WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Зайцева Елена Александровна

СИСТЕМА АНАЛИЗА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ

ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ

LISTERIA MONOCYTOGENES 

03.02.03. – микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва

2010 год

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН (г. Владивосток) и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва)

Научные консультанты:

Академик РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор 

Доктор биологических наук  Ермолаева Светлана Александровна

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, д.м.н., профессор  Сергиев Владимир Петрович

Член-корр. РАМН, д.м.н., профессор Брико Николай Иванович

Доктор медицинских наук Шагинян Игорь Андроникович

Ведущая организация:

ФГУН «Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

Защита состоится «___»_________2010 г. в 11__ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан «__»_______ 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

д.м.н., профессор  Русакова Е.В.

ОБЩАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА  РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Последние 20 лет характеризуются существенным увеличением интереса ученых и клиницистов к листериозной инфекции. Он обусловлен многочисленными эпидемическими вспышками листериоза в развитых странах (Франция, США, Германия, Испания и т.д.), связанными с употреблением в пищу продуктов, контаминированных листериями. В то время как до 1980-х годов листериоз был относительно редкой инфекцией, регистрируемой преимущественно среди людей, связанных с животноводством, в настоящее время он является одной из ведущих пищевых инфекций в Европе и Америке с летальностью до 20-40% (ВОЗ, 1988, Farber J.M., Peterkin P.I., 1991). Причины подобного изменения эпидемической ситуации до сих пор остаются до конца невыясненными. Отчасти, увеличение заболеваемости листериозом связано с длительным хранением пищевых продуктов при низкой температуре, что способствует размножению в них листерий при первично слабой контаминации ими. С другой стороны, нельзя исключать возможности изменения свойств штаммов листерий, циркулирующих в окружающей среде и представляющих опасность для человека.

В Российской Федерации заболеваемость листериозом у людей регистрируется с 1991 г. (Опочинский Э.Ф., 2001, Тартаковский И.С. и др., 2002). Однако официальная статистика (40-100 случаев в год) не отражает реального состояния заболеваемости листериозом, что обусловлено не только разнообразием клинических форм болезни, но также недостаточной осведомленностью врачей об особенностях проявления этой инфекции и нехваткой недорогих отечественных селективно-дифференцирующих сред и тест-систем для ее лабораторной диагностики.

Наряду с этим проблема листериоза становится все более актуальной в связи с увеличением случаев заражения его возбудителем людей со сниженным Т-клеточным звеном иммунитета. Одним из важных остается вопрос о распространении листериозной инфекции у беременных женщин, в связи с возможностью внутриутробного инфицирования плода, часто сопровождающегося абортами, мертворождениями и высокой летальностью среди новорожденных.

Основная масса эпидемических вспышек пищевого листериоза, зарегистрированных начиная с 1982 г., связана с этиологическим значением относительно узкой филогенетической группы внутри вида Listeria monocytogenes, характеризующейся принадлежностью к серогруппам 4b (около 90% эпидемических случаев), 1/2a и 1/2b. Однако до сих пор неизвестно, какие именно свойства эпидемических штаммов L.monocytogenes обусловливают их высокую опасность. Остаются невыясненными биологические особенности L.monocytogenes, обитающих в разных экологических условиях. Особый интерес представляет вопрос о патогенных свойствах листерий, выделяемых из продуктов питания и объектов окружающей среды.

Практически отсутствуют работы, в которых была бы отражена характеристика листерий, обитающих в природе, а также дано сравнение их с эпидемически значимыми штаммами, что в настоящее время представляется важным ввиду возможности заноса высоковирулентных штаммов L.monocytogenes в окружение человека из природных очагов.

Решение перечисленных вопросов, связанных с биологией и вирулентностью возбудителя листериоза, а также с закономерностями эпидемического процесса этой инфекции, может быть осуществлено на основе микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга за возбудителем с применением эффективных методов диагностики и созданием современных систем для типирования штаммов листерий. Все вышесказанное определило направление исследований, предпринятых в данной работе.

Цель работы: разработать систему микробиологических и молекулярно-генетических маркеров, позволяющую выявлять высоковирулентные штаммы L. monocytogenes, необходимую для контроля распространения листериозной инфекции.

Задачи исследования:

  1. Разработать комплекс методов и средств для выделения и идентификации бактерий рода Listeria из различных источников окружающей среды, получить коллекцию дальневосточных штаммов листерий.
  2. Дать характеристику микробиологических свойств и патогенного потенциала штаммов L.monocytogenes, изолированных из различных источников в Дальневосточном регионе России, и провести их сравнительный анализ со штаммами L.monocytogenes, выделенными в Европейской части России. В экспериментальных условиях установить влияние абиотических факторов на вирулентность штаммов L.monocytogenes.
  3. Изучить молекулярно-генетические особенности штаммов L.monocytogenes, выделенных из различных объектов на Дальнем Востоке и в Европейской части России, и дать оценку их эпидемологической значимости.
  4. Выявить генетические маркеры, характерные для эпидемически значимых штаммов L.monocytogenes.
  5. На основе особенностей генетического полиморфизма штаммов разработать систему типирования L. monocytogenes и дать филогенетическую характеристику бактерий вида L.monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке Российской Федерации.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

  • Выявлено генетическое разнообразие бактерий рода Listeria, распространенных на Дальнем Востоке Российской Федерации, в том числе патогенного вида L.monocytogenes. Показано преобладание в данном регионе сероварианта 4b, опасного в эпидемическом плане для людей. Создана коллекция дальневосточных штаммов бактерий рода Listeria.
  • Впервые доказано, что, несмотря на сходство морфологических, культуральных и биохимических свойств, штаммы L.monocytogenes из дальневосточной и европейской частей РФ могут быть дифференцированы с помощью методов молекулярно-генетического типирования. Установлены существование регион-специфического распределения штаммов L.monocytogenes на территории РФ, а также поликлональность распределения штаммов этого вида внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).
  • Впервые в сравнительном аспекте изучены гены, кодирующие факторы адгезии и инвазии - белки семейства интерналинов (inlA, inlB, inlC, inlE, inlG, inlH, inlF), белки ActA, Auto у штаммов L. monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России из различных источников. Определены последовательности генов inlA, inlB, inlC, inlE, prs у штаммов L.monocytogenes, часть из которых (345 фрагментов) депонированы в базу данных международного GenBank.
  • Установлено, что штаммы L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, включая человека, имеют гены inlA, inlB, inlC, inlE, независимо от региона выделения; гены inlF, inlG, inlH являются штаммоспецифическими.
  • Впервые установлена корреляция между развитием внутриутробной инфекции и аллелем фрагмента генов inlA и inlC, кодирующего функционально-значимый домен (LRR-домен) факторов инвазии InlA и InlC, у штаммов L.monocytogenes. Высказано предположение о том, что развитие внутриутробной листериозной инфекции плода у беременных женщин может быть связано с определенными вариантами белков InlA и InlC возбудителя. Получены свидетельства значимости генов inlA и inlC как маркеров штаммов L.monocytogenes, представляющих повышенную опасность для развития листериоза у плода.
  • Впервые показано, что выявленные среди диких грызунов и морских гидробионтов штаммы L.monocytogenes могут обусловливать внутриутробную инфекцию у человека, что предполагает возможность заноса вирулентных штаммов L.monocytogenes из окружающей среды в антропогенные системы.
  • Выявлено изменение адгезивных свойств бактерий рода Listeria, включая вид L. monocytogenes различных серовариантов, под влиянием температуры, кислотности среды (рН) и экзогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Установлено, что при температуре 4-80С, рН = 6,0 и 8,0 повышаются, а при температуре 370С и рН = 9,0 снижаются адгезивные свойства L. monocytogenes.

Теоретическая значимость работы определяется тем, что впервые в сравнительном аспекте представлена комплексная характеристика микробиологических и молекулярно-генетических особенностей бактерий вида L.monocytogenes, выделенных из различных объектов на территории Дальнего Востока и Европейской части России. Установлены молекулярно-генетические маркеры, характеризующие высоковирулентные штаммы L.monocytogenes. Полученные результаты имеют фундаментальное значение для микробиологии и эпидемиологии, поскольку расширяют представление о патогенных бактериях рода Listeria, распространенных на территории Российской Федерации, а также дополняют и уточняют знания о развитии инфекционного процесса при листериозной инфекции.

Практическая значимость работы

  • Предложена модифицированная схема выделения и идентификации листерий с использованием сконструированных для этих целей запатентованных дифференциально-диагностической среды для листерий, комплексной индикаторной среды для дифференциации бактерий рода Listeria, питательной среды на основе молок лососевых рыб (жидкой, сухой и плотной) для культивирования бактерий. Создана коллекция дальневосточных штаммов бактерий рода Listeria. Разработанные среды и диагностические методы рекомендованы для проведения мониторинга за возбудителем листериоза в бактериологических лабораториях санитарно-эпидемиологического и ветеринарного надзора, а также в лечебно-профилактических, научно-исследовательских и учебных учреждениях как для целей диагностики инфекционных заболеваний человека и животных, так и для целей сертификации продуктов питания.
  • Предложен оригинальный метод генетического типирования изолятов L.monocytogenes на основании последовательностей фрагментов генов inlA, inlB, inlC, inlE и prs, позволяющий дифференцировать эпидемически несвязанные изоляты листерий с индексом дискриминации 0,982.
  • На основе полимеразной цепной реакции разработан способ детекции специфических для L.monocytogenes генов, кодирующих белки-интерналины (inlA, inlB, inlC, inlE). Результаты комплексного изучения генов, кодирующих белки-интерналины, могут служить базой для анализа принадлежности штаммов листерий к определенной филогенетической линии и для оценки их эпидемиологической значимости.
  • Установлен спектр антимикробных препаратов, к которым резистентны штаммы L.monocytogenes, выделенные на Дальнем Востоке, что позволяет совершенствовать рациональную схему этиотропной терапии листериоза у больных.
  • Полученные результаты микробиологических и молекулярно-генетических исследований могут быть использованы в исследованиях при изучении факторов патогенности L.monocytogenes, а также при создании новых диагностических и терапевтических препаратов.
  • Депонированные в GenBank нуклеотидные последовательности штаммов L.monocytogenes имеют значение при проведении научных исследований, поскольку они могут быть использованы при типировании вновь выделенных штаммов L.monocytogenes, а также для уточнения данных об их происхождении и для установления связи различных генетических вариантов с течением и проявлениями листериозной инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Существует полиморфизм факторов инвазии - семейства белков-интерналинов - у L.monocytogenes, основного возбудителя листериоза. Все культуры L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, независимо от региона изоляции, обладают генами inlA, inlB, inlE, inlC.
  2. Молекулярно-генетическое типирование L. monocytogenes на основании полиморфизма генов inlA, inlB, inlE, inlC и prs позволяет дифференцировать филогенетически удаленные штаммы, штаммы, циркулирующие в географически удаленных областях, а также эпидемически несвязанные между собой изоляты листерий.
  3. Для L. monocytogenes, выделенных на территории РФ, характерны регион-специфическое распределение штаммов и поликлональность распределения штаммов внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток). 
  4. Имеется связь между филогенетическим положением штамма L.monocytogenes и его эпидемиологическим потенциалом. Среди L. monocytogenes из клинического материала, от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди L. monocytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.
  5. Эпидемически значимые штаммы L.monocytogenes, вызывающие внутриутробную листериозную инфекцию плода у человека, распространены в объектах окружающей среды в Дальневосточном регионе, в том числе среди диких грызунов, морских гидробионтов и в пищевых продуктах, реализуемых в торговой сети.
  6. Выявлена корреляция между нуклеотидной последовательностью аллелей генов, кодирующих определенные факторы инвазии, и частотой выделения несущих эти последовательности штаммов L.monocytogenes от разных хозяев.

Материалы диссертации были использованы при подготовке:

  1. Информационно-методического письма «По правилам взятия, доставки, методам лабораторных исследований материала от больного с подозрением на ООИ, сроки выдачи результатов» авторов Кизиловой М.Д., Коленченко Г.Н., Просянниковой М.Н., Зайцевой Е.А. Разработано и одобрено Лабораторным советом ФГУ ЦГСЭН в Приморском крае (Решение № 1 от 25.04.02.). Владивосток. – 2002.
  2. Методических рекомендаций «Лабораторная диагностика листериоза» авторов Е.А.Зайцевой, Г.П. Сомова, Л.С. Бузолевой, Т.А. Глазыриной. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. – 2006.
  3. Информационного письма «Listeria monocytogenes – новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» авторов Л.Н.Федяниной, Е.А.Зайцевой, Т.Н. Каленик, В.Б.Светлова. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. – 2006.
  4. Методического пособия для бактериологов «Питательные среды для изоляции, типирования и идентификации бактерий рода Listeria» авторов Е.А. Зайцевой, Г.П.Сомова, Л.Н.Фатеевой, Г.Г. Компанец, Н.Г. Плеховой. Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. – 2008.
  5. Патента № 2184782 Российской Федерации. Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий / Глазырина Т.А., Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Сомов Г.П./ Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 2.11.1999. Опубл. 10.07.2002.
  6. Патента № 2303060 Российской Федерации. Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria /Зайцева Е.А., Глазырина Т.А., Сомов Г.П./ Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 28.12.2005. Опубл. 20.07.2007.
  7. Заявки на изобретение № 2008111691/13 (012634) МПК7 C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04. «Питательная среда для культивирования бактерий» /Зайцева Е.А., Фатеева Л.Н., Кривошеева А.М., Сомов Г.П. /Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 26.03.2008.
  8. Заявки на изобретение № 2008132232 МПК7 C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04 «Питательная среда для культивирования бактерий (ее варианты)» /Зайцева Е.А., Фатеева Л.Н., Сомов Г.П. /Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 4.08.2008.

Апробация материалов диссертационной работы:

Основные положения диссертации были представлены на конгрессах и конференциях международного, российского и регионального уровня: II Дальневосточном конгрессе «Человек и лекарство» с международным участием (Владивосток, 2005); Всероссийском конгрессе «Оптимальное питание – здоровье нации»: к 75-летию Государственного учреждения Научно-исследовательского института питания РАМН (Москва, 2005); Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» («Сосновка», Новосиб. обл., 2005); III Российской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); 13 международном конгрессе по приполярной медицине (Новосибирск, 2006); 11th International Symposium on Microbial Ecology (Вена, Австрия, 2006); 2nd FEMS Congress of European Microbiologists (Madrid, Spain, 2006); 16th International Symposium on Problems of Listeriosis. ISOPOL XVI (Savannah, Georgia, США, 2007); 9th Symposium on Bacterial Genetics and Ecology (Wernigerode, Германия, 2007); 5th World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases (Bangkok, Thailand, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007»; Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); 4 международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (Санкт-Петербург, 2008); научно-практической конференции с международным участием «Роль вирусных и бактериальных инфекций в формировании перинатальной и соматической патологии у детей» (Хабаровск, 2008).

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 62 научных публикациях, в том числе: 6 – в международной печати, 18 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, а также в 3 информационных письмах, 2 патентах на изобретение, 2 заявках на изобретение, 1 пособии для бактериологов, 1 методических рекомендациях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практическое здравоохранение, списка использованной литературы. Работа изложена на 312 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу, 36 рисунков. Список цитированной литературы включает 459 источников, из которых – 121 отечественных и 338 - иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены на базе лаборатории экологии патогенных бактерий НИИЭМ СО РАМН (г. Владивосток). Отдельные фрагменты молекулярно-генетических исследований выполнены на базе лаборатории экологии возбудителей инфекций в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва).

Все экспериментальные и клинические исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике НИИЭМ СО РАМН (протокол № 1/2 от 22 марта 2006 г.).

Микроорганизмы. В работе использованы типовые штаммы (21 штамм) бактерий рода Listeria – L.monocytogenes (серовариантов 1/2а, 1/2b, 1/2c, 3a, 4a, 4b, 4c, 4d, 7), L.ivanovii NCTC 11846, L.innocua SLCC 3379, L.seeligeri SLCC 5921, L.welschimeri, L.grayi 17, полученные из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (г. Москва) и музея Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВМиВ, г. Покров), а также изоляты листерий (289 изолятов), выделенные из клинического материала, животных, объектов окружающей среды (почва, вода, пищевые продукты) на Дальнем Востоке (238 изолятов) и в Европейской части (51 изолят) Российской Федерации.

При выполнении ряда экспериментальных исследований использовали штаммы Escherihia coli 284, Staphylococcus aureus 192, Yersinia pseudotuberculosis 222, Y. pseudotuberculosis 2781, Y. enterocolitica 2012, Y. enterocolitica 164, Shigella flexneri 73, Salmonella enteritidis 285, S. typhimurium 5369, S.paratyphi 286 из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.

В экспериментах по изучению адгезивных свойств листериозного микроба использовали нативные эритроциты человека О (I) Rh (+) группы крови.

В ряде исследований применяли низкомолекулярную дезоксирибонуклеиновую кислоту (нДНК) - вещество, полученное учеными ТИНРО - Центра, защищенное патентом (г. Владивосток, патент СССР № 915446). Низкомолекулярная ДНК представляет собой аморфный порошок светло-кремового цвета, растворимый в воде при нагревании и нерастворимый в органических растворителях. В состав нДНК входит 79,0% ДНК, 7,8% белка, 2,1% липидов и 10,7% воды. Молекулярная масса нДНК составляет 270 – 500 кДа.

Лабораторные животные. Экспериментальная часть работы выполнена на неинбредных мышах массой 14 - 18 г, морских свинках весом 150 - 200 г, кроликах массой 1,5 - 2 кг, полученных из питомника РАМН «Столбовая». Работа выполнена с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Разброс животных в группе по массе не превышал ± 10%. В каждой опытной группе было от 5 до 10 животных. Животные контрольных и опытных групп были одного пола, возраста, получены из питомника одновременно. Животных выводили из опыта с использованием эфирного наркоза.

Методы. Морфологические, культуральные и биохимические исследования проводили по общепринятым методам, описанным в справочниках по микробиологическим и вирусологическим методам исследования (Биргер М.О., 1982, Лабинская А.С., 1978, Никитин В.М., 1986, Хоулт Д. и др.,1997), а также согласно методов, сред, рекомендованных ГОСТ Р 51921-2002 и МУК 4.2.1122-02 для выделения листерий.

Антигенные свойства культур определяли в линейной реакции агглютинации с типовой поливалентной и моновалентных (I и II серотипов) листериозных сывороток и с использованием набора бактериофагов, включающий фаги L-2A и L-4A, по методике предложенной изготовителем (ВНИИВВиМ, г. Покров).

Антибиотикорезистентность штаммов листерий изучали методом диско-диффузии в агар согласно МУК 4.2.1890-04.

Определение адгезивной активности листерий проводили по методу В.И.Брилис с соавт. (1996).

Вирулентность культур определяли на белых неинбредных мышах (самцах), массой 14-18 г, которых заражали внутрибрюшинно десятикратно возрастающими дозами (от 10 до 109 микробных клеток), с вычислением LD50 и ее доверительного интервала при помощи метода Кербера (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962), средней продолжительности жизни (СПЖ) (Павлович Н.В. и др., 1997) а также по керато-конъюнктивальной пробе на морских свинках.

Молекулярно-генетические методы. В работе использовали олигонуклеотидные праймеры, синтезированные фирмой «Синтол» (Москва). Праймеры, ограничивающие фрагменты изучаемых генов, были выбраны в 5’ и 3’ областях открытых рамок считывания (ОРФ) с помощью программы Oligo38. Для проведения ПЦР использовали бактериальные лизаты, приготовленные из суточных культур листерий, как описано Т.И. Карповой с соавт. (2003).

Идентификацию выделенных листерий до вида L.monocytogenes проводили c помощью тест-системы АмплиСенс Listeria monocytogenes (ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва) методом ПЦР по программе фирмы-изготовителя, и с помощью видоспецифических для L.monocytogenes праймеров plc1 – plc2,и lmp1 – lmp2 (Карпова Т.И. и др., 2001; 2003).

Определение принадлежности выделенных культур к бактериям рода Listeria проводили методом амплификации ДНК бактерий при помощи ПЦР с праймерами для определения гена prs, кодирующего родоспецифический белок общего метаболизма - фосфорибозилпирофосфатсинтазу (Сапенко Т.П., Ермолаева С.А., 2003).

Серогруппоспецифические маркерные гены выявляли с помощью мультиплекс-ПЦР метода, предложенного M. Doumith и соавт. (2004).

Определение генов, кодирующих белки-интерналины (InlА, InlВ, InlС, InlE, InlG, InlH, InlF), и генов, кодирующих белки Auto и ActA, осуществляли с использованием в ПЦР праймеров, которые были выбраны на основе последовательностей генов, полученных из базы данных ListiList (http://www.pasteur.fr), содержащей последовательность генома штамма EGD-e (положительного контроля). ПЦР осуществляли по программам, которые были подобраны экспериментально для каждой пары праймеров. Продукты ПЦР анализировали методом гель-электрофореза в 1% агарозе (Sigma).

Подготовка образцов для секвенирования. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки - интерналины А, В, С, Е (inlA, inlB, inlC, inlE) и гена prs были получены из базы данных ListiList (http://www.pasteur.fr). Концентрацию ампликонов проверяли путем электрофореза на агарозном геле в сравнении со стандартным маркером (1 kb DNA Ladder, «Fermentas»). Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью набора GFXtm PCR DNA and Gel Band Purification Kit («Amersham», Англия).

Секвенирование фрагментов ДНК проводили в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН в Центре коллективного пользования «Геном» (г. Москва). Последовательности, полученные в результате секвенирования, были прочитаны с помощью программы Chromas v.1.45 (Copyright© 1996-1998 Conor McCarthy, http://www.technelysium.com.au/chromas.html). Множественное выстраивание последовательностей было осуществлено с помощью программы ClustalW 1.83.XP (Thompson J.D. et al., 1994). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета программ DnaSP version 4.10 (Rozas J. et al.,2003). Построение дендрограмм было осуществлено с помощью программы Mega version 3.1 (Kumar S. et al., 2004). Индекс дискриминации (D.I.) вычисляли, как предложено (Hunter P.R., Gaston M.A., 1988).

Нуклеотидные последовательности (345 последовательностей) штаммов L.monocytogenes были депонированы в GenBank.

Статистическую обработку материала осуществляли с использованием общепринятых параметрических критериев (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962, Гланц С., 1999). В работе были использованы методы корреляционного и регрессионного анализов (Гланц С., 1999), расчеты произведены с использованием программы электронных таблиц Excel - 4.1 на компьютере типа IBM-PC, Pentium IV.

Для выявления различий между данными опытных и контрольных групп применяли t-критерий Стьюдента. В работе использованы известные графические приемы выражения статистических данных (Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Биологические свойства листерий, изолированных на Дальнем Востоке

Подбор оптимальных питательных сред, схемы выделения, культивирования и изучения биологических свойств листерий. В начале работы были подобраны оптимальные питательные среды для изоляции и культивирования листерий, ингибиторы для приготовления селективной дифференциальной среды (патент РФ № 2184782), разработана индикаторная среда (патент РФ № 2303060) с целью эффективного выделения культур из разнообразных объектов окружающей среды, клинического материала, а также модифицированы среды для изучения свойств листерий - определение подвижности, ДНКазной и липазной активности, биохимических свойств. Наилучшие результаты при определении подвижности отмечались при посеве культур листерий на полужидкий 0,3%-ный агар с 2,3,5-трифенилтетразолием хлористым (ТТХ). Из-за высокой чувствительности и наглядности предпочтение в практической работе, возможно, следует отдать этой среде.

Отработана оптимальная схема исследования различных проб для выделения листерий. В результате сформирована коллекция дальневосточных культур листерий, включающая 238 изолятов.

В ходе исследований выявлено, что на Дальнем Востоке выделяются разнообразные виды бактерий рода Listeria – L.monocytogenes (47,1% от общего числа изолятов), L. innocua (19,7%), L.seeligeri (2,9%), L.ivanovii (1,2%), L.welschimeri (0,8%). Эти бактерии были обнаружены в различных объектах окружающей среды – в речной воде, наземных растениях, водорослях, изолированы из органов грызунов, морских гидробионтов, клинического материала, пищевых продуктов (мясных, молочных, рыбных, мясе птицы), а также из смывов с оборудования на производственных предприятиях.

Выявлена контаминация патогенными L. monocytogenes продуктов питания в 6,3% исследованных образцов. Чаще всего патогенный вид L.monocytogenes выделяли из мясных (12,7% от числа исследованных образцов), куриных (2,9%) и рыбных (1,6%) продуктов. Наряду с L.monocytogenes (2,8%), часто пищевые продукты были контаминированы и бактериями вида L.innocua (2,7 %), особенно мясные (13,3% от числа исследованных образцов; отечественного и импортного производства), овощи (8,1%), реже рыбные (1,2%).

Cреди биотических объектов в Дальневосточном регионе России патогенный вид L.monocytogenes обнаружили у мышевидных грызунов рода Apodemus (52,6% от общего числа изолятов, полученных от грызунов; полевая и восточно-азиатская мыши), лесных полевок рода Myodes (47,4%; красная и красно-серая полевки), серой крысы, морских гидробионтов (1,4%; морской гребешок, морская звезда, морской еж, камбала). Среди обследованных грызунов, отловленных на территории края, по числу инфицированных патогенным для человека и животных видом L.monocytogenes доминировала полевая мышь (Ap. agrarius), обитающая на равнинной территории Приморского края. Было также зафиксировано выделение L.monocytogenes из воды и ила реки Кневичи. Полученные результаты свидетельствуют о существовании на Дальнем Востоке РФ патогенных бактерий L.monocytogenes в естественных экосистемах.

Следствием широкого распространения листерий в природе явилось выделение возбудителя от людей (из абортированных плодов, клинического материала от беременных женщин, плацент, трупного материала от больного, умершего от листериозного менингита).

Обращает на себя внимание выделение из биологических объектов на территории Дальнего Востока и других видов листерий - L.ivanovii (0,1% от числа изолятов), L.innocua (0,2%), L.seeligeri (0,3%). Эти микроорганизмы обнаружены в пробах из органов грызунов (0,3%), морских гидробионтов (0,4%).

Сравнительный анализ микробиологических свойств L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России. Для решения вопроса о стабильности или изменчивости микробиологических свойств листерий, изолированных в различных регионах России, коллекции культур L. monocytogenes, выделенных в Дальневосточном регионе и Европейской части России, были исследованы по культурально-биологическим и ферментативным свойствам.

Для обеих коллекций отмечена стабильность биологических свойств листерий – типичный рост колоний на питательных средах с характерным кисломолочным запахом, при нормальном освещении колонии имеют голубовато-серый цвет, характерное голубое или голубовато-зеленое свечение в косо-проходящем свете, наличие каталазной и гемолитической активности, подвижность при 20-220С и ее отсутствие у большинства культур при 370С, отсутствие оксидазной активности.

У культур L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России, не было найдено выраженных отличий и по биохимическим свойствам. Все культуры L.monocytogenes независимо от их происхождения сбраживали с образованием кислоты – глюкозу, фруктозу, рамнозу, эскулин, мальтозу, салицин и не ферментировали ксилозу, раффинозу, мочевину, маннит, адонит.

Вариабельные результаты в зависимости от региона выделения листерии показали по отношению к мелецитозе, арабинозе, крахмалу, образованию ацетилметилкарбинола в реакциях с метиловым красным и Фогес-Проскауэра (табл. 1). Культуры L.monocytogenes, выделенные на Дальнем Востоке в большинстве ферментировали мелецитозу, арабинозу, крахмал и образовывали ацетилметилкарбинол, по сравнению с культурами листерий из Европейской части России.

Таблица 1

Биохимические свойства L.monocytogenes, выделенных

на Дальнем Востоке и в Европейской части России

Углевод

Ферментирование углевода L.monocytogenes в

зависимости от региона выделения

(M ± m, % культур)

Дальний Восток

(n=102)

Европейская часть (n=41)

Достоверность различий, р

Мелецитоза

82,4 ± 3,8

56,1 ± 7,7

< 0,05

Арабиноза

25,5 ± 4,3

0

< 0,01

Крахмал

8,8 ± 2,8

0

< 0,05

Глюкоза (в реакции с метиловым красным)

12,7 ± 3,3

68,3 ± 7,3

< 0,01

Глюкоза (в реакции Фогес-Проскауэра)

23,5 ± 4,2

51,2 ± 7,8

< 0,05

Для выявления отличительных особенностей среди L.monocytogenes в зависимости от источника изоляции было выделено 4 группы культур (независимо от региона): 1) от мертворожденных плодов, 2) от мышевидных грызунов, 3) из морских гидробионтов, 4) пищевых продуктов (как контроль) (табл.2).

Таблица 2

Биохимические свойства L.monocytogenes в зависимости

от группы сравнения

Группа

сравнения

Ферментирование углевода L.monocytogenes в

зависимости от источника выделения

(M ± m, % культур)

мелецитоза

сахароза

глюкоза

(в реакции с метиловым красным)

Мертворожденные плоды (n=21)

95,2±4,8*

85,7±7,8*

42,9±11,1*

Морские гидробионты (n=16)

81,3±10,1**

56,3±12,8**

18,8±10,1**

Грызуны (n=25)

84,0 ±7,5*

72,0±11,6**

44,0±10,1*

Пищевые продукты (n=59)

(контроль)

64,4±6,2

47,5±6,5

16,9±4,9

Примечание: * - р < 0,05;  ** - р > 0,05 

Выявлено, что чаще разлагали мелецитозу и образовывали ацетилметилкарбинол в реакции с метиловым красным L.monocytogenes в группах «Мертворожденные плоды» и «Грызуны», сахарозу - культуры из группы «Мертворожденные плоды» по сравнению с культурами листерий контрольной группы.

Сравнительный анализ патогенных свойств L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России. В последние годы достигнут существенный прогресс в изучении различных факторов патогенности листерий. Без учета патогенного потенциала невозможно оценить клинико-эпидемиологическое значение того или иного штамма L.monocytogenes.

С помощью микробиологических методов у культур L.monocytogenes была исследована ферментативная активность, связанная с их патогенностью (табл.3). Не было найдено статистически значимых отличий по ферментативной активности у культур L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ. Выявлены отличия в ферментативной активности (гиалуронидазной, лецитиназной и липазной в отношении к твину 80 и 20) только в зависимости от источника выделения.

Таблица 3

Ферментативная активность, связанная с патогенностью, у L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и

в Европейской части России

Активность

% обнаружения в зависимости от

источника изоляции культуры

Продукты

питания (n=50)

Мертворожденные

плоды (n=20)

Морские гидроби-онты (n=20)

Грызуны (n=28)

Каталазная

100,0

100,0

100,0

100,0

Гемолитическая

100,0

100,0

100,0

100,0

Гиалуронидазная

92,0 ±3,8

100,0*

60,0±11,2**

100,0*

Лецитиназная

79,5±6,4

100,0**

81,8±8,4*

80,0±7,4*

Липазная в отношении:  твин 20

  твин 60

  твин 80

60,0±9,1

20,0±9,2**

50,0±11,5*

82,1±7,4*

100,0

100,0

100,0

100,0

62,0±8,7

10,0±6,9***

30,0±10,5**

75,0±8,3*

       Примечание: * - р > 0,05; ** - р < 0,05; *** - р < 0,01

В экспериментах in vivo изучена вирулентность культур L.monocytogenes на белых неинбредных мышах и морских свинках. По вирулентности для белых мышей культуры L.monocytogenes были чрезвычайно неоднородны. Встречались листериозные культуры как вирулентные, так и слабовирулентные, независимо от источника их выделения. Часть изолятов L.monocytogenes вызывала развитие парезов или параличей у белых мышей, а у морских свинок развивался конъюнктивит, кератоконъюнктивит или кератит, протекавшие с различной длительностью и выраженностью. Нами не установлено связи между вирулентностью штаммов L.monocytogenes, географическим местом и объектом их выделения.

Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes, выделенных в различных регионах России (Дальний Восток и Европейская часть). В процессе адаптации микроорганизма к определенным условиям существования немаловажное значение отводится резистентности к антибиотикам (Домарадский И.В., 1997). Анализ антибиотикорезистентности изолятов L.monocytogenes с использованием диско-диффузионного метода показал, что изоляты листерий в той или иной степени устойчивы к действию 28 антибактериальных препаратов из 33 использованных. Все культуры L.monocytogenes (100%) оказались резистентными к цефалоспоринам II и III поколения (цефуроксиму и цефтазидиму, цефотаксиму, цефтриаксону, цефаперазону соответственно), налидиксовой кислоте и полимиксину. Высокий уровень резистентности L.monocytogenes был обнаружен к цефалоспорину I (цефалексину) и фторхинолонам (пефлоксацину, ломефлоксацину, ципрофлоксацину).

Все исследуемые культуры листерий обладали полиантибиотикорезистентностью. Отмечено, что наименьший индекс множественной антибиотикорезистентности (МАР) определялся у культур L.monocytogenes, изолированных из пищевых продуктов, особенно из Европейской части РФ (индекс МАР = 0,03 – 0,2) (табл.4).

Наиболее выраженная множественная антибиотикорезистентность отмечалась у культур L.monocytogenes, изолированных из объектов окружающей среды, клинических изолятов, органов животных. В ходе исследований не было отмечено существенных различий в чувствительности к антимикробным препаратам и между культурами, изолированных из клинического материала, органов грызунов, объектов окружающей среды (в том числе из пищевых продуктов), что согласуется с данными других исследователей (Тартаковский И.С. и др., 2002, Troxler R. et al., 2000).

Не выявлено зависимости между антибиотикорезистентностью культур L.monocytogenes и их вирулентностью для животных.

Таблица 4

Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ из различных источников

Источник

Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes (индекс МАР) в зависимости от региона изоляции

Дальний

Восток

Европейская

часть РФ

Пищевые продукты

0,14 - 0,62

0,03 – 0,2

Объекты окружающей среды

0,36 – 0,47

не исследовали

Клинический материал

0,24 – 0,54

0,1 – 0,6

Морские гидробионты

0,15 – 0,47

0,27 – 0,45

Грызуны

0,18 – 0,53

0,36 – 0,47

Независимо от источника выделения, все тестируемые культуры L.monocytogenes показали высокую чувствительность к антибактериальным препаратам из групп: пенициллинов (пенициллину, ампициллину, карбенициллину, амоксициллину, амоксиклаву (амоксициллин/клавуланат)), тетрациклинов (доксициклину, тетрациклину), гликопептидов (ванкомицину), а также к гентамицину, цефалоспорину I поколения (цефазолину), рокситромицину, кларитромицину, рифампицину, меропенему, офлоксацину, хлорамфениколу, что также согласуется с данными других исследователей (Тартаковский И.С. и др., 2002, Hof H., 1997, 2004, Safdar A., 2003, Troxler R., 2000).

Таким образом, анализ биологических свойств L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и Европейской части России из различных источников, показал, что подавляющее большинство культур обладали однотипными свойствами. Свойства штаммов, выделенных на территории Дальнего Востока и в Европейской части России, оказались тождественными свойствам типовых штаммов листерий, что позволяет уверенно рассматривать их как типичные для L.monocytogenes. Наличие отдельных штаммов, имеющих некоторые атипичные свойства (отсутствие способности проявлять -гемолитическую, лецитиназную активности, ферментировать отдельные углеводы, наличие подвижности при температуре 370С), не меняет общего представления о возбудителе.

Отмеченная вариабельность подвижности, биохимической и ферментативной активности факторов патогенности, антибиотикорезистентности L.monocytogenes указывала на определенную фенотипическую неоднородность природных популяций L.monocytogenes. Важно отметить, что проведенные исследования еще раз показали необходимость учитывать при идентификации культур, предполагаемых как листерии, всю совокупность признаков и свойств, а не совпадение отдельных из них. Правильная идентификация возбудителя приобретает большое значение еще и в связи с тем, что на сегодняшний день именно бактериологическое подтверждение диагноза остается единственно достоверным (Тартаковский И.С. и др., 2002). Однако необходимо подчеркнуть, что полученные результаты не позволили выделить специфические особенности, характерные для штаммов листерий, изолированных из определенных источников, в частности, из клинических изолятов. Поэтому с целью выявления специфических особенностей эпидемически значимых штаммов, мы обратились к молекулярно-генетическим методам исследования.

Генетическая вариабельность штаммов L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России

В нашей стране до настоящего времени работа по характеристике внутривидовой генетической вариабельности, в том числе факторов патогенности у L.monocytogenes, и определению их связи с источниками изоляции не проводилась. Коллекции культур L. monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ были проанализированы на присутствие генов, кодирующих интерналины, и другие факторы инвазии (гены actA и aut) с помощью ПЦР.

Не было обнаружено отличительных особенностей встречаемости генов, кодирующих белки-интерналины у штаммов L.monocytogenes, выделенных в различных регионах РФ, но выявлены различия в частоте встречаемости генов, кодирующих отдельные интерналины, в зависимости от источника выделения (табл. 5).

Таблица 5

Встречаемость генов, кодирующих интерналины и другие

факторы инвазии у культур L. monocytogenes (% культур)

Ген

Культуры L.monocytogenes, изолированные от/из

Мертворожденных плодов (n=36)

Органов

животных (n=54)

Продуктов питания

(n=31)

inlA

100,0

100,0

100,0

inlB

100,0

100,0

96,8

ilnC

100,0

100,0

96,8

inlE

100,0

100,0

96,8

inlF

100,0

72,2

54,8

inlG

40,0

3,7

54,8

inlH

20,0

3,7

29,03

actA

100,0

100,0

100,0

aut

33,3

12,1

51,6

Только ген inlA, кодирующий InlA, был обнаружен у всех исследованных штаммов. Гены inlB, inlC, inlE были выявлены у всех изолятов L. monocytogenes, выделенных из эукариотических организмов, включая человека. Штаммы L. monocytogenes, у которых данные гены не выявлялись методом ПЦР, встречались только среди изолятов из продуктов питания.

Встречаемость генов inlF, inlG и inlH существенно отличалась от вышеописанных генов (табл. 5). Полимеразная цепная реакция давала положительный ответ только у части культур, что говорит о том, что у остальных культур L.monocytogenes данные гены отсутствуют, либо область связывания праймеров вариабельна.

Кроме того, проведенный скрининг показал вариабельность в размере гена inlF (табл.6). Аллель гена inlF, дающий укороченный продукт в ПЦР, преобладал среди культур, выделенных из морских гидробионтов. Данный аллель гена inlF не встречался среди культур L.monocytogenes из других источников.

Таблица 6

Вариабельность гена inlF у культур L. monocytogenes,

выделенных из различных источников

Продукт ПЦР

с праймерами inlF1-inlF2

Мертворожденные плоды (n=36),

(% культур)

Животные

(n=43),

(% культур)

Продукты

питания

(n=27),

(% культур)

Грызуны

(n=19)

Морские

гидробионты

(n=24)

нормальный

100,0

84,2

4,2

51,8

укороченный

0

0

70,8

0

удлиненный

0

0

4,2

3,7

отсутствует

0

15,8

20,8

44,4

Экспериментальное изучение рядом авторов роли продуктов генов inlG и inlH показало, что эти белки не только не являются необходимыми в процессе внутриклеточной инфекции, но, напротив, частично подавляют адгезию и инвазию L. monocytogenes in vitro (Bergmann B. et al., 2002). В наших исследованиях эти гены были выявлены у двух из трех культур L.monocytogenes, относящихся ко второй филогенетической линии и изолированных у здоровых носителей, в то время как среди культур, выделенных от больных людей с клиническими проявлениями листериоза, ген inlG был выявлен у двух, а inlH у одного из пяти изолятов. Важно также отметить, что гены inlG и inlH не выявлялись у подавляющего большинства штаммов L. monocytogenes, изолированных из животных. Полученные нами данные подтверждают предположение о том, что белки InlG и InlH не являются необходимыми для развития листериозной инфекции.

Таким образом, установлено, что штаммоспецифический полиморфизм спектра интерналинов у L.monocytogenes коррелирует с источником выделения штамма и не зависит от региона изоляции.

Результаты, полученные при выявлении генов, кодирующих белки ActA и Auto, показали наличие гена, кодирующего белок ActА, у всех без исключения штаммов L.monocytogenes. Ген аut, кодирующий белок Auto, методом ПЦР обнаруживали менее чем у половины штаммов L.monocytogenes, изолированных как на Дальнем Востоке, так и в Европейской части России (32,9 и 25% соответственно). Ген аut, чаще определялся среди L.monocytogenes, изолированных из пищевых продуктов (51,6 %), и реже - среди штаммов листерий, изолированных из клинического материала (34,5 %) и из органов грызунов (18,7 %).

Таким образом, нами были выявлены гены факторов инвазии, которые встречаются у подавляющего большинства изолятов L.monocytoge-nes,выделенных из эукариотических организмов, включая человека, - inlA, inlB, inlC, inlE. Эти гены были использованы нами в качестве мишеней для разработки системы генотипирования.

Сравнительный анализ полиморфизма генов, кодирующих белки-интерналины (inlA, inlB, inlC, inlE), и гена prs у штаммов L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и Европейской части России

Анализ полиморфизма был проведен для генов факторов инвазии, которые, как описано выше, присутствовали у всех культур L. monocytogenes. Такими генами являются гены интерналинов inlA, inlB, inlC, inlE. Была изучена вариабельность внутренних фрагментов этих генов, а именно фрагментов, кодирующих LRR-домены, непосредственно вовлеченные в процесс взаимодействия интерналинов со специфическими рецепторами эукариот. Кроме генов, кодирующих интерналины, был секвенирован внутренний фрагмент гена prs, кодирующего фосфорибозилсинтазу - белок общего метаболизма, выявленный у всех представителей рода Listeria (табл.7).

Таблица 7

Сравнительный анализ секвенированных фрагментов генов у культур L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и Европейской части Российской Федерации

Ген

Длина

фрагмента,

пн

(% общей ОРФ)

Амино-кислоты

Число замен

Число аллелей

синони-мичных

несинонимичных

линия специфичных

несинони-мичных

общее

специ-фичных для ЕЧ

специ-фич-ных для ДВ

inlA

648 (27)

54-269

14

6

0

11

5

3

inlB

618 (33)

64-269

37

25

7

18

5

12

inlC

586 (66)

70-264

17

8

4

12

3

7

inlE

558 (37)

82-267

45

46

29

11

4

4

prs

618 (66)

39-244

24

1

0

6

3

1

Примечание: ОРФ - открытая рамка считывания, ЕЧ – Европейская часть России, ДВ – Дальний Восток.

У гена prs все замены (24), кроме одной, были синонимичны. Отсутствие несинонимичных замен в последовательности гена prs подтверждает представление об отсутствии адаптивной вариабельности среди белков общего метаболизма и отражает аминокислотную стабильность этого белка для изолятов L.monocytogenes, эволюционирующих в разных условиях.

Напротив, интерналины характеризовались значительной изменчивостью, в том числе на аминокислотном уровне. Наибольшую вариабельность продемонстрировали гены inlE и inlB, у которых было выявлено 45 и 37 синонимичных, 46 и 25 несинонимичных замен, соответственно. Фрагменты генов inlA и inlC были более консервативны (14 и 17 – синонимичных, 6 и 8 – несинонимичных замен соответственно). Установлено наличие специфических аллелей генов inlA, inlB, inlC, inlE, prs, присущих определенному географическому региону (табл.7).

Для всех пяти маркерных фрагментов в сумме было выявлено 223 единичных нуклеотидных замен. Высокая вариабельность изученных генов позволила нам разработать систему типирования, описанную ниже.

Филогенетическая характеристика популяции L.monocytogenes, распространенной на Дальнем Востоке Российской Федерации

Прежде чем приступать к разработке независимой системы типирования, мы охарактеризовали филогенетическую структуру популяции L.monocytogenes, распространенной на Дальнем Востоке, уже существующими методами.

Известно, что бактерии вида L.monocytogenes имеют сложную антигенную структуру и включают 13 серологических вариантов. Большая часть случаев заболеваний листериозом связана с серовариантами 4b, 1/2a, 1/2b, причем эпидемические вспышки заболевания чаще всего связаны с серовариантом 4b. За последние годы установлено, что внутри вида L.monocytogenes выделяют три филогенетические линии, отличающиеся по своему эпидемиологическому потенциалу, каждая из которых объединяет штаммы, принадлежащие к определенным серовариантам (Piffaretti J.C. et al., 1989, Wiedman M. et al., 1997, Doumith M. et al., 2004).

С целью оценки вариабельности и эпидемиологической значимости изолятов L.monocytogenes, выделенных из разнообразных источников, первоначально нами были использованы методы серо- и фаготипирования.

В нашей стране для серотипирования используются сыворотки двух вариантов. Отмечено, что большинство дальневосточных культур L.monocytogenes, принадлежали ко второй серогруппе согласно отечественной классификации. Культуры L.monocytogenes, изолированные из пищевых продуктов, в большинстве (72,2±7,5%) относились к первой серогруппе (рис.1).

Рис. 1. Частота встречаемости (%) L.monocytogenes различных серогрупп на территории РФ: ДВ – Дальний Восток, ЕЧ – Европейская часть РФ.

Результаты, полученные при изучении коллекции L.monocytogenes, показали, что среди дальневосточных L. monocytogenes 34,1±7,1% культур типировались бактериофагом L-4A, 15,9±5,5 % культур – бактериофагом L-2А (рис.2).

Рис. 2. Фаговарианты (%) культур L.monocytogenes, изолированных из различных источников в Дальневосточном регионе (ДВ) и Европейской части (ЕЧ) России.

В то же время анализ антигенной структуры штаммов L.monocytogenes с использованием отечественных сывороток и бактериофагов двух типов показал относительно низкую специфичность данной системы дифференциации. Кроме того, ее низкая разрешающая способность не позволяет проводить анализ эпидемически значимых штаммов листерий.

Исследования, выполненные с помощью метода мультиплексной ПЦР, предложенной (Doumith М. al., 2004), позволили более детально охарактеризовать структуру популяции L.monocytogenes, распространенной на разных территориях России, и прежде всего, установить преобладание эпидемиологически значимого сероварианта 4b среди L. monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке (табл. 8).

Таблица 8

Типирование культур L.monocytogenes,изолированных в

Дальневосточном регионе и Европейской части РФ, на основе выявления генетических маркеров, специфичных для определенных серогрупп

Серогруппа

Частота выделения культур в зависимости от

территории изоляции L.monocytogenes (%)

p

Дальний Восток (n=52)

Европейская часть (n=17)

1/2a

19,2±5,5

41,17±12,3

< 0,05

1/2b

3,8±2,6

11,8±8,1

> 0,05

1/2c

1,92±1,9

17,64±9,5

< 0,05

4b

75,4±6,0

29,4±11,4

< 0,01

Таким образом, полученные результаты показали гетерогенность штаммов L.monocytogenes, изолированных из различных объектов на территории России. Однако использованные методы характеризовались низкой дискриминационной способностью, не отражали полной картины вариабельности популяции и не выявляли степени генетического родства между эпидемическими и неэпидемическими штаммами L.monocytogenes.

В последние годы для типирования наиболее значимых в эпидемиологическом отношении штаммов L.monocytogenes разрабатываются молекулярно-генетические методы, среди которых мультилокусное секвенирование превосходит все остальные по воспроизводимости и, во многих случаях, по разрешающей способности. Для разработки системы типирования нами было выбрано 40 независимых культур L. monocytogenes, изолированных в разных регионах России (Дальний Восток и Европейская часть России), у которых было осуществлено секвенирование внутренних областей генов inlA, inlB, inlC, inlE и prs, по схеме, описанной выше (табл. 7).

Суммарная длина конкатемеров, включающих фрагменты 5 маркерных генов, равнялась 3029 н.п., что составляет около 0,1% хромосомной ДНК L.monocytogenes. Изучаемые последовательности относились к 25 аллелям. Только один изолят из 40 имел продолжительную делецию – изолят VIMHA009 имел делецию 69 п.н. в гене inlE. Остальные различия заключались в единичных нуклеотидных заменах. Вычисление индекса дискриминации (D.I.) для предлагаемого метода типирования дало величину 0,982. Это означает, что если два эпидемически не связанных изолята, принадлежащих к разным штаммам, будут произвольно выбраны из популяции, то в предлагаемом методе типирования с вероятностью 98 % они будут относиться к разным типам. Полученная величина, хотя и не является максимально возможной (теоретически максимально возможная величина для индекса дискриминации равна 1), обеспечивает приемлемый уровень дифференциации эпидемически не связанных изолятов.

Для установления филогенетических связей между изолятами L.monocytogenes была построена дендрограмма, с использованием метода минимальной эволюции (рис.3), которая позволила разделить L.monocytogenes на две группы, соответствующие описанным филогенетическим линиям и коррелирующие с принадлежностью к определенному сероварианту (Карпова Т.И. и соавт., 2003, Piffaretti J.C. et al., 1989, Wiedman M. et al., 1997).

Большинство культур L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе, принадлежали к первой филогенетической линии, наиболее опасной в эпидемическом плане (по Wiedman M. et al., 1997). Было отмечено, что среди изолятов L. monocytogenes, полученных из клинического материала (от мертворожденных плодов), от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди изолятов L. monocytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.

Рис. 3. Дендрограмма, устанавливающая степень схожести последовательностей ДНК среди изолятов L.monocytogenes.

Овальные скобки – два основных кластера, соответствующих I (нижняя) и II (верхняя) клональным линиям. Окружности – группы изолятов, имеющих идентичные последовательности изученных фрагментов; * – изоляты из разных регионов, образующие совместные кластеры.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами впервые установлена филогенетическая структура L. monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке, а также подтверждено существование двух филогенетических линий внутри вида L.monocytogenes.

Анализ филогенетической принадлежности изолятов L.monocytogenes в зависимости от региона и источника выделения

       Разработанная система была применена для анализа распределения штаммов L. monocytogenes в зависимости от региона и источника выделения. Используя данную систему, была осуществлена дифференциация всех имеющихся изолятов L.monocytogenes, выделенных в Дальневосточном и Европейском регионах РФ, которая выявила 32 сиквенс-типа (СТ) (табл.9).

Отмечено, что все сиквенс-типы имели региональную приуроченность. Среди изолятов листерий, выделенных на Дальнем Востоке, было найдено 19, а в Европейской части России – 13 сиквенс-типов. Не было найдено ни одного сиквенс-типа, который встречался бы в обоих регионах. Среди дальневосточных L.monocytogenes заметно преобладали СТ 1, СТ 9 и СТ 17. Не отмечено превалирования какого-либо сиквенс-типа среди L.monocytogenes, изолированных в Европейской части РФ.

Таким образом, доказано существование регион-специфического распределения штаммов L.monocytogenes на территории РФ. Кроме того, выявленное разнообразие сиквенс-типов предполагает поликлональное распределение вида L. monocytogenes в пределах географически отдаленных областей.

При анализе распределения сиквенс-типов в зависимости от источника выделения, было найдено, что некоторые сиквенс-типы обнаруживаются среди специфических хозяев с более высокой частотой, по сравнению с другими сиквенс-типами: СТ1, СТ5, СТ9 и СТ17 чаще встречались среди изолятов L.monocytogenes, полученных из мертворожденных плодов (группа «МП»), СТ1 – среди изолятов группы «Г» и СТ17 в группе «МГ» (табл. 9).

Таблица 9

Характеристика сиквенс-типов (СТ) среди изолятов L.monocytogenes,

полученных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ

СТ

Регион

Аллель

Число изолятов

Общее

В группе специфичного хозяина

inlA

inlB

inlC

inlE

prs

«МП»

«Н»

«Г»

«МГ»

«П»

1

ДВ

1

1

1

1

1

12

4

0

7

0

1

2

ДВ

1

3

1

1

1

1

1

0

0

0

0

3

ДВ

1

9

1

1

1

1

1

0

0

0

0

4

ДВ

1

9

1

4

2

2

1

0

0

0

1

5

ДВ

1

9

1

3

2

4

4

0

0

0

0

6

ДВ

1

10

1

3

2

1

1

0

0

0

0

7

ЕЧ

5

14

6

8

4

1

1

0

0

0

0

8

ЕЧ

5

14

6

10

5

1

1

0

0

0

0

9

ДВ

9

14

9

6

5

7

3

2

0

1

1

10

ЕЧ

8

14

6

10

5

2

0

1

0

0

1

11

ДВ

2

1

5

1

1

1

0

0

1

0

0

12

ДВ

10

14

8

7

6

2

0

0

2

0

0

13

ЕЧ

9

14

6

6

5

1

0

0

1

0

0

14

ЕЧ

2

7

4

1

1

1

0

0

0

0

1

15

ЕЧ

4

14

6

8

4

4

0

0

1

0

3

16

ЕЧ

6

12

6

6

5

1

0

0

0

0

1

17

ДВ

2

1

6

1

1

10

3

0

0

9

1

18

ДВ

2

5

4

1

1

1

0

0

0

1

0

19

ДВ

2

6

4

1

1

1

0

0

0

1

0

20

ДВ

2

2

4

1

1

1

0

0

0

1

0

21

ДВ

3

8

3

1

2

1

0

1

0

0

0

22

ДВ

2

1

4

1

1

1

0

1

0

0

0

23

ЕЧ

8

15

6

10

5

1

0

1

0

0

0

24

ЕЧ

4

15

6

8

4

1

0

1

0

0

0

25

ЕЧ

1

16

2

3

3

1

0

1

0

0

0

26

ЕЧ

4

14

6

8

4

1

0

1

0

0

0

27

ЕЧ

11

14

11

11

5

1

0

1

0

0

0

28

ЕЧ

9

11

7

8

6

1

0

0

0

0

1

29

ДВ

1

4

1

1

1

1

0

0

0

0

1

30

ДВ

7

18

9

6

5

1

0

0

0

0

1

31

ДВ

10

17

12

2

5

1

0

0

0

0

1

32

ДВ

7

13

10

9

5

1

0

0

0

0

1

Примечание: ДВ – Дальний Восток, ЕЧ – Европейская часть России, «МП» – изоляты L.monocytogenes, выделенные из мертворожденных плодов, «Н» – изоляты от носителей, «Г» - изоляты от грызунов, «МГ» – изоляты из морских гидробионтов, «П» – изоляты из продуктов, объектов окружающей среды и млекопитающих (кроме грызунов).

Важно отметить, что были выявлены два сиквенс-типа, к которым принадлежали как клинические изоляты, так и изоляты, полученные из дикой природы. Так, к СТ1 принадлежали культуры L.monocytogenes, выделенные от мертворожденных плодов, из окружающей среды и грызунов. К сиквенс-типу 17 принадлежали культуры L.monocytogenes, выделенные от морских гидробионтов, из морепродуктов из торговой сети и от мертворожденных. Полученные данные свидетельствуют о распространении в природных очагах штаммов L. monocytogenes, высоковирулентных для человека.

Для более детального выявления характеристик, которые могли быть специфическими для культур, выделенных из конкретных источников, мы установили частоту встречаемости определенных аллелей для каждого из генов в зависимости от источника выделения. В результате, впервые нами была обнаружена корреляция между источником выделения L.monocytogenes и аллелем генов инвазии (табл.10).

Таблица 10

Оценка достоверности неравномерного распределения аллелей генов

у штаммов L.monocytogenes, связанных с определенным видом хозяина

Группа

2 тест Пирсона

Тест рандомизации

p < 0,01

p<0,05

p<0,01

p<0,05

«МП»

inlA

inlC

inlB

inlA

inlC

«H»

inlB

«Г»

inlB

inlB

«МГ»

inlA

inlC

inlE

inlA

inlC

inlE

«П»

inlB

Примечание: «МП» – изоляты L.monocytogenes из мертворожденных плодов, «Н» – изоляты L.monocytogenes от носителей, «Г» – изоляты L.monocytogenes от грызунов, «МГ» – изоляты L.monocytogenes из морских гидробионтов, «П» – изоляты L.monocytogenes из объектов окружающей среды, пищевых продуктов, млекопитающих, кроме грызунов из группы «Г».

Анализ частоты встречаемости аллелей отдельных генов, кодирующих интерналины, у штаммов L.monocytogenes, изолированных от различных организмов, показал статистически достоверную неравномерность распределения аллелей некоторых генов у изолятов, полученных от конкретного хозяина (табл. 10). Для генов inlA и inlC специфические аллели преобладали среди культур L.monocytogenes, выделенных из мертворожденных плодов (группа «МП», аллели 1 и 5 для inlA, 1 и 6 для inlС); аллель 1 гена inlB преобладал среди культур, выделенных от грызунов (группа «Г»), но не других хозяев. В группе контроля (изоляты из пищевых продуктов, «П») все аллели изучаемых генов были распределены равномерно. Аллели гена prs были распределены однородно во всех группах.

Полученные данные позволяют предположить, что развитие внутриутробной листериозной инфекции у беременных женщин может быть связано с определенными аллелями генов inlA и inlC. Кроме того, полученные нами результаты свидетельствуют о значимости генов inlA и inlC как маркеров штаммов L. monocytogenes, представляющих повышенную опасность для беременных женщин в развитии листериоза у плода.

Отмеченное низкое генетическое разнообразие аллелей генов inlA, inlC и inlE у изолятов L.monocytogenes, полученных из морских гидробионтов на Дальнем Востоке России, предполагает, что эти изоляты могли быть потомством одного клона. В то же время они отличались по аллелям гена inlB, что предполагает отсутствие предпочтения аллелей гена inlB в возникновении инфекции у данной группы хозяев.

Таким образом, наши результаты предполагают распространенность специфических аллелей генов, кодирующих интерналины у культур L.monocytogenes, инфицирующих определенного хозяина. Наличие несинонимичных замен у генов, кодирующих интерналины, свидетельствует о возможности селективного отбора, в результате которого могут отбираться варианты, более адаптированные для выживания в определенных условиях и, поскольку интерналины принадлежат к факторам патогенности, для паразитирования в определенных хозяевах.

ВЫВОДЫ

  1. Создана комплексная система анализа микробиологических и молекулярно-генетических свойств возбудителя листериоза, L.monocytogenes, включающая: (1) оригинальные селективные и дифференциальные питательные среды на основе отечественного сырья; (2) адаптированные и оптимизированные для отечественных условий методы микробиологической дифференциации; (3) экспресс-методы выявления и идентификации возбудителя листериоза, основанные на ПЦР, специфичной в отношении консервативных фрагментов генов патогенности; (4) систему типирования L.monocytogenes на основе мультилокусного секвенирования генов факторов патогенности, позволяющую дифференцировать эпидемически несвязанные между собой изоляты листерий с индексом дискриминации 0,982. 
  2. Впервые дана комплексная характеристика бактерий вида L.monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке РФ; показано преобладание в этом регионе штаммов вида L.monocytogenes, относящихся к эпидемически значимому сероварианту 4b.
  3. Впервые доказано, что, несмотря на сходство морфологических, культуральных и биохимических свойств, дальневосточные и европейские штаммы L.monocytogenes могут быть дифференцированы с помощью методов молекулярно-генетического типирования. Установлены существование регион-специфического распределения штаммов L. monocytogenes на территории РФ, а также поликлональность распределения штаммов L. monocytogenes внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).
  4. Впервые установлена филогенетическая структура L. monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке. Подтверждено существование двух филогенетических линий внутри вида L.monocytogenes. Установлена связь между филогенетическим положением штамма L. monocytogenes и его эпидемиологическим потенциалом. Впервые показано, что среди изолятов L. monocytogenes из клинического материала, от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди изолятов L. monocytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.
  5. Впервые показано, что штаммы L. monocytogenes, распространенные в природе среди мышевидных грызунов и среди морских гидробионтов, вызывают внутриутробную инфекцию у человека. Это подтверждает предположение о возможности заноса вирулентных штаммов L. monocytogenes из окружающей среды в человеческую популяцию.
  6. Показано существование у L.monocytogenes штаммоспецифического полиморфизма спектра факторов инвазии - белков семейства интерналинов. Определено, что все культуры L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, независимо от региона изоляции, обладают генами inlA, inlB, inlE, inlC. Впервые установлено, что ген, кодирующий белок InlF, проявляет вариабельность в размере и последовательности нуклеотидов у L.monocytogenes, выделенных из разных источников; показано, что гены inlG и inlH не выявляются у большинства штаммов L.monocytogenes, изолированных из организма человека и животных. Эти данные свидетельствуют о том, что кодируемые этими генами белки InlG и InlH не являются необходимыми для возникновения листериозной инфекции.
  7. Впервые установлена корреляция между последовательностью определенных аллелей генов, кодирующих факторы инвазии, и частотой выделения штамма L. monocytogenes от разных хозяев. Среди штаммов, вызывающих развитие внутриутробной инфекции у человека, преобладают определенные аллели гена inlA, и гена inlC, кодирующих факторы инвазии InlA и InlC. Среди штаммов L. monocytogenes, выделенных от мышевидных грызунов, доминируют определенные аллели гена inlB, кодирующего функциональный домен фактора инвазии InlB.
  8. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности фрагментов генов inlA, inlB, inlC, inlE и prs показал значимость LRR-кодирующего фрагмента генов inlA и inlC, как маркера штаммов L.monocytogenes, представляющих повышенную эпидемиологическую опасность для развития листериоза у плода.
  9. Впервые комплексно определено влияние абиотических факторов среды на адгезивные свойства листерий. Установлено значение температуры, кислотности среды и экзогенных нуклеиновых кислот в изменении адгезивных свойств листериозного микроба, что может воздействовать на инициацию инфекционного процесса.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ:

- в науку:

  1. Использование метода мультилокусного секвенирования при типировании L. monocytogenes на основании полиморфизма генов интерналинов и гена prs позволит дифференцировать филогенетически удаленные штаммы листерий и штаммы, циркулирующие в географически удаленных областях, а также эпидемически несвязанные изоляты, что поможет решать задачи микробиологии и эпидемиологии. 
  2. Полученные нуклеотидные последовательности генов инвазии inlA, inlB, inlC inlE и гена общего метаболизма prs, депонированные в базе данных Международного GenBank, могут служить стандартами для исследования геномного полиморфизма штаммов L.monocytogenes в научных целях.

- в медицинскую практику:

1. Для здравоохранения разработана система микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга за возбудителем листериоза, что позволит проводить систематический анализ и прогнозирование заболеваемости этой инфекцией. Начиная с 2002 г. на базе лаборатории экологии патогенных бактерий НИИЭМ СО РАМН осуществляется мониторинг за возбудителем листериоза в Приморском крае и г. Владивостоке.

2. Для накопления культур возбудителей сапрозоонозов, включая бактерии рода Listeria, рекомендовано использовать питательные среды на основе молок дальневосточных рыб, которые обеспечивают активное размножение микробов (заявка на изобретение № 2008111691 от 26.03.2008 г. «Питательная среда для культивирования бактерий»; заявка на изобретение № 2008132232 от 4.08.2008 «Питательная среда для культивирования бактерий (ее варианты)»). Предложенные питательные среды (жидкие, агаризованные, в т.ч. сухие) предназначены для культивирования различных бактерий, обладают хорошими ростовыми свойствами и накопительным эффектом. Данные среды просты и экономичны в изготовлении, легко могут быть освоены на производстве и приготовлены в бактериологической лаборатории. Использование отходов рыбного производства – молок рыб различной стадии зрелости, в том числе текучих, позволяет расширить отечественную сырьевую базу для приготовления питательных бактериологических сред.

3. Для контроля за инфицированностью листериями пищевых продуктов и объектов окружающей среды рекомендовано использовать дифференциально-диагностическую среду (патент РФ № 2184782 от 10.07.2002 г. «Дифференциально-диагностическая среда для листерий»). Предложенная селективная среда не уступает по своим качествам известным селективно-дифференциальным средам для выделения листерий.

4. На начальных этапах бактериологического исследования рекомендовано использовать комплексную индикаторную среду для дифференциации бактерий рода Listeria (патент РФ № 2303060 от 20.07.2007 г. «Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria»), которая позволяет в первые 18-24 ч удалить посторонние микроорганизмы. Это сокращает использование дорогостоящих сред и реактивов, ускоряет процесс идентификации листерий в сравнительно короткие сроки, что значительно упрощает работу врача-бактериолога (методическое пособие «Питательные среды для изоляции, типирования и идентификации бактерий рода Listeria» /авторы Е.А. Зайцева, Г.П. Сомов, Л.Н. Фатеева, Г.Г. Компанец, Н.Г. Плехова. Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2008).

5. Предприятиям, деятельность которых связана с пищевой продукцией, в том числе пищеблокам различных учреждений, рекомендовано усилить меры по профилактике листериоза (информационное письмо «Listeria monocytogenes - новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» / авторы Л.Н. Федянина, Е.А. Зайцева, Т.К. Каленик, В.Б. Светлов. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2006).

6. Бактериологическим лабораториям, осуществляющим диагностику инфекционных заболеваний, рекомендовано активизировать работу по изоляции патогенного вида L.monocytogenes из клинического материала и пищевых продуктов (методические рекомендации «Лабораторная диагностика листериоза» / авторы Е.А. Зайцева, Г.П. Сомов, Л.С. Бузолева, Т.А. Глазырина. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. - 2006; методическое пособие «Питательные среды для изоляции, типирования и идентификации бактерий рода Listeria» / авторы Е.А. Зайцева, Г.П. Сомов, Л.Н. Фатеева, Г.Г. Компанец, Н.Г. Плехова. Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2008).

- в учебный процесс:

Материалы диссертации рекомендовано использовать при преподавании курса медицинской микробиологии, экологии бактерий, эпидемиологии, инфекционных болезней.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Терехова В.Е., Сомов Г.П. Биохимические механизмы адаптации Listeria monocytogenes к факторам окружающей среды // Листериоз на рубеже тысячелетий: материалы межд. конференции. Покров, 18-20 мая 1999 г. С.91 - 93.

2. Сомов Г.П., Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Терехова В.Е. О существовании патогенных бактерий в окружающей среде // Вестник ДВО РАН. 2000. № 3. С. 3 9.

3. Зайцева Е.А., Терехова В.Е. Эколого-эпидемические особенности Listeria monocytogenes в Приморском крае // Тихоокеанский мед. журнал. Спец. выпуск. 2001. №2. С.29 - 31.

4. Зайцева Е.А., Бузолева Л.С., Терехова В.Е. и др. Изоляция Listeria monocytogenes из  различных объектов в Приморском крае и их биологические свойства // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. № 1. С. 47 - 49.

5. Терехова В.Е., Бузолева Л.С., Айздайчер Н.А., Зайцева Е.А. и др. Окраинные моря северо-западной части Тихого океана как среда обитания Listeria monocytogenes и эпидемиологическое значение этого явления // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. №1. С. 43 46.

6. Глазырина Т.А., Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий /Патент № 2184782 Российской Федерации. Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 2.11.1999. Опубл. 10.07.2002.

7. Зайцева Е.А. Распространение бактерий рода Listeria на территории Приморского края // Ветеринарная патология. 2004. Т 4, № 11. С. 28 – 31.

8. Зайцева Е.А. Изучение чувствительности к антимикробным препаратам штаммов Listeria monocytogenes, выделенных в Приморском крае. // Антибиотики и химиотерапия. 2005. Т. 50. № 7. С. 27 - 31.

9. Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации бактерий Listeria monocytogenes // Генодиагностика инфекционных болезней: материалы Российской научно-практической конференции. «Сосновка», Новосиб.обл., 25-27 октября 2005. С. 112 - 114.

10. Федянина Л.Н., Зайцева Е.А., Эпштейн Л.М. и др. Влияние ДНК из молок лососевых рыб на Т-клеточный иммунитет в эксперименте // Антибиотики и химиотерапия. 2005. № 2 - 3. С. 14 - 17.

11. Зайцева Е.А. О контаминации пищевых продуктов Listeria monocytogenes в Приморском крае // Оптимальное питание – здоровье нации: материалы VIII Всерос. Конгресса к 75-летию Государственного учреждения Науч.-исслед. инст. питания РАМН. Москва, 2005. С. 97.

12. Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Микробиологическая характеристика Listeria monocytogenes, изолированных из различных источников в Приморском крае // Журн. микробиол. 2006. № 2. С. 3 - 6.

13. Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Влияние температуры на адгезивные свойства листерий // Журн. микробиол., Приложение. 2006. № 3. С. 20 - 23.

14. Зайцева Е.А., Федянина Л.Н., Потапова В.В., Беседнова Н.Н. Влияние ДНК из молок лососевых рыб на адгезивные свойства Listeria monocytogenes и выживаемость белых мышей при экспериментальном листериозе // Журн. микробиол., Приложение. 2006. № 3. С. 61 - 64.

15. Федянина Л.Н., Зайцева Е.А., Каленик Т.К. .Изучение эффективности применения биологически активного вещества ДНК из молок лососевых рыб при экспериментальном листериозе // Журн. микробиол., Приложение. 2006. № 3. С. 65 68.

16. Зайцева Е.А., Федянина Л.Н., Коленченко Г.Н., Антоненко О.М. Listeria monocytogenes – новый микробиологический показатель безопасности пищевых продуктов // Мясная индустрия. 2006. № 4. С. 30-32.

17. Зайцева Е.А., Ермолаева С.А, Сомов Г.П. Гены, кодирующие факторы инвазии у штаммов Listeria monocytogenes, изолированных в Европейской части и Дальневосточном регионе России // Журн. микробиол. 2006. № 4. С. 42 - 44.

18. Зайцева Е.А., Ермолаева С.А., Пуховская Н.М. и др. Эпидемиологическая значимость Listeria monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе из клинического материала // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: материалы III Российская научно-практическая конференция с международным участием. Новосибирск, 27-29 сентября 2006 г. С. 192–193.

19. Zaytseva E.A., Ermolaeva S.A., Somov G.P. Genes coding invasion factors in Listeria monocytogenes strains isolated from macroorganisms on the Russian Far East // 2nd FEMS Congress of European Microbiologists: abstr. Madrid, Spain. 5-8 Jule, 2006. P. 134.

20. Zaytseva E., Ermolaeva S., Somov G. Genes coding invasion factors in Listeria monocytogenes strains isolated on the Russian Far East // 11th International Symposium on Microbial Ecology: abstr. Vienna, Аustria, 20-25 August 2006. P. 442.

21. Зайцева Е.А., Сомов Г.П., Бузолева Л.С., Глазырина Т.А. Лабораторная диагностика листериоза: методические рекомендации. Владивосток. 2006. 44 с.

22. Зайцева Е.А., Ермолаева С.А., Сомов Г.П. Гены, кодирующие факторы инвазии, у штаммов Listeria monocytogenes, изолированных из пищевых продуктов // Бюллетень СО РАМН. Приложение: материалы конференции. Новосибирск, 12-16 июня, 2006. С.231-232.

23. Зайцева Е.А., Пуховская Н.М., Мусатов Ю.С. и др. Молекулярно-генетические особенности и эпидемиологическая значимость штаммов Listeria monocytogenes, выделенных от беременных женщин и из абортного материала в дальневосточном регионе России // Клин. микробиол., антимикроб. химиотер. 2007. Т. 9. № 1. С.81-89.

24. Zaytseva E.A., Ermolaeva S.A., Somov G.P. Phylogenetic features of Listeria monocytogenes clinical strains isolated on the Russian Far East // 16th International Symposium on Problems of Listeriosis. ISOPOL XVI: abstr. Savannah, Georgia, USA. March 20-23, 2007. P-16.

25. Zaytseva E.A. , Ermolaeva S.A., Somov G.P. SNP analysis of the virulence gene inlB and the housekeeping gene prs in Listeria monocytogenes isolated in the Far East of Russia // 9th Symposium on Bacterial Genetics and Ecology – Bageco-9: abstr. Wernigerode, Germany. 23-27 June 2007. P. 82.

26. Zaytseva E.A., Pukhovskaya N.M., Musatov Y.S., Ivanov L.I., Ermolaeva S.A., Somov G.P. Genetic diversity and epidemiological significance of Listeria monocytogenes from pregnant women and aborted fetuses on the Russian Far East // 5thWorld Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases: abstr. Bangkok, Thailand. November 15-18, 2007. P. 51.

27. Зайцева Е.А., Кушнарева Т.В., Ермолаева С.А. Диагностический мониторинг за листериозной инфекцией в очаге ГЛПС на территории Приморского края // Молекулярная диагностика – 2007: материалы 6-ой Всероссийской научно-практической конф. с межд. участием. М., 2007. Т. 2. С. 298–299.

28. Zaytseva E., Ermolaeva S., Somov G.P. Low genetic diversity and epidemiological significance of Listeria monocytogenes isolated from wild animals in the Far East of Russia // Infect. Genet. Evol. 2007. Vol. 7, No. 6. P. 736-742.

29. Зайцева Е.А., Глазырина Т.А., Сомов Г.П. Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria / Патент № 2303060 Российской Федерации. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 28.12.2005. Опубл. 20.07.2007.

30. Зайцева Е.А., Савина О.Г., Ерохина Л.Г., Гордеец А.В. Выявление Listeria monocytogenes у больных с клиникой инфекционного мононуклеоза // Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний: материалы Всероссийской научной конференции. Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. № 2 (22). Приложение, Часть I. С. 225–226.

31. Зайцева Е.А., Ермолаева С.А., Сомов Г.П. Филогенетические особенности L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке России // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: материалы 4 межд. конф. Санкт-Петербург. 2 - 4 июня 2008 г. С. 147.

32. Зайцева Е.А., Ермолаева С.А., Сомов Г.П. Распространение Listeria monocytogenes среди мышевидных грызунов на территории Приморского края // Тихоокеанский мед. журнал. 2008. № 2. С. 65 - 69.

33. Зайцева Е.А., Сомов Г.П., Фатеева Л.Н.и др. Питательные среды для выделения, типирования и идентификации бактерий рода Listeria: методическое пособие для бактериологов. Владивосток. 2008. 76 с

34. Зайцева Е.А., Беляев К.Р., Егорова И.Ю. и др. Дифференциация штаммов Listeria monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России, на основе полиморфизма генов, кодирующих факторы инвазии // Журн. микробиол. 2008. № 6. С. 10 14.

35. Зайцева Е.А., Фатеева Л.Н., Кривошеева А.М., Сомов Г.П. Питательная среда на основе молок рыб для культивирования бактерий // Известия ТИНРО. 2009. Т. 157. С. 229-236.

36. Зайцева Е.А., Глазырина Т.А., Сомов Г.П. Ускоренный метод дифференциации бактерий рода Listeria // Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 6. С.46 - 48.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.