WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

Даниленко Константин Васильевич

РОЛЬ СВЕТОВЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ В РЕГУЛЯЦИИ СУТОЧНОЙ, МЕСЯЧНОЙ И ГОДОВОЙ ЦИКЛИЧНОСТИ У ЧЕЛОВЕКА

03.00.13 – физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск 2009

Работа выполнена в НИИ терапии и НИИ физиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Новосибирск)

Официальные оппоненты:

д.м.н., профессор Шурлыгина Анна Вениаминовна д.б.н., профессор, засл. деятель науки РФ Айзман Роман Иделевич д.м.н., профессор, засл. деятель науки РФ Куликов Вячеслав Юрьевич

Ведущая организация:

Сибирский государственный медицинский университет (г.Томск)

Защита диссертации состоится "_____" ____________ 2009 года в ______ часов на заседании диссертационного совета Д.001.014.01 при НИИ физиологии СО РАМН, ул. Академика Тимакова, 4, Новосибирск, 630117.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физиологии СО РАМН.

Автореферат разослан "_____" _______________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Бузуева Ирина Ивановна ВВЕДЕНИЕ



Актуальность проблемы. Развитие общества привело к тому, что с появлением электричества человек стал проводить больше времени при искусственном освещении, в то время как экспозиция естественным светом уменьшилась, в частности, из-за повышения задымленности атмосферы на ~10% за предыдущие 40 лет [Stanhill, Cohen, 2001]. Это придает особую важность вопросам влияния освещенности на организм и определения характеристик света, способствующих сохранению и поддержанию здоровья.

Для живого организма свет не только обеспечивает восприятие зрительной информации, но и вызывает широкий спектр физиологических реакций. При этом различают реакции, связанные с влиянием света на ритмические процессы (сдвиг фазы суточных ритмов, фотопериодизм и др.), и немедленное угнетающее или стимулирующее воздействие на ряд физиологических функций (подавление синтеза мелатонина, увеличение частоты сердечных сокращений, повышение уровня бодрствования и др.) (обзор в [Cajochen, 2007]. Роль света как регулятора ритмических процессов в организме показана при трансмеридианных перелетах, ночной работе, длительно пониженном освещении, полной слепоте (обзор в [Skene, Arendt, 2006]). На стимулирующих свойствах света основано его использование при лечении зимней и несезонных депрессий, нервной булимии, предменструального синдрома (обзор в [Terman, Terman, 2005]).

Анатомические образования, опосредующие физиологическое действие света на организм, включают сетчатку глаза и ретиногипоталамический тракт [Hendrikson et al., 1972; Moore, Lenn, 1972]. Недавно выяснено, что импульсацию по ретиногипоталамическому тракту передают не палочковые или колбочковые фоторецепторы, участвующие в обеспечении зрительной функции, а ганглиозные клетки сетчатки, содержащие фотопигмент меланопсин [Provencio et al, 2000; Berson et al., 2002], с пиком чувствительности на длине волны ~4нм (сине-зеленый цвет) (обзор в [Brainard, Hanifin, 2005]). Тем самым выделена новая сенсорная система мозга [Foster, Hankins, 2002; Fu et al., 2005; Hannibal, 2006]. Показано, что у единичного числа полностью слепых людей благодаря интактной меланопсиновой фоторецепции сохранены физиологические реакции на свет [Czeisler et al., 1995; Zaidi et al., 2007]. Функцию меланопсиновых фоторецепторов не удается охарактеризовать напрямую известными офтальмологическими методами [Barnard et al., 2004; Zaidi et al., 2007], но можно опосредованно, путем колбочковой электроретинографии, регистрируемой в разное время суток и при различных режимах освещения [Hankins, Lucas, 2002; Barnard et al., 2006], поскольку меланопсиновые и колбочковые фоторецепторы модулируют функцию друг друга [Drouer et al., 2007; Dkhissi-Benyahya et al., 2008]. Од - 3 - нако, базовые представления о том, как меняется светочувствительность собственно колбочковой и палочковой системы на протяжении суток, отсутствуют.

Основной (но не единственной [Saper et al., 2005; Lockley, Gooley, 2006;

Kalsbeek et al., 2007]) проекцией ретиногипоталамического тракта являются парные супрахиазматические ядра гипоталамуса, содержащие центральные "биологические часы" – группу нейронов, которые при их изоляции in vitro сохраняют свою электрическую активность с генетически закрепленным индивидуальным периодом, близким к 24 часам ("циркадианным") (обзор в [Деряпа и др., 1985; Weaver, 1998]). Супрахиазматические ядра связаны полисинаптическим путем с шишковидным телом мозга (эпифизом), которое секретирует гормон мелатонин в темное время суток – и у дневных, и у ночных животных (обзор в [Klein, 1993]). Мелатонин координирует работу всего организма благодаря его влиянию на экспрессию генов биологических часов в клетках. Секреция мелатонина находится под двойным контролем – со стороны центральных биологических часов (при постоянном невысоком освещении суточный ритм выработки мелатонина сохраняется), и со стороны освещенности (немедленное подавление секреции светом), и мало зависит от иных, несветовых факторов (обзор в [Arendt, 2006]).

Хорошо изученным является действие света на суточную ритмичность у человека. Цикл освещенности (свет-темнота) является важнейшим среди "времязадателей", подстраивая ход биологических часов под астрономические сутки.

Относительную силу (иерархию) других факторов для человека – состояние сна-бодрствования, интенсивная физическая нагрузка, прием пищи, звуковые сигналы, температурные условия, знание времени суток, социальные стимулы – требуется еще установить [Klerman, 2001; Mistlberger, Skene, 2005]. Мелатонин можно рассматривать как антагонист действию света. Так, утренний прием мелатонина сдвигает фазы суточных ритмов на более позднее время, а утреннее воздействие светом – на более раннее время [Lewy et al., 1998].

Кроме регуляции суточной ритмичности, свет влияет на годовые и месячные циклические процессы в организме человека. Наиболее ярким проявлением годовой ритмичности на средних и крайних широтах проживания является возвратная зимняя депрессия – сезонное аффективное расстройство [Rosenthal et al., 1984], отмеченное примерно у 2% населения [Danilenko, Putilov, 1996; Levitt et al., 2000; Michalak et al., 2001]. Воздействие ярким светом признано методом выбора в терапии зимней депрессии [Lam, Levitt, 1999], приводя к значительному улучшению состояния быстро, всего за неделю, с минимумом оказываемых побочных эффектов (обзор в [Симуткин, 2007]). При этом терапевтический эффект связывают не столько с нормализацией суточной ритмичности [Lewy et al., - 4 - 2006], сколько с активационным действием света [Kasper et al., 1988], механизм которого по-прежнему не ясен.

Наиболее явным проявлением месячной ритмичности у человека является менструальный цикл у женщин. В единичных исследованиях, посвященных изучению действия света на репродуктивную функцию у человека, было показано, что ночной свет (имитирующий лунный) способствует нормализации менструального цикла у женщин с удлиненным, нерегулярным циклом (обзор в [Kripke, 1993]).

В регистрируемых эффектах света функциональное значение имеют время суток, в которое происходит световоздействие, интенсивность, продолжительность, спектр светового сигнала, что отражено в результатах многочисленных исследований. Менее изучены в этом отношении интермиттирующий свет [Rimmer et al., 2000; Gronfier et al., 2004], постепенное изменение интенсивности светового сигнала ("искусственный рассвет" и "искусственный закат") [Terman et al., 1989], поляризация света [Brainard et al., 2000], угол падения светового потока [Visser et al., 1999; Glickman et al., 2003].

Данная работа направлена на выявление параметров световых воздействий, имеющих физиологическое и терапевтическое значение для человека, и новых реакций организма на свет.

Цель исследования – определить функциональную роль световых воздействий в регуляции циклических процессов у человека: циркадианных ритмов, зимней депрессии, менструальной (дис)функции.

Задачи:

1. Выяснить наличие циркадианного ритма колбочковой и палочковой зрительной светочувствительности и роль мелатонина в ее регуляции у человека.

2. Установить степень влияния искусственного рассвета и времени сна на циркадианные ритмы секреции мелатонина и температуры тела.

3. Выяснить степень клинической эффективности поляризованного света и искусственного рассвета в коррекции зимней депрессии.

4. Определить действие искусственного света на уровень репродуктивных гормонов, овуляцию и менструальный цикл.

Научная новизна. Впервые показано, что, по данным электроретинографии, у колбочковой (световой) светочувствительности человека имеется отчетливый эндогенный циркадианный ритм, а у палочковой (темновой) светочувствительности он слабо выраженный. В условиях режима постоянного освещения (~лк для колбочек, темнота – для палочек) светочувствительность фоторецепторов постепенно снижается.

- 5 - Впервые доказано, что искусственный рассвет сдвигает фазы суточных ритмов человека, в то время как собственно сон оказывает лишь слабое влияние на них. В условиях световой депривации в течение нескольких дней уровень секреции мелатонина снижается.

Впервые показано, что поляризация света не имеет значения для достижения клинического эффекта светолечения зимней депрессии. Использование искусственного рассвета приближается по эффективности к яркому свету за счет большего предпочтения его пациентами.

Впервые показано совокупное стимулирующее действие яркого искусственного света на секрецию половых гормонов (лютеинизирующего гормона, фолликулостимулирующего гормона, пролактина), рост яичникового фолликула и наступление овуляции у женщин.

Научно-практическая значимость. Работа имеет значение для развития перспективного научного направления по изучению физиологических механизмов действия света на организм человека. Показано, что использование искусственного рассвета является эффективным для коррекции различных циклических процессов: циркадианных ритмов, менструального цикла, зимней депрессии. Одним из побочных эффектов светолечения зимней депрессии является укорочение менструального цикла. Утреннее воздействие ярким светом показано в качестве дополнительного метода лечения бесплодия ановуляторного генеза у женщин. Для поддержания нормальной светочувствительности зрительных фоторецепторов необходимо изменяющееся в течение дня освещение. После приема мелатонина следует учитывать его ослабляющее влияние на световое зрение (при сохранении бодрствования).

Положения, выносимые на защиту:

1. Колбочкам и палочкам сетчатки в разной степени присущ циркадианный ритм светочувствительности. При постоянном освещении светочувствительность фоторецепторов снижается. На колбочковую функцию влияет мелатонин.

2. При пониженной освещенности циркадианные ритмы секреции мелатонина и температуры тела не синхронизированы с 24-часовыми сутками, и сдвиг их фаз отражает индивидуальный ход центральных биологических часов. Искусственный рассвет является значимым хронофизиологическим сигналом для человека, а собственно сон – нет.

3. Искусственный рассвет является значимой альтернативой стандартному стимулу яркого света при лечении зимней депрессии. Поляризация света не имеет значения для достижения клинического улучшения.

4. Воздействие искусственным светом стимулирует овариально-менструальную функцию у женщин.

- 6 - Внедрение результатов работы. Метод светолечения зимней депрессии, начатый применяться нами впервые в стране с 1988 года, получил распространение в учреждениях СО РАМН г. Новосибирска. С 1999 года в поликлинике НИИ терапии СО РАМН функционирует кабинет светолечения зимней депрессии [www.iimed.ru]. При поддержке автора светолечение ярким светом внедрено в практику в профилактории Отдела образования при Городском центре образования и здоровья "Магистр" и в Городской клинической психиатрической больнице №3 (Договоры о сотрудничестве от 19.01.2007 и 17.04.2008). В соавторстве с коллегами написана и издана брошюра "Светолечение зимней депрессии" [1]. Сведения о методе включены в программу преподавания в Новосибирском государственном медицинском университете.

Основные результаты доложены автором лично в виде устного или стендового докладов на следующих научных конференциях: 3-ей Швейцарской постерной конференции по фундаментальным и клиническим нейронаукам (Берн, 1996), международном симпозиуме "Биологические эффекты света" (Базель, 1998), Гордоновской конференции по хронобиологии (Италия, 1999), встречах Общества светолечения и биоритмов (Стокгольм, 2001, Эйндховен, 2005, Квебек, 2006), международного Общества исследований биологических ритмов (Флорида, 2002), 1-й Всероссийской конференции "Депрессивные расстройства" (Томск, 2003), 13-м Международном конгрессе по Приполярной медицине (Новосибирск, 2006). Диссертационная работа обсуждена на расширенном заседании сотрудников НИИ терапии СО РАМН 25.11.2008.

Личный вклад автора. В диссертационную работу вошли исследования (табл. 1), в которых исполнительский вклад диссертанта был преобладающим (исследования 1-9) или равен вкладу других исполнителей (исследования 1012). Автор лично отбирал и наблюдал практически всех исследуемых, проводил все методики (кроме ультразвукового исследования и определения гормонов [не мелатонина]; табл. 2) и обрабатывал полученные данные.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы статей в рецензируемых журналах (из них 10 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для докторских диссертаций по медицине), 1 глава в зарубежной книге, 1 научно-популярная брошюра, 26 статей в сборниках и тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 191 странице, содержит 24 таблицы и 40 рисунков, включает главы Введение, Обзор литературы, Объекты и методы исследования, Результаты, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Список литературы состоит из 43 отечественных и 285 зарубежных источников.

- 7 - ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работу включены 12 исследований, выполненных автором с 1987 по 20год, и относящихся к теме диссертации (табл. 1). Из этих исследований 11 являются экспериментальными, а одно – описательным (исследование 6).

Таблица Характеристика исследований (сводные данные) Вид воздействия / объект воздейст- Годы вы- Ди- Усло- Коли- Публикавия полнения зайн а вия чес-тво б ция зрительная светочувствительность 1. Суточный ритм палочковой свето- 2004-2005 лабор. 8 (7) [16] чувствительности в темноте 2. Суточный ритм колбочковой све- 2008 лабор. 9 (9) точувствительности на свету 3. Влияние мелатонина на колбочко- 2004 лабор. 12 (12) [12] вую светочувствительность суточные ритмы: центральные биологические часы 4. Влияние искусственного рассвета 1995 лабор. 8 (8) 1995 9 (8) [4] 1997-1998 10 (9) [5] 5. Влияние времени сна 2001 лабор. 12 (10) [7] Влияние темноты - см. №годовой ритм: зимняя депрессия 6. Характеристики зимней депрессии 1987-2006 206 [1-3, 10] 7. Влияние поляризованного света 2001-2003 домаш. 32 (15) [8, 9] 8. Влияние искусственного рассвета 1998-2005 домаш. 18 (11) [11] месячный ритм: менструальный цикл 9. при светолечении зимней депрессии 1998-2004 домаш. 38 (38) [15] 10. Влияние ночного света на дли- 1993-1996 домаш. 29 (16) [6] тельность менструального цикла 11. Влияние ночного света на овуля- 1997-1998 домаш. 24 (13) цию (по тесту OvuQuick) 12. Влияние яркого света на гормоны, 2003-2006 домаш. 27 (22) [13, 14] овуляцию и менструальный цикл Итого 1987-2008 442 (194) а Дизайн исследования: "" – простой, "" – перекрестный.

б Количество человек, включенных в исследование (в скобках – завершивших экспериментальное исследование, и чьи данные включены в основной анализ).

Критерии включения в исследование и исключения. Исследуемые отбирались через объявления, врачебную базу пациентов и путем скрининг-опроса;

всего отобрано 442 человека. Для участвовавших в экспериментальных исследованиях (236 человек) использовались следующие критерии:

- 8 - (1) Для здоровых лиц: возраст 18-50 лет; некурящие; отсутствие приема медикаментозных средств.

(2) Для лиц с зимней депрессией: диагноз сезонного аффективного расстройства (САР) зимнего типа, согласно классификации DSM-IV; текущий депрессивный эпизод (по DSM-IV); отсутствие антидепрессивного лечения в течение не менее 2 недель.

(3) Для участвовавших в исследованиях 10-12: женщины в возрасте 18-40 лет;

наличие менструальной цикличности; наличие "месячных календариков", по которым циклы в большинстве своем несколько удлиненные, не короче дней; отсутствие приема контрацептивных и других гормональных препаратов в течение 1-2 последних менструальных циклов; отсутствие клинических проявлений эндокринных расстройств.

Общими критериями включения для трех групп были удовлетворительное и стабильное состояние здоровья, нормальный режим сна-бодрствования.

Выполнение исследований, начатых после 2000 года, было одобрено локальным Этическим комитетом НИИ терапии или НИИ физиологии СО РАМН, г.

Новосибирск. Все исследуемые, участвовавшие в экспериментальных исследованиях, подписывали информированное согласие.

Методы воздействия. В работе применялись различные световые стимулы и условия, а также мелатонин и сон в определенное время суток (табл. 2).

Таблица Использованные методы воздействия и учитываемые показатели Исследование, № Светочувст- Центр. био- Зимняя Менструвительность логич. часы депрессия альный цикл Воздействие (Полу)темнота (0-0.2 люкса) 1 Неяркий свет (57 лк) Ночной свет (240 лк) 10, Иск. рассвет ( 1000 лк) 4 8 Яркий свет (4300 лк) 7 9, Мелатонин (15 мг) Сон Учитываемые показатели Светочувствительность (ЭРГ) 1-Мелатонин (уровень секреции) 1, 4, Ректальная температура 4, 5 Актиметрия 1 4, Депрессия (уровень) 7, Менструальный цикл (длительность) 9-Гормоны (половые и тиреотропин) 11, Ультразвуковое исследование (УЗИ) Количество часов солнечного сияния 7, 8 Время сна (дневник) 1, 2 4, 5 7, 8 9- - 9 - Представление о силе использованных световых воздействий дает Рисунок 1.





Интенсивность света, люксы:

темнота полутемнота звездное небо 0.00полнолуние 0.тусклый свет свеча можно читать неяркий свет комнатное освещение 1рассвет 7очень пасмурный день 15яркий свет безоблачный день 10 0в направлении солнца 104 0Рис. 1. Интенсивность света в различных условиях.

Очень низкое освещение (полутемнота) создавалось при помощи лампочек, распределенных по периметру потолка (по типу гирлянды). В исследовании это был желтовато-белый свет <0.2 лк от лампочек накаливания, в исследовании 1 – красный свет <0.1 лк от светодиодов. Такая интенсивность едва достаточна для того, чтобы разобрать, закрыты глаза исследуемого или нет.

Стимул ночного света создавался от 100-ваттной матовой лампы накаливания, располагающейся на расстоянии метра от изголовья (240 лк) и включаемой за 5-30 минут до сна. Исследуемые могли закрываться одеялом, отворачиваться от светильника, выключить лампу под утро (когда светает), если свет слишком мешал спать. Курс воздействия составлял 5 ночей подряд.

Искусственный рассвет создавался при помощи двух разных устройств. В исследовании 4 это была конструкция, крепящаяся над головным концом кровати (рис. 2А); в систему также входили электронный контроллер и компьютер с заложенным алгоритмом имитации рассвета (США). Выбранный профиль рассвета соответствовал рассвету на 50 сев. широты 21 июня. Исследуемого будили в 6:00 "наблюдать" рассвет. Для этого он лежал лицом вверх, с открытыми глазами. Интенсивность света нарастала с 0.1 до 1000 люксов за полтора часа (155 лк в среднем).

В исследованиях 8 и 9 для имитации искусственного рассвета использовалось портативное рассветное устройство фирмы Outside In (Англия), сочетающее в себе светильник с лампой накаливания 60 Вт и механические часы-будильник (рис. 2Б). Перед сном устройство программировалось на закат и рассвет, располагалось у изголовья, в полуметре от подушки, и включалось на полную яркость - 10 - (100 лк на расстоянии 50 см). В течение 30 минут светильник автоматически уменьшал яркость до нуля (в первые 15 минут можно было читать, смотреть телевизор), а утром, за полчаса до звонка, вновь набирал яркость. После пробуждения с будильником, светильник располагался ближе, в 30 см от глаз (250 лк) для дополнительной экспозиции в течение 15 минут.

(Б) (В) (А) Рис. 2. Внешний вид стационарного рассветного устройства (А), портативного рассветного устройства (Б), светильника яркого света (В).

В качестве источника яркого света использовался светильник фирмы Outside In (рис. 2С), состоящий из трех U-образных люминесцентных ламп мощностью 36 Вт каждая, с зеркальным вогнутым отражателем позади них и рассеивающим экраном спереди. В исследовании 7, для достижения поляризации света обычный рассеивающий экран менялся на экран, поляризующий свет (круговая поляризация), внешне мало отличающийся от обычного экрана. Светильник располагался на расстоянии 41 см от экрана до глаз (с поляризующим экраном - см). На указанном расстоянии интенсивность света составляла 4300 лк. Сеансы начинались вскоре после утреннего пробуждения и длились 45 минут. Во время сеанса можно было читать, завтракать и т.д., но при этом оба глаза должны были быть доступны свету. Курс световоздействия всегда составлял неделю. В качестве источника неяркого света ("контрольный" стимул в исследовании 12) использовался отечественный бытовой светильник с одной люминесцентной лампой 36 Вт, с добавлением двух слоев белой бумаги перед рассеивающим экраном (100 лк на расстоянии 41 см).

Мелатонин принимался исследуемыми однократно в суммарной дозе 15 мг (таблеток по 3 мг; Юнифарм, США); в качестве плацебо были использованы таблеток по 0.5 мг кальция глюконата. Известно, что доза, создающая физиологическую концентрацию мелатонина в кровотоке – 0.3 мг, максимально используемая в исследованиях на человеке – 250 мг и более [Zhdanova et al., 1997].

- 11 - Учитываемые показатели. Содержание мелатонина определяли в слюне, собранной на протяжении суток по ~2 мл с минимальным интервалом в полчаса, радиоиммунным методом с использованием биохимических наборов Bhlmann лаборатории (Швейцария) [Weber et al., 1997]. Вариабельность внутри анализа - 2-5 % (для диапазона значений 1-30 пг/мл). Время вечернего подъема секреции мелатонина или время ее утреннего снижения служило маркером фазы мелатонинового ритма. Оно определялось либо как момент достижения пороговой концентрации 3 пг/мл (исследования 4 и 5), либо как момент достижения подъема от минимума к максимуму на аппроксимированной кривой [Van Someren, Nagtegaal, 2007] (исследование 1).

Ректальную температуру измеряли в условиях протокола постоянного режима [Czeisler et al., 1985; Kruchi et al., 1997], длящегося от 16 до 42.5 часов.

Исследуемый находился в положении (полу)лежа, при постоянном пониженном освещении 8 лк, комфортной температуре, контролируемом бодрствовании, с ежечасным приемом изокалорийной пищи, а для опорожнения мочевого пузыря пользовался мочеприемником. Сон был в запланированное время, либо не разрешен вовсе. Протокол нацелен на то, чтобы минимизировать или распределить равномерно действие внешних времязадателей; полученные в таких условиях суточные кривые не требуется "очищать" от шума, они готовы к анализу. Температура измерялась при помощи термистора, расположенного в прямой кишке и соединенного кабелем с портативным устройством, закрепленным на поясе, считывающим в память показания каждые 2 мин. (фирма "АРМ", Новосибирск). Разрешающая способность – 0.026-0.031 С. Время вечернего снижения температуры или ее утреннего повышения вполовину (или на треть) от суточной амплитуды на предварительно сглаженной кривой служило маркером фазы температурного ритма.

Актиметрию использовали для документации времени сна до и во время экспериментальных дней [Ancoli-Israel et al., 2003]. Для этого исследуемые носили на запястье левой (у правшей) руки актиметр (GhwilerTM, Швейцария), в память которого записывался суммированный за каждые 2 мин. уровень двигательной активности. Отсутствие активности ("0") в течение пяти последовательных 2минутных интервалов (10 минут) трактовали как сон.

Гормональные показатели в работе, кроме мелатонина, включали концентрацию в сыворотке крови тиреотропного гормона (ТТГ), пролактина, лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), эстрадиола, 17-гидроксипрогестерона (17-ОП) и тестостерона (табл. 3). Определение проводили в гормональной лаборатории НИИ терапии СО РАМН. Образцы сыворотки, полученные от одного исследуемого, анализировали в одной планше - 12 - те, для исключения погрешности, связанной с вариацией воспроизводимости между анализами.

Таблица Методы определения гормональных показателей Показа- Метод Биохимиче- Чувствитель- Коэф-т вариации тель ский набор ность внутри анализа а ТТГ ИЛМА (иммуно- "Immunotech" 0.03 мМЕ/л 6.2% люминометрический) (Чехия) Пролактин ИЛМА "Immunotech" 0.26 нг/мл 3.4% ЛГ ИЛМА "Immunotech" 0.2 МЕ/л 5.6% ФСГ ИЛМА "Immunotech" 0.2 МЕ/л 3.1% Эстрадиол ELISA (иммуно- "DRG" (Гер- 9.7 пг/мл 6.8% ферментный) мания) 17-ОП ELISA "DRG" 0.05 нг/мл 6.9% Тестосте- ИХЛА(иммунохеми- "AmerCard" 0.04 нг/мл 8.1% рон люминесцентный) (Москва) а – указан максимальный коэффициент для нормальных значений гормона Биохимический набор OvuQuick (США) использовали для определения преовуляторного всплеска ЛГ, свидетельствующего о вероятном наступлении овуляции. Исследуемая должна была собирать мочу в одно и то же время суток, наносить несколько капель мочи и реактивов на определенные места на тестовой бумажке, и сравнивать насыщенность получающегося цвета с пятном сравнения. Если получаемая окраска была такой же по интенсивности или темнее, то тестирование продолжалось еще 2-3 дня, чтобы убедиться в положительном результате (овуляция есть). Если результат был постоянно отрицательный, то тестирование прекращалось на 21-29-й день цикла.

Уровень депрессии оценивали при помощи 29-пунктного опросника SIGHSAD-SR [Williams et al., 1998], заполняемого пациентом. Опросник состоит из стандартной 21-пунктной шкалы Гамильтона и восьми дополнительных вопросов, касающихся, в основном, так называемых атипичных симптомов депрессии: повышение аппетита, массы тела, объема потребляемой пищи, пристрастие к углеводной пище, гиперсомния, усталость, дневной спад и снижение общительности. Оценивали состояние за прошедшие 3-4 дня.

Длительность менструального цикла определяли как количество дней от первого дня месячных до первого дня следующих месячных. Усредненное значение длительности "интактных" менструальных циклов до вступления в исследование названо в работе исходным циклом.

Ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза проводилось на сканере SSD-500 (Aloka) с абдоминальным датчиком 3.5 МГц и трансвагинальным датчиком 5 МГц врачом Е.А.Самойловой. Определяли диаметр фоллику - 13 - лов, объем яичников, толщину эндометрия, факт наступления овуляции. Рост фолликула рассчитывали как диаметр наибольшего (доминантного) фолликула минус диаметр наибольшего фолликула в этом же яичнике неделю назад.

Светочувствительность определяли при помощи электроретинографии (ЭРГ), регистрирующей биопотенциалы, возникающие в сетчатке в ответ на стандартизованные вспышки света [Marmor et al., 2004]. Для характеристики палочковой системы, вспышки тусклого сине-зеленого света давали на фоне адаптации к темноте. Для характеристики колбочковой системы, относительно яркие вспышки белого света давали на фоне адаптации к "палочко-насыщаемому" освещению (57 или 104 люксов). В качестве активного электрода использовали нити DTL (Plus ElectrodeTM), помещаемые за нижнее веко каждого глаза. Зрачки исследуемого были медикаментозно расширены, лицо направлено внутрь Ганцфельд-шара, обеспечивающего равномерное освещение всего поля зрения во время предъявления коротких вспышек света (10 мсек). Вспышки определенной интенсивности давали сериями по 5, 10 или 20, с интервалом 1 или сек. Вызванные биопотенциалы пропускались на частоте 1-1000 Гц, усиливались, усреднялись и представлялись графически на экране при помощи BIOPAC системы с компьютерной программой AcqKnowledge 3.7 (США). Анализ ЭРГ кривых включал четыре общепринятых параметра [Brown, 1968], представленных на рисунке 4: латентность пика и амплитуду первой, негативной, a-волны (характеризующей собственно фоторецепторы), латентность пика и амплитуду второй, позитивной, b-волны (характеризующей постсинаптические к фоторецепторам нейрональные клетки сетчатки).

Сведения о количестве часов солнечного сияния за каждые сутки предоставлены местной агрометеорологической станцией Огурцово.

Статистический анализ полученных данных проведен с использованием программ StatView 4.5 или 5.0 и SuperANOVA 1.11 на компьютере Macintosh.

"rANOVA" в тексте означает дисперсионный анализ для повторной переменной.

В тексте повсеместно указано стандартное отклонение для средних значений, в то время как на графиках отложена в виде отрезка ошибка среднего значения. * означает уровень достоверности (р) <0.05, ** – p<0.01, *** – р<0.001, **** – p<0.0001.

- 14 - РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ЧАСТЬ 1. Зрительная светочувствительность. Как было отмечено во введении, функцию меланопсиновых фоторецепторов не удается охарактеризовать напрямую известными офтальмологическими методами. Тем не менее, путем сложных по дизайну многоэтапных измерений с использованием колбочковой электроретинографии (ЭРГ) Hankins и Lucas [2002] смогли построить кривую спектрального ответа с пиком на длине волны 471 нм, которая, как они считают, характеризует меланопсиновую фоторецепцию. Несмотря на неоднократные попытки (6 разовых экспериментов), предпринятые нами с 2001 года, в том числе в тесном сотрудничестве с авторами методики, воспроизвести ключевой результат их работы не удалось. Вместо этого нами были выполнены два других исследования, задуманные также при сотрудничестве с Hankins и Lucas. Они касались изучения динамики колбочковой и палочковой светочувствительности при длительном пребывании в определенных условиях освещения, поскольку базовые представления об этом отсутствовали, а изменение светочувствительности палочек и/или колбочек могло естественным образом отражать функцию меланопсиновых фоторецепторов. Практический интерес к выполнению этих двух исследований был продиктован еще тем, что лабораторные хронобиологические исследования на человеке часто проводятся в условиях пониженной освещенности (0.3-30 лк), чтобы нивелировать влияние света на биологические часы. Не исключено, что светочувствительность зрительного анализатора сама меняется в этих условиях, влияя на получаемые результаты.

Для характеристики палочкового аппарата сетчатки исследуемые находились в темноте (или при красном свете <0.1 лк) в течение 4.5 суток, а для характеристики колбочкового аппарата – при постоянном освещении (57 ± 30 лк) в течение 26 часов, без сна. Первое исследование прошли 7 человек (все - женского пола, возраст 18-45 лет). Второе исследование прошли 9 человек (1 - мужского, 8 - женского пола, возраст 20-49 лет). Шесть из перечисленных человек участвовали в обоих исследованиях.

В первую очередь обращает на себя внимание наличие линейного тренда на полученных суточных кривых (рис. 3). После математического удаления этого тренда обнаружены достоверные циркадианные колебания ЭРГ-показателей:

для палочковой функции – только на вспышках высокой интенсивности, для колбочковой функции – на вспышках широкого диапазона (особенно для латентности пика b-волны). Ночью возбудимость светом понижалась (увеличение латентности пиков а- и b-волны, уменьшение амплитуды b-волны), а днем - повышалась, что согласуется с результатами изучения суточного ритма показателей палочко-колбочковой ЭРГ [Nozaki et al., 1983, Tuunainen et al., 2001].

- 15 - Палочковая ЭРГ, Колбочковая ЭРГ, в полной темноте, N=7 при постоянном освещении, N=день день 15. 14. 2(N=5) 11 1со 10 16 22 4 10 ч.

12 18 24 6 - достоверный 24-часовой линейный тренд (p<0.05);

© - достоверные циркадианные колебания (после удаления линейного тренда; rANOVA, p<0.05);

- достоверное снижение от дня 1 к дню 4 (p<0.05, тест Стьюдента).

Рис. 3. Суточная динамика показателей палочковой и колбочковой ЭРГ на вспышки яркой интенсивности (-1.43 и 0.77 log кд·сек/м2, соответственно) у здоровых исследуемых.

Поскольку при скотопической (темновой) ЭРГ, начиная со вспышек яркой интенсивности, определенный вклад вносят колбочки [Hood, Birch, 1994], то не исключено, что выявленные циркадианные колебания обусловлены колбочками, а не палочками. Последнее имеет некоторое подтверждение в экспериментах на животных [Manglapus et al, 1998; Cameron et al., 2008]. Колебания колбочковой функции, в свою очередь, модулируются меланопсиновыми фоторецепторами, поскольку у мышей, генетически их лишенных, нормальная разница между днем и ночью в показателях фотопической (световой) ЭРГ исчезает [Barnard et al., 2006]. Таким образом, у колбочковой функции имеется отчетливый циркадианный ритм, а у палочковой функции если он и имеется, то очень слабый.

- 16 - Латентность пика Латентность пика Амплитуда b-волны, мкВ b-волны, мсек a-волны, мсек В исследовании скотопической ЭРГ, длящемся 4.5 дня в темноте, снижение светочувствительности, зафиксированное в виде линейного тренда в первый день, продолжилось до дня 4-го (см. рис. 3). Характерное уменьшение ЭРГ ответа показано на рисунке 4 на примере одного из исследуемых. Амплитуда а- и b-волн по всей группе уменьшилась (b-волны - в среднем на 22 ± 14 %), а латентность пика b-волны увеличилась (p<0.05). Изменение латентности пика аволны не достигло уровня достоверности.

Интенсивность день вспышек, log день кд·сек/м2:

-3.-2. латентность пика b-волны -1.1 латентность пика а-волны 0 50 100 150 2Время, мсек Рис. 4. Изменение ЭРГ ответа (усредненные 9 кривых за сутки) в течение дней световой депривации у исследуемого “4d”.

Так как а-волна отражает функцию фоторецепторов, а b-волна – следующих за фоторецепторами нейрональных клеток сетчатки [Шамшинова, 2006], и обе изменились, то следует предположить первичную роль фоторецепторов. Снижение светочувствительности палочек и колбочек отражает, вероятно, процесс их адаптации к условиям постоянного освещения. Нами обнаружены три работы с использованием ЭРГ на животных, содержащихся в условиях постоянного освещения, – в них получены аналогичные результаты [Manglapus et al., 1998;

Miranda-Anaya et al., 2002; Cameron et al., 2008]. Поскольку более чем 10 нейромодуляторов и нейротрансмиттеров регулируют функцию палочек и колбочек [Максимова, 2006], объяснить механизм явления сложно.

Не связан ли циркадианный ритм светочувствительности с выработкой мелатонина? Мы не стали тестировать действие мелатонина на палочковую функ - 17 - амплитуда b-волны цию, потому что ее ритм довольно слабый (см. выше), и, как было показано Rosolen с соавт. [2004], мелатонин не влияет на показатели палочковой ЭРГ у собак. Что касается колбочек, то по данным Rufiange с соавт. [2002], в естественных условиях, когда мелатонин начинает вырабатываться вечером, амплитуда колбочковой ЭРГ снижается на 3-16 %. В единственно известном нам опубликованном исследовании было показано, что мелатонин в дозе 10 мг снижает амплитуду колбочковой ЭРГ у человека [Emser et al., 1993]. Однако, для тестирования авторы использовали вспышки света только одной интенсивности, красного цвета (а не белого, как общепринято).

Выполненное нами плацебо-контролируемое, двойное слепое, перекрестное, сбалансированное исследование прошли 12 человек (6 мужчин и 6 женщин, возраст 18-52 года). Они обследовались в течение двух часов в дневное время (13:00–15:00) в два разных дня, разделенных между собой периодом без обследования (2-7 дней). Колбочковая ЭРГ проводилась на протяжении получаса до и через 30 минут после приема мелатонина или плацебо. Освещение в помещении сохранялось на уровне ~100 лк.

Уже через 30 минут после приема мелатонина отмечались изменения в колбочковом ответе, проявившиеся в снижении амплитуды b-волны (рис. 5) и увеличении латентности пиков a- и b-волны (rANOVA, Воздействие До и после, p<0.05). Лишь для амплитуды a-волны и для вспышек низкой интенсивности эти изменения не достигли уровня достоверности по сравнению с плацебо. Величина снижения максимальной амплитуды b-волны (на яркие вспышки интенсивностью 0.84 или 0.39 log кд·сек/м2 – индивидуально) составила 6.9 ± 7.микровольт (р=0.0065, тест Стьюдента), или 7.9 %. Поскольку мелатониновые рецепторы (MT1) найдены на колбочках у человека [Meyer et al., 2002], можно предположить прямое ингибирующее действие мелатонина на их функцию.

1Плацебо Мелатонин 80 до после - p<0.или менее (тест Стьюдента) 20 минут 5 минут 20 минут 5 минут Интенсивность вспышек, log кд·сек/мРис. 5. Изменение амплитуды колбочковой ЭРГ после приема плацебо или мелатонина у 12 здоровых лиц.

- 18 - Амплитуда b-волны, мкВ 0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.-0.-0.-0.-1.-0.-0.-0.-1.ЧАСТЬ 2. Влияние света на циркадианные ритмы. Для получения базисных представлений о работе биологических часов человека необходимо поместить человека в контролируемые условия пребывания, максимально свободные от действия внешних времязадателей. Наиболее применяемые регистрируемые показатели, отражающие ход внутренних часов человека, – это ректальная температура тела (измеряемая при длительном положении полулежа) и концентрация мелатонина (в крови или слюне). В последнее время мелатонин признан наиболее точным периферическим индикатором "внутреннего времени" организма [Klerman et al., 2002; Benloucif et al., 2005], так как секреция мелатонина мало зависит от каких-либо факторов, кроме освещенности. Данный протокол необходим также для точного отслеживания влияния изучаемого воздействия на биологические часы. В нашей работе приводятся три исследования – по изучению влияния искусственного рассвета, времени сна и темноты на суточные ритмы. В них исследуемые находились до 9 дней в условиях низкого освещения (<0.1 – <30 лк), в двух исследованиях – дважды: один раз без воздействия (контрольный цикл), другой – с воздействием (экспериментальный цикл), в сбалансированном порядке. Перед каждым заходом исследуемые должны были соблюдать определенный стабильный режим сна в течение 5-9 дней.

Изучение действия искусственного рассвета на биологические часы было предпринято в связи с тем, что имитация рассвета и заката у животных является более значимым хронофизиологическим сигналом, чем резкий переход между режимами свет-темнота (ссылки в [Boulos et al., 2003]). При этом следует учесть, что рассветный сигнал является низкодозовым в сравнении со стимулами постоянного света, обычно используемыми в экспериментальных условиях.

Наше исследование, насколько нам известно, – первое, проводимое в контролируемых лабораторных условиях, по выявлению степени влияния искусственного рассвета на суточные ритмы человека. Предварительные две серии исследований показали сдвиг фазы суточного ритма мелатонина на более раннее время после 1 и 3 рассветов [4]. В третьей серии рассветов было 6, и исследование включало контрольный цикл, в котором рассвет "приостанавливался" в момент пробуждения, оставаясь на уровне 0.1 лк. Исследование прошли 9 здоровых мужчин в возрасте 24.0 ± 5.1 года, интервал между двумя 9-дневными циклами составил 9-10 дней.

Исследование по изучению влияния сна на биологические часы было направлено на решение вопроса: что влияет на сдвиг суточных ритмов при изменении времени сна – темнота или сам сон? Отделить влияние одного от другого у человека сложно. В семи проведенных исследованиях получено, что сон является времязадателем (ссылки в [7]), но не все они были методологически безукориз - 19 - ненны, чтобы получить надежный вывод. В нашем исследовании как можно больше внешних времязадателей подверглось контролю, включая "рекордно" низкое постоянное освещение <0.2 лк и нахождение в постели с 21:00 до 8:00. В экспериментальном цикле время сна смещалось на 20 минут раньше каждый день в течение 6 дней, в контрольном оно оставалось стабильным (с 23:00 до 08:00); в остальном циклы между собой ничем не различались. Исследование прошли 10 человек (4 мужчин и 6 женщин, возраст 20-34 лет), интервал между двумя циклами составил 16-22 дней.

Третье исследование было упомянуто выше (см. рис. 3, 4). Оно включало только один цикл, длящийся 4.5 дня в темноте (дни 1 и 4, замеры) или полутемноте (красный свет <0.1 лк, дни 2 и 3, свободные от замеров).

Общее в результатах этих трех исследований то, что фазы суточных ритмов не остались стабильными в условиях пониженного освещения и 24-часовых суток – они сдвинулись на более раннее или более позднее время. Величина сдвига фазы как мелатонинового (рис. 6), так и температурного ритмов в контрольных циклах составила до 0.4 часа в день.

Искусственный рассвет Смещение сна Полутемнота (красный свет) p=0.031 p=0.0-0.5 0 0.5 -0.5 0 0.5 -0.5 0 0.Сдвиг фазы мелатонинового ритма, часов/день контроль воздействие Рис. 6. Сдвиг фазы циркадианного ритма секреции мелатонина (индивидуальный - сверху вниз и усредненный - внизу) после воздействия искусственным рассветом (6 дней), смещения времени сна (6 дней) и во время пребывания в полутемноте (в течение 4 дней). "р" – согласно тесту Стьюдента.

Данные согласуются с результатами других исследований, где люди также жили в 24-ч. сутках c пониженной освещенностью – их фаза суточного ритма "дрейфовала" [Nakamura et al., 1996; Wright et al., 2001; Gronfier et al., 2007], и согласуются с измеренным в протоколе принудительного десинхроноза периодом биологических часов у человека, диапазон которого составляет от 23.47 ч.

- 20 - [Gronfier et al., 2007] до 24.78 ч. [Hiddinga et al., 1996], в среднем – немногим больше 24 часов [Czeisler et al., 1999]. Важно, что эти индивидуальные тренды сохранялись как на протяжении контрольного цикла, так и в экспериментальном цикле (табл. 4), что свидетельствует об их генетической закрепленности.

Между сдвигами фаз мелатонинового и температурного ритмов также имелась достоверная корреляционная связь (табл. 4), что свидетельствует в пользу того, что эти два ритма отражают работу одних (центральных) биологических часов.

Таблица Результаты корреляционного анализа сдвига фаз циркадианных ритмов Исследование Корреляция в сдвиге фаз между: Иск. рассвет Смещение сна Оба исслед.-я первыми 3 и последними 4 днями r=0.77 * r=0.60 ^ r=0.65 ** (контрольный цикл, МТ ритм) (N=9) (N=18) контрольным и эксперимен- МТ ритм r=0.68 * r=0.89 *** r=0.71 *** тальным циклом Т ритм r=0.74 * r=0.88 *** r=0.83 **** МТ и Т ритмом (объединенно в кон- r=0.61 ** r=0.74 **** r=0.64 **** трольном и экспериментальном цикле) (N=18) (N=20) (N=38) МТ – мелатониновый; Т - температурный; r – коэффициент корреляции Пирсона; ^ - p<0.1.

Искусственный рассвет и смещение сна сдвинули фазы суточных ритмов на более раннее время по сравнению с контрольными циклами (см. рис. 6). После 6 искусственных рассветов этот относительный сдвиг фазы мелатонинового ритма составил 0.92 ± 1.07 ч. (р=0.031), а температурного – 0.67 ± 0.87 ч.

(р=0.046). Таким образом, искусственный рассвет интенсивностью в среднем 155 лк в течение 1.5 часов (общая доза 232 люксо·часов), оказался достаточным для сдвига фаз суточных ритмов. Эта доза меньше минимально эффективной, используемой в стимулах постоянного белого света: 180 лк в течение 5 часов (900 люксо·часов) [Boivin et al., 1996] или ~100 лк в течение 6.5 часов (650 люксо·часов) [Zeitzer et al., 2000].

В исследовании со смещением сна, сдвиг фазы мелатонинового ритма относительно контрольного цикла составил 0.27 ± 0.45 ч. (р=0.091), а температурного – 0.66 ± 0.72 ч. (р=0.017). Это гораздо меньше (p<0.005, тест Стьюдента), чем сдвиг самого сна, который, согласно актиметрии, составил 1.63 ± 0.62 ч. Учитывая, что мелатониновый ритм является более точным индикатором хода центральных биологических часов человека, хронофизиологическое действие сна следует признать незначительным. Можно предположить, что в "идеальном" протоколе, в котором исследуемые находились бы несколько дней в полной темноте, с минимальной активностью и закрытыми глазами (но не спящими) в предназначенные периоды бодрствования в постели, оказалось бы, что сон сам по себе не является времязадателем для человека.

- 21 - Дополнительно, для оценки немедленного действия искусственного рассвета на концентрацию мелатонина, слюна во время первого рассвета и далее собиралась чаще, каждые 20 минут. Несколько более низкая концентрация мелатонина (по сравнению с контрольным циклом) наблюдалась незадолго до окончания рассвета, в 07:20 (p<0.09) и сразу после его окончания, в 07:40 (p=0.20).

Когда все утренние мелатониновые кривые – во время воздействия первым, 3-м и 6-м рассветом – были усреднены, достоверно более низкая концентрация мелатонина наблюдалась на момент окончания (07:30) и еще спустя полчаса после окончания (08:00) искусственного рассвета (рис. 7). Учитывая, что от момента начала экспозиции ярким светом до обнаружения снижения уровня мелатонина в крови проходит 5-10 минут [Retterborg et al., 1991], можно предположить, что начало подавления наступало при достижении искусственным рассветом интенсивности ~100 лк (в 7:02). Это соответствует выявленной другими авторами пороговой интенсивности света 100 лк [Gaddy et al., 1993] или 80 лк [Zeitzer et al., 2000], необходимой для снижения секреции мелатонина.

N=- контроль - искусственный рассвет - сон, 0 лк * - время экспозиции (глаза открыты) * * - р<0.05 (тест Стьюдента) 6:00 6:30 7:00 7:30 8:00 8:30 9:Рис. 7. Концентрация мелатонина во время искусственного рассвета (среднее по рассветам 1, 3 и 6) по сравнению с контрольным циклом.

В исследовании, проводившемся 4.5 суток в темноте, ночная концентрация мелатонина от дня 1 ко дню 4 снизилась (рис. 8): площадь под кривой уменьшилась (p=0.017, тест Стьюдента) у всех 7 исследуемых, в среднем на 33.1 ± 18.9%. Эффект темноты выявлен впервые. При низких освещенностях, например, <1.5 лк в работе Gronfier с соавт. [2004], изменения уровня мелатонина зарегистрировано не было. Вероятно, здесь имеет значение отсутствие контраста в освещении, так как описан обратный эффект: чем выше доза света днем, тем больше секреция мелатонина ночью [Mishima et al., 2001]. У животных продукция мелатонина в постоянной темноте может уменьшаться, оставаться неизменной или даже повышаться при сохранении цикличности – в зависимости от вида. Например, у резус-макак мелатониновый ритм оставался неизменным на протяжении 6.5 суток пребывания в темноте [Reppert et al., 1981].

- 22 - Мелатонин, пг/мл день день 12:00 18:00 24:00 6:00 12:Рис. 8. Изменение уровня мелатонина в слюне в течение 4 дней световой депривации у исследуемого “4d”.

ЧАСТЬ 3. Влияние света на зимнюю депрессию. Возвратная зимняя депрессия является наиболее ярким проявлением годовой ритмичности, в которой основную причинную роль играет светозависимость человека [Rosenthal et al., 1984]. С 1987 по 2006 год нами выявлено более двухсот случаев зимней депрессии. По сравнению с пациентами в исследованиях других авторов (табл. 5) группа пациентов из Новосибирска оказалась более "типичной" в плане большего процента лиц женского пола (95%), большей частоты симптомов подавленность /апатичность (99%) и гиперсомния (95%). Для наших пациентов тревожность была менее характерна (72%), и это объяснимо, поскольку она находится в обратной зависимости от комплекса симптомов, включающих апатию, гиперсомнию, повышение массы тела [3]. Более частый наследственный анамнез зимней депрессии (29%) в нашем исследовании связан, видимо, с тем, что учитывались не только ближайшие, но и дальние кровные родственники, и не только с зимней депрессией, но и с чертами сезонозависимости состояния (со слов пациента). Низкий процент предшествующего лечения антидепрессантами (6%) связан, очевидно, с более низкой обращаемостью наших пациентов в специализированные службы за помощью и менее частым приемом медикаментов.

Не исключено, однако, что пациенты принимали антидепрессанты реже еще и потому, что депрессия у них была менее выраженной, хотя процент суицидов в Новосибирской группе оказался довольно высоким – 7%. Длительность анамнеза характерной годовой цикличности составляла от 3 до 30 и более лет. Состояние летом было нормотимическим, реже – гипоманиакальным (11%). Различие в количестве баллов по шкале депрессии Гамильтона между зимой и летом было значительным: 17.3 ± 5.6 против 3.8 ± 3.5 балла (p<0.0001, N=42).

- 23 - Мелатонин в слюне, пг/мл Таблица Характеристика групп пациентов с зимней депрессией Географическое место Япония Швейца- США, Велико- США, Новосирия штат Мэ- британия г. Нью- бирск риленд Йорк Широта, N° 33-43 47 39 52 41 Ссылка (источник) [Takaha- [Oren et [Oren et [Thomp- [Terman наше shi et al, al, 1992] al, 1992] son et al, et al, исследо1991] 1988] 1989] вание а Численность группы 46 81 336 51 163 2Возраст, лет 35.5 44.3 38 42 39.3 35.Лиц женского пола, % 59 80 78 90 83 Длительность зимнего 4.4 4.9 5.2 4.5 4.8 4.ухудшения, мес.

Наследственный анамнез зим- 10 23 15 14 23 ней (суб)депрессии, % Предшествующее лечение 63 45 43 49 32 антидепрессантами, % Симптомы, %:

Подавленность, апатичность 80 95 96 96 95 Тревожность 93 84 86 86 76 Раздражительность 78 68 86 77 84 Снижение активности 100 80 95 100 97 Повышение аппетита 42 48 67 74 77 Повышение массы тела 54 54 75 84 78 Тяга к углеводной пище 60 73 71 82 88 Гиперсомния 74 61 79 78 71 а – жирным шрифтом выделены значения, являющиеся крайними среди приведенных.

Светолечение ярким светом признано методом выбора для лечения зимней депрессии [Lam, Levitt, 1999]. Оно приводит к значительному уменьшению симптомов уже за неделю [Terman et al., 1989]. В качестве стандарта принят белый яркий свет до 10 000 лк от люминесцентных ламп в течение 30-45 минут вскоре после пробуждения [Lam et al., 1997]. Поляризация света долгое время оставалась неизученным параметром светолечения. Она не осознается человеком, тогда как пчелы, например, ориентируются по смене поляризации лучей Солнца. В единственном известном нам исследовании хронофизиологического значения поляризации света для человека не выявлено различий в степени подавления секреции мелатонина поляризованным и неполяризованным светом [Brainard et al., 2000]. В нашем исследовании проведен сравнительный анализ эффективности поляризованного и неполяризованного света при лечении зимней депрессии.

Данное перекрестное, сбалансированное, слепое исследование прошли 15 пациентов, все – женщины, возраст 21-61 год. Интервал между двумя недельными - 24 - курсами светолечения составил от 27 дней до года. Оба курса привели к одинаковой регрессии симптомов депрессии (по опроснику SIGH-SAD-SR): на 44.2 ± 25.4 % после поляризованного света и на 42.2 ± 25.4 % после неполяризованного света (p=0.69, тест Вилкоксона, соотношение эффективности 8:7). Связи эффектов с количеством часов солнечного сияния не выявлено.

Имитация рассвета – альтернативный яркому свету способ светолечения зимней депрессии, при котором "не надо тратить время на сидение" перед светильником [Terman et al., 1989]. Полученные разными авторами результаты разноречивы: искусственный рассвет по эффективности уступает яркому свету [Lingjaerde et al., 1998], равен ему [Terman et al., 1990] или даже превосходит его [Avery et al., 2001]. Однако, указанные исследования выполнены на параллельных группах пациентов, тогда как можно предположить, что более ценную информацию можно получить при перекрестном дизайне, когда один и тот же пациент сообщает о сравнительных преимуществах и недостатках того или иного метода. Именно подобное исследование и было нами проведено.

Исследование прошли 18 пациентов, и 11 из них выполнили требования протокола в достаточной степени, чтобы провести адекватное сравнение исходов двух недельных курсов световоздействия. Интервал между курсами составил от 20 дней до 5 лет.

- яркий свет лучше - до - после - иск. рассвет лучше (А) (Б) (тест Вил- p=0.25 (тест Макнемара) * ** % коксона) 40 1N=30 N=N=Эффективность Предпочтение Иск. рассвет Яркий свет Рис. 9. Антидепрессивное действие (А) и эффективность и предпочтение (Б) искусственного рассвета по сравнению с ярким светом (N=11).

Оба курса светолечения привели к достоверной регрессии симптомов депрессии (согласно опроснику SIGH-SAD-SR; рис. 9А). При этом снижение баллов после искусственного рассвета было несколько (недостоверно) меньше, чем после яркого света: 31.3 ± 35.1 % против 44.8 ± 16.3 %, соответственно (p=0.15, тест Вилкоксона; соотношение эффективности 3:8). Однако, предпочтение пациентов было отдано искусственному рассвету - соотношение 6:5 (55 %) в группе из 11 человек (рис. 9Б) и 10:8 (56 %) во всей группе 18 человек. Причинами, - 25 - Уровень депрессии, балл объясняющими это предпочтение, были названы: более мягкое, "физиологическое" действие, в частности, на процесс пробуждения (N=7), возможность экономить время, компактность рассветного устройства (N=2), и потому что искусственный рассвет, в отличие от яркого света, не вызывал раздражения глаз (N=1). Причина, объясняющая предпочтение яркого света, была единственная - он субъективно более эффективен (N=8).

Полученные результаты согласуются с результатами исследований Terman с соавт. [1990, 2006], свидетельствующими о том, что искусственный рассвет практически не уступает яркому свету по антидепрессивному действию, и с мнением д-ра Avery, что в его исследовании [Avery et al., 2001] бльшая эффективность искусственного рассвета связана с бльшим его предпочтением пациентами - при положительном восприятии метода возрастает доля плацебо эффекта. Кажется странным, что такая низкая интенсивность света может быть эффективной. Через закрытые веки проходит только 1-10% всего света (10% - красного света) [Moseley et al., 1988; Ando et al., 1996]. Видимо, люди с зимней депрессией особо чувствительны к рассвету, как сигналу перехода от ночи ко дню, которым они обделены во время длинных зимних ночей. Во всяком случае, по свидетельству Brainard с соавт. [1988], снижение синтеза мелатонина под воздействием света при условии медикаментозного расширения зрачков (а во время сна они расширены) происходит при интенсивности света всего 5 лк.

ЧАСТЬ 4. Влияние света на овариально-менструальную функцию. Сообщения некоторых пациентов с зимней депрессией об укорочении (на 1-4 дня) менструального цикла после курса светолечения поступали с первых лет использования метода в Новосибирске [Putilov et al., 1991]. С 1998 г. данные о длительности цикла стали целенаправленно собираться в выполняемых исследованиях по светолечению. В них недельный курс светолечения всегда начинался в первую половину менструального цикла. Целью было выяснить, насколько характерно укорочение менструального цикла, сопутствует ли оно антидепрессивному действию света или является побочным эффектом.

В общей сложности, 38 женщин с зимней депрессией включены в анализ, возраст 18-51 год. Если курсов светолечения было несколько, в анализ брался первый. Менструальный цикл достоверно укоротился на 1.2 дня – с 29.5 ± 3.до 28.3 ± 5.1 дней (рис. 10). Укорочение наблюдалось в 27 случаях из 38 (удлинение – только в 9 случаях). Из 25 пациенток, ведущих "календарики" на регулярной основе, у двух цикл при светолечении оказался короче, чем когда бы то ни было: 19 дней при ярком свете (обычно 23–30 дней, 26 циклов проанализированы) и 25 дней при искусственном рассвете (обычно 27–42 дня, 37 циклов проанализированы). Циклов длительнее, чем обычно, не наблюдалось. Корре - 26 - ляционный анализ не выявил достоверных связей между: (а) изменением уровня депрессии, (б) изменением длительности менструального цикла, (в) началом курса светолечения (на день менструального цикла), (г) возрастом пациенток, (д) изменением продолжительности солнечного сияния.

Все Яркий свет Иск. рассвет (N=17) (N=21) * * - до светолечения (два цикла усредненных) - во время светолечения * - p<0.03 (тест Вилкоксона) Рис. 10. Длительность менструального цикла при светолечении зимней депрессии (N=38).

Таким образом, укорочение менструального цикла является характерным при светолечении зимней депрессии, не сопутствует антидепрессивному действию, и порой является побочным. Степень побочного эффекта умеренная – не такая, как, например, в случае метроррагии на фоне светолечения, описанной в единичном наблюдении Pjrek с соавт. [2004].

Лица с зимней депрессией – не единственная группа, в которой отмечено действие искусственного света на менструальный цикл. С 1963 по 1995 годы в серии из 5 зарубежных исследований было показано, что ночной свет (имитирующий лунный) способствовал нормализации менструального цикла у женщин с удлиненным, нерегулярным циклом (опсоменореей; ссылки в [6, 14]). Световоздействие осуществлялось в течение пяти ночей подряд между 10 и 17 днем менструального цикла и сравнивалось с тусклым светом. Мы постарались проверить данный результат и изучили влияние ночного света на удлиненный менструальный цикл в зависимости от применения света в разные дни цикла.

Шестнадцать женщин (возраст 19-40 лет, исходный средний цикл 35.9–53.дня) прошли все исследование, включавшее три менструальных цикла с 5дневным курсом ночного световоздействия в первые, вторые и третьи 10 дней менструального цикла (перекрестный, сбалансированный дизайн) и по два цикла без световоздействия между ними.

Достоверной динамики длительности цикла на протяжении исследования отмечено не было (рис. 11). Тем не менее, циклы со световоздействием оказались короче по сравнению с исходным средним циклом до исследования.

- 27 - Менструальный цикл, дней * * p=0.(тест Фридмана) до свет после до свет после до свет после 4-12 дни 11-19 дни 19-29 дни - исходный цикл ± ошибка среднего (41.2 ± 1.3 дня) * - p<0.05 по сравнению с исходным циклом (тест Вилкоксона) Рис. 11. Длительность менструального цикла до, во время и после воздействия светом (5 ночей подряд, в разные дни цикла) у женщин с удлиненным циклом (N=16).

Дополнительный (регрессионный) анализ выявил, что укорочение цикла более вероятно, когда световоздействие происходит ближе к середине исходного цикла. Так, для женщин с очень длительным исходным циклом (>42 дней), световоздействие не во вторые, а в третьи 10 дней цикла эффективно. Исключение этих женщин из группы (N=5) выявило преимущественное укорочение цикла при световоздействии между 13-19-м днем цикла, а не 4-12-м и не 21-27-м (рис.

12, p<0.04, тест Вилкоксона). Укорочение было на 7.7 дня (с 38.3 ± 2.2 до 30.6 ± 6.4 дней, p=0.008, тест Вилкоксона).

p=0.0028 (тест Фридмана) 0 4 8 12 16 20 24 Середина световоздействия (день цикла) Рис. 12. Длительность менструальных циклов со световоздействием у женщин с исходным циклом 35.9–41.6 дней (N=11).

Поскольку укорочение менструального цикла происходит при воздействии ночного света между 13-м и 19-м днем цикла, а не раньше и не позже, логичным было проверить предположение о том, что свет потенцирует наступление овуляции, и тем самым укорачивает цикл за счет сокращения фолликулярной фазы. Из предыдущего исследования следовало также, что для проверки данно - 28 - Цикл, дней Цикл, дней го предположения более подходит группа женщин с удлиненным менструальным циклом в среднем не более 42 дней.

Тринадцать женщин (возраст 20-36 лет, исходный цикл 28.7–39.0 дней) прошли исследование с соблюдением всех требований протокола. Они использовали тест OvuQuick (на овуляторный всплеск лютеинизирующего гормона) в первом менструальном цикле, без световоздействия, и в следующем цикле, со световоздействием. Пятидневный курс ночного света назначался так, чтобы его 34-й день приходился на предполагаемый день овуляции (минимальный цикл по данным "календарика" минус 14 дней).

У шести из 13 женщин первый, контрольный цикл не был овуляторным. Однако, у четырех из них он стал таковым в следующем, экспериментальном цикле, при световоздействии (р=0.125, тест Макнемара). Таким образом, количество овуляторных циклов увеличилось с 54% до 85%. Укорочения экспериментального цикла по сравнению как с контрольным, так и с исходным средним, не отмечено (p>0.57, тест Вилкоксона). Последнее не согласуется с результатами предыдущих наших и зарубежных исследований. Однако, в проведенном в это же время похожем исследовании Rex с соавт. [1999] также было отмечено увеличение частоты овуляторных циклов (с 48% до 61% в первом и до 79% во втором цикле со световоздействием), и также не было получено укорочения менструального цикла. Противоречие может быть связано с менее удлиненным исходным менструальным циклом в изученных группах женщин.

Совокупность полученных данных побудила нас запланировать и выполнить в 2003-6 годах исследование, имевшее целью комплексно и с определенностью ответить на вопрос, действительно ли искусственный свет может влиять на уровень половых гормонов, наступление овуляции и длительность менструального цикла.

Двадцать две женщины (возраст 19–37 лет, исходный цикл 28.1–37.8 дней) прошли исследование, включавшее недельный курс воздействия ярким светом во время одного менструального цикла и неярким светом – во время другого цикла (перекрестное, сбалансированное, слепое исследование) и по крайней мере один свободный от воздействия цикл между ними. До и после курса световоздействия, обычно на день 7 и 14 менструального цикла, в дневное время бралась кровь из вены и проводилось УЗИ, которое повторялось и далее для документирования овуляции. Исследование проходило в темное время года.

Отклонения уровня гипофизарных гормонов от нормы оказались редкими (у 6 из 22 женщин) и умеренно выраженными. У половины женщин имелись признаки умеренной гиперандрогении (повышенная концентрация тестостерона и/или 17-ОП), у большинства – мультифолликулярного изменения структуры - 29 - яичников (свидетельствующего о частых ановуляторных циклах) [Chang, 2004], но ни у кого – синдрома поликистозных яичников [Ehrmann et al., 2005].

- неяркий - яркий (А) ТТГ, мМЕ/л Пролактин, нг/мл 2.2.3 1.rANOVA, p=0.28 p=0.00ЛГ, МЕ/л ФсГ, МЕ/л 25 15 5 p=0.014 p=0.0Эстрадиол, Размеры фолликула, мм 180 p=0.11 p=0.0День 7 День 14 День 7 День (Б) p=0.070 (тест Макнемара) % - нет овуляции 1- есть овуляция N=N=N=N=Неяркий Яркий свет Рис. 13. Изменение концентрации гормонов, размеров яичникового фолликула (А) и количества овуляторных циклов (Б) при воздействии ярким и неярким светом (недельный курс в фолликулярную фазу менструального цикла; N=22).

- 30 - После курса воздействия ярким светом, в сравнении с неярким, концентрация пролактина, ЛГ, ФСГ и размеры доминантного фолликула достоверно увеличились (рис. 13А). Количество наступивших овуляций оказалось больше в цикле с ярким светом, чем в цикле с неярким светом (рис. 13Б). Длительность менструального цикла не претерпела достоверных изменений.

Из совокупности полученных результатов, изменения в росте доминантного фолликула описаны впервые. УЗИ подтвердило данные теста OvuQuick, что искусственный свет способствует наступлениию овуляции (см. предыдущее исследование). Результаты гормонального обследования согласуются с обнаруженным повышением уровня ЛГ и/или ФСГ у мужчин или женщин после световоздействия [Miyauchi et al., 1990, 1991; Yoon et al., 2003]. Как по нашим, так и по литературным сведениям, концентрация эстрадиола [Graham et al., 2001] и ТТГ [Leproult et al., 2001] мало подвержена влиянию яркого света; данные же исследований по пролактину разноречивы (ссылки в [13]).

Невысокий процент (27%) овуляторных циклов в группе неудивителен, поскольку менструальные циклы длительностью 35 и более дней ассоциируются с низким уровнем зачатия у таких женщин [ВОЗ, 1983]. Очевидно, что больший процент овуляций после действия яркого света является следствием более быстрого созревания яичникового фолликула. Созревание фолликула, в свою очередь, определяется комплексным взаимозависящим изменением секреции гипофизарных и яичниковых гормонов. Так, уровни ФСГ и ЛГ повышаются к моменту овуляции в несколько раз [Пищулин, 1991]. Вероятно, свет стимулирует выработку этих гормонов через ретино-гипоталамический тракт и дальнейшие связи от гипоталамуса к гипофизу. Что касается мелатонина, секретируемого ночью шишковидной железой, для человека зрелого возраста, в отличие от животных, нет убедительных данных, что мелатонин играет значительную роль в модулировании репродуктивной функции [Kripke et al., 2006].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в работе проведена оценка влияния различных световых воздействий на человека с точки зрения физиологических и клинических эффектов.

Показано, что определенные параметры воздействия являются значимыми для организма человека (световой сигнал, имитирующий рассвет), а другие – нет (поляризация света, сон в качестве времязадателя). Обнаружены новые физиологические реакции организма на свет (снижение светочувствительности фоторецепторов сетчатки при постоянном освещении, снижение секреции мелатонина в условиях длительной световой депривации, стимуляция овариальноменструальной функции ярким светом), что помогает лучше понять роль света в регуляции функций организма и учитывать ее на практике.

- 31 - ВЫВОДЫ 1. Зрительным фоторецепторам человека в разной степени присущи ритмические циркадианные изменения светочувствительности, измеренные электроретинографически: у колбочек они выраженные (днем – повышение, ночью – понижение), а у палочек – нет. При этом светочувствительность постепенно снижается в условиях режима постоянного освещения (~57 люксов – для колбочек, темнота – для палочек).

2. Мелатонин является ингибитором колбочковой светочувствительности:

при приеме мелатонина днем, когда его эндогенная секреция отсутствует, светочувствительность колбочкового аппарата сетчатки снижается.

3. При низкой освещенности (до 30 лк) действия несветовых времязадателей (стабильный режим сна-бодрствования, приема пищи, положения тела, знание времени суток) недостаточно для синхронизации циркадианной ритмичности с 24-часовыми сутками. При этом фазы суточных ритмов секреции мелатонина и температуры тела сдвигаются в равной степени на более раннее или более позднее время (индивидуально) до 23 минут в среднем за сутки, что отражает эндогенный ход центральных биологических часов. В условиях полутемноты (красный свет <0.1 лк) отмечается также снижение ночной секреции мелатонина (амплитуды ритма).

4. Утренний световой стимул, имитирующий по нарастанию интенсивности рассвет, будучи низкодозовым (155 лк в среднем), является, тем не менее, значимым хронофизиологическим сигналом для человека, вызывая опережающий сдвиг фаз циркадианных ритмов секреции мелатонина и температуры тела. При этом секреция мелатонина начинает снижаться по достижении интенсивности света для открытых глаз около 100 лк. Cобственно сон является слабым времязадателем для человека: смещение времени сна мало влияет на фазу циркадианного ритма секреции мелатонина.

5. Клиническое улучшение, достигаемое при воздействии на пациентов с зимней депрессией утренним ярким светом (4300 лк), не зависит от поляризации света. Значимой альтернативой яркому свету является искусственный рассвет: его клиническая эффективность приближается к эффективности яркого света, в чем определенную роль играет предпочтение его пациентами.

6. Искусственный свет влияет на месячную цикличность у человека: к побочным эффектам светолечения при зимней депрессии относится укорочение менструального цикла, а у женщин с опсоменореей удлиненный менструальный цикл укорачивается при воздействии ночным светом (240 лк), но только при воздействии в дни накануне предполагаемой овуляции.

- 32 - 7. Яркий утренний искусственный свет потенцирует выработку половых гормонов (лютеинизирующего гормона, фолликулостимулирующего гормона, пролактина), рост яичникового фолликула и способствует наступлению овуляции у женщин.

Список основных работ, опубликованных по материалам диссертации (у статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК РФ по медицине, название журнала выделено жирным шрифтом) 1. Путилов А.А., Даниленко К.В., Вольф Н.В., Черепанова В.А., Пальчиков В.Е., Золотарев Д.Ю., Сенькова Н.И., Кравченко M.T. Светолечение зимней депрессии: научно-популярный очерк о нетрадиционном методе лечения неизвестной болезни. Новосибирск: Тип. СО АМН СССР, 1990. 50 с.

2. Нешумова Т.В., Даниленко К.В., Путилов A.A. Особенности реактивности кардио-васкулярной системы при сезонном аффективном расстройстве и светолечение // Физиол. чел. 1994. Т. 20, № 3. С. 83–88.

3. Danilenko K.V., Putilov A.A. The importance of full summer remission as a criterion for the diagnosis of seasonal affective disorder // Psychopathology. 1996. V.

29. P. 230–235.

4. Danilenko K.V., Wirz-Justice A., Kruchi K., Cajochen C., Weber J.M., Fairhurst S., Terman M. Phase advance after one or three simulated dawns in humans // Chronobiol. Int. 2000. V. 17. P. 659–668.

5. Danilenko K.V., Wirz-Justice A., Kruchi K., Weber J.M., Terman M. The human circadian pacemaker can see by the dawn's early light // J. Biol. Rhythms. 2000.

V. 15. P. 437–446.

6. Putilov A.A., Danilenko K.V., Protopopova A.Y., Kripke D.F. Menstrual phase response to nocturnal light // Biol. Rhythm Res. 2002. V. 33. P. 23–38.

7. Danilenko K.V., Cajochen C., Wirz-Justice A. Is sleep per se a zeitgeber in humans? // J. Biol. Rhythms. 2003. V. 18. P. 170–178.

8. Danilenko K.V., Hayes S.B. No benefit to using polarized rather than nonpolarized light for the treatment of seasonal affective disorder // Society for Light Treatment and Biological Rhythms abstracts 2003. Chronobiol. Int. 2003. V. 20.

P. 1211–1213.

9. Wirz-Justice A., Terman M., Oren D.A., Goodwin F.K., Kripke D.F., Whybrow P.C., Wisner K.L., Wu J.C., Lam R.W., Berger M., Danilenko K.V., Kasper S., Smeraldi E., Takahashi K., Thompson C., van den Hoofdakker R.H. Brightening depression // Science. 2004. V. 303. P. 467–469.

10. Putilov A.A., Danilenko K.V. Antidepressant effects of light therapy and “natural” treatments for winter depression // Biol. Rhythm Res. 2005. V. 36. P. 389–403.

- 33 - 11. Hayes S.B., Danilenko K.V. Dawn simulation vs. bright light in SAD: treatment effects and subjective preference // Society for Light Treatment and Biological Rhythms abstracts 2005. Chronobiol. Int. 2006. V. 23. P. 711–712.

12. Hbert M., Rosolen S., Lachapelle P., Danilenko K.V. Investigating the effect of melatonin on the human photopic ERG // Ibid. P. 712–713.

13. Самойлова Е.А., Степкина Е.О., Даниленко К.В., Пасман Н.М. Коррекция нарушения менструального цикла ярким искусственным светом // Вестник НГУ, серия: "Биология, клиническая медицина". 2007. Т. 5, № 3. С. 88–90.

14. Danilenko K.V., Samoilova E.A. Stimulatory effect of morning bright light on reproductive hormones and ovulation: results of a controlled crossover trial // PLoS Clin. Trials. 2007. Feb 9, 2(2): e7.

15. Danilenko K.V. Shortening of the menstrual cycle following light therapy in seasonal affective disorder // Psychiat. Res. 2007. V. 153. P. 93–95.

16. Danilenko K.V., Plisov I.L., Wirz-Justice A., Hbert M. Human retinal light sensitivity and melatonin rhythms following four days in near darkness // Chronobiol.

Int. 2009. V. 29. P. 93–107.

ПРИЗНАТЕЛЬНОСТЬ Грантовая и спонсорская поддержка: грант IBRO 1995-96 годы, гранты SNF CEEC-NIS 1996-98 #7SUPJ048549 и SCOPES 2000-03 #7SUPJ062228, фонд Velux (2000-05 гг.), фирма Outside In (Кембридж, Англия). Методическая и организационная поддержка: лаб. Хронобиологии Психиатрической клиники Университета Базеля, МНТК "Микрохирургия глаза" (г.

Новосибирск), медицинские центры "Фитомед" и "Тет-а-тет" (г. Новосибирск).

Благодарность всем исследуемым, принявшим участие в экспериментальных исследованиях, и тем, с кем в тесном сотрудничестве выполнены данные исследования:

Е.А.Даниленко, Т.И.Карповой, С.А.Кондратову, к.м.н. И.Л.Плисову, д.б.н. А.А.Путилову, к.м.н. Е.А.Самойловой, Е.О.Стёпкиной, А.Ю.Протопоповой, C.Cajochen, M.Hbert, K.Kruchi, D.F.Kripke, M.Terman, J.M.Weber, A.Wirz-Justice и многим другим.

Благодарность за конструктивные комментарии к диссертации, сделанные в период написания работы, академику РАМН проф. Ю.П.Никитину, д.м.н. проф. Т.К.Немиловой, д.м.н.

проф. М.П.Мошкину, д.м.н. проф. А.В.Шурлыгиной, д.м.н. проф. В.И.Хаснулину, д.б.н.

проф. Р.И.Айзману, д.м.н. проф. К.Ю.Николаеву, д.м.н. А.А.Кузнецову, д.м.н. проф.

Н.В.Вольф, д.б.н. В.Э.Диверту, д.м.н. проф. В.Ю.Куликову.

- 34 -






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.