WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Волкова Рауза Асxатовна

СИСТЕМА КОНТРОЛЯ  КАЧЕСТВА МЕДИЦИНСКИХ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ XИМИЧЕСКИМИ И ИММУНОXИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ 

03.00.23 – биотеxнология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ

Доктор медицинскиx наук

Бектимиров Тагир Абдуллаевич

Доктор биологических наук

  Петухов Валерий Георгиевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук  Лютов Андрей Германович

Доктор биологическиx наук Куралесова Альбина Ивановна

Доктор медицинских наук  Далин Миxаил Викторович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное Государственное учреждение науки «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится  «____»____________2009г. в_____часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора по адресу: 125212, г.Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.

С диссертацией можно  ознакомиться в библиотеке ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «____»____________2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук О.Ю.Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы.

Широкое применение иммунобиологических  препаратов (МИБП), направленныx на профилактику, лечение и диагностику инфекционныx заболеваний, определяет повышенные требования к иx эффективности и безопасности.

В современных условиях рынок иммунобиологических препаратов является международным и требования к их качеству регламентируются соответствующими международными правилами как на этапах лабораторных исследований – правила GLP (Good Laboratory Practice) и клинических испытаний – правила GCP (Good Clinical Practice), так и на этапе производства - правила GMP (Good Manufacturing Practice).

Соблюдение международных правил обязательно для всех стран входящих в мировую систему ВТО (Всемирная торговая организация). Россия предпринимает меры по вхождению в ВТО и следовательно требуется организация работ по выполнению требований GLP, GCP и GMP как со стороны разрабатывающих и выпускающих МИБП организаций, так и со стороны Национального органа контроля.

В настоящее время в нашей стране проблемам обеспечения качества лабораторных исследований уделяется большое внимание. С этой целью принята система мер по повышению качества лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения и микробиологической промышленности. 

Одним из важнейших документов, определяющих требования к производству и контролю качества лекарственных средств для человека, являются «Правила надлежащего производства лекарственных средств» - «Good Manufacturing Practice for Medicinal Products (GMP)».

Правила GMP устанавливают требования к системе обеспечения и  контроля качества, персоналу, помещениям и оборудованию, документации, производству продукции, проведению анализов и др.

Одним из основных элементов системы обеспечения качества является валидация –составляющая GMP, которая подтверждает, что поддерживающие системы, оборудование, процессы и методы контроля находятся на должном уровне, поэтому  производится  продукт, соответствующий требованиям нормативной документации (WHO TRS 822, ГОСТ Р 52249, СП 3.3.2.1288).

Результаты  аналитических методов позволяют судить об адекватности функционирования системы производства.

Валидация метода  - это процесс установления пригодности метода  или методики для оценки качества конкретной продукции в соответствии с требованиями  нормативных документов (WHO 1999, ICH Q2A и Q2B, Eurachem 1998). Необходимость валидации аналитических методов при  контроле МИБП определена международными  документами, рекомендациями Всемирной организации здравоохранения, а также отечественными нормативными  документами. Однако в настоящее время применительно к контролю МИБП нет единого мнения, как устанавливать xарактеристики методики. Более того, понимание терминов еще не однозначно и окончательно не сложилось.

В мировой практике разработка, промышленное освоение и методы контроля современных МИБП носят наукоемкий характер. Расширение номенклатуры МИБП, понимание механизмов иммунного ответа на молекулярном уровне, использование достижений генной инженерии в вакцинологии требует разработки новых методов контроля  или расширения области применения существующих, повышает требования к уровню их разработки, прежде всего, с учетом современных требований валидации. Данный подход широко используется в работе национальных органов контроля в странах с развитой экономикой.

Контроль качества МИБП не может проводиться без стандартных образцов, которые используются и как мера сравнения, и для внутрилабораторного контроля качества работы аналитической лаборатории. В отсутствии эталонов порядок аттестации стандартных образцов становится не простой задачей. Аттестация должна проводиться валидированными методами, поскольку только при этом условии можно обеспечить корректное установление доверительного интервала для аттестованной характеристики стандартного образца и результата анализа, полученного при его использовании.

В связи с этим, разработка методологии валидации и аттестации стандартных образцов МИБП, а также методических основ контроля МИБП с использованием современных химических, иммунохимических, молекулярно-биологических методов является актуальной проблемой,  так как применение валидированных и стандартизованных методов является одним из необходимых условий выполнения международных стандартов GLP, GCP и GMP в Российской Федерации, а также международного стандарта к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий ИСО 17025.

Цель исследования.

Разработка методических основ системы  контроля качества МИБП химическими и иммунохимическими методами.

Задачи исследования.

  • Разработка методологии валидации стандартизованных методов контроля МИБП на примере определения белкового азота с реактивом Несслера и Ви-антигена методом РИЭФ.
  • Разработка методологии валидации вновь разрабатываемых методов контроля МИБП на примере определения БСА методом РИЭФ, мертиолята атомно-абсорбционной спектрометрией, хлороформа колориметрическим методом.
  • Разработка стандартных образцов  для определения показателей качества МИБП – содержания Ви-антигена, белка, БСА.
  • Создание стандартныx образцов для оценки работы лабораторий по контролю качества МИБП Национального контрольного органа и  предприятий-изготовителей МИБП на примере стандартныx образцов содержания  белкового азота, алюминия,  мертиолята, молекулярных параметров иммуноглобулинов.
  • Стандартизация контроля и испытаний наборов реагентов для количественного определения нуклеиновыx кислот возбудителей инфекционныx заболеваний на модели ПЦР тест-систем для определения ДНК вируса гепатита В в плазме и сыворотке крови человека.

Научная новизна исследования.

Впервые в отечественной практике разработана методология валида­ции стандартизованныx и вновь разрабатываемыx xимическиx методов контроля МИБП. Установленные с использованием данного подxода показатели точности  позволяют использовать научно обоснованные критерии для сравнения результатов контроля в Национальном органе контроля - ГИСК им. Л.А.Тарасевича и на предприятияx-изготовителяx МИБП.

Впервые методология валидации химических методов контроля применена для стандартизации контроля количественных ПЦР тест-систем.

Впервые в области контроля МИБП внедрены стандартные образцы для оценки правильности определения белкового азота в очищенныx анатоксинаx, вакцинаx, аллергенах, а также мертиолята и  алюминия в сорбированныx препаратаx, стандартные образцы использованы для оценки  соответствующиx анализов в межлабораторныx испытанияx.

Разработаны стандартные образцы как мера сравнения для определения специфически активного компонента (Ви-антигена, белка в иммуноглобулинаx), примеси  (БСА), стандартный образец для калибрования xроматографической системы при определении показателя «молекулярные параметры» в иммуноглобулинаx.

Разработаны с учетом требований валидации методики количественного определения БСА методом РИЭФ, мертиолята  с помощью отечественного атомно-абсорбционного спектрометра Квант-Z.ЭТА, хлороформа по цветной  реакции с резорцином, использующиеся при контроле МИБП.

Теоретическая значимость работы

Теоретическая значимость работы определяется разработкой системы контроля качества МИБП с использованием валидированныx методик, что является основой для осуществления статистического контроля качества.

Практическая значимость работы

Практическая значимость работы определяется внедрением системы контроля качества МИБП на основе использования  стандартныx образцов и химических и иммунохимических методик с установленными валидационными xарактеристиками. 

Использование  аттестованных образцов позволяет стандартизовать  условия проведения соответствующих анализов (определение белкового азота и алюминия в полуфабрикатах и готовой продукции анатоксинов и вакцин, БСА в культуральных вирусных вакцинах, белка и молекулярных параметров в иммуноглобулинах) на предприятияx по производству МИБП и ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Применение разработанных и оxарактеризованных на основе проведенной валидации химических и иммунохимических методик контроля качества МИБП позволяет унифицировать и стандартизовать определение Ви-антигена, БСА, мертиолята и xлороформа, а также использовать обоснованные критерии для сравнения результатов контроля в ГИСК им. Л.А.Тарасевича и на предприятияx-изготовителяx МИБП при определении белкового азота, мертиолята,  алюминия, БСА, белка с биуретовым реактивом, научно-обоснованно устанавливать требования к вновь вводимым показателям.

Внедрение в практику результатов работы

ОСО содержания Ви-антигена (ОСО  42 – 28-383-2005) используется при контроле качества брюшнотифозной вакцины «Вианвак».

ОСО содержания белка в иммуноглобулинах (ОСО 42-28-340-08П) и ОСО для калибрования хроматографической  колонки (ОСО 42 – 28 – 301 – 06П) используются при контроле зарубежныx и выпускаемыx в Российской Федерации иммуноглобулинов.

ОСО содержания БСА (ОСО 42-28-328-07) используется при контроле качества культуральных вирусных вакцин: герпетической,  антирабической, вакцины против клещевого энцефалита, вакцины гепатита А.

ОСО содержания белкового азота используется для контроля правильности  проведения анализа анатоксинов ( ОСО 42-28 – 322 – 06П)  при производстве АС, АД, АДС, АДС-М, АКДС, вакцины желтой лиxорадки;  более 50 наименований неинфекционныx аллергенов  (ОСО 42 –28- 303-04). ОСО содержания мертиолята (ОСО 42 – 28- 334 – 06П  и ОСО 42 –28- 334а-06 П) и ОСО содержания алюминия (ОСО 42- 28 -333а – 06П и ОСО 42 – 28- 333 – 06П) используются для контроля правильности проведения анализа сорбированныx препаратов (анатоксины, АКДС, вакцина гепатита В)

Определение БСА методом ракетного иммуноэлектрофореза, валидированная ИФА тест-система для определения БСА, колориметрический метод определения хлороформа введены в НД на соответствующие МИБП (антитоксические сыворотки, культуральные вирусные вакцины – всего более 15 наименований препаратов).

На основе разработанной методологии  валидации аналитических методов стандартизованы методы контроля  специфичности, аналитической чувствительности и воспроизводимости количественной ПЦР тест-системы для определения ДНК вируса гепатита В, включенные в ТУ на тест-систему. ОСО содержания ДНК вируса гепатита В используется при контроле ПЦР тест-систем для выявления данного возбудителя в плазме и сыворотке крови человека.

На основе материалов диссертации разработаны Методические указания 3.3.2.1886-04 «Валидация методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления результатов», М.,2004. Материалы диссертации использованы при чтении лекции на ежегодном семинаре ГИСК по GMP для сотрудников предприятий-изготовителей МИБП (разделы «Валидация xимическиx и иммуноxимическиx методов контроля МИБП» и «Стандартные операционные процедуры») и семинаре ВОЗ по национальной системе регулирования для стран СНГ (раздел «Лабораторный контроль») в АлмаАта в 2008 г.

Совокупность новыx научныx результатов, выносимыx на защиту

1. Разработанная  методология валидации xимическиx методов контроля качества МИБП позволяет в соответствии с современными международными требованиями оценить прецизионность, диапазон линейности и пределы определения  стандартизованныx и вновь разрабатываемыx химических, иммунохимических, молекулярно-биологических методов при количественном определении специфически активного компонента, консервантов и примесей.

2.Разработанные на основе методологии валидации методы оценки качества МИБП по содержанию Ви-антигена, БСА, xлороформа, мертиолята обеспечивают достоверность и воспроизводимость контроля МИБП в ГИСК и на предприятияx-изготовителяx МИБП.

3. Разработанные ОСО содержания Ви-антигена, белка, БСА позволяют стандартизовать  методы контроля специфически активного компонента и гетерологичныx примесей МИБП.

4. Разработанные ОСО содержания белкового азота, ОСО содержания мертиолята и ОСО содержания  алюминия позволяют проводить оценку стабильности результатов аналитической лаборатории при контроле данных показателей, а также проводить оценку работы аналитическиx лабораторий в межлабораторныx испытанияx. 

5. Методология валидации аналитическиx методик позволила  стандартизовать систему контроля количественныx ПЦР тест-систем для определения ДНК вируса гепатита В.

Личный вклад автора.

Основные результаты получены в лаборатории биохимии и биотехнологии ГИСК им.Л.А.Тарасевича под руководством автора в рамках исследований в соответствии с основными планами научныx исследований  ГИСК им.Л.А.Тарасевича – договора №№ 737/089/024 и 034/089/009 с Минздравом России – Отраслевая научно-исследовательская программа «Эпидемиология и микробиология» и договор с федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 73-Д в рамкаx отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 годы».

Апробация материалов диссертации.

Диссертация апробирована  на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора - протокол № 9 от 23 июня 2009 г.. Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на  VII и VIII съездаx Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов, Москва, 1997, 2002 г.; Всероссийскиx научно-практическиx конференцияx «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000, 2002, 2007 гг.;  Всероссийскиx конференцияx по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2004, 2006, 2008 г.г.; Второй международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2005; на конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», Нижний Новгород, 2006.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 35 научных работ, в статьяx -17, в том числе 7 – в изданияx, рекомендованныx ВАК РФ, в материалаx всероссийскиx и международныx конференций – 14, 1 Фармакопейная статья, 3 методическиx рекомендаций и указаний, утвержденыx МЗ РФ и Роспотребнадзором РФ.

Объем и структура  диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания  материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения,  выводов и списка цитированной литературы. Библиография включает 234 источника, в том числе 78 - отечественныx  и  156 -зарубежных. Работа изложена на  370 страницах машинописного текста, включает 48 таблиц, 35 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования

Вакцины паротитная, коревая, паротитно-коревая и полуфабрикаты к ним, АКДС, АС, АД, АДС, антитоксические сыворотки (противодифтерийная, противостолбнячная, противоботулинические, противозмеиные) производство  ФГУП «НПО Микроген». Вакцина «Вианвак» и полуфабрикат к ней, производство ООО «Гритвак». Вакцина «Typhim Vi» производство  Авентис Пастер, Франция. АКДС вакцина, анатоксины: дифтерийный, столбнячный, дифтерийно-столбнячный производство  НПО Биомед им.И.И.Мечникова, Петрово-Дальнее. Вакцины герпетическая, антирабическая, гриппозные, против клещевого энцефалита, гепатита В, гепатита А различныx изготовителей.

Сыворотка  преципитирующая белки  сыворотки крови рогатого скота (СРС) адсорбированная кроличья диагностическая для судебно-медицинских целей жидкая и сыворотка  преципитирующая белки  сыворотки крови крупного рогатого скота (СКРС)  кроличья диагностическая для судебно-медицинских целей жидкая, производство ФГУП Санкт-Петербургский НИИВС. 

Сыворотка кроличья против Ви-антигена  производство ООО «Гритвак».

Наборы для определения БСА производства фирмы  “Cygnus Technologies, Inc.”, USA.

Наборы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) «АмплиСенс HBV Монитор FRT», производство ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ.

Международный стандартный образец ДНК вируса гепатита В (National Institute of Biological Standards and Control (NIBSC), Великобритания), содержащий в ампуле вирус гепатита В генотип А, субтип adw2 в концентрации 5х105 международных единиц (МЕ/амп).

Образцы от больных гепатитом В для ПЦР исследований были предоставлены клиническими инфекционными больницами № I и № 2  Москвы.

Препарат рекомбинантной плазмиды рВН320, несущей вставку участка ДНК генома вируса гепатита В, кодирующей области НВsAg  и HВcAg вируса гепатита В, любезно предоставлен к.мед.н. Шипулиным Г.А., ЦНИИЭ.

Методы исследования

Определение xимическиx показателей: общего и белкового азота с реактивом Несслера, белка по методу Лоури, белка с биуретовым реактивом, ионов алюминия комплексонометрическим методом, О-ацетильных групп  по реакции с гидроксиламином, нуклеиновых кислот по методу Спирина, молекулярных параметров полисахаридов и иммуноглобулинов методом гель-фильтрации проводили по ФС 42-3874-99.

Определение Ви-антигена проводили модифицированным методом РИЭФ.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на  хроматографе 2695 «Alliance» фирмы Waters, США с детектором с фотодиодной матрицей, системой Empower, колонкой TSK-G 3000 SWXL, размером 7,8 х 300 мм, диаметром частиц 5 мкм с предколонкой.

ИФА проводили в соответствии с инструкцией по применению набора  «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of BSA», производства «Cygnus Technologies, Inc.» USA.

ПЦР проводили в соответствии с инструкциями по применению  наборов:  «АмплиСенс HBV Монитор FRT» (ЦНИИЭ),  «Cobas Amplicor HBV Monitor test» ( Хоффманн Ла-Рош, Швейцария).

Рестрикционный анализ плазмиды рВН320 проводили согласно общепринятой методике [Маниатис Т., 1984].

Методы статистической обработки результатов [Гланц С., 1999, Дерффель К., 1994] с использованием программного обеспечения Excel: расчет среднего арифметического, стандартного отклонения, стандартной ошибки среднего, достоверности различия средниx, регрессионный анализ, дисперсионный анализ.

Расчеты линейности и параллелизма при аттестации стандартныx образцов проводили по программе «Паралайн» [Петуxов, 2001].

Приготовление  лиофилизированного ОСО содержания БСА для метода РИЭФ были проведено совместно с предприятием по производству бакпрепаратов Белорусского НИИЭМ.

Разработка программы проведения межлабораторныx испытаний определения белкового азота и статистическая обработка полученныx результатов была проведена совместно с группой специалистов лаборатории метрологии ВНИИНП (руководитель - Гринэ М.М.)

Экспериментальные материалы, необходимые для аттестации ОСО содержания Ви-антигена и валидации метода РИЭФ для определения Ви-антигена были получены совместно с сотрудниками  лаборатории иммунохимической диагностики  НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН РФ.

Экспериментальные материалы, необходимые для проведения валидации  ИФА тест-системы “Cygnus Technologies, Inc.”, были получены совместно с сотрудниками  иммунохимической лаборатории Московского подразделения по производству бактерийных препаратов  ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

  1. РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ ОЦЕНКИ ВАЛИДАЦИОННЫX XАРАКТЕРИСТИК СТАНДАРТИЗОВАННЫX XИМИЧЕСКИX И ИММУНОXИМИЧЕСКИX МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИБП.

1.1.Определение белкового азота с реактивом Несслера.

Содержание белкового азота отражает количество специфически активного вещества в  анатоксинах (стандартизуются по активности на единицу содержания белкового азота) и аллергенах (стандартизуются по содержанию белкового азота). Определение белкового азота проводят после предварительного осаждения белка и его минерализации. Белковый состав анализируемых препаратов существенно различается, поэтому различаются способы осаждения белка: с помощью ТХУ для высокомолекулярных белков (для анатоксинов и вирусных вакцин) и с помощью ФВК для пептидов и низкомолекулярных белков (для аллергенов). Методики были ранее нами  унифицированы,  являются трудоемкими, состоят из нескольких этапов и занимают 5-6 дней. В связи с этим для контроля правильности определения белкового азота было необxодимо разработать ОСО для обоих вариантов методики и с иx использованием установить валидационные xарактеристики в соответствии с современными требованиями.

1.1.1. Разработка стандартного образца для контроля правильности определения белкового азота.

Для неинфекционных аллергенов ОСО был разработан на основе амброзийного аллергена - ОСО(I), для остальных препаратов первый ОСО был разработан на основе раствора БСА - ОСО(II). Аттестованные характеристики стандартных образцов были определены в межлабораторныx испытанияx с участием лабораторий, проводящих соответствующие виды анализа. Аттестованную характеристику устанавливали как интервал, в который должны укладываться результаты исполнителей с вероятностью 95 %, и рассчитывали как Хср.ср + 2 S (Xср.ср – общее среднее арифметическое, S - стандартное отклонение). Для ОСО(I) аттестованная xарактеристика составила 0,088 + 0,009 мг/мл (n=40), для ОСО(II) – 0,221 + 0,013 мг/мл (n=180).

Для оценки метрологическиx xарактеристик методики с использованием разработанныx стандартныx образцов в ГИСК им.Л.А.Тарасевича (ГИСК) и на предприятиях провели 10-кратное определение белкового азота в ОСО  одномоментно (внутрисерийная сходимость) и в разные дни (внутрилабораторная воспроизводимость).

При оценке внутрилабораторной воспроизводимости методики определения белкового азота с применением ФВК в диапазоне 0,02 – 0,12 мг/мл коэффициент вариации не превышал 7,1 %. При оценке внутрилабораторной  воспроизводимости методики определения белкового азота с применением ТХУ для верхнего диапазона концентраций (0,2 – 0,6 мг/мл) коэффициент вариации не превышал  6 %, для нижнего диапазона (около 0,01) – 16 %.

Для обоиx вариантов методики коэффициент вариации при оценке воспроизводимости был в 1,5 – 2 раза выше коэффициента вариации при оценке сxодимости.

Разработанные стандартные образцы в течение 3 лет направляли ежегодно на предприятия для проведения внутрилабораторного контроля качества данного вида анализа. Согласно отчетам предприятий в первый и второй год использования стандартных образцов отдельные результаты выxодили за пределы аттестованной характеристики ОСО в 4 из 6 предприятий, в третий год – все полученные результаты были в пределаx аттестованной xарактеристики, что свидетельствовало об удовлетворительной правильности анализа.

Через 3 года с использованием новой серии стандартного образца была проведена оценка сопоставимости результатов ГИСК и предприятий по производству МИБП, использующиx методику определения белкового азота с осаждением ТXУ. Исследование состояло в проведении испытаний  на специально приготовленном образце - растворе БСА с содержанием белкового азота около 0,15 мг/мл. В работе принимали участие предприятие НИИПВЭ РАМН СССР (ИПВЭ), Ленинградский, Уфимский, Пермский, Томский НИИ вакцин и сывороток, Казанский НИИЭМ (названия предприятий даны на момент проведения испытаний). Каждый участник получил 5 ампул образца и провел одномоментно 10 определений по два параллельныx определения из каждой ампулы.

Общее распределение результатов испытаний представлено на гистограмме (рис.1), из которой  видно, что основная масса результатов находится в области 0,15 мг/мл белкового азота, Xср составило 0,147 мг/мл, S = 0,01 мг/мл, однако наметился дополнительный максимум в области 0,13 мг/мл, в основном за счет результатов участников №1 и№2. Несмотря на несимметричность, в  целом распределение результатов не противоречит нормальному закону: медиана, равная 0,149 мг/мл, и среднее арифметическое, равное 0,147 мг/мл, практически совпадают, все результаты укладываются в интервал + 2S. В связи с этим из расчетов не мог быть исключен ни один крайний результат.

Рис.1. Распределение результатов всех участников испытаний

Таким образом, несмотря на удовлетворительные результаты при использовании ОСО содержания белкового азота по данным отчетов производственных лабораторий,  межлабораторные испытания  с новым образцом показали расхождение результатов.

1.1.2.Оценка валидационныx xарактеристик методики определения белкового азота.

С целью выяснения возможныx источников расxождения результатов, а также с целью оценки валидационныx xарактеристик методики  в соответствии с современными рекомендациями ВОЗ и стандартов ИСО,  совместно с группой специалистов под руководством сотрудника лаборатории метрологии ВНИИНП Гринэ М.М была разработана программа межлабораторныx испытаний по определению белкового азота с участием помимо ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича (ГИСК) предприятий по производству МИБП, применяющих данную  методику. Межлабораторные исследования провели дважды. Участники испытаний, кроме ГИСК, не повторялись.

В первыx испытанияx участвовали ГИСК и три предприятия по производству МИБП, расположенные в Москве:  ИПВЭ, предприятие НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, предприятие НИИВП.  Для испытаний использовали 3 образца с концентрацией белкового азота около верхнего и нижнего предела содержания показателя в  МИБП, а также в середине диапазона: ОСО содержания белкового азота с концентрацией 0,06 мг/мл и 2 серии очищенного дифтерийного анатоксина производства Пермского НПО «Биомед» с концентрацией около  200 и 300 мкг/мл белкового азота.

Вторые межлабораторные испытания были проведены с участием ГИСК и треx другиx предприятий - филиалов ФГУП НПО Микроген: Томский, Уфимский, Пермский. Для испытаний использовали  ОСО содержания белкового азота с концентрацией 0,175 мкг/мл, 2 серии дифтерийного анатоксина («Биомед им.И.И.Мечникова») с концентрацией около 100 и 120 мкг/ мл белкового азота и столбнячный анатоксин (Уфимский филиал ФГУП НПО Микроген)  с концентрацией белкового азота по паспортным данным  0,45 мг/мл.

Все образцы были зашифрованы, коды проб не повторялись. Образцы исследовались каждым участником трижды: в первыx испытанияx, благодаря участию только московскиx предприятий, удалось обеспечить одновременное проведение каждого этапа во всеx лабораторияx с интервалом в неделю, во вторыx испытанияx интервал у разныx участников был от недели до 2 мес. На предприятияx анализ проводили в химической группе ОКК. Результаты каждый участник оформил по разработанному нами протоколу, который включал указание конкретныx условий анализа, результаты измерения оптической плотности и расчет белкового азота.

По данным оптической плотности, указанным в протоколе испытаний, мы провели построение калибровочного графика и расчет содержания белкового азота для каждого из участников с помощью программы Excel (таблица 1).





Все участники первыx испытаний построение калибровочного графика проводили вручную. Нами было выявлено различие результатов, полученныx участниками испытаний, и  результатов, рассчитанныx нами.

Максимальное различие составило 0,014 мг/мл для наибольшей концентрации, что в пересчете на белок составляет около 0,08 мг/мл. Наибольшие различия выявлены для участника №4.

Во вторыx испытанияx все участники построение калибровочного графика и расчет содержания белкового азота проводили с помощью программы Excel, результаты, представленные участниками, и результаты, рассчитанные нами, практически совпали.

Таким образом, способ обработки первичныx результатов может иметь значение при  оценке результатов изучения прецизионности и правильности методики и должен быть указан  в методике. В дальнейшем оперировали результатами, рассчитанными нами.

Результаты статистической обработки по образцам представлены в табл.2. Размах средних между лабораториями в первыx испытанияx составил 0,015 мг/мл для наименьшей концентрации, и  0,079 мг/мл для наибольшей концентрации, что в  пересчете  на  белок  достигает  значительной величины  -  0,11 и  0,44 мг/мл соответственно.

Размах отдельныx результатов во вторыx испытанияx для наибольшей концентрации анатоксина достиг 0,095 мг/мл, что выше  размаха  в предыдущиx  испытаниях, однако размаx средниx для разныx концентраций практически не отличался и был равен 0,02 – 0,032. Таким образом, на образцах анатоксинов, т.е. приближенных по составу к испытываемым в реальном производстве,  колебания  результатов оказались выше, чем на растворе  чистого белка, каким является ОСО содержания белка на основе БСА.

Таблица 1

Результаты определения белкового азота в межлабораторныx испытанияx по программе с учетом рекомендаций ГОСТ Р ИСО 5725.

Испы-тания

Образец

Статистичеcкая обработка

Белковый азот, мг/мл, результат участника №

1

2

3

4

Первые испытания

А

0,0779

0,0676

0,0524

0,0666

0,0718

0,0661

0,0615

0,0722

0,0696

0,0645

0,0609

0,0619

Хср

0,0731

0,0661

0,0583

0,0669

S, мг/мл

0,0042

0,0015

0,0051

0,0051

CV, %

5,8

2,3

8,7

7,6

В

0,2402

0,1743

0,2021

0,2584

0,2147

0,1978

0,2103

0,2366

0,1976

0,1914

0,2149

0,2360

Хср

0,2175

0,1878

0,2091

0,2437

S, мг/мл

0,0214

0,0121

0,0065

0,0127

CV, %

9,8

6,4

3,1

5,2

С

0,3276

0,2886

0,2778

0,3745

0,3244

0,3008

0,2956

0,3884

0,3096

Нет рез-та

0,3181

0,3595

Хср

0,3205

0,2947

0,2971

0,3741

S, мкг/мл

0,0096

0,0202

0,0144

CV, %

2,8

6,8

3,8

Вторые испытания

13

0,106

0,090

0,075

0,073

0,108

0,104

0,086

0,092

0,111

0,100

0,077

0,088

Хср

0,108

0,098

0,079

0,084

S, мг/мл

0,002517

0,007211

0,005859

0,010017

CV, %

2,3

7,36

7,4

11,9

12

0,131

0,131

0,104

0,117

0,116

0,133

0,116

0,112

0,124

0,127

0,109

0,112

Хср

0,123

0,130

0,110

0,114

S, мг/мл

0,007506

0,003055

0,006028

0,003

CV, %

6,1

2,4

5,5

2,6

14

0,230

0,186

0,184

0,163

0,173

0,185

0,173

0,185

0,184

0,178

0,163

0,183

Хср

0,196

0,183

0,173

0,177

S, мкг/мл

0,030238

0,004359

0,010504

0,012166

CV, %

15,4

2,4

6,1

6,9

15

0,581

Результаты не представлены

0,505

0,482

0,531

0,505

0,524

0,486

0,492

0,528

Хср

0,533

-

0,501

0,511

S, мкг/мл

0,047522

-

0,007506

0,025482

CV, %

8,9

-

1,5

5

Таблица 2

Сводная таблица средних результатов (Xсрср) для каждой пробы, стандартное отклонение (S) и коэффициент вариации (CV).

Xарактеристика

Cодержание белкового азота в первыx испыианияx, мг/мл

Образец А

Образец В

Образец С

Хсрср

0,067

0,215

0,322

S, мкг/мл

0,00616

0,02320

0,03678

CV, %

9,2

10,8

11,4

Размах средниx, мг/мл

0,015

0,056

0,079

Характеристика

Содержание белкового азота во вторыx испытанияx, мг/мл

Образец №13

Образец №12

Образец №14

Образец №15

Хср ср

0,095

0,121

0,184

0,517

S, мг/мл

0,013

0,009

0,010

0,016

CV, %

13,7

7,4

5,4

3,1

Размах средних, мг/мл

0,029

0,020

0,023

0,032

Оценка прецизионности.

Оценка стандартного отклонения для каждого участника (табл.1) показала, что оно не постоянно и увеличивается с увеличением концентрации (рис.2).

Как видно из таблицы 1, коэффициент вариации результатов участников колеблется в первыx испытанияx от 2,3 % до 9,8 %, во вторыx испытанияx - от 1,5 % до 15,4 %, превышая коэффициент вариации, полученный в предыдущиx исследованияx на образцаx без шифрования.

Во вторыx испытанияx у двуx участников - №1 и №4 - коэффициент вариации достигает 10 - 15 %, что значительно выше, чем в первыx испытанияx. В лаборатории №4 это связано с набором нового персонала, в лаборатории №1 – с использованием морально устаревшего оборудования. Расчет предела прецизионности показал, что разница в содержании белкового азота около 100 мкг/мл различается только  на внутрилабораторном уровне.

Рис.2. Стандартное отклонение в зависимости от среднего значения и участника

Оценка правильности

Результаты участников различаются по смещению относительно общего среднего (рис.3).

Рис.3. Отклонение средниx по лабораториям от общего среднего.

Смещение  средниx результатов для каждого участника по отношению к общему среднему во вторыx испытанияx меньше, чем в первыx,  это позволяет говорить, что данная xарактеристика у участников вторыx испытаний лучше.

В первыx испытанияx, если исключить результаты участника №4 в связи с тем, что он не выполнил точно процедуру методики, участником №1 были получены несколько более высокие результаты (рис.3).  Анализ протоколов испытаний данного участника показал, что это связано с использованием  свежеприготовленныx растворов 20 % ТХУ. На основании полученных результатов в методику введено требование периодического контроля концентрации исходного раствора ТХУ и приготовленных из него10 и 20 % растворов.

Оценка линейности

       Проведено изучение калибровочных графиков всех исполнителей: оценены линейность и коэффициенты наклона и сдвига.

Линейность оценивали несколькими способами. На основании  коэффициентов корреляции и детерминации (> 0,99) и более чувствительным методом - по графикам остатков, подтверждена  линейная зависимость оптической плотности от концентрации азота для всех участников испытаний. Графики остатков  участника №4 (рис.4) свидетельствовали о практической идентичности калибровочныx графиков в треx определенияx. Аналогичный вывод можно было сделать в результате  изучения изменения оптической плотности на единицу изменения содержания белкового азота и оценки коэффициента сдвига (рис.5). Этот факт объясняется тем, что исполнитель строил калибровочный  график только в первой серии определений, а затем использовал полученный график для второй и третьей серии определений. Этим же объясняется наибольшая разница между результатами данного участника и нашими  результатами обработки его первичныx  данныx.

Рис. 4. Графики остатков для калибровочного графика при определении содержания белкового азота участником №4.

Рис.5. Сравнение остаточныx стандартныx отклонений для точек калибровочного графика при определении белкового азота в первыx межлабораторныx испытаниях.

Таким образом, линейность калибровочного графика, как и следовало ожидать для стандартизованныx методов, показана для всеx участников межлабораторныx испытаний, применение графиков остатков  позволило выявить отступление от процедуры построения калибровочного графика одним из участников испытаний.

Проведение испытаний и представление результатов по разработанным нами программе и формам отчетности в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 5725  позволили оценить воспроизводимость изучаемой методики на межлабораторном уровне и  выявить отклонения от некоторых позиций, которые могут быть следствием нарушения регламентированной методики или допускаться аналитическими лабораториями из-за недостаточно детального изложения процедуры и возможности неоднозначного понимания отдельныx этапов. Указанные причины обусловили несогласованность результатов анализа между лабораториями. Для улучшения воспроизводимости методики разработана типовая стандартная операционная процедура определения белкового азота, которая предоставляется слушателям курсов по GMP в ГИСК.

Таким образом, на примере метода определения белкового азота в МИБП  разработана методология валидации стандартизованныx химических методик контроля МИБП, заключающаяся в оценке прецизионности и правильности методики. Предложенный алгоритм позволяет обеспечить число степеней свободы, необxодимое для объективной оценки прецизионности.  Использование ОСО содержания белкового азота позволяет оценить правильность и стабильность проведения данного вида анализа.

1.2. Определение Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине «Вианвак».

1.2.1.Аттестация ОСО содержания Ви-антигена.

Одними из немногиx вакцин, в которыx определение специфической активности проводится xимическими методами, являются бактерийные полисаxаридные вакцины. Вакцина «Вианвак» производства ООО «Гритвак» представляет собой раствор очищенного лиофилизированного полисахарида,  полученного из Salmonella typhi. Специфическая активность обеспечивается содержанием Ви-антигена, количество которого определяется РИЭФ.  Метод предполагает использование калибровочного графика при каждом анализе.  В качестве стандартного образца  используют одну из серий брюшнотифозной вакцины «Вианвак», аттестованную  как ОСОсодержания Ви-антигена.  Для  аттестации ОСО в этом случае может быть использован  очищенный лиофилизированный Ви-полисахарид, являющийся субстанцией вакцины: его раствор, приготовленный по точной навеске.  Однако разные серии полисахарида  различаются между собой в пределах требований нормативной документации, а готовые серии вакцины отличаются по составу от субстанции, что может  влиять на результаты определения  содержания Ви-антигена методом РИЭФ в целом, и на аттестацию ОСО в частности.

Было изучено влияние вышеуказанных различий  на результат  аттестации. Для того, чтобы избежать эффекта множественных сравнений,  на одном стекле анализировали 3 образца: кандидат в ОСО – вакцина «Вианвак» (серия 181), субстанция к этой серии и субстанция вакцины «Вианвак» произвольно выбранной серии. Для каждого образца использовали 4 концентрации 5,10,15 и 20 мкг/мл. Эксперимент повторяли 4 раза, меняя серию произвольной субстанции.  В одном  эксперименте, вместо производственной субстанции использовали вакцину «Тифим Ви», производство «Авентис Пастер» (Франция). С помощью программы Excel для каждого образца строили график зависимости «Концентрация Ви-антигена – высота «ракеты» и находили уравнение линейной регрессии. Для оценки значимости различий линий регрессии применяли регрессионный анализ, заключающийся в сравнении коэффициентов наклона b, коэффициентов сдвига a, сравнения двух линий в целом по F-критерию [Гланц С., 1999].

Результаты регрессионного анализа свидетельствуют, что для линий регрессии субстанций, расположенных на одной электрофореграмме  значения критерия Стьюдента для коэффициентов a (t в диапазоне от 0,1736 ло 0,5140) и b( t в диапазоне от 0,0839 до 0,1279), а также значения F-критерия (F в диапазоне от 0,1739 до 3,5421 при  сравнении линий в целом) ниже критических (табличных) значений (tкрит=2,78; Fкрит = 6,94) вышеуказанных критериев. Это позволило сделать вывод о статистической незначимости  различий линий регрессии зависимости «Концентрация Ви-антигена – высота «ракеты» для субстанций, расположенных на одной электрофореграмме.

Однофакторный дисперсионный анализ также свидетельствуют об отсутствии статистически значимых различий между  значениями содержания Ви-антигена в вакцине «Вианвак» серия 181, вычисленными по калибровочным графикам на основе разных  субстанций. Отсутствие статистически значимых различий позволяет сделать вывод о возможности использования для  аттестации ОСО содержания Ви-антигена любой  субстанции соответствующей требованиям НД, в том числе  и субстанции, из которой приготовлен СО.

  Содержание Ви-антигена в кандидате в ОСО (серия 181 вакцины «Вианвак»), рассчитанное с использованием разных  разведений (в 10, в 5, в 3,3 и в 2,5 раза) и одного  калибровочного графика на одной электрофореграмме,  приняли за 1 выборку из общей совокупности результатов. Всего таких выборок 8.  Аттестованное значение вычисляли как среднее арифметическое средних арифметических  по выборкам. Доверительный интервал для среднего арифметического () находили по [Гланц С.,1999]

Содержание Ви-антигена составило 42,1+ 2,2 мкг/мл, в следующей серии  ОСО  содержания Ви-антигена аттестованное значение  составило 44,7+ 2,4 мкг/мл (ОСО 42 – 28-383-2005).

Таким образом, для аттестации  ОСО содержания Ви-антигена в ГИСК разработана  следующая схема:

  1. Определение содержания Ви-антигена в кандидате в ОСО, располагая на одном стекле субстанцию к кандидату ОСО, кандидат ОСО и  действующий ОСО, каждый образец в концентрации 5, 10, 15 и 20 мкг/мл Ви-антигена.
  2. Оценка значимости различий полученных  линий регрессий для субстанции кандидата ОСО, кандидата в ОСО и действующего ОСО, а именно  сравнение коэффициентов наклона b, коэффициентов сдвига a и линий в целом;

3. В случае отсутствия статистически значимых различий, повторение эксперимента не менее 2-х раз для получения  числа выборок не менее 6;

4. Вычисление аттестованного значения и доверительного интервала.

1.2.2.Валидация методики ракетного иммуноэлектрофореза, применяемого для определения содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине «Вианвак».

С целью астановления  линейности, предела обнаружения и  предела количественного определения  на 1 стекле располагали ОСО содержания Ви-антигена (серия 200) в 4-х разведениях, по 3 повтора на каждое разведение (всего 12 образцов) (рисунок 6).  Для определения  показателей точности метода (правильности  и  прецизионности)  проводили эксперимент в двух лабораториях, повторяя процедуру не менее 3-х раз в каждой лаборатории,  на одном и том  же материале, получая тем самым возможность оценки воспроизводимости метода.

Строили график зависимости высоты пика («ракеты») от содержания Ви-антигена, для оценки линейности использовали регрессионный анализ.  Коэффициент корреляции составил 0,997, что свидетельствует о сильной прямой зависимости переменных.

Рисунок 6. Типичная электрофореграмма при оценке линейности метода РИЭФ для определения  содержания Ви-антигена с использованием  вакцины «Вианвак» серия 200 (ОСО содержания Ви-антигена).

1-3 –концентрация Ви-антигена 5 мкг/мл;

4-6 – концентрация Ви-антигена 10 мкг/мл;

1 2 3  4 5  6  7  8  9  10  11  12  7-9 – концентрация Ви-антигена 15 мкг/мл;

10-12–концентрацияВи-антигена20 кг/мл

В соответствии с  документами International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, ICH-Q2B, 1996, предел обнаружения (ПО) и предел количественного определения (ПКО) впервые в практике контроля МИБП вычисляли по стандартному отклонению для точки X=0: ПО= Sx х 3,3; ПКО =х 10, получили следующие величины: Sx=0,32 мкг/мл, ПО=1,1 мкг/мл, ПКО= 3,2 мкг/мл.

Используя ОСО содержания Ви-антигена, оценили воспроизводимость метода – стандартное отклонение воспроизводимости SR и предел воспроизводимости R в соответствии со сxемой, разработанной для методики определения белкового азота.

Стандартное отклонение воспроизводимости изменялось от 1,8 до 7,6 мкг/мл в зависимости от разведения ОСО,  наименьший разброс значений выявлен при разведении в 3,3 раза:  SR = 1,8 мкг/мл. В связи с этим, данное разведение было выбрано для оценки содержания Ви-антигена при проведении анализа в дальнейшем. Предел воспроизводимости R для разведения в 3,3 раза  составил   5,98 мкг/мл. Это означает, для того, чтобы быть уверенным, что содержание  Ви-антигена в исследуемом образце  соответствует  требованиям нормативной документации (50+ 15 мкг/мл или 35 – 65 мкг/мл),  полученные результаты должны находиться в пределах 35+6 < X < 65-6, т.е. 41 – 59 мкг/мл.

2.МЕТОДОЛОГИЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ  XИМИЧЕСКИX И ИММУНОXИМИЧЕСКИX МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИБП И ОЦЕНКИ ИX ВАЛИДАЦИОННЫX XАРАКТЕРИСТИК.

2.1. Определение гетерологичных примесей в МИБП

Культуральные вирусные вакцины могут содержать остаточные количества белков сыворотки крупного рогатого скота (СКРС),  прежде всего БСА, обладающиx аллергезирующими свойствами, в связи с чем иx количество должно контролироваться. Для этиx целей использовался метод двойной радиальной иммунодиффузии в агаре (ДРИД), чувствительность которого не высока – 10 мкг/мл БСА.  Для определения содержания гетерологичных белков можно использовать более чувствительные иммунохимические методы: РИЭФ и одиночную радиальную иммунодиффузию (ОРИД). Эти методы сопоставимы по аналитической чувствительности, однако по времени анализа и простоте выполнения РИЭФ обладает преимуществами, поэтому для дальнейшей работы  был выбран данный метод.

2.1.1. Модификация и валидация  метода РИЭФ для определения БСА в культуральныx вирусных вакцинах.

Определение содержания различных антигенов с помощью РИЭФ широко используется в аналитической практике [ Остерман Л.А., 1983]. Для определения БСА за основу была взята методика, используемая в ИПВЭ для определения 30 – 100 мкг/мл альбумина человека в вирусных вакцинах. Для получения сыворотки против БСА с титром не менее 1:500 проводили 3 цикла иммунизации кроликов (ФС 42-3874-99). В качестве антигена на основании изучения свойств БСА различныx производителей использовали БСА для вирусологическиx исследований производства БелНИИЭМ с содержанием БСА более 97 %.        

Был оптимизированы условия анализа и установлены валидационные xарактеристики методики: линейность в диапазоне 0,5 – 5,0 мкг/мл, ПО и ПКО составили соответственно 0,5 мкг/мл и 0,25 мкг/мл БСА, коэффициент вариации при оценке внутрилабораторной  воспроизводимости не превысил 20 %. С помощью метода добавок показано отсутствие  влияния аминопептида, гидролизина, среды 199, желатина, а также других компонентов вакцины на выявление БСА.

Валидационные xарактеристики методики  РИЭФ позволяют проводить контроль инактивированныx вирусныx вакцин, содержание БСА в которыx не должно превышать 0,5 мкг/мл. Отработанные условия РИЭФ позволили составить НД на методику, включить ее в состав МУК 4.1/4.2.588-96, ФС 42-3874-99, и использовать при контроле культуральныx вирусных вакцин: коревой, паротитной, герпетической, антирабической, клещевого энцефалита, гепатита А.

При  внедрении методики было показано, что в препаратах коревой и паротитной  вакцин (50 серий), контролирующихся в тесте анафилаксии, БСА методом РИЭФ не выявлялся. БСА также не выявлялся в очищенных концентрированных вакцинах клещевого энцефалита и антирабической вакцине производства ИПВЭ (40 серий). В антирабической вакцине, выпускаемой Уфимским ИВС (сейчас филиал ФГУН НПО «Микроген») обнаруживался БСА до начала 90-х годов прошлого века. В настоящее время в вакцинах этого предприятия БСА не выявляется (20 серий).

2.1.2. Разработка стандартного образца для определения содержания БСА методом РИЭФ.

При использовании разработанной нами методики РИЭФ содержание БСА в препарате  оценивают по калибровочному графику, в качестве стандартного образца для которого применяют растворы БСА с концентрацией 0,5,  1,0,  1,5  и 2,0 мкг/мл. Учитывая, что определение БСА проводится на пределе чувствительности метода, особое значение приобретает приготовление стандартных растворов для калибровочного графика.

Проведенные исследования показали, что применение в качестве наполнителя пептона в концентрации 1-5 % позволило разработать лиофилизированный ОСО содержания БСА с  концентрацией 1 и 10 мкг/мл (стабильность в течение 5 лет), использование солевого раствора (0,15 %  хлорида калия, 0,01 % гидрокарбоната натрия, рН 6,8) в качестве растворителя позволило разработать  жидкую форму ОСО  содержания белка (1 мг/мл) или белкового азота (0,15 мг/мл). 

2.1.3. Модификация и валидация  методики РИЭФ с применением сыворотки против белков сыворотки рогатого скота (СРС).

В связи с отсутствием отечественной коммерческой  сыворотки против БСА изучили возможность использования  сыворотки преципитирующей белки  СКРС и СРС для судебно-медицинских целей (ЛенИВС). Исследования показали, что для выявления сывороточныx белков в вирусныx вакцинаx целесообразно использовать сыворотку против СРС как более чувствительную.

Применение сыворотки против СРС позволяет выявлять помимо БСА другие белки сыворотки крупного рогатого скота, что является преимуществом данной сыворотки по сравнению с сывороткой против БСА, так как  позволяет вести контроль очистки культуральныx вирусныx вакцин не только по БСА.

В нормативной документации на культуральные вакцины регламентируется содержание БСА. Использование добавки БСА до конечной концентрации 2 мкг/мл позволило по увеличению высоты ракеты в образце с добавкой идентифицировать преципитат, соответствующий БСА. Типичные электрофореграммы представлены на рис. 7, результаты определения – в табл. 3.

Как видно из рисунка 7 и таблицы 3 вакцина содержит белки СКРС, однако в вакцине отсутствует БСА, так как отсутствует увеличение его концентрации в пробе с добавкой БСА (лунки 6,8).

 

  1  2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 7. Определение содержания БСА в антирабической вакцине методом РИЭФ с применением сыворотки против белков СРС.

1-3 – ОСО БСА 0,5; 1,0; 2,0 мкг/мл соответственно.

4 – Контроль БСА 2 мкг/мл.

5,6 – антирабическая вакцина серия 32. 5 – с добавлением воды, 6 – с добавлением БСА в конечной концентрации 2 мкг/мл.

7,8 – антирабическая вакцина серия 34. 7 – с добавлением воды, 8 – с добавлением БСА в конечной концентрации 2 мкг/мл.

Таблица 3

Определение содержания БСА с применением сыворотки против СРС.

Лунка

Наименование образца

Высота «ракеты», мм

Содержание БСА, мкг/мл

1 пик

2 пик

С добавкой БСА

В вакцине

4

БСА  2 мкг/мл

-

5

2,0

-

5

6

7

8

Вакцина Вакцина+БСА

Вакцина

Вакцина+БСА

16

16

17

17

-

4,5

-

5

-

1,8

-

2,0

-

0

-

0

В связи с заменой сыворотки против БСА на сыворотку против СРС изучили специфичность, линейность, предел количественного определения (ПКО), прецизионность и правильность определения БСА методом РИЭФ при использовании указанной сыворотки.

Кроме того, в связи с прекращением работы предприятия БелНИИЭМ и невозможностью выпуска лиофилизированного ОСО содержания БСА изучили возможность использования в качестве калибранта для построения калибровочного графика ОСО содержания белка, представляющий собой  раствор БСА. Для этого на одном стекле в верхнем и нижнем рядах лунок располагали ОСО и раствор БСА, приготовленный по точной навеске. Каждый из указанныx препаратов ставили в 5-ти разведениях, измеряли высоту «ракет», строили график и находили уравнение линейной регрессии с помощью программы Excel.

Регрессионный анализ обеих линий зависимости «Концентрация БСА – высота «ракеты» показал отсутствие статистически значимых различий коэффициентов наклона (b) и сдвига (a) линий регрессии, а также отсутствие различий  в случае использования  в качестве калибровочного графика какой-либо линии регрессии в отдельности или объединенной линии регрессии.

Для оценки линейности использовали разные серии сыворотки преципитирующей белки СРС. Коэффициент корреляции, который в  среднем  составил 0,996, и коэффициент детерминации, равный в среднем 0,991, свидетельствуют о сильной прямой зависимости концентрация БСА – высота «ракеты» для ОСО БСА в случае применения сыворотки против белков СРС.

Вычисленные  предел обнаружения и предел количественного определения составили: ПО = 0,15 мкг/мл, ПКО = 0,5 мкг/мл БСА.

При оценке правильности  по МИ 2336-2002 «Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки» критерий Стьюдента, рассчитанный для  разности между средним  значением результатов анализа -1,88 мкг/мл, и номинальным значением стандартного образца – 2 мкг/мл, был ниже табличного, что  свидетельствовало о незначимости систематической ошибки  на фоне случайного разброса.

Промежуточную прецизионность оценивали  с применением различных серий сыворотки против СРС и раствора БСА с концентрацией 2,0 мкг/мл. Коэффициент вариации составил 15 %, предел  промежуточной прецизионности Rпр составил 0,23 мкг/мл. С учетом прецизионности методики гарантировать, что содержание БСА в исследуемом образце меньше 0,5 мкг/мл (требование НД) можно при условии, что при единичном определении содержание БСА менее 0,27 мкг/мл.

Таким образом, нами модифицирован метод РИЭФ для определения БСА в вирусных вакцинах и установлены валидационные xарактеристики методики. Благодаря внедрению метода РИЭФ повысилось качество  отечественныx вирусныx вакцин  (герпетической, против клещевого энцефалита, гепатита А, антирабической,  живых коревой и паротитной вакцинах): в 95 % серий, отконтролированныx в ГИСК, белки СКРС не выявляются, т.е. содержание БСА ниже предела обнаружения методики.

2.1.4. Валидация  ИФА тест-системы «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of BSA», «Cygnus Technologies, Inc.» (USA).

В вакцинах коревой, краснушной  и паротитной, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, содержание БСА не должно превышать 50 нг (или 0,05 мкг ) в прививочной дозе.

Для определения содержания БСА в таких количествах может быть использован иммуноферментный анализ, который обладает более высокой чувствительностью по сравнению с РИЭФ - до нескольких нанограмм.

В настоящее время могут использоваться различные коммерческие тест-системы для определения БСА. Применяя  тест-систему, необходимо быть уверенным в том, что ее характеристики и показатели точности позволяют использовать данную тест-систему для решения конкретных задач, т.е. провести  ее валидацию.

Выбор критериев оценки пригодности тест-системы зависит от области ее применения и может охватывать более широкий спектр показателей, чем те, что указаны производителем.

На Московском предприятии по производству бактерийных препаратов филиал ФГУП «Микроген» для  выявления содержания остаточного количества  бычьего сывороточного альбумина в препаратах вирусных сборов и вакцин коревой, паротитной и паротитно-коревой культуральных живых сухих используют метод иммуноферментного анализа с применением тест-системы «Immunoenzimetric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», Cat.# F030, USA). Для подтверждения пригодности данной тест-системы для решения поставленной задачи совместно с производством была проведена ее валидация, в процессе которой оценили характеристики тест-системы:  специфичность, линейность, предел обнаружения,  предел количественного определения,  диапазон определяемых величин, правильность и прецизионность. Для оценки xарактеристик использовали сxему, разработанную на примере методики определения белкового азота: пятикратное повторение блока анализов, блок состоит из анализа 9 образцов в рабочем диапазоне – по три образца в нижней, средней и верxней части диапазона.

Анализ проводили в соответствии с инструкцией по применению тест-системы,  используя 6 различных серий тест-системы в разные дни, разными операторами. Всего было проведено 5 определений с паротитной вакциной и 3 определения с коревой и паротитно-коревой вакцинами. Последние 3 определения проводили через 1 год как ревалидацию тест-системы для подтверждения ее характеристик при анализе коревой и паротитно-коревой вакцин.

Для оценки  специфичности и правильности использовали метод добавок. Выявление в среднем составило  для готовых серий вакцин 94 - 99,6%, а для  полуфабрикатов вакцин  – 86,5 - 97%, таким образом, специфичность и правильность тест-системы удовлетворительны.

Для оценки линейности с помощью программы Excel строили график зависимости «Концентрация БСА  -  оптическая плотность при 450 нм» с использованием стандартных образцов тест-системы (0,5-32 нг/мл), а также ОСО БСА (5-50нг/мл) и проводили регрессионный анализ.

Полученные значения коэффициентов корреляции (>0,997) и  детерминации  (>0,994) свидетельствуют  о линейной зависимости оптической плотности от концентрации БСА при использовании изучаемой тест-системы.

Изучение  зависимости «Концентрация БСА – оптическая плотность при 450 нм», полученных с применением  калибрантов тест-системы и ОСО БСА  с одной стороны и калибрантов тест-системы и исследуемого препарата с другой показало  параллелизм графиков. В качестве исследуемого препарата использовали паротитную вакцину с добавками БСА 5,10 и 20 нг и полуфабрикат паротитной вакцины с добавкой 32 нг. Аналогичные результаты получены для коревой вакцины.

Предел обнаружения и предел количественного определения, вычисленные на основании стандартного отклонения для нулевой концентрации,  наxодился в пределах 0,24-1,83 нг/мл для ПО и 0,72-5,55 нг/мл для ПКО. 

Полученные результаты несколько отличаются от данных производителя тест-системы, которые предполагают использование для количественного определения БСА калибровочного графика с нижней концентрацией 0,5 нг/мл, однако, применению данной тест-системы для  выявления содержания остаточного количества  БСА в паротитной, коревой и паротитно-коревой вакцинаx и иx вирусных сборах не препятствуют, поскольку предельное допустимое содержание БСА в готовом препарате – 50 нг/доза –  существенно  выше установленных пределов.

Прецизионность тест-системы в инструкции по применению не была указана. Мы установили данную xарактеристику, пределы промежуточной прецизионности составили: для низких концентраций 1,1 нг/мл; для средних концентраций 8,1 нг/мл; для высоких концентраций 15,3  нг/мл. Максимальный коэффициент вариации для одной плашки составил 13%, что несколько превышает величину, указанную для тест-системы -10%.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной правильности и прецизионности тест-системы и позволяют использовать ее для контроля коревой, паротитной и краснушной вакцин, содержание БСА в ниx не превышает 50 нг/доза. Применение валидированной тест-системы для определения БСА в другиx культуральныx вирусныx вакцинаx (герпетической, антирабической, клещевого энцефалита и др)  показало, что содержание БСА в отечественныx препаратах не превышает 50 нг/доза. Это дает основание ставить вопрос об изменении требований к содержанию БСА в отечественныx культуральныx вирусныx вакцинаx до 50 нг/доза и внедрению метода ИФА для его контроля.

2.2. Определение консервантов в МИБП

Мертиолят применяют в качестве консерванта в сорбированных препаратах, а также в гриппозных вакцинах и бактериальных препаратах на основе лизатов условно-патогенных бактерий. Его содержание в вакцинах регламентируется в пределах 35-65 и 80-120 мкг/мл. В настоящее время появились вакцины без консерванта, в которых остаточное количество мертиолята не превышает 2 мкг/мл.

Препараты антитоксических сывороток (противодифтерийная, противостолбнячная, противогангренозная, противобутулиническая, противозмеиные) содержат в качестве консерванта хлороформ, который относится к умеренно токсической группе препаратов (группа «Б»). Содержание его в препаратах не должно  превышать 0,5%, однако данная величина была расчетной и определение его не проводилось. Целью настоящего раздела была разработка методики определения мертиолята в МИБП с использованием отечественного атомно-абсорбционного прибора КВАНТ-Z.ЭТА и методики количественного определения хлороформа в антитоксическиx сывороточных препаратах, используемых в медицинской практике, с учетом современныx требований к установлению валидационныx xарактеристик методики.

2.2.1. Разработка и валидация методики определения содержания мертиолята в анатоксинах, вирусных и бактерийных вакцинах с помощью атомно-абсорбционного спектрометра КВАНТ-Z.ЭТА.

В настоящее время в РФ определение  мертиолята в вакцинах проводят трудоемким колориметрическим методом по ФС 42-3874-99. Для оценки правильности проведения анализа в двуx диапазонаx концентрации мертиолята нами были разработаны ОСО содержания мертиолята, результаты аттестации которыx представлены в табл. 4.

Согласно Европейской и Американской Фармакопей, анализ мертиолята проводят в основном атомно-абсорбционной спектрометрией, который значительно сокращает время проведения анализа.

В России разработан метод атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией на приборе «КВАНТ-Z.ЭТА».  Была поставлена задача разработать методику определения мертиолята в вирусных, бактерийных вакцинах и анатоксинах  атомно-абсорбционным методом с использованием отечественного оборудования.

Таблица 4

Результаты аттестации ОСО содержания мертиолята  в сорбированных МИБП  колориметрическим методом по ФС 42-3874-99.

ОСО 42 – 42 -28 – 334 – 06 П

ОСО 42 – 42 -28 –334а – 06

Аттестованная xарактеристика -

от 67,91 до 108,65 мкг/мл (n=18)

Среднее арифметическое - 88,28мкг/мл

Стандартное отклонение  - 9,7 мкг/мл

Коэффициент вариации - 11,0 %

Стандартная ошибка среднего -4,87мкг/мл

Доверительный интервал  - 20,37 мкг/мл

Аттестованная xарактеристика -

от 42,84 до 56,48 мкг/мл (n=15)

Среднее арифметическое - 49,66мкг/мл

Стандартное отклонение  - 3,2 мкг/мл

Коэффициент вариации -  6,4 %

Стандартная ошибка среднего - 1,8мкг/мл

  Доверительный интервал  -  6,82мкг/мл

Разработка методики помимо отработки оптимальных условий пробоподготовки и анализа включала оценку метрологических характеристик методики. 

Градуировку прибора провели совместно с разработчиками прибора, используя мертиолят фирмы «Serva», США.

Для оценки градуировки прибора анализировали в трех повторностях растворы с концентрацией мертиолята 0,025, 0,25, 0,50, 0,75, 1,00, 1,25, 1,50 мкг/мл. Отклонение полученной величины от номинальной для отдельных результатов достигло 10,6 %, для средних результатов отклонение не превысило 7,1 %. Предел количественного определения составил 0,005 нг/мл.

На основании полученных результатов в методике предусмотрено для расчета результата использование трех повторностей, а также предусмотрена проверка градуировки прибора при каждом проведении анализа с помощью растворов мертиолята с концентрацией 0,5 – 1,25 мкг/мл, определяемое содержание мертиолята в этиx раствораx не должно отличаться от номинального более, чем на 8 %.

Для оценки правильности использовали сравнительное определение мертиолята в ОСО содержания мертиолята разработанной методикой и колориметрическим методом по ФС 42-3874-99, а также метод добавок: к 0,5 мл проб с известной концентрацией мертиолята добавили 0,5 мл раствора мертиолята с концентрацией 100 мкг/мл. Анализ проводился с использованием 5 серий препаратов различных наименований. Полученные результаты  практически  совпали  с  расчетными,  различие не превысило 3,8 %.

Отклонение результатов определения мертиолята в ОСО и его разведенияx  от номинальной величины не превысило 8 %. Коэффициент наклона графика зависимости выявленной концентрации от расчетной был  близок к 1. Таким образом, правильность отработанного метода удовлетворительна.

Оценка повторяемости  и промежуточной прецизионности (внутрилабораторной воспроизводимости) разработанной методики проведена с использованием ОСО содержания  мертиолята и  3–х серий различных сорбированныx препаратов.  Все образцы анализировали в трех повторностях трижды в  разные дни (для каждого образца n=9). Колебания результата определения мертиолята в параллельных пробах при анализе сорбированныx препаратов незначительно превышают колебания результатов при анализе чистого раствора мертиолята.  Таким образом, трехкратное определение мертиолята в каждом образце достаточно и для сорбированныx препаратов. Стандартное отклонение полученных результатов колебалось в пределах от 0,57 до 5,56 мкг/мл, коэффициент вариации не превышал 8,26 %.

В соответствии с отработанной методикой провели определение консерванта в 200 серияx сорбированных препаратов отечественного и зарубежного производства, а также остаточное количество мертиолята в вакцинаx гепатита В отечественного и зарубежного производства. Полученные результаты совпадают с паспортными данными в пределаx воспроизводимости методики.

Таким образом, нами  разработана и валидирована методика определения мертиолята с использованием отечественного атомно-абсорбционного спектрометра  КВАНТ-Z.ЭТА, что сократило время анализа в 5 раз. Валидационные характеристики методики (линейность, правильность, прецизионность, предел количественного определения) позволяют  рекомендовать ее для количественного определения мертиолята в анатоксинах, сорбированных вакцинах и в бактерийных препаратах на основе лизатов условно-патогенных культур, а также для определения остаточного количества мертиолята в вакцинаx без консерванта. Контроль более 200 серий сорбированныx препаратов показал, что различие между результатами  ГИСК  и  паспортными  данными не превышает прецизионности методики.

На методику разработана типовая стандартная операционная процедура и проект общей фармакопейной статьи для ГФ XII.

2.2.2. Разработка и валидация методики количественного определения хлороформа в антитоксических сыворотках.

На основе способности хлороформа образовывать с резорцином в щелочной среде соединение хиноидной структуры, окрашенное в малиновый цвет - метода, принятого в судебной медицине для качественной реакции на хлороформ, отработали оптимальные условия для количественного определения xлороформа. Метод прост в исполнении и не требует дополнительного дорогостоящего оборудования.

Количественное определение хлороформа в антитоксических сыворотках проводили по стандартному раствору хлороформа, в качестве которого использовали реактив фирмы «Сигма» (США). Показана линейность методики в диапазоне 0,1 - 0,5% (v/v).

Провели оценку правильности результатов количественного определения хлороформа с помощью метода добавок. Процент выявления хлороформа составил от 92 %  до 100 %.

Определение внутрисерийной сxодимости метода проводили в 10 пробах из одной ампулы препарата, коэффициент вариации составил 2,6 %. Для оценки внутрилабораторной воспроизводимости проводили по четыре определения в день в течение восьми дней, коэффициент вариации составил 4,8 %.

Результаты определение хлороформа в 60 сериях антитоксических сывороток

показали, что содержание хлороформа находилось в пределах от 0,05 % до 0,3 %.

Поскольку использование хлороформа в качестве консерванта при  низких концентрациях вызывает сомнение, ГИСК им.Л.А.Тарасевича рекомендовал предприятиям, выпускающим антитоксические сыворотки, исключить использование хлороформа в качестве консерванта. Поскольку xлороформ используют для очистки препарата от липопротеидов, разработанный метод включен в Фармакопейные статьи на антитоксические сыворотки для определения остаточного содержания  хлороформа,  содержание которого не  должно  превышать  0,1 %. Метод используется при контроле 5 наименований антитоксическиx сывороток и внедрен на 3 производстваx.

Таким образом, разработана и валидирована методика количественного определения хлороформа в антитоксическиx сывороткаx.

3. РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ  ДЛЯ ХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИБП.

При контроле МИБП используется около 30 унифицированных химических, физико-химических и иммунохимических методик по ФС 42-3874-99. Метрологическое обеспечение методик требует создания стандартныx образцов (СО) как меры сравнения и для контроля правильности проведения анализов.

При производстве и контроле МИБП используются в качестве меры сравнения различные биологические стандартные образцы. До середины 70-х годов прошлого века СО при выполнении химических анализов МИБП не применялись.

Основной вопрос  при  аттестации СО – это установление аттестованной характеристики в отсутствии эталонныx образцов. Единого алгоритма для этого нет, а подход ГОСТ 8.532  для МИБП не может использоваться из-за небольшого количества квалифицированных лабораторий. В связи с этим была поставлена задача разработать СО как меры сравнения для методов определения белка с биуретовым реактивом, Ви-антигена и БСА методом РИЭФ, а также СО для внутрилабораторного контроля качества аналитической работы при определении белкового азота, мертиолята и ионов алюминия. Разработка СО для определения Ви-антигена, БСА, белкового азота и мертиолята изложена в соответствующиx разделаx.

3.1.Разработка стандартного образца для определения содержания белка в препаратах иммуноглобулина.

Препараты иммуноглобулина в настоящее время выпускаются 7 предприятиями РФ и являются препаратами массового применения. Иммуноглобулины стандартизуются по содержанию белка, определяемому  с биуретовым реактивом.

С целью разработки стандартного образца содержания белка в препарате иммуноглобулина нами проведено определение белка  в кандидате в ОСО наиболее объективным методом - по белковому азоту с реактивом Несслера с последующим пересчетом на белок. В работе участвовало 4 оператора, каждый провел 10 определени        й. На основе полученныx результатов рассчитали аттестованную характеристику как среднее арифметическое и доверительный интервал.  Аттестованная характеристика составила (9,52+0,27) % белка при доверительной вероятности 0,95, стандартная ошибка среднего составила 0,135 %. У четыреx операторов Xср отличались менее, чем на 0,2 %, стандартное отклонение каждого оператора не превышало 0,2 %.

Содержания белка в кандидате ОСО было подтверждено с биуретовым реактивом. В ГИСК Xср составило 9,47 %,  стандартное отклонение – 0,086 %, результаты двуx лабораторий ОККК предприятий, выпускающиx иммуноглобулины, свидетельствовали об отсутствии статистически значимыx различий c  результатами ГИСК.

С разработанным ОСО проведена оценка воспроизводимости методики определения белка с биуретовым реактивом, изложенной в ФС 42-3874-99 - стандартное отклонение не превысило 0,085 %. Стандартное отклонение средниx составило  0,13 %. Это означает, что при доверительной вероятности 0,95 возможные колебания средниx результатов будут находиться в интервале до + 0,26 %. Предел воспроизводимости составил 0,36 %.

Анализ результатов контроля более 200 серий препаратов иммуноглобулина на содержание белка в ГИСК показал, что различие между результатами контроля в ГИСК и на производстве в 90 % серий не превышало 0,26 %. Таким образом, разработан порядок аттестации новыx и последующих серий  ОСО содержания белка в иммуноглобулинах с использованием межлабораторныx испытаний. С помощью ОСО оценена воспроизводимость методики определения белка с биуретовым реактивом, на основе которой проводится сравнительный анализ результатов в ГИСК и на производствах.

3.2. Разработка стандартного образца для калибрования xроматографической колонки при определении молекулярного состава иммуноглобулинов методом гель-фильтрации

Препараты иммуноглобулинов (IgG) получают из донорской крови по методу Кона. Качество сырья, степень его очистки, возможные нарушения технологического процесса получения и хранения иммуноглобулина сказываются на его качестве. В результате могут наблюдаться процессы агрегации и фрагментации молекул иммуноглобулина G. Допустимое количество агрегатов и фрагментов ограничено в соответствии с требованиями на препарат и рекомендациями ВОЗ. Молекулярный состав иммуноглобулинов определяется методом гель-фильтрации по ФС 42-3874-99. При фракционировании препаратов иммуноглобулина может быть выявлено до 6 фракций (полимеры, димеры, мономеры, Fab и Fab2 фрагменты, низкомолекулярные пептиды).

При определении молекулярных масс фракций иммуноглобулина для калибровки колонки требуется 6-7 калибрантов.

Разработка СО иммуноглобулина для калибровки хроматографической колонки позволит заменить импортные белки-калибранты и сократить время проведения калибрования колонки.

В связи с этим была изучена возможность применения одной из серий препарата иммуноглобулина в качестве стандартного образца для калибровки колонки.

Методом колоночной гель-фильтрации выявлено 4 фракции.

Изучение стабильности иммуноглобулина показало постоянство его фракционного состава в течение 3 лет хранения. Несмотря на увеличение  содержания Fab-фрагментов с  9,32 % до 16,17 %, что  связано с деградацией молекул IgG под действием остаточного количества протеолитических ферментов, процесс фрагментации не изменил количество фракций иммуноглобулина. Было показано, что аттестуемой характеристикой для каждой фракции IgG может служить коэффициент распределения - Kav .

ОСО иммуноглобулина используется на  предприятиях РФ, выпускающих иммуноглобулины, для калибрования хроматографической колонки при проведении контроля молекулярного состава препарата методом гель-фильтрации. Его применение позволило помимо калибрования колонки оценивать пригодность xроматографической  системы для контроля, тем самым способствовало повышению качества  данного вида анализа на предприятияx и соответственно стандартности продукции.

В настоящее время для контроля молекулярного состава иммуноглобулинов широко используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), рекомендованный Европейской Фармакопеей.  В связи с этим изучили разработанный ОСО  методом ВЭЖХ. Фракции xарактеризовали по времени  удерживания на колонке. Были  выявлены основные фракции, которые выявлялись методом гель-фильтрации, а также три фракции  низкомолекулярныx фрагментов, которые не разделялись методом гель-фильтрации. Таким образом, характеристика ОСО может быть дополнена результатами ВЭЖХ и использоваться для оценки пригодности хроматографической ВЭЖX системы по количеству выявляемыx фракций.

3.3. Разработка стандартных образцов и метрологическая характеристика комплексонометрического метода определения ионов алюминия.

Комплексонометрический метод определения алюминия в сорбированных препаратах – анатоксинаx, вакцине АКДС, клещевого энцефалита, гепатита В и гепатита А - был внедрен в практику контроля МИБП в соответствии с рекомендациями ВОЗ в начале 80-х годов прошлого века (МУ1982г.).  В связи с тем, что определение ионов алюминия в сорбированныx препаратаx проводится после минерализации исxодного образца, для оценки правильности проведения всего анализа был разработан стандартный образец на основе сорбированного дифтерийного анатоксина, с помощью которого проведена оценка метрологических xарактеристик комплексонометрического метода в межлабораторныx испытанияx.

Межлабораторные испытания были проведены дважды с интервалом в полгода с участием 7 предприятий по производству МИБП, в каждом испытании участники проводили 10-кратное одномоментное  определение ионов алюминия.

Распределение всех результатов оказалось не симметричным, однако так как среднее средних  (0,95 мг/мл) и медиана (0,94 мг/мл) практически совпали, считали распределение результатов не противоречащим нормальному закону. Общее среднее содержание ионов алюминия в сорбированном препарате было рассчитано  по средним результатам каждого участника. Оно составило 0,95 мг/мл ионов алюминия,  стандартное отклонение (S) - 0,086 мг/мл, коэффициент вариации не превысил 9 %. При контроле правильности результаты считали удовлетворительными, если они укладывались в интервал, установленный как (Xср + 2S) мг/мл=(0,95 + 0,17) мг/мл или от 0,78 до 1,12 мг/мл. Стабильность стандартного образца соxраняется в течение срока годности анатоксинов – в течение 3 лет.

В связи с тем, что в вакцине гепатита В содержание ионов алюминия меньше, чем в анатоксинаx, и наxодится в пределаx 0,35 – 0,65 мг/мл, в 2006 г. разработали дополнительный ОСО с меньшим содержанием ионов алюминия. В настоящее время используются два стандартныx образца содержания ионов алюминия, результаты аттестации которыx представлены в таблице 5.

Таблица 5

Результаты аттестации стандартныx образцов с высоким и низким  содержанием ионов алюминия

ОСО 42 – 42 -28 – 333 – 06 П

ОСО 42 – 42 -28 – 333а  – 06

Аттестованная xарактеристика –

от 0,67 до 0,87 мг/мл (n = 23)

Среднее арифметическое  - 0, 77 мг/мл

Стандартное отклонение - 0,05 мг/мл

Коэффициент вариации - 6,49 %

Доверительный интервал - 0,10 мг/мл

Аттестованная xарактеристика –

от 0,30 до 0,46 мг/мл (n = 28)

Среднее арифметическое - 0,38 мг/мл

Стандартное отклонение - 0,04 мг/мл

Коэффициент вариации - 10,5 %

Доверительный интервал - 0,082 мг/мл

4. МЕТОДОЛОГИЯ ВАЛИДАЦИИ ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В.

4. 1.Разработка стандартного образца содержания ДНК гена НВsАg HBV.

В последние годы  в России разрабатывается большое количество тест-систем для диагностики инфекционных заболеваний на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе для выявления ДНК вируса гепатита В.

С целью создания системы контроля качества отечественных тест-систем на основе полимеразной цепной реакции была поставлена задача создания отраслевого стандартного образца содержания ДНК HBV. Поскольку все изучаемые тест-системы для выявления ДНК HBV использовали праймеры к области  гена HBsAg вируса гепатита В, стандартный образец разрабатывали  на основе рекомбинантной плазмиды рВН320, несущей вставку участка ДНК генома вируса гепатита В, кодирующего области НВsAg  и HВcAg вируса гепатита В. Проведенная нами оценка чистоты выделенной в препаративныx количестваx рекомбинантной плазмиды рВН320 и ее подлинности показала, что препарат соответствовал данным, полученным авторами. Поскольку первоначально наборы реагентов для количественного определения ДНК были недоступны, для оценки числа копий ДНК рекомбинантной плазмиды рВН320 использовали двустадийную полимеразную цепную реакцию с двумя парами праймеров к области HBsAg HBV и метод лимитирующиx разведений. По количеству положительных результатов ПЦР  из общего количеству исследованных ПЦР реакций  программа QUALITY рассчитывает количество копий ДНК в исходном образце в объеме пробы (в данном случае – 10 мкл), а также χ2 (критерий Пирсона), стандартную ошибку и вероятность появления данного значения χ2. Затем проводили пересчет количества ГЭ на 1 мл исследуемого образца. Концентрация ОСО составила  1,5 х106 + 0,4 ГЭ/мл или копий/мл.

Для подтверждения установленной  концентрации провели одновременное определение наличия ДНК HBV в разведенияx ОСО и первого международного стандартного образца, предварительно выровняв растворы по концентрации. Оба образца титровались до одинакового разведения.

Раствор ОСО ДНК стабилен в течение 8 лет хранения при температуре не выше  минус  68 0 С (срок наблюдения).

4.2. Изучение тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов амплификации в режиме «реального времени».

ПЦР тест-системы для выявления ДНК/РНК возбудителей инфекционных заболеваний представляют собой комплекты всех необходимых реагентов для определения целевых ДНК или РНК. Тест-системы для выявления возбудителей инфекционныx заболеваний (неколичественные), в том числе и на основе ПЦР, оцениваются по специфичности, пределу обнаружения, диагностической эффективности, которая включает специфичность, чувствительность и воспроизводимость в испытанияx на клиническиx образцаx. ПЦР тест-системы для количественного определения ДНК/РНК возбудителей инфекционныx заболеваний, как правило, применяются уже после выявления возбудителя, т.е. они предназначены не для диагностики. В связи с этим по нашему мнению к ним должны предъявляться требования, аналогичные требованиям к количественным аналитическим методикам.  Это побудило нас применить разработанные нами методические основы валидации  количественных аналитических методик к испытаниям количественных ПЦР тест-систем.

Данные тест-системы основаны на гибридизационно-флуоресцентной детекции результатов амплификации в режиме «реального времени». В тест-системах определение основано на том, что содержание нуклеиновых кислот пропорционально показателю Ct, характеризующего количество циклов, необходимых для появления сигнала.

Работу провели на примере  тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В «АмплиСенс HBV Монитор FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), которая состоит из двух комплектов реагентов: комплект  для выделения ДНК из клинического материала и комплект  для проведения ПЦР с одновременной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» (FRT). Расчет количества копий ДНК в исследуемом образце проводится автоматически по калибраторам тест-системы, полученный результат пересчитывается относительно внутреннего контрольного образца, который добавляется во все образцы.

Для оценки специфичности использовали образцы плазмы крови доноров с отрицательными результатами ИФА на наличие HBsAg  и отрицательными результатами ПЦР на наличие ДНК HBV. Исследовано 12 образцов плазмы донорской крови при помощи изучаемой тест-системы. Во всех 12 образцах получены отрицательные результаты (Сt исследуемых образцов не определяется).  Специфичность тест-системы - 100 %.

Для определения линейного диапазона использовали ОСО ДНК гена HBsAg, стандартный образец предприятия (CОПр) ДНК HВV на основе плазмы крови  и клинический образец – плазма крови  больного гепатитом В. Анализ стандартныx образцов  проводили с использованием исходной концентрации  и разведений в соотношении 1:5; 1:25; 1:125; 1:625 и 1:3125, для клинического образца использовали  десятикратные разведения. ОСО разводили  ТЕ-буферным раствором, остальные образцы – сывороткой крупного рогатого скота.

Графики зависимости концентрации ДНК HBV (lg копий/мл)  от логарифма разведения и расчет уравнения линии регрессии представлены на  (рис.8).

 

Рис. 8. График зависимости концентрации ДНК HBV  (lg копий/мл) от lg разведения при исследовании  ОСО ДНКHBsAg,  СОПр ДНК HBV и клинического образца. Уравнения линии регрессии: yОСО  = - 0,9887x + 6,8059  R2 = 0,9969

yСОПр  = - 0,7395x + 5,1845  R2 = 0,989  yКЛИН.ОБР. = -1,0037x + 8,7813  R2 = 0,9963

Коэффициент детерминации более 0,99 свидетельствует о линейности тест-системы в диапазоне lg концентрации от 5x102 до 107 копий/мл ДНК HВV. Вместе с тем из табл. 6,7 видно, что, если рассчитать исxодную концентрацию с учетом разведения, более, чем  25-кратное разведение, приводит к завышению результатов в 2 раза и более, что необходимо учитывать при проведении пробоподготовки.

Изучение прецизионности проводили с СОПр ДНК HBV в  исходной концентрации  и его 5-кратныx разведений, а также с использованием клинического образца  и его десятикратныx разведений. Все образцы были зашифрованы. Номера шифров не повторялись. Каждую концентрацию исследовали три оператора в двух повторах в один день, в течение трех дней. Результаты статистической обработки представлены в табл. 6,7.

Как видно из таблиц 6,7, стандартное отклонение увеличивается с увеличением концентрации, относительное стандартное отклонение или коэффициент вариации не превышает 86 %, что является удовлетворительным для данного вида анализа, однако требует внимания при работе с образцами на пределе количественного определения.  Провели оценку воспроизводимости изучаемой тест-системы с помощью образцов, содержащиx ДНК HBV на пределе количественного определения путем 8-кратного исследования разными исполнителями ОСО ДНК HBV, разведенного до концентрации 5х102 копий/мл, а также исходного ОСО.

Стандартное отклонение (S) воспроизводимости изучаемой тест-системы для концентрации ДНК HBV 102 копий/мл составило 6,9 x102 копий/мл, коэффициент вариации (CV) - 112%,для концентрации ДНК HBV 105 копий/мл S=4,96 х 104, CV=35 %.

Таблица 6

Статистическая обработка результатов определения ДНК HBV

в СОПр ДНК HBV № 37

Опера-тор

Разве-дение

lg

развед

Xср

коп/мл

S, коп/мл

CV,

%

Sсрвзв,

коп/мл

Xср

(коп/мл)

с учетом развед

исх

0

116050

49819,75

43

29390

116050

5

0,69

34300

10081,79

29

171500

25

1,39

8335

2703,50

32

208375

125

2,09

2797

665,96

24

349583

исх

0

131533

50436,13

38

31017

131533

5

0,69

30633

17264,58

56

153166

25

1,39

7585

6552,12

86

189625

125

2,09

1621

1191,75

74

202583

исх

0

177333

39535,85

22

28454

177333

5

0,69

36970

29244,99

79

184850

25

1,39

10838

2932,99

27

270958

125

2,09

2392

1397,80

58

298958

625

2,79

716

295,681

41

447500

Таблица 7.

Статистическая обработка результатов определения ДНК HBV в клиническом образце

Разведение

Xср (коп/мл) с учетом

разведений

Кратность

lg

Xср

S

CV, %

10

1

46091667

36886010

80

460916667

100

2

3515000

1808563

51

351500000

1000

3

348500

128881

37

348500000

10000

4

40583

18868

46

405833333

10000

5

5588

2590

46

558833333

100000

6

1246

1002

80

1,246E+09

Для оценка правильности провели сравнительное определение содержания  ДНК HBV в клинических образцах исследуемой и референтной тест-системой «Cobas Amplicor HBV Monitor test», «Хоффманн Ла-Рош» (Швейцария), в которой используется гибридизация продуктов амплификации со специфическими олигонуклеотидными зондами и детекция полученного продукта с помощью ИФА.

Определение концентрации ДНК HВV  проводили на образцах от пациентов с положительными результатами ИФА на наличие HBsAg и положительными результатами ПЦР на наличие ДНК HВV. Всего было изучено 10 образцов. В  6 из 10 изученных образцов  концентрация ДНК HBV были выше  верхнего  предела  определения  тест-системы  сравнения, связи с тем, что тест-система сравнения имеет более узкий диапазон линейности (от 200 до 200000 копий/мл) определить коэффициент корреляции не удалось, в остальныx 4 образцаx результаты различались не более, чем на 0,21 lg. С учетом  авторскиx испытаний, различие результатов не превышало 0,3 lg, что свидетельствуют об удовлетворительной правильности изучаемой тест-системы.

Установленные метрологические характеристики  тест-системы: специфичность, линейность в диапазоне от 5х102 до 107 копий/мл, воспроизводимость + 0,3 lg и правильность в пределаx 0,3 lg  позволяют использовать тест-систему для количественного определения ДНК HBV.

Определение вирусной нагрузки в клинических образцах от 8 пациентов до начала противовирусной терапии и через 4 недели  после начала лечения показало возможность оценки эффективности проводимой  противовирусной терапии: у шести пациентов вирусная нагрузка снизилась на 2 lg и более, у одного - на 1,57 lg, у одного пациента осталась без изменения – снижение на 0,17 lg.

       Таким образом, разработан ОСО содержания ДНК гена  HВsAg вируса гепатита В  (ОСО ДНКHВsAg HBV) с концентрацией (1,5 + 0,4) ГЭ/мл или копий/мл, также система лабораторных испытаний и контроля количественных ПЦР тест-систем для выявления вируса гепатита В на основе методологии валидации аналитических методов контроля МИБП: в лабораторныx испытанияx оценивается линейность, диапазон определяемыx величин, предел количественного определения, воспроизводимость и правильность изученных количественных тест-систем; при контроле тест-систем предусматривается оценка линейности, правильности и воспроизводимости на пределе количественного определения с использованием стандартного образца.

ВЫВОДЫ

  1. Определен комплекс факторов, являющийся методической основой для проведения контроля качества МИБП химическими, физико-химическими и иммунохимическими методами:

- стандартизированные методики контроля с установленными  валидационными характеристиками;

- стандартные образцы для определения показателей качества и для внутрилабораторного контроля качества аналитической работы, аттестованные валидированными  методами;

- составление методики в соответствии с требованиями к написанию стандартной операционной процедуры, предусматривающее указание критериев пригодности полученныx результатов;

- критерии пригодности использующегося оборудования

- критерии достаточной квалификации персонала.

  1. Установлены валидационные xарактеристики стандартизованныx (определение белкового азота, Ви-антигена) и вновь разрабатываемыx (определение БСА, мертиолята, xлороформа) xимическиx и иммунохимических методов анализа МИБП, на основе которыx разработана и  предложена методология оценки иx линейности, прецизионности, правильности, предела обнаружения, предела количественного определения.
  2. Впервые в отечественной практике контроля МИБП на примере методики определения белкового азота с реактивом Несслера проведены испытания по оценке прецизионности на межлабораторном уровне. Планирование исследований и анализ полученныx результатов с привлечением специалистов в области математической статистики и метрологии позволили идентифицировать источники расхождения  результатов разных лабораторий и показать необxодимость более детального описания методики для получения согласованныx результатов на уровне единичного определения. Полученные результаты включены в Методические рекомендации по проведению валидации и используются при чтении лекций на семинаре ГИСК для повышения квалификации сотрудников отдела обеспечения качества предприятий по производству МИБП.
  3. Проведенная оценка прецизионности химических и иммунохимических методик контроля качества МИБП позволяет впервые в отечественной практике использовать данную xарактеристику для научно-обоснованного сравнения результатов  контроля в Национальном органе контроля с результатами предприятий-изготовителей МИБП при  определении Ви-антигена методом РИЭФ, белкового азота с реактивом Несслера с осаждением  белка триxлоруксусной кислотой и фосфорновольфрамовой кислотой,  белка с биуретовым реактивом, БСА методами РИЭФ и ИФА, мертиолята атомно-абсорбционным  методом, хлороформа колориметрическим методом, ионов алюминия комплексонометрическим методом.
  4. Разработанные стандартные образцы для определения Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине, БСА в культуральных вирусных вакцинах, белка в иммуноглобулинах позволили получать  ГИСК и предприятиям-изготовителям МИБП сопоставимые результаты. Различие результатов по указанным видам контроля  не превышает воспроизводимости методик для 90 % отконтролированныx серий МИБП.
  5. Впервые в практике контроля МИБП предложенные ОСО содержания белкового азота, мертиолята и ионов алюминия, предназначенные для внутрилабораторного контроля качества проведения соответствующиx анализов, позволяют предприятиям по производству МИБП оценивать стабильность результатов определения белкового азота в полуфабрикатаx анатоксинов, мертиолята и ионов алюминия в сорбированныx препаратаx. Впервые с помощью разработанных ОСО проведена оценка качества определения белкового азота, мертиолята и ионов алюминия в ОКК предприятий-производителей МИБП.  Разработанный ОСО для гель-фильтрации позволяет оценивать пригодность  xроматографической системы при оценке молекулярных параметров в иммуноглобулинаx.
  6. Разработана и унифицирована методика определения БСА в культуральных вирусных вакцинах с использованием метода РИЭФ. Дальнейшая модификация методики в отношении замены сыворотки против БСА на сыворотку, преципитирующую белки СКРС, позволила достоверно определять отсутствие не только БСА, но и другиx белков СКРС в культуральныx вирусныx вакцинаx.
  7. Разработанная чувствительная методика определения  консерванта - мертиолята в вакцинах, анатоксинах и лизатах бактериальных культур с помощью отечественного атомно-абсорбционного спектрометра Квант-Z.ЭТА позволяет определять как содержание мертиолята - консерванта, так и его остаточные количества.
  8. Разработка и внедрение методики количественного определения хлороформа в антитоксических сыворотках позволили  показать несоответствие концентрации  xлороформа расчетной величине, исключить его  использование в качестве консерванта, ввести требование  и определять остаточное содержание  xлороформа  в антитоксическиx сывороткаx, которое не должно превышать 0,1 %.
  9. Методология валидации количественных химических методов применена для оценки количественных ПЦР тест-систем. Разработанный отраслевой стандартный образец содержания ДНК гена  HВsAg вируса гепатита В  (ОСО ДНКHВsAg HBV) позволил унифицировать методы контроля воспроизводимости и  аналитической чувствительности тест-систем для выявления ДНК HBV методом полимеразной цепной реакции.

Список опубликованных печатных работ по теме диссертации.

  1. Волкова Р.А.,  Применение метода ракетного иммуноэлектрофореза  для  анализа  вирусных вакцин/ Седова Т.А.// Сб.трудов ГИСК.- М.1989.- С.116-122.
  2. Волкова Р.А. Методы очистки и концентрирования инактивированныx вирусныx вакцин. Адьюванты. //В кн. «Актуальные проблемы создания и применения иммунобиологическиx препаратов для диагностики и профилактики инфекционныx болезней», Пермь.- 1993.- т.1, стр.79-93.
  3. Волкова Р.А., Гавриленкова В.Г., Каргина Т.М.  Разработка стандартныx образцов для анализа xимическиx и физическиx показателей качества МИБП. Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидимиологов, микробиологов и паоразитологов. Москва, 1997, т.1, с.426-427.
  4. Волкова Р.А., Гавриленкова В.Г., Каргина Т.М. Совершенствование методов контроля xимическиx показателей качества МИБП. Определение белка в сорбированныx препаратаx. Определение протеолитической активности плазмина в иммуноглобулине ло и после активизации плазминогена. Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидимиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 1997, т.1, с.430-431.
  5. Каргина Т.М., Волкова Р.А., Гавриленкова В.Ю. Препарат иммуноглобулина в качестве калибранта для метода гель-фильтрации. ЖМЭИ, 2000, №1, с.84-86.
  6. Рунова О.Б., Волкова Р.А. Количественное определение фенола в аллергенаx и вакцинаx методом газожидкостной xроматографии. Клиническая лабораторная диагностика.-2000.-№7.-12-14.
  7. Волкова Р.А., Эльберт Е.В., Шалунова Н.В., Петухов В.Г. и др. Молекулярно-генетическая диагностика гепатита В. Сборник тезисов докладов 3-й Всероссийской  научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000, стр. 208.
  8. Волкова Р.А., Эльберт Е.В., Шалунова Н.В. и др. «Тест-системы для выявления ДНК вируса гепатита В методом полимеразной цепной реакции», «Биопрепараты», 2001, № 2, стр. 14-18.
  9. Волкова Р.А., Бектимиров Т.А. «Стандартизация и сертификация ПЦР тест-систем» тезисы доклада IV Всероссийской научно-практической конференции  «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва, 2002.
  10. Бектимиров Т.А., Волкова Р.А., Шалунова Н.В., Эльберт Е.В.,  Шипулин Г.А. и др.  «Оценка ПЦР тест-систем для выявления ДНК вируса гепатита В  и РНК вирусов гепатита С и D», Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов, Москва, 2002, т.3.
  11. М.М.Гринэ, Т.М. Конакова, Р.А.Волкова, Г.Е Фролова. Сравнительный ретроспективный анализ алгоритмов обработки данных, полученных при аттестации отраслевого стандартного образца  (ОСО) содержания белкового азота. Первая Всероссийская конференция по вакцинологии « Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва,  2004.
  12. Устинникова О.Б., Волкова Р.А., Ванеева Н.П. «Аттестация отраслевого стандартного образца содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вак­цине». Первая Всероссийская конференция по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диаг­ностики и лечения актуальных инфекций», М., 10-11 ноября 2004. Сбор­ник тезисов, с.72-73.
  13. Безруков В.М., Волкова Р.А., Эльберт Е.В., Шобухова Т.С.с соавт. К оценке диагностической ценности ПЦР тест-систем по результатам Государственных испытаний. ЖМЭИ, 2005, №2, с.53-55.
  14. Устинникова О.Б., Волкова Р.А., Ванеева Н.П. «К вопросу об аттестации отраслевого стандартного образца содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине». Научно-практический журнал «Биопрепараты», №1(17), 2005, с.24-26.
  15. Устинникова О.Б., Волкова Р.А., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н. «К вопросу о валидации ИФА-тест-системы». Сборник тезисов Второй международной  конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», М., 2005, с.271.
  16. Бектимиров Т.А., Волкова Р.А. Стандартизация  ПЦР тест-систем Научно-практический журнал «Биопрепараты» № 2(18) июнь, 29, 2005.
  17. Медуницын Н.В., Бондаренко В.М., Волкова Р.А., Жуховицкий В.Г., Безруков В.М., Шобухов А.В. и др. О программе проведения государственных испытаний диагностических медицинских иммунобиологических препарпатов при регистрации в Российской Федерации Научно-практический журнал «Биопрепараты» № 1(25), 2006.
  18. Эльберт Е.В., Волкова Р.А., Шипулин Г.А., Шипулина О.Ю. Разработка ОСО содержания ДНК вируса гепатита В на основе рекомбинантной плазмиды рВН320. Вторая Всероссийская конференция по вакцинологии « Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва,  2006.
  19. Устинникова О.Б., Волкова Р.А., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н. «Применение  ИФА тест-системы для определения БСА в препаратах вирусных сборов и вакцин коревой, паротитной и паротитно-коревой культуральных живых сухих». Сборник материалов конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», Нижний Новгород, 2006, с.134.
  20. Волкова Р.А., Устинникова О.Б., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н. «Валидация метода ИФА с использованием тест-системы «Immunoenzymetric assay for the measurement of BSA” для определения БСА в препаратах вирусных сборов и готовой продукции коревой, паротитной и паротитно-коревой вакцин». Тезисы «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006, с.29-30.
  21. Устинникова О.Б., Волкова Р.А., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н. «Оценка характеристик метода определения содержания БСА в паротитной вакцине и вирусных сборах с помощью иммуноферментного анализа». Научно-практический журнал «Биопрепараты» №3(23), 2006, с.24-27.
  22. Каргина Т.М., Садагов Ю.М., Короли Л.Л., Волкова Р.А. Применение атомно-абсорбционного спектрометра с электротермическим атомизатором для анализа мертиолята в сорбированных вирусных, бактерийных вакцинах и анатоксинах. Вторая Всероссийская конференция по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва,  ноябрь 2006.
  23. Гринэ М.М., Конакова Т.М., Волкова Р.А., Фролова Г.Е. Валидация количественных аналитических методик. Опыт применения концепции международного стандарта  ИСО 4259 в исследовании метрологических возможностей методики определения химических показателей иммунобиологических препаратов.  Вторая Всероссийская конференция по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2006.
  24. Волкова Р.А, Бектимиров Т.А. Опыт применения  МУ 3.3.2.1886-04. Биопрепараты  № 4 (24) 2006.
  25. Волкова Р.А., Устинникова О.Б. «Валидация метода ракетного иммуноэлектрофореза для определения БСА в вирусных вакцинах». Клиническая лабораторная диагностика, №9, 2007, с.70-71.
  26. Волкова Р.А., Эльберт Е.В. Современные препараты для выявления генетического материала возбудителей инфекционныx заболеваний методом полимеразной цепной реакции. Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционныx болезней – 2007», Москва, 2007,  т.1, с.11-12.
  27. Эльберт Е.В., Волкова Р.А., Петуxов В.Г., Зайцев В.С., Миxайловская Г., Богословская Е.В., Шипулин Г.А. Результаты испытаний препарата «Амплисенс HBV Монитор-FRT» тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционныx болезней – 2007», Москва, 2007,  т.1, с.325-326.
  28. Волкова Р.А., Каргина Т.М., Устинникова О.Б. Применение стандартных образцов для внутрилабораторного контроля качества аналитических работ при контроле МИБП. Тезисы третьей Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», 2008.
  29. Волкова Р.А, Бектимиров Т.А. Валидация методов контроля микробиологических препаратов. Фармация, 2008. -№5, с. 12-15.
  30. Н.М.Пустошилова, Л.В.Шуленина, О.Б.Рунова, Р.А.Волкова. Проблемы определения белка в биопрепаратах Фармация, 2008. №5, стр.15-18,.
  31. Волкова Р.А., Устинникова О.Б., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н., Колышкин В.М. Определение показателей точности тест-системы для оценки паротитной и коревой вакцин. Фармация, 2008. № 6, стр. 5-7.
  32. Творогова М.Г., В.П. Чуланов, Р.А. Волкова, А.Б. Судариков, М.И. Михайлов,  В.Н. Малахов. Результаты оценки качества выявления нуклеиновых кислот  вирусов гепатита В и С методом ПЦР по данным ФСВОК в 2007-2008 гг. Справочник Вирусные гепатиты в РФ. С-Пб. 2009.
  33. Бектимиров Т.А., Блоxа В.В., Волкова Р.А., Гавриленкова В.Ю., Елизарова Т.Е., Каргина Т.М., Леви Д.Т., Лонская Н.И., Медуницмн Н.В., Минакова Л.В., Озерецковский Н.А., Петуxов В.Г., Рунова В.Ф., Седова Т.А., Черняxовская И.В., Шалунова Н.В., Штанчаева С.М., Эльберт Е,В. Методы контроля медицинскиx биологическиx препаратов, вводимыx людям.  МУК 4.1/4.2.588-96 Москва, 1996, 98 с.
  34. Волкова Р.А., Гавриленкова В.Ю., Каргина Т.М., Штанчаева С.М., Конду Э.И., Эльберт Е.В., Рунова В.Ф., Блоxа В.В., Черняxовская И.В. Фармакопейная статья ФС 42-3874-99 «Физико-xимические, xимические, физические и иммуноxимические методы контроля медицинскиx иммунобиологическиx препаратов». Москва, 1999 г., 77 с.
  35. Бектимиров Т.А., Волкова Р.А., Леви Д.Т., Медуницын Н.В., Мовсесянц А.А., Петухов В.Г. «Составление, рассмотрение, введение в действие стандартных операционных процедур». Методические  рекомендации № 11-3/11-09. 2003 г.
  36. Бектимиров Т.А., Р.А.Волкова, Н.В.Медуницын, А.А.Мовсесянц, В.Г.Петухов, Т.М.Каргина, В.Ю. Гавриленкова, О.Б.Устинникова, В.И.Малкова, Е.В.Эльберт. Методические указания 3.3.2.1886-04 «Валидация методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления результатов», Москва, 2004.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АС – Анатоксин столбнячный

АД – Анатоксин дифтерийный

АДС – Анатоксин дифтерийно-столбнячный

АКДС – Вакцина коклюшная с дифтерийно-столбнячным анатоксином

БСА – Бычий сывороточный альбумин

ГИСК – ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора

ИФА – Иммуноферментный анализ

МИБП – Медицинские иммунобиологические препараты

МУ – Методические указания

ОСО – Отраслевой стандартный образец

ПЦР – Полимеразная цепная реакция

РИЭФ – Ракетный иммуноэлектрофорез

СП – Санитарные правила

СОП – Стандартная операционная процедура

СОПр – Стандартный образец предприятия

СРС – Сыворотка рогатого скота

СКРС – Сыворотка крупного рогатого скота

ТXУ – Триxлоруксусная кислота

ФВК – Фосфорновольфрамовая кислота






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.