плазмида pHK002, содержащая в гене ermC сайт EcoRI, а в участке, кодирующем лидерную последовательность мРНК ermC,  встроен триплет GUC, который должен служить субстратом для расщепления рибозимом .  Модификация лидерной последовательности не влияет на функционирование гена ermC. Для  изучения способности синтезированного рибозима расщеплять лидерную последовательность мРНК ermC были получены штаммы B. subtilis,  содержащие одну копию модифицированного гена ermC. В плазмидную ДНК pHK002 встроен триплет GUC, в участок, кодирующий лидерную последовательность мРНК ermC,  который должен служить субстратом для расщепления рибозимом, и получен штамм B. subtilis,  содержащий одну копию модифицированного гена ermC. Модификация лидерной последовательности не влияла на функционирование гена ermC. Штаммы B. subtilis,  содержащие одну копию модифицированного гена ermC ,  тестировали на чувствительность к тилозину в отсутствие эритромицина и устойчивость в его присутствии. Опыты показали, что клетки штамма BD430 B. subtilis, содержащие плазмиду с немодифицированным геном ermC, а также клетки штамма HK002, содержащие плазмиду с модифицированным геном ermC, устойчивы к тилозину, при этом,  клетки штаммов HK005 и HK001 чувствительны к тилозину и эритромицину, поскольку в этих клетках не вырабатывается метилаза, придающая устойчивость к макролидным антибиотикам. Для  изучения способности синтезированного рибозима расщеплять лидерную последовательность мРНК ermC  были получены штамм HK012 B. subtilis, в клетки которого введены плазмида с последовательностью антисмысловой РНК и  плазмида с транскрибируемой мишенью, а также  штамм HK014 B. subtilis,  в клетки которого введены плазмида, способная  индуцировать экспрессию рибозима в B. subtilis, и плазмида, содержащая модифицированный ermC ген. Клетки штамма HK014 на среде с тилозином росли существенно лучше, чем клетки штаммов HK002 и контрольного HK012.  Более того, они выживали в присутствии ингибирующей концентрации тилозина 10 мкг/мл, что может косвенно свидетельствовать о функционировании синтезированного рибозима. В результате были получены бактериальные трансформанты, экспрессирующие наиболее эффективные мутантные рибозимы. Результаты исследования показали, что предложенная система может быть использована для отбора рибозимов, эффективно функционирующих in vivo.

  Таким образом, клонирование в клетках E. coli позволило создать библиотеки к ДНК геномов РНК- содержащих фитовирусов ВШМЯ и ХВК. Полученные библиотеки использованы для определения первичной структуры и выяснения  организации геномов этих вирусов, демонстрируя, что клонирование различных гетерологичных генов  в составе векторных молекул, введенных в клетки бактерий, позволяют достаточно просто расшифровать структуру этих генов. С использованием систем клонирования в клетках  Bacillus subtilis разработана система функциональной селекции рибозимов.

Однако, в отличие от бактериальных клеток, дрожжи, например, способны осуществлять некоторые  характерные для эукариот этапы пост-трансляционной модификации и сборки белка, что позволяет получать в дрожжевой клетке  чужеродный белок с посттрансляционными модификациями, близкими или идентичными его нативной форме. Поэтому  дрожжевые системы экспрессии стали играть важную роль в получении гетерологичных белков.

3. Создание новых векторных конструкций, содержащих делеционные варианты

промотора кислой фосфатазы PHO5, для экспрессии и секреции репортерных генов в клетках дрожжей S. cerevisiae. 

  Для решения задачи получения различных белков методами генетической инженерии создан набор дрожжевых векторов, содержащих регулируемый промотор гена кислой фосфатазы  PHO5  S. cerevisiae и нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды секретируемых белков.  Эти векторы применены для получения штаммов дрожжей, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В и гормон роста человека.

Для создания новых векторных конструкций, содержащих  регуляторные области гена PHO5  S. cerevisiae выполнены следующие этапы.

  3.1.  Получение набора фрагментов, содержащих регуляторные элементы транскрипции гена репрессибельной кислой фосфатазы дрожжей, кодируемой геном PHO5.  

Серию плазмид, содержащих делеционные варианты промотора PHO5, получали путем обработки нуклеазой Bal31 фрагмента ДНК из плазмиды pBR322/PHO3-PHO5/HIS3, несущей полный ген PHO5, и последующего субклонирования. Анализ первичной структуры плазмидных ДНК в полученных клонах показал, что точки делеций располагаются между стартом транскрипции и ATG-кодоном, а также в пределах области, кодирующей сигнальный пептид кислой фосфатазы (Рис. 3).  В качестве терминатора транскрипции использовали фрагмент из 3’-концевой области гена  кислой фосфатазы, клонированный в векторе pUC8. Плазмиды, содержащие кассету  экспрессии,  включающие  промотор и терминатор PHO5,  вводили в челночный вектор дрожжей YEp13 (Рис.4).

Рис.3. Делеционные варианты промотора PHO5: стрелками указаны положения синтетических

линкеров, присоединенных к 3’- концам делеций; положения оновных и минорных точек

инициации транскрипции, сайта отщепления сигнального пептида приведены в соответствии с

  данными Хиннена и др.[181]

  Рис. 4.  Схема конструирования плазмиды, содержащей регуляторные области гена кислой

фосфатазы PHO5 S. cerevisiae.

  3.2.1.  Варианты промотора (-36, -31,  -18, -12), отличающиеся по положению линкера по отношению к инициаторному кодону кислой фосфатазы использовали для конструкции плазмид, содержащих различную структуру 5’-нетранслируемой области мРНК гена HBsAg, что позволило исследовать влияние этого участка на уровень синтеза HBs-белка в дрожжах. Уровень экспрессии HBsAg под контролем сконструированных плазмид YEpPHO5(-36)/HBs,  YEpPHO5(-31)/HBs, YEpPHO5(-18)/HBs, YEpPHO5(-12)/HBs  различается боле чем на порядок. Максимальный синтез обеспечивает плазмида YEpPHO5(-12)/HBs, в которой структура 5’-нетранслируемой области наиболее близка к соответствующей последовательности в гене PHO5.[182].

3.2.2.  Дделеционные варианты промотора гена PHO5 (-12, -31, +54 ) использовали  для изучения влияния лидерного пептида кислой фосфатазы, а также различных условий культивирования дрожжевых клеток на синтез гормона роста (ГР) человека, а также для изучения характера внутриклеточного распределения и экспорта гетерологичного для дрожжевой клетки белка гормона роста в зависимости от природы сигнальной последовательности. Для этого были сконструированы плазмиды, обеспечивающие синтез ГР в зрелой форме, в форме предшественника с собственной сигнальной последовательностью, с сигнальной последовательностью дрожжевой кислой фосфатазы.

Результаты исследования  экспрессии ГР в дрожжах показали, что при использовании промотора PHO5 наиболее эффективно экспрессирется ген ГР, не содержащий  последовательности  сигнального пептида. Исследование субклеточного фракционирования секретируемого гена ГР в дрожжах показало, что при использовании промотора PHO5 наблюдается  максимальный уровень зрелого ГР, при этом 90% гормона содержится  в цитозоле. Добавление собственной СП или СП дрожжевой кислой фосфатазы приводило к значительному снижению уровня экспрессии, при этом продукты синтеза ГР в основном локализовались в периплазме и вакуолях. Показано, что СП обеспечивает не только вхождение белка в секреторный поток, но и предопределяет его конечную локализацию. Это открывает возможность экспериментально управляемой «посылки»  белков в различные внутриклеточные компартменты и за пределы клетки -  в окружающую среду [183]. Таким образом,  разработанная и предложенная векторная систьема дрожжей может быть использована  для секреции гетерологичных белков в клетках S. cerevisiae. Дрожжи, у которых основные черты секреторного процесса схожи с таковыми у высших эукариот, могут быть использованы в качестве промышленных продуцентов рекомбинантных белков млекопитающих.

4. Роль серотониновой системы в реакции различных типов клеток на стрессорные  сигналы.

  Накопленные  доказательства общности основных биохимических  процессов и регуляторных систем в животной и растительной клетках указывают на существование похожих клеточных механизмов передачи сигналов.  Для сравнения систем передачи сигнала в растительных и животных клетках исследована роль серотониновой системы в реакции различных клеток на стрессорные сигналы. Для изучения реакции клеток растений и ооцитов Xenopus laevis  на стрессорный сигнал, активированный  взаимодействием серотонинового рецептора с серотонином,  мы использовали рекомбинантный рецептор серотонина 5HT1c мозга мыши.

  4.1.  На основе растительных векторов экспрессии TMV pC-GC2 и pMGd2 были сконструированы рекомбинантные ДНК, содержащие ген серотонинового рецептора  5HT1c мыши в векторе TMV pС-GC2: pGC-SER-1 и  pGC-SER-2 и в агро-векторе pMGd2: pMGd2-SER, способные направлять  в клетках растений синтез белкового продукта серотонинового рецептора мыши, слитого с зеленым или красным флуоресцентным белком (Рис. 5).

  Рис.  5.  Схематическое изображение рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих ген серотонинового  рецептора  5HT1c мыши а - pGC-SER-1; б- pGC-SER-2; в- pMGd2-SER. 

  4.2.  Экспрессию и активность  рецептора серотонина проверяли в составе гибридных молекул. 

  1) Для этого мРНК гибридных белков, полученные  в системе транскрипции in vitro, инъецировали в ооциты Xenopus laevis и провели  электрофизиологический анализ экспрессии и функционирования гибридного белка и связанных с ним ионных каналов. Оказалось, что флуоресцентный белок встраивается в мембрану и что рецептор серотонина  в составе гибрида активен. Электрофизиологические показатели регистрировали при  помощи электронной аппаратуры с использованием метода «пэтч-кламп». Синтезированный в ооцитах рецептор 5HT1c, связываясь с гормоном  5HT, стимулировал Ca2+-  зависимый Cl- -  ионный канал, открывая поток ионов Cl- и изменяя при этом проводимость канала.

2) продукты транскрипции in vitro инокулировали  в  листья табака, после чего в них

наблюдалась флуоресценция, демонстрируя  экспрессию сконструированных гибридных генов в клетках растений  (Рис.6).

  Рис.  6. Флуоресценция гибридных генов (5HT1c-GFP in pGC-SER-1), экспрессирующихся в 

  листьях табака  после инокуляции продуктов транскрипции in vitro.

  Совокупность полученных предварительных  данных позволяет предположить, что в клеточном ответе на 5HT рецептор  серотонина 5HT1c мозга мыши  связывается с гормоном и, при участии GTP-связывающего белка, активирует фосфолипазу С, инициируя ионный поток  кальция в клетке.

4.3.  Клонирование и экспрессию  кДНК гена серотонинового рецептора мыши в клетках насекомых проводили  с использованием бакуловирусной системы экспрессии, которая позволяет синтезировать белковый продукт в количествах, достаточных  для электрофизиологических исследований при изучении функционирования ионных каналов. С помощью сконструированной рекомбинантной бакмидной ДНК ген рецептора серотонина 5HT1c переносили в геном  вируса ядерного полиэдроза калифорнийской совки AcMNPV с образованием рекомбинантного бакуловируса, что обеспечивало заражение  клеток насекомых Sf9 и продукцию рекомбинантного серотонинового рецептора (Рис.7).

Рис.  7.  Характеристика рекомбинантного белка рецептора серотонина 5HT1c в инфицированных клетках насекомых Sf9. Электрофоретическое разделение в 12% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия; 1- клетки, инфицированные  вирусом дикого типа AcNPV; 2- клетки, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом; 3- выделенный и очищенный на Ni-NTA смоле рецепторный белок из клеток, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом; 4- маркерные белки.

  1. Экспрессия генов хорионического гонадотропного гормона человека и рецептора CD4  в клетках насекомых, с использованием бакуловирусной системы экспрессии.

  Для обеспечения  синтеза белков, структурно и функционально близких к своим природным аналогам, применяют перенос и экспрессию трансгенов в клетках эукариот in vitro и in vivo.  С этой целью нами использованы бакуловирусы в качестве экспрессирующих векторов и разработаны на их основе экспрессирующие системы в клетках насекомых и млекопитающих.

5.1. Сконструированы плазмиды на основе бакуловирусных векторов, содержащие кДНК альфа- и бета-субъединиц хориогонадотропина (ХГ) человека и рецептора CD4, под контролем промотора гена полиэдрина вируса ядерного полиэдроза (AcMNPV) (Рис.8).

Рис.8. Схематическое изображение рекомбинантных бакуловирусных векторов pAcYM()-CG и  pAcYMCD4, несущих  гены альфа- или бета-субъединиц ХГЧ и рецептора CD4.

5.2. Получены рекомбинантные вирусы и линии клеток насекомых , синтезирующие иммунологически активные белки  альфа-ХГ, бета-ХГ и рецептор CD4. Для очистки рекомбинантных  вирусов проведено три цикла их клонирования при помощи метода бляшкообразования (Plaque hybridization). Результаты иммунодетекции полученных белков с антителами к альфа-ХГ, бета-ХГ и CD4 - рецептору  ВИЧ-1  представлены на (Рис.9).

Рис.  9. Иммунодот белков, синтезируемых рекомбинантными бакуловирусами; а - bv-CG(-субьединица ХГЧ (А) и bv-CG(- субъединица ХГЧ (Б), стрелками обозначены 1-белки из неинфицироанных клеток Sf9, 2- белки из клеток Sf9, инфицированных диким вирусом AcNPV, 3-очищенный ХГЧ; б - bv-CD4(CD4 - рецептор ВИЧ-1), стрелкой 1 обозначены белки из неинфицироанных клеток Sf9, стрелкой 2- белки из клеток Sf9, инфицированных диким вирусом AcNPV. 

5.3. Отработана оптимальная схема препаративного выращивания клеток насекомых для получения рекомбинантных белков. При разработке условий трансфекции культуры клеток Sf9 и роллерного культивирования инфицированных клеток для получения большого количества бакулолвирусов нами была усовершенствована система получения рекомбинантного вируса ядерного полиэдроза (ВЯП). Данная система предусматривает использование структурного гена -галактозидазы E. coli под контролем промотора гена  полиэдрина ВЯП калифорнийской совки AcMNPV в плазмиде pAc360 -gal в качестве маркера при отборе гибридных вирусов. Из культуральной жидкости выделяли вирус, очищали и использовали для выделения инфекционной ДНК. Из 1 л  культуральной жидкости выделяли в среднем 70-100 мг очищенного вируса и 300-500 мкг вирусной ДНК. Из 200 мл клеточной культуры с помощью лизиса клеток получали около 200 мкг суммарной ДНК, из них 50 мкг –вирусной. Выделенная вирусная ДНК не теряла активности при хранении в течение 5 месяцев при 40С.При длительном хранении в замороженном состоянии при -200С за год активность препарата снижалась в 2 раза.

6.  Оптимизация бакуловирусной системы доставки и экспрессии генов в клетках  насекомых.

В этой части работы нами  предложен новый набор векторов экспрессии на основе бакуловирусов насекомых, позволяющий экспрессировать одновременно несколько генов в одной инфицированной клетке насекомого и получать мультимерные белки.

6.1. Проклонированы EcoRI   S- J- и P-фрагменты геномной ДНК вируса ядерного полиэдроза (AcMNPV), содержащие гены поздних вирусных белков  p35, p39 и p10.   J–фрагмент длиной 6.66 т.п.н., содержащий ген вирусного белка  p39 и S–фрагмент длиной 1.38 т.п.н., содержащий  ген белка  p35 клонировали  в бактериальной плазмиде  pUC18, а  P-фрагмент длиной 1.9 т.п.н., содержащий  ген позднего вирусного белка p10 –  в плазмиде pUC118 (Рис.10).

Рис.  10. Схема получения плазмид, содержащих EcoRI-фрагменты  геномной ДНК AcNPV. А – 

  EcoRI-фрагменты AcNPV, буквами I – B обозначены полученные фрагменты; Б - новые 

  плазмидные ДНК: pUC18S содержит S-фрагмент;  pUC118P содержит  P-фрагмент и  pUC18J несет

  J-фрагмент AcMNPV.

  6.2. Субклонированы полученные промоторные фрагменты генов p35, p39, p10 и ph геномной  ДНК вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) (Рис.11).

Рис. 11. Схематическое изображение плазмид, содержащих промоторы генов белков вируса ядерного полиэдроза: а - p39, б и в - p10, в -полиэдрина ; ген устойчивости к ампициллину; фрагменты плазмид pUC, включающие  участок  ori; f1 ori, lacZ промотор; единичные рестриктазные сайты.

6.3.  Получены новые двух- и трех-промоторные векторы экспрессии pAcSG2pH, pAcSGpHp39, pAcSGpHp10,  pAcSG2pHp10 на основе бакуловирусов, с использованием субклонированных фрагментов геномной ДНК вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), содержащих промоторные последовательности генов вирусных белков P10, P35 и P39 и PH (Рис. 12).

  Рис. 12.  Схематическое изображение плазмидных конструкций производных  вектора pAcSG2, полученных в настоящей  работе. pH, p10, p39 –промоторы генов полиэдрина, p10, p39; GFP – репортерный ген, MCS – полилинкер. 

  Для экспрессии гетеродимера хориогонадотропина человека (ХГЧ) в клетках насекомых с использованием  полученных нами векторных плазмид на основе бакуловирусного вектора pAcYM1сконструирована рекомбинантная плазмида pAcYMCG (10670 т.п.н.) с генами - и  - ХГЧ под контролем независимых промоторов pH и p10 (Рис.13).

  Рис.13. Схематическое изображение рекомбинантной плазмиды pAcYMCG с генами двух субъединиц хориогонадотропина человека под контролем промоторов pH и p10.

  Таким образом, проклонированы фрагменты ДНК вируса ядерного полиэдроза, содержащие гены белков p10, p39, p35, а также их промоторные фрагменты, амплифицированные с помощью полимеразной цепной реакции; создан набор новых мультипромоторных  векторов экспрессии для клеток  насекомых, содержащих промоторы поздних генов  вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), на основе плазмидной ДНК  pAcSG2 и получена конструкция, несущая кДНК обеих субъединиц ХГЧ под контролем независимых промоторов p10 и pН, для последующего создания линий  клеток насекомых,  синтезирующих  гетеродимеры ХГЧ. 

7. Экспрессия гена стероид-21-гидроксилазы человека и ее мутантного  варианта  С169R в клетках насекомых. Функциональный анализ продуктов экспрессии.

Стероид-21-гидроксилаза – ключевой фермент биосинтеза глюкокортикоидных  и минералокортикоидных гормонов в коре надпочечников – относится к семейству  микросомных цитохромов P450. Дефицит этого фермента  является наиболее частой причиной адреногенитального синдрома у человека. Нами впервые в клетках насекомых Sf9 и  Hi5, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами, синтезированы стероид-21-гидроксилаза (CYP21A2) человека и ее мутантный вариант (С169R), обнаруженный ранее у больной с классической формой адреногенитального синдрома; изучено влияние мутации на активность фермента в этой системе.

7.1.  Для получения функционально активной стероид 21-гидроксилазы, локализованной в мембране эндоплазматического ретикулума клеток насекомых, использовали  бакуловирусный вектор рFastBacHTa, модифицированный путем делеции последовательности, которая  кодирует шесть остатков гистидина, надстраивающихся к N-концу экспрессируемого рекомбинантного белка. Схема получения рекомбинантного бакуловирусного вектора с открытыми рамками считывания CYP21A2 и CYP21A2-С169R представлена на  (Рис. 14).

Рис.  14. Схема получения рекомбинантного бакуловирусного вектора с открытыми рамками считывания CYP21A2 и CYP21A2-С169R. кДНК гена CYP21A2 показана черной стрелкой, кДНК гена CYP21A2-С169R - серой стрелкой, промотор Ррh гена полиэдрина - темной стрелкой, MCS представлен  в виде белого прямоугольника, сайт полиаденилирования SV40pA и ген устойчивости к гентамицину – в виде черных прямоугольников, сайты для транспозиции в геном AcNPV Tn7L и Tn7R – в виде серых прямоугольников, ген устойчивости к ампициллину и фрагменты плазмид pUC, включающие участки начала репликации ColE1 и фага f1 (ori) показаны белыми прямоугольниками. Отмечены единичные рестриктные сайты и сайты инициации трансляции ATG.

7.2.   На основе  вектора рFastBacHTa получены бакуловирусы bv-CYP21А2 и bv-CYP21А2 C169R и линии клеток насекомых, синтезирующие функционально активную стероид 21-гидроксилазу и ее мутантный вариант.  Оптимальные условия синтеза CYP21A2 подбирали по результатам иммуноблотинга.  Синтезируемые белки, выявленные Вестерн-блот-анализом  в лизатах и микросомных препаратах  инфицированных рекомбинантными бакуловирусами клеток насекомых, были обнаружены  в виде единственной полосы на уровне 55 кДа, что соответствует молекулярной массе CYP21A2. Идентификация СYP21A2 дикого типа и СYP21A2-C169R в микросомной фракции клеток свидетельствует о встраивании рекомбинантных белков в мембраны эндоплазматической сети клеток насекомых.

Рис.  15. Иммуноблоттинг белков а - клеточных лизатов и б, в - микросом  из клеток Sf9 и Hi5,

экспрессирующих гены СYP21A2 и СYP21A2-C169R. а – Влияние множественности

заражения на продукцию CYP21A2 в клетках Sf9 ( 1- 6 - лизаты клеток при множественности заражения вирусом 0,1, 1, 2, 3, 4 и 8;  7 – лизат ложноинфицированных клеток.) б – Сравнение содержания CYP21A2 в микросомах из клеток Sf9 и Hi5, выращенных в среде , с добавлением 3мкг/мл гемина.  в – Сравнение содержания CYP21A2 и СYP21A2-C169R в микросомах из клеток Hi5. 

 

Как следует из результатов иммуноблотинга, CYP21A2-C169R синтезируется  столь же эффективно и так же встраивается в мембрану эндоплазматической сети, как СYP21A2 дикого типа (Рис.15 в).  Таким образом, мутация C169R не влияет на эффективность синтеза CYP21A2 в клетках насекомых и не препятствует встраиванию фермента в мембраны эндоплазматической  сети. Уровень синтеза рекомбинантной 21-гидроксилазы в клетках Hi5 значительно превышает показатели, достигнутые в системах экспрессии на основе клеток млекопитающих и дрожжей. 

Т.о. предложены условия эффективной продукции (28% от суммарного белка микросом) функционально-активной 21-гидроксилазы в линии клеток Hi5, что делает возможным получение рекомбинантного белка для функционального анализа, а также для его кристаллизации.

7.3 Ферментативную активность  CYP21A2 и CYP21A2-C169R в препаратах микросом из клеток Hi5  определяли по отношению к двум субстратам – 17OHпрогестерону (17OHП) и прогестерону (Рис.19). Известно, что содержание NADPH-P450-оксиредуктазы (CYPOR) в клетках насекомых недостаточно для поддержания активности рекомбинантных цитохромов P450. Для компенсации недостатка СYPOR  к микросомным частицам из клеток Hi5, синтезирующих 21-гидроксилазу, добавляли СYPOR кролика в молярном соотношении CYP21A2 : СYPOR = 1 : 1, что приводит к увеличению активности по превращению 17-ОНпрогестерона в 11-дезоксикортизол и активности  реакции превращения прогестерона в дезоксикортикостерон в этих условиях (см. подпись к рис.16) .

Рис.  16.  Ферментативная активность СYP21A2 в микросомах из клеток Hi5. Относительная активность представлена как отношение радиоактивности продукта к суммарной радиоактивности субстрата и продукта. Используемая концентрация субстратов 0.01 мкМ. Показаны средние значения ± стандартное отклонение, n  – число экспериментов. Заштрихованные столбцы показывают значения активности в микросомных препаратах, серые - в микросомных препаратах, к которым добавлена НАДФ.Н-Р450-оксидоредуктазы кролика; а - Относительная активность СYP21A2 по отношению к 17-ОНпрогестерону; б - Относительная активность СYP21A2 по отношению к прогестерону.

Активность по отношению к 17OHпрогестерону составила  10.45±0.8 пмоль/мг микросомного белка в мин, а активность к прогестерону составила 1.43±1.05  пмоль/мг микросомного белка в мин. Мутантный вариант C169R оказался полностью неактивным  в отношении обоих субстратов. Данные по измерению каталитической активности СYP21A2 и мутантного фермента в системе in vitro с добавлением НАДФН-Р450-оксидоредуктазы кролика свидетельствуют о практически полном отсутствии каталитической активности мутантного белка по отношению к двум субстратам СYP21A2 – прогестерону и 17- гидроксипрогестерону, что согласуется с данными, полученными на клетках COS-7.

  Наши результаты позволяют считать экспрессию в бакуловирусной системе удобным способом синтеза  CYP21A2 с большим выходом, что очень важно для функционального анализа мутаций. Данные о влиянии мутаций на свойства 21-гидроксилазы in vitro могут иметь важное значение для  прогнозирования тяжести заболевания в случае их выявления у детей  при молекулярно-генетической диагностике в неонатальном периоде.

8. Бакуловирусные векторы для эффективной доставки и экспрессии генов в  клетках млекопитающих.

Конструирование векторов для переноса экзогенных ДНК в клетки млекопитающих является актуальным направлением современной молекулярной биологии.  Успешное применение бакуловирусной векторной системы в качестве эффективного метода доставки генетической информации  в клетки эукариот in vitro открывает возможности ее использования  для доставки генов  in vivo.

  Для направленной доставки и экспрессии клонированных генов в культивируемых клетках млекопитающих HEK293, COS-7 и Huh7 нами использован модифицированный бакуловирус AcMNPV, получивший название BacMam-вирус. Он содержит экспрессионную кассету с промотором цитомегаловируса и репортерным геном зеленого или  цианового флуоресцентного белка. Сконструированы бакуловирусные векторы  с экспрессирующими кассетами под контролем промотора CMV, содержащие репортерные гены GFP или  Luc, сайт полиаденилирования вируса SV40 (SV40pA) и полилинкер (MCS). В качестве исходной плазмиды использовали  бакуловирусный вектор pFastBacHTa (Рис.17).

Рис. 17. Схематическое изображение рекомбинантных бакуловирусных векторов Bac-CMV-GFP. а – Бакуловирусный трансфер-вектор pFastBacMam1GFP; б –Бакуловирусный трансфер-вектор pFastBacMam2GFP; в –  Бакуловирусный трансфер-вектор pFastBacMam3GFP; г  – бакуловирусный  трансфер-вектор pFastBacMamLuc, содержащий репортерный ген люциферазы;  PCMV  - промотор CMV;  SV40pA – сигнал полиаденилирования; pUCori и f1ori – ori-репликации pUC и f1 соответственно; Amp и Gm – гены устойчивости соответственно к ампициллину и гентамицину; Tn7R и Tn7L – элементы транспозона Tn7.

8.1.  Для получения pFastBacMam1GFP в  исходную плазмидную ДНК  pFastBacHTa по сайтам  SnaBI и NotI встраивали промотор CMV-IE с GFP-геном, полученным из плазмиды pcDNA3.1GFP, предварительно удалив бакуловирусный полиэдриновый промотор.

  8.2. Для конструирования pFastBacMam2GFP фрагмент ДНК с промотором цитомегаловируса  клонировали в бакуловирусном векторе pFastBacHTa по сайтам SnaBI и NotI, с образованием  промежуточнуой формы  pFastBacHT- CMV.  В полученную плазмидную ДНК встраивали фрагмент, содержащий участок кДНК модифицированного гена  CFP (кодирующего циановый флуоресцирующий белок),  полученный из плазмидного вектора  pMGd2.

  8.3. Трансфер-вектор pFastBacMam3GFP конструировали в два этапа. Первый этап заключался в получении промежуточной плазмидной ДНК, содержащей промотор CMV, полилинкер MCS и EGFP на основе  плазмиды pcDNA3.1. На втором этапе после рестрикции промежуточной плазмидной ДНК рестриктазами NruI и NotI  фрагмент,  содержащий NruI-(CMV – MCS – EGFP)-NotI, клонировали в бакуловирусном векторе pFastBacHTa по сайтам  SnaBI – NotI. 

  8.4.  Эффективность экспрессии флуоресцентных  белков оценивали непосредственно в клетках COS-7, Huh7 и HEK293, трансфицированных полученными конструктами. После трансфекции клетки инкубировали в течение 48 ч в среде DMEM, обогащенной глютамином и содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка и антибиотики. Флуоресценцию GFP выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа и проточной цитофлуориметрии (Рис.18,19).

Рис.  18.  GFP-специфическая флуоресценция в клетках млекопитающих; а – Клетки COS-7, трансфицированные плазмидной ДНК pFastBacMam1GFP; б – Клетки COS-7, трансфицированные плазмидной ДНК pFastBacMam3GFP; в – Клетки HEK-293, трансфицированные плазмидной ДНК pFastBacMam2CFP.

Рис. 19.  Анализ флуоресценции зеленого белка GFP  в клетках HEK293 методом проточной флуориметрии (А) и флуоресцентной микроскопии (Б). На гистограммах и фотографиях представлены клетки Hek293, нетрансдуцированные (а), трансдуцированные рекомбинантным вектором bv- FastBacMam1GFP (б) или bv-FastBacMam-Е1Е2GFP (в).  На гистограммах по оси абсцисс указан линейный размер анализируемых частиц (клеток) в относительных значениях , по оси ординат – относительное значение интенсивности флуоресценции (Iфл)).

8.5.  Новый трансфер-вектор pFastBacMamLuc  с экспрессирующей кассетой под контролем промотора CMV, содержащей репортерный ген люциферазы, сигнал полиаденилирования (SV40pA) и полилинкер (MCS), конструировали с использованием  в качестве исходной плазмиды бакуловирусный вектор pFastBacHTa. При конструировании pFastBacMamLuc, фрагмент ДНК NruI – BamHI с промотором CMV, полученный в результате обработки pcDNA3.1 рестриктазами NruI и BamHI, клонировали в бакуловирусном векторе pFastBacHTa по сайтам SnaBI и BamHI с образованием промежуточной плазмиды pFastBacHT-CMV. Ген

Luc  из плазмиды pGL- 3 Basic Vector, предварительно встраивали по сайтам XhoI и XbaI в плазмиду pcDNA 3.1, затем по сайтам NotI и XbaI в pFastBacHTa. В новом трансфер-векторе два полилинкера, расположенные до и после репортерного гена люциферазы, предназначены для клонирования целевого гена под контролем промотора CMV.

8.6.  Эффективность экспрессии люциферазы оценивали непосредственно в клетках HEK293, трансфицированных полученной конструкцией, используя Luciferase Assay System.

Табл. 1. Эффективность экспрессии люциферазы в клетках HEK293

Образец

Величина люминесценции

HEK 293

237.7

PCMVHTaLuc.1

114269.0

PCMVHTaLuc.2

90933.5

Лизирующий буфер

42.0

Таким образом, созданные рекомбинантные бакуловирусные векторы pFastBacMamGFP, содержащие экспрессионную кассету с промотором CMV и репортерным геном флуоресцентных белков GFP и CFP, и  pFastBacMamLuc с  репортерным геном люциферазы пригодны  и эффективны для направленной доставки и экспрессии клонированных генов в культивируемых клетках млекопитающих.

  9. Изучение морфогенеза вируса гепатита С человека, с использованием в  качестве

модели вирусподобных частиц ВГС, образующихся в трансгенных клетках насекомых и млекопитающих. 

Геном вируса гепатита С (ВГС) представляет собой одноцепочечную полноразмерную РНК длиной 9.6 тысяч оснований. После трансляции с единственной рамки считывания, образующийся полипротеин подвергается процессингу с образованием 10 зрелых структурных (core, Е1, Е2 и р7) и неструктурных (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B) белков ВГС. Три структурных белка – кор-белок С (core protein) и гликопротеины оболочки Е1 и Е2 являются основными компонентами вириона вируса гепатита С; неструктурные белки не обнаружены в вирионе, но  участвуют в вирусной  репликации.

  Морфологические свойства ВГС, определяющие природу вириона, зависят от морфологических свойств структурных белков, способа их укладки, упаковки, белок-белковых взаимодействий. Процесс сборки вирусной частицы, роль структурных белков в морфогенезе вируса до сих пор во многом остаются неясными. Изучение взаимодействий между оболочечными белками ВГС, их пост-трансляционных модификаций и формирования вирусных частиц позволяет исследовать роль структурных белков ВГС в морфогенезе вируса. Оболочечные гликопротеины gpE1 и gpE2 могут либо димеризоваться (при нековалентном взаимодействии в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) с образованием функциональных, предшествующих почкованию, комплексов),  либо образовывать,  связанные  дисульфидными мостиками агрегаты, содержащие неправильно свернутые нефункциональные гликопротеины.  В образовании комплексов обоих типов участвуют два хозяйских белка-шаперона. Калнексин взаимодействует с гликопротеинами, участвующими в образовании функциональных комплексов, в то время как калретикулин взаимодействует с неверно упакованными гликопротеинами, образующими агрегаты.

9.1.  Синтез структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы экспрессии и их характеристика.

  Экспрессия трех структурных белков C, E1 и E2 ВГС в клетках насекомых сопровождается образованием вирусоподобных частиц и может служить основой модельной системы морфогенеза ВГС. Такая модельная система использована нами  для изучения влияния гликозилирования структурных белков ВГС на их димеризацию и сборку и для исследования действия новых синтетических ингибиторов – глюкозидаз на процесс сборки вирусных частиц.

Клетки насекомых Sf9, зараженные бакуловирусом, экспрессирующим структурные белки ВГС,

использованы для исследования  функциональных характеристик структурных вирусных белков, их взаимодействий  друг с другом,  изучения процессов сборки вирусных частиц.  Получение бакуловирусных конструкций, рекомбинантных бакуловирусов, синтез и анализ экспрессии рекомбинантных белков вируса гепатита С в клетках Sf9, анализ РНК ВГС проводили стандартными методами, описанными в инструкции Bac-to-Bac («Invitrogen»).

  9.1.1. Конструирование  и идентификация рекомбинантных бакуловирусов (Рис.20).

  Фрагменты ДНК, содержащие кДНК генов структурных белков ВГС – кор-белка (С), гликопротеинов E1 и E2, укороченного Е2660, а также последовательностей CE1, Е1Е2 и CE1E2, амплифицировали с помощью ПЦР, используя плазмидную ДНК pHCV-21, содержащую последовательность генома ВГС (генотип 1б).  Полученные ПЦР-фрагменты клонировали в бакуловирусных плазмидах pFastBacHTb и pFastBacHTc. Размер клонированной к ДНК в составе рекомбинантных плазмидных ДНК определяли с помощью рестрикционного и ПЦР-анализа.

Рис. 20. Схематическое изображение плазмидных конструкций на основе бакуловирусного вектора pFastBacHT, содержащих в полилинкерной последовательности кДНК генов структурных белков ВГС: C, Е1 и Е2. На схеме отмечены: PPH-промотор гена полиэдрина; заштрихованные области – cигнальные последовательности гликопротеинов Е1 и Е2; SV40 pA – поли(А)- последовательность вируса SV40.

Затем,  в результате сайт-специфического переноса целевых фрагментов ДНК в бакуловирусный шаттл-вектор, получали рекомбинантные бакмиды в клетках E. coli DH10Bac. После трансфекции клеток насекомых линии Sf9 этими бакмидными ДНК отбирали  рекомбинантные бакуловирусы bv-C, bv-CE1, bv-E1, bv-E1Е2, bv-E2660, bv-CE1E2 и bv-C+E1+E2660.

      1. Экспрессия и взаимодействие структурных белков ВГС в клетках насекомых. 

  Поскольку уровень синтеза рекомбинантных белков в клетках Sf9 зависит от длительности инфекции (24–96 ч) и множественности заражения клеток рекомбинантным бакуловирусом (1–10 БОЕ/кл), оптимальные условия получения структурных белков ВГС подбирали, контролируя титр вируса методом бляшкообразования. Клетки насекомых заражали рекомбинантными бакуловирусами при множественности заражения 3–5 БОЕ/кл. Количество синтезируемых в клетках насекомых структурных белков ВГС значительно увеличивается  на третий–четвертый день после заражения клеток бакуловирусом (5х108 БОЕ/мл).  Электрофоретический анализ лизатов зараженных клеток насекомых, синтезирующих рекомбинантные струтурные белки вируса гепатита С, проводили в 12% ПААГ с SDS. Подвижность структурных белков ВГС соответствует белкам с Mr 21 кДа и 23 кДа (белок С), 35 кДа (белок Е1), 66 кДа (белок Е2) и 57 кДа (укороченный Е2). Кроме того, в области 55 кДа видна полоса, которая может соответствовать гетеродимеру СЕ1 (Рис.21).

Рис. 21. Анализ экспрессии структурных белков C, E1 и E2 ВГС в клетках насекомых Sf9. Электрофореграммы лизатов клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами: 1 – bv–Е1Е2; 2 – bv–Е1; 3 – bv–СЕ1; 4 – bv–Е2; 5 – bv–СЕ1Е2; 6 – bv–С +Е1+Е2; 7 – bv–CAT/Gus в 12% ПААГ с SDS.

  Взаимодействие между структурными белками ВГС исследовали, заражая клетки насекомых рекомбинантными бакуловирусами bv-CE1E2 и bv-E1E2.Лизаты клеток ультрацентрифугировали  и выделенные комплексы соосаждали с антителами против белков ВГС. Вестерн-блот анализ иммуноосажденных белков с анти-E1 и анти-E2 выявил белки С, Е1, Е2 и Е1Е2 в лизатах клеток, зараженных соответствующими вирусами (Рис.22).

Рис.  22.  Анализ экспрессии структурных белков C, E1 и E2 ВГС в клетках насекомых Sf9. Иммуноблоттинг белков, осажденных из лизата клеток,  зараженных бакуловирусами bv-CE1E2 (1, 5), bv–E1E2 (2) и bv-CAT/Gus (3, 4),  сывороткой против белков ВГС, с антителами к белку: а – Е1; б– Е2. М – маркеры молекулярной массы белков, кДа.  

  Результаты показали, что, во-первых, уровень синтеза белков составляет 25% - 35% от суммарного  белка; во-вторых, что структурные белки образуют между собой комплексы CoreЕ1, Е1Е2, CoreЕ1Е2.  Белок Core  взаимодействует с белком Е1 и с димером Е1Е2, образуя комплексы СЕ1 и СЕ1Е2,  экспрессируется с большей эффективностью в присутствии белков Е1 и Е2, мигрирует в геле в виде двух полос с разной молекулярной массой  21 кДа и 23 кДа, причем  преобладает белок с массой – 21 кДа;  Белок Е1 взаимодействует с белками Core и Е2, образуя комплексы СЕ1, СЕ1Е2 и Е1Е2, и в комплексах экспрессируется с низкой эффективностью;  Белок Е2  взаимодействует с белками Е1 и дуплексом СЕ1 образуя комплексы Е1Е2 и СЕ1Е2, не взаимодействует с белком Core и экспрессируется с высокой эффективностью. 

9.1.3. Образование и характеристика вирусоподобных частиц  вируса гепатита С.

  Известно, что в бакуловирусной системе экспрессии удается получать самособирающиеся, нереплицирующиеся частицы, сходные с интактными вирионами различных вирусов.  Мы использовали эту систему для получения вирусоподобных частиц (ВПЧ) вируса гепатита С, для чего, на основе бакуловирусного вектора pFastBacHTа сконструировали рекомбинантный бакуловирус bv-CE1E2 и использовали его для трансфекции клеток насекомых Sf9. Кроме бакмидной ДНК, содержащей кДНК с последовательностью генов CE1E2, проводили котрансфекцию клеток насекомых одновременно тремя бакмидными ДНК, содержащими кДНК генов структурных белков C, Е1 и Е2660 (бакуловирус bv-C+E1+E2). В лизатах зараженных клеток оценивали электрофоретическую подвижность продуктов экспрессии генов СЕ1Е2 и C+E1+E2 в 12% денатурирующем ПААГ  и анализировали экспрессию рекомбинантных ВПЧ в клетках насекомых Sf9, зараженных бакуловирусом bv-СЕ1Е2, используя Вестерн-блот-  анализ с сывороткой крови, содержащей антитела к белкам ВГС (Рис.23).

Рис.  23. Анализ экспрессии рекомбинантных ВПЧ гепатита С в клетках насекомых Sf9. А – Анализ экспрессии рекомбинантных ВПЧ в клетках насекомых Sf9, зараженных бакуловирусом bv-СЕ1Е2. а –Подвижность в денатурирующем 12 % ПААГ белков лизата клеток, зараженных бакуловирусами: 1 – bv-СЕ1Е2; 2 – bv-СAT/Gus;3 –дикого типа, б – Вестерн-блот анализ продуктов экспрессии генов структурных белков ВГС в клетках, зараженных рекомбинантными бакуловирусами bv-СЕ1Е2 (4, 7, 9) и bv-СAT/Gus (5, 6, 8), с анти-Е2 (4, 5), анти-Е1 (6, 7) и с сывороткой против ВГС (8, 9). Б – Вестерн-блот-анализ продуктов экспрессии генов структурных белков ВГС во фракциях микросом и ЭР - клеток, зараженных бакуловирусом bv-CE1E2, с анти-Е1 и анти-Е2 и с сывороткой против ВГС. М – маркеры молекулярной массы белков, кДа.

  Структурные белки С, Е1 и Е2 ВГС (рис. 23А) мигрируют  в геле в соответствии с их молекулярной массой: 21, 32-35 и 66-68 кДа. Электрофоретическая подвижность белков комплекса СЕ1Е2 ВГС и котрансфецированных C+E1+E2 не отличается.

  Вирусоподобные частицы (ВПЧ), очищенные двухстадийным ультрацентрифугированием, анализировали методами электронной микроскопии (Рис. 24Б). Клеточные микросомы, полученные из 6x107 клеток Sf9, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом bv-CE1E2, осаждали центрифугированием  и также анализировали с помощью электронной микроскопии (Рис.24А) и Вестерн-блотинга (Рис.23Б).

Рис.  24.  Электронная микроскопия препаратов микросом (А) и очищенных ВПЧ (Б). Препараты получены из клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами: 1 – bv-CAT/Gus; 2 – bv-CE1E2; 3 – bv-C+E1+E2 (котрансфекция).

  Предполагаемые ВПЧ наблюдали только в микросомах зараженных клеток, секретирования их в среду культивирования обнаружено не было.  Присутствие структурных белков ВГС во фракциях микросом и ЭР свидетельствует о том, что экспрессируемые в клетках насекомых рекомбинантные белки ВГС встраиваются в мембраны ЭР. Локализация поверхностных гликопротеинов ВГС (Е1 и Е2) в ЭР указывает на то, что присоединение нуклеокапсида к  оболочке ЭР происходит при миграции через мембрану ЭР. Предполагается, что гликопротеины Е1 и Е2 ВГС, задерживаясь в ЭР, формируют вирусную частицу.  Полученные результаты свидетельствуют о том, что внутри клетки насекомых in vitro происходит самосборка структурных белков вируса в ВПЧ без участия других компонентов ВГС, без  репликативного комплекса, 5`-нетранслируемой области мРНК генома и  вирусного белка p7.

  На основании полученных данных можно предположить, что формирование вирусных частиц, вероятнее всего, начинается с взаимодействия кор-белка С с синтезированной вирусной РНК. Однако, соответствует ли образующаяся структура вирусному нуклеокапсиду или она представляет собой относительно неспецифичный рибонуклеопротеидный комплекс, пока не понятно. Имеются данные о том, что полноразмерные кор-белки специфически взаимодействуют с вирусной РНК и склонны к олигомеризации. Полученные нами ВПЧ гепатита С содержат кор-частицы с капсидированной вирус-специфической РНК. В клетках, содержащих ВПЧ, кор-белок находится в мембране ЭР вместе с гликопротеинами Е1 и Е2; здесь же происходит N-гликозилирование последних, а затем и образованием ВПЧ.

  Хотя разработанная на сегодняшний день система репликации с использованием самореплицирующихся РНК позволяет получать полноразмерный полипротеин ВГС, частицы, морфологически подобные вирионам ВГС, в ней не образуются. Вот почему модель с использованием ВПЧ, экспрессируемых в клетках насекомых, остается пока одной из лучших для изучения различных стадий морфогенеза ВГС, а именно –  синтеза индивидуальных белков, конформационных изменений и взаимодействий между оболочечными белками, их пост-трансляционных модификаций и формирования частиц, морфологически подобных вирионам ВГС.

9.1.4.  Экспрессия структурных белков и  вирусоподобных частиц (ВПЧ) вируса гепатита С в клетках млекопитающих.  На основе плазмидного бакуловирусного вектора pFastBacMam1GFP созданы генетические конструкции, содержащие последовательности кДНК генов белка C, белков оболочки E1 и E2 ВГС: pFastBacMam-CGFP, pFastBacMam-E1E2GFP и pFastBacMam-CE1E2GFP (рис. 28), используемые для  доставки  и экспрессии структурных белков и вирусоподобных частиц ВГС в клетках млекопитающих.

Рис. 25.  Схематическое изображение плазмидных конструкций на основе бакуловирусного вектора pFastBacMam1GFP.

Фрагменты кДНК, содержащие гены белка C и слитых белков CЕ1Е2 (соответственно 575 и 2240 п.н.), получали с помощью ПЦР, используя плазмидную ДНК pHCV-21, в которую входит последовательность генома ВГС (генотип 1б, штамм 274933RU).

С использованием новых конструкций получены рекомбинантные бакуловирусы и стабильные клеточные линии млекопитающих HEK293 и Huh7, экспрессирующие вирусоподобные частицы  вируса гепатита С и структурные вирусные белки. Клонированные гены структурных белков ВГС вводили в клетки Hek293 и Huh7 с помощью трансдукции рекомбинантными бакуловирусами, полученными в клетках насекомых Sf9. Эффективность доставки экспрессирующих конструкций FastBacMam-Е1Е2GFP в клетки млекопитающих определяли иммуноблотингом структурных белков ВГС и белка GFP (Рис. 26), а также методом флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии (Рис.19). 

Рис. 26. Анализ экспрессии генов рекомбинантных структурных белков ВГС и белка GFP в клетках млекопитающих и насекомых. А - Вестерн-блот с антисывороткой к белкам ВГС, осажденных с антителами против белков Е2 (а), Е1 (б) или С (в) лизатов клеток млекопитающих Hek293, трансфицированных рекомбинантными плазмидными ДНК pFastBacMam-E1E2GFP (1), pFastBacMam-CE1E2GFP (2), pFastBacMam-СGFP (3), pFastBacMam1GFP (4).  Б – Вестерн-блот анализ с поликлональными антителами к белку С лизатов клеток Hek293, трансфицированных рекомбинантными плазмидами pFastBacMam1GFP (1) или pFastBacMam-CGFP (2), и в клетках насекомых линии Sf9, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами bv-C (3) или bv-CAT/Gus (4); В – электрофоретический анализ экспрессии гена зеленого флуоресцентного белка GFP в клетках Hek293, трансфицированных (а) рекомбинантными плазмидами pFastBacMam1GFP (1), pFastBacMam-E1E2GFP (2), pFastBacMam-CE1E2GFP (3), контроль (без трансфекции, 4) или трансдуцированных (б) рекомбинантными бакуловирусами bv-FastBacMam1GFP (1), bv-FastBacMam-E1E2GFP (2), bv-FastBacMam-CE1E2GFP (3), контроль (без трансдукции, 4).

Трансдукция клеток млекопитающих Hek293Т и Huh7 модифицированным бакуловирусом AcMNPV, несущим последовательности кДНК структурных генов ВГС, приводит к экспрессии клонированных генов полипротеина ВГС и их правильному процессингу с образованием продуктов генов структурных белков вируса. 

  9.2. Исследование посттрансляционного гликозилирования оболочечных белков ВГС.

Важным этапом морфогенеза вирусных частиц, предопределяющим правильную сборку вириона ВГС, является  гликозилирование структурных белков в зараженной клетке. Гликозилирование происходит в ЭР под действием олигосахаридтрансферазы, причем с белками взаимодействуют только олигосахариды с высоким содержанием маннозы. Наличие углеводных цепей в молекулах белков Е1 и Е2 ВГС определяет их третичную структуру, стабильность, антигенность и специфику взаимодействия с другими компонентами вириона. 

В зрелом вирионе гликопротеины Е1 и Е2 ВГС  высокогликозилированы и содержат 5–6 и 9–10 сайтов гликозилирования соответственно (рис.27).

Рис.  27.  Схема распределения сайтов гликозилирования в молекулах белков Е1 и Е2 ВГС.

Известно, что наличие или отсутствие N-гликанов у оболочечных белков вируса может влиять на структуру белков, их стабильность, специфичность действия, белок-белковые взаимодействия. В литературе обсуждается влияние гликозилирования на образование гликопротеинового комплекса, на сворачивание заякоренных в мембране гликопротеинов ВГС, однако, в целом, процесс сборки вирусной частицы остается малопонятным. Следует отметить, что до сих пор не известно точное число сайтов гликозилирования белка Е1, какие именно сайты гликозилирования  участвуют в модифицировании белка Е1 и все ли потенциальные сайты гликозилирования реализуются in vivo.

Для исследования  эффективности гликозилирования  гликопротеинов  ВГС, влияния гликанов на экспрессию и процессинг Е1 и Е2, на образование продуктивного комплекса гликопротеинов и на формирование вирусоподобных  частиц ВГС мы использовали бакуловирусную систему экспрессии в клетках насекомых и мутагенез N-связанных сайтов гликозилирования.

9.2.1.  Получены генетические конструкции, кодирующие 11  вариантов белка Е1, несущих мутации  в 7 сайтах  гликозилирования и обеспечивающие  экспрессию в клетках насекомых для исследования влияния индивидуальных углеводных цепей в составе белка Е1 на образование комплекса Е1Е2.

1-  Е1(N1)Е2, с мутацией в сайте N1;

2-  Е1(N5)Е2, с мутацией в сайте N5

3-  Е1(N1,5)Е2, с мутациями в сайтах N1 и N5;

4-  Е1(N2,3,4)Е2, с мутациями в сайтах N2, N3 и N4

5-  Е1(N2,3,4,5)Е2, с мутациями в сайтах N2, N3, N4 и N5;

6-  Е1(N1,2,3,5)Е2, с мутациями в сайтах N1,N2, N3 и N5;

7-  Е1(N1-5)Е2, с мутациями во всех сайтах  N1- N5;

8-  Е1(N5)Е2, с мутацией в сайте N5; 

9-  Е1(N6)Е2, с мутацией в сайте N6;

10-  Е1(N7)Е2, с мутацией в сайте N7;

11-  Е1Е2 без мутаций (W) 

  В данной работе применяли олигонуклеотид-направленный мутагенез непосредственно на «стандартных» двутяжевых плазмидных векторах, схема которого разработана и предложена В.Л. Друцей (МГУ). В результате была сконструирована серия рекомбинантных плазмид pBluescriptKS-E1, несущих кДНК белка Е1 с точечными заменами в сайтах гликозилирования N1 – N5 и двумя дополнительными сайтами гликозилирования N6 и N7, для чего синтезированы синтетические олигонуклеотидные праймеры,  содержащие последовательности, кодирующие сайты N-гликозилирования Asn-X-Thr/Ser (X Pro), в котором триплет, кодирующий Asn, замещен триплетом, кодирующим Gln.  Таким образом, был создан набор  Е1-гликозилированных мутантов,  в которых  выключены/включены или добавлены сайты гликозилирования для анализа N-гликозилирования оболочечного белка Е1 ВГС.

9.2.2.  В  плазмидном бакуловирусном векторе pFastBacHTа клонировали фрагменты ДНК, содержащие последовательность кДНК гена Е1 (E1mut) с мутациями в сайтах гликозилирования, а также кДНК, включающую последовательность генов E1mutE2.. Рекомбинантные конструкции использовали для получения бакмидных ДНК и трансфекции клеток насекомых для получения рекомбинантных бакуловирусов.

9.2.3. Экспрессию Е1-гликозилированных мутантов в клетках насекомых, а также эффективность гликозилирования белков Е1 с мутациями в потенциальных сайтах гликозилирования  анализировали с помощью иммуноблотинга (Рис. 28).

Рис. 28.  Вестерн-блот анализ продуктов экспрессии генов мутантных белков Е1 в комбинации с Е2 ВГС в клетках насекомых Sf9 с антителами к Е1 ВГС после предварительного иммуноосаждения с anti-E1. Клеточный лизат очищали центрифугированием через 30% сахарозную подушку. 1 – E1E2 дикий тип;

2 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N1; 3 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N5; 4 – E1mutE2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1 и N5; 5 – E1mutЕ2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4; 6 – E1mutE2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1, N2, N3 и N4; 7 – E1mutЕ2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4 и N5; 8 – E1mutE2 с мутацией во всех сайтах гликозилирования; WT- бакуловирус дикого типа.

Нарушение сайтов гликозилирования приводило, как и ожидалось,  к повышению электрофоретической подвижности гликопротеина Е1 в денатурирующем 12% ПААГ.

Обработка  мутантных гликопротеинов Е1 эндогликозидазой EndoH с последующим вестерн-блот анализом  показали, что синтезированные в клетках насекомых мутантные гликопротеины, как и природный белок, чувствительны к последней (Рис.29).

Рис. 29.  Вестерн-блот анализ экспресии мутантных белков Е1 в комбинации с Е2 ВГС в клетках насекомых Sf9 с антителами к Е2 ВГС. Клеточный лизат очищали центрифугированием через 30% сахарозную  подушку. 1 – E1mutE2 с дополнительным сайтом гликозилирования N6 в позиции 325 а.к;

2 – E1E2 дикий тип;  3 –  E1E2 дикий +EndoH;  4 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N1;

5 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N1+EndoH; 6 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N1+ Tunicamycin;  7 –  E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N5;

8 – E1mutE2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1 и N5; 9 – E1Е2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4;  10  – E1mutE2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1, N2, N3 и N4;

11 – E1Е2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4 и N5;  12 – E1mutE2 c мутацией в сайтах гликозилирования N1, N2, N3 и N5;  13 – E1mutE2 с мутацией во всех сайтах гликозилирования; WT- бакуловирус дикого типа.

  Анализ экспрессии  мутантных белков Е1 в комбинации с Е2 ВГС в клетках насекомых Sf9 подтвержден также иммунопреципитацией с антителами к калнексину и калретикулину.

Полученные результаты показали, во-первых, что мутантные белки Е1 экспрессируются в клетках насекомых; во-вторых,  нарушение сайтов гликозилирования  N2, N3, N4 в различных  комбинациях не влияет заметным образом на эффективность экспрессии гликопротеина Е1, но снижает эффективность формирования нековалентного продуктивного комплекса Е1Е2; в-третьих, что введение дополнительного сайта  гликозилирования N7 или нарушение сайта N4 в Е1 не влияет на характер гликозилирования белка и образование продуктивного гетеродимера Е1Е2; в-четвертых, чтоповреждение сайтов гликозилирования N1 или  N5 в белке  Е1 нарушает сборку продуктивного комплекса Е1Е2. В результате обнаружено, что отсутствие углеводных цепей в сайтах гликозилирования N1 и N5  влияет на образование  нековалентного комплекса Е1Е2 прототипа природного комплекса,  входящего в состав вириона ВГС.

Полученные нами результаты  показывают, что дальнейшее исследование N-гликозилирования оболочечных белков Е1, Е2  ВГС позволит уточнить  роль углеводных цепей в образовании комплекса Е1Е2 и его функционировании  в инфекционном цикле вируса.

  9.3. Исследование  влияния новых синтетических ингибиторов -глюкозидазы на

  процессинг  структурных белков вируса гепатита С и формирование вириона ВГС.

  Вирус гепатита С инфицирует более 3% населения во всем мире. В настоящее время нет оптимальных методов лечения и вакцины для профилактики этой инфекции. Уникальные особенности вируса гепатита С, такие как, большая изменчивость, высокая геномная вариабельность, способность к преодолению иммунного ответа, но, при этом, низкая эффективность репликации вируса в культуре клеток и отсутствие подходящих клеточных культур и животных моделей  затрудняют исследования  жизненного цикла и репликации вируса и сдерживают поиск ингибиторов инфекции. Воздействие на вирусный морфогенез может быть использовано в качестве альтернативного подхода  к существующим стратегиям блокирования вируса гепатита С.

  Во время  N-гликозилирования белка цепь N-гликанов гликопротеина претерпевает серию модификаций внутри  эндоплазматического  ретикулума  и аппарата Гольджи,  в которых участвуют -глюкозидаза и  -маннозидаза.  Производные иминосахаров, способные блокировать  действие -глюкозидазы  или  -маннозидазы, и, как следствие, нарушающие процесс внутриклеточного N-гликозилирования гликопротеинов,  могут нарушать правильное складывание и сборку вирусных оболочечных белков, блокируя вирусный морфогенез и, в результате, снижать инфекционность вируса. Такие соединения могут быть потенциальными антивирусными агентами. В качестве потенциальных ингибиторов -глюкозидазы могут быть использованы производные аналога глюкозы – дезоксиноиримицина (DNJ), блокирующие действие -глюкозидазы. Для проверки этого предположения были синтезированы алкилированные производные DNJ:  N-пентил-DNJ и N-бензилl-DNJ. ( Бакиновский Л.В. и Зинин А.А., ИОХ РАН) (Рис.33). 

Рис.  30.  Иминосахара, алкилированные производные аналога глюкозы дезоксиноиримицина DNJ

Для изучения влияния этих соединений на гликозилирование структурных белков ВГС, на процесс сборки структурных белков, на инфекционность вирусных частиц и на способность вируса связываться с клеткой использовали  вирусоподобные частицы ВГС, образующиеся в клетках насекомых и млекопитающих. Отобранные в этих системах соединения могут стать основой для разработки новых противовирусных препаратов.

Для оценки ингибирующего действия новых соединений  на процессинг  структурных белков вируса гепатита С определяли их  влияние, во-первых,  на накопление gpE1и gpE2 ВГС в эндоплазматическом ретикулуме и их гликозилирование; во-вторых, на взаимодействие gpE1и gpE2 с калнексином, определяющим правильное сворачивание Е2 и сборку продуктивных димеров Е1Е2; и в-третьих, на  взаимодействие вирусных гликопротеинов gpE1и gpE2 с калретикулином, определяющим неправильное сворачивание Е2 и образование непродуктивных димеров Е1Е2.

Структурные белки вируса синтезировали в бакуловирусной системе экспрессии генов в клетках Sf9 в отработанных нами условиях и анализировали с помощью иммуноблоттинга белков клеточного лизата  с антителами  к белкам  - кора, E1 или E2. Вестерн-блот анализ экспрессии вирусоподобных частиц ВГС в инфицированных клетках насекомых Sf9 после 48 ч. заражения рекомбинантным вирусом bv-CE1E2 выявлял белки  в зонах,  соответствующих  ожидаемой молекулярной массе: 17-22 (кор), 27-30 (E1) и 66-68 кДа (E2) соответственно.

Рис. 31. Вестерн-блот анализ экспрессии вирусоподобных частиц ВГС в инфицированных

клетках насекомых Sf9 после 48 часов заражения рекомбинантным вирусом bv-CE1E2.

Иммуноблоттинг белков клеточного лизата  с антителами anti-Core, anti-E1 и anti-E2

 

  Установлено, что синтезированные в клетках насекомых гликопротеины  Е1 и Е2, чувствительны к endoH, то есть в клетках насекомых происходит их эффективное пост-трансляционное гликозилирование (Рис. 32).

Рис. 32.  Анализ  гликопротеинов  Е1 и Е2 ВГС, синтезированных в клетках насекомых,  которые были  инфицированы бакуловирусом bv–СЕ1Е2 и обработаны  EndoH, с помощью вестерн-блоттинга с антителами к Е1 и Е2 ВГС,  после предварительного иммуноосаждения антителами  к Е1 и Е2 в денатурирующем 12%-ом ПААГ-геле; А – иммуноосаждение и иммунноблотинг с антителами  к Е1 ВГС,  Б – иммуноосаждение и иммунноблотинг с антителами  к Е2 ВГС; 1 – CE1E2;  2 – CE1E2 + Endo H

9.3.1.  Для изучения влияния ингибиторов -глюкозидазы на  накопление gpE1и gpE2 ВГС и их  гликозилирование в эндоплазматическом ретикулуме  клетки, зараженные bv- CE1E2 при множественности заражения 20, обрабатывали NBn-DNJ и NPn-DNJ в концентрациях  0-10-200-1000 M. Через 24 ч. после заражения клетки лизировали, белки ЭР экстрагировали и анализировали с помощью вестерн-блоттинга (Рис. 33). В качестве контроля использовали белки из клеток, обработанных N-бутил-DNJ (NBDNJ) в концентрации 200мкМ.

Рис. 33.  Электрофореграммы лизатов клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом bv–СЕ1Е2 в присутствии различной конценрации производных DNJ в денатурирующем 12%-ом ПААГ-геле; Иммуноблотинг белков лизатов инфицированных клеток с с антителами против белка Е2 ВГС. 1 –  CE1E2;  2  – CE1E2 + NBDNJ (200 M)-положительный контроль; 3 – CE1E2 + NBnDNJ (10 M);  4 –  CE1E2 + NBnDNJ (200 M);  5 –  CE1E2 + NBnDNJ (1 mM);  6 –  CE1E2 + NPnDNJ(10 M);  7 – CE1E2 + NPnDNJ (200 M );  8 –  CE1E2 + NPnDNJ (1 mM);  Маркерные белки, кДа. 

Под действием производных DNJ, (NBnDNJ, NPnDNJ и NBDNJ)  наблюдалось  снижение подвижности gpE2 ВГС  в клетках насекомых, зараженных рекомбинантным  вирусом, по сравнению с клетками насекомых, инфицированными bv-CE1E2 в отсутствии ингибиторов. В присутствии 1mM NBnDNJ и NPnDNJ снижение подвижности было более выраженым. Такой восходящий сдвиг может быть  прямым результатом ингибирования  -глюкозидаз в ЭР и накопления  гипергликозилированных N-гликанов в гликопротеинах ВГС. По результатам этого опыта для дальнейших  экспериментов были использованы следующие концентрации ингибиторов: NPnDNJ - 1 mM  и  NBnDNJ -1 mM. ( концентрации сравнительно нетоксичные для клеток – процент гибели клеток за 48 часов инкубации составлял около 15%) 

Наблюдали увеличение накопления и снижение подвижностей гликопротеинов gpE1и gpE2 ВГС в клетках насекомых, зараженных рекомбинантным  вирусом, в присутствии 1 mM NBnDNJ, 1 mM NPnDNJ и 200 M NBDNJ (известным положительным контролем) по сравнению с исходным бакуловирусом bv–СЕ1Е2 (Рис.34).

Рис. 34.  Анализ экспрессии генов рекомбинантных структурных белков E1 и E2 ВГС в клетках насекомых Sf9, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом bv–СЕ1Е2 в присутствии производных DNJ. Иммуноблотинг белков E1 и E2 лизатов инфицированных клеток с с антителами против белков Е2 ВГС в денатурирующем 12 %-ом ПААГ. 1 –CE1E2; 2 – CE1E2 +NBnDNJ (1 mM); 3 – CE1E2 + NPnDNJ (1 mM); 4 – CE1E2 + NBDNJ 200 M)-положительный контроль; Маркерные белки, кДа.

9.3.2. Взаимодействие вирусных гликопротеинов gpE1и gpE2 с калнексином . Лизаты клеток Sf9, инфицированных рекомбинантным  вирусом bv-CE1E2 ВГС в присутствии 1 mM NBnDNJ и 1 mM NPnDNJ, подвергали иммуноосаждению с антителами к калнексину или калретикулину, с последующим электрофорезом  в денатурирующем  ПААГ и анализировали с  помощью вестерн-блоттинга с антителами к Е2.

Рис.  35.  Вестерн-блот анализ продуктов экспрессии генов вирусоподобных частиц ВГС  в рекомбинантных клеточных линиях Sf9, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом  bv-CE1E2 в присутствии производных DNJ.  Иммуноблотинг белков лизатов инфицированных клеток с антителами анти-E2, после предварительного иммуноосаждения антителами к калнексину (CNX). 1 –CE1E2;  2 – CE1E2 + NBDNJ(200 M);  3  – CE1E2 + NBnDNJ(1 mM);  4 – CE1E2 + NPnDNJ(1 mM).

Вестерн-блот анализ гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС, синтезированных  в клетках насекомых, зараженных рекомбинантным  вирусом bv–СЕ1Е2 в присутствии и отсутствии ингибиторов, и осажденных антителами к калнексину показал существенное уменьшение количества gpE2,  что обусловлено его неправильным сворачиванием  (неправильно свернутый gpE2 нарушал его взаимодействие с gpE1, это приводило к образованию непродуктивных димеров Е1Е2, поэтому можно предположить, что гипергликозилированные гликаны, индуцированные ингибированием –глюкозидазы, подавляют продуктивную ассоциацию гликопротеинов ВГС. (Рис.35)

Рис.  36.  Вестерн-блот анализ продуктов экспрессии генов вирусоподобных частиц ВГС  в рекомбинантных клеточных линиях Sf9, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом  bv-CE1E2, в присутствии алкилированных  производных DNJ.  Иммуноблотинг белков лизатов инфицированных клеток с антителами анти-E2, после предварительного иммуноосаждения антителами к калретикулину  (CLR).  1 – CE1E2;  2 – CE1E2 + NBDNJ(200 M)- положительный контроль;  3 – CE1E2 + NBnDNJ

(1 mM);  4 – CE1E2 + NPnDNJ(1 mM); Маркерные белки, кДа. 

  Иммуноблотинг белков лизатов инфицированных клеток в присутствии и отсутствии ингибиторов с антителами анти-E2, после предварительного иммуноосаждения антителами к калретикулину  показал увеличение количества и снижение подвижности gpE2. Снижение подвижности gpE2, может  указывать на присутствие гипергликозилированных гликанов в гликопротеине, усиливающих его взаимодействие с  калретикулином.

Таким образом,  процесс внутриклеточного N-гликозилирования оболочечных гликопротеинов нарушается в присутствии исследуемых N-алкилированных DNJ.

  Для дальнейшего анализа сворачивания гликопротеинов ВГС и их сборки в зависимости от присутствия исследуемых ингибиторов, необходимы эксперименты с конформационно-чувствительными  антителами анти-Е2 специфичными к разным эпитопам. К сожалению, на сегодняшний день, не описано ни одного конформационно-зависимого антитела анти-Е1.

Заключение

  Цикл работ, представленный в настоящей диссертации,  посвящен разработке систем клонирования и экспрессии генов в клетках про- и эукариот.

Клонирование в клетках  E. coli применено для создания библиотек кДНК геномов РНК- содержащих фитовирусов – ВШМЯ и ХВК. Полученные библиотеки использованы для определения первичной структуры и выяснения организации геномов этих вирусов. С использованием систем клонирования в клетках  Bacillus subtilis разработана система функциональной селекции рибозимов.

Для решения задачи получения различных белков методами генетической инженерии создан набор дрожжевых векторов, содержащих регулируемый промотор гена кислой фосфатазы и нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды секретируемых белков. Эти векторы применены для получения штаммов дрожжей, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита B и гормон роста человека.

  В заключительной части диссертации представалены результаты исследований, посвященных разработке и оптимизации бакуловирусной системы экспрессии генов в клетках насекомых.

С использованием этой системы получены клетки насекомых, продуцирующие разные типы сложных белков. Это – мембранные белки рецептор CD4 человека и серотониновый рецептор 5HT1c мыши, микросомный гем-содержащий белок стероид-21-гидроксилаза и его мутантный вариант, гликопротеидный двухсубъединичный гормон хориогонадотропин человека, структурные белки C, E1 и E2 вируса гепатита С. Экспрессия трех структурных белков ВГС в клетках насекомых сопровождается образованием вирусоподобных частиц и может служить основой модельной системы морфогенеза ВГС. Эта система использована для изучения влияния гликозилирования структурных белков ВГС на их димеризацию и сборку, а также для исследования действия новых синтетических ингибиторов – глюкозидаз на процесс сборки вирусных частиц.

Для экспрессии  нескольких  генов одновременно в одной инфицированной клетке насекомого и получения  мультимерных белков созданы новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии на основе бакуловирусов. 

  Сконструированы также новые бакуловирусные векторы для доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих.

 

Выводы.

  1.  С  использованием  разработанных систем  клонирования и экспрессии в клетках бактерий впервые получена библиотека бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии  геномной РНК ВШМЯ  и предложена схема организации функционально фрагментированного генома фитовируса ВШМЯ; впервые предложена бактериальная тест-система, для функционального скрининга библиотек мутантных рибозимов.

  2. Впервые сконструирована серия векторных плазмид, содержащих делеционные варианты  регуляторных  областей гена PHO5, для экспрессии и секреции гетерологичных белков в культуре клеток Saccharomyces  cerevisiae, которые  могут быть использованы в качестве промышленных продуцентов рекомбинантных белков млекопитающих.

  3.  Разработаны и предложены условия синтеза серотонинового рецептора 5HT1c мозга мыши в клетках растений, в ооцитах Xenopus laevis и в клетках насекомых  для изучения его функциональной активности.  Впервые показано, что рецептор серотонина в виде гибрида с GFP, в клеточном ответе на серотонин  в ооцитах  Xenopus laevis, связывается с гормоном и, при участии GTP-связывающего белка, активирует фосфолипазу С, инициируя поток кальция в клетке.

  4. В инфицированных рекомбинантными бакуловирусами клетках  насекомых впервые синтезированы стероид-21-гидроксилаза (СYP21A2) человека и ее мутантный вариант (С169R), обнаруженный у больной с классической формой адреногенитального синдрома, с уровнем экспрессии, значительно превышающим показатели, достигнутые в системах экспрессии на основе клеток млекопитающих и дрожжей. Впервые проведены исследования влияния мутаций стероид-21-гидроксилазы на ее свойства, которые могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести заболевания классической формой адреногенитального синдрома при молекулярно-генетической диагностике у новорожденных

  5.  Предложены новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии для эукариот на основе бакуловирусов, для синтеза мультимерных белков со специфическими пост-трансляционными модификациями и корректной сборкой из различных субьединиц.в клетках насекомых. 

  6.  Сконструированы новые модифицированные бакуловирусные векторы  в форме трансфер-векторов pFastBacMamGFP и pFastBacMamLuc, с экспрессирующими кассетами под контролем промотора цитомегаловируса (CMV) для направленной доставки и экспрессии эукариотических генов в  культивируемых клетках млекопитающих. Разработаны условия эффективной трансдукции и экспрессии структурных генов ВГС в клетках Hek293 и Huh-7, с помощью рекомбинантных бакуловирусов.

  7.  Получены линии  клеток насекомых Sf9 – эффективные продуценты структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С, структурно и иммунологически подобных вирионам вируса, использованных в качестве  модели при изучении морфогенеза ВГС.

  8.  Для изучении морфогенеза ВГС  исследовано  влияние  N-гликозилирования гликопротеина Е1 вируса гепатита С на экспрессию и процессинг белков оболочки вируса, на образование комплекса Е1Е2 ВГС, влияющего на формирование частиц, морфологически подобных вирионам ВГС, с использованием  вирусоподобных частиц ВГС, синтезируемых в клетках насекомых.

  9.  С целью разработки новых антивирусных соединений, влияющих на формирование вириона  вируса гепатита С, синтезированы ингибиторы -глюкозидазы, производные иминосахара дезоксиноиримицина (DNJ) N-пентил -DNJ и N-бензил -DNJ, способные нарушать процесс внутриклеточного N-гликозилирования оболочечных гликопротеинов вируса, влияя на  сворачивание гликопротеинов и, соответственно, сборку вирусных частиц.

 

Список публикаций по теме диссертации.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Dolja, V., Lunina, N., Leiser, R., Stanarius, T., Beljelarskaya, S., Kozlov, Y. and Atabekov, I. (1983) A comparative study on the in vitro translation products of individual RNAs  from two-, three-, and four- component strains of Barley stripe mosaic virus. Virology 127, 1-44.

2.  Белжеларская С.Н., Морозов С.Ю., Доля В.В., Козлов Ю.В., Атабеков Г.И. (1984), Клонирование ДНК копий индивидуальных РНК ВШМЯ. Доклады АНСССР, 275,186-188.

3.  Рупасов В., Адышев Д., Морозов С., Белжеларская С., Манкин А., Доля В., Аграновский А., Атабеков Г. и Козлов Ю. (1984) Структура 3’-концевого участка РНК вируса штриховатой мозаики ячменя . Молекулярная биология 18, 140-145

4.  Kozlov, Yu., Rupasov, V., Adyshev, D., Beljelarskaya, S., Agranovsky, A., Mankin, A., Morozov, S., and Dolya, V. (1984) Nucleotide sequence of the 3’-terminal structure in BSMV genome. Nucleic Acids Research, 12, 4001-4009.

5.  Adyshev, D., Beljelarskaya, S. Kozlov, Yu.. (1987) Pecularities of structural organization of BSMV genome. Ac. of  Sci. of the Kyrghyz  Rep. News, 4: 52-55.

6. Краев А., Морозов С., Лукашева Л., Розанов М., Чернов В.,  Симонова М., Голова Ю., Белжеларская С., Позмогова Г., Скрябин К. и Атабеков Г. (1988) Первичная структура и организация генома Х-вируса картофеля. Доклады АНСССР. 300, 711-716.

7. Циоменко А.Б., Лупашин В.В., Морзунов С.П., Карпычев И.В., Белжеларская С.Н., Рубцов П.М., Скрябин К.Г. (1990) Природа N-концевой сигнальной последовательности определяет характер внутриклеточного распределения и эффективность экспорта гормона роста человека у дрожжей Sacccharomyces cerevisiae. Молекулярная биология 24, 1126-1133.

8.  Белжеларская С.Н., Орловский И В.и Никитенко С.В. (1996). Использование бактериальной селекционной системы на основе Bacillus Subtilis для отбора мутантных рибозимов, эффективно функционирующих in vivo. Доклады АНСССР. 347, 113-116.

9.  Белжеларская С.Н., Сутугина Л.П., Филенко О.М., Бучацкий Л.П. и Рубцов П.М. (1996) Экспрессия кДНК хорионического гонадотропного гормона человека в культуре клеток насекомых. Молекулярная биология 30(3), 518-523.

10. Сутугина Л.П., Белжеларская С.Н., Филенко О.М., Труш Ф.М., Бучацкий Л.П. и Скрябин К.Г. (1996) Метод роллерного культивирования культуры клеток насекомых SF9, инфицированных гибридными бакуловирусами. Молекулярная биология 30, 410-415.

11. Белжеларская С.Н., Сутугина Л.П., Толкачева Т.В., Рубцов П.М.и Скрябин К.Г. (1996) Экспрессия гена CD-4 рецептора ВИЧ-1 в клетк5ах насекомых с использованием бакуловирусной системы. Молекулярная биология 30, 524-528.

12. Белжеларская С.Н. (2002) Бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых, Обзор, Молекулярная биология 36(3), 371-385.

13. Белжеларская С.Н. и Саттон Ф. (2003) Роль серотониновой системы в реакции различных типов клеток на стрессорные сигналы. Молекулярная биология 37(3), 452-457.

14.  Белжеларская С.Н. и Саттон Ф. (2004) Экспрессия кДНК гена серотонинового рецептора мыши (5HT1c) в культуре клеток насекомых. Молекулярная биология 38(3), 477-482.

15. Королева Н.Н., Грищук Ю.В., Кочеткова С.В., Прасолов В.С., Рубцов П.М.  и  Белжеларская С.Н. (2006) Оптимизация бакуловирусной системы доставки  генов в клетки насекомых и млекопитающих. Молекулярная биология, 40(6), 1074-1081

16. Yu.Grischuk, P. Rubtsov, F. Riepe, J. Grotzinger, S. Beljelarskaya, V. Prassolov, N. Kalintchenko, T. Semitcheva, V. Peterkova, A. Tiulpakov, W. G. Sippell and N.Krone (2006). Four novel missense mutations in the CYP21 gene in Russian patients with>

17. Грищук Ю.В., Рубцов П.М. и Белжеларская С.Н.(2007) Экспрессия и функциональный анализ стероид 21-гидроксилазы человека и ее мутантного варианта в клетках насекомых. Молекулярная биология, 41(1), 77-78

18.  С.Н. Белжеларская, Н.Н. Королева, В.В. Попенко, В.Л. Друца, О.В.Орлова, П.М. Рубцов, С.Н. Кочетков.(2010) Характеристика структурных белков и  вирусоподобных частиц вируса гепатита С, синтезированных в клетках  насекомых с  помощью бакуловирусной системы экспрессии.  Молекулярная биология 44(1), 107-119

19. Королева Н.Н., Спирин П.В., Тимохова А.В., Рубцов П.М., Кочетков С.Н., Прасолов В.С., Белжеларская С.Н. (2010) Бакуловирусные векторы для эффективной доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих, Молекулярная биология, 44(3), 1-13

20.  Lyupina YV, Dmitrieva SB, Timokhova AV, Beljelarskaya SN, Zatsepina OG, Evgen’ev M.B., Mikhailov VS. (2010) An important role of the heat shock response in infected cells for replication of baculoviruses. Virology, 406(2), 336-341

21.  Белжеларская С.Н. (2010). Бакуловирусные системы экспрессии рекомбинантных белков в клетках насекомых и млекопитающих. Обзор, Молекулярная биология,45(1), (в печати)

Избранные тезисы конференций:

22.  Beljelarskaya, S., Morozov, S., Dolja, V., Kozlov, Yu. and Atabekov, I.. (1982) Cloning of DNA –copies of RNA genome BSMV. Thesises on Sixth USSR-FRANCE Symposium “Proteins and Nuclear Acids Structure and Function”, Tskhaltubo, p.21

23.  Kozlov, Yu., Rupasov, V., Adyshev, D., and  Beljelarskaya, S. (1984) Pecularities of structural organization of BSMV genome. Thesis on 16-th FEBS conference, Moscow, p.22.9

24.  Beljelarskaya, S., Krajev, A., Mironova,M. and Skryabin, K. (1983) Cloning of ADE2 gene of Saccharomyces cerevisiae. Report on The International Conference” Metabolic and genetic regulation in yeast”, Jena, GDR.

25.  Краев А., Морозов С., Лукашева Л., Розанов М., Чернов В.,  Симонова М., Голова Ю., Белжеларская С., Позмогова Г., Скрябин К. и Атабеков Г. (1987) Первичная структура генома Х-вируса картофеля. Молекулярная генетика .3, 32

26.  Рубцов П.М., Морозов И.А., Свердлова П.С., Дебабов Д. Г. и Белжеларская С.Н. (1994) Создание трансфер-векторов для экспрессии мультимерных генов в эукариотической системе экспрессии Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология. 4, 17-18.

27.  Белжеларская С.Н., Свежинский Е.А., Сутугина Л.П., Трум В.М., Рубцов П.М., Скрябин К.Г.(1994)  Экспрессия гонадотропных гормонов в клетках эукариот. Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология. 4, 16-17.

28.  Белжеларская С.Н., Рубцов П.М., Сутугина Л.П., Рахимова Л.Х., Батырева Е.Р. и Скрябин К.Г.(1996)  Создание эффективных систем клонирования и экспрессии эукариотических генов в клетках насекомых с использованием бакуловирусных векторов. Тезисы стендовой сессии Международной конференции, посвященной памяти акад. А.А.Баева . 109.

29. Beljelarskaya S., Holt C., Sutton F. (1999) Conservation of signal transduction pathways in plant and animal cells. Thesises on The 4th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, Moscow, 7.

30. S. N. Beljelarskaya, Yu.V. Grischuk, N.N Koroleva, S.N. Kochetkov and P.M. Rubtsov. (2004) Efficient gene transfer into insect and mammalian cells  by baculovirus vectors for production of functional human steroid-21-hydroxilase and hepatitis C virus proteins in insect and mammalian cells. Thesises: 7th Interntional  Engelhardt  Conference on Molecular Biology,  Susdal. 

31.  Y.V.Grischuk, D.S. Ivanov, V.S. Prassolov, S.N. Beljelarskaya and P.M.Rubtsov. (2005) Two  novel disease-causing mutations in the CYP21 gene in Russian patients with 21-hydroxylase deficiency: affect on functional enzyme activity. 30th FEBS Congress-9th IUBMB Conference, Budapest, A4-023P.

Благодарности.  Автор благодарит К.Г. Скрябина, который инициировал  данную тему исследований, и признателен П.М. Рубцову за критические замечания при обсуждениях и анализе результатов. Автор искренне  благодарен С.Н. Кочеткову за помощь и поддержку в работе. Автор выражает глубокую благодарность моим коллегам и соавторам, и особенно

О.В. Орловой  и  А.В. Тимоховой за поддержку и помощь в работе. Автор благодарит за дружеское участие С.Г.  Скуридина, сотрудников лаборатории молекулярной эндокринологии.

 






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.