WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

УДК 577.218 Тиллиб

Сергей Владимирович Исследование молекулярных механизмов функционирования продуктов гена trithorax в регуляции тканеспецифической экспрессии генов у Drosophila melanogaster Специальности:

03.01.03 - молекулярная биология и 03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена в Университете Томаса Джефферсона (Филадельфия, США) и в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чуриков Николай Андреевич Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва чл.-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Габибов Александр Габибович Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН, Москва доктор биологических наук Томилин Алексей Николаевич Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития РАН, Москва

Защита состоится « » __________ 2011 г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН) по адресу: 119334 г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу:

119991 г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан « » __________ 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук Грабовская Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Данная работа посвящена очень актуальной в последние годы теме молекулярной и клеточной биологии – эпигенетической регуляции активности тканеспецифических генов в процессе развития. Особый интерес в этой связи связан с белками группы Поликомба (PcG, Polycomb Group) и группы Триторакса (trxG, trithorax Group). Эти белки, первоначально описанные у дрозофилы, являются консервативными хромосомными факторами, которые, находясь в составе многокомпонентных комплексов, поддерживают задаваемое на самых ранних этапах эмбрионального развития тканеспецифическое распределение активного или репрессированного состояния многих генов-мишеней (в частности, гомеотических генов) путём поддержания соответственно «открытой» или «закрытой» их локальной хромосомной структуры. Нарушение регуляции генов этих групп (trxG, PcG) ведёт к потере «клеточной памяти», аберрантной клеточной пролиферации и злокачественному перерождению клетки. Эти факторы играют важную роль в таких разнообразных эпигенетических процессах, как плюрипотентность и пластичность стволовых клеток, геномный импринтинг и инактивация Х-хромосомы.

Интерес к генам и белкам групп Триторакса и Поликомба особенно усилился несколько лет тому назад, когда была обнаружена непосредственная связь данных хромосомных белков с энзиматическими активностями, модифицирующими гистоны и структуру нуклеосом. Так, например, белок TRX и его гомолог у млекопитающих, протоонкоген MLL (ALL1, HRX), обладают гистон-метилтрансферазной активностью, за которую отвечает высококонсервативный SET-домен. Этот домен специфически метилирует лизин 4 гистона Н3, что является эпигенетическим маркером, типично ассоциированным с транскрипционно активным хроматином.

Эпигенетические регуляторы групп Триторакса и Поликомба осуществляют свою функцию посредством взаимодействия с особыми регуляторными цис-элементами геновмишеней. Эти элементы обычно называют PRE/TRE («Polycomb- / trithorax- response elements»). Так как PRE и TRE часто колокализуются, их вместе также называют «элементами поддержания» («maintenance elements») тканеспецифической активности гена, или «модулями клеточной памяти». Принципиальные особенности самих PRE/TRE, детали механизмов их узнавания хромосомными факторами и последующего распространения специфического воздействия на экспрессию регулируемого гена остаются слабо изученными. Эти элементы в некоторых случаях локализуются на значительном (десятки тысяч пар нуклеотидов) отдалении от промотора. Представление об организации этих участков ДНК на сегодняшний день остаётся довольно запутанным:

"довольно протяжённый без чётко выраженных краёв элемент, чья функция зависит от множественных кооперативно работающих суб-элементов". Эти «модули клеточной памяти» обычно непосредственно соседствуют с энхансерными и репрессорными элементами, или даже включают их в свой состав. Интересные, но пока противоречивые данные были получены недавно о связи этих элементов с районами транскрипции некодирующих регуляторных РНК, о возможной связи PRE/TRE с системами транскрипционной интерференции или транскрипционной активации/репрессии близко расположенного промотора гена. Принципиальная сложность изучения этих элементов связана с тем, что их активность проявляется только в контексте развития и зависит от конкретного типа ткани/клетки. Большая часть сведений о PRE/TRE была получена при функциональном изучении in vivo всего трёх генетических локусов, что, очевидно, недостаточно. При этом не было выявлено протяжённых гомологичных последовательностей или каких-то воспроизводимых выраженных структурных особенностей. Большинство Pc-G/trx-G - белков, по-видимому, не способны связываться со строго специфической последовательностью ДНК. Некоторые белки (PHO/PHOL, GAGA factor, Zeste, Pipsqueak, Dsp1, Grainyhead/Elf, Sp1/KLF) в разной мере обладают подобной активностью. Эти белки, очевидно, участвуют в каких-то элементах процесса связывания регуляторных белковых комплексов с определёнными участками ДНК, однако, только участием этих белков объяснить процесс специфического узнавания не удаётся. Предполагается, что TRE и PRE в данном гене в значительной степени колокализуются и функционируют взаимоисключающе, в зависимости от типа клетки.

Исторически большинство исследователей эпигенетической регуляции уделяли большее внимание механизмам репрессии генов, считая поддержание их активности пассивным процессом. В настоящее время происходит заметный пересмотр такого одностороннего представления. Накапливается все больше веских аргументов об активной природе эпигенетически регулируемого поддержания активной экспрессии многих важных регуляторных генов. Именно исследованию экспрессии и механизмов функционирования продуктов одного из главных факторов поддержания тканеспецифической активности генов, гена trithorax, и посвящена данная работа.

Цели и задачи исследования.

Цель работы заключалась в изучении экспрессии и молекулярных механизмов функционирования продуктов гена trithorax.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить ряд следующих задач.

1. Изучить структуру и распределение в эмбрионах Drosophila melanogaster на разных стадиях развития транскриптов гена триторакс (trx).

2. Исследовать структурно-функциональные особенности основных белковых продуктов (TRX) гена trx.

3. Провести определение и сравнительный анализ первичных структур гена trx и соответствующих альтернативных транскриптов у наиболее эволюционно удаленных видов Drosophila: D.virilis и D.melanogaster.

4. Исследовать взаимодействия TRX с другими ядерными компонентами, в первую очередь, с белковыми продуктами других генов группы Триторакса.

5. Исследовать на модельных системах хромосомные регуляторные элементы, необходимые для функционирования Триторакс-ассоциированной системы поддержания заданного уровня тканеспецифической транскрипции соответствующих регулируемых генов-мишеней.

6. Предложить новые подходы для исследования in vivo функционирования Триторакс-ассоциированной регуляторной системы и других подобных регуляторных белков.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Определена структура и локализация в эмбрионах на разных стадиях развития альтернативно сплайсируемых транскриптов гена trithorax (trx) Drosophila melanogaster.

2. Детектированы соответствующие альтернативным транскриптам основные белковые изоформы Триторакса (TRX). Установлено, что TRX является ядерным белком и способен связываться с определенными участками политенных хромосом слюнных желёз.

3. Проведен сравнительный анализ первичной структуры гена trx и соответствующих альтернативных транскриптов у Drosophila virilis и у Drosophila melanogaster.

Выявлена высокая консервативность как структуры этого гена, так и распределения его транскриптов в эибриогенезе.

4. TRX и ASH1, продукт другого гена группы Триторакса, непосредственно взаимодействуют, и их участки связывания с политенными хромосомами совпадают или находятся в непосредственной близости друг от друга.

5. Исследован in vivo регуляторный элемент PRE/TRE из дальней промоторной области гена Ultrabithorax. Выявлена необычно сложная его структура, состоящая из многих функционально значимых участков, способных взаимодействовать с белками и активационной и репрессионной систем.

6. В расширенной промоторной области гена fork head уточнены границы и продемонстрирована функциональная значимость in vivo нового регуляторного элемента (TRE), необходимого для TRX-зависимого поддержания экспрессии этого гена в клетках слюнных желёз личинки дрозофилы. Получены данные о колокализации TRE со скаффолд / матрикс-ассоциированными участками хромосом.

7. Проведено крупномасштабное исследование изменений транскрипции генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL1 (гомолог дрозофилиного TRX). Выявлены гены, которые могут быть непосредственно вовлечены в онкогенез. Полученные результаты демонстрируют наличие характерного рисунка транскрипционной активности генов в ALL1ассоциированных опухолях.

8. Белок TRX, известный как хромосомный белок и важный компонент системы поддержания транскрипционно активного состояния многих генов, может быть выявлен в ассоциации с не хромосомными элементами ядерного скелета.

9. Разработан новый подход к исследованию клеточных компонентов (в том числе и пока неизвестных), ассоциированных с определённым белком на примере получения однодоменных мини-антител к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком Триторакс (TRX).

10. Продемонстрирован новый метод наблюдения за антигеном в живых клетках с помощью специально генерированных флуоресцирующих мини-антител.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Данная работа, проводимая в течение последних 20 лет, включает в себя проверенные временем и признаваемые ведущими учеными разных стран пионерские исследования в области изучения транскриптов и белковых продуктов гена trithorax, их взаимодействий с другими белками группы Триторакса, а также исследования in vivo с помощью трансгенных конструкций регуляторных элементов (TRE), необходимых для TRX-зависимого поддержания экспрессии генов-мишеней. Впервые было показано, что TRE/PRE элемент может состоять из множественных суб-элементов, существенных для функционирования как trxG-, так и PcG-белков, причём эти суб-элементы явно взаимодействуют друг с другом. В результате сложных как конкурентных, так и кооперативных взаимодействий определяется структура локального хроматина и, как следствие, соответствующий для данной ткани уровень экспрессии гена. В ходе проделанной работы были впервые получены и опубликованы в ведущих журналах новые данные, посвященные а) белок-белковым взаимодействиям среди продуктов различных генов группы trx-G, б) очистке первого белкового комплекса (ТАС1), содержащего TRX, в котором также выявлялась гистон-ацетилтрансфераза dCBP и вероятная антифосфатаза Sbf1, в) участию ТАС1-комплекса в регуляции экспрессии генов теплового шока, г) в работе по крупномасштабному исследованию изменений транскрипции многих тысяч генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL1 (гомолог дрозофилиного TRX), в результате которой были выявлены гены, которые могут быть непосредственно вовлечены в онкогенез. Было установлено, что применяемые ранее условия фракционирования (выделение комплекса ТАС1, Petruk et al., Science, 2001) могут приводить к потере значительной доли TRX вследствие его тенденции к ассоциации с нерастворимыми компонентами ядерного скелета (Лебедева и Тиллиб, Генетика 2003). Более того, подобная ассоциация является, по-видимому, характерной особенностью белков, связанных с системой модификации гистонов (хроматина). Одним из основных инструментов в исследовании белков являются антитела. На протяжении многих лет исследований мы генерировали различные антитела, узнающих разные домены исследуемых белков. Конечно же, в первую очередь, получали антитела к доменам TRX.

Эти антитела используются во многих лабораториях мира. Также использовались полученные нами для исследования TRE/PRE конструкции и соответстующие линии трансгенных мух. В последние годы мы уделяли большое внимание разработке и использованию новой высокоэффективной технологии генерирования однодоменных мини-антител. С помощью этой технологии мы разработали новый подход к исследованию клеточных компонентов (в том числе и пока неизвестных), ассоциированных с определённым белком на примере получения однодоменных миниантител к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком Триторакс.

Совместно с зарубежными коллегами мы разработали новый подход для наблюдения за антигеном в живых клетках с помощью специально получаемых однодоменных миниантител, соединенных (экспрессирующихся в одной общей рамке считывания) с флуоресцирующим белком. Полученные в настоящее время мини-антитела к различным доменам TRX планируется использовать для получения трансгенных конструкций, экспрессирующих такие мини-антитела, соединенные с флуоресцирующим белком в разных тканях дрозофилы. Мы надеемся, что этот подход позволит изучать процессинг и функционирование белковых продуктов гена trithorax в максимально приближенных к нативным условиях. Полученные результаты используются в курсах лекций для студентов и молодых ученых, в частности на кафедре эмбриологии МГУ им М.В. Ломоносова, на школах по биологии развития.

Апробация работы.

Материалы работы докладывались на различных отечественных и международных конференциях и семинарах, в том числе на международных конференциях по исследованию дрозофилы (Сан Диего, США, 1996, и Питтсбург, США, 2000), на ежегодной конференции Института молекулярной генетики Макса-Планка (Берлин, Германия, 2002), на 6-ой международной конференции им. Энгельгардта (СанктПетербург – Москва, Россия, 2003), на конференции EMBO «Структура и динамика ядра» (Монпелье, Франция, 2007), на российско-немецком двустороннем симпозиуме «Молекулярная биомедицина» (Санкт-Петербург, Россия, 2008), на XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития». (Звенигород, Россия, 2008), на международном симпозиуме «Однодоменные антитела достигли совершеннолетия» (Гент, Бельгия, 2010), отчетных конференциях по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Москва, Россия, 2005, 2007 и 2009), межинститутском семинаре «Хромосома» (Москва, Россия, 2011).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 20 статей в международных и отечественных рецензируемых журналах.

Структура и объём работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы «результаты и обсуждение», объединяющей 9 подглав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 245 наименований. Работа изложена на 233 страницах машинописного текста, содержит 60 рисунков и 9 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение структуры и локализации в эмбрионах Drosophila melanogaster на разных стадиях развития альтернативно сплайсируемых транскриптов гена триторакс (trx).

Предшествующие данной работе предварительные исследования (Northernгибридизационные эксперименты) показали, что ген trx,по-видимому, кодирует несколько очень длинных мРНК (размером примерно 10-15 т.п.н.), по-разному экспрессирующихся в процессе раннего эмбрионального развития (Mozer and David, 1989; Breen and Harte, 1991). Был получен ряд кДНК, соответствующих некоторым, но не всем, участкам trx мРНК. Эти последовательности кДНК с помощью метода ОТ-ПЦР (RT-PCR) удалось соединить, в результате чего была выявлена гипотетическая очень протяженная открытая рамка считывания (ORF), кодирующая гигантский белок, состоящий из 3759 аминокислот (Mazo et al., 1990).

На начальном этапе данной работы был проведен детальный анализ структур и экспрессии на разных стадиях эмбрионального развития альтернативно сплайсируемых транскриптов гена trx. Полученные результаты суммированы в рисунке 1. 5’-конец trxмРНК был определен в результате применения методов «защиты от РНКазы» (RNase protection) и «удлинения праймера» (primer extension). Выявленное положение начала транскрипции совпало с началами последовательности двух ранее полученных клонов кДНК (Mozer and David, 1989). Для определения положения 3’-концов trx-мРНК был использован метод 3’ RACE-PCR (Frohman, 1990). Наши предварительные Норзернгибридизационные эксперименты позволили предположить, что 3’-конец trx-мРНК локализуется внутри XbaI-XhoI фрагмента размером 2,2 т.п.н. (рис.1). Мы просеквенировали этот фрагмент геномной ДНК (в то время еще не было данных геномного секвенирования) и на основе полученной последовательности синтезировали несколько олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-экспериментов. Секвенирование полученных ПЦР-продуктов позволило выявить два альтернативных 3’-конца trx-мРНК:

ближний – локализующийся в154 нуклеотидах от конца белок-кодирующей последовательности, и дальний – в 1732 нуклеотидах от конца белок-кодирующей последовательности. Эти 3’-концы локализуются соответственно в 16 и 32 нуклеотидах от сигнала полиаденилирования (AATAAA). Пять форм trx-мРНК (M,ME,E1,E2 и L), образующихся в результате альтернативного сплайсинга, было идентифицировано в результате применения комбинации различных методических подходов: обратной транскрипции, сопряженной с ПЦР-амплификацией, метода «защиты от РНКазы», Норзерн-гибридизационного анализа. Впервые были детектированы структуры, соответствующие M, ME и E2 РНК (в районе экзонов 1-4), обнаружен ряд ранее неизвестных микроинтронов. Представленные на рис.1 структуры пяти trx-мРНК, опубликованные в 1994 году, и на сегодняшний день являются базовой информацией о транскриптах гена trx.

Рисунок 1. Молекулярная структура trx-мРНК. В верхней части рисунка показана схема геномной ДНК в районе гена trx (kb – т. н.). Показаны участки расщепления рестрикционными эндонуклеазами Xb, XbaI; E, EcoRI; N, NdeI; H, HindIII; X, XhoI. B(trxB11) и E3 (trxE3) – локализации делеционных мутаций, картированных ранее (Mazo et al., 1990). trxB11 – делеция с нарушением рамки считывания («нулевой аллель»); trxE3 - делеция аминокислот 2164-2443 с сохранением рамки считывания. Стрелка под верхней линией указывает на локализацию общего для trx-мРНК участка начала транскрипции, который мы детектировали с помощью методов “защиты от РНКазы” (RNase protection) и «удлинения праймера» (primer extension). (A)n – обозначает два сайта полиаденилирования, которые были определены с помощью метода «3’-RACE». Пять вариантов trx-мРНК были детектированы и проанализированы: M, 10941 н., ME, 12519 н., E1, 13519 н., E2, 12968 н., L, 14205 н. (последовательности этих мРНК были депозитированы в GenBank (регистрационный номер - Z31725). Положение экзонов в кДНК последовательности и размеры мРНК определяли, основываясь на результатах предыдущего секвенирования кДНК (Mazo et al., 1990) и секвенирования полученных в данной работе продуктов RT-PCR. Показаны инициирующий и терминирующий кодоны в каждой мРНК. Микроинтроны обозначены вертикальными линиями. кДНК-пробы, использованные для Northern-blot и in situ гибридизаций показаны в нижней части рисунка. Слева схематически представлены данные по in situ детекции соответствующих trx-мРНК в фиксированных эмбрионах.

Экспрессию пяти различных trx-мРНК на разных этапах развития анализировали с помощью Норзерн-блот- гибридизации (рис.2).

общая проба Б общая проба А В Рисунок 2. Пять trx-мРНК (M,ME,E1,E2 и L, рис.1) экспрессируются в варьирующих количествах на определенных стадиях развития эмбриона. (А) Норзерн-блотгибридизации с поли(А)+РНК (примерно по 10 мкг на дорожку) из эмбрионов («embryo», показаны временные интервалы сбора эмбрионов на разных стадиях развития в часах; из личинок 1 и 2 стадии («1instar», «2 instar»); ранней куколки («early pupae»); из взрослых самцов («male») и самок («female»). Два фильтра (блота) с РНК гибридизовали с Р32мечеными фрагментами кДНК: с общей (детектирующей все trx-мРНК) пробой 1 (35416172 н., согласно нумерации нуклеотидов в trx-мРНК-L), экзоном 2 («exon 2», 888-10н.), экзоном 3 («exon 3», 1140-2252 н.) и пробой к 3’-концу («3’end», 12718-141н.).Гибридизации двух фильтров с контрольной пробой «rp49» (кДНК рибосомного белка 49) были практически идентичны. (Б) Норзерн-блот-гибридизация поли(А)+РНК из эмбрионов отобранных стадий (2-4 часа, 0-1 час, 7-20 часов) и из взрослых мух с Р32меченным фрагментом кДНК, общей пробой 2, специфической к экзонам 1, 3 и началу экзона 4 (рис.1, «probe 2»). (В) Сравнительная Норзерн-гибридизация поли(А)+РНК из самок двух эволюционно отдаленных видов мух D. virilis (V) и D. melanogaster (M).

Любопытно отметить, что во всех проведенных экспериментах мы наблюдали очень узкий пик экспрессии РНК размером примерно 12-13 т.н. – в период 2-4 часов эмбрионального развития. Этот результат хорошо согласуется с обнаружением характерного рисунка экспрессии trx-РНК на стадии формирования индивидуальных плазматических мембран (стадия целлюляризации, рис. 3). РНК размером примерно 14 т.н. также сначала экспрессируется временно, в период 11-15 часов эмбрионального развития. Эта РНК снова выявляется в большом количестве на стадии ранней куколки, а во взрослых самцах является основным вариантом trx-РНК. РНК размером примерно 14 т.н. детектируется с примерно одинаковой относительной интенсивностью пробами к экзону 2 и к экзону 3, из чего можно заключить, что это РНК-L, которая содержит оба эти экзона. В зоне РНК размером примерно 12-13 т.н. в период 2-4 часов, исходя из различий в относительной интенсивности гибридизационных сигналов при использовании разных проб, можно предположить наличие трех вариантов РНК, ME, E1 и E2, экспрессирующихся в примерном количественном соотношении 11:3:1. РНК М с примерным размером 10-11 т.н.

выявляется только во взрослых самках и самых ранних эмбрионах (0-1 час), что указывает на то, что она является материнской РНК. При использовании в качестве гибридизационного зонда длинного 3’-нетранслируемого участка («3’end») детектировались все виды trx-РНК кроме короткой материнской (М).

Рисунок 3. Экспрессия ранних trx-РНК в эмбриогенезе ограничена в пространстве и времени. Гибридизация in situ фиксированных целых эмбрионов, используя дигоксигенинмеченную РНК пробу (соответствующую общей пробе 1, рис.1 и 2) за исключением (Е), где использовали пробу, соответствующую экзону 3. Эмбрионы ориентированы:

антериальной стороной – слева, вентральной стороной – внизу. (F) Для определения границ домена экспрессии trx-РНК на стадии целлюляризации было проведено двойное окрашивание: с антителами анти-ftz и trx РНК-пробой 1.

Из рис. 3 видно, что на стадии ранних делений ядер выявляется равномерное распределение материнских trx-РНК (рис.3, А). Затем в течение короткого промежутка времени (примерно на стадии 9-10 деления ядер) вообще не детектируется trx-РНК (рис.3, В). Зиготическая экспрессия trx-РНК детектируется на ранней стадии 4 (стадия синтициальной бластодермы; стадии различали согласно Campos-Ortega and Hartenstein, 1985) и локализована (рис. 3, С) в постериальной части эмбриона в вентральной области (соответствует будущей мезодерме). На стадии целлюляризации trx-РНК экспрессируется как в вентральной области (презумптивной мезодерме), так и в виде четырех полос, перекрывающихся с распределением продуктов «pair-rule» генов, таких как fushi tarazu ( ftz) (рис.3, D-F). Причем мажорный тип РНК-МЕ экспрессируется в основном в вентральной области, тогда как РНК-Е1 – равномерно распределена вдоль всего видимого окрашивания (рис. 3, Е). Антериальная граница экспрессии trx-РНК на этой стадии соответствует постериальной части парасегмента 5 (между 2 и 3 полосами ftz), а постеральная граница локализуется в парасегменте 13 (между 6 и 7 полосами ftz). Рисунок экспрессии trx-РНК заметно не меняется на стадии начала гаструляции (на рис. показаны латерально (G) и вентрально (H) расположенные эмбрионы). «Ранняя эмбриональная trx-РНК» также детектируется в мезодерме на стадии удлинения зародышевой полоски (рис.3, I,J)., после чего наблюдается заметное ослабление ее экспрессии. На более поздних стадиях эмбриогенеза наблюдается снова усиление экспрессии уже «поздней эмбриональной trx-РНК» (рис.3, К,L), что согласуется с данными Норзерн-гибридизации (РНК-L, рис.1 и 2).

Известно, что ген trx требуется во время развития для поддержания экспрессии гомеотических генов комплексов bithorax (BX-C) и Antennapedia (ANT-C). В соответствии с выявленными паттернами экспрессии trx-РНК можно предполагать, что trx может участвовать в очень ранней регуляции гомеотических генов, экспрессирующихся в постериальном районе эмбриона там же, где и ранние trx-РНК, внутри парасегментов 613. Эта локализация совпадает с доменами экспрессии генов BX-C. В самом деле, нам удалось показать, что экспрессия генов BX-C заметно понижена в сильном trx-мутанте trxB11 (рис.1) уже на стадии удлинения зародышевой полоски (рис. 4). Интересно, что экспрессия генов ANT-C локализуется в более антериальной части эмбриона, и лишь на поздних стадиях эмбриогенеза (13-16 часов) можно увидеть ослабление их экспрессии в trx-мутанте. Более того, в trx-мутанте trxE3 (рис.1) экспрессия генов BX-C не изменена, а экспрессия генов ANT-C понижена. Из наших данных можно заключить, что правильная экспрессия генов этих двух гомеотических комплексов поддерживается продуктами различных trx-РНК на разных стадиях эмбриогенеза.

Рисунок 4. Экспрессия генов BX-C (Ubx, Abd-A и Abd-B ) заметно понижена в trxмутанте (trxB11, А, C, E) по сравнению с эмбрионом дикого типа (wt, B, D, F) уже на ранних стадиях эмбриогенеза (стадии 10-11).

Исходя из определенной структуры trx-РНК, мы проанализировали возможные открытые рамки считывания на предмет предсказания белковых продуктов. Различия в кодирующих районах trx-РНК определяются альтернативным использованием экзона 3.

Первый AUG-кодон локализуется в начале экзона 3 и может быть использован для инициации трансляции trx-РНК E1 и L. Инициация трансляции trx-РНК M, ME и Eможет начинаться с первого AUG-кодона, находящегося в 21 н. от начала экзона 4. Оба AUG-кодона окружены последовательностями, которые оптимальны для инициации трансляции (Cavener and Ray, 1991). Проведенный нами анализ кодирующих последовательностей в гене trx из D.virilis показал, что эти два AUG-кодона консервативны между этими двумя видами. Интересно, что альтернативный сплайсинг также обнаружен в N-концевой кодирующей части у белка человека (MLL1/ALL1), являющегося гомологом trx (Domer et al., 1993).

2. Определение и сравнительный анализ первичной структуры и экспресии гена trx у Drosophila virilis и у Drosophila melanogaster.

С целью выявить консервативные элементы структуры и экспрессии гена trx в эпоху до геномного секвенирования была проведена трудоемкая работа по клонированию и ручному секвенированию геномных последовательностей гена trx из D. virilis наряду с досеквенированием аналогичных последовательностей этого гена у D. melanogaster (GenBank-регистрационный номера, соответственно, Z50038 и Z50152). Выявлена высокая консервативность как структуры этого гена (рис. 5, А,Б), так и распределения его транскриптов в эибриогенезе (рис. 5, В и рис. 2В).

A В Б Рисунок 5. (А) Дот-плот сравнение 18 т.н. геномной последовательности trx из D. virilis (вертикальная ось) и trx из D. melanogaster (от -2,9 т.н. от начала транскрипции и до +23 т.н.; горизонтальная ось).

Прямоугольники соответствуют предсказанным белок-кодирующим последовательностям. Положение протяженных сильно гомологичных последовательностей в интронах и 3’-нетранслируемой последовательности указано стрелками. (Б) Дот-плот сравнение предсказанных белковых TRXпоследовательностей для D. virilis (вертикальная ось) и для D. melanogaster (горизонтальная ось, сверху), а также последовательности человеческого ортолога Триторакса, белка ALL1/MLL1 (горизонтальная ось, снизу). В средней части рисунка представлены результаты сравнения этих белков в виде прямоугольников с указанием консервативных доменов (выделены черным). (В) Экспрессия trx-РНК в эмбрионах D. virilis (A, C, E) так же, как и у D. Melanogaster (B, D, F) локализована в постериальной части презумптивной мезодермы на стадии клеточной бластодермы.

3. Исследование основных белковых продуктов гена триторакс.

В результате большой проделанной работы по получению антител к различным доменам предполагаемого белкового продукта гена trx и по оптимизации Вестерн-блот-процедуры нам впервые удалось детектировать соответствующие альтернативным trx-мРНК две основные белковые изоформы триторакса, названные TRX I и TRXII, с размером примерно 450 и 475 кДа (рис. 6).

Б Рисунок 6. Детекция белковых продуктов гена trx в эмбриональных экстрактах.

(А) Схема идентифицируемых белковых продуктов гена trx. N1, L2, N4, L9 обозначают локализации белковых доменов, к которым получали соответствующие антитела. Е3 и черный прямоугольник обозначают локализацию белкового домена в 280 аа, делетированного в trxE3.

Стрелка показывает, что специфическое расщепление обеих белковых изоформ происходит внутри участка, делетированного в trxE3.

(Б) Серия фильтров, полученных в результате Вестерн-блот-анализа белков из эмбриональных (тотальных или ядерных) экстрактов. Для детекции trx-белков использовали поликлональные кроличьи аффинно очищенные антитела N1, L2, N4, L9 в разведениях 1:200-1:400. (Е3) Ядерные экстракты из эмбрионов, собранных из гетерозиготных мух, содержащих мутацию trxE3; (wt, левая панель) ядерные экстракты из эмбрионов дикого типа; (В11) тотальные экстракты, приготовленные из специально отобранных гомозиготных по мутации trxB11 эмбрионов; (wt, правая панель) тотальные экстракты из гетерозиготных trxB11 эмбрионов, отобранных в том же, что и гомозиготные мутанты, эксперименте. С целью увидеть большие белковые изоформы с помощью L9 антител было нанесено в 10 раз большее количество экстракта (wt, вторая из двух справа). Фильтр L2+N4 показывает разницу в количестве trx-белковых изоформ в ранних (0-7 ч) и поздних (8-20 ч) эмбрионах. В соответствиями с данными альтернативного сплайсинга в ранних эмбрионах мажорной является изоформа TRXI, а в поздних – TRXII.

С помощью полученных и охарактеризованных на специфичность анти-TRX антител было установлено, что TRX является ядерным белком и способен связываться с определенными участками политенных хромосом из секреторных клеток слюнных желёз личинок 3-ей стадии (рис. 7). Мы прокартировали 16 мажорных сайтов связывания TRX (рис. 7, Б), многие из которых близко локализуются с сайтами связывания нескольких белков группы Поликомба. Следует заметить, что эти первые окрашивания хромосом проводили еще до использования флуоресцирующих белков, использование которых впоследствии позволило заметно повысить чувствительность метода и выявить большее число сайтов связывания TRX.

Рисунок 7. Иммунное окрашивание с помощью анти-TRX антител препаратов политенных хромосом из личинок мух дикого типа. Стрелка указывает на один из сильных сигналов связывания TRX, соответствующий цитологичекой локализации гена fork head (fkh, 98D1). Справа приведена таблица с картированными сайтами связывания TRX («trx site») и некоторых белков группы Поликомба («Pc-G and zeste sites», из работ ряда других авторов).

Интенсивность связывания TRX заметно ослабевало в личинках несущих мутации (использовали температурочувствительные мутации) в другом гене группы Триторакса, ash-1, и ослабевало в несколько меньшей степени в личинках с мутацией в гене E(z) группы Поликомба, что может указывать на взаимодействие белковых продуктов этих генов, которое способствует связыванию с этими хромосомными сайтами.

Сильный сайт связывания TRX был локализован в области регион-специфического гомеотического гена fork head (fkh), не входящего в гомеотические комплексы.

Последующий анализ связывания TRX с помощью трансгенов, содержащих фрагменты гена fkh, которые достаточны для выраженной экспрессии с его промотора в трансгене репортерного гена(lacZ), показал, что 8,4 т.н.-расширенная промоторная область этого гена достаточна для связывания TRX (рис. 8, А) и для поддержания экспрессии в нескольких эмбриональных и личиночных тканях, включая слюнные железы. Экспрессия эндогенной fkh-мРНК сильно ослабляется в мутантных по trx эмбрионах и тканях личинки (например, в слюнных железах), как видно на рис.8, Б. Эти результаты указывают на то, что белковые продукты гена trx (TRX) поддерживают экспрессию генов-мишеней посредством взаимодействия с регуляторными участками этих генов (эти участки можно обозначить как «TRE», «trithorax response element»).

А Б Рисунок 8. (А) Детекция нового участка связывания TRX в месте встраивания трансгенной конструкции, содержащей 8,4 т.н.- промоторную область гена fkh (указан стрелкой, внизу). Сверху показано отсутствие сигнала в этом месте в случае хромосомы дикого типа (без трансгена).

(Б) Экспрессия fkh-мРНК сильно ослабляется в гомозиготных trxB11 эмбрионах на стадии (верхний ряд, справа) по сравнению с эмбрионом дикого типа (верхний ряд, слева), а также в слюнных железах личинки в случае гомозиготной trx-мутации trxE12 (нижний ряд, справа) по сравнению с экспрессией в личинке дикого типа (нижний ряд, слева).

4. TRX и ASH1, продукт другого гена группы Триторакса (ash-1), непосредственно взаимодействуют, и их участки связывания с политенными хромосомами совпадают или находятся в непосредственной близости друг от друга.

Среди белков группы Триторакса нам представляется наиболее близким к TRX по свойствам белок ASH1, являющийся продуктом гена ash-1. Уже, базируясь на анализе генетических взаимодействий между trx и ash-1 (и ash-2), было предпложено, что эти белки функционируют в составе общего многокомпонентного комплекса (Shearn, 1989).

Правда, до сегодняшнего дня пока не удалось выделить такой комплекс с помощью биохимического фракционирования. Другим веским аргументом в пользу взаимодействия этих белков явлется уже упомянутые выше наши данные о том, что связывание TRX с политенными хромосомами заметно ослабевало при повышенных температурах в личинках, гомозиготных по температурочувствительному мутантному аллелю ash-1. Оба белка, TRX и ASH1, содержат похожие консервативные домены. Это «PHD-finger»домены, которые являются богатыми цистеинами «цинковый палец»-подобными мотивами, участвующими в белок-белковых взаимодействиях, а также очень важный многофункциональный высококонсервативный «SET»-домен. Все известные лизиновые гистон-метилтрансферазы содержат «SET»-домен, который собственно и обладает этой активностью. Оба рассматриваемых белка, TRX и ASH1, также являются гистонметилтрансферазами. Нам удалось получить еще ряд данных указывающих на функциональную близость этих белков. Эндогенные белки TRX и ASHкоиммунопреципитируют из эмбрионального экстракта и практически полностью колокализуются на политенных хромосомах слюнных желез (Рис.9).

Рисунок 9. Эндогенные белки ASH1 (окраска с использованием вторичных антител, конъюгированных с красным флуоресцентным белком) и TRX (окраска с использованием вторичных антител, конъюгированных с зеленым флуоресцентным белком) колокализуются на политенных хромосомах слюнных желез (при наложении этих двух окрашиваний в случае совпадения сигналов получается желтый цвет, на рисунке справа).

Мы также показали, что TRX и ASH1 оба связываются in vivo со сравнительно небольшим (4 т.н.) суб-регионом из pbx/bxd-регуляторной области гомеотического гена Ultrabithorax (Ubx), который содержит несколько TRE (рис.10). Анализ эффектов мутаций ash1 на активность (окраску глаз, зависимую от репортерного гена white) этого регуляторного субрегиона показал, что этот регион также содержит ash1-зависимые регуляторные элементы.

Позднее мы также показали, что TRX и ASH1 ведут себя очень похоже при ступенчатой экстракции ядерных белков. Оба эти белка имели тенденцию к ассоциации с так называемым материалом «ядерного матрикса», или со скаффолд/матриксприкрепленными участками ДНК. В совокупности эти результаты указывают на то, что TRX и ASH1 функционально очень близки и взаимодействуют, являясь компонентами одного трудновыделяемого trxG-комплекса или двух различных комплексов, которые находятся вблизи друг от друга на регуляторном элемнте и совместно участвуют в поддержании экспрессии гена-мишени (как в случае с Ubx).

Б Рисунок 10. TRX и ASH1 связываются in vivo с 4 т.н.-регионом из pbx/bxd-регуляторной области гена Ubx. (А) Сверху – карта района BX-C, соответствующего протяженной предпромоторной зоне гена Ubx. Внизу – карта анализированных нами (см. следующий раздел) TRE/PRE-содержащих модулей (D, C и B) в pbx/bxd-районе гена Ubx и в используемой трансгенной конструкции. (Б) Колокализация эндогенных TRX (зеленый) и ASH1 (красный) на политенных хромосомах в месте встраивания трансгенной конструкции N18.

Ряд важных результатов, связанных с тематикой данной работы и полученных в результате нашей совместной работы со многими другими исследователями, коротко упомянуты ниже (подробное изложение - в тексте диссертации).

Установлено, что TRX дрозофилы и его ортолог у человека (MLL/ALL-1/HRX) непосредственно взаимодействуют с белками комплексов (SWI/SNF, BRM), участвующих в структурных изменениях хроматина, ведущих к активации генов.

Выделен белковый комплекс (TAC1), содержащий помимо TRX еще два белка – Sbf1 и dCBP. Белок dCBP способен ацетилировать гистоны. Этот факт является одним из первых свидетельств связи ацетилирования гистонов с механизмами наследуемого поддержания активного состояния определённых генов. Позднее было показано, что этот комплекс способен также специфически метилировать гистон H3 по четвертому лизину (H3-K4). Эта модификация является эпигенетическим маркером активного хроматина.

TRX-содержащий комплекс ТАС1 требуется для метилирования и ацетилирования гистонов нуклеосом в 5’-кодирующем районе гена hsp70 и ряда других генов теплового шока после индукции, что предполагает наличие у ТАС1 новой функции в процессе элонгации транскрипции.

5. Исследование хромосомного регуляторного элемента (TRE/PRE), необходимого для функционирования Триторакс-ассоциированной системы поддержания заданного уровня тканеспецифической транскрипции и локализованного в дальней промоторной области гена Ultrabithorax.

Данный раздел работы посвящен масштабному и уникальному в своем роде исследованию in vivo одного из наиболее ярких примеров TRE/PRE-регуляторных элементов, находящегося внутри pbx/bxd регуляторного района bithorax-комплекса (BXC). Вначале мы провели предварительные эксперименты по иммунопреципитации, сопряженной с ПЦР-амплификацией, комплексов TRX-ДНК, образующихся в эмбриональном ядерном экстракте, с целью картировать потенциальные места связывания TRX в BX-C. Сразу три фрагмента ДНК, связывающихся с TRX, были картированы в области pbx/bxd, наименьшего из картированных на тот момент TRE/PRE-регуляторных элементов. Эта регуляторная область pbx/bxd необходима для правильной тканеспецифической экспрессии гена Ultrabithorax (Ubx) (Chan et al., 1994; Chang et al., 1995). Именно на этом регуляторном районе мы и решили сосредоточить свои усилия при планировании экспериментов по функциональному исследованию in vivo выявленных сайтов связывания TRX. Мы выбрали довольно редко используемый и трудоемкий подход, который сочли более подходящим в данном случае. Вместо исследования относительно небольших регуляторных фрагментов данного района отдельно от остальных регуляторных элементов гена Ubx, мы решили создать базовую трансгенную конструкцию (встраиваемую в вектор pCaSpeR3 для последующей Р-элемент-зависимой трансформации дрозофилиных эмбрионов), которая включает сайты связывания TRX в наболее приближенном к реальности контексте, в составе комбинированной регуляторной последовательности гена Ubx размером в 13 т.н. (рис. 11), в которую мы включили весь регуляторный генетический район bxd, все известные на тот момент значимые регуляторные элементы (в частности, эмбриональные и личиночные энхансеры и репрессоры) расширенной промоторной области этого гена. В качестве репортерного гена использовали ген lacZ (ген -галактозидазы), введенный в конструкцию путем присоединения к фрагменту транскрибируемой части гена Ubx ниже его промоторной области. Таким образом, экспрессия lacZ отражала активность промотора гена Ubx, находящегося в составе трансгенной конструкции. Нам сопутствовала удача в том, что экспрессия нашей базовой конструкции почти полностью соответствовала нормальному эмбриональному экспрессионному паттерну эндогенного гена Ubx (рис. 12). Анализ паттернов экспрессии был дополнен анализом эффектов на второй репортерный ген, ген white, включенный в ту же базовую конструкцию. Также мы изучали чувствительность различных трансгенов к мутациям в генах групп trxG и PcG. На рис. 11 показана как схема базовой конструкции (N), так и различных ее производных, содержащих небольшие (размером примерно 400-500 п.н.) делеции, первоначально соответствующие участкам (B, C, D), связывающимся с TRX in vitro, а также контрольной конструкции (А), содержащей делецию в 1410.п.н. в близлежащем районе (для контроля). Позднее были получены трансгенные мухи, содержащие делеции между B и C, между C и D фрагментами (не показаны), двойную делецию (ВС), а также малые делеции внутри С фрагмента (рис. 11).

Рисунок 11. Схемы «больших» конструкций, используемых для идентификации и исследования TRE/PRE в pbx/bxd-районе гена Ubx. Сверху приведена частичная карта BXC (согласно последовательности в GenBank с рег. номером U31961), включающая регуляторный район pbx/bxd. Базовая конструкция (исследуемая регуляторная последовательность, встраваемая в вектор между двумя репортерными генами) размером в 13 т.п.н. показана утолщенными отрезками сразу под картой. Делеции в конструкциях обозначены незакрашенными прямоугольниками.

На рисунке 12 в верхнем ряду показаны (слева – схема, справа - результат in situ гибридизации с Ubx-РНК) паттерны экспрессии гена Ubx в позднем эмбрионе как дикого типа (wt), так и в случае мутаций по гену trithorax (trx-) или гену Polycomb (Pc-). Видно, что эффект trx- - это ослабление экспрессии Ubx в том же постериальном домене, где этот ген в норме экспрессируется, тогда как в случае Pc- выявляется сильное антериальное распространение экспрессии (нарушение границ экспрессии). Важно отметить, что эти эффекты мутаций генов групп trxG/PcG проявляются лишь на поздних эмбриональных стадиях (после 10 стадии; на этапах поддержания заданного уровня экспрессии) и не влияют на правильное формирование паттерна (инициацию) экспрессии в ранних эмбрионах. Из полученных нами трансгенных линий для последующего анализа брали только те линии (их было большинство), в которых паттерн экспрессии репортерного гена lacZ на стадии ранних эмбрионов напоминал (был практически идентичен) паттерн(у) экспрессии эндогенного Ubx. В эмбрионах всех отобранных трансгенных линий экспрессия репортерного гена lacZ была ограничена (по крайней мере до эмбриональной стадии 10) районом, расположенным постериальнее парасегмента 5 (рис. 13, А, верхний ряд), аналогично эндогенной Ubx-РНК. Экспрессия lacZ в эмбрионах, несущих базовую конструкцию bxd13, «N» (рис.12, рис.13,А), а также укороченную конструкцию А, были очень похожи на паттерн экспрессии эндогенного Ubx на всех проверенных стадиях развития. Эти результаты указывают на то, что все существенные для правильной инициации экспрессии Ubx регуляторные элементы из bxd-райна не были делетированы в наших конструкциях и что наши базовые трансгены содержали практически все TRE и PRE, требующиеся для правильного поддержания экспрессии Ubx в эмбриогенезе.

Делеция А (1,4 т.п.н.) в дистальной области не оказывала какого-либо эффекта на паттерн эмбриональной экспрессии. В нижнем ряду рис. 12 слева схематически показаны эффекты, наблюдаемые при исследовании экспрессии наших трансгенных конструкций, а справа показаны реальные результаты in situ гибридизации с lacZ-РНК.

Рисунок 12. Экспрессия эндогенного (верхний ряд) и репортерного (нижний ряд) генов с промотора гена Ubx в поздних эмбрионах дикого типа (wt) и в случае мутаций по генам trithorax (trx-) или Polycomb (Pc-). Слева –схематическое изображение, справа - результат in situ гибридизации; bxd13 – обозначение базовой («нормальной», N) конструкции;

bxd13B и bxd13C – конструкции, содержащие делеции соответственно фракментов В и С (рис.11).

Анализ паттернов экспрессии трансгенов с делециями В, С и D выявил неожиданные результаты. Хотя во всех трех случаях инициация и поддержание экспрессии на ранних стадих эмбриогенеза были идентичны конструкциям N и А, начиная с 11 стадии, lacZРНК в этих трех вариантах трансгенов начинала абнормально экспрессироваться в антериальных районах центральной нервной системы и структурах головы (рис. 13).

Б В Рисунок 13. Эмбриональная экспрессия lacZ в трансформированных линиях мух дикого типа и в случае мутации trxB11. (А) Детектируемая с помощью in situ гибридизации на фиксированных эмбрионах lacZ-РНК экспрессировалась в районе парасегментов 6-13 на ранней эмбриональной стадии 10 как в показанных N и B (верхний ряд), так и во всех других анализируемых трансгенных линиях (антериальный район – слева). На более поздних эмбриональных стадиях (ст. 15-16) экспрессия конструкции N (и А) оставалась ограниченной этим постериальным участком, а вот экспрессия конструкций В, С и D заметно отличалась: наблюдалась сильная экспрессия в антериальных нейромерах и в головных структурах, при этом также происходило относительное ослабление экспрессии в постериальных сегментах. (Б) Экспрессия lacZ-РНК в центральной нервной системе поздних эмбрионов трансгенных линий N, В, С и D (антериальный район – вверху).

(В) Эффект мутации trxB11 на экспрессию трансгенов N, С и D. Эмбрионы были окрашены антителами к -галактозидазе (коричневый цвет) и несильно окрашены с помощью in situ гибридизации с пробой, специфичной для эндогенной Ubx-РНК (синий цвет).Мутантные эмбрионы идентифицировали по ослаблению экспрессии Ubx.

Как время в эмбриогенезе, так и уровень этой абнормальной экспрессии в антериальной части эмбриона указывают на делецию сильного PRE, что приводит к потере антериальной границы экспрессии. Детали паттернов и уровней экспрессии немного различаются в каждом из трех вариантов анализируемых трансгенов (рис. 13,Б), что указывает на то, что каждая из этих делеций может удалять PRE с несколько отличными характкристиками, вероятно, с несколько отличающимися комплексами связывающихся белков PcG. Наряду с этим Pc-подобным мутантным фенотипом мы также наблюдали в случае каждого из этих делеционных конструкций ослабление экспрессии на периферии нейромеров в районе постериальнее парасегмента 6 (по сравнению с линиями N и А).

Это ослабление lacZ-экспрессии похоже на ослабление экспрессии Ubx в эмбрионах, гомозиготных по мутации trxB11. Для того, чтобы уточнить эти данные, указывающие на то, что существенные TRE были также делетированы в этих трансгенах, несущих делеции TRX-связывающих элементов, мы дополнительно проанализировали экспрессию трансгенов N, В, С и D в эмбрионах, несущих мутацию trxB11 (рис. 13, В). По сравнению с ожидаемо сильным эффектом trxB11, выражающимся в ослаблении lacZэкспрессии, в конструкции N, не было заметного ослабления экспрессии в постериальном районе эмбриона, несущего исследуемые трансгены с делециями В, С и D (рис. 13, В).

Эти результаты указывают на то, что все три TRX-связывающих элемента, детектированные в наших предварительных иммунопреципитационных экспериментах, содержат функциональные TRE и что, по крайней мере, в контексте нашего трансгена все эти элементы существенны для нормальной экспрессии регулируемого гена в эмбрионах.

Абнормальная экспрессия трансгена в антериальной части позднего эмбриона, детектируемая в случае делеций, как мы показали, также зависит от наличия TRX (ослабевает в эмбрионах, несущих мутацию trxB11). А зависимость от наличия соответствующих TRE в трансгене нам удалось продемонстрировать, сконструировав трансгенные линии, несущие делецию сразу двух TRE/PRE, В и С (ВС, рис. 11, рис.

13,А). Экспрессия репортерного гена lacZ в линиях ВС сильно ослаблена в антериальной части эмбриона по сравнению с экспрессией в линиях В и С и напоминет экспрессию в этих линиях с одиночными делециями в эмбрионах, несущих мутацию trxB11. Таким образом, одновременное удаление двух TRE приводит к тому же эффекту, что и полное удаление функции TRX в антериальной части позднего эмбриона.

Помимо анализа экспрессии репортерного гена lacZ мы также анализировали в полученных трансгенных линиях экспрессию второго репортерного гена, mini-white, оценивая окраску глаз во взрослых мухах, которая определяется этим геном. Зависимость работы этого гена (работающего в органе, расположенном в антериальной области тела мухи) от функции гена trithorax была подобна той, что мы обнаружили для абнормальной экспрессии lacZ в антериальной части эмбриона в линиях N, В, С, D и ВС, то есть, если в первых четырех окраска глаза ослабевала в гетерозиготных по мутации trxB11, то в линии ВС окраска глаза не менялась.

Мы использовали этот факт на следующем этапе работы, посвященном исследованию суб-элементов одного из выявленных PRE/TRE, C-элемента, с целью выяснить, одни и те же суб-элементы важны для функционирования TRE и PRE, или же эти суб-элементы могут быть разделены. Для этого было получено большое число новых трансгенных линий, несущих «малые» конструкции, содержащих регуляторный участок размером в 4 т.п.н., включающий В, С и D элементы, небольшую 800 п.н.- фланкирующую последовательность, репортерный ген mini-white и векторную часть.

Базовая 4 т.н.-конструкция (без делеций, N) была способна генерировать новый участок связывания с TRX в месте встраивания трансгена (рис. 14). На сегодняшний день, это один из самых коротких элементов, обладающих такой способностью.

Рисунок 14. Связывание TRX c 4т.н.трансгеном на политенных хромосомах.

Сверху – локализация N18-трансгена в цитологическом участке 100F хромосомы 3R (зеленый сигнал in situ гибридизации). В середине – область хромосомы дикого типа, содержащая только 2 сигнала связывания TRX (красного цвета); внизу – та же область хромосомы трансгенной линии, где детектируется третий сигнал в месте локализации трансгена (указан стрелкой) на самом конце хромосомы в райне 100F.

В исследуемых конструкциях В-элемент был делетирован, а в С-элементе были сделаны небольшие делеции (рис. 15). В качестве контрольной также были получены трансгенные линии с конструкций, несущей делецию только В-элемента (не показано).

Полученные трансгенные линии тестировали на потерю активностей TRE и/или PRE, визуально анализируя изменения в окраске глаз мух в результате введения мутантного аллеля гена trxG- или PcG-группы путем генетического скрещивания с мухами, несущими мутации или в гене trx (trxB11) или в генах группы PcG (Psc1, Pcl11, ScmD1). Было показано, что делеция С1-фрагмента (но не С2- или С3-фрагментов) нарушает эффект введения в трансгенные линии мутации trxB11 во всех 11 протестированных линиях ВС1. При этом больше половины линий ВС1 продолжали отвечать на введение мутации в гене группы PcG (окраска глаза усиливалась).

Рисунок 15. Схемы «малых» конструкций, используемых для исследования TRE/PRE в составе базовой 4 т.н.–конструкции с репортерным геном mini-white.

Обратная картина наблюдалась в линиях ВС3 (с делецией С3-фрагмента). В этом случае, наоборот, во всех 5 проанализированных линиях терялась чувствительность ко всем трем мутантным аллелям генов группы PcG и при этом почти во всех линиях сохранялась чувствительность к мутации в гене trx (trxB11). Эти результаты указывали на весьма важный вывод о том, что TRE и PRE в С-элементе могут быть разделены. Для того, чтобы подтвердить этот факт, мы получили новые трансгенные линии, несущие нашу базовую конструкцию размером 13 т.н., в которой или С1 TRE-содержащий фрагмент или С3 PREсодержащий фрагмент были делетированы (рис.11, рис. 16).

Рисунок 16. Экспрессия lacZ в трансгенных линиях С1 и С3. В левой колонке – как в исходной линии без делеций (N), так и в линиях с делециями, видно сохранение экспрессии в границах парасегментов (ПС) 6-13 на эмбриональной стадии 10. В правой колонке – экспрессия на эмбриональной стадии 15-16: в С1 сохраняется антериальная граница экспрессии и ослабевает экспрессия по сравнению с N ; в С3- антериальная граница экспрессии сдвинута от ПС 6 (большая стрелка) к ПС 5 (малая стрелка).

Из рис. 16 видно, что в поздних эмбрионах в С1 сохраняется антериальная граница экспрессии и ослабевает постериальная экспрессия (особенно в ПС6) по сравнению с N и С3 ; в С3- антериальная граница экспрессии сдвинута от ПС 6 к ПС 5. Эти данные подтверждают, что первичные активности TRE и PRE внутри С-элемента зависят от разделяемых суб-элементов.

Таким образом, наши исследования in vivo тканеспецифического узнавания продуктами trx- и Pc-групп генов специфического регуляторного элемента из дальней промоторной области гена Ultrabithorax выявили необычно сложную его структуру, состоящую из многих функционально значимых участков, способных взаимодействовать с белками и активационной и репрессионной систем. По-видимому, имеется конкурентное (этих двух альтернативных систем) и кооперативное (внутри каждой системы) взаимодействие регуляторных белков одновременно с различными составными частями таких довольно протяженных элементов.

6. Исследование хромосомного регуляторного элемента (TRE), необходимого для функционирования Триторакс-ассоциированной системы поддержания заданного уровня тканеспецифической транскрипции и локализованного в промоторной области гена fork head (fkh).

Данная работа базировалась на наших более ранних исследованиях, указывающих на существование сильного TRE в протяженной промоторной области гена fkh в D.

melanogaster (см. выше). Мы исходили из нескольких имеющихся принципиальных заделов и особенностей выбранной модели. Во-первых, ген fkh был ранее достаточно детально охарактеризован в отношении локализации цис-регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию в различных тканях (Weigel et al., 1990; Shou et al., 2001), в частности, был выявлен и детально охарактеризован энхансерный элемент, специфичный для клеток слюнных желез (sgE на рис. 17 и 18). Во-вторых, было показано, что содержащий TRE промоторный участок (размером 8700 п.н.) этого гена достаточен для возникновения нового сайта связывания TRX в месте встраивания соответствующего трансгена (Kuzin et al., 1994). Подобный тест на связывание с трансгенной конструкцией на препарате политенных хромосом может быть использован в качестве функцинального теста при уточнении границ TRE. Любопытно, что, если экспрессия fkh сильно подавляется в мухах, имеющих мутации по гену trx (Kuzin et al., 1994), то в случае мутации по гену Pc не обнаруживается заметных изменений в экспрессии этого гена (Jurgens, 1997), что отличает данный элемент от других PRE/TRE и может указывать на возможность существования TRE без выраженного PRE. Наконец, в данной работе мы использовали поликлональные антитела против трех различных доменов белка TRX, полученные нами ранее. Параллельное использование антител к различным доменам одного и того же исследуемого белка представляется принципиальным для повышения достоверности результатов иммунологических иследований, особенно таких, как иммунопреципитация сшитого формальдегидом и дробленого ультразвуком хроматина («X-ChIP» метод), где очень высок неспецифический фон. Мы смогли существенно повысить разрешение данного метода, используя комбинированые подходы на основе параллельного использования нескольких антител. В частности, путем дополнительного перекрестного гибридизационного обогащения библиотек последовательностей, первоначально получаемых с использованием различных антител мы смогли заметно повысить эффективность X-ChIP эксперементов. Было проведено несколько экспериментов, которые давали воспроизводимые результаты (один из типичных результатов представлен на рис.17,В). Из совокупности проведенных экспериментов нам удалось выявить в исследуемом районе два потенциальных TRE (размером около 10п.н.), находящихся на расстоянии примерно 7000 п.н. и 4000 п.н. от начала транскрипции гена fkh (рис. 17,Б). Особое внимание следует обратить наиболее удаленному от промотора из выявленных TRE. Этот элемент, соответствующий основному гибридизующемуся материалу в большинстве наших экспериментов, хотя и не перекрывается, но находится в непосредственной близости от ранее выявленного регуляторного элемента, sgE, определяющего специфическую экспрессию гена fkh именно в клетках слюнных желез. Наряду с вышеизложенным «гибридизационным» подходом мы также ис-пользовали метод прямого включения радиоактивной метки в ходе многочисленных параллельных ПЦР с использованием 18 пар праймеров, подобранных с учетом покрытия всего исследуемого района. При анализе получаемых данных проводилась нормализация относительных интенсивностей сигналов с помощью сравнения интенсивностей детектируемых полос в обогащенном материале и относительной эффективности наработки данного продукта в положительном контроле.

Нормализованные данные отражены на графике рис. 17,А.Выявляемые участки хорошо коррелировали с теми, которые были идентифицированы с использованием гибридизационного метода детекции, и соответствовали продуктам ПЦР, обозначенным на рис.17 номерами 4 (мажорный обогащающийся район), а также 10 и 11. В дополнение к данным о локализации потенциальных TRE были также получены данные о непосредственной близости участков связывания ASH1 и TRX (рис.17,А).

Итоговые обобщенные результаты этого этапа работы представлены на схеме рис.18.

Рис. 17. Анализ связывания TRX с хромосомными участками в предпромоторной области гена fkh с помощью метода иммунопреципитации хроматина (X-ChIP). (А) Прямой ПЦР-анализ получаемых в результате применения X-ChIP-метода проб с включением радиоактивной метки и с использованием 18 различных пар праймеров. Вверху: график показывает обогащение соответствующих фрагментов, обозначенных на оси абсцисс (разными значками и цветом обозначены обогащения, полученные в результате использования разных антител: N1,N6 – различные антитела к белку TRX; ASH1 – антитела к белку ASH1). Внизу: показано привязанное к карте (ниже) положение анализируемых ПЦР-фрагментов в промоторной области гена fkh (обогащаемые фрагменты отмечены знаком «+»). (Б) Представлена карта-схема регуляторной области гена fkh. sgE – энхансер экспрессии гена fkh в клетках слюнных желёз; TRE1, TRE2- два обогащающихся района (гипотетические TRE). Стрелкой вправо показано начало транскрипции гена fkh. (В) Сверху показана схема полученных с помощью ПЦР перекрывающихся фрагментов геномной ДНК, которые разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле (фотография внизу), переносили на мембрану и использовали для анализа методом Саузерн-блот-гибридизации участков обогащения в радиоактивно меченных ДНК-пробах, получаемых в результате иммунопреципитации хроматина (X-ChIP) с помощью различных антител, узнающих TRX.

Представлен один из типичных результатов эксперимента (в середине). Положение обогощаемых фрагментов отмечено знаком «+».

Рисунок 18. Обобщенные результаты иммуноприципитационного картирования потенциальных TRE в промоторной области гена fkh. (А) Ориентация промоторной области гена fkh на данной схеме противоположна той, что использовалась на рис.17 для удобства сопоставления с данными биоинфрматического поиска PRE элементов. В верхней части схемы указаны положения сайтов рестриктаз, положение последовательности малоизученного транскрипта distal fork head (dfk), обозначены определенные ранее энхансерные тканеспецифические элементы (amg – передней части средней кишки, pmg – задней части средней кишки, hg – задней кишки, mt – мальпигиевых сосудов, sgE – слюнных желез). Далее на схеме (сверху вниз) представлены данные гибридизационной детекции TRX-ассоциированных последовательностей, а затем и данные прямого ПЦР-анализа обогащающихся коротких фрагментов ДНК. Количество и размер «+» на схеме соответствует степени обогащения данной последовательности. В нижней части схемы указаны локализации трех выявленных предполагаемых TRE. (Б) – Биоинформатический анализ последовательности регуляторной области гена fkh проведён программой (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/predictor/submission.html), оценивающей вероятность существования PRE в данном месте геномной ДНК, основываясь на локальном неслучайном обогащении сайтами связывания белков PHO, Zeste и GAF (Ringrose et al., 2003). На рисунке отражены локализация этих сайтов связывания (сверху), а также положение гипотетических PRE (пики в нижней части рисунка), пердполагаемых в результате применения программы.

В верхней части схемы обозначены определенные ранее энхансерные тканеспецифические элементы. Мы работали с клетками слюнных желез, и в них наиболее важным регуляторным элементом является sgE. Далее на схеме (сверху вниз) представлены данные гибридизационной детекции TRX-ассоциированных последовательностей, а затем и данные прямого ПЦР-анализа обогащающихся коротких фрагментов ДНК. В нижней части схемы указаны локализации трех выявленных предполагаемых TRE. TRE1 – мажорный из выявленных участков, более слабый элемент – TRE2, а TRE3 – едва детектируем и, возможно, является участком вторичного взаимодействия TRX, ранее связавшегося с основным TRE. Интересный результат был получен при анализе обогащения в исследуемой промоторной области участками связывания белков PHO (“Pleiohomeotic”), Z (“Zeste”) и GAGA-фактора (GAF). Обогащение этими участками, повидимому, является характерной особенностью PRE/TRE, и была разработана программа поиска PRE/TRE, основанная на выявлении районов геномной ДНК, обогащенной участками связывания этих трех белков (Ringrose et al., 2003). На рис.18,Б отражен результат применения этой поисковой программы для исследуемой нами промоторной области гена fkh. Любопытно, что обнаруживается явная корреляция в локализации идентифицированных нами TRX-ассоциированных последовательностей и районов обогащения участками связывания трех упомянутых ДНК-связывающих белков.

Интересно, что для каждого из трех потенциальных PRE/TRE, предсказываемых для исследуемой промоторной области, можно указать идентифицированные ранее тканеспецифические энхансерные элементы (схема на рис.18,А). Можно предположить, что в каждой конкретной ткани, где активен ген fkh, принципиально важны для активности гена энхансеры, специфичные именно для данной ткани, и соответственно принципиально важны расположенные по-соседству с этими энхансерами элементы, поддерживающие их активность (TRE). Соответственно, в тканях, где ген fkh неактивен, рядом с энхансерными элементами, по-видимому, формируются PRE. Ранее было показано, что энхансерный элемент “sgE” является определяющим для специфической экспрессии гена fkh в клетках слюнных желез (Zhou et al., 2001). В используемой для трансформации мух минимальной конструкции авторы помещали только этот элемент непосредственно перед промотором и видели слабую экспрессию репортерного гена именно в клетках слюнных желез. В реальной же ситуации этот энхансерный элемент отстоит от промоторной области на 8 тыс. п.н., да и уровень экспрессии гена существенно выше. Мы предполагаем, что выявляемый нами в непосредственной близости от этого энхансерного элемента TRE1 отвечает за поддержание энхансера в «открытом» активном состоянии и, возможно, за пространственное сближение sgE с промотором.

Полученные результаты в дальнейшем были использованы при создании трансгенных конструкций с целью проверки in vivo функциональной значимости выявленных TRE. Схема «базовой» трансгенной конструкции «мини-fkh» представлена на рис. 19.

Рисунок 19. Схема «базовой» трансгенной конструкции «мини-fkh» для проверки in vivo функциональной значимости гипотетических TRE (TRE1 обозначен как FKH3-4;

TRE2 обозначен как FKH9-11). Вверху показана маштабированная схема исследуемой области. На схеме отмечены регуляторные элементы и выявленные гипотетические TRE (красные полоски с цифрами 1 и 2). Внизу показана схема созданной трансгенной конструкции, с указанием использованных для клонирования последовательностей. sgE – энхансер слюнных желез; FHK17-18 – область промотора; FKH3-4 и FKH9-11 – гипотетические TRE, которые могут быть удалены из конструкции с использованием методов соответственно FRT/FLP- и/или Lox/Cre-зависимых рекомбинаций (указаны соответствующие сайты рекомбинации, фланкирующие проверяемые элементы).

В эту конструкцию мы включили энхансер слюнных желёз - уже изученный ранее элемент, необходимый для тканеспецифичной экспрессии гена fkh (Shou et al., 2001).

Также в неё мы клонировали область промотора (длиной примерно 860 п.н), содержащую точку начала транскрипции гена fkh и 5’-фрагмент первого экзона гена fkh. Включение части экзона позволило нам в последующем оценить влияние элементов конструкции на экспрессию гена-мишени путём измерения уровня транскрипции трансгенной РНК. Также стоит отметить, что мы наблюдали небольшое обогащение этого района в предшествующих X-ChIP экспериментах, поэтому нельзя было исключить, что этот фрагмент важен для функционирования TRE. Помимо указанных элементов, конструкция также содержала проверяемые гипотетические TRE, выявленные нами на первом этапе работы и обозначенные FKH3-4 (TRE1) и FKH10-11 (TRE2). Чтобы иметь возможность более достоверно оценить значимость проверяемых элементов, мы поместили их между сайтами рекомбинации LOX и FRT (рис. 19). Таким образом, при анализе трансгенных мух мы могли вырезать любой из этих элементов соотетствующими рекомбиназами в (CRE и FLP), и получить производную трансгенную линию с конструкцией, находящейся в том же месте в геноме и отличающейся от исходной конструкции лишь отсутствием в ней одного из гипотетических TRE. Сравнение конструкций, находящихся в одном и том же месте генома принципиально в подобном анализе, потому что, как известно, геномное окружение может существенно влиять на характер экспрессии гена. Благодаря такому подходу можно было более надёжно оценить как связывание белка TRX с конструкцией, так и уровень транскрипции трансгена при наличии и отсутствии изучаемых последовательностей в конструкции.

В результате проделанной работы мы получили 8 трансгенных линий мух, местоположение конструкции в которых было определено методом инвертированного ПЦР. Пять из них мы отобрали для дальнейшего анализа (в трёх случаях конструкция находилась слишком близко к центромере, что сильно затрудняло анализ с помощью иммунного окрашивания). При иммуннофлуоресцентном окрашивании мы детектировали появление сильного сигнала связывания TRX на политенных хромосомах в клетках слюнных желёз во всех анализируемых линиях (рис. 20). Положение и интенсивность нового флюоресцентного сигнала в месте встраивания конструкции сопоставляли с известными эндогенными участками связывания TRX. Интересно отметить, что, как правило, новый сигнал окрашивания, как и в случае с эндогенным fkh, был одним из самых заметных. Удаление фрагмента FKH10-11 из конструкции не приводило к какомулибо заметному эффекту, и мы по-прежнему наблюдали наличие нового сайта связывания TRX во многих ядрах различных исследуемых линий трансгенных мух. В то же время удаление из конструкции последовательности, наиболее сильно обогащающейся в иммунопреципитационных экспериментах (FKH3-4), было критичным и приводило к полному исчезновению флюоресцентного сигнала TRX в месте встраивания конструкции для всех анализируемых линий трансформированных мух (рис. 20).

Рисунок 20. Иммунное окрашивание политенных хромосом антителами к TRX.

Показаны результаты окрашивания для одной из линий трансгенных мух с удобным для детекции положением конструкции в районе 100D1 (на краю хромосомы рядом с двумя эндогенными сигналами связывания). В каждой паре фотографий слева - окрашивание по DAPI, справа - детекция TRX. (A) Хромосомы дикого типа. (Б)-(Г) Исходная трансгенная линия 2C и производные от нее линии (в результате рекомбинационного удаления одного из исследуемых элементов). (Б) – Линия с полной «базовой мини-fkh» конструкцией; (В) – линия с конструкцией, в которой был удален фрагмент FKH9-11; (Г) – линия с конструкцией, в которой был удален фрагмент FKH3-4 (TRE). Стрелками указаны эндогенные сигналы связывания TRX в районах 98D1 и 99B1, а также отмечено положение трансгенной конструкции в районе 100D1.

Таким образом, элемент FKH3-4 необходим для связывания TRX с конструкцией.

Помимо подтверждения значимости выявленного элемента для связывания белка TRX мы также проанализировали влияние новых гипотетических TRE на экспрессию генамишени. С этой целью для пяти исходных трансгенных линий и их производных (линии с вырезанными фрагментами FKH3-4 и FKH10-11) методом ПЦР в реальном времени мы проанализировали отношение уровня транскрипции РНК с трансгенного промотора (“мини-fkh”-РНК) к уровню транскрипции мРНК эндогенного гена fkh. Интересно отметить, что уровень транскрипции с трансгенного промотора во всех линиях мух с базовой конструкцией mini-fkh был сопоставим с уровнем транскрипции эндогенного гена fkh: в четырёх случаях из пяти отношение уровней транскрипции составляло 40-80%, а в одном случае (линия 3-red) уровень транскрипции с трансгенного промотора был даже втрое выше (рис. 21). Во всех случаях при вырезании фрагмента FKH3-4 мы детектировали существенное снижение уровня транскрипции в несколько раз по сравнению с базовой трасгенной конструкцией (для различных линий уровень транскрипции снижался от 2 до 10 раз со средним значением примерно в 4 раза) (рис. 21).

Рисунок 21. Анализ уровня транскрипции с «трансгенного» fkh-промотора в полученных первичных и производных трансгенных линиях. Показано отношение уровней транскрипции «трансгенной mini-fkh-РНК» к эндогенномйfkh-РНК для пяти различных линий трансгенных мух и производных от них линий (с удалением указанных проверяемых элементов).

В то же время удаление из конструкции фрагмента FKH10-11 практически не оказывало влияния на уровень транскрипции. В результате описанных экспериментов мы идентифицировали новый TRE, расположенный в 7 т.п.н выше промотора гена fkh и имеющий размер примерно 600 п.н. Было показано, что этот новый элемент важен как для связывания белка TRX, так и для экспрессии гена fkh в секреторных клетках слюнных желез личинки дрозофилы. Этот элемент расположен поблизости от энхансера слюнных желёз, что может быть важным обстоятельством функционирования данного TRE.

Помимо выявления TRE мы также проанализировали распределение модификаций коровых гистонов, характерных для активного гена, в протяжённой промоторной области гена fkh. Определенный тип модификаций гистонов является важным признаком (маркером) транскрипционного статуса хроматина. Так, метилирование лизинов в гистоне H3 по положениям 9 и 27 является маркёром репрессированного состояния хроматина, в то время как ацетилирование H4 и метилирование лизина-4 в H3 ассоциировано с активными районами. Также известно, что некоторые белки группы триторакса (trx-G) обладают гистон-модифицирующими активностями. Например, ASH1 и TRX содержат консервативный домен (SET-домен), способный метилировать определённые остатки лизина в гистонах, в частности, триметилировать лизин-4 в гистоне H3. В связи с этими данными нам показалось интересным проанализировать методом иммунопреципитации хроматина характер обогащения предпромоторной области гена fkh данными модификациями гистонов в случаях активного и репрессированного состояния гена fkh.

Для этого в предварительном опыте методом RT-PCR мы показали отсутствие транскрипции fkh в культуре клеток S2, что позволило нам использовать эти клетки для анализа распределения модифицированных гистонов при неактивном состоянии гена fkh в сравнении с активным состоянием гена fkh в клетках слюнных желёз. Проведённые XChIP-эксперименты показали, что хроматин в протяжённой промоторной области гена fkh действительно обогащен в значительной степени ацетилированными гистонами и триметилированными по 4 остатку лизина гистонами H3 (H3K4me3) в клетках слюнных желез, где ген активен (рис. 22), в отличие от клеток линии S2, в которых ген неактивен, и сколько либо заметного обогащения при X-ChIP не наблюдается. Также мы показали, что обогащение промоторной области носит неравномерный характер, и имеется существенный пик обогащения в районе энхансера слюнных желёз и TRE с последующим затуханием сигнала при удалении от TRE. При этом, в случае анализа модификации H3K4me3 мы наблюдали заметное усиление обогащения в районе начала транскрипции гена fkh, но в случае с антителами к ацитилированным гистонам такого эффекта не было отмечено.

Рисунок 22. Анализ распределения модифицированных гистонов в промоторной области гена fkh.

Показаны результаты опытов по иммунопреципитации хроматина (X-ChIP) с использованием антител к модификации гистона H3K4me3 и к ацетилированным гистонам, сопряженной с ПЦРамплификацией. Для анализа результатов обогащения использовали те же 18 пар праймеров, что и в иммунопреципитационных экспериментах с антителами к TRX. Были использованы дополнительные праймеры к району TRE (фрагменты 4’2, 4R, 4F) для более детального изучения этого участка. График показывает отношение количества ДНК в обогащенных X-ChIP-пробах к ДНК положительного контроля (аликвота хроматина, взятая непосредственно перед иммунопреципитацией) для соответствующих ПЦР фрагментов.

На основе полученных данных можно предположить наличие прямого взаимодействия TRE c областью промотора. Представленные результаты и выводы хорошо согласуются с недавними исследованиями других авторов. Так, например, в лаборатории Паро на примере гена Abd-B было показано, что белок TRX находится как в регуляторных элементах («PRE»), так и в районе промотора гена-мишени в случае активного состояния гена, в то время как в случае репрессированного состояния гена обогащения в районе промотора не наблюдалось (Beisel, 2007). В той же работе было проанализировано распределение ацетилированных гистонов в этих районах, показавшее, на примере генов Abd-B и dfd, что появляющееся обогащение в случае активного состояния генов так же, как и в наших экспериментах, не затрагивает промоторную область.

7. Обнаружение ассоциации продуктов гена trithorax (белков TRX) с компонентами ядерного скелета (матрикса).

С помощью иммуннофлуоресцентного окрашивания и «Вестерн-блот» анализа распределения белка во фракциях экстрагированных ядер впервые было показано, что белок ТRX может быть выявлен в ассоциации с нерастворимыми компонентами экстрагированных ядер, так называемым “ядерным матриксом” (рис. 23,24).

Рисунок 23. Иммунофлуоресцентный анализ TRX в ядрах клеток слюнных желёз, подвергавшихся последовательной экстракции:

(а) после удаления цитоплазмы (слева – окрашивание ДНК, справа – окрашивание TRX) (б) после ДНКазной обработки и экстракции «растворимого» хроматина 0,25М сульфатом аммония (слева – окрашивание ДНК, справа – окрашивание TRX) (в) после доплнительной экстракции в 2М NaCl и обработки РНКазой А (две разных глубины фокуса) (г) TRX в ядрах (две разных глубины фокуса) после обработки ДНКазой и альтернативной экстракции в буфере с низкой йонной силой, содержащим 25 мМ 3,5-дийодосалицилат лития кДа 2 1Рисунок 24. Детекция ТRX в последовательно экстрагируемых ядерных фракциях:

1- «растворимый» хроматин, 2 - экстракция 2M NaCl, 3 - обработка РНКазой А, 4 - «ядерный матрикс», экстракция 8М мочевиной. Детекция ТRX с помощью антител (А) к С-половине белка (антитела N6) и (Б) к N-концу белка (антитела N1). (В) Детекция РНК-полимеразы II.

Нам удалось также показать на двух описанных выше модельных системах (на промоторной области гена fkh в клетках слюнных желез личинки и на районе сильного PRE/TRE гена Ubx в клетках эмбрионов дрозофилы), что два типа регуляторных хромосомных элементов, так называемые скаффолд- / матрикс-ассоциированные ДНКи TRE, колокализуются. Причем, эта колокализация, по-видимому, имеет динамический, тканеспецифический характер и выявляется лишь в том случае, когда ген активен. Так, эта колокализация имеет место в области участка TRE1 в расширенной промоторной области гена fkh в клетках слюнных желез, где этот ген активен, и не выявляется в культуральных клетках S2 дрозофилы, в которых ген fkh неактивен.

Пока трудно интерпретировать функциональную значимость обнаруживаемой ассоциации. C одной стороны, нельзя исключить, что это артефакт используемых процедур экстракции. С другой стороны, существуют многочисленные данные, указывающие на важность ядерного скелета (матрикса, скаффолда) для поддержания специфической структурно-функциональной организации хромосом и правильного протекания разнообразных ядерных процессов, таких как транскрипция, репликация ДНК, процессинг РНК, рекомбинация и конденсация хромосом, для наследуемого поддержания тканеспецифической активности генов. С практической стороны, учет выявленного факта при разработке оптимизированной процедуры экстракции/фракционирования ядерных компонентов может способствовать выделению новых или более полных TRXсодержащих комплексов.

8. Исследование изменений транскрипции различных генов человека в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL(гомолог дрозофилиного TRX).

Ген человека ALL-1 (MLL1, HRX, hTRX), являющийся структурным и функциональным гомологом дрозофилиного trx, прямо вовлечен в 5-10% всех острых лимфобластических лейкемий (ALL) и острых миелоидных лейкемий (AML). Первичным событием, вызывающим трансформацию клеток в этих случаях, является хромосомная транслокация, в результате которой образуется новый гибридный белок, в котором Nконцевой фрагмент МLL присоединён к С-концевому фрагменту одного из многих (порядка 50) известных партнёров. Наиболее частые транслокации - t(4;11) при ALL и t(9;11) при AML - составляют 40 и 27 % случаев, соответственно. МLL-ассоциированные лейкемии типа ALL характеризуются как CD10-, CD19+, имеют фенотип предшественников В-клеток и обычно отличаются повышенной экспрессией миелоидассоциированных маркёров (CD15, CD65). Они часто обозначаются как бифенотипичные или лейкемией смешанного типа (“mixed-lineage leukaemia”, или MLL).

Мы провели крупномасштабное исследование изменений транскрипции многих тысяч генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген MLL1.

Б Рисунок 25. (А) Исследование с помощью ДНК-микроэррейной технологии (Affimetrix) экспрессионных профилей острых лимфобластических лейкемий (ALL) с перестройками MLL-[t(4;11)] от других ALL. (Б) Относительные уовни экспрессии отобранных генов. Экспрессионные уровни выше и ниже 0 обозначены соответственно красным и зеленым цветом.

Было проанализировано более 50 разных образцов РНК. Все МLL1-ассоциированные лейкемии имели экспрессионные профили, отличающие их от других типов ALL и AML.

Мы получили списки дифференциально экспрессирующихся генов, которые могут иметь важное значение как для диагностики, так и для последующего изучения критических метаболитических путей, ведущих к онкогенезу. Особое внимание было уделено, в частности, случаям ALL с t(4;11) (рис. 25). Многие из идентифицированных характеристических для таких трансформированных клеток генов были ранее ассоциированы с раком, апоптозом или контролем роста.

9. Развитие новой эффективной технологии получения и использования однодоменных мини-антител с целью исследования продуктов гена trithorax и других внутриклеточных компонентов (антигенов) in vitro и in vivo.

С целью разработать новые подходы для исследования in vivo функционирования Триторакс-ассоциированной регуляторной системы и других подобных регуляторных белков, а также более эффективно генерировать антитела к изучаемым белкам и структурам, мы решили освоить и развивать далее новую эффективную технологию генерирования «верблюжьих» однодоменных мини-антител (или «наноантител»).

Наноантителами (или «нанотелами») называют однодоменные антиген-узнающие вариабельные фрагменты особых антител, присутствующих (наряду с традиционными антителами) в природе в норме у представителей семейства Верблюдовые (рис. 26, А и Б) и у некоторых видов хрящевых рыб. Наличие эффективной технологии получения (рис.

26, В), а также ряд уникальных особенностей наноантител, выгодно отличающих их от классических антител и их производных (малый размер, способность узнавать спрятанные для обычных антител эпитопы, высокая растворимость, стабильность, экономичность их наработки, простота генно-инженерных модификаций), предполагают большой потенциал использования наноантител в иммунобиотехнологии и медицине.

Мы разработали новый метод идентификации и исследования клеточных компонентов (в том числе и пока неизвестных), ассоциированных с определённым белком на примере получения однодоменных мини-антител (наноантител) к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком TRITHORAX (TRX) в ядрах клеток Drosophila melanogaster (рис. 28).. Предлагаемый подход включает: а) иммунизацию верблюда смесью эндогенных антигенов («хроматином»), б) генерирование библиотеки антигенсвязывающих вариабельных доменов особых одноцепочечных верблюжьих антител и в) использование этой библиотеки для отбора с помощью модифицированного метода VH CHVL CL Fab CH Fc CHscFv Классические Антиген-связывающий антитела фрагмент А (IgG1) VHH VHH Шарнирный участок Рисунок 26. Схематическое Антиген(существенно CHизображение обнаруживаемых у удлинён в связывающий IgG2) домен (12-15 кДа), верблюдовых традиционных Fc «Наноантитело» антител (А) и антител, состоящих CH(Nanobody ®) только из тяжелых цепей (Б).

Показаны также антигенАнтитела HCAb, связывающие фрагменты этих состоящие из димера антител. (В) Схема основных только тяжелой цепи иммуноглобулина этапов процедуры генерирования Б (IgG2, IgG3) «наноантител».

В фагового дисплея, «сэндвич-иммунной селекции»(рис.28), наноантител, узнающих клеточные компоненты, белки и комплексы, ассоциированные с определенным исследуемым белком.

А Б Рисунок 28. (А) Схема метода селекции бактериофагов, содержащих на поверхности наноантитела, специфически связывающихся с компонентами хроматиновых комплексов, ассоциированных с белком TRX. (Б) Схема анализа отобранных наноантител на способность связывать компоненты хроматина, содержащие TRX.

Принципиально новым в разработанном подходе является использование при селекции фаговых частиц метода, названного нами «сэндвич-иммунной селекцией». При этом подходе вначале на иммобилизованные специфические антитела к известному изучаемому белку (в данном случае аффинно-очищенные анти-TRX кроличьи антитела N1 и N6, полученные нами ранее) из материала хроматина вылавливаются (за счет связывания с TRX) специфические комплексы (TRX-содержащие), а затем отбираются фаговые частицы, содержащие экспрессированные на поверхности наноантитела (а также, внутри частицы, кодирующие их плазмидные клоны ДНК), которые связываются с другими (TRX-ассоциированными) компонентами этих комплексов. Нам удалось отобрать несколько различных наноантител, которые узнают ядерные компоненты, по-видимому, способные к ассоциации с белком TRX. Мы надеемся, что разработанный подход позволит нам определить с помощью полученных наноантител компоненты хроматина или ядерного скелета, с которыми TRX взаимодействует in vivo.

Мы предложили ряд модификаций процедуры фагового дисплея для повышения эффективности селекции наноантител. В частности, мы впервые экспериментально продемонстрировали повышение эффективности процедуры селекции наноантител методом фагового дисплея путем дополнительного параллельного использования наряду с традиционным фагом-помощником также и модифицированного фага-помощника c Nконцевой делецией в поверхностном белке pIII. Было показано (путем проведения нескольких независимых полномасштабных селекций против 2 различных антигенов), что данные методы являются взаимодополняющими, в совокупности позволяющими отбирать большее разнообразие наноантител к данному антигену.

В результате совместной работы с зарубежнами коллегами был разработан и продемонстрирован новый метод наблюдения за антигеном в живых клетках с помощью специально генерированных флуоресцирующих мини-антител. Генерированные нами наноантитела (анти-ламин, анти-цитокератин-8) были соединены с красным флуоресцентным белком, RFP ( путем клонирования их нуклеотидных последовательностей в одной общей рамке считывания), чтобы получить флуоресцирующие антиген-связывающие белки. Было показано, что такие флуоресцирующие мини-антитела могут быть экспрессированы в клетках (насекомых или млекопитающих) и могут связывать эпитопы в соответственно различных клеточных компартментах (рис. 29). Используя микроскопию живой клетки, оказалось возможным прослеживать динамические изменения антигенов сквозь весь клеточный цикл. Мы надеемся в скором будущем использовать этот новый метод наблюдения за антигеном в живых клетках для дальнейшего исследования TRX и функционально связанных с ним белков in vivo.

Рисунок 29. Использование полученных однодоменных мини-антител (наноантител) для детекции антигенов в фиксированных клетках. (А) Окрашивание ядер слюнных желез D.

melanogaster антителами к ламину. Окрашивание ламина (на периферии ядра) провдилось для сравнения как коммерчески-доступными моноклональными антителами (верхний ряд), так и полученными нами наноантителами (нижняя часть). (Б) Двойное окрашивание ядер клеток слюнных желез антителами к тритораксу совместно с наноантителами к ламину (эти окрашивания не перекрываются). (В) Окрашивание фиксированных клеток (сверху вниз: мышиные миобласты С2С12, дрозофилиные S2 клетки, HeLa клетки человека, внизу – снова S2 клетки) через 24-48 часов после трансфекции плазмидными ДНК, экспрессирующими соответственно анти-цитокератин-RFP (верхний ряд) или антиламин- RFP мини-антитела.

ВЫВОДЫ 1. Определена структура и локализация в эмбрионах на разных стадиях развития альтернативно сплайсируемых транскриптов (длиной от 11 до 14,5 тысяч нуклеотидов) гена trithorax (trx) Drosophila melanogaster.

2. Проведены определение и сравнительный анализ первичной структуры гена trx у Drosophila virilis и у Drosophila melanogaster. Выявлена высокая консервативность как структуры этого гена, так и распределения его транскриптов в эибриогенезе.

3. Детектированы соответствующие альтернативным транскриптам две основные белковые изоформы триторакса (TRX I и TRXII, белки размером более 400 КДа).

Установлено, что TRX является ядерным белком и способен связываться с определенными участками политенных хромосом слюнных желёз, по-видимому, соответствующими его генам-мишеням, активно транскрибируемым в данном типе клеток.

4. Показано, что TRX и ASH1, продукт другого гена группы Триторакса, непосредственно взаимодействуют, и их участки связывания с политенными хромосомами совпадают или находятся в непосредственной близости друг от друга.

5. Проведено исследование in vivo регуляторного элемента PRE/TRE из дальней промоторной области гена Ultrabithorax с помощью специальных трансгенных конструкций. Выявлена необычно сложная его структура, состоящая из многих функционально значимых участков, способных взаимодействовать с белками как группы Триторакса, так и группы Поликомба.

6. Определена локализация и продемонстрирована функциональная значимость in vivo нового регуляторного элемента (TRE), необходимого для TRX-зависимого поддержания экспрессии гена fork head в клетках слюнных желёз личинки дрозофилы.

7. Проведено крупномасштабное исследование изменений транскрипции многих тысяч генов человека (на микрочипах фирмы Аффиметрикс) в случае лейкемий с хромосомными нарушениями, затрагивающими ген ALL1/MLL1 (гомолог дрозофилиного TRX). Выявлены гены, которые могут быть непосредственно вовлечены в онкогенез. Полученные результаты помимо общей схожести изменений экспрессии генов с другими случаями раковой трансформации клеток демонстрируют также и наличие характерного рисунка транскрипционной активности генов в ALL1/MLL1-ассоциированных опухолях.

8. Показано, что белок Триторакс (TRX) может быть выявлен в ассоциации с не хромосомными элементами ядерного скелета. Получены данные о колокализации TRE со скаффолд/матрикс-ассоциированными участками хромосом.

9. Разработан и продемонстрирован принципиально новый метод исследования клеточных компонентов, ассоциированных с заданным белком, на примере получения однодоменных мини-антител к компонентам хроматина, ассоциированным с регуляторным белком Триторакс (TRX). Продемонстрировано, что параллельное использование наряду с традиционным фагом-помощником предложенного модифицированного фага-помощника c N-концевой делецией в поверхностном белке pIII ведет к повышению эффективности селекции мини-антител методом фагового дисплея.

10. Разработан и продемонстрирован принципиально новый метод наблюдения за антигеном в живых клетках с помощью специально генерируемых флуоресцирующих мини-антител.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Sedkov I.*, Tillib S.*, Mizrokhi L. and Mazo A. (1994) The bithorax complex is regulated by trithorax earlier during Drosophila embryogenesis than is the Antennapedia complex, correlating with a bithorax-like expression pattern of distinict early trithorax transcripts. Development 120,1907-1917.

2. Kuzin B.*, Tillib S.*, Sedkov I., Mizrokhi L. and Mazo A. (1994) The Drosophila trithorax gene encodes a chromosomal protein and directly regulates the region-specific homeotic gene fork head. Genes & Dev. 8,2478-2490.

3. Tillib S., Sedkov Y., Mizrokhi. L., Mazo A. (1995) Conservation of structure and expression of the trithorax gene between Drosophila virilis and Drosophila melanogaster.

Mechanisms of Development 53, 113-122.

4. Rozenblatt-Rosen O.*, Rosovskaya T.*, Burakov D.*, Tillib S*., Sedkov Yu.*, Blechman J., Nakamura T.,Croce C., Mazo A. and Canaani E.(l998) The C-terminal SET domains of ALL-I and TRITHORAX interact with the INII and SNRI proteins, components of the SWI/SNF complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4152-4157.

5. Sedkov Y., Benes J., Berger J., Riker K., Tillib S., Jones R. and Mazo A. (1999) Molecular genetic analysis of Drosophila trithorax-related gene that encodes a novel SET domain protein. Mechanisms of Development 82, 171-179.

6. Tillib S., Petruk S., Sedkov Y., Kuzin A., Fujioka M., Goto T. and Mazo A. (1999) Trithorax and Polycomb group response elements within a Ultrabithorax transcription maintenance unit consist of closely situated but separable sequences. Mol. Cell. Biol. 19, 5289-5202.

7. Rosovskaya T., Tillib S., Smith S., Sedkov Y., Rozenblatt-Rosen O., Petruk S., Yano T., Nakamura T., Ben-Simchon L., Gildea J., Croce C., Shearn A., Canaani E and Mazo A.

(1999) Trithorax and ASH1 interact directly and associate with the Trithorax-Group responsive bxd region of the Ultrabithorax promoter. Mol. Cell. Biol. 19, 6441-6447.

8. Petruk S., Sedkov Y., Smith S., Tillib S., Kraevsky V., Nakamura T., Canaani E., Croce C.M., Mazo A. Epigenetic regulator trithorax and acetyltransferase dCBP act in a protein complex to maintain expression of a homeotic gene. Science, 2001, 294: 1331-1334.

9. Tillib S.V., Mirzabekov A.D. (2001) Advances in the analysis of DNA sequence variations using oligonucleotide microchip technology. Curr Opin Biotechnol. 12, 53-58.

10. Rozovskaia T., Ravid-Amir O., Tillib S., Getz G., Feinstein E., Agrawal H., Nagler A., Rappaport E.F., Issaeva I., Matsuo Y., Kees U.R., Lapidot T., Lo Coco F., Foa R., Mazo A., Nakamura T., Croce C.M., Cimino G., Domany E., Canaani E. Expression profiles of acute lymphoblastic and myeloblastic leukemias with ALL-1 rearrangements. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003, 100(13):7853-7858.

11. Л.А.Лебедева, С.В.Тиллиб. Глобальный фактор поддержания тканеспецифического активного состояния генов Diosophila melanogaster белок TRITHORAX, ассоциирован с ядерным матриксом. Генетика 2003, 39(2):250-258.

12. Smith S.T., Petruk S., Sedkov Y., Cho E., Tillib S., Canaani E., Mazo A.

Modulation of heat shock gene expression by the TAC1 chromatin-modifying complex.

Nature Cell Biol. 2004; 6(2):162-7.

13. Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., Nowak D., Schermelleh L., Gahl A., Backmann N., Conrath K., Muyldermans S., Cardoso M.C., Leonhardt H. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods 2006, 3, 887-889.

14. Ряховский А.А., Тиллиб С.В. Иммунопреципитационное картирование TRXассоциированных участков хромосом в промоторе гена fkh в клетках слюнных желез Drosophila melanogaster. Генетика 2007, Т. 43, №9, С. 1181-1189.

15. Ряховский А.А., Тиллиб С.В. Колокализация S/MAR и TRE в регуляторных участках хромосом тканеспецифически экспрессирующихся генов Drosophila melanogaster. Доклады Академии Наук 2007, Т. 416, №3, С. 416-419.

16. Вятчанин А.С., Тиллиб С.В. Новый подход к исследованию клеточных компонентов, ассоциированных с определённым белком. Доклады Академии Наук.

2008. Т.421. №6. С. 826-829.

17. Вятчанин А.С., Тиллиб С.В. Модификации процедуры фагового дисплея для повышения эффективности селекции антиген-связывающих доменов особых одноцепочечных верблюжьих антител. Биотехнология. 2008. №4. С. 32-34.

18. S. Muyldermans, T.N. Baral, V. Cortez Retamozzo, P. De Baetselier, E. De Genst, J.

Kinne, H. Leonhardt, S. Magez, V.K. Nguyen, H. Revets, U. Rothbauer, B. Stijlemans, S.

Tillib, U. Wernery, L. Wyns, Gh. Hassanzadeh-Ghassabeh and D. Saerens. Camelid immunoglobulins, nanobody technology. Veterinary Immunology and Immunopathology.

2009, 128(1-3):178-83.

19. Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фаговпомощников. 2010. Acta Naturae 2, №3 (6), 100-108.

20. Тиллиб С. В. «Верблюжьи антитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. 2011. Молекулярная биология 45, №1, 77-85.

__________________ *Равное участие в работе на правах первого автора






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.