WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ХВОСТУНОВ

Игорь Константинович

Роль стохастических факторов в процессе формирования первичных повреждений ДНК и хромосомных аберраций при воздействии радиации на соматические клетки млекопитающих in vitro и in vivo

03.01.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Обнинск – 2011

Работа выполнена в лаборатории радиационной цитогенетики

Федерального Государственного бюджетного учреждения

"Медицинский радиологический научный центр"

Министерства здравоохранения и социального развития

Российской Федерации

Научный консультант доктор биологических наук, профессор

       Севанькаев Александр Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Петин Владислав Георгиевич,

доктор биологических наук, профессор Сынзыныс Борис Иванович,

доктор биологических наук, профессор Рождественский Лев Михайлович

Ведущая организация: Лаборатория радиационной биологии Объединенного                                                                               института ядерных исследований (г. Дубна).

  Защита состоится 26 апреля 2011 г. в 1100 часов на заседании диссертационного совета Д 208.132.01 при ФГБУ «Медицинский радиологический научный  центр» Минздравсоцразвития России

по адресу: 249036, Калужская обл., г. Обнинск, ул. Королева, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_____»  ___________ 2011 г.

  Ученый секретарь

диссертационного совета Палыга Г.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы исследования. Для оценки эффективности воздействия радиации на живые организмы необходима детальная информация как о микродозиметрическом распределении поглощенной энергии в веществе, так и о первичных повреждениях молекулы ДНК, о закономерностях образования летальных и мутационных изменений ДНК и, в частности, о хромосомных аберрациях. Наиболее перспективным подходом к решению подобного рода задач является сочетание теоретических и экспериментальных методов исследования. При этом необходима разработка биофизических методов, позволяющих предсказывать как ранние, так и отдаленные последствия воздействия радиации на молекулярном, клеточном уровне и, в конечном счете, на уровне организма человека в целом. Особенностью воздействия на молекулы ДНК различных излучений, особенно с низкой линейной переданной энергией (ЛПЭ) (гамма- и рентгеновское излучение), является существенный вклад механизма косвенного действия свободных радикалов, которые возникают в процессе радиолиза молекул воды и приводят к повреждению сахаро-фосфатного остова молекулы ДНК. По этой причине учет как прямого, так и косвенного действия ионизирующего излучения является необходимым условием разработки современной биофизической модели для оценки радиационных повреждений, вызванных излучением с различной ЛПЭ. На молекулярном уровне возрастает локальная кластеризация поглощенной энергии ионизирующего излучения. Поскольку эффективность работы репарационных систем на клеточном уровне может зависеть от распределения повреждений на масштабах в десятки пар оснований (ПО) в структуре молекулы ДНК, то исследование как простых, так и комплексных разрывов ДНК позволяет оценить эффективность работы систем репарации. Актуальность исследования первичных повреждений ДНК обусловлена тем, что они играют определяющую роль в механизмах образования хромосомных аберраций в соматических клетках человека. Анализ хромосомных аберраций позволяет делать обоснованные заключения о характере радиационного воздействия, а также прогнозировать его последствия. 

Целью работы являлось исследование роли стохастических факторов путем биофизического моделирования взаимодействия ионизирующего излучения с биологическими структурами различного уровня организации, а также путем анализа наблюдаемого выхода хромосомных аберраций при облучении соматических клеток человека in vitro и in vivo. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие конкретные задачи:

  1. Разработка биофизической модели взаимодействия ионизирующего излуче-ния с биологическими структурами клетки, включая высшие формы пространственной организации молекулы ДНК.
  2. Проведение анализа предсказанных по разработанной модели законо-мерностей индукции первичных повреждений на молекулярно-клеточном уровне в сопоставлении с наблюдаемыми радиационными эффектами.
  3. Разработка модели межклеточного взаимодействия наблюдаемого in vitro эффекта "свидетеля" (bystander effect).
  4. Исследование стабильных и нестабильных аберраций хромосом при облучении соматических клеток человека in vitro и in vivo.
  5. Анализ закономерностей частоты радиационно-индуцированных аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека с целью совершенствования цито-генетических методов в задачах ретроспективной биодозиметрии.

Научная новизна. В процессе выполнения исследования были получены новые фундаментальные данные о закономерностях образования первичных повреждений ДНК и аберраций хромосом в соматических клетках человека.

Впервые была разработана оригинальная биофизическая модель, позволяющая рассчитывать вероятности поглощения энергии в различных структурных элементах ядра клетки, абсолютные значения эффективности образования первичных повреждений ДНК и их координаты с точностью до нуклеотида в широком диапазоне ЛПЭ воздействующего излучения. Также впервые была разработана биофизическая модель эффекта “свидетеля” (bystander effect), проявляющегося в форме изменения выживаемости и частоты образования мутантных клеток при воздействии малых доз радиации.

В работе впервые представлены оригинальные интерпретации и пред-сказания ряда радиобиологических эффектов, в частности, заключение о роли структуры хроматина при формировании спектра коротких фрагментов ДНК, выводы о механизме распространения и массе носителя сигнала в эффекте “свидетеля”, причина появления больших событий поглощения энергии при касательном воздействии тяжелого иона на сферическую газовую полость.

Впервые на репрезентативном уровне удалось получить и проанализиро-вать данные многолетнего цитогенетического наблюдения людей, облучив-шихся в дозах от 1 Гр до 10 Гр на все тело с клиническими проявлениями острой лучевой болезни (ОЛБ). При этом впервые были получены количествен-ные закономерности динамики стабильных и нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови этих лиц от момента облучения до 4050 лет после радиационного воздействия. Установлено, что частота дицентриков и центрических колец в лимфоцитах крови человека после острого облучения непрерывно снижается, следуя быстро и медленно спадающим компонентам в соотношении (90% на 10%), а частота транслокаций после первоначального снижения в течение 310 лет сохраняется на постоянном уровне до 3540 лет.

Практическая значимость. В работе обоснована возможность оперативного прогноза степени тяжести ОЛБ (от I до IV), основываясь на результатах анализа частоты дицентриков (от 5 до 500 диц/100 кл) в лимфоцитах крови человека непосредственно после общего аварийного облучения. По результатам работы предложены следующие практические рекомендации:

1. При исследовании закономерностей выхода двойных разрывов (ДР) путем анализа спектров индуцированных фрагментов ДНК, которые получены методом импульсного гель-электрофореза, необходимо учитывать фактор неслучайного распределения первичных повреждений по структуре ДНК за счет пространственной конфигурации хроматина в ядре клетки, что приводит к к возрастанию оценки числа ДР от 10% до 100% в зависимости от ЛПЭ.

2. При использовании метода Qdr в задачах ретроспективной биодозиметрии необходимо вносить поправку в показатель qdr. Если цитогенетический анализ выполнен в период от 1 года до 10 лет и более после облучения, то показатель qdr необходимо увеличить на 30%50%, чтобы правильно оценить поглощен-ную дозу.

3. В задачах ретроспективной биодозиметрии не следует использовать в качестве калибровочной кривой дозовую зависимость частоты транслокаций, полученную при облучении лимфоцитов крови in vitro, поскольку доза при этом будет существенно занижена. Дозовая кривая in vitro должна быть скорректирована с учётом снижения частоты транслокаций в лимфоцитах крови облучившихся лиц в отдаленном пострадиационном периоде.

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследований, планировании, проведении экспериментов и анализе результатов. Диссертантом обоснованы актуальность, цели и задачи работы. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является опреде-ляющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследо-вания: от постановки задачи до публикации.

Основные положения, выносимые на защиту. В работе установлено, что:

  1. спектр радиационно-индуцированных фрагментов ДНК, образующихся при воздействии тяжелых ионов, позволяет реконструировать организацию хроматина в ядре клетки на нуклеосомном и фибриллярном уровнях;
  2. гипотеза о диффузионном механизме передачи сигнального объекта позволяет интерпретировать эффект "свидетеля" (bystander), наблюдаемый на клеточном уровне, и получить оценку массы сигнала менее 10 кДа;
  3. после общего острого облучения человека частота транслокаций в лимфоцитах крови в отдаленном периоде сохраняется на уровне 12%18 % от первоначально индуцированной величины в течение 3540 лет;
  4. in vitro дозовая зависимость частоты транслокаций не пригодна для ретро-спективной биодозиметрии, поскольку существенно занижает оценку дозы, и должна быть скорректирована с учетом пострадиационного снижения частоты транслокаций, которая наблюдается у облучившихся лиц.

Внедрение в практику. На основании полученных в работе результатов были предложены методы совершенствования ретроспективной биологической дозиметрии по цитогенетическим показателям. Эти методы внедрены и используются в практической деятельности Лаборатории радиационной гематологии и цитогенетики ФГУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна и Лаборатории молекулярной биологии Российского научного центра рентгенорадиологии Минздравсоцразвития России, что подтверждается соответствующими официальными актами о внедрении. Полученные результаты были использованы при выполнении совместных НИР с ФГУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна, ИОГЕН РАН, в международных проектах, поддержанных CEC, INTAS и МНТЦ.

Апробация работы.  Основные результаты диссертации представлены и обсуждены на следующих научных конференциях: VII Совещание стран СНГ по микродозиметрии и школы «Фундаментальные и прикладные аспекты радиационных исследований», 1992, 15-20 ноября, Суздаль; 24-th Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, 4-8 Oct., 1992, Erfurt, Germany; 25-th Annual Meeting of the European Society  for Radiation Biology, June 10-14, 1993, Stockholm University, Sweden; 26-th Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, 25-29  June, 1994, Amsterdam, The Netherlands; 11-th Symposium on Microdosimetry, 13-18 Sept. 1992, Gatlinburg, Tennessee, USA; Molecular Mechanisms of Environmental Mutagenesis and Cancer, August 20-25, 1994, Stockholm/Huddinge, Sweden; 10-th International Congress of Radiation Research Aug. 27- Sept. 1, 1995, Wurzburg, Germany; 12-th Symposium on Microdosimetry Sept. 29- Oct. 4, 1996, Oxford, UK; International Conference on Biodosimetry and 5-th International Symposium on ESR Dosimetry and Applications Obninsk-Moscow, June 22-26, 1998; 29-th Meeting of the European Society for Radiation Biology and the 9-th Meeting of the Italian Society for Radiation Research. Capri 3-7 Oct. 1998 ; International Conference Modern Problems of Radiobiology, Radioecology and Evolution dedicated to centenary of N.W. Timofeeff-Ressovsky, Sept. 6-9, 2000, Dubna 2000; Cospar Colloquium. Second International Workshop – Radiation Safety for Manned Mission to Mars. Sept. 29–Oct. 01, 2003, Dubna; 3rd Dosimetry workshop on the Semipalatinsk nuclear test site area and 10-th Hiroshima International Symposium, Hiroshima, 9-11 March, 2005; V съезд по радиационным исследованиям, Москва, 10-14 апреля, 2006; 7-th International Symposium on ESR Dosimetry and Applications 10-13 July 2006, Bethesda, Maryland, USA; 4-th International Workshop on Space Radiation Research and 17-th Annual NASA Space Radiation Health Investigators’ Dubna, 2006; III Международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», Дубна, 24-28 января 2007; Международная конференция «Новые направления в радиобиологии» Москва, 6-7 июня, 2007; BioDose-2008, Sept. 7-11, 2008, Dartmouth College, Hanover, NH, USA; 46-th Japan Science Workshop, 27-28 Nov., NIRS, Chiba, Japan; VI съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) Москва, 25-28 октября 2010; EPRBioDose 2010 Conference Mandelieu La Napoule (France) 10-14 October, 2010.

Диссертационная работа апробирована на научной конференции экспериментального радиологического сектора Учреждения Российской академии медицинских наук «Медицинский радиологический научный центр» РАМН, протокол №  255 от 10.11.2010 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 статьи в российских и зарубежных изданиях. Кроме того, результаты представлены в 44 тезисах докладов на научных конференциях.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Первая глава посвящена обзору современного состояния проблемы, описанию используемых материалов и методов и постановке задачи. Во второй и последующих главах излагаются полученные результаты и проводится обсуждение результатов исследований. Диссертация содержит 287 страниц текста, 72 рисунка и 35 таблиц. Список литературы включает 355 наименований, среди них 41 работа на русском языке и 314 работ зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ Содержание  работы

Во введении представлено обоснование актуальности выбранной темы в связи с имеющимися результатами по оценке роли стохастических факторов при исследовании воздействия ионизирующего излучения на живые организмы. В первой главе представлен обзор данных литературы по необходимости учета стохастических факторов и их классификации. Обсуждаются существующие методы учета прямого и косвенного действия радиации, молекулярная структу-ра мишени и модели образования хромосомных аберраций. Представлен обзор методов биологической дозиметрии, которые основаны на цитогенетическом анализе лимфоцитов крови человека. Сформулированы имеющиеся достижения и нерешенные проблемы для постановки задачи настоящего исследования.

Материалы и методы исследования

Для исследования первичных радиационно-индуцированных поврежде-ний ДНК в настоящей работе была разработана оригинальная биофизическая модель, включающая пространственную структуру биологической мишени, стохастическую структуру трека и воздействие свободных радикалов на радиационно-химической стадии. Использованные биофизические методы заключались в моделировании методом Монте Карло воздействия излучения на структуры живой клетки и межклеточного взаимодействия.

Хромосомные аберрации изучались метафазным методом в лимфоцитах крови человека. Использовалась стандартная методика IAEA (2001) с фиксацией на 48 ч после начала культивирования. Для анализа нестабильных и стабильных аберраций хромосом использовали стандартный метод окрашива-ния по Гимза и FISH-метод, соответственно. При анализе части генома методом FISH частота аберрации на весь геном составляла FG = FP / NGE, где FP –частота  с участием только «окрашенных» хромосом, NGE – число эквивалентных клеток (GEкл.), соответствующих числу проанализированных метафаз N. Эти величины связаны между собой по известной формуле Lucas J.N. et al. (1992).

Экспериментальные исследования с облучением образцов крови человека in vitro выполнялись на -60Co установке при комнатной температуре. Дозимет-рия выполнялась путем измерения мощности экспозиционной дозы иониза-ционной камерой VAK-253 с -дозиметром 27012. Одновременно с биологи-ческими образцами в точках облучения размещались ТЛД-детекторы Li-F.

Материалом для исследования аберраций in vivo являлись образцы крови доноров и лиц, подвергшихся аварийному воздействию ионизирующего излуче-ния. В группе облучившихся лиц из 73 чел. было выполнено 265 анализов стандартным методом и 97 – методом FISH. Контрольная группа состояла из 398 человек, из них 386 чел. были обследованы стандартным методом, в среднем по 630 метаф/чел, 12 – методом FISH в среднем по 1500 метаф/чел. 

Стандартные ошибки вычисляли для аберрантных клеток в предположении биномиального распределения, а для частоты аберраций – распределения Пуассона. Распределения аберраций по клеткам сравнивали с распределением Пуассона по U-критерию, Edwards A.A. et al. (1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И  ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе была исследована роль стохастических факторов в процессе образования первичных повреждений ДНК под влиянием ее пространственной организации и стохастической структуры трека заряженных частиц с различной ЛПЭ. В качестве наблюдаемых проявлений воздействия рассматривалось распределение одиночных (ОР) и двойных (ДР) разрывов ДНК с учетом их кластеризации, а также выход фрагментов ДНК, соотношение различных типов первичных повреждений ДНК и выживаемости клеток. Учитывался вклад прямого действия радиации и косвенное воздействие свободных радикалов. Были проведены экспериментальные исследования частоты хромосомных аберраций при облучении лимфоцитов крови человека in vitro. Закономерности частоты аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении in vivo были исследованы путем цитогенетического обследования аварийно облучившихся лиц в острый и отдаленный периоды. Полученные данные были обобщены в форме рекомендаций по совершенствованию методов ретроспективной биодозиметрии на основе частоты хромосомных аберраций.

  1. Биофизическая модель взаимодействия ионизирующего излучения с биологическими структурами клетки.

Для решения поставленных в работе задач была разработана оригинальная биофизическая модель, которая состоит из взаимосвязанных компонент: (1)- пространственной структуры биологической мишени, (2)- стохастической структуры трека и (3)- диффузионно-рекомбинационной кинетики свободных радикалов. Состоятельность модели была установлена путем исследования на воспроизводимость таких физических величин как: ЛПЭ, энергия образования пары ионов, кинетика свободных радикалов, зависимость кинетики радикалов от ЛПЭ, поглощенной дозы и концентрации поглотителя свободных радикалов.

Основные постулаты разработанной модели состоят в следующем:

    • воздействие излучения моделируется в виде представительного набора стохастических треков в форме совокупности точек передачи энергии с учетом как первичных взаимодействий, так и всех вторичных -электронов;
    • первичные продукты радиолиза воды (свободные радикалы) образуются в точках передачи энергии стохастического трека, при этом процесс диффузии и рекомбинации учитывается путем моделирования их кинетики методом Монте Карло с целью оценки косвенного действия излучения на ДНК;
    • молекулярная структура ДНК конструируется с использованием координат атомов нуклеотидов и биологически обоснованных параметров простран-ственной конфигурации высших форм ее организации;
    • ОР и ДР ДНК образуются в результате кластеризации повреждений сахаро-фосфатного остова за счет прямого и косвенного воздействия излучения;
    • комплексные ДР, которые характеризуются низкой вероятностью репарации, являются причиной возникновения хромосомных аберраций;
    • облученные клетки могут передавать интактным клеткам межклеточный сиг-нал, который распространяется в соответствии с законами диффузионно-рекомбинационной кинетики, что приводит к эффекту "свидетеля".

  Модель применима для расчета микродозиметрических распределений поглощенной энергии в биологических мишенях с характерными размерами от 1 нм до десятков мкм при воздействии заряженных частиц нерелятивистских энергий от электрона до тяжелых ядер. На радиационно-химической стадии моделируется динамика свободных радикалов в течение 10-12 – 10-6 с после физической стадии воздействия. Модель структуры мишени реализована в атомарном и субобъемном вариантах. В первом случае структура ДНК представлена декартовыми координатами атомов, составляющих четыре типа нуклеотидов и сахаро-фосфатный остов. Во втором - нуклеотид представлен в виде сегмента коаксиального цилиндра диаметром 2,3 нм и толщиной 0,34 нм. Соответственно, в первом варианте расчеты повреждений ДНК производятся с точностью до координат отдельных атомов, а во втором – с точностью до координат отдельных нуклеотидов. Основные параметры модели образования разрывов таковы: min – пороговая энергия, поглощение которой в сахаро-фосфатном остове нуклеотида вызывает ОР; Δ – минимальное расстояние между последовательными ОР на комплементарных цепочках ДНК, необходимое для образования ДР; Δssb и Δdsb – расстояния между последователь-ными ОР и ДР, при превышении которых образуются новые разрывы.

В целом, в отличие от других стохастических подходов, разработанная биофизическая модель позволяет вычислять абсолютные значения вероятности поглощения энергии в различных структурах, эффективность образования первичных повреждений ДНК, декартовы координаты повреждений, размеры и координаты радиационно-индуцированных фрагментов ДНК.

  1. Оценка роли стохастических факторов воздействия ионизирующего излучения в рамках микродозиметрической концепции.

В рамках микродозиметрической концепции была исследована роль геометрической формы моделей ядра клетки и субъядерных структур, включая различные формы высшей организации молекулы ДНК, а также фактор стохастической структуры трека без учета молекулярной структуры мишени. Целью исследования была проверка гипотезы о том, что конформации хроматина в клетке могут влиять на ее радиационную чувствительность.

       

Рис. 1. Вероятность одиночного события поглощения энергии в ДНК в форме линейного сегмента двойной спирали ( * )  и фибриллы хроматина ( ) с одинаковой массой 5,2 кПО при воздействии трека тяжелого иона в зависимости от ЛПЭ.





Расчетным путем показано, что с увеличением компактизации мишени наблюдается снижение вероятности поглощения в ней энергии. В простейшем случае модели ядра клетки в форме эллипсоида и сферы вероятность поглощения энергии в сфере в 1,5 раза меньше, чем в эллипсоиде, на что указывает увеличение частотного среднего удельной энергии zF для сферы. С ростом компактизации структуры ДНК возрастает роль событий с большой поглощенной энергией за счет кратных пересечений мишени одним треком при сворачивании двойной спирали ДНК в нуклеосому или фибриллу. На рис. 1 представлена вероятность поглощения энергии от трека тяжелого иона в линейном сегменте ДНК и в фибрилле хроматина в зависимости от ЛПЭ. Такая вероятность существенно ниже для компактной фибриллы по сравнению с линейным сегментом ДНК той же массы. Проявляется это в росте частотного среднего zF от 1,5 до 50 раз при увеличении ЛПЭ от 2 до 104 кэВ/мкм (рис. 1).

При исследовании фактора пространственной гетерогенности мишени был предсказан эффект "скользящего" воздействия (grazing effect) от тяжелой заряженной частицы, проходящей по границе сферического пропорциональ-ного счетчика. Приборы данного класса являются важными источниками микродозиметрических данных для оценки эффективности смешанных радиа-ционных полей и космического излучении. Путем моделирования структуры трека на границе плотной и разреженной среды была обоснована оригинальная интерпретация указанного эффекта за счет повышенного вклада вторичных -электров, образующихся в стенке счетчика, Rademacher R.S. et al. (1998) (рис.3), где точками показаны экспериментальные значения поглощенной энергии в зависимости от прицельного параметра b. При b=RSV, где RSV – радиус чувствительной сферы, наблюдается резкий максимум.

       

Рис. 2. Поглощенная энергия в сферическом счетчике радиуса RSV в зависимости от прицельного параметра b от ионов железа 56Fe с энергией 1,05 ГэВ/нукл. Для сравнения приведены расчеты других авторов.

В настоящем исследовании впервые показано, что этот эффект вызван вторичными -электронами, образующимися в стенке счетчика. Расчеты других авторов не представили интерпретации эффекта. Кроме того, наши расчеты показали, что подобный феномен может наблюдаться только в сферическом счетчике при воздействии многозарядных тяжелых ионов больших энергий. В цилиндрических счетчиках проявление подобного эффекта не ожидается.

Фактор стохастической структуры трека, с учетом полного замедления первичных частиц в мишени, был исследован путем оценки воздействия протонов на клетки линии V79 при облучении их в монослое. На рис. 3 и рис. 4 представлены спектры линейной энергии «y» в ядре клетки и в сфере диаметром 1 мкм при облучении их протонами различных энергий. Результаты представлены в безразмерной форме y f(y), поэтому площадь под кривыми равняется среднему частотному yF. Показано, что спектр линейных энергий от 10 МэВ протонов очень узкий, при этом ЛПЭ совпадает с yF, которая в 1,21,4 раза меньше yD. Разброс линейных энергий от 250 кэВ протонов достигает 160 кэВ/мкм, что в 2,6 раза больше ЛПЭ первичного протона, при этом сама ЛПЭ немного меньше yF, которая, в свою очередь, в 1,6 раза меньше yD (рис.4).

Установлено, что на ядро клетки наиболее эффективно воздействуют протоны с энергией 550 кэВ, которые способны полностью в нем поглощаться. На субъядерные мишени с размерами порядка 1 мкм наиболее эффективно воздействуют пересекающие мишень протоны при условии, что их начальная энергия порядка 250 кэВ.

Рис. 3.  Спектры линейной энергии при воздействии протонов с энергией E на ядро клетки V79.

Рис. 4. Спектры линейной энергии при воздействии протонов с энергией E на сферу диаметром 1 мкм.

Это означает, что 1 мкм сфере наиболее эффективно передают энергию «кроссеры», т.е. частицы, пересекающие мишень с потерей в нем существенной доли своей начальной энергии. В рамках микродозиметрической концепции дозовое среднее удельной энергии yD коррелирует с биологической эффективностью, ICRU 36 (1983). По этому критерию протоны с энергией 550 кэВ в 13 раз более эффективны, чем 10 МэВ протоны при условии, что чувствительной областью клетки является ее ядро. Если же эффект определяется областью диаметром 1 мкм, то протоны с энергией 250 кэВ оказываются в 18 раз более эффективны, чем 10 МэВ протоны.

  1. Биофизическое моделирование радиационных повреждений ДНК и хроматина, индуцированных излучением с различной ЛПЭ.

Анализ образования начальных повреждений ДНК является важным инструментом в изучении биологических эффектов действия радиации. Различия в относительной биологической эффективности (ОБЭ) в зависимости от ЛПЭ часто связывают со структурой первичных повреждений ДНК вследствие высокой плотности ионизаций. Предполагается, что большие ОБЭ излучений с высокой ЛПЭ обусловлены низкой эффективностью репарации локальных участков ДНК с множественными повреждениями, Ward J.F. (1994). Кроме того, эффективность репарационных систем в клетке может зависеть от распределения повреждений на масштабах значительно больших, чем десятки ПО, т.е. определяться параметрами надмолекулярной организации ДНК в клетке, Lobrich M. et al. (1996). Кластерное распределение повреждений в хроматине может быть обусловлено высокой объемной концентрацией участков цепи ДНК при ее сворачивании в структуры высших порядков. И если распределение повреждений в хроматине отличается от случайного, то взаимное расположение ДР может оказаться фактором, определяющим разли-чия в эффективности репарации, т.е. различия в ОБЭ в зависимости от ЛПЭ.

Рис. 5. Эффективность индукции одиночных (ОР) и двойных (ДР) разрывов в сегменте ДНК массой 54 ПО при прямом и прямом+косвенном воздействии электронов с энергией 1,5 кэВ (ЛПЭ=0,2 кэВ/мкм) и тяжелых заряженных частиц. Расчет проведен в рамках субобъемной модели.

Путем моделирования индукции первичных повреждений с учетом прямого и косвенного действия была исследована эффективность образования ОР и ДР в линейном сегменте ДНК в зависимости от ЛПЭ (рис.5), где представлены результаты расчета при заданной дозе и высокой концентрации поглотителя радикалов гидроксила OH. Среднее время жизни этих радикалов составляло OH = 0,95 10-9 с (длина свободного пробега 4 нм), что соответствует внутриклеточным условиям с высокой эффективностью их поглощения. Полученные результаты (рис. 5) показывают, что при внутриклеточных условиях с ростом ЛПЭ в пределах от 1 до 120 кэВ/мкм вклад косвенного действия составляет ~30% при индукции ОР и ~30-40% для ДР. Оценка ОБЭ по ОР равна (0,77), а по ДР – (1,5), соответственно, что вызвано образованием кластерных повреждений ДНК при прямом и косвенном действии радиации.

Эффективность индукции повреждений ДНК в клетках линии V79 протонами различных энергий (включая область пика Брэгга) была исследована при помощи разработанной модели. В проведенных расчетах учитывалось снижение энергии протонов при их замедлении в клетке вплоть до полного поглощения. Эффективность индукции ОР и ДР в ядре клетки была рассчитана с учетом классификации разрывов на простые (ssb, dsb), сложные (ssb+, dsb+) и комплексные (2ssb, dsb++), Charlton D.E. et al. (1989). При расчетах использовалась субъобъемная модель ДНК в виде линейного сегмента массой 300 ПО. Для учета внутриклеточных условий с высокой концентрацией поглотителя радикалов OH применялась аппроксимация вклада прямого и косвенного действия с параметрами разрыва emin = 17,5 эВ, (10,10,10) ПО в геометрии облучения клеток при заданной дозе. Результаты представлены на рис. 6 для протонов с энергией более 100 кэВ, которые могут пересечь слой цитоплазмы толщиной около 1 мкм на пути до ядра клетки.

Рис. 6. Рассчитанная эффективность двойных разрывов (ДР) ДНК в зависимости от энергии протона, воздействующего на линейный сегмент ДНК в ядре клетки V79 (сплошные линии, справа) в сопоставлении с экспериментальными величинами ОБЭMAX протонов (точки, слева).

На основе рассчитанной эффективности ДР для протонов была оценена их ОБЭ и сопоставлена с экспериментальными ОБЭMAX по выживаемости и частоте мутаций в клетках V79. Показано, что сложные (dsb+) и комплексные (dsb++) ДР более эффективно индуцируются протонами с энергией 400 кэВ по сравнению с 10 МэВ протонами в 5 и 9 раз, соответственно. Эти оценки хорошо согласуются с экспериментальными данными (рис.6). Остальные разновид-ности ОР и ДР качественно отличаются от экспериментальных зависимостей и не могут рассматриваться в виде показателей биологической эффективности. Выявленная значимость сложных и комплексных ДР в качестве критических повреждений согласуется с гипотезой о важной роли локальных кластеров ионизаций в структуре ДНК, Goodhead D.T. (1999), Ottolenghi M. et al. (1999), Ward J.F. (1995).

Эффективность репарационных систем на клеточном уровне может также зависеть от распределения повреждений на масштабах надмолекулярной организации ДНК в клетке. Неслучайное или кластерное распределение повреждений в хроматине может быть обусловлено высокой объемной концентрацией участков цепи ДНК при ее сворачивании в структуры высших порядков. Так, впервые предсказанное в настоящем исследовании и в работе Holley W.R. et al. (1995) неслучайное, кластерное распределение длин коротких фрагментов ДНК при воздействии тяжелых ионов нашло подтверждение в экспериментах Rydberg B. et al. (1996). На рис. 7 представлены результаты расчета распределений длин фрагментов ДНК для различных вариантов структуры хроматина, индуцированных ионами азота с ЛПЭ=98 кэВ/мкм, в сопоставлении с экспериментальным распределением, Rydberg B. et al. (1996).

Расчетные кривые показывают, что распределение коротких фрагментов зависит от параметров структуры фибриллы хроматина. Для фибриллы с меньшим числом нуклеосом на виток (5) и с бльшим шагом соленоида (22 нм) величина второго максимума уменьшается по сравнению с фибриллой с 7,4 нуклеосомами на виток и шагом соленоида 11 нм. Кроме того, положение максимума сдвигается в сторону меньших длин фрагментов и отношение второго максимума к локальному минимуму (при 500 ПО) существенно уменьшается. При этом форма теоретической кривой согласуется с наблюдаемой зависимостью в диапазоне фрагментов более 250-300 ПО.

       

Рис. 7. Расчетное и экспериментальное, Rydberg B. et al. (1996), распределения длин фрагментов ДНК индуцированных ионами азота в хроматине.

Расчеты с помощью соленоидальной модели хроматина, параметры расчета: emin = 17,5 эВ, (10,10,10) ПО.

Таким образом, расчеты показали, что распределение коротких фрагментов ДНК зависит от параметров структуры фибриллы хроматина, отражая нуклеосомный и фибриллярный уровень организации. Было доказано наличие кластеров ДР ДНК в хроматине, что согласуется с эксперименталь-ными измерениями коротких фрагментов ДНК в диапазоне до 3 тыс. ПО.

Роль мульти-петлевой интерфазной структуры ДНК была исследована при моделировании спектра фрагментов ДНК в диапазоне до 6 млн. ПО при воздействии ионов азота с ЛПЭ=125 кэВ/мкм. Для корректного сопоставления с экспериментальными данными был учтен спонтанный уровень ДР, равный 0,12 10-6 ДР/ПО, Hoglund E. et al. (2000). При моделировании воздействия трека методом Монте Карло, вначале на мишени размещались спонтанные ДР, используя для их числа распределение Пуассона с заданным средним на геном (0,71 ДР) и эмпирически подобранную зависимость положения спонтанного ДР от центра розетки. Это позволило воспроизвести экспериментальное распре-деление фрагментов, вызванных спонтанными ДР (рис. 8). Распределение радиационно-индуцированных фрагментов моделировалось при параметрах разрыва emin = 15 эВ, (10, 30, 30) ПО в рамках субобъемной модели.

Рис. 8. Расчетное и экспериментальное (Hoglung et al. 2000) распределения фрагментов ДНК, индуцированных ионами азота (ЛПЭ=125 кэВ/мкм) при воздействии на интерфазную хромосому в дозе 100 Гр.  Наблюдаемые фрагменты: (I)– эксперимент (III) – расчет. Контрольный уровень (необлученные образцы): (II) – эксперимент, (IV) – расчет.

На рис. 8 показаны расчетные и экспериментальные распределения коротких фрагментов ДНК, вызванных спонтанными и индуцированными ДР при облучении ДНК ионами азота. Ранее было показано, Pinto M. et al. (2000), что распределение наблюдаемых в опыте фрагментов ДНК не является простой суммой спонтанной и индуцированной компонент. В настоящей работе экспериментальное распределение моделировалось путем суперпозиции распределений спонтанных и индуцированных ДР на одной мишени. Рис. 8 показывает хорошее согласие экспериментального и теоретического распределений как для необлученной мишени, так и при воздействии ионов в дозе 100 Гр. В результате было установлено, что распределение фрагментов отличается от модели случайного равномерного распределения ДР по двойной спирали ДНК и зависит от ее мульти-петлевой интерфазной структуры. Наблюдаемое распределение длин фрагментов не совпадает с суммой индуци-рованной и спонтанной компонент из-за их взаимной зависимости. Выводы подтверждаются экспериментальными результатами Hoglund E. et al. (2000).

Таким образом, разработанная методика моделирования образования первичных повреждений ДНК позволяет корректно интерпретировать и планировать экспериментальные исследования спектров радиационно-индуцированных фрагментов ДНК при различных вариантах облучения.

Экспериментальные исследования показывают, что радиационно-индуцированные эффекты могут проявляться не только в облученных, но и в интактных (необлученных) клетках за счет эффекта межклеточного взаимодействия (bystander effect). Для учета этого эффекта была разработана биофизическая модель, основанная на гипотезе о диффузионном механизме распространения межклеточного сигнала (например, активного белка). Основные постулаты модели формулируются следующим образом: (1)- облученные клетки испускают межклеточные сигналы (bystander signals); (2)-сигналы диффундируют в межклеточной среде и взаимодействуют с необлученными клетками; (3)-радиус реакции сигнала с необлученной клеткой составляет примерно половину диаметра клетки-мишени; (4)- провзаимодейст-вовавшие с сигналом необлученные клетки также испускают межклеточные сигналы; (5)- наблюдаемые межклеточные эффекты (гибель клетки, трансфор-мация и т.д.) вызываются сигналами различных видов; (6)- сигналы не взаимо-действуют друг с другом; (7)- диффузией клеток-мишеней можно пренебречь.

Разработанная модель межклеточного взаимодействия была апробиро-вана на экспериментальных данных по воздействию на клетки млекопитающих среды, содержавшей облученные клетки и тяжелых ионов в геометрии широкого пучка и микропучка. Было показано, что при высоких дозах облучения тяжелыми ионами на каждую инактивированную прямым облучением клетку приходится примерно две клетки, погибшие за счет межклеточного взаимодействия. С ростом числа попаданий треков в ядро клетки (с ростом дозы) возрастает число инактивированных клеток и, следовательно, возрастает концентрация межклеточных сигналов.

Рост концентрации сигналов приводит к увеличению числа клеток, воспринявших такой сигнал, и повышению эффекта. В работе была получена оценка среднего числа межклеточных сигналов, которое может испускать клетка при облучении. Так, для γ-излучения она равна (1,2), а при воздействии -частиц с ЛПЭ=90 кэВ/мкм число сигналов может варьировать от 6 до 12. Кроме того, получена оценка массы объекта, несущего сигнал менее 10 кДа, что существенно сужает область поиска физического носителя такого сигнала.

На рис. 9 представлена рассчитанная дозовая зависимость частоты трансформированных клеток при облучении монослоя клеток широким пучком α-частиц в сопоставлении с экспериментальными данными и расчетом по модели Brenner et al. (2001). Модель межклеточного взаимодействия пред-сказывает увеличение начального наклона дозовой зависимости, что подтверж-дается в эксперименте. Такой эффект имеет важное значение для оценки радиационного риска отдаленных последствий облучения в малых дозах.

Известно, что в живой клетке радиационно-индуцированные поврежде-ния ее ядра восстанавливаются достаточно эффективно. Так, при γ-облучении соматической клетки человека в дозе 1 Гр в объеме ее ядра образуется порядка 100 000 пар ионов, что в итоге приводит, в среднем, к 500 ОР и 40 ДР ДНК. Из числа этих разрывов лишь незначительная часть, в основном, сложные, комплексные разрывы, сохраняется после процесса восстановления клетки. В том случае, когда повреждения ДНК оказываются все же нелетальными для клетки, но их репарация пошла по ошибочному пути, то в дальнейшем они могут проявляться в форме хромосомных аберраций. Помимо этого, для образования обменных аберраций необходимы дополнительные условия, в частности, разрывы ДНК должны относиться к разным хромосомам и располагаться в ядре клетки достаточно близко друг к другу и во времени и в пространстве. В итоге, при γ-облучении в дозе 1 Гр возникает в среднем всего лишь 1,5 - 2 обменные аберрации на 100 клеток, IAEA (2001).

         

Рис. 9. Частота индуцированных трансформированных клеток линии C3HT10  после воздействия широкого пучка α-частиц (ЛПЭ=90 кэВ/мкм). Экспериментальные данные Miller R.C. et al. (1999). Сплошные линии – расчет: прямое действие (пунктир), прямое и межклеточное действие (сплошная). Для сравнения приведена модель Brenner et al. (2001)

Процесс формирования хромосомных аберраций имеет вероятностную природу. Их количественными показателями являются частота встречаемости аберраций среди облучённых клеток и распределение аберраций по клеткам. Одним из наиболее эффективных методов исследования закономерностей образования аберраций является метафазный метод анализа хромосом при облучении клеток in vitro и in vivo. В настоящей работе исследование аберраций было сосредоточено, главным образом, на задачах биологической дозиметрии при достаточно высоких дозах преимущественно γ-облучения.

  1. Закономерности образования хромосомных аберраций при облучении лимфоцитов in vitro и in vivo.

Анализ радиационно-индуцированных хромосомных аберраций позволяет изучать как особенности первичного радиационного воздействия, так и возможности живой клетки восстанавливать поврежденную генетическую структуру путем репарации разрывов ДНК. Частота радиационно-индуцирован-ных хромосомных аберраций в клетках млекопитающих тесно связана с ОБЭ и, в ряде случаев, может использоваться для оценки воздействия ионизирующего излучения на отдельные органы или организм в целом, Natarajan A.T. (2002).

В настоящем работе изучалась частота спонтанных и радиационно-индуцированных аберраций в лимфоцитах крови человека. Индуцированные аберрации исследовались при облучении лимфоцитов in vitro в различных дозах и в образцах крови лиц, облучившихся в результате различных аварийных или неконтролируемых ситуаций с радиационным воздействием. Спонтанные аберрации изучались в контрольной группе из 386 человек различного пола и возраста (от 5 до 75 лет), где стандартным методом было проанализировано в сумме 243 830 метафаз для оценки частоты нестабильных аберраций и аномальных моноцентриков (АМ). В результате доля аберрантных клеток с нестабильными аберрациями хромосомного типа составила 0,24±0.01%, частота нестабильных аберраций равнялась 2,51±0.10 абер/1000кл, из них дицентриков 0,44±0,04 абер/1000 кл. При этом не было выявлено зависимости частоты дицентриков и центрических колец от пола и возраста. В этой же контрольной группе частота стабильных аберраций в форме АМ, со средним значением 0,26±0,03 абер/1000 кл, изменялась в пределах от 0,04 до 0,88 в зависимости от возраста обследованных лиц. Установлено, что регрессионная зависимость АМ от возраста имела вид: YMONO = (0,0096±0,0017)x(age), где YMONO – частота АМ на 1000 кл, (age) – возраст человека, лет.

В контрольной группе из 12 чел. мужского пола методом FISH было проанализировано в сумме 17 967 метафаз (5 857 клеточных эквивалентов) для оценки спонтанного уровня стабильных аберраций в форме полных и неполных транслокаций. Показано, что частота суммы полных и неполных транслокаций составила 8,5±1,2 абер/1000GEкл, из них полных транслокаций –  6,7±1,1 абер/1000GEкл. В силу немногочисленности группы собственную регрессионную зависимость от возраста построить не удалось. Однако полученные нами данные в отдельных возрастных группах полностью совпали с результатами работы Whitehouse C.A. et al. (2005), где возрастной контроль был исследован силами 7-ми Европейских лабораторий в группе их 385 человек и была получена зависимость спонтанной частоты транслокаций от возраста в виде: YT = (0,093±0,0017)x(age) + (0,0011±0,0002)x(age)2, где YT – частота суммы транслокаций на геном (на 1000GEкл), (age) – возраст человека, лет.

Дозовая зависимость частоты радиационно-индуцированных аберраций при облучении образцов крови доноров in vitro была выполнена при окраске стандартным методом в группе из 4 человек в возрасте от 29 до 43 лет (2 муж. и 2 жен.). Исследовалась зависимость выхода аберраций при -облучении 60Co в дозах от 0,035 до 5,0 Гр с мощностью дозы от 0,06 до 0,5 Гр/мин. В результате были получены дозовые зависимости для суммы всех нестабильных аберраций, дицентриков, суммы дицентриков и центрических колец и ацентриков. В частности, дозовая зависимость частоты дицентриков имела вид:

YDIC = (0,017±0,013) + (1,43±0,22) D + (4,16±0,13) D2,

где YDIC – частота дицентриков на 100 кл, D – доза, Гр. Кроме того, получена дозовая зависимость частоты стабильных аберраций в форме АМ в виде:

YMONO = (0,32±0,27) D + (0,25±0,07) D2,

где YMONO – частота АМ на 100 кл., D – доза, Гр. Дозовая зависимость частоты радиационно-индуцированных транслокаций при облучении образцов крови доноров in vitro  была получена методом FISH в группе из 2 человек мужского пола в возрасте 29 и 37 лет. Исследовалась зависимость индукции транслока-ций при -облучении 60Co в дозах от 0.1 до 5.0 Гр с мощностью дозы 0.5 Гр/мин. В результате была получена зависимость в виде:

YTRN =(0,67±0,25) + (4,59±1,33) D + (2,92±0,51) D2,

где YTRN – частота транслокаций на 100 кл., D – доза, Гр. Полученные регресс-сионные коэффициенты дозовых зависимостей частоты нестабильных и стабильных аберраций хорошо согласуются с результатами других авторов.                       Закономерности индукции аберраций в лимфоцитах крови при облучении in vivo в больших дозах и с высокой мощностью дозы были исследованы в группе из 73 человек (табл. 1), из них 62 человека с острым облучением имели клинические последствия в форме ОЛБ, а у 56 человек имелась официальная запись о степени тяжести ОЛБ в сопроводительных документах.

Подгруппы обследованных лиц (табл. 1) имеют следующее происхож-дение: (АЭС) – пострадавшие при аварийных ситуациях на АЭС, главным образом, при аварии на ЧАЭС; (АПЛ) – военнослужащие ВМФ РФ, получив-шие высокие дозы при радиационных авариях на борту атомных подводных лодок (в период 1961-1984 гг.); (ЯО) – сотрудники учреждений, проводивших испытания ядерного оружия, которые стали участниками нештатных ситуаций и подверглись аварийному облучению; (ИСТ) – инциденты с источниками ионизирующих излучений (нарушения техники безопасности, потеря источни-ков, их воровство и пр.); (СРКФ) – работа профессиональных дозиметристов и сотрудников предприятия «Укрытие», которые в 19871993 гг. принимали участие в исследовании разрушенного реактора внутри саркофага ЧАЭС.

Таблица 1. Подгруппы обследованных лиц при анализе индукции аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека in vivo при аварийном облучении.

Под-группа

Число лиц (пол)

Средний возраст±SE, лет*

Диапазон доз, Гр

Вид облучения

Период наблюдения

АЭС

13 (м)

34,8±2,2

1,6 8,5

γ-(137Cs, 134Cs), β

19862010 гг

АПЛ

28 (м)

23,2±0,8

0,1 4,0

γ - n - β

19852001 г

ЯО

8 (7м, 1ж )

32,3±7,9

0,7 1,2

γ - n

19962008 г

ИСТ

14 (м)

34,2±3,1

0,8 4,0

γ-(137Cs, 134Cs, 192Ir)

19752006 г

СРКФ

11 (м)

40,9±2,7

0,9 17,1

γ-(137Cs, 134Cs)

19862006 г

Всего

73 (72 м, 1ж)

31,1±1,2

0,1 17,1

γ - n - β

19752010 гг

* возраст при облучении

Цитогенетические данные обследованной группы состояли из 265 результатов анализа аберраций стандартным методом и 97 анализов методом FISH, выполненных как в острый, так и в отдаленный (до 45 лет после облучения) период. Многие люди наблюдались повторно от 2 до 15 раз. Полученные результаты позволили детально исследовать зависимости частоты аберраций при облучении in vivo от таких факторов как степень тяжести ОЛБ, поглощенная доза, время после облучения и др.

Сопоставление частоты хромосомных аберраций при облучении in vitro и in vivo позволяет выявить особенности индукции и последующего формиро-вания аберраций в соматических клетках человека. Результаты сопоставления имеют важное практическое значение, поскольку дозовые зависимости выхода аберраций хромосом после облучения in vitro нашли широкое применение в качестве калибровочных кривых для биологической дозиметрии.

Так, анализ соотношения частоты дицентриков в остром периоде в диапазоне от 5 до 500 диц/100 кл и степени тяжести ОЛБ от I до IV степени тяжести в подгруппе из 21 человека показал, что между степенью тяжести ОЛБ и частотой дицентриков имеется четкая корреляция. Для такого сопоставления были отобраны лица с данными в пределах одного месяца после аварийного облучения, преимущественно из группы (АЭС) и (ИСТ). Расположенные по возрастанию частоты дицентриков, эти результаты представлены на рис. 10. Встречающийся в двух случаях повышенный уровень дицентриков может быть следствием дополнительного внутреннего облучения от короткоживущих радионуклидов при ингаляционном, пероральном или перкутантном (через кожу) путях поступления этих радионуклидов в организм человека.

Рис. 10.  Соотношение частоты дицентриков в лимфоцитах крови облученных лиц и степени тяжести ОЛБ

Благодаря репрезентативным цитогенетическим данным удалось с хорошей статистической точностью оценить индивидуальную динамику числа аберрантных клеток в крови облучившихся лиц после облучения. Для ее описания была использована следующая двухфазная зависимость:

YAC=A0 [ c exp(-t/T1) + (1-c) exp(-t/T2) ],

где YAC – доля (%) клеток, содержащих нестабильные хромосомные  аберрации, A0 – начальная доля аберрантных клеток при t=0, T1, T2 – характерное время элиминации быстрой и медленной компонент, соответственно, "с" – доля клеток с быстрой элиминацией, t – время после облучения.

В табл. 2 приведены регрессионные коэффициенты для лиц с наиболее представительными цитогенетическими данными. Расположенные в порядке возрастания степени тяжести ОЛБ результаты демонстрируют рост начальной доли клеток и снижение времени элиминации "быстрой" фракции клеток по мере роста степени тяжести ОЛБ (c увеличением дозы). Аналогичной зависимости от дозы для времени элиминации "медленной" фракции T2 и доли клеток с быстрой элиминацией "с" не наблюдается. По сравнению с рекомендациями IAEA (2001), где характерное время "полужизни" нестабильных аберраций принято равным 3 (лет), наши результаты показывают более быструю элиминацию 90% аберрантных клеток с характерным временем в пределах 0,51,5 (лет) и последующим медленным снижением оставшихся 10% аберрантных клеток.

Таблица 2. Регрессионные коэффициенты индивидуальных зависимостей от времени доли аберрантных клеток в крови лиц с наиболее представительными цитогенетическими данными.

Обследованный человек

A0,%

T1, лет

T2, лет

с

№1 (АЭС), ОЛБ-I

11,1±1,4

5,32±0,40

-

1,0*

№8 (АЭС), ОЛБ-II

31,3±4,8

1,8±1,5

8,5±3,9

0,61±0,36

№5 (АЭС), ОЛБ-II

34,7±6,7

0,49±0,35

6,0±1,5

0,53±0,14

№7 (АЭС), ОЛБ-II

45,6±10,1

0,82±0,30

13,3±5,1

0,86±0,07

№2 (АЭС), ОЛБ-II

71,1±6,0

0,70±0,13

12,9±2,7

0,88±0,03

№3 (АЭС), ОЛБ-II

71,3±4,2

1,52±0,19

14,7±8,9

0,92±0,04

№6 (ИСТ), ОЛБ-III

49,4±7,5

0,51±0,19

12,5±2,7

0,85±0,07

№10 (АЭС), ОЛБ-III

77,0±4,1

0,55±0,09

9,0±1,3

0,87±0,02

№4 (АЭС), ОЛБ-III

69,3±4,9

0,63±0,15

6,13±0,75

0,78±0,05

№6 (АЭС), ОЛБ-III

96,7*

0,48*

12,1±6,9

0,96*

№9 (АЭС), ОЛБ-IV

100,0±0,4

0,74±0,09

10,5±2,4

0,93±0,02

  *без оценки статистической погрешности

Разновидности нестабильных аберраций в аберрантных лимфоцитах облучившихся лиц в пострадиационном периоде были исследованы в группе из 56 человек в зависимости от степени тяжести ОЛБ. Динамика среднего числа аберраций в аберрантных клетках (табл. 3) была получена в виде:

YAB = Y1 + (Y0-Y1) exp(– t/T3),

где YAB –число нестабильных хромосомных аберраций на аберрантную клетку, Y0 – начальное число аберраций; Y1 –число аберраций в отдаленном периоде; T3 – характерное время снижения числа аберраций. Анализ результатов (табл. 3) показывает, что число ацентриков и центрических колец в аберрантных клетках не зависит от времени после облучения, но увеличивается с ростом тяжести ОЛБ. Начальное число дицентриков возрастает с ростом степени тяжести ОЛБ от I до IV за счет клеток содержащих более одного дицентрика. В отдаленном периоде число дицентриков стремится к постоянной величине порядка 0,3-0,4 диц/абер.кл. Этот уровень устанавливается для подгруппы с ОЛБ-III–IV за 3,4 (лет) и примерно за вдвое большее время для подгруппы с ОЛБ–I.

Таблица 3. Коэффициенты регрессионной зависимости от времени среднего числа нестабильных аберраций в аберрантных лимфоцитах облучившихся лиц.

Данные

дацентрики

центрич. кольца

дицентрики

Y0±SE

Y0±SE

Y0±SE

Y1±SE

T3±SE

ОЛБ-I (32 чел, 78 точек)

0,56±0,03

0,09±0,01

0,74±0,03

0,26±0,03

6,16±2,37

ОЛБ-II (16 чел, 77 точек)

0,57±0,03

0,13±0,02

0,96±0,03

0,29±0,04

5,30±1,23

ОЛБ-III-IV (8 чел, 67 точек)

0,63±0,05

0,18±0,02

1,55±0,05

0,39±0,04

3,41±0,53

В настоящем исследовании установлено, что среднее число нестабильных спонтанных аберраций в аберрантных клетках равно (1,04), из них ацентрики, дицентрики и центрические кольца составляют 0,79; 0,18 и 0,07, соответственно. Следовательно, по разновидностям аберраций, содержащихся в аберрантных клетках, облучившиеся лица в отдаленном периоде отличаются от контрольной группы (табл. 3). В результате облучения среднее число радиационных маркеров оказывается в 23 раза выше в период до 40 лет после облучения. По этой причине частота дицентриков в лимфоцитах крови облучившихся лиц остается существенно выше спонтанного уровня даже при достижении такого уровня по доле аберрантных клеток.

Изменение с течением времени после облучения соотношения видов нестабильных аберраций в аберрантных клетках облучившихся лиц может являться следствием различий в способности аберраций передаваться дочерним клеткам. Известно, что наименьшей вероятностью характеризуются именно дицентрики (~50% в первом митозе), поэтому их доля с течением времени уменьшается. Однако сохраняющийся в организме облучившегося человека источник аберраций в виде облученных стволовых клеток может поддерживать повышенную частоту радиационных маркеров в соматических клетках человека длительное время после воздействия радиации.

Таким образом, показано, что пострадиационная динамика частоты нестабильных аберраций имеет двухфазный вид с быстрым спадом до 90% аберрантных клеток за 0,51,6 лет и последующим медленным снижением в течение 1020 лет. Среднее число аберраций на одну аберрантную клетку за первые 10 лет снижается от величины 1,42,4 до постоянного значения порядка (1,0), что соответствует спонтанному уровню по сумме аберраций, но не по разновидностям. Так, без облучения в аберрантных клетках доля дицентриков составляет 18%, а в облученных аберрантных клетках - вначале 5070%, а затем снижается до 30% в отдаленном периоде. Поэтому частота радиационных маркеров превышает спонтанный уровень до 4050 лет после облучения.

При изучении динамики транслокаций в лимфоцитах облучившихся лиц  возникают вопросы: “Снижается ли частота транслокаций со временем или она выходит на плато? Если плато существует, то в течение какого времени оно сохраняется и зависит ли эта частота транслокаций от дозы облучения?” Ответы были найдены путем анализа результатов обследования методом FISH, итоги которого представлены в табл. 4. Динамика транслокаций имела вид: 

YTR=Y1 + (Y0 – Y1) exp(-t/T4),

где YTR– частота трансл/100GEкл, Y0– начальная частота, Y1–частота в отдален-ном периоде, T4 – характерное время снижения частоты транслокаций.

Таблица 4. Коэффициенты регрессионной зависимости от времени частоты транслокаций (tc+ti) /100GEкл в лимфоцитах крови облучившихся лиц.

Данные

Параметры динамики транслокаций

Y0±SE

Y1±SE

T4±SE

ОЛБ-I (29 чел, 36 точек)

22,9±2,2

2,80±0,89

7,76±2,34

ОЛБ-II (14 чел, 23 точки)

46,6±3,8

8,45±0,88

6,17±0,87

ОЛБ-III (7 чел, 18 точек)

176,0±1,5*

23,7±0,9

1,23±0,23

ОЛБ-IV (1 чел,  3 точки)

-

-

-

*оценка экстраполяцией на начальное время

На рис. 11 представлена динамика частоты транслокаций в лимфоцитах крови облучившихся лиц. Анализ результатов (рис. 11) показывает, что как начальная частота, так и частота транслокаций в отдаленном периоде возрастают с ростом степени тяжести ОЛБ. Во всех подгруппах получена качественно одинаковая динамика с характерным временем снижения в пределах 1,27,8 лет. Для подгрупп c ОЛБ II–IV частоты транслокаций выше спонтанного уровня вплоть до 50 лет после облучения. В подгруппе с ОЛБ–I эта частота превышает спонтанный уровень только в первые 20 лет после облучения. Кратность снижения с течением времени частоты транслокаций (Y1/Y0) составляет 0,12; 0,18; и 0,13 для трех групп, соответственно.

Для исследования возможности оценки частоты транслокаций путем подсчета АМ стандартным методом была проанализирована динамика АМ, которая показала схожие с транслокациями результаты (табл. 5). Так, начальная частота АМ и их частота в отдаленном периоде  возрастают с ростом степени тяжести ОЛБ. Во всех подгруппах наблюдается качественно одинаковая динамика с характерным временем снижения в диапазоне от 3 до 11 лет.

Рис. 11. Зависимость от времени после облучения частоты наблюдаемых транслокаций в лимфоцитах крови облучившихся лиц с разной степенью тяжести ОЛБ. Точки – индивидуальные данные, сплошные линии – регрессионные зависимости (табл. 4). Пунктирная линия - соответствующий спонтанный уровень.

Таблица 5. Коэффициенты регрессионной зависимости от времени частоты аномальных моноцентриков (АМ) в лимфоцитах крови облучившихся лиц

Данные

Параметры динамики АМ

Y0±SE

Y1±SE

T4±SE

ОЛБ-I (32 чел, 62 точки)

2,29±0,30

0,46±0,06

3,04±1,02

ОЛБ-II (16 чел, 77 точек)

5,57±0,65

1,38±0,85

9,9±6,3

ОЛБ-III (7 чел, 55 точек)

8,57±1,34

4,29±2,0

10,7±15,6

ОЛБ-IV (1 чел, 11 точек)

-

-

-

В подгруппе с ОЛБ–I существенное превышение спонтанного уровня наблюдается только в первые 10 лет после облучения. Сопоставление регрессионных зависимостей частоты транслокаций и АМ показало, что в остром периоде частота АМ составляла 10–12% от уровня транслокаций в группах ОЛБ–I, ОЛБ–II и 5% в группе ОЛБ–III. В отдаленном периоде это соотношение составило в среднем 18% по всем подгруппам.

Таким образом, динамика частоты стабильных аберраций в виде транслокаций и АМ была проанализирована в период до 45 лет после облучения. Показано, что после первых 10 лет частота индуцированных транслокаций падает до 12–18 % от первоначального уровня, оставаясь затем неизменной вплоть до 45–50 лет. Похожие закономерности были выявлены и для АМ, частота которых была примерно в 10 раз меньше, чем частота транслокаций. В целом наблюдалась очевидная корреляция степени тяжести ОЛБ облучившихся лиц с динамикой стабильных аберраций, но она была менее четкой, чем с частотой дицентриков в острый период (рис. 11).

Основной причиной снижения частоты стабильных аберраций в первые годы после облучения является элиминация нестабильных клеток. Как показано выше, элиминация основной доли нестабильных клеток происходит достаточно быстро, за время порядка 0,51,6 лет, в то время как снижение частоты стабильных аберраций за такое время наблюдалось только у лиц с дозой на все тело свыше 4 Гр (ОЛБ III–IV), а при меньших дозах частота стабильных аберраций снижалась гораздо медленнее, за 68 лет. Это означает, что при дозах на все тело менее 4 Гр (ОЛБ I–II) в течение первых 68 лет, наряду с элиминацией лимфоцитов, содержащих стабильные аберрации, идет процесс поступления таких клеток в периферическую кровь за счет процесса пролиферации из облученных стволовых клеток. С течением времени, когда элиминируют все первично облученные лимфоциты, поступление клеток, содержащих транслокации. стабилизируется, приводя к независящей от времени частоте транслокаций в лимфоцитах периферической крови.

  1. Совершенствование методов биологической дозиметрии по цитогенетическим показателям.

Сочетание свойств лимфоцитов крови человека и метода их культивирования явилось основой т.н. «золотого стандарта» биодозиметрии, IAEA (2001). При этом соотношение индуцированного и спонтанного уровней аберраций (радиационных маркеров) определяет пределы применимости цитогенетического метода, Alexander G.A. et al. (2007). Для биодозиметрии в остром периоде используют дицентрики, центрические кольца, транслокации, а также ацентрические парные фрагменты, IAEA (2001). Для ретроспективной биодозиметрии в отдаленном периоде рассматриваются полные и неполные транслокации, выявляемые методом FISH. Ключевой проблемой при этом остается выбор калибровочной кривой для вычисления дозы по частоте транслокаций, выявляемых в отдаленном периоде. Точность биодозиметрии на основе транслокаций во многом зависит от погрешности при оценке линейного коэффициента дозовой зависимости и корректного учета спонтанного уровня аберраций, Simon S. et al. (2007).

Рис. 12. Изменение относительной частоты дицентриков  (A) и величины Qdr  (Б) с течением времени после облучения. Точки - индивидуальные показатели (11 чел., 111 точек), сплошные линии – регрессионные зависимости, пунктир 95% доверительный интервал. Регрессионные формулы-

(A):

Y=0.84 exp(-t/0.74) + 0.16 exp(-t/7.6))

(Б):

Y = 0.545 + 0.455 exp(-t/0.79))

В настоящей работе был исследован фактор индивидуальной радиацион-ной чувствительности человека для уточнении области применимости известных методов на основе нестабильных аберраций для ретроспективной дозиметрии. Для этого был выполнен анализ динамики частоты дицентриков и величины Qdr (число дицентриков и центрических колец на аберрантную клетку) у облучившихся лиц. На рис. 12 показаны относительная частота дицентриков и величина Qdr в зависимости от времени после облучения. По ординате отложены зависимости отношения этих величин на время t к показателю, который был получен у того же человека сразу после облучения.

В результате установлено, что уже через год после облучения частота дицентриков и величина Qdr снижаются в среднем на 65% и 35%, соответственно. Такое изменение указывает на неприемлемость этих показателей для ретроспективной биологической дозиметрии. Очевидно, что допустимый временной интервал между облучением и взятием образцов крови может составлять не более 4 месяцев. Из представленных данных следует, что средняя величина Qdr вначале снижается, но по истечении примерно 5 лет выходит на плато, которое проявляется статистически достоверно в пределах 95% интервалов (рис.12). Чтобы изменение величины Qdr с течением времени не искажало оценку дозы, необходимо вносить повышающую поправку в этот показатель, если он получен в период свыше 5 мес. после облучения. Такая поправка составляет от 30% до 50% при взятии образцов крови на анализ в период от 1 года до 10 лет после облучения, соответственно (рис.12).

Для уточнения применимости метода транслокаций в ретроспективной биологической дозиметрии были использованы результаты анализа динамики частоты индуцированных транслокаций в отдаленном пострадиационном периоде. Как известно, индуцированные и наблюдаемые транслокации различаются за счет зависящей от возраста человека частоты спонтанных аберраций. Так, анализ индуцированной компоненты показал снижение частоты транслокаций за первые 5 лет после облучения до постоянного уровня, который существенно не менялся в течение 30 лет. Этот постоянный уровень зависел от поглощенной дозы на все тело и снижался по отношению к начальному значению до 43% при дозах менее 4,7 Гр и до 23% для бльших доз. Характерное время снижения частоты индуцированных транслокаций зависело от дозы, убывая с 4,4 до 1,4 (лет) с ростом дозы от 1 до 7 Гр.

Оцененные параметры динамики частоты индуцированных транслокаций позволяют предложить способ корректировки калибровочной дозовой зависимости. Необходимость корректировки калибровочной in vitro дозовой зависимости, с целью использования частоты транслокаций для ретроспектив-ной биодозиметрии, является актуальной научной задачей, Duran A. et al. (2009). В настоящей работе предложен метод корректировки, основанный на обобщении индивидуальных цитогенетических данных облучившихся лиц, у которых брались образцы крови как в ранний, так и в отдаленный периоды. Начальная частота дицентриков позволила вычислить поглощенную дозу, а прослеженная в пострадиационном периоде динамика частоты транслокаций - внести поправки в in vitro калибровочную зависимость для корректного вычисления дозы по частоте транслокаций, выявляемых в отдаленном периоде.

В качестве калибровочной зависимости на начальное время (острый период, t=0, рис. 13) была использована in vitro дозовая зависимость суммы полных и неполных индуцированных транслокаций, которая была получена в настоящей работе путем вычитания из наблюдаемой в эксперименте частоты транслокаций соответствующего возрастного контроля. Калибровочные дозо-вые зависимости на время t>0 были получены с использованием динамики индуцированных транслокаций в соответствующих дозовых группах. За счет внесения подобных поправок в in vitro калибровочную кривую предложен способ устранить смещенную оценку при вычислении дозы, которая приводит к существенному занижению индивидуальных поглощенных доз (рис.13).

Следует отметить, что в литературе предлагаются альтернативные методы корректировки. Так, в работах Finnon P. et al. (1999), Edwards A.A. et al. (2005), Simon S.L. et al. (2007) предложен метод построения дозовой зависимости путем подсчете транслокаций только в стабильных клетках. Предполагается, что стабильные клетки свободно проходят цикл деления и поддерживают частоту индуцированных в них транслокаций на постоянном уровне. Данная гипотеза правомерна с теоретической точки зрения, однако не получила статистически представительного подтверждения на данных in vivo. Тем не менее, предложенный метод успешно применяется на практике при оценке доз облучения менее 3 Гр, Lloyd D.C. et al. (1998), Edwards A.A. (2007).

Рис. 13. Калибровочные дозовые зависимости частоты индуцированных транслокаций (tc+ti)/100GE кл для ретроспективной биологической дозиметрии с учетом поправки на время после облучения.

Необходимо учитывать, что для применения метода анализа стабильных клеток требуется анализировать аберрации на всех хромосомах с применением панцентромерных проб. Для выполнения небольшого числа прецизионных биодозиметрических исследований метод стабильных клеток с панцентро-мерным мечением является, безусловно, предпочтительным. Однако и использованный в настоящей работе более простой и относительно дешевый метод FISH с анализом лишь 3-х хромосом и корректировкой калибровочной кривой вполне может применяться при массовом скрининговом обследовании без существенной потери точности при оценке дозы. Показано, что с учетом всей совокупности погрешностей, влияющих на ретроспективную оценку дозы по частоте транслокаций, оба подхода имеют сопоставимую точность. Более простой метод позволяет повысить эффективность анализа и снизить его стоимость при сохранении точности в оценке дозы, Stronati L. et a. (2001).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для стохастических эффектов характерно отсутствие пороговой дозы, а также отсутствие зависимости степени тяжести эффекта от дозы по правилу «все или ничего». Типичными примерами стохастических эффектов являются механизмы канцерогенеза и индукция мутаций в половых и соматических клетках. Причиной стохастических эффектов могут быть повреждения ДНК в одной или нескольких клетках, в то время как для детерминистского эффекта требуется повреждение не менее определенного числа клеток. Особенность воздействия радиации на ДНК состоит в повреждении нуклеотидов, сахаро-фосфатного остова и присоединенных к ДНК белков. Потеря или изменения в генетической информации ДНК напрямую связаны с изменением клоногенного потенциала соматических клеток. Одним из основных видов последствий воздействия радиации на ДНК являются структурные изменения хромосом, которые, в отличие от генных мутаций, визуально видны в метафазе. Поэтому для проявления радиационных повреждений генома клетка должна сохранять способность к делению, т.е. иметь клоногенный потенциал.

В настоящей работе первичные повреждения ДНК, возникающие при воздействии ионизирующей радиации с различной ЛПЭ, были исследованы при помощи разработанной биофизической модели. Эта модель использует стохастическую структуру трека и пространственную структуру ДНК, включая нуклеосомномный, фибриллярный и доменный уровень ее организации. Модель позволяет выполнять стохастическое моделирование физической и радиационно-химической стадий, а также расчет абсолютных значений эффективности индукции первичных повреждений в клетке, субклеточных структурах и ДНК в различных формах ее организации.

Воздействие радиации на лимфоциты крови человека изучались по частоте хромосомных аберраций, индуцированных в результате облучения образцов крови in vitro. Стандартным методом окрашивания и методом FISH была получена дозовая зависимость частоты радиационно-индуцированных аберраций стабильного и нестабильного типа в клетках первого деления. Частота спонтанно возникающих аберраций исследовалась на образцах крови контрольных лиц, не подвергавшихся радиационному воздействию.

Закономерности образования хромосомных аберраций в соматических клетках человека при облучении in vitro и in vivo были изучены путем анализа результатов цитогенетического обследования лиц, облучившихся при радиационных авариях. Основное внимание при этом уделялось частоте аберраций хромосом в отдаленном пострадиационном периоде. Динамика различных типов аберраций показала их способность передаваться в поколениях делящихся соматических клеток. Выявленные закономерности динамики аберраций позволили внести ряд уточнений в методику ретроспективной биологической дозиметрии, основной на цитогенетических показателях.

ВЫВОДЫ

  1. Установлено, что при воздействии тяжёлых ионов фрагментация ДНК зависит от структуры фибриллы хроматина за счёт кластеризации двойных разрывов, что отражается на спектре фрагментов ДНК. При анализе распределения фрагментов ДНК с целью оценки числа двойных разрывов необходимо учитывать неслучайный характер распределения первичных повреждений, обусловленный пространственной конфигурацией хроматина.
  2. Показано, что 30-40% радиационно-индуцированных разрывов ДНК в клетке вызваны косвенным действием свободных радикалов - продуктов радиолиза воды.
  3. Установлено, что наблюдаемые при касательном воздействии тяжёлых ионов на сферическую чувствительную область аномально большие события поглощения энергии вызваны вкладом вторичных -электронов.
  4. Показано, что наблюдаемый на клеточном уровне эффект "свидетеля" объясняется взаимодействием облученных и интактных клеток посредством межклеточного сигнала, который распространяется по законам диффузии.
  5. Показано, что частота дицентриков в лимфоцитах крови человека в диапазоне от 5 до 500 диц/100 кл после общего облучения позволяет представить достоверный прогноз последующего развития острой лучевой болезни со степенью тяжести от I до IV.
  6. Установлено, что при общем остром облучении человека доля радиационных маркеров в аберрантных клетках сохраняется на повышенном уровне в течение более 40 лет после облучения, что позволяет осуществлять ретроспективную индикацию облучения по частоте дицентриков в отдаленном пострадиационном периоде.
  7. Установлено, что при общем остром облучении человека в дозах свыше 1 Гр частота транслокаций снижается за первые 10 лет после облучения до 12–18% от первоначальной величины, а затем остается постоянной в течение последующих 3540 лет.
  8. Показано, что при длительном фракционированном общем облучении человека с высокой мощностью дозы в суммарных дозах от 1 до 17 Гр при работе в саркофаге ЧАЭС, частота как дицентриков, так и транслокаций в лимфоцитах крови линейно зависит от дозы. После прекращения работ частота дицентриков быстро спадает за 23 года до 1015% от первоначальной величины, а частота транслокаций остаётся на постоянном уровне в течение, как минимум, 10 лет после облучения.
  9. Доказано, что дозовая зависимость выхода транслокаций при облучении лимфоцитов in vitro не пригодна в качестве калибровочной кривой для ретроспективной биологической дозиметрии. Она должна быть скорректирована с учётом пострадиационной динамики частоты транслока-ций в лимфоцитах крови облучившихся лиц.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Хвостунов И.К., Чепель В.Ю., Андреев С.Г. Моделирование косвенного действия на ДНК радиации с низкой ЛПЭ //Сборник Трудов VII Совещания стран СНГ по микродозиметрии и школы «Фундаментальные и прикладные аспекты радиационных исследований», Суздаль, 15-20 ноября 1992.– М, 1993.– часть I.– С.107-125.
  2. Chepel V.Yu., Khvostunov I.K., Mirny L.A., Talyzina T.A., Andreev S.G. 3D Computer model of chromatin fibre for radiation damage simulation //Radiation Protection Dosimetry.– 1994.– V.52.– № 1-4.– P.256-263.
  3. Khvostunov I.K., Andreev S.G., Pitkevich V.A., Chepel V.Yu. Novel algorithm for analysis of DNA and chromatin damage induced by ionising with different quality //10th International Congress of Radiation Research, August 27- September 1, 1995 Wurzburg, Germany: Proceedings of Congress: Congress Lectures / Ed. by U. Hagen, D. Harder, H. Jung, C.S. Streffer.– 1995.– V.2.– P.254-257.
  4. Khvostunov I.K., Andreev S.G. Microdosimetric distributions for target volumes of complex topology //Proceedings of 12th Symposium on Microdosimetry Sept. 29- Oct. 4, 1996 Oxford, UK.– Oxford, 1997.- V.2.- P.47-50.
  5. Andreev S.G., Khvostunov I.K., Spitkovsky V.A. et al. Dependence of DNA break clustering in chromatin fibre on radiation quality//Proceedings of 12th Symposium on Microdosimetry Sept. 29-Oct. 4, 1996 Oxford, UK.–Oxford, 1997.-V.2.- P.133-136.
  6. Андреев С.Г., Хвостунов И.К., Спитковский Д.М., Талызина Т.А. Биофизическое моделирование радиационных повреждений ДНК и хроматина, индуцированных излучением разного качества //Радиационная биология. Радиоэкология.–1997.– Т.37.–№ 4.– С.533-538.
  7. Nikjoo H., Uehara S., Khvostunov I.K., Cucinotta F.A. Track structure in molecular radiation biology. Advanced Monte Carlo for Radiation Physics, Particle Transport Simulation and Applications //Proceedings of the Monte Carlo 2000 Conference, Lisbon, 23-26 October 2000.- P.251-260.
  8. Хвостунов И.К. Оценка последствий воздействия малых доз радиации на уровне молекул ДНК методом биофизического моделирования //Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук.– Калуга: Эйдос, 2000.– Вып.1.- С.290-306.
  9. Sevan’kaev A.V., Khvostunov I.K., Mikhailova G.F. et al. Novel data set for retrospecttive biodosimetry using both conventional and FISH chromosome analysis after accidenttal overexposure //Applied Radiation and Isotopes.– 2000.– V.52.– №5.– P.1149-1152.
  10. Nikjoo H., Uehara S., Khvostunov I.K., Cucinotta F.A., Goodhead D.T. Monte Carlo track structure for radiation biology and space applications //Physica Medica.– 2001.– V.17.– №1(Suppl.).– P.38-44.
  11. Колганов А.В., Филин С.В., Баранов А.Е., Надежина Н.М., Бушма-нов А.Ю., Галстян И.А., Гордеева А.А., Гусев И.А, Гуськов А.К., Иванова Е.Ю., Каширина О.Г., Нугис В.Ю., Потетня О.И., Севанькаев А.В., Хвостунов И.К., Яценко В.Н. Три случая острого радиационного поражения человека от гамма-источника (иридий-192): реконструкция дозы и клиническая картина // Медицинская радиология и радиационная безопасность.– 2002.– Т.47.– №2.– С.34-45.
  12. Nikjoo H., Khvostunov I. K., Cucinotta F. A. The response of (TEPC) proportional counters to heavy ions //Radiation Research.–2002.–V.157.–P.435-445.
  13. Khvostunov I.K, Andreev S.G., Eidelman Yu.A. Biophysical analysis of radiation induced initial DNA fragmentation // Radiation Protection Dosimetry.– 2002.– V.99.– №1-4.– P.151-152.
  14. Sevan'kaev A.V., Lloyd D.C., Edwards A.A., Moquet J.E., Nugis V.Yu., Mikhailova G.F., Potetnya O.I, Khvostunov I.K. et al. Cytogenetic investigations of serious overexposures to an industrial -radiography source //Radiation Protection Dosimetry.– 2002.– V.102.– P.201-206.
  15. Khvostunov I K, and Nikjoo H. Computer modelling of radiation-induced bystander effect //J. Radiol. Prot.– 2002.– V.22.– №3A.– P.A33-A37.
  16. Севанькаев А.В., Потетня О.И., Михайлова Г.Ф., Хвостунов И.К. и др. Частота цитогенетических нарушений в лимфоцитах периферической крови у жителей Орловской области, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях после Чернобыльской аварии //Бюллетень Национального радиационно-эпидемиологического регистра «Радиация и риск».– 2003.– Спец. вып.– С.87-95.
  17. Андреев С.Г., Эйдельман Ю.А., Хвостунов И.К. и др. Радиационные повреждения генетических структур клетки. Экспериментальные данные и результаты моделирования //Лекции школы по радиационной биологии в «Галактике» /Под ред. д.б.н. проф. А.С. Саенко.- Обнинск: МРНЦ РАМН, 2003.- С.7-39.
  18. Хвостунов И.К. Микродозиметрические аспекты в биофизическом моделировании биологического действия малых доз радиации //Лекции школы по радиационной биологии в «Галактике» /Под ред. д.б.н. проф. А.С. Саенко.– Обнинск: МРНЦ РАМН, 2003. - С.184-204.
  19. Nikjoo H., Khvostunov I.K. Biophysical model of the radiation-induced bystander effect //International Journal of Radiation Biology.– 2003.– V.79.– №1.– P.43-52.
  20. Севанькаев А.В., Голуб Е.В., Хвостунов И.К. и др. Ретроспективная оценка доз в отдаленный пострадиационный период различными биологическими методами //Радиационная биология. Радиоэкология. – 2004.– Т.44.– №6.– С. 637-652.
  21. Галстян И.А., Илевич Ю.Р., Клещенко Е.Д., Михайлова Г.Ф., Надежина Н.М, Нугис В.Ю., Севанькаев А.В., Хвостунов И.К. Возможности ретроспективного определения дозы при лучевых поражениях //Медицинская радиология и радиационная безопасность.– 2004.– Т.49.– №5.– С.5-13.
  22. Nikjoo H., Khvostunov I.K. A theoretical approach to the role and critical issues associated with bystander effect in risk estimation //Human and Experimental Toxicology.– 2004.– V.23.– №2.– P.81-86.
  23. Sevan’kaev A.V., Lloyd D.C., Edwards A.A., Khvostunov I.K. et al. A cytogenetic follow-up of some highly irradiated victims of Chernobyl accident // Radiation Protection Dosimetry.– 2005.–V.113.– № 2.– P.152-161.
  24. Андреев С.Г., Эйдельман Ю.А., Хвостунов И.К. и др. Биофизическое моделирование радиационных повреждений генетических структур клетки // Радиационная биология. Радиоэкология.– 2005.– Т.45.– №5.– С.549-560.
  25. Севанькаев А.В., Шкаврова Т.Г., Потетня О.И., Михайлова Г.Ф., Цепенко В.В., Голуб Е.В., Хвостунов И.К. и др. Сравнительное исследование структурных и генных соматических мутаций у работников ядерно-химических предприятий. 1. Исследование нестабильных и стабильных хромосомных аберраций //Радиационная биология. Радиоэкология. – 2005.– Т.45.– №2.– С.149-161.
  26. Севанькаев А.В., Михайлова Г.Ф., Потетня О.И., Цепенко В.В., Хвостунов И.К. и др. Результаты динамического цитогенетического наблюдения за детьми и подростками, проживающими на радиоактивно-загрязненных территориях после Чернобыльской аварии //Радиационная биология. Радиоэкология.– 2005.– Т.45.– №1.– С.5-15.
  27. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф., Ушенкова Л.Н., Надежина Н.М., Раева Н.Ф., Севанькаев А.В., Хвостунов И.К. Сопоставление молекулярно-биохимических и цитогенетических характеристик клеток периферической крови у людей в отдаленный период после воздействия ионизирующей радиации в клинически значимых дозах //Радиационная биология. Радиоэкология.– 2006.– Т.46.–№4.–С.393-409.
  28. Севанькаев А.В., Замулаева И.А., Михайлова Г.Ф., Потетня О.И., Цепенко В.В., Хвостунов И.К. и др. Сравнительный анализ генных и структурных соматических мутаций у жителей загрязненных радионуклидами районов Орловской области после аварии на ЧАЭС //Радиационная биология. Радиоэкология. – 2006.– Т.46.– №3.– С.315-321.
  29. Andreev S.G., Eidelman Y.A., Salnikov I.V., Khvostunov I.K. Mechanistic modelling of genetic and epigenetic events in radiation carcinogenesis //Radiation Protection Dosimetry.– 2006.– V.122.– №1-4.– P.335-339.
  30. Sevan’kaev A., Khvostunov I., David Lloyd D. et al. The suitability of FISH chromosome painting and ESR-spectroscopy of tooth enamel assays for retrospective dose reconstruction //Journal of Radiation Research.– 2006.– V.47.– №A (Suppl.).– Р.A75-A80.
  31. Nikjoo H. and Khvostunov I.K. Modeling of radiation-induced bystander effect at low LET //Int. J. Low Radiation.– 2006.– V.3.– №2-3.– P.143-158.
  32. Sevan’kaev A.V., Khvostunov I.K., Lloyd D.C. et al. The chromosomal aberration assay for biological dosimetry a long time after exposure // Чернобыльские чтения-2008. Материалы международной научно-практической конференции, Гомель, 24-25 апреля 2008.- Гомель: Сож, 2008.- С.248-253.
  33. Khvostunov I.K., Nikjoo H., Uehara S., Hoshi M. The consideration of biological effectiveness of low energy protons using biophysical modeling of the effects induced by exposure of V79 cells //Радиационная биология. Радиоэкология. – 2010.– Т.50.– №1.– C.81-89.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.