WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

                                                                       На правах рукописи

ПРОШИН

Сергей Николаевич

СИАЛИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК НЕЙРАЛЬНОГО И МЫШЕЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание учёной степени

доктора медицинских наук

03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена во ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова» МЧС России

Научный консультант

доктор медицинских наук профессор Петр Дмитриевич Шабанов

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук профессор Сергей Викторович Чепур

доктор медицинских наук Дмитрий Эдуардович Коржевский

доктор медицинских наук Ирина Алексеевна Одинцова

Ведущее учреждение

Санкт–Петербургская государственная медицинская академия

им. И.И. Мечникова

Защита состоится “ ”  марта 2009 г. в  11.00 часов на заседании специализированного учёного совета Д 001.022.02 по защите кандидатских и докторских диссертаций при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Автореферат разослан “__”  2009 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук                                        П.А. Дыбан

                                                                       

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изменение морфологических свойств клетки в ответ на воздействие внешних и/или внутренних факторов характеризует её состояние. В связи с этим необходимо исследование механизмов, регулирующих эти изменения.  Возможность клеточного ответа на определённый стимул – будь то трофический фактор (синтез факторов роста или дифференцировки) или физико–химическое воздействие, – обеспечивается комплексным взаимодействием сопряжённых молекулярных систем, которые расположены как на мембранах, так и в ядре клетки. Плазматическая мембрана является динамичной структурой со сложной организацией. Гликосфинголипиды и ферменты, модулирующие их, способны образовывать надмолекулярные системы плазматической мембраны, которые особенно насыщены ганглиозидами. Ганглиозиды, являясь неотъемлемой составной частью плазматической мембраны любой эукариотической клетки, подвергаются гидролизу ферментом сиалидазой, элиминирующим молекулы сиаловой кислоты из их структуры. Изменение количества молекул сиаловой кислоты приводит к качественным изменениям ганглиозидов, что активирует или тормозит ряд протеинкиназ. Протеинкиназы, в свою очередь, осуществляют фосфорилирование ряда белков, что стимулирует или снижает транскрипцию определённых генов. Несмотря на значительные достижения в исследовании клеточного генома, нет полной ясности о том, как реализуют своё действие уникальные гены в клетках эукариот. 

К настоящему времени уже не вызывает сомнения, что сиалидазы играют важную роль в изменении морфологических свойств клеток. Показано, что накопление сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в области окончания одного из отростков способствует его росту (Rodriguez  et al., 2001). Ассиметричное перераспределение сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ) локально повышает активность тирозинкиназы A, которая, в свою очередь, стимулирует активность фосфатидил–инозитол–3–киназы (ФИ–3–К) и следующую за этим деполимеризацию актина в отростке и его развитие в виде аксона (Da Silva et al., 2005). Матричная рибонуклеиновая кислота, с которой происходит трансляция фермента сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной, выявляется в коре головного мозга, мозжечке и гиппокампе у мышей. Экспериментально вызванная с помощью трансфекции высокая активность данного типа сиалидазы инициировала феномен дифференцировки в клеточных линиях нейрального происхождения. При этом дифференцировка клеток сопровождалась морфологическими изменениями, что регистрировалось как образование отростков  (Hasegawa et al., 2000). При аксонотомии регенерация аксонов происходила в тех нейронах, в которых выявлялась высокая активность САПМ. В нейронах с низкой активностью САПМ аксонотомия, как правило, не сопровождалась восстановлением аксонов, что было показано на клеточной культуре нейральных клеток, полученных из гиппокампа крыс (Rodriguez et al., 2001). Предполагается, что данный эффект сиалидазы сопровождается изменением в плазматической мембране содержания высших ганглиозидов и накоплением содержания ганглиозидов с одной молекулой сиаловой кислоты (Kato et al., 2006).

       Нарушение экспрессии сиалидаз имеет значение для развития патофизиологических процессов в организме. При сиалидозах, например, болезни Тэя–Сакса происходит нарушение деградации олигосахаридов и их избыточное накопление в лизосомах. Такие характеристики опухолевых клеток, как способность к метастазированию и инвазивность, непосредственно связаны с состоянием плазматической мембраны клетки, в состав которой входят соединения, содержащие молекулы сиаловых кислот, включая гликосфинголипиды. При этом изменение активности сиалидаз может существенно влиять на злокачественность опухолевых клеток не только вследствие изменения состава гликосфинголипидов, но, главным образом, влияния на активность определённых типов тирозинкиназ, которые могут инициировать перестройку цитоскелета. Как известно, функциональное состояние клеточного цитоскелета оказывает влияние на подвижность и инвазивность опухолевых клеток. Повышенная экспрессия сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии карциномы почки RCC приводила к истощению моносиалоганглиозида GM3 и делала опухолевые клетки карциномы менее чувствительными к факторам, индуцирующим апоптоз (Ueno et al., 2006). Снижение концентрации GM3 также приводило к повышению подвижности опухолевых клеток. Метастатический потенциал опухолевых клеток меланомы В16 мыши также существенно зависит от моносиалоганглиозида  GM3 (Kato et al., 2001). Высокая экспрессия сиалидазы сопровождает процесс дифференцировки клеток мышечной ткани. Значительное повышение уровня матричной рибонуклеиновой кислоты для гена сиалидазы регистрировалось в крысиных миобластах уже на 3–и сут после индукции дифференцировки. В то же время, миогенная дифференцировка могла быть блокирована при экспозиции крысиных миобластов к антисенс–олигодезоксирибонуклеиновой кислоте, комплиментарной ДНК, кодирующей сиалидазу (Sato and Miyagi, 1996). 

       Анализ данных литературы показывает недостаточную изученность взаимосвязи морфологических изменений опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения с их сиалидазной активностью.

       Вследствие этого целью настоящей работы явилась оценка морфологических и функциональных изменений опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения и определение взаимосвязи этих изменений с сиалидазной активностью опухолевых клеток.

       

В задачи исследования входило:

  1. Получить клоны клеток с высоким и низким метастатическим потенциалом, используя модель перевиваемой органотропной рабдомиосаркомы РА-23 крыс;
  2. Провести сравнительную характеристику активности лизосомальной сиалидазы в контрастных по метастатическому потенциалу клонах;
  3. Провести сравнительную характеристику активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в контрастных по метастатическому потенциалу клонах;
  4. Охарактеризовать структуру ядер в клетках клонов с высоким и низким метастатическим потенциалом, в том числе в клетках клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при воздействии химиотерапевтических агентов;
  5. Определить уровень матричной РНК гена сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, в клеточной линии NB–1 нейробластомы человека в ответ на воздействие веществ, способствующих клеточной дифференцировке;
  6. Оценить эффект высокой активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной на морфологическую дифференцировку клеток линии NB–1 нейробластомы человека в том числе при воздействии веществ, способствующих клеточной дифференцировке;
  7. Оценить активность ацетилхолинэстеразы как маркера нейральной дифференцировки в клеточной линии NB–1 нейробластомы человека на фоне, вызванном трансфекцией, высокой активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной.

Научная новизна. Впервые в мире обосновано использование показателей сиалидазной активности для оценки морфологических изменений опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения. Выявлена отрицательная взаимосвязь между повышенной активностью лизосомальной сиалидазы и метастатическим потенциалом. На основе гетерогенности клонов перевиваемых опухолевых клеток in vivo показано, что существует положительная взаимосвязь между метастатическими характеристиками опухолевых клеток и изменением структуры ядер опухолевых клеток в виде интерфазных мостов. Установлено, что высокая активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной сопровождает морфологическую дифференцировку нейральных клеток in vitro. При этом доказано, что циклический аденозинмонофосфат индуцирует морфологическую дифференцировку и повышенную активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной. Работа имеет приоритетное значение для изучения молекулярных механизмов регенерации нервной ткани и поиска фармакологических веществ антибластомной направленности.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Клоны перевиваемой рабдомиосаркомы РА–23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом отличаются по активности лизосомальной сиалидазы и по частоте клеток со структурными изменениями ядер в форме интерфазных мостов, этот эффект модулируется цитостатиком циклофосфаном.
  2. Циклический аденозинмонофосфат повышает уровень матричной РНК гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной но не влияет на уровень матричной РНК гена лизосомальной сиалидазы.
  3. Повышенная активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной сопровождает морфологическую дифференцировку опухолевых клеток нейального происхождения, этот эффект усиливается циклическим аденизомонофосфатом.
  4. Повышенная активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, связана с биохимическими маркерами дифференцировки нейральных клеток (ацетилхолинэстераза).

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость полученных результатов заключается в доказательстве значения двух типов сиалидаз (ассоциированной с плазматической мембраной и лизосомальной) в морфологических изменениях опухолевых клеток нейрального (образование отростков) и мышечного происхождения (изменение структуры ядер в форме интерфазных мостов). Высокая активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной вызывает глубокие морфофункциональные перестройки нейральных клеток, выражающиеся в их морфологической и биохимической дифференцировке. Циклический аденозинмонофосфат повышает активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, но не лизосомальной сиалидазы, что, по-видимому, связано с активацией разных молекулярных сигналов (сигнальных систем) в нейральных клетках. Кроме того, получены данные, указывающие на то, что различные типы сиалидазной активности имеют разное значение в формировании метастатических характеристик злокачественных клеток мышечного происхождения.

       Практическая значимость работы состоит в том, что предложен и апробирован оригинальный способ выявления активности разных типов сиалидаз, который может быть использован в экспериментальных и клинических исследованиях для оценки влияния различных стимулов на клеточную дифференцировку. Комплексный подход в оценке молекулярных и морфологических изменений, которые сопровождаются  высокой сиалидазной активностью, может быть использован для тестирования пептидных, синаптотропных, метаботропных, гормональных и антибластомных фармакологических средств.

Реализация результатов работы. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедр нормальной физиологии и фармакологии Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова, кафедры нервных болезней и психиатрии и кафедры специализированной терапии Института медицинского образования Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого. Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова МЧС России. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований при РАН (РФФИ №04-04-49672).

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на 18–м международном конгрессе генетиков (Пекин, 1998), 17–м международном конгрессе по исследованию рака (Рио–де–Жанейро, 1998), 14–й объединённой встрече европейского и американского нейрохимических обществ (Вёрлиц, Берлин, 1999), 11–м международном конгрессе по гистохимии и иммуноцитохимии (Йорк, Великобритания, 2000), 23–й конференции по исследованию полисахаридов (Токио, Япония, 2002), 27–й конференции по гликолипидам (Бостон, США, 2007), 3–м съезд фармакологов России (Санкт–Петербург, 2007).

               Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 10 журнальных статей, один патент на изобретение и 5 тезисов. Работы опубликованы в материалах международных конференций и в журналах: «Доклады Академии наук», «Вопросы онкологии», «Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии», «Медико–биологические и социально–психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях», «Neurochemical Research», «Генетика», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», «Glycobiology», «Медицинский Академический Журнал».

               Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы из 446 источников, среди которых 411 на иностранном языке. Диссертация изложена на 236 страницах, содержит 7 таблиц, 61 рисунок.

2. МАТЕРИАЛЫ  И  МЕТОДЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ

       Клеточная линия NB-1 нейробластомы человека (нейральная клеточная линия) выращивалась и поддерживалась в РПМИ-1640 (45%) и среде Игла (45%), содержащей 10%-ю эмбриональную телячью сыворотку на чашках Петри (диаметр 10 см), покрытых поли-Л-лизином (рис. 1). В эксперименте клеточная линия инкубировалась в течение 24 и 48 ч без эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением или без дб-­цАМФ (2 мМ) и  по окончании инкубации клетки собирались для биохимического анализа.

       Для определения длины отростков нейральных клеток линии NB-1 нейробластомы человека измерение производили от начала отростка и до его окончания. Не менее 600 клеток на предмет исследования длины отростков были выбраны для анализа в поле фазово-контрастного микроскопа. Нейральные клетки с отростками были подразделены на 4

группы: 1) клетки с ультракороткими отростками (до 12 мкм); 2) клетки с короткими отростками (длина отростка 12–24 мкм); 3) клетки с отростками средней длины (длина отростка 25–36 мкм); 4) клети с длинными отростками (длина отростка более 36 мкм).

Рис. 1. Схема эксперимента по трансфекции вектором с геном САПМ клеток NB–1 нейробластомы человека. САПМ – вектор с геном сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной; ПВ – “пустой вектор”; дб–цАМФ – дибутирил–цАМФ. 

       Для трансфекции гена, кодирующего сиалидазу ассоциированную с плазматической мембраной (САПМ) была сконструирована плазмида pCEP-hmSD посредством вставки открытой рамки считывания (1.200 п.н.) гена САПМ  (Neu 3) в плазмиду pCEP (Invitrogen). Биохимическая активность полученной конструкции была проанализирована на клеточной линии COS-1. Трансфекция клеточных линий была проведена с использованием набора фирмы “BenderMedsystems” согласно рекомендации производителя: после инкубирования в течение суток клеточная линия NB-1 была обработана в течение 16 ч добавлением в среду деферриоксамина. По окончании инкубации клетки были подвергнуты трансфекции 5 мкг ДНК (pCEP-hmSD или pCEP, для экспериментальной и контрольной клеточных культур, соответственно). Затем клетки были проинкубированы в течение 24 ч в среде с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (10%) и в зависимости от целей эксперимента проинкубированы в течение 24 ч в отсутствии эмбриональной телячьей сыворотки.

       Для клонирования в условиях in vivo рабдомиосаркомы РА-23 крыс, которая была отселектирована в лаборатории генетики клеточных популяций Института цитологии РАН из высокодифференцированной рабдомиосаркомы крыс, индуцированной 20-метилхолантреном, путём массового отбора клеток на тропность к легочной ткани (Степаньян, Вахтин, 1980), опухолевую ткань очищали от некротизированных участков, промывали в среде 199 с добавлением антибиотиков (пенициллин, стрептомицин) в стандартных концентрациях и измельчали с помощью ножниц в стерильном флаконе. Полученную взвесь фильтровали через стерильную нейлоновую ткань, осаждали клетки из суспензии с помощью центрифугирования (1000 об/мин, 10 мин). Осадок опухолевых клеток разводили в среде 199, концентрацию жизнеспособных клеток определяли с помощью камеры Горяева. Для получения легочных экспериментальных метастазов (клонов) рабдомиосаркомы приготовленные суспензии вводили в хвостовую вену крыс в объёме 0.2 мл. Животным прививали по 60 тыс. клеток. Через 20–25 сут после в/в прививки клеток рабдомиосаркомы РА-23 животных выводили из эксперимента, предварительно усыпив эфиром, вычленяли лёгкие и отпрепаровывали клоны размером 3–5 мм в диаметре.

Определение активности лизосомальной сиалидазы в клетках клонов рабдомиосаркомы РА-23 проводили по следующей схеме: опухолевые клоны (n=10) гомогенизировали в калий фосфатном буфере (10 мМ) при +4°С: 0.25 М сахароза, 1 мМ ЕДТА. Фенилметилсульфонилфлюорид в концентрации 0.2 мМ был добавлен непосредственно перед гомогенизацией. Гомогенат цетрифугировали при 3.000 об/мин в течение 10 мин. Далее супернатант отделяли (фракция I) и 1 мл полученной фракции I пипетировали и центрифугировали в течение часа при 40 т. об/мин при +4°С. Супернатант отбрасывали, а полученный осадок (фракция II) дополнительно пипетировали в небольшом объёме (220 мкл) в буфере для гомогенизации. Активность лизосомальной сиалидазы определяли против 4-метилумбеллиферил-N-ацетилнейраминовой кислоты (4–МУ–N–АНК) в конечной концентрации 2 мМ. Реакционная смесь, конечный объём которой составлял 200 мкл, также содержала ацетат натрия (рН 4.6 или 5.5). После инкубации при 37°С в течение 1-2 ч реакцию останавливали добавлением 2.5 мл глицинового буфера (0.25 М глицин-NaOH, рН 10.4) и проводили флуорометрическое измерение продукта реакции 4-умбеллиферона (450 нм). Активность выражали в единицах на мг белка – ед./мг белка.

               Определение активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной проводили в клетках линии NB-1. После удаления культуральной жидкости из чашек Петри клетки снимали резиновым шпателем, добавляли в чашку охлаждённый фосфатно-солевой буфер (рН 7.0), в который также был добавлен, непосредственно перед использованием, ЭДТА в конечной концентрации 0.5 М и фенилметилсульфонилфлюорид в конечной концентрации 0.2 М. Клеточную взвесь пипетировали и переносили в центрифужные пробирки (Sarsted) объёмом 15 мл. Клетки центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин, после чего удаляли надосадочную жидкость, а клеточный комок подвергали гомогенизации. Концентрацию белка определяли по Брэдфорду. Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, определяли против смеси ганглиозидов (конечная конц. 0.5 мг /мл). Общий объём реакционной смеси составлял 100 мкл и состоял из следующих компонентов: Тритон Х-100 (0,1%), бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл) и 0.025 М ацетат натрия (рН 4.6) и образца, содержащего фермент (50 мкл включительно). После инкубации при 37С (при умеренном встряхивании) в пробирки добавляли 50 мкл метапериодата натрия (0.6%), энергично перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. После инкубации с метапериодатом натрия в пробирки добавляли арсенит натрия объёмом 0.5 мл (10%). Далее добавляли 1.5 мл ТБК, энергично перемешивали и немедленно переносили в кипящую воду на 15 мин, после чего немедленно охлаждали в воде, добавляли циклогексан объёмом 1.5 мл, энергично перемешивали с помощью встряхивателя и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. По окончании центрифугирования отбирали верхнюю фазу (70 мкл) и измеряли при длине волны 549 нм (Hitachi). Расчёт активности фермента производили по методу предложенному ранее (Hasegawa et al., 2001). Активность выражали в единицах на мг белка  -ед./мг белка.

       Для получения комплементарной ДНК (кДНК) образцы выравнивали, чтобы получить концентрацию РНК 5 мкг в 11 мкл воды высокой степени очистки, к каждой пробе добавляли 1 мкл олиго-Т праймера. Образцы инкубировались при следующих температурных и временных параметрах амплификатора до внесения обратной транскриптазы (Superscript II RT): 70С в течение 10 мин, 3С в течение 5 мин. Непосредственно перед повышением температуры до 42С в пробирки вносили по 7 мкл буфера для обратной транскриптазы, включающий также смесь нуклеотидов (10 мМ) и 0.1 М дитиотрейтол, и 1 мкл обратной транскриптазы. Далее инкубацию образцов проводили при 42С в течение 50 мин. По завершении инкубации образцов при 70С в течение 15 мин в пробирки добавляли 0.2 мкл РНКазы H (из расчёта 60 U/мкл) и продолжали инкубацию при 37С в течение 20 мин. Реакцию останавливали, добавляя 480 мкл воды. Условия ПЦР в течение 45 циклов: 94С – 1 мин, 60С – 1 мин, 72С – 2 мин. 72С – 10 мин. Прямой праймер: 5’-GACAGAGGGATTACCTACCGGATC-3’, нуклеотиды 55-78 от стартового кодона; обратный праймер: 5’-GAGCCATGATTCTGACGGTGTT-3’, нуклеотиды  966-987.Образцы нормализовали по уровню экспрессии –актина.

       Для проведения вертикального электрофореза белков в полиакриламидном геле (“Biorad”) использовались следующие параметры: напряжение 70 – 140 В, сила тока мА, мощность 1 – 2 Вт и время проведения – 90 мин. Для проведения полусухого переноса разделённых белков из геля на мембрану (Hybond–C) приготавливали многослойную систему, состоящую из геля, двух слоёв фильтровальной бумаги хроматографического класса  и мембраны. При этом использовались следующие параметры: напряжение – 10 ~ 15 В; сила тока – 2 А. Перенос осуществляли в течение 1 ч. После переноса мембрану аккуратно освобождали и отмывали в ТБС-Т -буфере (10 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 0.1% Твин-20, pH 7.4) в течение 10 мин. Детекцию сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, проводили с использованием мышиных антител в разведении 1:10. Затем мембрану инкубировали со вторыми козьими антителами (направленными против первых мышиных антител), конъюгированными со щелочной фосфатазой. Разведение вторых антител составляло 1:5000. Параллельно ставили изотипический контроль. Для визуализации использовали следующие растворы: буфер для щелочной фосфатазы состоял из следующих компонентов (0.1 М Трис-HCl, 0.1 M NaCl, 5 мМ MgCl2, pH 9.5). Раствор для окрашивания приготавливался в следующем формате: буфер для щелочной фосфатазы – 2 мл; нитросиний тетразолий – 8 мкл; 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат – 6 мкл. После последней отмывки в ТБС-буфере мембрану размещали на гладкой поверхности, покрытой полиэтиленом, и наносили раствор для окрашивания. Образец инкубировали в течение 1 мин, после чего немедленно помещали в раствор (20 мМ Трис-HCl, 5мМ ЭДТА, pH 7.5) для остановки реакции на 5 мин. Далее мембрану отмывали в бидистиллированной воде, высушивали и анализировали молекулярную массу разделённых белков. Для флюоресцентного анализа нейральные клетки клетки NB–1 нейробластомы человека, выращенные в стерильных микроскопических камерах, отмывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, pH 7.4), препараты высушивали и фиксировали в 4%-м параформальдегиде в течение 5 мин при комнатной температуре. Отмывали в ФСБ (3х по 5 мин) и проводили (строго в течение 2 мин) дополнительную фиксацию в 0.2%-м Тритоне Х-100, приготовленном на ФСБ. Далее препараты отмывали в ФСБ (3х по 5 мин) и не высушивая, а только удалив избыток влаги фильтровальной бумагой наносили первые антитела – моноклональные мышиные антитела (1:100), направленные против сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной. Препараты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере. По окончании инкубации препараты отмывали в ФСБ (3х по 5 мин) и, удалив избыток влаги фильтровальной бумагой, наносили вторые козьи (F(ab)'2) антитела, конъюгированные с ФИТЦ (флуоресцеинизотиоционат). Со вторыми антителами препараты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в разведении 1:300. Отмывали в ФСБ (3х по 5 мин) и, удалив избыток влаги, наносили пропидий иодида на 1 мин, после чего ещё раз отмывали, наносили раствор, препятствующий быстрому выгоранию флюорохромов, и накрывали покровным стеклом. Исследование проводили с использованием фильтров для анализа ФИТЦ (520 нм). В каждом препарате подсчитывали не менее 300 клеток.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Морфофункциональные изменения клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА23 крыс при воздействии противоопухолевых средств.

3.1.1. Метастатический потенциал клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА23 крыс при воздействии противоопухолевых средств.

Результаты опытов с рабдомиосаркомой РА-23 представленные на рис.  2 – 5 показывают,  что  введение циклофосфана оказывало значительный тормозящий эффект, выражавшийся в снижении всех показателей метастазирования. При этом среднее число метастазов у животных 2-й группы, получавших циклофосфан, снижалось по сравнению с контролем более чем  в 30 раз. При анализе нарушений морфологии ядер в опухолевых клетках отмечено, что циклофосфан, вызывал нарушения в ядрах клеток рабдомиосаркомы РА-23, выражавшиеся, прежде всего, в увеличении частоты клеток с микроядрами и “хвостатыми” ядрами (рис. 6 – 8).

Рис. 2. Число крыс с метастазами клонов рабдомиосаркомы РА–23 при введении циклофосфана (группа II). Группа I – контроль (изотонический раствор хлористого натрия). В каждой группе по 10 голов. По вертикали – число крыс.

Рис.  3. Количество метастазов Рис. 4. Среднее число метастазов

клонов рабдомиосаркомы РА–23  при клонов рабдомиосаркомы РА–23

введение  циклофосфана  (группа II).  на  крысу при  введении  цикло-

Группа I – контроль ( изотонический  фосфана (группа II).  Группа I –

раствор хлористого натрия). В каждой контроль (изотонический раст-

группе  по  10  голов (N – количество вор хлористого натрия).  В каж-

крыс с метастазами). По вертикали –  дой группе по 10 голов  (N – ко- 

количество метастазов. личество крыс  с метастазами).

                                                      По вертикали  – среднее число        

                                                      метастазов. *Различие достовер-

                                                      но относительно  группы  I при

                                                      p<0.05.        

Рис. 5. Среднее масса метастаза (мг) клонов рабдомиосаркомы РА–23 при введении циклофосфана (группа II). Группа I – контроль (изотонический раствор хлористого натрия). В каждой группе по 10 голов (N – количество крыс с метастазами). По вертикали – средняя масса метастаза. *Различие достоверно относительно группы I и II при p<0.05.

Рис. 6. Частота клеток с микроядрами в клетках клонов метастазов рабдомиосаркомы РА–23 крыс при введении циклофосфана (группа II). Группа I – контроль (изотонический раствор хлористого натрия). N=количество проанализированных клеток. По вертикали – процент клеток с микроядрами. *Различие достоверно относительно группы I при p<0.05.

Рис. 7. Частота клеток с интерфазными мостами в клетках клонов метастазов рабдомиосаркомы РА–23 крыс при введении циклофосфана (группа II). Группа I – контроль (изотонический раствор хлористого натрия). N=количество проанализированных клеток. По вертикали – процент клеток с интерфазными мостами.

Рис. 8. Частота клеток с «хвостатыми» ядрами в клетках клонов метастазов рабдомиосаркомы РА–23 крыс при введении циклофосфана (группа II). Группа I – контроль (изотонический раствор хлористого натрия). N=количество проанализированных клеток. По вертикали – процент клеток с «хвостатыми» ядрами. *Различие достоверно относительно группы I при p<0.05.

Анализируя результаты, можно отметить, что при дозировке 50 мг/кг циклофосфан тормозил образование и рост метастазов. Полученные данные подтверждают результаты предыдущих экспериментов, показавших противоопухолевые свойства циклофосфана, и позволяют предположить, что данный препарат оказывает генотоксическое действие как на первичные опухоли, так и на их метастазы.

3.1.2. Сиалидазная активность в клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА23 крыс, контрастных по метастатическому потенциалу.

       В виду изменений способности к метастазированию (метастатического потенциала) клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 представлялось важным также ответить на вопрос: сопровождается ли изменение метастатического потенциала изменением биохимических характеристик опухолевых клеток. Лизосомальная сиалидаза и сиалидаза, ассоциированная с плазматической мембраной, являются ферментами, участвующими в гидролизе олигосахаридов и гликосфинголипидов (ганглиозидов), соответственно, модулируя состав гликопротеинов и гликосфинголипидов клеточной мембраны, и изменяя, таким образом, способность опухолевых клеток к метастазированию и инвазии. В связи с этим на активность лизосомальной сиалидазы и сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), были проанализированы опухолевые клоны, контрастные по способности к метастазированию. На предмет выявления сиалидазной активности были протестированы три клона из контрольной выборки и три клона, извлечённых из лёгких животных, подвергшихся обработке цитостатиком циклофосфаном. Как видно из табл. 1, активность лизосомальной сиалидазы в клонах с низким метастатическим потенциалом варьировала в грубой фракции (фракция I) от 0.903 до 1.297 ед. на мг белка и в среднем составляла 1.100±0.284 ед. на мг белка. Активность лизосомальной сиалидазы в клонах с высокой способностью к метастазированию в грубой фракции (фракция I) варьировала от 0.602 до 0.950 ед. на мг белка и в среднем составила 0.818±0.271 ед. на мг белка, что достоверно не отличалось от среднего показателя, выявленного во фракции I, полученной из клонов с низким метастатическим потенциалом (p>0.05). Дальнейшее исследование обогащённой  фракции (фракция II), выделенной из клонов с  высоким метастатическим потенциалом, выявило, что средний показатель активности лизосомальной сиалидазы составил 1.48±0.12 ед. на мг белка, тогда как активность лизосомальной сиалидазы, зарегистрированная во фракции II, выделенной из клонов с высоким метастатическим потенциалом, в среднем составляла 2.70±0.29 ед. на мг белка, что значимо отличалось от среднего показателя (фракция II) среди клонов с пониженной способностью к метастазированию (p<0.01). Следует отметить, что активность лизосомальной сиалидазы в мышечной ткани как у крыс, не подвергшихся

                                                                                        Таблица 1

Активность лизосомальной сиалидазы в клетках

  опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 с высоким

  и низким метастатическим потенциалом

  Клоны

Активность лизосомальной сиалидазы

(в единицах на мг белка)

фракция I

фракция II

  С высоким

метастатичес-ким

потенциалом

D 1

0.602

1.38

D 2

0.905

1.49

D 3

0.950

1.57

Средние значения

0.818±0.271

1.48±0.12

С низким 

метастатичес-ким

потенциалом

C 1

0.903

2.81

C 2

1.297

2.44

C 3

1.101

2.86

Средние значения

1.100±0.284

2.70±0.29*

*Различие достоверно относительно среднего показателя

для клонов с высоким и низким метастатическим потенциалом при p<0,01.

воздействию цитостатиков, так и у крыс, которые подверглись воздействию циклофосфана, в среднем, не превышала 0.983±0.142 и 0.979±0.197 ед. на мг белка, соответственно.

       Поскольку были выявлены различия по активности лизосомальной сиалидазы в контрастных по способности к метастазированию (метастатическому потенциалу) клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 (табл. 1), мы протестировали эти же клоны на предмет активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ). Результаты показывают (табл. 2), что в клонах с повышенной способностью к метастазированию (высоким метастатическим потенциалом) и в клонах с пониженной способностью к метастазированию активность  САПМ различалась  и  среди выборки клонов  D1, D2 и D3 была выше (1.040±0.187 ед. на мг белка) по сравнению со средним показателем, зарегистрированным для выборки клонов С1, С2 и С3 (0.930±0.167 ед. на мг белка). Несмотря на тенденцию к повышению активности САПМ среди клонов D1, D2 и D3 следует отметить, что достоверных различий между исследованными показателями активности САПМ выявить не удалось (p>0.05). Активность САПМ в мышечной ткани как у крыс, которые не подвергались воздействию цитостатиков, так и у крыс, которые подверглись воздействию циклофосфана, составила 0.901±0.282 и 0.911±0.165 ед. на мг белка, соответственно.

                                                                                        Таблица 2

Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), в клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 

с высоким и низким метастатическим потенциалом

  Клоны

Активность САПМ

(в единицах на мг белка)

С высоким

метастати-ческим

потенциалом

D 1

0.96

D 2

1.32

D 3

0.84

Средние значения

1.040±0.187

С низким

метастати-ческим

потенциалом

С 1

1.04

С 2

0.91

С 3

0.84

Средние значения

0.930±0.167

       Полученные результаты позволяют сделать вывод, что генотоксические факторы приводят к существенному снижению способности опухолевых клеток к метастазированию (метастатическому потенциалу). Пониженная способность к метастазированию ассоциирована с изменением морфологических (повышение частоты опухолевых клеток с нарушением морфологии ядер) и биохимических (повышенная лизосомальная активность) характеристик опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс.

3.2. Функциональные изменения клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА23, связанные с отбором на повышение и понижение частоты опухолевых клеток с нарушением

структуры ядер.

3.2.1. Отбор опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА23 крыс на повышение и понижение частоты опухолевых клеток с нарушением структуры ядер.

       Для того чтобы исключить воздействие циклофосфана на сиалидазную активность был проведён эксперимент для получения клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом без воздействия каких-либо генотоксических факторов. Для этой цели клоны опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс были подвергнуты отбору на понижение и повышение частоты встречаемости клеток с такими нарушениями морфологии ядер как интерфазные мосты (ЧКИМ). На повышение и понижение частоты встречаемости клеток с интерфазными мостами было проведено пять циклов отбора. Средняя частота клеток с интерфазными мостами в исходной выборке клонов

составила 1.0%, а размах изменчивости от 0.0 до 2.4% (рис. 9). При этом доля  клонов  исходной  выборки,  в  которой  ЧКИМ была зарегистрирована

Рис. 9. Исходная выборка клонов (N=44, Хср=1.0%) легочных метастазов (n=количество клонов) рабдомиосаркомы РА–23 крыс

на уровне менее 1–го процента составила 79%. К пятому циклу отбора на повышение ЧКИМ не удалось зарегистрировать ни один опухолевый клон, в котором частота интерфазных мостов составляла бы менее 1%. При этом средняя ЧКИМ в выборке 5–го цикла отбора составила 8.8% (рис. 10). Таким образом, частота клеток с интерфазными мостами в полученных популяциях клеток рабдомиосаркомы повысилась с 1.0 до 8.8%, т.е. в 8.8 раза. Различия между выборками исходных клонов и подвергнутых отбору на повышенную ЧКИМ были достоверны при P<0.001 (критерий Вилкоксона–Манна–Уитни). Отбор клонов рабдомиосаркомы РА-23 на понижение спонтанной частоты встречаемости в них клеток с мостами проводился одновременно и параллельно с отбором клонов РА-23 на повышение ЧКИМ. Из исходной популяции (рис.  9) отбирали  1 клон с минимальным показателем частоты

Рис. 10. Выборка клонов (N=16, Хср=8.8%) легочных метастазов (n=количество клонов) рабдомиосаркомы РА–23 крыс, полученная после 5–го (терминального) этапа отбора на повышение частоты клеток с интерфазными мостами (ЧКИМ).

Рис. 11. Выборка клонов (N=48, Хср=0.5 %) легочных метастазов (n=количество клонов) рабдомиосаркомы РА–23 крыс, полученная после 5–го этапа отбора на понижение частоты клеток с интерфазными мостами (ЧКИМ).

интерфазных мостов, т.е. ЧКИМ в котором регистрировалась на уровне 0.0%. К пятому циклу отбора на понижение частоты клеток с интерфазными мостами средняя ЧКИМ в выборке из 48 клонов составила 0.5%. При этом более 94% клонов имели частоту мостов, не превышающую 0.9% (рис. 11). Таким образом, были проведены  5 циклов  отбора  популяций клеток

рабдомиосаркомы на понижение частоты клеток с интерфазными мостами. Частота встречаемости клеток с интерфазными мостами в популяциях клеток рабдомиосаркомы снизилась с 1.0 до 0.5%, т.е. в два раза. Достоверность  различий на каждом цикле  отбора  составила  P<0.001  по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.

3.2.2. Метастатический потенциал опухолевых клонов, контрастных по частоте клеток с нарушениями структуры ядер.

       После проведения 5-ти циклов отбора на повышение и отбора на понижение ЧКИМ клеточные популяции РА-23 были специально протестированы на метастатический потенциал (табл. 3). Видно, что популяции клеток с повышенной ЧКИМ имели достоверно меньший метастатический потенциал, чем популяции клеток с пониженной ЧКИМ (P<0.05, n=5). При этом, различия по величине метастатического потенциала между линиями с высокой и низкой ЧКИМ были более, чем пятикратными.

       Среднее значение метастатического потенциала клеточной популяции с повышенной ЧКИМ в субштамме РА-23 составило 28.6±7.5, а значение метастатического потенциала клеточной популяции этого субштамма с пониженной ЧКИМ составило 107.1±23.9.

                                                                                       Таблица 3

Метастатический потенциал клеток клонов РА-23 после 5-ти циклов отбора на повышение и 5-ти циклов отбора на снижение частоты встречаемости клеток с интерфазными мостами.

Характеристика клонов

Средняя

ЧКИМ, %

Число сформировавшихся метастазов на крысу

Клоны после отбора на понижение частоты клеток с интерфазными мостами

(А 1 – А 5)

0.5

  107.1±23.9

*(N=15)

Клоны после отбора на повышение частоты клеток с интерфазными мостами

(В 1 – В 5)

 

18.5

  28.6±7.5

(N=15)

*Примечание: N – количество животных в каждой группе

       

       Таким образом, полученные данные свидетельствуют о снижении метастатического потенциала в ходе отбора клонов РА-23 на повышение частоты встречаемости в них клеток с интерфазными мостами.

3.2.3.Активность лизосомальной сиалидазы в клетках опухолевых клонов, различающихся по нарушениям структуры ядер.

Таким образом, полученные данные показывают, что клоны с повышенной и  пониженной способностью  к метастазированию различаются между собой по ряду морфофункциональных характеристик. При этом следует подчеркнуть, что контрастные по метастатическому

                                                                                         Таблица 4

Активность лизосомальной сиалидазы в клетках опухолевых

клонов рабдомиосаркомы РА-23 с высоким и низким метастатическим

потенциалом

  Клоны

Активность лизосомальной сиалидазы

(в единицах на мг белка)

фракция I

фракция II

  С высоким 

метастатическим

потенциалом

А 1

0.802

1.42

А 2

1.000

1.50

А 3

0.350

1.40

А 4

0.001

1.16

А 5

0.620

1.80

Средние значения

0.555±0.183

1.46±0.10

С низким 

метастатическим

потенциалом

В 1

1.330

2.95

В 2

0.850

2.60

В 3

0.700

1.84

В 4

0.790

2.47

В 5

1.800

3.71

Средние значения

1.094±0.304

2.71±0.31*

*Различие достоверно относительно среднего показателя фракции II

для клонов с высоким метастатическим потенциалом при P<0,01.

потенциалу клоны не подвергались каким-либо генотоксическим воздействиям.  В  связи  с этим  представлялось важным оценить активность

различных типов сиалидаз в клонах с повышенной и пониженной способностью к метастазированию. Как показывают результаты (табл. 4) определения активности сиалидазы в грубой лизосомальной фракции (фракция I)  более выраженная активность фермента  была зарегистрирована

в клонах с низким метастатическим потенциалом (1.094±0.304). В грубой лизосомальной фракции полученной из клонов с высоким показателем метастазирования активность сиалидазы была ниже, однако, достоверных различий между исследованными выборками клонов рабдомиосаркомы РА-23 выявить не удалось (P>0.05). Как показывает проведённое исследование, более 60%  активности  сиалидазы  было зарегистрировано во фракции II (как для выборки клонов с низким, так и для выборки клонов с высоким метастатическим потенциалом), полученной в результате ультрацентрифугирования и, следовательно, являющейся обогащённой лизосомами фракцией. При этом было выявлено, что активность лизосомальной сиалидазы была существенно (P<0.01) ниже в клонах, характеризующихся высоким метастатическим потенциалом по сравнению с активностью фермента в клонах с низким метастатическим потенциалом, 1.46±0.10 и 2.71±0.31, соответственно. По–видимому, повышенное содержание молекул сиаловой кислоты на гликопротеинах клеточной мембраны способствует повышенному метастазированию опухолевых клеток, тогда как высокая активность лизосомальной сиалидазы может приводить к повышенному метаболизму сиалоконъюгатов в лизосомах клетки, снижая метастатический потенциал злокачественных опухолей.

 

3.2.4. Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, в клетках опухолевых клонов, различающихся по нарушениям структуры ядер.

       Наряду с определением активности лизосомальной сиалидазы представлялось важным исследовать активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, в клонах с высоким и низким метастатическим  потенциалом.  Как следует из  табл.  5, активность САПМ в клонах с высоким метастатическим потенциалом варьировала от  0.42  до  1.24 ед./мг белка  и в  среднем по  выборке

составила 0.876±0.167 ед./мг белка. В выборке клонов с низким метастатическим потенциалом наименьшая активность САПМ в клоне В2 составила 0.63 ед./мг белка, а самая высокая – 1.51 ед./мг белка (клон В5). При этом среднее значение составило 0.986±0.162 ед./мг белка, что не отличалось достоверно от среднего значения активности САПМ для выборки клонов с высоким метастатическим потенциалом (p>0.05).

       Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что наблюдается тенденция в повышении активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, в выборке клонов с высоким метастатическим потенциалом, однако, достоверных различий при данных экспериментальных условиях не удалось зарегистрировать.

                                                                                        Таблица 5

Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), в клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 с

высоким и низким метастатическим потенциалом

  Клоны

Активность САПМ

(в единицах на мг белка)

  С высоким 

метастати-ческим  потенциалом

А 1

1.20

А 2

0.63

А 3

0.84

А 4

0.75

А 5

1.51

Средние значения

0.986±0.162

С низким 

метастати-ческим

потенциалом

В 1

1.24

В 2

1.06

В 3

0.42

В 4

0.53

В 5

1.13

Средние значения

0.876±0.167

3.3. Морфофункциональные изменения нейральных клеток линии NB-1 нейробластомы человека.

3.3.1. Морфологические маркеры дифференцировки клеток линии NB-1 нейробластомы человека при повышенной экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной

         Морфологическая дифференцировка нейральных клеток характеризуется образованием отростков. Поэтому был выбран этот маркер дифференцировки нейральных клеток NB–1 нейробластомы  человека  в  ответ  на трансфекцию вектором с геном САПМ и/или воздействие дибутирил цАМФ (дб-цАМФ). Поскольку в эмбриональной телячьей сыворотке (ЭТС) содержатся самые разнообразные ростовые факторы, в том числе и те, которые влияют на образование и рост отростков опухолевых клеточных линий нейрального происхождения, то представлялось целесообразным  придерживаться  экспериментальных условий, чтобы исключить влияние подобных факторов в эксперименте: нейральные клетки инкубировались в истощённой среде без эмбриональной телячьей сыворотки.

Рис. 12. Длина отростков в нейральных клетках линии NB-1 нейробластомы человека: без трансфекции (а) и после трансфекции (б) вектором, содержащим вставку гена САПМ. Среда без ЭТС (1 сут). Классы клеток по длине развиваемых отростков: I – <12 мкм; II – 12–24 мкм; III – 25–36 мкм; IV - >36 мкм. По оси ординат – %. *p<0.001

Рис. 12,в. Длина отростков в нейральных клетках линии NB-1 нейробластомы человека. После трансфекции вектором, не содержащим вставку гена САПМ. Среда без ЭТС (1 сут). Классы клеток по длине развиваемых отростков: I – <12 мкм; II – 12–24 мкм; III – 25–36  мкм; IV - >36 мкм. По оси ординат – %. p<0.001.

       Так, в культуре, которая не подверглась трансфекции  (истощение по ЭТС в течение 1  сут), частота клеток  с длиной отростков более 36 мкм не превышала 0.9±0.3% (рис. 12,а), тогда как в культуре, подвергшейся трансфекции вектором, содержащем САПМ, частота клеток, которые развили отростки более 36 мкм превысила 7% (7.4±0.4%) (рис. 12,б). Это значимо отличалось как от контроля (p<0,001), так и от клеток, которые были генетически модифицированы “пустым” вектором (1.0±0.2%, p<0.001) (рис. 12,в). Обработка клеток дб–цАМФ (среда без ЭТС) на фоне экспрессии САПМ вызывала ещё более значимое удлинение отростков. Так, в культуре клеток NB–1 нейробластомы человека, подвергшихся трансфекции вектором, содержащим вставку гена САПМ, частота клеток с длиной отростков более 24 мкм превысила 26% (рис. 13,б), что значимо отличалось от показателей (рис. 13,а и 13,в), выявленных для клеток контрольных культур (p<0.001). Интересно отметить, что в культуре, которая была подвергнута трансфекции геном САПМ, но не обработана дб-цАМФ (рис. 12,б) частота клеток с длиной отростков более 36 мкм (7.4±0.4%, класс IV) была даже выше, чем частота клеток как подвергнутых трансфекции, так и обработанных дб-цАМФ (3.5±0.3%) (рис. 13,б). По-видимому, “сольное” воздействие  САПМ  способно индуцировать  в отдельной популяции

Рис. 13. Длина отростков в нейральных клетках линии NB-1 нейробластомы человека: без трансфекции (а) после трансфекции (б) вектором, содержащим вставку гена САПМ. Среда без ЭТС, дб-цАМФ (2 мМ) (1 сут). Классы клеток по длине развиваемых отростков: I – <12 мкм; II – 12–24 мкм; III – 25–36 мкм; IV - >36 мкм. По оси ординат – %. *p<0.001.

Рис. 13,в. Длина отростков в нейральных клетках линии NB-1 нейробластомы человека. После трансфекции вектором, не содержащим вставку гена САПМ. Среда без ЭТС, дб-цАМФ (2 мМ) (1 сут). Классы клеток по длине развиваемых отростков: I – <12 мкм; II – 12–24 мкм; III – 25–36 мкм; IV - >36 мкм. По оси ординат – %. *p<0.001.

нейральных клеток более выраженное образование отростков. Вместе с тем частота клеток с длиной отростков более 24 мкм была значимо выше в культуре как подвергнутой трансфекции, так и обработанной дб-цАМФ (27%) (p<0.001), что указывает на синэргичный эффект дб-цАМФ на фоне повышенной экспрессии сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной.

       Таким образом, высокая активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной вызывает морфологическую дифференцировку в опухолевых клетках нейрального происхождения.

3.3.2. Анализ активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии NB1 нейробластомы человека.

       Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), была осуществлена при тех же экспериментальных состояниях, что и анализ морфологии клеток NB–1 нейробластомы человека, т.е. на 2-е сут после трансфекции, 1-е сут после истощения среды по ЭТС (см. материалы и методы). Как следует из рис. 14, активность САПМ в контрольной клеточной линии NB-1 (I) составила  4.2±1.6  ед./мг  белка,  а  в

Рис. 14. Нейральная клеточная линия NB-1 нейробластомы человека: I – контроль без обработки дб-цАМФ; II – контроль c обработкой дб-цАМФ; III – трансфекция вектором, не содержащем ген САПМ; без обработки дб-цАМФ; IV – трансфекция вектором, не содержащем ген САПМ; обработка дб-цАМФ; V – трансфекция вектором, содержащем ген САПМ; без обработки дб-цАМФ; VI – трансфекция вектором, содержащем ген САПМ; обработка дб-цАМФ. Активность САПМ выражена в ед./мг белка. По оси ординат – активность САПМ (ед./мг белка). *p<0.001, **p<0.05 (см. пояснение в тексте).

клетках, обработанных дб-цАМФ (II) – 10.1±3.1 ед./мг белка, что, однако, не позволило выявить достоверных отличий по активности САПМ в исследуемых клеточных культурах. Активность САПМ в клетках, подвергнутых трансфекции вектором, содержащим ген анализируемого фермента (V), составила не менее 35 ед./мг белка, что достоверно отличалось от контрольных клеток, не подвергавшихся трансфекции (I и II) и подвергнутых трансфекции  “пустым” вектором (III и IV)  (p<0.001). Активность  САПМ  в  клетках, подвергнутых  трансфекции исследуемым геном и обработанных дб-цАМФ составила не менее 50 ед./мг белка (VI). Анализируемая сиалидазная активность значимо отличалась не только от активности зарегистрированной в контрольных клетках (p<0.001), но и от сиалидазной активности, выявленной для клеток, подвергнутых трансфекции с САПМ, но не обработанных дб-цАМФ (p<0.05).

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что активность САПМ и цАМФ–сопряжённых факторов может быть взаимно усилена.

3.3.3. Активность ацетилхолинэстеразы в клеточной линии NB1 нейробластомы человека при воздействии факторов дифференцировки.

       Ацетилхолинэстераза (АЭ) является функциональным маркером дифференцировки нейральных клеток, поэтому представлялось важным оценить влияние повышенной экспрессии сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, на активность ацетилхолинэстеразы в клеточной линии NB–1 нейробластомы человека. Активность АЭ оценивалась в тех же культуральных условиях, что и оценка активности САПМ и морфологических маркеров дифференцировки. Чтобы исключить влияние вектора на индукцию в активности АЭ была осуществлена также трансфекция клеток вектором, не содержащим ген САПМ. В виду того, что до истощения (1 сут после трансфекции) культуральной среды по ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка) не были зарегистрированы достоверные различия между исследованными клеточными культурами приводятся данные по активности ацетилхолинэстеразы через 1 сут после истощения среды по ЭТС (2 сут после трансфекции). Как показывают результаты (рис. 15), наиболее высокая активность ацетилхолинэстеразы была зарегистрирована в клеточной культуре, которая не подвергалась трансфекции, но была обработана дб-цАМФ (136±3.2%). При этом активность АЭ в данной клеточной культуре значимо отличалась при p<0.001 не только от контроля (I), но и от клеточных культур (V и VI), подвергшихся трансфекции вектором, несущим ген  САПМ (p<0.001). Однако ацетилхолинэстеразная активность не отличалась достоверно между клеточной популяцией, которая не подвергалась трансфекции и была обработана дб-цАМФ (II), и клеточной популяцией, которая подвергалась трансфекции вектором с отсутствующим геном САПМ и обработанной дб-цАМФ (IV). Клеточные линии (V, VI), подвергшиеся трансфекции вектором, содержащим ген САПМ, также показали высокую активность ацетилхолинэстеразы (119±2.8 и 116.3±2.7%, соответственно), которая достоверно отличалась от контрольного показателя (p<0.001). Как следует из рис. 15, в клеточной линии, подвергшейся трансфекции вектором с геном САПМ, с последующей обработкой дб-цАМФ была зарегистрирована некоторая тенденция к снижению активности АЭ (VI). По-видимому, данный эффект можно объяснить активацией разнообразных молекулярных факторов, которые в некоторых случаях могут иметь по отношению друг к другу неспецифический тормозящий эффект. В связи с этим интересно отметить, что в клетках, которые были подвергнуты трансфекции  вектором, не  содержащим  ген  САПМ,  и обработанные

Рис. 15. Нейральная клеточная линия NB-1: I – контроль без обработки дб-цАМФ; II – контроль c обработкой дб-цАМФ; III – трансфекция вектором, не содержащем ген САПМ; без обработки дб-цАМФ; IV – трансфекция вектором, не содержащем ген САПМ; обработка дб-цАМФ; V – трансфекция вектором, содержащем ген САПМ; без обработки дб-цАМФ; VI – трансфекция вектором, содержащем ген САПМ; обработка дб-цАМФ. Активность ацетилхолинэстеразы выражена в процентах от контроля. По оси ординат – %. *p<0.001, **p<0.05 (см. пояснение в тексте).

дб-цАМФ также регистрировалась высокая активность АЭ достоверно отличавшаяся от активности АЭ как в клетках, подвергнутых только трансфекции вектором с САПМ (V), так и в клетках и подвергнутых трансфекции вектором с САМП, и обработанных дб–цАМФ (VI).

       Результаты проведённого исследования указывают, что высокая активность САПМ приводит к выраженной активности такого функционального маркера дифференцировки нейральных клеток как ацетилхолинэстераза. Более значимое повышение в активности АЭ в клетках без повышенной экспрессии САПМ, но обработанных дб–цАМФ, можно объяснить активацией нескольких цАМФ–сопряжённых молекулярных факторов, которые усиливают действие друг друга.

3.3.4. Активность лизосомальной сиалидазы в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека.

         В связи с полученными результатами при исследовании активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной,

                                                                                       Таблица 6

Активность лизосомальной сиалидазы в клеточной линии NB–1 нейробластомы человека

Клетки при различных экспериментальных условиях*.

Активность фермента в ед./мг белка.

Контрольная клеточная культура

0.884±0.139

Контрольная клеточная культура, с последующей обработкой д-цАМФ

1.114±0.215

Клетки, подвергнутые трансфекции “пустым вектором”

1.451±0.370

Клетки, подвергнутые трансфекции “пустым” вектором, с последующей обработкой дб-цАМФ

0.935±0.421

Клетки, подвергнутые трансфекции вектором, содержащим ген САПМ

1.510±0.353

Клетки, подвергнутые трансфекции вектором, содержащим ген САПМ, с последующей обработкой дб-цАМФ

1.640±0.491

*См. материалы и методы. Средние представлены результатом трёх экспериментов.

представляло несомненный интерес изучить активность лизосомальной сиалидазы (ЛС) в клеточной линии NB–1 нейробластомы человека при различных экспериментальных условиях, включая обработку клеток синтетическим аналогом циклического аденозинмонофосфата. Результаты, представленные в табл. 6, показывают, что в нейрональных клетках NB-1 выявляется спонтанная активность лизосомальной сиалидазы, которая в контрольной клеточной культуре составляет 0.884±0.139 ед./мг белка. В клетках, подвергшихся трансфекции, активность ЛС варьировала и была зарегистрирована на уровне 0.935±0.421 ед./мг белка для клеток после трансфекции “пустым” вектором с последующей обработкой д-цАМФ и максимальной для клеток, модифицированных вектором с САПМ и обработанных дб–цАМФ, в которых ЛС активность составила 1.640±0.491 ед./мг белка. Вместе с тем следует отметить, что при анализе средних показателей активности ЛС в исследованных клеточных культурах достоверных различий не было зарегистрировано.

3.4. Анализ молекулярногенетических маркеров экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека.

3.4.1. Верификация продукта транскрипции гена сиалидазы  ассоциированной с плазматической мембраной в клетках NB1 нейробластомы человека.

       Исследование количества матричной РНК, экспрессируемого геном САПК, было проведено в клеточных культурах при условиях согласно стандартному протоколу (см. материалы и методы). При этом исследование количества матричной РНК в культурах, подвергшихся трансфекции вектором, содержащим ген САПМ, не проводилось. Количество мРНК (рис. 16), измеренное  в контрольной клеточной культуре,  подвергшейся

Рис. 16. Количество матричной РНК (% от контроля), выявленной в нейральных клетках NB–1 нейробластомы человека, культивировавшихся при разных экспериментальных условиях (среда без ЭТС): I – контроль; II – контрольные клетки, обработанные дб-цАМФ; III – клетки, подвергшиеся трансфекции вектором, не содержащим ген САПМ; IV – клетки, подвергшиеся трансфекции, вектором, не содержащим ген САПМ. Обработаны дб-цАМФ. По оси ординат –  %. *p<0.001 (см. пояснение в тексте).

обработке дб-цАМФ, превысило контрольное значение (клетки,  не  подвергавшиеся трансфекции и обработке дб-цАМФ) более чем в 4 раза  (p<0.001).  Измерение  количества мРНК  в  клеточной культуре, подвергшейся трансфекции “пустым” вектором, выявило тенденцию в повышении уровня мРНК гена САПМ, однако, различия по сравнению с контролем оказались недостоверны, что позволяет говорить об отсутствии неспецифической индукции “пустым” вектором в повышении транскрипционной активности гена, кодирующего мРНК для САПМ.

3.4.2. Иммуноцитохимическая верификация клеток NB-1, положительных по экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной.

       Исследование методом иммуноцитохимического анализа показало, что в клеточных линиях NB–1 нейробластомы человека, не модифицированных трансфекцией для получения клеток с повышенной экспрессии гена САПМ, представляется затруднительным локализовать антиген,  даже  при использовании усиления сигнала с помощью иммуноцитохимических систем визуализации. По–видимому,  это  связано с тем,  что  САПМ – это фермент, который в количественном отношении незначительно представлен в клетке и не образует скоплений в клеточной мембране. В связи с этим представляет несомненный интерес возможность локализовать САПМ: находится ли фермент предпочтительно в теле нейральной клетки или её отростках. Результаты иммуноцитохимического анализа показали, что клетки NB–1 нейробластомы человека после трансфекции вектором, содержащим ген САПМ, значимо экспрессируют фермент, который выявляется с помощью моноклональных антител. При этом флюоресцентный сигнал выявляется не только в теле нейральной клетки, но и её отростке. По–видимому, синтезируясь и созревая в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме фермент, в дальнейшем, поступает из тела нейральной         клетки в её отросток.

ВЫВОДЫ

1. Клоны клеток перевиваемой рабдомиосаркомы РА–23 крыс с высоким метастатическим потенциалом характеризуются низкой активностью лизосомальной сиалидазы, тогда как клоны клеток с низким метастатическим потенциалом характеризуются высокой активностью лизосомальной сиалидазы, что свидетельствует о важности этого фермента для метастазирования опухолевых клеток мышечного происхождения.

2. Клоны клеток перевиваемой рабдомиосаркомы РА–23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом характеризуются, соответственно, более выраженными и менее выраженными изменениями структуры ядер в форме  интерфазных мостов. 

3. Морфологическая дифференцировка нейральной клеточной линии NB–1 нейробластомы человека сопровождается высокой активностью сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной, что свидетельствует о супрессивном значении этого фермента для опухолей нейрального происхождения. 

4. Циклический аденозинмонофосфат повышает количество матричной РНК гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной и её активность в нейральной клеточной линии NB–1 нейробластомы человека, что свидетельствует о зависимости этих изменений от цАМФ–сопряжённой сигнальной системы.

5. Циклический аденозинмонофосфат не вызывает повышения количества матричной РНК гена лизосомальной сиалидазы и её активности в клетках NB–1 нейробластомы человека, что указывает на отличные от цАМФ–сопряжённой сигнальной системы механизмы геномной и протеомной регуляции этого фермента в нейральных клетках.

  1. В нейральных клетках NB–1 нейробластомы человека с высокой активностью сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной регистрируется достоверное повышение активности ацетилхолинэстеразы, что доказывает возможность использования сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, как функционального маркера дифференцировки опухолевых клеток нейрального происхождения. 

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендуется использование перевиваемой рабдомиосаркомы РА-23 крыс в качестве экспериментальной модели для тестирования противоопухолевых препаратов. При этом предлагается измерять активность лизосомальной сиалидазы, как маркера снижения метастатического потенциала опухолевых клеток.

2.  Предлагается регистрировать активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной при тестировании антибластомных средств, разрабатываемых для супрессии опухолей нейрального происхождения. 

  1. В экспериментах по регенерации аксонов необходимо учитывать значения активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной как прогностического маркера. 

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кравцов В.Ю., Прошин С.Н., Федорцева Р.Ф., Треус В.В., Никифоров А.М., Яковлев А.Ф., Каминская Е.В., Вахтин Ю.Б. Частота клеток с полумостами в клеточных популяциях in vivo // Доклады Академии Наук. – 1996. – Т.350. – N.6. – С.831–833.

2. Vakhtin Yu.B., Kaminskaya E.V., Kravtsov V.Yu., Proshin S.N., Fedorova E.V., Yakovlev A.F. Genomic stability of tumour cells of rat rhabdomyosarcoma with different levels of tumorogenicity. In: 'Molecular determinants of cancer metastasis' // 50th Annual Symposium on Fundamental Cancer Research / Houston, Texas, USA. – 1997. – P.122.

3. Кравцов В.Ю., Прошин С.Н., Яковлев А.Ф., Каминская Е.В., Вахтин Ю.Б. Мосты и многополюсные митозы в популяциях клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс // Бюл. Эксп. Биол. Мед. – 1997. –  Т.123. – N.5. – С.569–572.

4. Proshin S, Kaminskaya E, Vakhtin Yu, Kravtsov V, Yakovlev A. Cells with "trailed nuclei" as markers of the breakages of the chromosome bridges // XVIII International Congress of Genetics / Beijing, China. – 1998. – P.32.

5. Kaminskaya E.V., Vakhtin Yu.B., Fedorova E.V., Kravtsov V.Yu., Proshin S.N., Yakovlev A.F. Mutagenecity and tumorigenecity in cells of lung metastases of rat rhabdomyosarcomas // 17th International Cancer Congress / Rio de Janeiro - Brazil. – 1998. – P.216.

6. Прошин С.Н., Кравцов В.Ю., Ольнев М.Г., Яковлев А.Ф., Вахтин Ю.Б. Хромосомные мосты и "хвостатые" ядра в популяциях злокачественных клеток // Генетика. – 1998. – Т.34. – №.1. – С.61-64.

7. Патент на изобретение N 2111249 от 20 мая 1998 года. Способ селекции популяций клеток in vivo. Прошин С.Н., Кравцов В.Ю., Яковлев А.Ф., Федорцева Р.Ф., Бычкова Н.В., Вахтин Ю.Б., Никифоров А.М.

8.Забежинский М.А., Коваленко А.Л., Кветной И.М., Южаков В.В., Попучиев В.В., Вахтин Ю.Б., Каминская Е.В., Прошин С.Н., Попович И.Г., Зарипова Е.А., Анисимов В.Н. Влияние циклоферона на метастазирование карциномы лёгких Льюис у мышей и рабдомиосаркомы РА-23 у крыс // Вопросы онкологии. – 1999. – Т.45. – N.6. – С.650–654.

9. Proshin S., Yamaguchi K., Wada T., Miyagi T. Modulation of neuritogenesis by ganglioside-specific sialidase in human neuroblastoma NB-1 cells // The 23rd Japanese Carbohydrate Research Meeting / Yokohama, Japan. 2002. – P.237.

10.Proshin S., Yamaguchi K., Wada T., Miyagi T. Modulation of neuritogenesis by ganglioside-specific sialidase (Neu 3) in human neuroblastoma NB-1 cells // Neurochemical Research. – 2002. – Vol.27. – N7/8. – P.841-846.

11.Прошин С.Н. Физиологические эффекты сиалидаз в формировании пластичности нервной ткани // Психофармакология и биологическая наркология. – 2007. – Том.7. – N.1. – С.1414–1418.

12.Прошин С.Н. Физиологическая роль ганглиозидов и сиалидаз при воздействии факторов ионизирующей радиации // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. – 2007. – N. 2. – С.28–32.

13.Proshin S.N. Sialidase activity and metastatic characteristics of tumor cell clones in vivo of rat rhabdomyosarcoma RA-23 // J. Glycobiology. - 2007. – Vol.17. – N.11. – P.1228.

14.Прошин С.Н., Каминская Е.В., Лебедев А.А., Кравцов В.Ю., Шабанов П.Д. Активность лизосомальной сиалидазы в опухолевых клетках клонов рабдомиосаркомы РА-23 / III Съезд Фармакологов России: спец. вып. (сентябрь). С.1909 // Психофармакология и биологическая наркология. – 2007. – Т.7. – Ч.2. – 2084 с.

15.Прошин С.Н., Каминская Е.В., Лебедев А.А., Шабанов П.Д. Опухолевые клетки клонов рабдомиосаркомы РА-23 с высоким и низким метастатическим потенциалом отличаются по активности лизосомальной сиалидазы // Бюл. Эксп. Биол. Мед. – 2008. – Том.145. – N.3. – С.330–333.

16.Прошин С.Н., Каминская Е.В., Лебедев А.А., Байрамов А.А., Яковлев А.Ф., Шабанов П.Д. Метастатический потенциал и сиалидазная активность клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА – 23 крыс // Мед. Акад. Жур. – 2008. – Том.2. – С.26–29.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.