WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

ХОЛМУХАМЕДОВ Эхсон Лукманович

Роль митохондрий в обеспечении нормальной жизнедеятельности и выживания клеток млекопитающих

03.00.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПУЩИНО 2008

Работа выполнена: в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, Пущино Российская Федерация и в Университете Северной Каролины, Чапел Хил США (University of North Carolina at Chapel Hill, NC USA)

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Виноградов Андрей Дмитриевич Доктор биологических наук Маевский Евгений Ильич Доктор биологических наук Зоров Дмитрий Борисович

Ведущая организация: Институт Биофизики Клетки РАН

Защита диссертации состоится “_17_”___сентября____2008 г. в “_15-30_” часов на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу:

142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан “_____”______________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физ.-мат. наук Ланина Н.Ф.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Митохондрии являются важнейшими внутриклеточными структурами, определяющими судьбы клеток млекопитающих в норме и при патологии. Большое разнообразие патологических условий - аноксия, ишемия, геморрагический шок или окисление этанола, сопровождается глобальной потерей митохондриальных функций. Это выражается в неспособности митохондрий поддерживать электрохимический градиент ионов водорода на внутренней мембране, с потерей способности эффективно осуществлять окислительное фосфорилирование, производство АТФ и сбалансированный митохондриальный Ca2+ ионный гомеостаз, несмотря на наличие кислорода, и субстратов окисления. Изучение роли митохондрий в жизнедеятельности клеток млекопитающих осложнено множественностью функций выполняемых митохондриями и переплетением внутриклеточных и внешних факторов, определяющих взаимодействие между митохондриями и остальными внутриклеточными структурами. Многочисленные экспериментальные данные указывают на то, что митохондрии являются первичными мишенями патологических воздействий, которые в большинстве случаев обусловлены нарушениями внутриклеточного Ca2+ баланса. Кроме хорошо известной роли митохондрий как основного производителя АТФ, универсальной внутриклеточной энергетической “валюты”, митохондрии также принимают непосредственное участие в регуляции свободной концентрации клеточного Ca2+, исполняя роль внутриклеточного кальциевого депо с низким сродством, которое по своей емкости далеко превосходит емкости эндо - и/или саркоплазматического ретикулумов. В нормальной, покоящейся клетке, митохондрии, окруженные цитоплазмой с низкой концентрацией ионов Ca2+, находятся в стационарном состоянии умеренного покоя, так как концентрация свободного Ca2+ существенно ниже сродства митохондриальной Ca2+ транспортирующей системы митохондрий.

Однако при переходных процессах, когда концентрация ионов Ca2+ в цитоплазме значительно возрастает (особенно это касается областей, заключенных между эндоплазматическим ретикулумом и собственно митохондриями), митохондрии оказываются окруженными высокой концентрацией свободных ионов Ca2+, что способствует накоплению значительных количеств ионов Ca2+ в матрикс. В этих условиях количество и концентрация ионов Ca2+ в матриксе митохондрий оказывается уже достаточным для индукции изменений состояния митохондрий:

увеличению производства АТФ, генерации кислородных радикалов, активации неспецифической поры в мембране митохондрий, набуханию и разрыву внешней мембраны митохондрий. Т.о. митохондриальный транспорт Ca2+, в зависимости от количества накопленного Ca2+, определяет судьбу клеток млекопитающих от нормального функционирования до программируемой или некротической, клеточной гибели. При ишемическом повреждении сердечной мышцы, эта способность митохондрий накапливать и освобождать ионы Ca2+ определяет степень пост-ишемического повреждения сердечной мышцы. В период ишемии, когда из-за закупорки коронарных сосудов подача кислорода и метаболитов к клеткам сердечной мышцы ограничена, активность митохондриальной дыхательной цепи подавлена и митохондриальная мембрана деполяризована.

При этом накопления ионов Ca2+ в митохондриях не происходит и никаких внешних проявлений повреждений тканей не наблюдается. Наиболее резкие нарушения структуры и функции митохондрий и клеток наблюдаются после восстановления протока свежей крови через закупоренные коронарные сосуды, которое приводит к подаче кислорода и метаболитов к ишемической ткани и удалению продуктов метаболизма. По-видимому, поступление кислорода к анаэробным митохондриям с высоким уровнем восстановленности участников дыхательной цепи и переноса электронов, сопровождающееся быстрым восстановлением митохондриального мембранного потенциала, приводит к значительному и интенсивному накоплению ионов Ca2+ в матрикс. Повреждающее действие избыточного накопления ионов Ca2+ усиливается в условиях повышенного окислительного стресса, которое наблюдается при окислении многих ксенобиотиков, включая окисление этанола, в клетках печени. Различные патофизиологические условия, приводящие к повреждению митохондриальных функций, т.о. оказываются обусловленными избыточным накоплением ионов Ca2+ в митохондриях, которое приводит к открыванию неспецифической поры и потере важнейших митохондриальных функций. Следовательно, для понимания механизмов токсического действия ионов Ca2+ на функции митохондрий, необходимо исследовать динамику этих ионов в клетках и определить взаимодействие этих ионов с митохондриями на различных уровнях - на выделенных митохондриях, на клеточных культурах и на целом органе. Такой подход позволит нам понять следующее: а) роль и участие митохондрий в поддержании нормальной жизнедеятельности клеток млекопитающих; б) выяснить путем экспериментального и теоретического изучения, роль митохондрий в определении динамики свободной концентрации цитоплазматического Ca2+; в) изучить механизм защитной роли и необходимости «умеренной» деполяризации митохондрий в пост-ишемическом периоде восстановления кровотока/перфузии в сердечной мышце и г) продемонстрировать, что нормальный обмен метаболитами между митохондриями и клеткой, является необходимым условием защиты от токсического действия ксенобиотиков, путем уменьшения Ca2+ стресса. Т.о.

изучение роли транспорта ионов Ca2+ в митохондриях тканей сердца и печени позволит выявить факторы, которые являются определяющими в потере митохондриальных функций в механизмах повреждающего действия различных патофизиологических состояний, и использовать полученные данные для разработки методологических и терапевтических подходов для защиты этих органов. Эти исследования позволят также произвести разработку методологических подходов к уменьшению и последующему лечению последствий ишемического и/или алкогольного повреждения тканей сердца и печени.

Цель работы: 1. Выяснить последствия взаимодействия ионов Ca2+ с основными митохондриальными функциями и определить факторы, активирующие неспецифическую Ca2+-зависимую пору во внутренней мембране митохондрий. 2. Разработать математическую модель митохондриального ионного транспорта, основанную на регуляции проницаемости внутренней мембраны митохондрий этой Ca2+-зависимой порой, которая активируется потоками ионов H+, Ca2+, K+, объемом матрикса, а также митохондриальным мембранным потенциалом. 3. Получить экспериментальные доказательства участия энергозависимого транспорта Ca2+ в митохондриях в определении внутриклеточной динамики свободного Ca2+, включая генерацию, распространение и синхронизацию волн свободной концентрации в цитоплазме. 4.

На ишемической модели изолированного сердца крысы, определить роль митохондриального транспорта Ca2+ в механизме пост-ишемического повреждения сердечной мышцы. 5. Выявить митохондриальный механизм защитного действия противоишемических фармакологических агентов, таких как диазоксид и пинацидил, известных как фармакологические активаторы АТФзависимых K+ каналов (КАТФ) плазматической мембраны. 6. На модели изолированных гепатоцитов крыс, проанализировать гипотезу, что причиной глобальной потери митохондриальных функций при отравлении печени алкоголем, является закрывание пориновых каналов. 7. Разработать подходы к экспериментальному измерению проницаемости пориновых каналов во внешней мембране внутриклеточных митохондрий без их выделения из гепатоцитов. 8.

Определить какой из продуктов окисления этанола (NADH, кислородные радикалы, ацетальдегид и/или ацетат) играет существенную роль в механизме закрывания и способствует закрыванию митохондриальных пориновых каналов. 9.

Исследовать роль закрывания пориновых каналов и уменьшения проницаемости внешней мембраны митохондрий к водорастворимым метаболитам в синтезе мочевины. 10. Используя С-ЯМР спектроскопию определить влияние этанола и закрывания пориновых каналов на митохондриальный метаболизм глицина и серина, являющегося составной частью системы синтеза и обмена метильных групп в гепатоцитах. 11. Определить эффект закрывания пориновых каналов на цитотоксичность лекарственных препаратов на примере адафостина, известного адафостина, известного противоопухолевого препарата.

Научная новизна работы. Разработана первая полная теоретическая модель энергозависимого транспорта ионов в митохондриях с учетом активации Ca2+зависимой неспецифической поры, которая воспроизводит все экспериментально наблюдаемые режимы ионного транспорта, включая колебания ионных потоков.

Впервые показано, в эксперименте и на модели, наличие Ca2+-индуцированного выброса Ca2+ в митохондриях, нового явления, лежащего в основе «возбудимости» митохондриальной популяции. Получены экспериментальные данные о синхронизирующей роли энергозависимого митохондриального транспорта Ca2+ на амплитуду и скорость распространения концентрационных волн ионов Ca2+ в цитоплазме живых клеток. Показано, что энергозависимый транспорт Ca2+, а также Ca2+-индуцированный выброс Ca2+ в митохондриях является составной частью механизма усиления внутриклеточных Ca2+ сигналов, необходимого для генерации, поддержания и синхронизации распространяющихся волн свободного Ca2+ в цитоплазме клеток. В развитие этих представлений, далее прослежен механизм защитного действия противоишемических фармакологических агентов, диазоксида и пинацидила, известных активаторов АТФ-зависимых K+ каналов (КАТФ) плазматической мембраны. В работе впервые экспериментально доказано, что оба этих агента обладают протонофорными свойствами, т.е. что эти соединения способствуют переносу заряженных ионов водорода (H+) через гидрофобную фазу, будь то бислойная мембрана или гидрофобный растворитель. Эти новые представления, позволили нам предположить, а затем впервые продемонстрировать в эксперименте противоишемическое, защитное действие 2,4-динитрофенола, классического разобщителя окислительного фосфорилирования. Нами впервые показано, что подобно диазоксиду и пинацидилу, 2,4-динитрофенол обладает выраженным противоишемическим защитным действием. В настоящей работе впервые продемонстрировано изменение проницаемости пориновых каналов внешней мембраны митохондрий гепатоцитов крысы, вызванное окислением этанола. Проницаемость пориновых каналов, являющихся единственными «воротами» обмена митохондриальных водорастворимых субстратов, была оценена в прямом эксперименте используя флуоресцентно-меченные молекулы декстрана с молекулярным весом 3,000 Да, способных диффундировать через открытые (но не закрытые) пориновые каналы. Кроме того впервые продемонстрировано, что закрывание пориновых каналов во внешней мембране митохондрий гепатоцитов при окислении этанола ингибирует синтез мочевины и митохондриальный путь обмена метильных групп. На изолированных митохондриях печени крыс показано, что закрывание пориновых каналов приводит к возрастанию окислительного стресса, обусловленного подавлением диффузии супероксид анионов из межмембранного пространства. На культуре клеток мышиных фибробластов показано, что закрывание или нокаутирование пориновых каналов приводит к повышению чувствительности клеток к адафостину, противоопухолевому препарату, с митохондриальным механизмом токсического действия. Показано, что повышение цитотоксического действия адафостина выражающееся в ускорении апоптоза, программируемой клеточной гибели, обусловлено возросшим окислительным стрессом и усилением повреждающего действия ионов Ca2+ на митохондрии. Полученные в настоящей работе данные позволяют предполагать, что закрывание митохондриальных пориновых каналов в любых клетках млекопитающих будет сопровождаться повышением окислительного стресса и усилением цитотоксического действия лекарственных препаратов. В работе впервые продемонстрировано, что отсутствие пориновых каналов в мембране митохондрий приводит к многократному повышению чувствительности клеток млекопитающих к фармакологическим препаратам, вызывающим клеточную гибель по механизму апоптоза, обусловленную прямой активацией митохондриального пути апоптоза или же косвенно, через индукцию Ca2+ стресса, который активирует митохондриальный апоптоз. Полученные в настоящей работе экспериментальные данные указывают на ведущую роль пориновых каналов в регуляции основных митохондриальных функций, таких как синтез АТФ, энергозависимый транспорт ионов Ca2+ и сенситизация митохондриального апоптоза. Ценность полученных в настоящей работе данных заключается также и в том, что они открывают раннее неизвестные возможности для повышения эффективности протоколов лечения человеческих опухолей путем совместного использования традиционных лекарственных препаратов с блокаторами пориновых каналов во внешней мембране митохондрий.

Практическое значение работы. Результаты проделанной работы могут быть использованы при разработке новых подходов к изучению и мониторингу динамических режимов свободной концентрации Ca2+ ионов в клетках млекопитающих в норме и при различных патофизиологических состояниях.

Неизвестные раннее и продемонстрированные в настоящей работе протонофорные свойства фармакологических препаратов, известных активаторов плазматических АТФ-зависимых K+ каналов, открывают новые перспективы для поиска и/или синтеза новых анти-ишемических препаратов, которые будут обеспечивать защиту митохондрий сердца против ишемического повреждения по механизму специфической и «умеренной» деполяризации. Наши наблюдения, сделанные на сердце крысы, могут быть взяты в качестве экспериментальной модели для разработки подходов для дизайна и изготовления, новых более эффективных анти-ишемических фармакологических препаратов, с протонофорным механизмом действия. Усиление повреждающего действия ионов Ca2+ на митохондрии при блокировании пориновых каналов, представляет новую экспериментальную модель для разработки фармакологических препаратов, прицельно закрывающих пориновые каналы во внутриклеточных митохондриях.

Такой подход является принципиально новым, основанным на оригинальной концепции о том, что закрывание пориновых каналов в митохондриях клеток млекопитающих повышает чувствительность клеток к фармакологическим препаратам. Полученные в настоящей работе данные, открывают путь для принципиально нового подхода к повышению эффективности фармакологического действия противоопухолевых лекарственных препаратов путем их совместного использования с веществами, которые закрывают пориновые каналы во внешней мембране митохондрий. Такой оригинальный подход является стимулирующим при разработке и поиске новых более эффективных протоколов лечения, основанных на единовременном использовании блокаторов пориновых каналов в качестве стимулирующих адъювантов, с известными противоопухолевыми агентами.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Советских, Российских, Международных Конференциях и Съездах, в том числе на ежегодных Международных Съездах Научных Обществ США: Биофизическом, Экспериментальной и Клеточной Биологии, Биологии Клетки, Токсикологии, Клинической и Экспериментальной Биологии, Кардиологической Ассоциации.

Кроме того результаты были представлены на Митингах и Конференциях в Польше, Германии, Италии, Чехословакии, Болгарии.

Публикации. По результатам работы исследования опубликованы более работ в отечественных и зарубежных научных журналах и сборниках, более тезисов, и сделано более 30 научных докладов в России и за рубежом.

Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора Литературы, Материалов и Методов, Результатов, Обсуждения, Выводов и Списка избранных работ соискателя и списка основных публикаций, цитируемых в работе. Диссертация изложена на... страницах машинописного текста, содержит _____ Таблиц и ____ Рисунков. Список литературы включает ____ источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Препарат изолированных митохондрий Во всех экспериментах препараты интактных митохондрий были получены стандартными методами дифференциального центрифугирования из тканей сердца и/или печени крыс Sprague-Dawley, анестезированных пентобарбиталом (50-75 мг/кг живого веса), так как это было описано раннее (Холмухамедов и др., 1980, 1983; Holmuhamedov et al., 1994, 1998,1999).

Параметры изолированных митохондрий Митохондриальные ионные потоки и скорость поглощения кислорода, исследовались с помощью многоканальной компьютеризованной установки для одновременной регистрации концентрации жизненно важных ионов и кислорода, используя ионоселективные Ca2+, K+, H+ и TPP+ электроды и кислородный датчик закрытого типа (Холмухамедов и др., 1980, 1983; Holmuhamedov et al., 1994, 1998,1999). Сбор, хранение и обработка данных проводилась с помощью программы Bioquest (Holmuhamedov et al., 1995).

Перенос меченых протонов (3H) через гидрофобную среду Для определения потока ионов H+ катализируемого диазоксидом, пинацидилом и/или 2,4-ДНФ-ом мы использовали классическую ячейку Прессмана (Pressman et al., 1966), наполненную хлороформом, в котором растворялись испытуемые соединения в концентрациях, указанных в подписи к рисункам. В отдельных экспериментах перенос протона измерялся по наведению потенциала Нернста на бислойной мембране, разделяющей два отсека с заданными концентрациями ионов водорода (Holmuhamedov et al., 2004).

Ишемическое и пост-ишемическое повреждение сердечной мышцы изучали, используя ретроградную перфузию выделенного сердца крысы по методике Лангендорфа. Степень ишемического повреждения определяли по захвату флуоресцентной краски (пропидиум иодида), а также по изменению систолического и диастолического давлений, которое измерялось с помощью наполненного водой баллончика, вставленного в левое предсердие, как описано (Dzeja et al., 2002; Holmuhamedov et al., 2004).

Культивирование клеток Первичная культура неонатальных кардиомиоцитов была получена путем коллагеназной обработки кусочков сердца новорожденных крысят (Holmuhamedov et al., 1999, 2002). Первичная культура гепатоцитов была получена из печени взрослых крыс (Sprague-Dawley, 250-300 г) после ферментативного «переваривания» перфузируемой печени (Nieminen et al., 1996;

Theruvath et al., 2007). Для конфокальной микроскопии клетки культивировались в чашках Петри со стеклянным, прозрачным дном для непосредственного получения оптического изображения клеток (Lemasters & Holmuhamedov, 2006;

Theruvath et al., 2007).

«Перфорирование» плазматической мембраны выделенных гепатоцитов Для получения доступа к внутриклеточным митохондриям, выделенные и/или культивированные на стекле клетки печени, обрабатывались детергентом дигитонином или бактериальным белком стрептолизином О, для образования пор в плазматической мембране (Bhakdi et al., 2002). Для конфокальной микроскопии и исследования внутриклеточного распределения флуоресцентного декстрана, мембраны клеток разрушались механически с помощью стеклянной микропипетки, которая проводилась через клетки (Lemasters & Holmuhamedov, 2006).

Измерение ферментативных активностей Активности цитоплазматических ферментов лактат-, алкоголь-, альдегид- дегидрогеназ, NADH-оксидоредуктазы, а также аденилат киназы, гексокиназы, ксантиноксидазы и пероксидазы проводилось с помощью флуоресцентных или люминесцентных методов.

Измерение проницаемости митохондриальных поринов Внутриклеточное распределение флуоресцентных зондов проводилось с помощью конфокального флуоресцентного лазерного сканирующего микроскопа (Carl Zeiss LSM 510), используя соответствующие флуоресцентные красители, так как это было описано раннее (Lemasters & Holmuhamedov, 2006).

Статистический анализ Полученные экспериментальные данные анализировались по методу Студента, а также используя анализ переменных (ANOVA). Данные на всех экспериментальных зависимостях выражены как среднее ± средняя ошибка, показано также число повторов. Представлены только результаты экспериментов попавших в доверительный интервал 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ После их открытия в 1949 году, митохондрии на протяжении 60 с лишним лет активно изучаются во многих лабораториях мира. Несмотря на десятки тысяч работ посвященных митохондриям, их роль в жизнедеятельности клетки и участие в регуляции внутриклеточных процессов все еще остается загадкой. Наблюдения последних лет показали, что кроме их основной функции как генератора внутриклеточной АТФ в ходе окислительного фосфорилирования, митохондрии также активно вовлечены в сложную сеть внутриклеточной регуляции жизни клетки от обмена специфическими метаболитами, образующимися исключительно в матриксе митохондрий до освобождения апоптогенных факторов, инициирующих клеточную гибель. Наиболее широко известным фактором, определяющим характер и способ взаимодействия между митохондриями и клеткой, является свободная концентрация ионов цитоплазматического Ca2+. На примере выделенных митохондрий мы покажем, как осуществляется регуляция проницаемости внутренней мембраны митохондрий ионами Ca2+; как дисбаланс в транспорте ионов кальция в митохондриях транслируется в необратимые повреждения сократительной функции миокарда, а закрывание анионных каналов во внешней мембране проводит к окислительному стрессу, усилению повреждающего действия ионов Ca2+, проявляющегося в ускоренном набухании матрикса, разрывам во внешней мембране митохондрий и высвобождению цитохрома С, и других апоптогенных факторов. Настоящая работа разделена на три Главы, каждая из которых представляет экспериментальные данные по одной теме. Глава 1 посвящена описанию особенностей транспорта ионов Ca2+ в митохондриях и их определяющей роли в регуляции динамики внутриклеточных Ca2+ волн. В Главе 2 мы представим и обсудим данные о повреждении митохондриальных функций в ишемическом сердце, о способах защиты миокарда от ишемического повреждения и о роли митохондрий в восстановлении сократительной активности сердца после длительной ишемии. Глава 3 целиком посвящена регуляторной роли пориновых каналов во внешней мембране митохондрий для нормальной жизнедеятельности митохондрий и клетки, а также их значение в механизме токсического действия этанола. Мы покажем, что окисление этанола способствует закрыванию пориновых каналов, которое сопровождается повышением чувствительности митохондрий к ионам Ca2+, которое проявляется в активации Ca2+-зависимых неспецифических пор во внутренней мембране митохондрий, набуханию и потере метаболических функций.

Глава Митохондрии в регуляции внутриклеточной динамики ионoв Ca2+ Явление колебаний ионных потоков в изолированных митохондриях известно уже более 40 лет. Начиная с первых работ (Pressman et al., 1964; Lardy et al.; Carafoli et al., 1965; Chance et al., 1966; Packer et al. 1969) до настоящего времени обнаружено и опубликовано более 13 различных режимов (Packer et al., 1979; Холмухамедов и др., 1980). Открытие колебаний в митохондриях было связано с синтезом новых антибиотиков и их способностью индуцировать транспорт ионов одновалентных щелочных металлов через биологические мембраны. Колебания ионых потоков и обьема митохондрий были обнаружены случайно при исследовании влияния целого ряда синтетических антибиотиков на энергетику изолированных митохондрий. В 1964-1966 гг. было показано, что колебания обьема и потоков ионов калия, натрия или цезия в митохондриях наблюдаются в присутствии любых антибиотиков изменяющих проницаемость мембране митохондрий к одновалентным ионам (Pressman et al., 1964; Lardy et al.; Chance & Yoshioka, 1966; Packer et al. 1969). В этой связи необходимо отметить работы Ленинджера и Карафоли 1965 года, где они показали что даже в отсутствии антибиотиков или обработки митохондрий ЭДТА, единичное добавление к энергизованным митохондриям пульса ионов кальция также сопровождается колебаниями потоков Н и кальция. В своих пионерских работах Пакер с соавторами показали, что наличие антибиотиков не является необходимым для запуска колебаний, и что участие дыхательной цепи и ее сложных регуляторных механизмов также не является необходимым для колебаний, которые наблюдаются также в митохондриях энергизованных за счет гидролиза добавленного АТФ (Mustafa & Packer, 1969). Самые долговременные колебания ионов водорода и калия были обнаружены в митохондриях, обработанных валиномицином, ионофором с очень высокой селективностью к ионам К+ (Chance & Yoshioka, 1966). Другим важным шагом в понимании этих колебаний были работы Карафоли Ленинджера (5) и более поздняя работа Ташмухамедова и Гагельганса (Ташмухамедов & Гагельганс, 1971) в которых было продемонстрировано участие двухвалентных ионов (Ca2+ или Sr2+) в колебаниях. Таким образом, к началу наших исследований было предложено множество различных моделей генерации этих колебаний, которые несмотря на некоторые различия, тем не менее помогли прояснить общую картину событий, ведущих к возникновению колебаний, которую кратко можно сформулировать следующим образом:

1. Митохондрии в присутствии субстратов окисления и кислорода, накапливают катионы (преимущественно одновалентные положительно заряженные ионы калия, а также и Ca2+, всегда имеющиеся в наличии в цитоплазме клеток или в среде инкубации.

2. В результате накопления ионов калия и Ca2+ в митохондрии, матрикс набухает и защелачивается. Эти факторы “запускают” Ca2+-зависимые перестройки во внутренней мембране митохондрий сопровождающиеся открыванием неспецифической поры.

3. В эту открывшуюся пору малые ионы матрикса, ионы водорода, калия, Ca2+ и другие перетекают по своим градиентам и способствуют деполяризации мембраны, уменьшению обьема матрикса и сокращению внутренней мембраны митохондрий одновременно с закислением матрикса и уменьшением концентрации Ca2+ 4. В результате «к Ca2+-зависимые» перестройки мембраны релаксируют назад в нормальное состояние и неспецифическая пора закрывается 5. Закрытие поры способствует медленной диффузии субстратов в митохондрии, активации дыхательной цепи (или АТФазы) и восстановлению мембранного потенциала митохондрий 6. Восстановление мембранного потенциала сопровождается новым циклом накопления ионов калия и Ca2+ в митохондрии, выбросом ионов водорода дыхательной цепью и защелачиванием матрикса, которое завершается активацией «Ca2+-зависимой» перестройки мембраны, открыванием неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий и следующим циклом колебаний ионных потоков и обьема митохондрий. Все эти этапы генерации колебаний подтвержденые экспериментально, позволили нам формализовать процесс колебаний в форме математической модели (Селиванов и др. 1998; Pokhilko et al., 2006).

1. Математическая модель колебаний ионных потоков и объема митохондрий Диаграмма всех Ca2+out Ca2+/2H+ Ca2+out Ca2+/2H+ ионных потоков через K+out внутреннюю, сопрягающую K+out Ca/2H Ca/2H Uniporter Uniporter митохондриальную мембрану, так как она использована в K+ uptake K+ uptake H+ leak H+ leak Ca2+in 2H+/Ca2+ Ca2+in 2H+/Ca2+ K+/H+ K+/H+ нашей модели, показана на Рис. 1 (Pokhilko et al., 2006).

K/H K/H Ca2+ buffer Ca2+buffer K+in K+in Все процессы, рассмотренные Respiratory Respiratory nH+innH+inH+/K+ на этой диаграмме, являются H+/K+ nH+out chain nH+out chain M A T R I X M A T R I X энергозависимыми, и потоки H+ buffer H+ buffer A2-in A2-in указанных ионов используют (H+, K+, Ca2+, A2-)in (H+, K+, Ca2+, A2-)in энергию электрохимического Substrate Substrate OH/P-in OH/P-in I N N E R I N N E R градиента ионов водорода carrier carrier M E M B R A N E PTP M E M B R A N E PTP (µH) на внутренней мембране Pin/OH Pin/OH митохондрий - электрическую A2-out A2-out (H+, K+, Ca2+, A2-)out (H+, K+, Ca2+, A2-)out (m) для поддержки переноса OH/P -out OH/P out заряженных частиц, а также Рисунок 1. Диаграмма ионных потоков в митохондриях концентрационную (pH) для переноса незаряженных частиц. Наша модель состоит из 5 независимых модулей описывающих потоки ионов, а также состояние поры. Модуль # 1: Потоки протонов, дыхательная цепь; пассивные “утечки” (H leak); электро-нейтральный обмен H+, Ca2+, K+, и фосфата (Ca/2H, K/H, P/OH, PTP); Модуль # 2: Потоки Ca2+:

(Юнипортер,Ca2+/2H+, PTP). Модуль # 3: Потоки K+: (Юнипортер, K+/H+, PTP).

Модуль # 4: Потоки анионов: фосфата (P/OH) и субстратов (A2-) и PTP. Модуль # 5: Митохондриальная пора. Этот модуль описывает регулировку состояния PTP ионами Ca2+, pH и п потенциалом мембраны. Эта модель имеет множество решений, и анализ модели оказал, что в зависимости от количества ионов Ca2+, добавленного в систему всего имеется три основных режима транспорта, как показано 2+ Рисунке 2. Режим #1: Нагрузка митохондрий малым количеством на ионов Ca, которое не достигает порогового значения концентрации Ca2+, при которой пора активируется. Следовательно, пора остается закрытой и весь добавленный Ca2+ накапливается в матриксе без последствий (Рис. 2). Режим #2:

Нагрузка митохондрий промежуточными количествами ионов Ca2+. При этом +пора будет циклически открываться, и закрываться, порождая колебания Ca2+, H, K+, потенциала и объема митохондрий (Рис. 3). Режим #3: Нагрузка митохондрий большими количествами ионов Ca2+ (Рис. 4). Эти количества ионов Ca2+ вызывают постоянную активацию поры. При этих условиях пора остается постоянно открытой, и все малые ионы распределяются по своим градиентам и выходят из матрикса (Рис. 4). Таким образом, математическая модель, основанная на регуляции состояния поры ионами Ca2+, H+ и мембранного потенциала, продемонстрировала возможные режимы транспорта ионов Ca2+, H+, K+ в митохондриях. В хорошем соответствии с нашими экспериментальными данными (Ichas et al., 1994) математическая модель также описывала явление A A D A D 100 A D D A D 100 A D 100 120 1100 120 1100 1100 180 80 110 1110 1110 60 110 60 40 40 100 1100 1110 0 90 90 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 0 1 2 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min B E B Time, min Time, min B E B E E 8.3 100 8.3 18.3 100 8.3 1E E 8.00 B 8.00 B 118.8.8.8.7.90 7.90 8.8.60 8.60 8.7.7.8.0 8.8.0 8.7.9 7.9 7.9 7.9 7.7.0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min 200 C Time, min F C F Time, min Time, min 200 C Time, min F C F 2.0 200 2.2.0 200 2.C 2.0 F C 2.0 F 1.8 1.1.8 1.195 1195 1111.6 1.6 1.1.6 1.6 1.1111111.4 1.1.4 1.1.1.1.2 1.1.2 1.110 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 1 2 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 1 2 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Time, min Рисунок 3. Состояние Рисунок 4. Состяние Рисунок 2. Состояние митохондрий с закрытой порой – митохондрий с колеблющейся митохондрий с открытой порой – порой–колебания есть колебаний нет колебаний нет митохондриального Ca2+-индуцированного выброса накопленного Ca2+ из матрикса, которое объясняет синхронизирующую роль митохондриального транспорта Ca2+ в целых клетках.

2. Роль митохондрий в определении свободной концентрации Ca2+ в клетках Динамика концентрации внутриклеточного Ca2+ имеет существенное значение для нормальной жизнедеятельности клеток (Berridge, 1999; Clapham, 1999). До недавнего времени существовало мнение, что участие митохондрий в Ca2+ гомеостазе 0.56 0.0.56 0.0.56 0.клетки ограничено Ca2+-зависимой Control Control активацией матриксных ферментов, которое Control Control 0.42 0.0.42 0.0.42 0.транслируется в усиленное производство 8 µM Cys A 8 µM Cys A АТФ (McCormack & Denton, 1980, 1991).

2 µM PS 2 µM PS 0.28 0.0.28 0.0.28 0.Однако недавние исследования показали, что митохондрии напрямую участвуют в Ca2+ 0.14 0.0.14 0.0.14 0.гомеостазе клетки путем накопления и освобождения ионов Ca2+ (Rizzuto et al, 1992, 0 0 0 1994; 2000; Ichas et al., 1994,1995). На ATP 20 sec ATP 20 sec ATP ATP рисунке 5 показано, что ингибирование Ca2+- 25 µM 25 µM 25 µM 25 µM активируемой поры в клетках асцитной Рисунок 5. АТФ-индуцированные Ca2+ карциномы подавляет АТФ - индуцированные спайки в асцитной карциноме Эрлиха.

изменения Ca2+ в цитоплазме.

Ингибирование дыхательной цепи митохондрий антимицином А, подавляет амплитуду АТФ-индуцированного Ca2+ сигнала в 3-5 раз (Рис. 5, Б).

3. Синхронизирующая роль митохондрий в клетках. Ранее мы продемонстрировали, что изолированные митохондрии, в матриксе которых находится определенное количество ионов Ca2+, обладают способностью освобождать эти накопленные ионы Ca2+ под действием дополнительного внешнего импульса Ca2+ (Holmuhamedov et al., 1980,1998). Эта способность митохондрий усиливать концентрацию Ca2+ в суспензии за счет высвобождения 2+ 2+ + + + + 2+ 2+ 2+ 2+ K K K K Ca Ca Ca Ca Ca Ca + + K K + + (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) in in in in 2222A A in in pH pH pH pH A A 22A A pH pH (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) , mV , mV , mV , mV Volume Volume Volume Volume Volume Volume , mV , mV ( l/mg protein) ( l/mg protein) ( l/mg protein) ( l/mg protein) ( l/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) ( l/mg protein) (nmoles/mg protein) (nmoles/mg protein) 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Ca, µM Ca, µM Ca, µM Ca, µM Ca, µM Ca, µM внутренних запасов Ca2+, которую мы назвали «Ca2+-индуцированный выброс Ca2+ из митохондрий» (Ichas et al, 1994) оказалось явлением, принципиально важным для понимания роли митохондрий в регуляции динамики ионов Ca2+ в цитоплазме (Jouaville et al., 1995).

Используя выделенные клетки ооцитов лягушки, мы показали, что характер и динамика Ca2+ волн в цитоплазме ооцитов зависит от состояния дыхательной цепи митохондрий. Дополнительная Рисунок 6. Энергизация митохондрий синхронизует инъекция субстратов окисления Ca2+ волны в ооците: а конфокальные изображения вызывает синхронизацию волн инозитол-3-фосфат-индуцированных волн Ca2+; b свободного Ca2+, и наоборот, Поперечное сечение волн в выбранной плоскости. c ингибирование дыхательной цепи Колебания концентрации Ca2+; d, e и f, ротенон разрушает синхронное распространение Са2+-волн.

ротеноном, специфическим ядом, который подавляет 2+ дыхание митохондрий, разрушает синхронность распространения Ca волн, и возрождает исходный «хаос» (Рис. 6). Т.о.

энергизация митохондрий является необходимым условием поддержания в клетках усиления и синхронизации волн концентрации свободного кальция в цитоплазме ооцитов лягушки (Jouaville et al., 1995). Возникновение волн Ca2+ в цитоплазме ооцитов лягушки, как и во многих других клетках, было индуцировано хорошо известным внутриклеточным стимулятором инозитол-1,4,5трифосфатом, который вызывает высвобождение ионов Ca2+ из ретикулума, и таким образом инициирует генерацию в цитоплазме яйцеклеток распространяющихся кальциевых волн (Lechleiter & Clapham, 1995,1996).

Особенностью этих волн является то, что при сталкивании они взаимно аннигилируют и исчезают, порождая “хаос” и разрывы волны (Lechleiter & Clapham, 1995,1996). Данные показанные на Рис. 6 и Рисунок 7. Aнтимицин разрушает (a), а 7 иллюстрируют, что потециал-зависимое энергизация митохондрий аскорбиновой накопление Са2+ в митохондриях является кислотой с ТМПД восстанавливает (b,c) основным фактором регулирующим и упорядоченное характер волн Ca2+ в ооците.

синхронизирующим инозитол-зависимую генерацию Са2+ волн. Полученные данные указывают на физиологическое значение транспорта ионов Ca2+ в митохондриях, как системы активной регуляции динамики ионов Ca2+, важнейшего участника внутриклеточной сигнализации.

Таким образом, в настоящей работе продемонстрировано, что усиление амплитуды внутриклеточных волн концентрации свободных ионов Ca2+, а также их пространственная синхронизация, находится под контролем митохондриальной системы энергозависимого транспорта ионов Ca2+, осуществляющей накопление этих ионов в матриксе и освобождение их в цитоплазму клеток.

Глава Митохондрии в механизме ишемического повреждения сердечной мышцы Ионы калия являются главным ионным компонентом не только цитоплазмы, но и митохондриального матрикса. Направление электрического поля на внутренней мембране митохондрий, благоприятствует транспорту ионов калия из цитоплазмы в матрикс. Таким образом, наличие любых K+-селективных каналов, включая АТФзависимых, во внутренней мембране митохондрий, будет сопровождаться изменениями митохондриального объема и регуляцией состояния Ca2+-зависимой неспецифической поры. В настоящей работе мы рассмотрим механизм действия диазоксида и пинацидила, соединений, которые известны как активаторы K+селективной +проницаемости во внутренней мембране митохондрий, т.н. АТФзависимых K каналов, на митохондрии.

1. Диазоксид и пинацидил уменьшают мембранный потенциал митохондрий.

Для понимания механизма защитного A Б В действия этих агентов, необходимо 40 140 специально отметить, что, несмотря на общепринятое мнение о механизме 20 работы этих соединений как активаторов плазматических АТФ0 0 ДЗ ПИН ДНФ ДЗ ПИН ДНФ ДЗ ПИН ДНФ зависимых КАТФ K+ (КАТФ) каналов, модуляция митохондриальных функций ПИН ДЗ диазоксидом или пинацидилом не 40 1ПИН требовало присутствия во внешней ПИН ДЗ ДЗ среде ионов K+ (Рис. 8). Замена ионов 20 6 K+ на ионы Na+ или Li+ не изменило эффекта этих агентов на 0 митохондриальное дыхание (Рис. 8А), мембранный потенциал (Рис. 8Б) или Рисунок 8. Эффект замены ионов K+ на производство АТФ (Рис. 8В). Более действие диазоксида и пинацидила на того, все эффекты этих агентов на дыхание, мембранный потенциал и синтез АТФ митохондрий.

митохондрии, были подобны тем, которые вызывал 2,4-динитрофенол, известный разобщитель окислительного фосфорилирования. Все три агента, 2,4-ДНФ, диазоксид и пинацидил A Б В Б В мито 6644АДФ 4433-Пин 2211- Пин - Пин Пин + Пин + Пин +Пин 0 90 180 270 30 90 180 270 34.0 3.5 3.4.0 3.5 3.Пинацидил, - log [Пин] Время фосфорилирования Пинацидил, - log [Пин] Время фосфорилирования 30 с Рисунок 9. Эффект пинацидила на АДФ-зависимую деполяризацию митохондрий: А– Циклическое изменение потенциала митохондрий (1мг/мл) пинацидилом (100 µM) и АДФ (2µM). Б–Деполяризация митохондрий пинацидилом. В–Ингибирование синтеза АТФ.

, мВ Дыхание Синтез АТФ (% максимума) (нг , мВ Дыхание Синтез АТФ (% максимума) (нг-атом O /мин/мг) -атом O /мин/мг) LiCl LiCl LiCl LiCl LiCl LiCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl Длительность Длительность деполяризации, с деполяризации, с нмоль АТФ/мин/мг нмоль АТФ/мин/мг Скорость синтеза АТФ Скорость синтеза АТФ 35 мВ увеличивали дыхание и потребление кислорода покоящимися митохондриями, вызывали деполяризацию мембраны и снижали мембранный потенциал митохондрий, а также подавляли синтез АТФ, независимо от присутствия ионов K+ в среде инкубации (Рис. 8). Мембранный потенциал митохондрий, окисляющих сукцинат, оцененный с помощью тертафенилфосфониевого электрода был около 180 ± 15 mV (Рис. 9) и пинацидил, активатор КАТФ каналов, вызывал деполяризацию митохондрий. В среднем, пинацидил (100 µM), уменьшает мембранный потенциал митохондрий на 24 ± 9 mV (Рис. 9Б, показан Пинацидил только, Holmuhamedov et al., 1998). Деполяризующая способность этого агента зависела от концентрации препарата. На Рис. 9А & Б показано, что пинацидил деполяризует и ингибирует скорость синтеза АТФ в митохондриях, как видно из удлинения времени, которое нужно для фосфорилирования добавленного АДФ (Рис. 9А), а также из изменений скорости синтеза АТФ в отсутствии и присутствии пинацидила (Рис. 9В).

2. Диазоксид и пинацидил подавляют транспорт Ca2+ в митохондриях Расстройства митохондриальных функций вследствие ишемического повреждения сердца, в мито мито основном связаны с Б Б IC50=128 µM IC50=128 µM IC50=128 µM Диазо Диазо А А избыточным накоплением Ca2+ 11111в митохондриях (Ferrari, 1989;

300 µM 300 µM Liu et al., 2000). Среди 10-10-10-10-10-10-10-10-10-10-10-10-многочисленных гипотез Пинацидил, М Пинацидил, М Пинацидил, М 111+Пин +Пин 30 µM +Пин 30 µM защиты митохондрий от IC50=65 µM IC50=65 µM ишемического повреждения в Контроль Контроль Контроль Контроль Контроль сердце, предположение о 1 0 1 0 0 Время, с Время, с Время, с вовлеченности и роли АТФ10-6 10-5 10-4 10-10-6 10-5 10-4 10--30 0 30 60 -30 0 30 60 зависимых K+ (КАТФ) каналов Время, с Диазоксид, М Время, с Диазоксид, М как защитного фактора Рисунок 10. Активаторы КАТФ каналов ингибируют получило наибольшее транспорт Ca2+ в митохондриях. А–Диазоксид и пинацидил (вставка) подавляют накопления Ca2+ в суспензии распространение (Gross, митохондрий (1мг/мл); Б–Дозовая зависимость 1996,1998; Liu et al., 2000). В ингибирования накопления Ca2+.

своих исследованиях мы отдавали преимущество диазоксид и пинацидилу, активаторам АТФ-зависимых калиевых каналов, которые, как было показано, являются наиболее специфическим в отношении митохондрий (Gross, 1998; Liu et al., 2001; Garlid, 2001). Мы впервые продемонстрировали на митохондриях из мышцы левого желудочка, что оба исследованных активатора КАТФ каналов, диазоксид и пинацидил, несмотря на то, что эти соединения, хотя и имеют различную химическую структуру, тем не мито IC50=132 µM 1A Б менее, одинаково 11100 эффективно подавляют 1+Пин +Пин 75 энергозависимое накопление Контроль Контроль 1 300 µM 10-10-10-10-Ca2+ в митохондриях (Рис.

0 60 10 60 1Время, с Время, с Пинацидил, М 10). Концентрации Диазо 30 µM 25 диазоксида и пинацидила, IC50=96 mM подавляющие накопление Контроль Ca2+ на 50% были 65µM и 10-6 10-5 10-4 10-0 30 60 90 1128µM, соответственно Диазоксид, М Время, с (Holmuhamedov et al., Рисунок 11. Активаторы КАТФ каналов индуцируют 1998,1999). Аналогичным освобождение ионов Ca2+ из митохондрий. А–Выход Ca2+ из образом, и диазоксид и митохондрий (1мг/мл) в присутствии диазоксида (100 µM) или пинацидила (вставка). Б–Дозовая зависимость выхода пинацидил способствуют Ca2+ от концентрации диазоксида (вставка: пинацидил).

освобождению ионов Ca2+, 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Вxод Ca, (%) Вxод Ca, (%) Вxод Ca, (%) 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ [Ca ], µM [Ca ], µM [Ca ], µM [Ca ], µM [Ca ], µM входа Ca, (%) входа Ca, (%) Ингибирование Ингибирование 2+ 2+ [Ca2+], µM [Ca2+], µM Выxод Ca, (%) 2+ Индукция [Ca ], µM выxода Ca, (%) предварительно накопленных в митохондриях (Рис. 11). Концентрации диазоксида и пинацидила индуцирующие 50% увеличение скорости выброса ионов Ca2+ из митохондрий были 96 µM и 132 µM, для диазоксида и пинацидила, соответственно, и были близки к тем, которые использовались для защиты сердца от ишемического повреждения (Рис. 11). Таким образом, действие известных активаторов плазматических АТФ-зависимых калиевых (КАТФ) каналов, диазоксида и/или пинацидила на главные функции митохондрий является их способность вызывать деполяризацию внутренней мембраны митохондрий, приводящее к подавлению накопления добавленных ионов Ca2+ в матриксе, а также к активации процессов, приводящих к освобождению накопленных ионов Ca2+ из митохондрий.

3. Диазоксид и пинацидил индуцируют циклоспорин А зависимый выход Ca2+ из митохондрий. К митохондриям, инкубированным в присутствии ионов Ca2+ (1µM), кислорода и субстратов окисления после достижения стационарной концентрации кальция был добавлен диазоксид или A Б 1100 1пинацидил (Рис. 12А и 12Б). Диазо - Цис A Пин Добавление этих агентов к - Цис A митохондриям вызывало + Цис A немедленный и интенсивный + Цис A выход ионов Ca2+ из -1-1матрикса. Одновременная - Цис A - Цис A регистрация мембранного +Цис A -1+Цис A -1потенциала митохондрий демонстрирует, что выход 30 60 30 60 ионов Ca2+ совпадает с Время, с Время, с деполяризацией и падением Рисунок 12. Ингибирование поры снимает эффект диазоксида и пинацидила на выход Ca2+ из митохондрий.

мембранного потенциала митохондрий (Рис. 12А, Диазо или 12Б, Пин). Циклоспорин А, специфический игибитор Ca2+-зависимых перестроек и открывания неспецифических водных пор в мембране митохондрий (Bernardi, 1999; Crompton, 1999) предотвращал выход Ca2+, но не деполяризацию митохондрий (Рис. 12, нижняя панель). В отсутствии и присутсвии циклоспорина А, диазоксид вызывал деполяризацию митохондрий на 15±4 mV (n=20) и 18±6 mV (n=7, р<0.05), соответственно. Аналогично, пинацидил деполяризовал митохондриальную мембрану на 20±5 mV (n=6) и 23±3 mV (n=6), в отсутствии и присутсвии циклоспорина А, соответственно (р<0.05). Таким образом, действие диазоксида или пинацидила на выброс Ca2+ из митохондрий обусловлено деполяризацией мембраны митохондрий активацией Ca2+-зависимой циклоспорин-чувствительной поры (или пор).

4. Диазоксид и пинацидил деполяризуют митохондрии в изолированных кардиомиоцитах Как было показано выше, активаторы КАТФ каналов деполяризуют выделенные митохондрии, таким образом указывая на то, что защитное действие этих активаторов против ишемии может быть обусловлено уменьшением мембранного потенциала и электродвижущей силы, необходимой для поддержки энергозависимого транспорта ионов Ca2+ в митохондрии. Для визуального наблюдения и отслеживания мембранного потенциала вмутриклеточных митохондрий, мы нагрузили кардиомиоциты, которые были выращены на стекле, флуоресцентной потенциал-зависимой краской ТМРМ, которая специфически накапливается в матриксе и отражает мембранный потенциал митохондрий (Nieminen et al., 1998). Действие диазоксида и/или пинацидила, активаторов КАТФ каналов на мембранный потенциал митохондрий в культуре клеток кардиомиоцитов, изучалось при помощи лазерного 2+ 2+ 2+ [Ca ], µM [Ca ], µM [Ca ], µM , mV , mV конфокального флуоресцентного микро-скопа (Holmuhamedov et al., 1998).

Изображения клеток (Рис. 13) были получены с помощью A микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss). В среднем, флуоресценция TMRM уменьшилась от 175±произвольных единиц в контрольных клетках, до 115±единиц после добавления диазоксида к этим клеткам (N=24), - Диазо + Диазо B Обработка культуры клеток кардиомиоцитов, (5-HD) 5– гидроксидеканоевой кислотой, блокатором КАТФ каналов (Garlid 1996) не влияло на уровень флуоресценции TMRM (168±20, Рис. 13А&В). Однако если клетки до добавления диазоксида + 5HD + Диазо + FCCP предварительно обрабатывались 300 µM 5-HD, то диазоксид Рисунок 13. Диазоксид деполяризует внутриклеточные митохондрии (А). Эффект вызывал значительное подавление диазоксида предотвращается 5-ДК, блокатором уровня флуоресценции TMRM, которое уменьшалось со 168±20 действия диазоксида (Б). Разобщитель, FCCP (1nM) полностью деполяризовал митохондрии.

условных единиц до 155±7 единиц, указывая на деполяризацию митохондрий 5-HD (Рис. 13Б). Таким образом, приведенные в настоящей работе данные указывают на то, что диазоксид (или пинацидил), активаторы плазматических АТФ-зависимых K+ (КАТФ) каналов также на самом деле деполяризуют митохондрии (Рис. 13А) и эффект диазоксида (или пинацидила) может быть частично предотвращен в присутствии 5-HD, известного блокатора плазматических АТФ-зависимых калиевых (КАТФ) каналов (Рис. 13Б).

5. Диазоксид и пинацидил уменьшают содержание Ca2+ в митохондриях изолированных кардиомиоцитов Далее мы исследовали влияние активаторов калиевых каналов диазоксида и A пинацидила, на уровень Ca2+ в митохондриях интактных кардиомиоцитов. Кардиомиоциты выделенные из сердец новорожденных крысят были нагружены Rhod-2AM, Ca2+чувствительным флуоресцентным - Диазо + Диазо B красителем, который специфически накапливается в митохондриях и отражает уровень кальция в них (Holmuhamedov et al., 1998,1999).

Обработка диазоксидом (30 µМ) снижает уровень флуоресценции Rhod-2 в кардиомиоцитах, свидетельствуя 2+ о понижении + 5HD + Диазо + FCCP Рисунок 14. Диазоксид уменьшает содержание Ca2+ в содержания Ca в митохондриях митохондриях сердца (А) и этот эффект (Рис. 14А). В присутствии 5-HD преотвращается 5-ДК, блокатором действия это понижение флуоресценции диазоксида (Б), а FCCP - вызывает полную потерю диазоксидом уменьшается (Рис.

Ca2+ из митохондрий.

14Б). Аналогичные данные были получены при обработке клеток пинцидиалом (не показано). Подавление выброса Ca2 из митохондрий в присутствии циклоспорина А, блокатора и селективного ингибитора Ca2+-индуцированного изменения проницаемости внутренней мембраны, которое никак не связано с транспортом калия в митохондриях указывает на то, что 2диазоксид и/или пинацидил на самом деле могут менять митохондриальный Ca гомеостаз и уменьшать количество накопленного Ca2 как в норме так и при патологии, например при выходе из ишемии. Мы предполагаем, что эффект диазоксида (и пинацидила) вызван деполяризацией внутренней мембраны митохондрий, уменьшением накопления ионов Ca2+ из-за активации выброса Ca2+ при подавленном накоплении этих ионов (Holmuhamedov et al., 1998, 2+1999). В заключение, диазоксид и пинацидил ограничивают накопление Ca в митохондриях и этот эффект не зависит от присутствия ионов K+ в среде инкубации. В изолированных сердечных митохондриях диазоксид и пинацидил уменьшили скорость накопления Ca2+ в митохондриальный матрикс и концентрации, которые подавляли скорость накопления на 50%, были 65 µМ и 128 µМ, соответственно. Эти концентрации близки к тем, которые обеспечивают защиту от ишемии. Необходимо отметить, что на всех этапах накопления Ca2+, оба агента деполяризовали митохондриальную мембрану, таким образом, уменьшая поток потенциал зависимого транспорта Ca2+. И диазоксид и пинацидил активировали выход накопленных ионов Ca2+ из митохондрий, причем скорость выхода зависела от концентрации этих агентов. Процесс индукции выхода накопленного Ca2+ полностью подавлялся циклоспорином А, указывая на участие Ca2+-зависимой поры, ассоциированной с перестройками в мембране митохондрий и открытием большой неспецифической поры.

Таким образом, удаление ионов калия из среды инкубации и изооссмотическая замена их ионами натрия, лития или неионными заместителями (маннитолом или сахарозой) полностью подавляло 2+ влияние диазоксида и/или пинацидила на митохондриальный транспорт Ca, но не влияло на деполяризацию внутренней мембраны.

6. Молекулярный механизм действия диазоксида и пинацидила в митохондриях Выше мы показали, что действие известных активаторов КАТФ каналов на митохондрии заключается в деполяризации митохондрий и уменьшении уровня Ca2+ обмена в митохондриях (Рис. 10-11). Более того, этот эффект диазоксида и пинацидила наблюдался при полном отсутствии ионов K+, что свидетельствует о том, что деполяризация митохондрий этими агентами не зависит от присутствия ионов K+ (Holmuhamedov et al., 1999). Мы показали, что эти два структурно различных агента, диазоксид и пинацидил, обладают одним общим свойством – они оба являются слабыми протонофорами (Holmuhamedov et Rf A Б В Vm + * X H X + H + * M * X ·3H X ·3H cis trans H+cis H+trans X ·3H X ·3H EH = (RT/nF) ·log (H+cis/H+trans) EH = (RT/nF) ·log (H+cis/H+trans) K ДЗ ПИН ДНФ Рисунок 15. А – Схема определения переноса протонов; Б – Величины потоков протонов; В Схема определения протонофорной активности агентов на бислойной мембране.

Поток H H импульс/час/см al., 2004). Оба агента активируют дыхание энергизованных митохондрий, деполяризуют митохондрии и уменьшают эффективность окислительного фосфорилирования, т.о. демонстрируя типичные свойства разобщителей митохондриального окислительного фосфорилирования (Рис. 9). Мы далее экспериментально проверили протонофорные свойства диазоксида и пинацидила, используя классическую ячейку Прессмана, а также на бислойной мембране (Holmuhamedov et al., 2004). Диазоксид (100 µМ) и пинацидил (100 µМ) существенно ускорили поток тритиевой метки H через слой хлороформа от 2±H/час/см2 в контроле до 10±2 и 13±2 3H/час/см2, соответственно (Рис. 15, А и Б).

Добавление диазоксида или пинацидила к +бислойной мембране, разделяющей отсеки с 10х кратным градиентом ионов H (но не ионов K+), сопровождалось появлением электрического потенциала в 52.6±0.2 и 51.5±0.1 мВ, соответственно (Рис. 15В, Holmuhamedov et al., 2004). Эти значения близки к теоретическому потенциалу + реверсирования 56.2 мВ, рассчитанному исходя из использованного градиента H (pH 7.02 против 7.98, Рис. 15В). Этот потенциал был специфическим по отношению к ионам водорода и не наблюдался в условиях, когда градиент ионов H+ отсутствовал. Отсутствие белков любой природы в этих экспериментах, а также неспособность диазоксида или пинацидила создать электрический потенциал при наличии градиента ионов K+, свидетельствует о том, что эти соединения специфически катализируют перенос протонов через липидную фазу, т.е. обладают протонофорными свойствами. Основываясь на обнаруженном нами свойстве диазоксида и пинацидила, мы предсказали и экспериментально продемонстрировали кардиозащитное действие 2,4-динитрофенола, классического разобщителя окислительного фосфорилирования с протонофорным механизмом действия. Следовательно, механизм противоишемического защитного действия диазоксида и пинацидила, наряду с активацией плазматических КАТФ каналов, может включать также и слабое разобщение митохондрий.

Таким образом, диазоксид и пинацидил, химические агенты с различной химической структурой и свойствами, объединены тем, что оба обладают выраженными протонофорными свойствами и способны специфически переносить положительно заряженные ионы водорода (протоны) через гидрофобную фазу.

Глава Митохондриальные пориновые каналы в механизме токсического действия этанола Биохимические следствия окисления этанола в печени включают подавление синтеза АТФ, скомпрометированное окисление длинноцепочечных жирных кислот, увеличенное образование кислородных радикалов и окисление липидов (Thurman et al., 1997; Cunningham et al., 1996,1998; Lemasters & Holmuhamedov, 2006).

Этанол также вызывает в печени гиперметаболическую реакцию, которая характеризуется стремительным увеличением метаболизма спирта, почти удвоением митохондриального дыхания и разобщением окислительного фосфорилирования (Thurman et al., 1986). Нормальный митохондриальный метаболизм требует непрерывного обмена субстратов между клеткой и митохондриальным матриксом. При прохождении в митохондрии и обратно эти соединения должны пересечь две мембраны – внешнюю и внутреннюю. Если обмен через внутреннюю мембрану катализируется специфическими обменниками, то обмен всех водорастворимых метаболитов через внешнюю мембрану происходит через пориновые каналы, или т.н. voltage dependent anion channels (VDAC), потенциал-зависимых анионных каналы, расположенные во внешней мембране (Colombini, 2004). Таким образом, проводимость этих каналов может быть очень важным звеном в цепи глобальной регулировки митохондриального метаболизма. Мы предположили, что глобальное нарушение митохондриального метаболизма в гепатоцитах окисляющих этанол, обусловлено уменьшением потоков метаболитов через внешнюю мембрану митохондрий из-за закрытия VDAC каналов (Lemasters & Holmuhamedov 2004). Полученные нами данные, которые представлены ниже, подтверждают наше предположение о закрытии пориновых каналов в митохондриях гепатоцитов окисляющих этанол.

1. Селективное увеличение проницаемости плазматической и митохондриальной внешней мембран. Для получения доступа к внутриклеточным митохондриям для измерения митохондриальных функций, мы использовали обработку дигитонином, неионным детергентом, который образует большие поры в плазматической мембране клеток и внешней мембране митохондрий - мембранах с высоким содержанием холестерина. Механизм порообразования заключается в “вымывании” холестерина детергентом (Hackenbrock c et al., 1968).

В других экспериментах, мы использовали Стерптолизин О (СЛО), бактериальный белок, который работает по схожему с дигитонином механизму, с той разницей, что размеры пор могут быть оттитрованы и излишки СЛО легко удаляются из инкубационной среды (Bhakdi et al., 2002). И, наконец, мы разработали и применили другой метод разрушения плазматической мембраны клеток в культуре с помощью стеклянной микропипетки. Хотя этот метод применим только к одиночным клеткам, его преимущество заключается в том, что он не использует химические соединения и исключает возможные неспецифические эффекты.

При обработке дигитонином (Рис. 16А) первыми через мембрану проходят малые молекулы трипанового голубого с молекулярным весом 668 Да (ТГ), затем более крупные молекулы аденилат киназы (~ 40 кДа) и только после этого размеры пор достаточно велики чтобы пропускать Рисунок 16. Титрование суспензии гепатоцитов дигитонином большие молекулы лактат и выход цитоплазматических и митохондриальных маркеров.

А, Увеличение числа дырявых клеток (ТБ) и выход лактат дегидригеназы (~ 140 кДа).

дегидрогеназы (ЛДГ) и аденилат киназы (АК); Б, Выход Клеточная АК-аза цитохрома С из клеток обработанных дигитонином (Вестерн освобождается из клеток блот), MВ-молекулярные маркеры; 0, 8 и 80 концентрации двумя приблизительно дигитонина (µM). Цит С - 100 нг цитохрома С.

равными пулами: первый пул (~55%) выходит из клеток при низкой концентрации дигитонина, достигает плато при концентрации дигитонина ~ 20 µM и сопровождается одновременным входом трипанового голубого, подтверждая таким образом, что первый пул представлен цитоплазматической АК-азой (Рис. 16А). Второй пул АК-азы, ~ 45% от общего содержания АК-азы в гепатопоцитах, высвобождается при более высоких концентрациях детергента и достигает плато при ~ 100 µM дигитонина.

Необходимо отметить, что выход второго пула АК-азы сопровождается также выходом цитохрома С, что свидетельствует о том, что при этих концентрациях дигитонина, детергент достигает и разрушает внешнюю мембрану митохондрий (Рис. 16Б).

2. Нарушение барьерных свойств плазматичексой мембране не влияет на функциональные характеристики митохондрий. Основные функции митохондрий такие как окисление сукцината, пирувата, глутамата, -оксибутирата и связанная с этим генерация мембранного потенциала, фосфорилирование добавленной АДФ и транспорт ионов кальция сохраняются в изолированных гепатоцитах, чья плазматическая мембрана “продырявлена” либо обработкой дигитонином, СЛО или же простым механическим разрывом плазматической мембраны клеток с помощью миктопипетки. На рис. 17 показан типичный интактный гепатоцит, в котором все митохондрии помечены in vivo тетраметилродамином, краской с потенциал зависимой флуоресценцией. Эта краска специфически накапливается в энергизованных митохондриях и светится ярко-красным цветом, а при деполяризации и потере мембранного потенциала флуоресценция уменьшается и исчезает (Nieminen et al, 1998). На конфокальных изображениях гепатоцитов, нагруженных ТМРМ внутриклеточные митохондрии видны как ярко-красные органеллы (Рис. 17А, Интактные), расположенные вокруг темного ядра. Интенсивность этой красной флуоресценции соответствует уровню мембранного потенциала митохондрий и чем выше потенциал, тем ярче выглядят митохондрии. Обработка клеток дигитонином 8 µM, когда более 95% клеток становятся ТБ - положительными, приводит к значительному снижению флуоресценции митохондрий, указывая на падение мембранного потенциала.

Деполяризация, т.о. не обусловлена потерей красителя ТМРМ из цитоплзмаы и изменением градиента этой краски на мембране митохондрий, а видимо происходит вследствии разбавления и потери цитозольных субстратов из клеток, через поры, которые образует дигитонин (Рис. 17А, Диг). Несмотря на повреждение плазматической мембраны и потерю цитоплазмы, митохондрии сохраняют способность полностью восстановливать в клетке мембранный потенциал (уровень флуоресеценции) в присутствии добавленого сукцината (мМ). Как показано, добавление сукцината к клеткам в этих условиях вызывает быстрое восстанавление флуоресценции (Рис. 17А, Сукцинат). Последующее добавление 2,4-динитрофенола, классического разобщителя окислительного фосфорилирования, который деполяризует митохондрии, A гасит флуоресценцию ТМРМ (Рис. 2А, ДНФ). На этом же рисунке показано (Рис. 17Б), что в гепатоцитах, в которых Интактные +Дигитонин +Сукцинат +ДНФ плазматическая мембране Гепатоциты «продырявлена» дигитонином, Б В дыхание митохондрии остается 3ДНФ Дигитонин чувствительным к действию ДНФ, демонстрируя, таким 2Малонат образом, что обработка 1дигитонином не нарушает 1целостности дыхательной цепи.

1Дигитонин, M 10 1На рисунке 17Б показана как изменяется концентрация 0 1 4 5 растворенного кислорода в Время, мин суспензии гепатоцитов, Рисунок 17. Дигитонин не влияет на потенциал и дыхание которые инкубируются в среде митохондрий. А, Конфокальные изображения гепатоцитов содержащей 5 мМ сукцината и до (Интактные) и после обработки дигитонином, 1 мМ ЭГТА. При внесении сукцинатом, и ДНФ. Б, Изменение концентрации клеток в среду инкубации кислорода в суспензии после обработки разобщителем (ДНФ), дигитонином (ДИГ) и малонатом (МАЛ). В, дыханиe клеток составляет 7 ± Статистика эффекта дигитонина и ДНФ на дыхание клеток.

2 нмолей О2/мин/ 106 клеток.

Дыхание Кислород ( M) (нмоль/мин/10 клеток) Г Г И И Д Д Дальнейшее добавление к клеткам разобщителя ДНФ (в отсутствии дигитонина) лишь незначительно увеличивает скорость дыханиа до 14 ± 3 нмолей О2/мин/ 1клеток. Однако при последующей обработке этих гепатоцитов малыми дозами дигитонина (8 µM) происходит значительное увеличение скорости дыхания клеток и потребления кислорода до 110 ± 9 нмолей О2/мин/ 106 клеток (Рис. 17В, ДИГ 8), демонстрируя что добавленный сукцинат теперь достигает митохондрий. Это заключение подтверждается тем, что добавление малоната, ингибитора митохондриальной сукцинат дегидрогеназы, полностью подавляет потребление кислорода клетками, демонстрируя, что в присутствии дигитонина плазматическая мембрана клеток не препятствует диффузии этих водорастворимых молекул к митохондриям. Стимулирование дыхания контрольных гепатоцитов мало зависело от концентрации дигитонина и при концентрации дигитонина 8-10 µM, достигало плато (Рис. 17Б, см. вставку), указывая, что дыхательная цепь митохондрий в дигитонин-обработанных клетках сохраняет полностью свою активность. Аналогичные данные были получены с пируватом, глутаматом или окисбудтиратом.

Таким образом, изменяя концентрацию дигитонина или стрептолизина О можно селективно увеличивать проницаемость плазматической или внешней мембраны внутриклеточных митохондрий к водорастворимым молекулам разного молекулярного веса.

3. Ингибиторный анализ влияния блокаторов пориновых каналов на основные митохондриальные функции Регуляторная роль каналов-поринов на окислительное фосфорилирование была показана, используя эффект полианиона Коенига (ПАК), известного ингибитора этих каналов (Colombini et al., 1987) на АДФстимулированное дыхание гепатоцитов обработанных дигитонином. Как показано на Рис. 18А, КПА заблокировал ДНФ-стимулированное дыхание клеток, обработанных низкими концентрациями дигитонина A ДНФ Б АДФ (8 µM) на 33% и это 25 KPA 25 KPA ингибирование было почти 11полностью устранено при добавлении к клеткам * * высокой концентрации дигитонина (80 µM).

Подобным образом, ПАК 0 также заблокировал АДФстимулированное дыхание гепатоцитов, обработанных дигитонином на 41%, и Рисунок 18. Влияния полианиона Коенига (ПАК) на дыхание аналогично, увеличение “дырявых” гепатоцитов. А, Добавление полианиона концентрации дигитонина ингибирует ДНФ-стимулрированное дыхание при низких дозах (80 µM) снова сняло это дигитонина (ДИГ 8), которое достигает контроля при высоких дозах дигитонина (ДИГ 80). Б, Этот же эффект ПАK ингибирование (Рис. 18Б).

сохраняртся и для АДФ-стимулрированного дыхание клеток:

Полученные нами данные Высокие дозы дигитонина уменьшают ингибирующее свидетельствуют о том, что действие ПАК.

небольшие концентрации дигитонина достаточны для образования пор в плазматической мембране клеток, но явно не достаточны для того чтобы достигнуть и изменить проницаемость внешней мембраны митохондрий. Однако высокие концентрации дигитонина (µM и выше) способны достигнуть митохондрии и образовать поры во внешней мембране для АДФ, АТФ и неорганического фосфата.

Таким образом, закрытие пориновых каналов и последующее подавление главных митохондриальных функций может быть восстановлено при Дыхание Дыхание Нмол/мин/10 клеток Нмол/мин/10 клеток г г г г и г и и г и и Д и Д Д Д Д Д создании альтернативных пор, например обработкой дигитонином, которые позволят обмен субстратами в обход закрытых пориновых каналов.

4. Этанол подавляет метаболизм митохондрий в гепатоцитах. Инкубация изолированных гепатоцитов с этанолом подавляет скорости ДНФ – и/или АДФ - зависимого потребления кислорода в гепатоцитах с плазматической мембраной, которая «продырявлена» дигитонином (Рис. 19). Изолированные гепатоциты были инкубированы в культуральной среде с 50 мМ этанола в течении 60 минут, отмыты в среде без этанола, отцентрифугованы и суспендированы в среде внутриклеточного состава и хранились на льду. Дыхание Б Контроль Этанол A интактных гепатоцитов после обработки этанолом 100 1значительное ускорилось и * стало 23 ± 2 нмолей О2/мин/ 50 106. по сравнению с 12 ± нмолями О2/мин/ 106 клеток.

Малые концентрации 0 дигитонина увеличили АДФстимулированное дыхание контрольных гепатоцитов более чем в 6 раз, от 12 ± Рисунок 19. Дигитонин восстановливает дыхание гепатоцитов до 78 ± 4 нмолей О2/мин/ 1заингибированное этанолом. А, Дыхание контрольных клеток клеток до 98 ± 4 нмолей (2 х 106клеток/мл) в присутствии сукцината (5 мМ) и АДФ (5О2/мин/ 106 клеток, то время µM) после добавления дигитонина (ДИГ 8) и (ДИГ 80). Б, Дыхание клеток обработанных этанолом (60 минут, 370С) в как дыхание клеток, условиях аналогичных контрольным: 5 µМ сукцината, 500 µM обработанных этанолом АДФ после добавления дигитонина (ДИГ 8) и (ДИГ 80).

возросло чуть больше чем в 2 раза, от 23 ± 2 до 57 ± 4 нмолей О2/мин/ 106 клеток. (Рис. 19А, ДИГ 8).

Совершенно другая картина наблюдается при обработке тех и других гепатоцитов высокими концентрациями дигитонина. Если при увеличении концентрации дигитонина скорость АДФ-зависимого дыхания митохондрий в контрольных гепатоцитах изменилась всего на 5% и достигла 82 ± 6 нмолей О2/мин/ 106 клеток, то эта же концентрация дигитонина увеличила скорость АДФ-зависимого дыхания этанольных гепатоцитов почти в два раза и достигла 77 ± 4 нмолей О2/мин/ 1клеток вместо 57 ± 4 нмолей О2/мин/ 106 клеток и дыхание этанольных клеток, обработанных высокими Б A концентрациями дигитонина, Цитозоль Клетки возросло и достигло уровня Этанол близкого к дыханию контрольных клеток (Рис.

** ** 50 50 19А, Диг 80). Таким образом, проницаемость пориновых * * 25 25 каналов в мембране митохондрий определяет скорость дыхания клеток, 0 0 обработанных этанолом и измеренных в присутствии дигитонина. Обработка клеток этанолом не привела Рисунок 20. Дигитонин восстанавливает доступность АК в к каким-либо изменениям в гепатоцитах. А, Активность цитоплазматической АК в контрольных и этанольных клетках. Б, Активность АК активности АК в цитоплазме, связанной с гепатоцитами, обработанными низкими (ДИГ 8) которая осталась на уровне и высокими (ДИГ 80) дозами дигитонина.

50% от общей активности АК Дыхание Дыхание Нмол/мин/10 клеток Нмол/мин/10 клеток Аденилаткиназа Аденилаткиназа % от общей активности % от общей активности г г г г и г и г и и и и Д Д Д Д Д Д ь л л о о г г н р г и и а т и т Д Д н Д Э о К в контрольных гепатоцитах (Рис. 20). Однако эта же обработка клеток этанолом существенно уменьшила активность АК, которая осталась связанной с «дырявыми» клетками. В «дырявых» гепатоцитах активность AK, которая осаждается вместе с клетками после обработки малыми дозами дигитонина, уменьшилась от 48% в контрольных клетках до 24% в клетках обработанных этанолом (Рис. 20Б, Диг 8). Последующая обработка гепатоцитов высокими дозами дигитонина почти полностью восстановила измеряемую активность АК, которая достигла 49% от контроля (Рис. 20Б, Диг 80).

5. Внутриклеточное распределение флуоресцентно-меченного декстрана для оценки состояния пориновых каналов во внешней мембране митохондрий.

Для отслеживания состояния пориновых каналов мы предложили и разработали новый метод, основанный на прямом отслеживании внутриклеточного распределения флуоресцентной метки с использованием флуоресцентной конфокальной лазерной микроскопии. Для маркировки внутриклеточных митохондрий и облегчения визуального контроля над внутриклеточным распределением декстрана в «продырявленных» клетках, исходные целые гепатоциты (до обработки дигитонином) были проинкубированы с MitoTracker Green (МТГ) зеленой флуоресцентной краской, которая специфически накапливается в митохондриях и окрашивает их в характерный зеленый цвет (Рис. 21А). В качестве флуоресцентного зонда для отслеживания статуса пориновых каналов мы использовали молекулы АБВ декстрана, размером 3,0Да, к которым ковалентно пришиты флуоресцентные молекулы красителя, тетраметилродамина, и таким образом позволяя 20 µm измерять внутриклеточное флуоресцентной красной метки с помощью 60 с 120 с 60 с 300 с конфокальной микроскопии.

Как отмечалось выше, РоДек Разрыв DIDS Обработка молекулы с размером & MTG РоДек меньше 5 кДа могут & DIDS свободно проходить через открытые пориновые 2 µm Г ДЕ каналы во внешней мембране митохондрий (Colombini, 2004). Молекулы декстрана, которые после ковалентной сшивки с флуоресцентным ТМРМ имеют молекулярный вес МТЗ РоДек Вместе около 3,000 Да могут Рисунок 21. Схема механического разрушения плазматической мембраны гепатоцитов и внутриклеточного свободно диффундировать распределения молекул декстрана (РоДекс). Клетки с через открытые пориновые митохондриями (А, зеленая флуоресценция, MTG), рассечены каналы, в то время как микропипеткой (А, разрезы показаны белой стрелкой) и размер поры в закрытом инкубированы дехтраном (Б, красная флуоресценция, состоянии не достаточен РоДекс). В отмытых клетках (В) красная и зеленая флуоресценции полностью перекрываются (Г, Д и Е), для прохождения этих свидетельствуя о том, что молекулы декстрана захвачены в молекул. Подробная схема межмембранное пространство митохондрий.

этих экспериментов и механическое разрушение плазматической мембраны гепатоцитов, которое обеспечивает вход молекул ДИГИТОНИН декстрана в цитоплазму, показана на рисунке 21. Микропипетка опускается до того уровня, когда она соприкасается с мембраной гепатоцитов на стекле и после этого “протягивается” через все соседние клетки так, чтобы механически разорвать те клетки, ПИПЕТКА которые находились на пути стеклянной пипетки. После механического разрыва клеточной мембраны и получения доступа к цитоплазме и митохондриям (Рис.

21А), пипетка убиралась, и среда инкубации была заменена на другую, содержащую красную флуоресцентную метку Ро-Дек. На Рисунок 22. Накопление флуоресцентного декстрана (Ро-Декс) в митохондриях гепатоцитов после изображении, показанном на Рис.

удаления барьера плазматической мембраны либо 21Б, зеленые митохондрии в дигитонином (ДИГИТОНИН) либо механическим клетках отчетливо видны на ярком повреждением микропипеткой (ПИПЕТКА).

фоне красной флуоресценции.

Митохондрии (MTG, зеленая флуоресценция), Видно, что краска Ро-Дек, которая сохраняется после обработки дигитонином или повреждения пипеткой. В отмытых от РоДекс пронизывает цитоплазму и в клетках, красная флуоресценция остается только в пермеабилизованных клетках митохондриях.

флуоресценция обнаруживается внутри клеток в цитоплазме, ядре, а также внутриклеточных структурах (Рис. 21Б).

Несмотря на повреждение плазматической мембраны клеток, митохондрии (зеленая флуоресценция) сохраняют характерную и типичную для печеночных клеток форму и структуру. Митохондрии, которые видны как зеленые органеллы, окруженные красной флуоресценцией пронизывающей всю цитоплазму (Рис.

21Б) оказываются также местом накопления и красной флуоресценции (Рис. 21В).

После 2 минут инкубации, для того чтобы позволить молекулам декстрана проникнуть во все внутриклеточные подразделы, доступные для молекул размером 3 кДа, включая и межмембранное пространство митохондрий, клетки были обработаны ДИДС, ингибитором пориновых каналов, чтобы предотвратить выход молекул декстрана из межмембранного пространства. Затем несвязанные молекулы декстрана отмывались, и изображение клеток анализировалось при большем увеличении. После отмывки клеток, красная флуоресценция исчезла везде за исключением ядра и митохондрий. При более высоком увеличении (Рис.

21Г, 21Д и 21Е), видно, что красная и зеленая флуоресценция внутри клеток локализуются в одном и том же пространстве Отчетливо видно, что обе краски, и красная и зеленая, обнаруживаются только в зоне митохондрий (Рис. 21). Кроме того, флуоресценция иногда видна в области ограниченной клеточным ядром, а также локализуется внутри маленьких ярких красных структур, которые появляются в клетках после инкубации с флуоресцентным декстраном, но не являются митохондриями, так как они не показывают никакой ассоциации с зелеными митохондриями (Рис. 21 и Рис. 22). По-видимому, это или лизосомы, или эндосомы или аутофагосомы (Lemasters & Holmuhamedov, 2005). Мембрана клеток может быть «повреждена» одним из двух независимых методов: либо с помощью микропипетки или же после обработки дигитонином (Рис. 22). Данные, полученные с помощью микропипетки или дигитонина и конфокальной микроскопии, подтверждают, что эти данные не отличаются друг от друга и молекулы декстрана (3кДа) попадают в пространстве между митохондриальными мембранами, через открытые пориновые каналы (Рис. 22). При наличии “дырок” в клеточной мембране гепатоцитов, красные молекулы флуоресцентного декстрана могут свободно проникать в цитоплазму, и заполнять все доступное внутриклеточное пространство. Для наших целей существенным является то, что молекулы декстрана могут проникнуть через пориновые каналы во внешней мембране митохондрий также и в свободное пространство между двумя мембранами митохондрий (Рис. 22). Ингибирование пориновых каналов ДИДС'ом, перед тем как к клеткам были добавлены 3кДа молекулы декстрана, существенно снизило флуоресценцию, которая была ассоциирована с митохондриями, таким образом, свидетельствуя о том, что краска проходит через пориновые каналы (Рис. 22). Интересно, что красные молекулы родамин- декстрана накапливаются также и в изолированных митохондриях (Рис. 23). Выделенные митохондрии были иммобилизованы на обыкновенном покровном стекле, предварительно покрытым коллагеном из хвоста крысы, были покрашены зеленой митохондриальной флуоресцентной краской (MitoТrackerGreen, МТГ), чтобы их можно было различить на фоне красной флуоресценции молекул декстрана на конфокальных картинках (Рис. 23А). При добавлении ТМРМ-декстран большая часть митохондрий набирала эту красную флуоресценцию в пространство ограниченное зеленым. Это отчетливо видно на конфокальных изображениях митохондрий, которые были полученны после блокирования пориновых каналов ДИДСом и отмывки не связавшегося ТМРМ-декстрана из окружающей среды (Рис. 23Б).

Зеленые митохондрии демонстрируют удержание красной флуоресценции внутри зеленого контура, свидетельствуя о то, что молекулы декстрана могут проникать во внешнее пространство митохондрий, и там где интенсивности этих двух флуоресценций Рисунок 23. Накопление РД (красная флуоресценция) в изолированных митохондриях, меченных зеленой совпадают, митохондрии флуоресцентной краской. Иммобилизованные митохондрии окрашены в желтый цвет инкубировались вместе с РД и после блокирования (Рис. 23В). Если пориновые пориновых каналов, несвязанные молекулы РД отмывались.

каналы заблокировать ДИДСом до обработки митохондрий молекулами декстрана, то химическое ингибирование пориновых каналов также предотврашает накопление красной флуоресценции в митохондриях. Таким образом, используя конфокальную флуоресцентную микроскопию, стало возможным непосредственно отслеживать статус пориновых каналов по прохождению флуоресцентной метки размером кДа через внешнюю мембрану митохондрий и накопление ее в межмембранном пространстве как внутриклеточных, так и изолированных митохондрий.

6. Этанол ограничивает диффузию флуоресцентного декстрана в межмембранное пространство митохондрий. Обработка гепатоцитов этанолом и последующее разрушение плазматической мембраны клеток не изменило морфологию и внешний вид митохондрий в клетках. Однако предварительная обработка выделенных гепатоцитов этанолом сопровождалась закрытием пориновых каналов, которое привело к значительному уменьшению интенсивности красной флуоресценции ассоциированной с зелеными митохондриями вследствие подавления “захвата” и удержания красных молекул декстрана в митохондриях (Рис.24). Обработка клеток этанолом или ДИДС, химическим ингибитором пориновых каналов, не изменила внешний вид митохондрий (Рис. 24А, зеленые изображения), однако значительно снизило интенсивность красной флуоресценции, связанной с митохондриями (Рис. 24Б), и оба воздействия, этанол (или ДИДС), уменьшили красную флуоресценцию декстрана (35% и 56%, соответственно) (Рис. 24Б). Предварительная обработка клеток ДИДС, химическим ингибитором пориновых каналов, также снизило флуоресценцию Рисунок 24. Этанол закрывает пориновые каналы молекул декстрана в зонах, митохондрий. А, Интенсивность красной флуоресценции в ассоциированных с митогепатоцитах (Контроль) была значительно подавлена хондриальным матриксом в после обработки этанолом (Этанол) или ДИДСом, гепатоцитах. Результаты этих блокатором пориновых каналов (ДИДС). Б, Интенсивности экспериментов находится в красной флуоресценции молекул декстрана, ассоциированной с митохондриями (зеленая хорошем соответствии с биохимическими данными, представленными в этой работе. В подтверждение, нашей гипотезы, окисление этанола изолированными клетками печени крыс, сопровождается закрытием пориновых каналов во внешней мембране митохондрий, что приводит к ограничению и уменьшению потоков флуоресцентных молекул декстрана, АТФ и АДФ из внешней среды в митохондрии.

Таким образом, ограничение потока метаболитов через внешнюю мембрану митохондрий в результате закрытия пориновых каналов может приводить к глобальной потере митохондриями их специфических функций.

7. Этанол подавляет дыхание гепатоцитов, синтезирующих мочевину.

Синтез мочевины, важнейшего пути обмена азота, который требует больших энергетических затрат и у млекопитающих локализован исключительно в печени (Nissim, 2008). Две энергозависимые реакции цикла мочевины: синтез карбамоилфосфата и затем Фумарат производство цитруллина из Мочевина HO 2 Б A Аргинино- NH4+ + L- орнитин орнитина протекают в матриксе Аргиназа Аргинин сукцинат контроль лиа-за митохондрий (Рис. 25А). Синтез этанолl (mM) 1+ ORNITHINE NH 4 АргининоHCO мочевины в культуре клеток 3 2 ATP сукцинат _ AMP+PPi CPS I печени сопровождается ростом Аргинино2 ADP сукцинат 1синтетаза потребления АТФ, которое ATP OTC требует увеличения активности Pin Аспартат ЦИТРУЛЛИНE _ окислительного метаболизма ЦИТРУЛЛИН митохондрий и, таким образом, 0 14 28 42 56 Время (мин) приводит к активации дыхания Рисунок 25. А – Иллюстрация роли митохондрий в гепатоцитов (Рис. 25). Как и синтезе мочевины. Б – Подавление этанолом дыхания ожидалось, закрывание каналов гепатоцитов, синтезирующих мочевину.

поринов во внешней мембране митохондрий гепатоцитов окисляющих этанол, снижает потребность в производстве АТФ и приводит к подавлению активации дыхания субстратами синтеза мочевины (Рис. 25Б). Эффект этанола зависит от концентрации спирта и чувствителен к действию олигомицина, специфического ингибитора синтеза АТФ в митохондриях (данные не показаны). Подавление синтеза мочевины (и Дыхание (% изменений) И Л Б А М О К А Р И Т И Н О Р Н Т О С Ф А Ф следовательно, дыхания гепатоцитов) этанолом частично обращалось ингибиторами метаболизма этого спирта в клетках печени: 4-метилпиразолом, аминобензотриазолом и цианамидом, указывая на то, что для проявления наблюдаемых эффектов, необходим метаболизм этанола. В настоящее время ведутся исследования по выявлению того, какой из метаболитов окисления этанола участвует в закрывании пориновых каналов.

8. Этанол подавляет митохондриальный путь обмена метильных групп в гепатоцитах. В клетках млекопитающих производство метильных групп осуществляется двумя независимыми путями, локализованными в цитоплазме и матриксе митохондрий (Appling, 1991). Так как транспорт всех водорастворимых метаболитов в митохондриях протекает с участием пориновых каналов, далее мы изучали эффект этанола на реакции синтеза серина из глицина в цитоплазме и митохондриях (Рис. 26А). В интактных клетках печени млекопитающих молекулы глицина транспортируются в цитоплазму вместе с ионами натрия, и далее подвергаются энзиматическому расщеплению цитоплазматическим ферментом глицингидрооксиметилтрансферазой с образованием изотопомеров серина, специфических для цитоплазмы (Рис. 26Б). Кроме того, молекулы глицина транспортируются в матриксе, где расщепляются до аммиака и бикарбонат аниона, а освободившаяся метильная группа, которая конденсируется с другой молекулой глицина, образует набор изотопомеров серина, характерный для митохондрий (Рис. 26Б). Эти изотопомеры имеют различающиеся ЯМР спектры и могут быть количественно оценены в экстрактах клеток метаболизирующих Смеченный глицин. Для мониторинга синтеза метильных групп мы выбрали подход, который основан на том, что ЯМР-спектроскопия позволяет СЕРИН Б А Митохондрия 313С Цитоплазма 213С ГОМОЦИСТЕИН GSH различать сериновые СГЛИЦИН изотопомеры (Pasternack et al., P+PP САМ i i МЕТИОНИН ATP Контроль СИНТЕТАЗА 1992). Типичный ЯМР спектр МЕТИОНИН Bэкстракта клеток печени THF СЕРИН Этанол, 100 мМ 5-CH 2-ТГФ метаболизирующих С-глицин _ ЦСГМТ МТГФР ЭТАНОЛ показан Рис. 26Б, Контроль. На 5,10-CH 2-ТГФ Цистеамин, 100 М СЕРИН МСГМТ спектре можно четко различить 5,10-CH 2-THF два триплета: один, с ГЛИЦИН _ GLYCINE Серин Серин ГЛИЦИН химическим сдвигом ~ 61, что соответствует атому углерода в Химический сдвиг Рисунок 26. А – Иллюстрация роли митохондрий в положении 3 в молекуле 313Собмене и синтезе метильных групп. Б – Подавление серина, который синтезируется этанолом митохондриального синтеза серина из глицина исключительно в митохондриях, в культуре гепатоцитов (13С-ЯМР спектроскопия).

(митохондриальный триплет) и другой, с химическим сдвигом ~ 57 (213С-серин), который синтезируется исключительно в цитоплазме клеток (Pasternack et al.,1994;Dickson et al., 2005).

Здесь мы использовали соотношению этих пиков в триплетах для оценки состояния и активности митохондриального и цитоплазматического путей синтеза серинов. Добавление этанола (Рис. 26Б) снизило пики триплета 313С-серина (митохондриальный путь) оставив практически без изменения пики триплета 213Ссерина (цитоплазматический путь). Цистеамин, известный ингибитор митохондриального синтеза серина полностью подавил митохондриальный пик, оставив почти без изменения цитоплазматический 213С-серин (Рис. 26Б).

9. Закрывание пориновых каналов приводит к увеличению окислительного стресса в митохондриях. Кроме подавления транспорта метаболитов, закрывание пориновых каналов во внешней мембране митохондрий, также будет препятствовать свободному обмену супероксид радикалов через внешнюю мембрану. Эти радикалы образуются при работе дыхательной цепи митохондрий на внешней стороне внутренней мембраны и могут покинуть межмембранное пространство только через None None 88открытые пориновые каналы Ca2+ 50 µM 77(Madesh & Hajnoczky, 2001). Таким Ca2+ 100 µM 66Ca2+ 100 µM образом, закрывание этих каналов должно приводить к избыточному Ca2+ 150 µM 55Ca2+ 200 µM росту и накоплению кислородных 44Ca2+ 250 µM радикалов в митохондриях и 33Ca2+ 250 µM+ окислительному стрессу (Tikunov 2200 Цик А 0 500 1000 1500 2000 250 500 1000 1500 2000 25et al., 2008). Следовательно, Рисунок 27. Изменение оптической плотности закрывание пориновых каналов в суспензии после обработки ионами Ca2+. Циклоспорин изолированных митохондриях А (1M) полностью предотвращает изменение набухания митохондрий, индуцированное ионами Ca2+. приведет к ускоренной активации Ca2+-зависимой поры. Эффект закрывания пориновых каналов на митохондрии, оценивали по способности ионов Ca2+ вызывать открывание неспецифических пор во внутренней мембране митохондрий, которое мы измеряли по изменению поглощения и набуханию (Рис.

27). Время от момента накопления ионов Ca2+ до набухания митохондрий зависит от количества добавленного Ca2+ и ускоряется при его увеличении (Рис. 27).

Закрывание пориновых каналов путем обработки митохондрий G3139 (Genta, USA), ингибитором пориновых каналов (Tan et al., 2007) значительно ускоряла открывание неспецифической поры, что приводило к ускоренному набуханию и изменению оптической плотности суспензии (Рис. 28А). Эффект G3139 полностью снимался антиоксидантами (не показано), указывая, что закрывание пориновых каналов сопровождается ростом окислительного стресса в митохондриях. Прямые измерения содержания супероксид радикалов в 50A Б митохондриях с помощью 840красной флуоресцентной None 2+ метки дигидроксиэтидина 6Ca 302+ (Рис. 28Б) подтвердили, Ca + 20G314что уровень супероксид 2+ Ca + 10радикалов в митохондриях Цикл А 2при закрытии пориновых 0 200 400 600 800 А Н Т И М И Ц И Н А Контроль БЛОКАТОР ПОРИНОВ каналов возрастает, и что Время, сек ДИГИТОНИН последующая обработка Рисунок 28. А-G3139 (5 µМ, 5 мин) блокатор пориновых каналов ускоряет Ca2+-зависимую, циклоспорин А чувствительную пору и митохондрий дигитонином увеличивает уровень супероксид радикалов в митохондриях (Б).

способствует уменьшению Эффект G3139 обращается дигитонином (Tikunov et al., 2008).

окислительного стресса (Рис. 28Б). Это обусловлено тем, что дигитонин за счет образования пор во внешней мембране митохондрий облегчает диффузию анионов из межмембранного пространства (Becker et al., 1980).

Таким образом, закрывание пориновых каналов в функционально активных митохондриях приводит к окислительному стрессу из-за избыточного накопления супероксидных анионов в межмембранном пространстве митохондрий. Супероксид анионы продолжают производиться дыхательной цепью, но уже не могут покинуть митохондрии через закрытые пориновые каналы.

10. Нокаут пориновых каналов в культуре клеток увеличивает токсичность анти-опухолевых препаратов. Митохондриальный окислительный стресс является составным компонентом действия многих анти-опухолевых препаратов (Son et al., 2007). Из предварительных данных о том, что закрывание пориновых Поглощение, мOD Я ВНЫЕ ЕДИНИЦЫ) ФЛУОРЕСЦЕНЦИ (УСЛО Поглощение, мOD каналов усиливает окислительный стресс в митохондриях, мы сделали вывод о том, что ограничение проницаемости внешней мембраны митохондрий путем химического блокирования или генетического нокаута пориновых каналов можно существенно повысить эффективность лекарственных препаратов, направленных на уничтожение раковых клеток путем активации митохондриального апоптоза.

Для количественной оценки активации апоптоза в фибробластах из эмбрионов мыши (ФЭМ) анти-опухолевым препаратом адафостином (5 µМ) мы выбрали определение числа апоптозных ядер в культуре фибробластов мыши (Рис. 29), а также измерение ферментативной активности каспазы 3, которая является типичным индикатором и тесно связана с клеточной гибелью (Рис. 30). В интактных клетках ядра выглядят как равномерно и диффузно окрашенные структуры, таким образом, демонстрируя типичную для A B нормальных ядер морфологию (Рис.29А). Обработка этих клеток адафостином приводит к появлению морфологических изменений клеточных ядер, которые характерны для апоптозной клеточной гибели, сокращение и конденсацией Рисунок 29. Флуоресцентные изображения ядер ядерного материала (Рис.

фибробластов мыши окрашенных красителем йодистым 29Б). Удаление из этих клеток пропидием до (А) и после 6 часовой обработки (Б) одной из изоформ пориновых адафостином (5 µМ). Клетки обрабатывались метанолом и затем раствором йодистого пропидия (30 µг/мл,)в каналов (изоформы порин–1) фосфатном буфере 30 мин при комнатной температуре.

путем нокаутирования гена порин-1, сопровождается повышением чувствительности клеток к действию адафостина. Эти изменения морфологии ядер характерные для апоптозной гибели клеток были более чувствительны к клеткам с нокаутированным пориновым каналом. Клетки фибробластов, в которых генетически нокаутирован один из изомеров поринового канала (порин-1) при обработке адафостином продемонстрировали значительное усиление чувствительности к адафостину, препарату, который специфически индуцирует митохондриальный апоптоз (Son et al., 2007). В нокаутированных клетках, в которых полностью А Б отсутствует белок порин-1, за 60часов инкубации с адафостином Дикий Дикий Нокаут Нокаут активность каспазы 3 была 45увеличена почти в 50 раз в нокаутированных клетках по 30сравнению с контролем (Рис.

30А). Это свидетельствует о том, 15что отсутствие функциональных пориновых каналов в клетках ФЕМ ФЕМ увеличивает цитотоксичность Рисунок 30. А-Активация каспазы 3 в диких (ФЭМ) или лекарственных препаратов в нокаутированных (Нокаут) адафостином индукция десятки раз. Морфологическое апоптоза в клетках с помощью адафостина Активность каспазы 3 G3139 (5 µМ, 5 мин) блокатор пориновых исследование ядер нормальных и каналов, ускоряет Ca2+-зависимую, циклоспорин А нокаутированных фибробластов, чувствительную пору и увеличивает уровень подтвердило, что в клетках с супероксид радикалов в митохондриях (Б). Эффект нокаутированным пориновым G3139 обращается дигитонином (Tikunov et al., 2008).

каналом, количество апоптозных ядер значительно превосходит число апоптозных ядер в клетках с нормальной экспрессией этого белка (Рис.30Б). Таким образом, нокаутирование поринового % от максимального Активность каспазы Число апоптозных ядер (относительные единицы) белка в митохондриях, сопровождается значительным повышением чувствительности клеток к лекарственному препарату, который действует через активацию митохондриального пути апоптозной гибели, подтверждая нашу гипотезу о том, что уменьшение проницаемости внешней мембраны митохондрий химическим блокированием имеющихся пориновых каналов или генетическим нокаутом.

Таким образом, биохимические и биофизические данные, приведенные в настоящей работе, подтверждают правильность нашей гипотезы о том, что закрывание пориновых каналов во внешней мембране митохондрий лежит в основе глобальных нарушений функции митохондрий. Закрывание пориновых каналов, которое также препятствует свободной диффузии супероксид анионов из межмембранного пространства, приводит к накоплению этих радикалов в митохондриях, окислительному стрессу и повышению чувствительности клеток млекопитающих к цитотоксическим агентам, в том числе и к анти-опухолевым препаратам.

ВЫВОДЫ 1. Состояние Ca2+-зависимой неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий определяется количеством ионов Ca2+, наколенных в матриксе.

Малые количества Ca2+ не в состоянии открыть пору, a большие количества Ca2+ индуцируют состоянию с постоянно-открытой порой. В большом диапазоне промежуточных концентраций ионов Ca2+ наблюдаются колебания состояния этой поры между открытым и закрытым состояниями.

2. Показано, что изолированные митохондрии обладают новым свойством, которое мы назвали «митохондриальный Ca2+-индуцированный выброс Ca2+».

Высвобождение ионов Ca2+, предварительно накопленных в матриксе митохондрий, приводит к значительному увеличению концентрации внемитохондриальных ионов Ca2+. Эта способность митохондрий к автокаталитическому увеличению концентрации Ca2+ в среде инкубации лежит в основе нового явления, а именно, возникновению и распространению самоподдерживающихся Ca2+ волн в пространственно-распределенной суспензии изолированных и энергизованных митохондрий.

3. В невозбудимых живых клетках «Ca2+-индуцированный выброс Ca2+ из митохондрий» приводит к тому, что энергозависимый митохондриальный транспорт Ca2+ оказывается основным внутриклеточным элементом, определяющим синхронизацию, высокую амплитуду и скорость распространения Ca2+ сигналов в цитоплазме. Таким образом, энергозависимый транспорт Ca2+ в митохондриях регулирует динамику концентрации свободных ионов Ca2+ в цитоплазме клеток. Кроме непосредственного влияния на амплитуду Ca2+ сигналов в цитоплазме клеток, митохондриальный транспорт Ca2+ определяет синхронность концентрационных Ca2+ волн в цитоплазме клеток.

5. Ишемическое повреждение сердечной мышцы, в первую очередь, проявляется в повреждении митохондриальных функций и действие множества антиишемических фармакологических препаратов направлено на защиту митохондрий. Мы впервые показали, что анти-ишемические широко известные препараты, диазоксида и пинацидила, обладают выраженными протонофорными свойствами и, что в основе их защитного действия, лежит их способность к «слабому» разобщению митохондрий. В подтверждение, мы впервые экспериментально продемонстрировали анти-ишемическое действие 2,4динитрофенола, классического митохондриального разобщителя протонного типа, который, подобно диазоксиду и пинацидилу, значительно уменьшил ишемическое повреждение миокарда.

6. Токсическое действие этанола в печени вызывает глобальную потерю митохондриальных функций. Мы впервые показали, что это обусловлено закрытием пориновых каналов во внешней мембране митохондрий. Закрытие пориновых каналов и сопутствующее увеличение производства NADH, увеличение мембранного потенциала митохондрий и окислительный стресс, сопровождается повышенным повреждающим действием ионов Ca2+ на митохондрии.

7. Показано, что механизм повреждающего действия закрытых пориновых каналов заключается в повышении уровня супероксид радикалов в митохондриях вследствие уменьшения проводимости пориновых каналов во внешней мембране и уменьшения истока супероксид радикалов из межмембранного пространства митохондрий. Таким образом, закрывание пориновых каналов приводит к возрастанию окислительного стресса, и таким образом повышает чувствительность митохондрий к повреждающему действию ионов Ca2+.

8. Обнаруженное в настоящей работе увеличение окислительного стресса, приводящее к повышению чувствительности митохондрий к ионам Ca2+ при закрывании пориновых каналов, было использовано как способ повышения поражающего действия цитотоксических препаратов. В предварительных экспериментах мы продемонстрировали, что обработка клеток млекопитающих ингибиторами пориновых каналов, а также при генетическом удалении этих каналов, снижает эффективную токсическую дозу адафостина, известного противоопухолевого препарата, в десятки раз. В настоящее время проводится дальнейшее исследование эндогенных механизмов регуляции пориновых каналов митохондрий.

Список работ Холмухамедова Э.Л. опубликованных по теме диссертации 1. Dzeja PP, Bast P, Ozcan C, Valverde A, Holmuhamedov EL, Van Wylen DGL, Terzic A. Targeting nucleotide-requiring enzymes: Implications for diazoxide-induced cardioprotection. Am J Physiol 2002, 284:H1048-H1056.

2. Dzeja PP, Bortolon R, Perez-Terzic C, Holmuhamedov EL, Terzic A. Energetic communication between mitochondria and nucleus directed by catalyzed phosphotransfer. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:10156-10161.

3. Dzeja PP, Holmuhamedov EL, Ozcan C, Pucar D, Jahangir A, Terzic A.

Mitochondria: Getaway for cytoprotection. Circ Res 2001, 89:744-746.

4. Evtodienko YV, Zinchenko VP, Holmuhamedov EL, Gylkhandanyan AV, Zhabotinsky AM. The stoichiometry of ion fluxes during Sr2+-induced oscillations in mitochondria.

Biochim Biophys Acta 1980, 589:157-161.

5. Globus RK, Holmuhamedov EL, Lull JC, Lopez V, Doty SB, Moursi A, Damsky C.

Fibronectin is a survival factor for differentiated osteoblasts. J Cell Sci 1998, 111:1385-1393.

6. He T, Peterson TE, Holmuhamedov EL, Terzic A, Caplice NM, Oberley LW, Katusic ZS. Human endothelial progenitor cells tolerate oxidative stress due to intrinsically high expression of manganese superoxide dismutase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004 24:2021-207. Holmuhamedov EL, Bacon JA, Ulrich RG. Nucleotide-induced calcium transient and plasma membrane calcium permeability in Chang Human Liver Cells. Biochem Mol Biol Intern 1995, 35:595-604.

8. Holmuhamedov EL, Evtodienko YuV. Spatial structures in mitochondrial suspension induced by cation efflux. FEBS Lett 1986, 195:339-343.

9. Holmuhamedov EL, Jahangir A, Bienengraeber M, Lewis L, Terzic A. Deletion of mtDNA Disrupts the Function, but not the Biogenesis of Mitochondria Mitochondrion, 2003, 3:13-19.

10. Holmuhamedov EL, Jahangir A, Oberlin A, Komarov A, Colombini M, Terzic A.

Potassium channel openers are uncoupling protonophores: implication in cardioprotection. FEBS Lett. 2004, 568:167-170.

11. Holmuhamedov EL, Jovanovic S, Dzeja P, Jovanovic A, Terzic A. Mitochondrial ATP- sensitive channels modulate cardiac mitochondrial functions. Am J Physiol 1998, 275:H1567-H1576.

12.Holmuhamedov EL, Kholmukhamedova GL, Baimuradov TB. Non-cholinergic toxicity of organophosphates in mammals. Interaction of ethaphos with mitochondrial functions. J Appl Toxicol 1996, 16:475-481.

13. Holmuhamedov EL, Lewis L, Bienengraeber M, Holmuhamedova M, Jahangir A, Terzic A. Suppression of human tumor cell proliferation through mitochondrial targeting. FASEB J, 2002, 16:1010-1016.

14. Holmuhamedov EL, Ozcan C, Jahangir A, Terzic A. Restoration of Ca2+-inhibited oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria by mitochondrial Ca2+ unloading.

Mol Cell Biochem 2001, 220:135-140.

15.Holmuhamedov EL, Sadykov YH, Teplova VV. Oscillation of ion fluxes in mammalian erythrocytes: Mechanism of oscillation. Eur J Biochem 1988, 166:723726.

16. Holmuhamedov EL, Teplova VV, Chukhlova EA, Evtodienko YuV, Ulrich RG.

Strontium excitability of the inner mitochondrial membrane. Regenerative Strontiuminduced Strontium releases. Biochem Mol Biol Intern 1995, 36:39-49.

17. Holmuhamedov EL, Wang L, Terzic A. ATP-sensitive K+ channel openers prevent Ca2+ overload in rat cardiac mitochondria. J Physiol (London) 1999, 519:347-360.

18. Holmuhamedov EL. Oscillating dissipative structures in mitochondrial suspensions.

Eur J Biochem 1986, 158:543-546.

19.Ichas F, Jouaville LS, Sidash S, Mazat J-P, Holmuhamedov EL. Mitochondrial calcium spiking a transduction mechanism based on calcium-induced permeability transition involved in cell calcium signaling. FEBS Lett 1994, 348:211-215.

20.Ichas F, Jouaville LS, Sidash S, Mazat J-P, Holmuhamedov EL. Mitochondrial calcium spiking: The physiological face of permeability transition? Modern Trends in Bio-Thermo Kinetics 1994, 3:159-162.

21. Jahangir A, Ozcan C, Holmuhamedov EL, Terzic A. Increased calcium vulnerability of senescent cardiac mitochondria: Protective role for mitochondrial potassium channel opener. Mech Ageing Develop 2001, 122:1073-1086.

22.Jouaville LS, Ichas F, Holmuhamedov EL, Camacho P, Lechleiter JD.

Synchronization of calcium waves by mitochondrial substrates in Xenopus l.

Oocytes. Nature 1995, 377:438-441.

23. Le SB, Hailer MK, Buhrow S, Wang Q, Flatten K, Pediaditakis P, Bible KC, Lewis LD, Sausville EA, Pang YP, Ames MM, Lemasters JJ, Holmuhamedov EL, Kaufmann SH. Inhibition of mitochondrial respiration as a source of adaphostininduced reactive oxygen species and cytotoxicity. J Biol Chem 2007 Jan 9; [Epub ahead of print] 24. Le SB, Holmuhamedov EL, Narayanan VL, Sausville EA, Kaufmann SH. Adaphostin and other anticancer drugs quench the fluorescence of mitochondrial potential probes. Cell Death Differ. 2006, 13:151-159.

25. Lemasters JJ, Holmuhamedov EL. Voltage-Dependent Anion Channel (VDAC) As Mitochondrial Governator – Thinking Outside the Box. Biochim Biophys Acta 2006, 1762:181-190.

26. Maglova LM, Holmuhamedov EL, Zinchenko VP, Evtodienko YV. Induction of 2H+/Me2+ exchange in rat-liver mitochondria. Eur J Biochem 1982, 128:159-161.

27. Ozcan C, Jahangir A, Holmuhamedov EL, Terzic A. Diazoxide protects mitochondria from anoxic injury: Implications for myopreservation. J Thorac Cardiovasc Surg 2001, 121:298-306.

28.Pokhilko AV, Ataullakhanov FI, Holmuhamedov EL. Mathematical model of mitochondrial ionic homeostasis: Three modes of Ca2+ transport. J Theor Biol 2006, 243:152-169.

29. Sadykov YH, Holmuhamedov EL, Evtodienko YV. Effect of pH and proton buffer on oscillations of ion fluxes in rat erythrocytes. Eur J Biochem 1984, 143:369-371.

30. Selivanov VA, Ichas F, Holmuhamedov EL, Jouaville LS, Evtodienko YuV, Mazat JP. A model of mitochondrial Ca-induced Ca release simulating the Ca oscillations and spikes generated by mitochondria. Biophys Chem 1998, 72:111-121.

31. Stasko NA, Johnson CB, Schoenfisch MH, Johnson TA, Holmuhamedov EL.

Cytotoxicity of Polypropylenimine Dendrimer Conjugates on Cultured Endothelial Cells. Biomacromolecules. 2007 Nov 16; [Epub ahead of print] 32. Terzic A, Dzeja P.P, Holmuhamedov EL. Mitochondrial KATP Channels: Probing Molecular Identity and Pharmacology. J Mol Cell Cardiol 2000, 32:1911–1915.

33. Theruvath TP, Zhong Z, Pediaditakis P, Ramshesh VK, Currin RT, Tikunov A, Holmuhamedov E, Lemasters JJ. Minocycline and N-methyl-4-isoleucine cyclosporin (NIM811) mitigate storage/reperfusion injury after rat liver transplantation through suppression of the mitochondrial permeability transition. Hepatology. 2007 Nov 19;

[Epub ahead of print] 34.Ulrich RG, Bacon JA, Cramer CT, Petrella DK, Sun EL, Meglasson MD, Holmuhamedov EL. Disruption of mitochondrial activities in rabbit and human hepatocytes by a quinoxalinone anxiolytic and its carboxylic acid metabolite.

Toxicology 1998, 131:33-47.

35. Wiswedel I, Barnstorf U, Augustin W, Holmuhamedov EL, Medvedev B, Evtodienko Y. Involvement of periodic deacylation-acylation cycle of mitochondrial phospholipids during Sr2+-induced oscillatory ion transport in rat liver mitochondria. Biochim Biophys Acta 1982, 688:597-604.

36. Гольдштейн БН, Холмухамедов ЭЛ, Иванова АН, Фурман ГА. Ионофориндуцированные колебания в эритроцитах. Кинетическая модель. Мол Биол 1987, 21:132-139.

37. Теплова ВВ, Евтодиенко ЮВ, Холмухамедов ЕЛ, Сергеенко НГ, Гончаров НВ.

Еффект флуороцитрата на поглощение кислорода и транспорт в митохондриях печени. Цитология 1992, 34:71-75.

38. Теплова ВВ, Сидаш СС, Евтодиенко ЮВ, Холмухамедов ЭЛ. Характер и механизм изменений содержания АТФ в митохондриях в ходе колебаний ионных потоков. Биохимия 1991, 56:1975-1983.

39. Холмухамедов ЭЛ, Зинченко ВП, Евтодиенко ЮВ. Автоколебания ионных потоков и редокс состояния дыхательной цепи в митохондриях. Биофизика 1980, 25:124-128.

40. Холмухамедов ЭЛ, Селиванов ВА, Ким ЮВ. Математическая модель колебаний ионных потоков в эритроцитах млекопитающих. Биофизика 1990, 35:373-377.

41. Холмухамедов ЭЛ, Семенова ГА, Зинченко ВП, Евтодиенко ЮВ, Кондрашова МН. Обратимые изменения обьема митохондрий в ходе колебаний ионных потоков между митохондриями и средой. Цитология 1982, 24:1024-1027.

42. Холмухамедов ЭЛ, Чухлова ЭА. Эффект ионов двухвалентных металлов на колебания ионных потоков в митохондриях печени крыс. Укр Биох Ж 1985, 57:43-49.

43. Чухлова ЭА, Садыков ЮХ, Холмухамедов ЭЛ, Гренадер АК. Эффект тримекаина, аймалина, стеноприла и хлорацизина на колебания потоков в митохондриях печени крыс. Укр Биох Журнал 1984, 56:207-210.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.