WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

ТОМИЛИН Алексей Николаевич

РОЛЬ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА OCT4 В ПОДДЕРЖАНИИ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2009

Работа выполнена в Европейской молекулярно-биологической лаборатории (Гейдельберг, Германия), Пеннсильванском университете (Филадельфия, США), Институте иммунобиологии им. Макса Планка (Фрайбург, Германия) и в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург).

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Воробьёв Владимир Иосифович Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук, профессор Киселёв Олег Иванович Институт гриппа РАМН, Санкт-Петербург доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития РАН, Москва

Защита состоится 20 ноября 2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194964 СанктПетербург, Тихорецкий пр., 4, Факс (812) 297-03-Сайт института: http://www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан «____» ____________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н. Е.В.Каминская 2  Посвящается светлой памяти моего отца и истинного учёного Томилина Николая Викторовича

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

#

Актуальность темы Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, впервые полученные в 80-е годы из ранних эмбрионов мыши, уже на протяжении более чем двух десятилетий остаются важным инструментом для изучения функции генов методом нокаута. Важность открытия ЭС клеток нашла свое отражение в Нобелевской премии за 2007 г., присуждённой Эвансу, Капекки и Смитису. Изолированные из внутренней клеточной массы бластоцисты, ЭС клетки способны неограниченно долго делиться в культуре, а также подвергаться генетическому манипулированию, сохраняя свои свойства. Путём изменения условий культивирования можно добиваться дифференцировки ЭС клеток in vitro практически во все клеточные типы тканей взрослой мыши (за исключением двух внезародышевых клеточных типов – трофэктодермы (ТЭ) и первичной эндодермы). После подсадки в доимплантационные эмбрионы ЭС клетки способны встраиваться в ткани, происходящие из всех трех зародышевых листков, и, что существенно для успешного проведения генного нокаута, в линию половых клеток, обеспечивая тем самым передачу введенных генных мутаций в следующие поколения. Описанные свойства обозначаются термином клеточная плюрипотентность. Неотъемлемым компонентом регулярного аппарата ядра, # Принятые сокращения: ВКМ – внутренняя клеточная масса, иПС клетки – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, КСК – кроветворные стволовые клетки, МСК – мезенхимные стволовые клетки, МЭФ – мышиные эмбриональные фибробласты, ППК – первичные половые клетки, ПЦР – полимеразная цепная реакция, СЭПГ – сдвиг электрофоретической подвижности в геле; ТЭ – трофэтодерма, дпо – дней после оплодотворения, ЦНС – центральная нервная система, ЭС клетки – эмбриональные стволовые клетки, bFGF – basic fibroblast growth factor, Cre – causing recombination, ER – estrogen receptor, flox – flanking loxP, hCG – human chorionic gonadotropin, LIF – leukemia inhibitory factor, MORE – мore of PORE, OPN – остеопонтин, PIAS – protein inhibitor of activated STAT, PMS – pregnant mares’ serum, PORE – palindromic Oct-recognition element, PR – progesterone receptor, shRNA – small hairpin RNA, SUMO – small ubiquitin-related modifier, TNAP – tissue nonspecific alkaline phosphatase, TUNEL – terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling 3  обеспечивающим поддержание плюрипотентности, является POU-доменный транскрипционный фактор Oct4.

В 1998 г. Томсоном были впервые получены ЭС клетки человека [1], что открыло путь для использования этих клеток в заместительной терапии и дало следующий мощный стимул исследованиям в области биологии стволовых клеток. На сегодняшний день получены уже несколько десятков линий ЭС клеток человека, стали известны некоторые молекулярные и генетические аспекты механизма регуляции самообновления и плюрипотентности ЭС клеток мыши и человека, проведены широкомасштабные работы по оптимизации способов их дифференцировки в различные клеточные типы. Однако очевидны и серьёзные ограничения, заметно отдаляющие перспективу применения ЭС клеток в клинической практике, какими являются (а) туморогенность и (б) отсутствие этих клеток во взрослом организме с возникающей вследствие этого проблемой иммунной несовместимости при аллогенной трансплантации дифференцированных производных от уже полученных человеческих ЭС линий. Первая трудность пока еще ждет своего решения, тогда как для решения второй уже предложены несколько подходов. Во-первых, создание банков человеческих ЭС клеток, охватывающих все HLA типы, поможет решить эту проблему, но это, по-видимому, будет (если будет) реализовано только в отдаленной перспективе. Во-вторых, терапевтическое клонирование было предложено как альтернативный метод получения аутологичных (пациент-совместимых) ЭС клеток. При таком подходе ядра соматических клеток пациента подсаживают в безъядерные ооциты. ЭС клетки затем получают в культуре из развившихся клонированных бластоцист. Это весьма дорогостоящий и малоэффективный метод, который к тому же предполагает уничтожение доимплантационных человеческих эмбрионов, что запрещено в некоторых странах по этическим соображениям. Поэтому получение аутологичных ЭС или подобных клеток непосредственно из соматических клеток пациента, не прибегающее к терапевтическому клонированию, представлялось крайне актульным. Подобная идея доказала свою состоятельность, когда одна группа из Киотского университета путём простого перебора различных комбинаций из 24 генов, экспрессия которых 4  ассоциирована с ЭС фенотипом, показала возможность индукции плюрипотентного состояния соматических клеток (МЭФ) при помощи форсированной генной экспрессии [2]. Как оказалось, экспрессии 4 транскрипционных факторов Oct4, Sox2, cMyc и Klf4, доставленных в фибробласты при помощи ретровирусных векторов, на протяжении нескольких дней было достаточно для получения иПС клеток.

Полученные иПС клетки обладали всеми свойствами, присущими ЭС клеткам мыши, т.е. способностью самообновляться и дифференцироваться in vivo и in vitro во все эмбриональные типы клеток, включая половые клетки. За последующие 3 года вышло большое количество работ по данной тематике, описавших альтернативные комбинации транскрипционных факторов, улучшающие эффективность получения иПС клеток у разных видов (включая человека), предложивших различные способы доставки (вирусный, плазмидный, транспозонный, белковый), использовавших различные исходные соматические клеточные типы для получения иПС клеток и т. д.

[3,4]. Стало совершенно понятно, что клеточная терапия, основанная в первую очередь на иПС клетках, уже в ближайшие годы сулит здоровью человечества огромные выгоды.

Примечательно, что во всех используемых комбинациях транскрипционных факторов и при всех условиях культивирования для успешной индукции плюрипотентности в соматических клетках было абсолютно необходимо введение POU-доменного транскрипционного фактора Oct4, тогда как введение остальных факторов не было обязательным.

Цель и задачи исследования Цель работы состояла в изучении биологической роли Oct4 и молекулярных механизмов действия этого белка как ключевого для клеточной плюрипотентности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд конкретных задач:

1. Выяснить, выполняет ли Oct4 в ППК функцию, сходную с той, какую он несет в раннем эпибласте и ЭС клетках, а именно поддержание плюрипотентного недифференцированного статуса клеток.

5  2. Опровергнуть или подтвердить большое число противоречивых литературных данных, которые показывают экспрессию Oct4 в соматических стволовых клетках взрослой мыши, а также указывают на возможную функцию Oct4 в этих клетках.

3. Изучить возможность существования новых типов связывания ДНК димерами POU-доменных транскрипционных факторов Oct-подсемейства (Oct1, Oct2, Oct4 и Oct6), провести структурно-функциональные исследования новых типов димеров.

4. Провести поиск новых транскрипционных партнеров белка Oct4, изучить их роль в модуляции активности Oct4.

5. Исследовать способность лентивирусов селективно заражать первые ТЭ и и также и проходить через этот эпителий первый тип эпителия; исследовать возможность использования этих вирусов для селективного генного манипулирования в плаценте.

Основные положения, выносимые на защиту 1. В отличие от трофобластной дифференцировки плюрипотетных клеток ранних зародышей мышей, их непосредственные потомки – ППК – при генетическом нокаутировании гена Oct4 подвергаются апоптотической гибели, что указывает на плейотропные функции в развитии клеток «полового пути».

2. Ген Oct4 не экспрессируется и не нужен для самообновления и дифференцировки взрослых соматических стволовых клеток, таких как нейрональные стволовые клетки, КСК и МСК костного мозга, а также стволовые клетки крипты эпителия кишечника, печени, и волосяного фолликула.

3. Существует новый класс cis-элементов в ДНК (MORE), опосредующих связывание гомо- и гетеродимеров Oct-факторов в ранее не описанной конфигурации, что было подтверждено после определения молекулярной структуры MORE и ранее описанного PORE типа POU димеров. Фосфорилирование серинов и треонинов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях внутри PORE и MORE типов POU димеров, играет важную биологическую роль в селективной регуляции димеризации по двум описанным типам.

6  4. Димерный комплекс Oct1, образованный на PORE, способен рекрутировать изветный лимфоидный коактиватор OcaB и, тем самым, стимулировать транскрипцию, в то время как конфигурация POU димера, образованного на MORE ДНК, является непермиссивной для взаимодействия с OcaB. Природные MORE сайты, выявленные в промоторах генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (VH) также непермисивны для OcaB.

5. OcaB может выступать в роли мощного стабилизатора димера Oct1 на PORE ДНК, а также в роли коактиватора, ослабляющего требования к специфичности в последовательности PORE. Полученные нами данные предполагают альтернативное соединение POUS и POUH суб-доменов в димерном Oct1/PORE комплексе в присутствии OcaB.

6. PIASy, один из известных членов семейства SUMO лигаз, является впервые описанным негативным транскрипционным ко-регулятором Oct4, способным взаимодействовать с POU доменом Oct4 через свой SAP домен и репрессировать (независимо от его SUMO-лигазной активности) Oct4-опосредованную транскрипционную активацию посредством релокализации Oct4 на периферию ядра.

7. Лентивирусы способны заражать ТЭ бластоцисты, однако, ввиду эпителиальной природы последней, не способны проникать через ТЭ и заражать клетки ВКМ.

Данное свойство лентивирусов может быть использовано в функциональной генетике мыши для тканеспецифических генных манипуляций.

Научная новизна работы Данная работа представляет собой первое генетическое исследование функции гена Oct4 в первичных половых клетках (ППК). Впервые показано, что утеря функции одного гена в различных клеточных контекстах может проявляться в совершенно различных фенотипах. С другой же стороны, показано отсутствие функции Oct4 в соматических стволовых клетках, что должно положить конец многочисленным основанным на недостоверных данных спекуляциям, предполагающим обратное. В работе охарактеризована новая димерная конфигурация Oct-белков, возникающая при 7  связывании нового класса ДНК элементов. Сформулирована концепция, основанная на структурно-функциональных данных и постулирующая, что альтернативные конформация POU димеров могут по-разному взаимодействовать с транскрипционными кофакторами, оказывая тем самым различное влияние на транскрипцию. Такой механизм может обеспечивать регуляцию многообразных биологических процессов сравнительно небольшим числом белков POU семейства. В работе выявлен первый негативный транскрипционный регулятор функции Oct4 – белок PIASy. Наконец, впервые показана способность первого эпителиального типа, возникающего при развитии млекопитающих – ТЭ – служить непроницаемым барьером для вирусов, что имеет важные приложения в функциональной генетике мыши и, возможно, в лечении плацентарных заболеваний.  Теоретическое и практическое значение работы Работа имеет как фундаментальную, так и практическую направленность. Ее результаты важны, в первую очередь, для понимания механизмов регуляции самообновления и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, создают научно-теоретический базис и открывают перспективы их дальнейшего исследования в контексте клинического применения этих клеток в тканезаместительной терапии у человека. В представленной работе были продемонстрированы среди прочих (а) плодотворность условного генного нокаута при изучении функции гена, имеющего ранний летальный фенотип, и (б) успешность мультидисциплинарного подхода при изучении структурно-функциональных аспектов действия димеров POU-доменных транскрипционных факторов. Данные подходы могут быть рекомендованы для углубленного изучения ряда проблем эмбриогенеза и регуляции транскрипции.

Результаты работы используются при чтении курса лекций по трансгенезу для аспирантов Института иммунобиологии Макса Планка (Фрайбург, Германия). Они могут быть использованы в курсах лекций по частным разделам биологии развития, клеточной биологии, генетики, структурной биологии, при подготовке специалистов 8  в других высших учебных заведениях медико-биологического профиля и включены в руководства и учебные пособия по данным специальностям.

Апробация работы.  Материалы работы были представлены на конференциях по регуляции транскрипции (Колд Спринг Харбор, США, 2000), по развитию половых клеток (Колд Спринг Харбор, США, 2002, доклад), конференции научного сообщества Макса Планка по стволовым клеткам (Рингберг, Германия, 2005, доклад), конференции “Функциональная геномика эмбриональных стволовых клеток” (EMBL, Гейдельберг, Германия, 2007), Юбилейной конференции Института цитологии РАН (CанктПетербург, 2007, доклад), Российско-немецком двустороннем симпозиуме «Молекулярная биомедицина» (Санкт-Петербург, 2008, доклад). Финансовая поддержка работы осуществлялась грантами EMBO short-term fellowship, EMBL postdoctoral allowance, Marion Dilley and David George Jones Funds, Commonwealth and General Assembly of Pennsylvania, Max-Planck Gesselsсhaft, Alexander-von-Humboldt Stiftung, РФФИ (07-04-01154-a), РФФИ-Гельмгольц 07-04-92281-СИГ_а/HRJRG-024), программы МКБ «Новые группы», Гос. контракта 02.512.11.2253 с Мин. науки по программе «Живые системы».

Публикации По теме диссертации опубликовано 12 статей в международных и отечественных рецензируемых журналах.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного молекулярной биологии стволовых клеток и механизмам регуляции транскрипции, описания материалов и методов исследования, главы «Результаты и обсуждение», объединяющей _____ подглавы, в которых приводится изложение экспериментальных данных с их обсуждением, заключения, выводов и списка цитируемой литературы ( _____ наименования). Работа изложена на _____ страницах машинописного текста и содержит _____ иллюстраций и _____ таблицы.

9  КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Для проведения условного нокаута по гену Oct4 создавали плазмидную конструкцию, включающую ген устойчивости к неомицину (Neo), три сайта loxP и плечи гомологии к Oct4 локусу, как это изображено (Рис. 1). Данную конструкцию вводили в ЭС клетки линии E14 129/Ola электропорацией, G418-резистентные колонии отбирались и анализировались методами ПЦР и Саузерна для идентификации тех из них, в которых произошло встраивание в Oct4 локус всех 3 loxP сайтов и Neo кассеты [5].

Для выщепления Neo гена в floxNeo локусе проводили второй раунд электропорации Cre-экспрессирующей плазмидой. Клоны с типом делеции - (аллель Oct4flox, flox означает flanked loxP) отбирались, подтверждались ПЦР и Саузерн блотгибридизацией геномной ДНК и использовались для инъекций в бластоцисты мышей линии С57Bl(Рис. 1). Полученные химеры обратно скрещивали с C57Bl6 мышами с целью передачи flox мутации потомству.

Oct4flox мышей переводили в гомозиготное состояние, а затем скрещивали с TNAPCre мышами, экспрессирующими Cre рекомбиназу под контролем гена тканеРис. 1. Схема, иллюстрирующая получение Oct4flox аллеля в ЭС клетках для дальнейшего неспецифической щелочной проведения условного нокаута на мышах.

фосфатазы. Cre рекомбиназа в данной Условные обозначения: овал – промотор, черные прямоугольники – экзоны, треугольники – loxP линии экспрессируется в ППК, а после сайты, стрелки – места отжига праймеров для генотипирования алелей.

10.5 дпо – дополнительно в некоторых соматических тканях [6]. Поскольку экспрессия Oct4 после 7.5 дпо ограничена исключительно половыми клетками, его выщепление под действием Cre в этих соматических клетках себя никак не проявляет, а фенотип, который наблюдается в 10  ППК, является клеточно-автономным. При проведении нокаута в соматических тканях [7] Oct4flox мыши скрещивали с мышами различных линий, экспрессирующими Cre индуцибельным и(или) ткане-специфическим способом. Основные методики, использованные нами при проведении нокаутов, изложены в известных руководствах по генетике мыши [8-10].

Основным методом, используемым при изучении комплексов POU-доменных белков с ДНК, был метод СЭПГ, в котором меченные изотопом 32P двухцепочечные олигонуклеотиды (длина 20-50 пн), содержащие исследуемые сайты, инкубировали с экспрессированными в бактериях белками или клеточными экстрактами; комплексы затем разделяли электрофоретически в неденатурирущих 4-6%-ных полиакриламидных гелях [11-13].

Способность изучаемых ДНК сайтов опосредовать транскрипционную активацию исследовали методом временной трансфекции, для чего олигонуклеотиды, содержащие эти сайты, сначала мультимеризовали, а затем клонировали перед минимальным tk промотором, направляющим базальную экспрессию люциферазного гена (luc). Эти репортерные плазмиды затем ко-трансфецировали, отдельно или вместе с Oct-экспрессирующими векторами, в клетки млекопитающих с использованием липофектаминовых реагентов.

Сайт-направленный мутагенез POU-белков проводили при помощи ПЦР. При определении структуры ДНК-белковых комплексов экспрессированные в бактериях POU домены денатурировали, постепенно ренатурировали в присутствии PORE- и MORE-содержащих олигонуклеотидов, затем кристаллизовали. Рентгеноструктурные исследования выращенных кристаллов проводили на ускорителе DESY (EMBL, Гамбург).

Для изолирования новых Oct4-взаимодействующих факторов, библиотеку кДНК, созданную на основе мРНК из 11-дневных эмбрионов мыши, клонированную в pACT2 векторе и пре-трансформированнуя в дрожжевой штамм Y187, подвергали двугибридному скринингу путём скрещивания с дрожжевым штаммом AH109, несущим вектор-наживку pBD-GAL4-POU4. кДНК из прошедших два раунда селекции клонов была секвенирована и подвергнута дальнейшему анализу.

11  В опытах по иммунопреципитации клетки 293T трансфецировали кальцийфосфатным методом комбинациями плазмид, экспрессирующих таггированые MT, Tи FLAG пептидами PIAS и Oct4 белки, а также их мутанты. Лизаты транфецированных клеток затем инкубировали с соответствующими антителами на таг-пептиды, иммобилизованными на агарозе. Элюированные после промывок матрицы белки анализировали на иммуноблотах c использованием конъюгированных с пероксидазой антител против вышеупомянутых пептидных тагов.

Иммунофлуоресцентную окраску трансфецированных клеток линий HeLa, C2C12 и 293 проводили после их фиксации в 1 %-ном параформальдегиде, приготовленном на буфере ТФС (10 мM Tris-HCl pH8.0, 13.5 мM KCl, 20 мМ NaCl, 0.5мM EDTA, 0.1% Triton X-100), что являлось абсолютным условием сохранения морфологии ядерных органелл [14].

Использованные в работе лентивирусы упаковывали в клетках 293T с использованием упаковочной системы второго поколения (pMD2G и psPax2), концентрировали ультрацентрифугированием и титровали по известным методикам [15].

Cуперовуляцию у 4-6-недельных cамок мышей линии C57Bl6 или FVB индуцировали c использованием PMS и hCG [9]. За 0 дпо принимали полночь cуток начала спаривания. 4-клеточные эмбрионы (1.5 дпо) вымывали из яйцевода, а бластоцисты (3.5 дпо) – из матки, следуя известной процедуре [9]. Перед вирусным заражением zona pellucida удаляли, затем эмбрионы инкубировали с лентивирусами, разведенными до конечной концентрации (0.1–1)•107 трансформирующих единиц/мл.

После инфекции эмбрионы культивировали (37C, 5% CO2) до 4.5 дпо, а затем фиксировали и анализировали при помощи конфокальной микроскопии. Для анализа экспрессии лентивирусов после имплантации зараженные эмбрионы подсаживали в матки псевдобеременным реципиентным самкам линии NMRI. Эмбрионы, внезародышевые мембраны и плаценту анализировали на стадии 10.5 или 18.5 дпо.

Более подробная характеристика использованных в работе методов молекулярного клонирования, биохимии, эмбриологии, генетики, микроскопии, а также ссылки на первоисточники приведены в статьях из списка работ, 12  опубликованных по теме диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение функции Oct4 в первичных половых клетках Поскольку гомозиготные по Oct4 эмбрионы, получаемые при помощи классического нокаута, гибнут на стадии бластоцисты из-за отсутствия плюрипотентного эпибласта [16], для изучения функции этого гена в ППК, потомках клеток эпибласта, нами был применён метод условного нокаута, использующий Cre/loxP технологию [17]. В ходе выполнения поставленной задачи нами была создана линия мышей Oct4flox, в которой в Oct4 локус были введены два loxP сайта, фланкирующие промотор и 1-й экзон гена.

Предварительные тест-скрещивания подтвердили полную функциональность flox аллеля и полное отсутствие продуктов аллеля, получающегося при Creопосредованном выщеплении участка гена между двумя loxP сайтами. Для биаллельной flox конверсии в ППК (получаемые мыши нами названы для простоты /) мы провели многоступенчатое скрещивание Oct4flox и TNAPCre линий мышей. / мыши обоих полов не показывали каких-либо физиологических, поведенческих или анатомических отклонений, кроме того, что их фертильность была либо частично, либо полностью нарушена, что напрямую коррелировало со степенью обедненности гонад половыми клетками при гистологическом анализе. В сравнении с яичниками пред-эстральных (возраст 3 недели) контрольных (+/) самок, яичники / самок содержали примерно вдвое меньше растущих фолликулов. Более выраженной была разница в содержании примордальных фолликулов. Так, / самки содержали таковых в 25-100 раз меньше, чем /+ самки. У 6-недельных / самок первичные фолликулы уже практически не выявлялись, хотя небольшое число растущих фолликулов иногда обнаруживалось (Рис. 2а), в то время как у контрольных /+ самок такого же возраста выявлялось большое количество и тех, и других (Рис. 2б). По достижении половозрелости (6 недель) яичники / самок состояли из стромальной ткани, тогда как фолликулы практически отсутствовали, что, очевидно, и служило причиной стерильности этих самок.

13  В отличие от полной стерильности / самок, фертильность половозрелых / самцов заметно варьировала от частичной до полной, даже среди животных из одного помета. В согласии с этим оказались данные гистологического анализа, показавшего частичное или полное a в д отсутствие сперматогенных клеток в семенниках / самцов. Доля семенных канальцев, в которых отсутствовал половой е компонент, находилась в б г пределах 30 и 100% (n=7), что напрямую коррелировало с частично или полностью нарушенной фертильностью этих Рис. 2. Морфология яичников 6-недельных / (а) и самцов. В отличие от контрольных /+ (б) самок мыши. Примордиальные и растущие фолликулы отмечены черными и белыми стрелками, самок, пенетрантность соответственно. Морфология семенников половозрелых с такого фенотипа у / полной пенетрантностью фенотипа / самцов (в) и контрольных /+ (г) самцов. Показаны окрашенные самцов в целом не зависела гематоксилином/ эозином парафиновые срезы гонад. (д) 10.5дпо / (д) и контрольные /+(e) эмбрионы, окрашенные на от возраста. Кроме того, щелочную фосфатазу – маркер ППК (показаны стрелками).

можно отметить уменьшенный диаметр семенных канальцев без полового компонента и гиперпролиферацию окружающих их клеток Лейдига – типичная картина, наблюдаемая при подавлении сперматогенеза генетическими, химическими или иными способами (Рис. 2в). Как будет показано ниже, взрослые половые клетки, обнаруживаемые у / особей являются потомками ППК, в которых Creопосредованная рекомбинация в Oct4flox локусе не произошла. Рекомбинация эта должна происходить между 7.25 и 15.5 дпо, т.е. в период экспрессии TNAPCre локуса в ППК [18,19]. Следовательно, утеря взрослых половых клеток должна являться следствием утери ППК примерно в этот же период эмбрионального развития. Чтобы 14  проверить эту гипотезу, мы провели окрашивание ППК на щелочную фосфатазу и показали, что в то время как в 9.5-дпо / эмбрионах число ППК остается в пределах нормы, к 10.5 дпо, т.е. к моменту максимальной миграторной активности ППК, число этих клеток резко падает (Рис. 2д). После 10.5 дпо число обнаруживаемых половых клеток в / эмбрионах всегда оказывалось крайне низким. Таким образом, утеря гамет у взрослых / мышей является прямым следствием утери ППК в эмбриональный период. Присутствие же нормальных гамет в препубертатных самках и самцах может быть объяснено ограниченной эффективностью Cre-опосредованной делеции в Oct4flox локусе. Действительно, предыдущие тест-скрещивания линии TNAPCre c мышами-репортерами Z/AP линии показали в среднем 60 %-ную эффективность делеций в ППК [6]. Более сильным аргументом, однако, являются (а) экспрессия Oct4 белка в растущих ооцитах препубертатных / самок и (б) наличие во всех тестированных сперматозоидах / самцов нерекомбинированного flox локуса (данные не а б приведены).

Таким образом, пб  полученные результаты свидетельствуют о том, что нормальное развитие ППК в да  отсутствие OctРис. 3. Двойная окраска участков парафиновых срезов / (а и невозможно.

вставка) и /+ (б) 10.5-дпо эмбрионов на поверхностный маркер ППК SSEA1 (красный флюорохром) и методом TUNEL (зеленый Чтобы ответить на флюорохром). Показаны участки поперечных срезов в районе половых бугорков (пб) и дорсальной аорты (да).

вопрос о судьбе ППК при нокаутировании по Oct4, мы рассматривали по крайней мере 4 возможных сценария: (i) утрата способности к миграции или восприятию сигнала хемотаксиса от презумптивных гонад, (ii) дифференцировка в трофобластные клетки (по аналогии с эпибластными и ЭС клетками [16,20]), (iii) вхождение в профазу мейоза I (по аналогии со снижением экспрессии Oct4 при вхождении в мейоз женских ППК на 13.5 дпо) и, наконец, (iv) апоптотическая гибель. Ни эктопические ППК, ни 15  позитивные на трофобластные маркеры клетки, ни мейотические фигуры в / эмбрионах не были обнаружены (данные не показаны), в то время как в области половых бугорков наблюдались группы клеток с фрагментированными ядрами (данные не приведены) – типичный признак апоптотических клеток. Эти кластеры клеток оказались двойными позитивными при TUNEL окраске и при иммуноокраске на известный поверхностный маркер миграторных ППК, белок SSEA1 (Рис. 3), что говорило о том, что они представляют собой скопления подвергающихся апоптотической гибели ППК. Это заключение было подтверждено методом проточной цитофлуорометрии (данные не приведены).

TNAPCre локус ко-экспрессируется с Oct4 начиная с 7.25 дпо, в то время как ППК фенотип у / зародышей проявляется только к 10.5 дпо. Такая задержка может быть из-за того, что Oct4 не нужен в пре-миграторных (7.5-8.5 дпо) и раннемиграторных ППК (8.5 дпо), а становится необходимым только к 10.5 дпо, когда пролиферативная активность ППК наивысшая. Однако более правдоподобным объяснением этой задержки является необходимость достижения экспрессией Cre белка некоторого порогового уровня, выше которого она начинает эффективно выщеплять flox аллель.

Действительно, при тест-скрещиваниях TNAPCre мышей с репортерными мышами, рекомбиназная активность Cre обнаруживалась только к 9.5 дпо [6]. В нашем же случае, дальнейшая задержка в проявлении фенотипа до 10.5 дпо могла быть обусловлена временем, необходимым для деградации белка и мРНК Oct4, а также для запуска каскада, ведущего к апоптозу ППК.

Как отмечалось выше, пенетрантность фенотипа у / самок прогрессирует, в то время как у / самцов она с возрастом не меняется. Популяция покоящихся ооцитов, уже заметно обедненная у / самок в препубертатном периоде, продолжает и дальше истощаться через овуляторные циклы и(или) атрезию. Наблюдаемая между полами разница, очевидно, отражает тот факт, что сперматогенез полагается на самообновляющиеся в течение взрослой жизни недифференцированные клетки (известные как сперматогониальные стволовые клетки), в то время как оогенез полагается на фиксированное число ооцитов, заложенных в процессе эмбрионального развития.

16  Нокаут по одному и тому же гену в различных клеточных типах, хотя и принадлежащих к одному, так называемому половому пути (от англ. germline), приводит к различным фенотипическим проявлениям. Так, нокаут по Oct4 в ЭС клетках и эпибласте приводит к дифференцировке, a нокаут по Oct4 в ППК ведет к апоптозу. Ответ на вопрос о том, какие регуляторные механизмы задействованы при проявлении Oct4 своей плейотропной функции в ходе развития клеток полового пути, – задача будущих исследований. Знания эти, однако, важны для понимания природы полового пути.

Изучение роли Oct4 в соматических стволовых клетках За последнее десятилетие были представлены не менее 70 статей, в которых авторы обнаруживали продукты гена Oct4 в соматических компартментах и предполагали роль Oct4 в поддержании не только плюрипотентных, но и соматических стволовых клеток [7,21]. В согласии с такой возможностью находились результаты экспериментов по форсированной экспрессии Oct4 у взрослой мыши, показавших дефект дифференцировки и гиперпролиферацию прогениторного компартмента эпителия кишечника [22]. Таким образом, Oct4 мог выступать в роли протоонкогена, что также наводило на мысль об его причастности к неоплазиям, имеющим соматическое происхождение. Однако анализ более чем 3600 первичных опухолей, представляющих более чем 100 видов рака, выявил присутствие продукта Oct4 только лишь в 3 случаях [23], причем во всех трех экспрессия Oct4 вызвана не реактивацией эндогенного Oct4, а геномными перестройками, в ходе которых Oct4 локус оказывался вблизи от чужеродного активного промотора [24]. С другой стороны, виды рака, происходящие из половых клеток, практически всегда показывают высокий уровень экспрессии Oct4 [23].

В здоровых организмах экспрессию Oct4 чаще всего обнаруживали в костном мозге, а именно в МСК и КСК, а также в различных субпопуляциях мультипотентных прогениторных клеток. Помимо костного мозга, Oct4 обнаруживали в прогениторных клетках поджелудочной железы, в почках, эпителии молочной железы, эндометрии матки, щитовидной железе, легких, кожном эпителии, волосяных фолликулах, 17  амниотической жидкости, пуповинной крови, плаценте (см. обзор [7]). Хотя для нас было по-прежнему ясно, что роль Oct4 действительно ограничена исключительно клетками полового пути, внушительный объем данных по экспрессии этого гена в соме не мог быть проигнорирован и требовал дополнительного изучения.

Мы задались целью внести ясность в достаточно актуальный вопрос о том, действительно ли Oct4 экспрессируется и выполняет какую-либо функцию, по крайней мере, в некоторых из описанных соматических стволовых типов. С этой г а / или /+ CD45.CD45.flox + CollA1 -облучённые реципиенты б 1 1 1 1Анализ конкурирующего (CD45.1 против CD45.2) восстановления гематопоэза 1/ CD45. /+ / /+ / ЭC /+ в / /+ 8 недель 12 недель Рис. 4. Условный нокаут по Oct4 гену в МСК и КСК костного мозга. (а) Пример ПЦРгенотипирования потомства, получаемого при скрещивании Oct4flox/flox и Cre-экспрессирущих мышей. (б) Сравнительный анализ уровня экспрессии Oct4 мРНК в костном мозге мышей указанных генотипов и ЭС клетках методом количественного RT-ПЦР. (в) Сравнение клоногенных свойств МСК, выделенных из костного мозга указанных генотипов, (г) Сравнение способности восстанавления гематопоэза КСК костного мозга / и /+ генотипов.

целью были проведены опыты по условному нокауту гена, для чего описанные в предыдущей главе Oct4flox мыши скрещивали с мышами, экспрессирующими Cre рекомбиназу на тканеспецифический и(или) индуцибельный манер.

18  / + / flox / + flox / flox CD45.1 / CD45.2, % Для проведения нокаута по Oct4 в эпителии кишечника использовали тамоксифен-контролируемый гибрид между Cre рекомбиназой и лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER), помещенный под контроль villin гена [25]. Генерирование / генотипа в эпителии кишечника при инъецировании индуцирующего CreER активность тамоксифена потомству, полученному при Oct4flox X Villin-CreER скрещивании, было подтверждено ПЦР геномной ДНК (Рис. 4а). Затем это и контрольное (имеющее по крайней мере один функциональный аллель Oct4) потомство подвергали -облучению, а затем сравнивали регенеративную способность эпителия кишечника у этих двух генотипов.

Оказалось, что отсутствие функциональных Oct4 аллелей (+ или flox) не сказывается на способности стволовых клеток крипты регенерировать этот эпителий после облучения. Кроме того, анализ мРНК Oct4 в нормальном эпителии показал уровень этой экспрессии на 5 порядков ниже, чем в ЭС клетках.

Для проведения нокаута в МСК и КСК костного мозга использовали трансгенную линию мышей, в которой Cre экспрессия находится под контролем интерферон-индуцирумого промотора (Mx1-Cre) [26]. Высокая эффективность flox конверсии была подтверждена, как и раньше, при помощи ПЦР (Рис. 4а). Известно, что МСК дают начало хондроцитарному, адипоцитарному, миоцитарному и остеогенному клеточным типам. Все эти клетки наиболее часто упоминаются в связи с Oct4 экспрессией, однако во всех проведенных нами экспериментах, анализирующих клоногенные (Рис. 4в), дифференцировочные, пролиферативные свойства этих клеток не выявили какой-либо зависимости от функциональности Octлокуса (данные не приведены). Сравнительный анализ КСК из костного мозга / и контрольных мышей показал неотличимые показатели по содержанию в крови красных и белых кровяных телец, а также тромбоцитов. Долговременный регенеративный потенциал КСК обоих генотипов был также неотличим (Рис. 4г).

С целью выяснения роли Oct4 в печени мы опять использовали Mx1-Cre линию мышей. После индукции flox конверсии интерфероном печень подвергали 60-%-ной гепатэктомии. Два месяца спустя было обнаружено, что печень как у 19  нокаутной, так и у контрольной группы животных полностью восстановилась. Как и в других соматических клетках, экспрессия Oct4 в печени практически не выявлялась.

Вопрос о возможной функции Oct4 в центральной нервной системе (ЦНС), в частности в нейрональных прогениторных клетках, неоднократно поднимался [7]. Для ответа на него Oct4flox мыши cкрещивали с трансгенными мышами, в которых экспрессия Cre в нейрональных прогениторных клетках обеспечивается промотором гена Nestin (линия Nestin-Cre). Мыши, гомозиготные по аллелю в ЦНС, не показывали каких-либо очевидных отклонений в поведении и в морфологии мозга.

Кроме того, экспрессия РНК и белка Oct4 не обнаруживалась ни в одном из отделов мозга (данные не приведены).

Наконец, функцию Oct4 в волосяных фолликулах анализировали путем скрещивания Oct4flox мышей с трансгенными, экспрессирующими гибрид Cre и лиганд-связывающего домена прогестеронового рецептора (CrePR1) под контролем промотора гена Keratin15, который активен исключительно в стволовых клетках волосяного фолликула [27]. Эти клетки могут дифференцироваться во все типы клеток волосяного фолликула и дермы в процссе заживления кожного эпителия.

После индукции flox конверсии мифепристоном, антагонистом прогестерона, у 8недельных гибридов Oct4flox X K15-CrePR1 морфология волосяных фолликулов не менялась, как не менялась у таких мышей и способность к заживления повреждений кожного покрова.

Таким образом, представленные данные позволяют утверждать, что Oct4 не экспрессируется и не нужен для нормального функционирования соматических стволовых клеток кишечного эпителия, костного мозга, печени, ЦНС и волосяных фолликулов.

Регуляция транскрипции димерами POU-факторов Oct4 принадлежит к семейству POU-доменных транскрипционных факторов, которым присуще большое разнообразие в способах связывания с ДНК-элементами в промоторах и энхансерах важных для развития генов. Гибкость такого узнавания обеспечивается за счет уникальной двухчастной ДНК-связывающей белковой 20  единицы, POU домена, состоящего из двух структурно и функционально независимых суб-доменов, POU-специфического (POUS) и POU-гомео (POUH) доменов. Исходно POU белки были описаны как транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК в виде мономеров [28,29]. Более поздние исследования показали способность POU белков кооперировать при связывании со специфическими последовательностями в ДНК, что было впервые продемонстрировано на примере Oct1 и Oct2, которые могли связываться с промоторами семейства иммуноглобулиновых генов (VH) в виде димеров.

Консервативный ДНК мотив, опосредующий такое связывание, был идентифицирован как «гептамер-октамер» (CTCATGAATATGCAAAT), тогда как конфигурация POU димера на нем оставалась неизвестной [30-32]. Настоящее исследование проливает свет на природу этой конфигурации (см. ниже).

Другим примером явился гипофизарный POU-доменный белок Pit1, который способен связываться с ДНК либо как гомодимер, либо как гетеродимер с Oct1 [33].

Позднее были проведены кристаллографические исследования гомодимера Pit1 на синтетическом мотиве PitD (ATGTATATACAT), производном от Pit1-связывающего природного элемента ATATATATTCAT из промотора пролактинового гена [34].

Структура POUS и POUH субдоменов Pit1 в комплексе с ДНК оказалась очень схожей со структурой таковых в комплексе мономера POU домена Oct1 с октамерным сайтом (ATGCAAAT, [35]). В последнем POUS Oct1 узнавал подпоследовательность ATGC, а в Pit1-содержащем комплексе POUS узнавал мотив ATAC, причем в противоположной цепи ДНК, что обуславливало инвертированную относительно POUH ориентацию POUS [34].

Наконец, третий случай кооперативного связывания с ДНК был выявлен в ходе поиска генов-мишеней белка Oct4 методом иммунопреципитации хроматина [13].

ДНК мотив PORE (Palindromic Oct Recognition Element), ATTTGAAATGCAAAT (нт), обнаруженный в интроне остеопонтина (OPN), мог связывать димер Oct4, тем самым опосредуя активацию гена в доимплантационных эмбрионах мыши.

Компьютерное моделирование, основанное на кристаллографических данных исследований комплекса Oct1 мономера с октамерным мотивом [35], позволило 21  предсказать структуру этого димера. Помимо Oct4, возможность гомо- и гетеродимеризации белков Oct1 и Oct6 на мотиве PORE были также продемонстрированы [13].

Настоящее исследование имело целью выявить новые типы связывания ДНК гомо- и гетеро-димеров POU-доменных транскрипционных факторов Octподсемейства (Oct1, Oct2, Oct4 и Oct6) и провести структурно-функциональные исследования этих новых типов Oct димеров. В ходе выполнения поставленной задачи нами был синтезирован и а охарактеризован новый ДНК элемент, MORE димер PORE димер названный нами MORE (more of PORE, ATGCATATGCAT), который был способен обеспечивать кооперативное связывание гомо- и б в гетородимерами всех известных Octфакторов (Oct1, Oct2, Oct4, Oct6), а также опосредовать Д транскрипционную активацию М люциферазных репортеров в опытах по временной трансфекции (данные не приведены).

Расположение POU суб-доменов в димерах, образованных на MORE сайтах, принципиально отличается от Рис. 5. (а) Схема, иллюстрирующая такового на PORE, что было показано принципиальное различние в расположении POUспецифичеких (S) и POU-гомео (H) доменов при при анализе производных от MORE связывании ДНК в MORE и PORE димерных конформациях. (б) Производные от MORE спейсерных вариантов +1 – +4. Так, олигонуклотидные зонды, использованные для СЭПГ (в). Д – димер Oct4, М – мономер Oct4.

способность к связыванию Octдимера сохранялась при увеличении дистанции между POUS связывающими подсайтами ATGC в каждой цепи ДНК, в то время как подобная манипуляция с PORE привела бы к немедленной утрате 22  способности опосредовать связывание димера. Описанное различие обусловлено различным расположением двух POU доменов. Они расположены поперек оси ДНК в PORE димере так, что белок-белковая поверхность взаимодействия двух POU субъединиц димера (интерфейс) расположена в плоскости, перпендикулярной оси ДНК (Рис. 5a). Этот интерфейс был бы неизбежно нарушен у спейсерных вариантов сайта PORE, тогда как у MORE этого не происходит ввиду того, что взаимодействие субъединиц POU димера на этом элементе происходит в плоскости, параллельной оси ДНК, при этом только длина линкера, соединяющего POUS и POUH субдомены в каждой из субъединиц MORE димер PORE димер димера, накладывает ограничение на допустимое «растягивание» мотива MORE (Рис. 5). Эти выводы были полностью подтверждены в приведенных ниже результатах Рис. 6. Выявленная в процессе кристаллографических кристаллографических исследований структура димерных комплексов POU домена Oct1, исследований PORE и сформированных на MORE и PORE ДНК сайтах. POUспецифичекие (S) и POU-гомео (H) домены и соединяющие их MORE димеров (Рис. 6).

неструктурированные линкерные последовательности (пунктирные линии), принадлежащие одной молекуле, выделены оттенками Несет ли какой-либо одного цвета. Интерфейсы димеризации обведеные красными кругами.

биологический смысл выявленная способность POU-доменных факторов связываться с ДНК в различных димерных конформациях? Полученные нами результаты позволяют ответить на вопрос положительно и показывают, что реализовываться это различие может через селективное взаимодействия POU димеров с транскрипционными коактиваторами.

Так, в настоящей работе показано, что известный лимфоидный коактиватор OcaB (OBF1, Bob1), известный своей способностью синергетически активировать транскрипцию в тандеме с мономерами белков Oct1 и Oct2 [36,37], может 23  взаимодействовать и коактивировать транскрипцию репортерного гена через взаимодействие с димером Oct1, образованным на PORE, но не MORE (Рис. 7а).

Наблюдаемая селективность, очевидно, обусловлена различиями в конформациях двух типов Oct1 димеров. Полученные нами результаты кристаллографических исследований Oct1 димеров типа MORE и PORE [11,12] вкупе с опубликованными ранее данными по структуре Oct1/OcaB комплекса на октамерном сайте [38] позволили объяснить эту селективность на структурном уровне. Четыре -спирали в САЙТ а б POU-OcaB в Д M Рис. 7. (а) Опыт СЭПГ, показывающий селективное образование комплекса коактиватора OcaB с димером POU домена Oct1 (POU-1), сформированном на PORE сайте (отмечен звёздочкой). (б) Известная структура комплекса мономера POU1 c OcaB (розовый) на октамерном сайте (слева) и структура POU-1 димера на MORE сайте (справа, показана только половина коплекса). (в) Одна и та же белковая поверхность в POUS субдомене (выделена желтым цветом) принимает участие и в связывании OcaB (слева), и в димеризации по типу MORE (справа).

POUS суб-домене из каждого мономера образуют белковую поверхность, имеющую гидрофобную полость (выделена жёлтым цветом на Рис. 7в), которая взаимодействует с OcaB (розовый цвет) в OcaB/Oct1 комплексе, образованном на октамерном сайте (Рис. 7б, слева), а также, вероятно, в OcaB/Oct1/Oct1 комплексе, образованном на сайте PORE.

24  Надо отметить, что PORE димер (в отличие от MORE) представляет собой двукратно повторенный классический мономер, лежащий в плоскости, пересекающей ось ДНК (Рис. 6). Описанная гидрофобная полость в димере, образованном на MORE, участвует уже во взаимодействии с С-концевым участком спирали 4 POUH домена второй молекулы Oct1, т.е. играет роль уже интерфейса димеризации. Сходная ситуация имеет место на уровне ДНК-белковых взаимодействий: спираль 4 в MORE конфигурации взаимодействует с той же парой A:Т оснований (позиция 5 в MORE), которая принимает участие во взаимодействии с OcaB в мономерной и PORE конфигурациях (данные не показаны). Таким образом, димеризация по типу MORE и взаимодействие с OcaB являются для Oct1 двумя взаимоисключающими событиями.

Наши результаты показывают, каким образом разные димерные конформации POU-доменных факторов могут селективно рекрутировать транскрипционные коактиваторы, тем самым оказывая разное влияние на транскрипцию.

Одним из интересных приложений полученных нами данных явилось объяснение известного VН-OcaB парадокса. Поскольку консенсусный MORE (ATGCATATGCAT) является всего лишь синтетическим ДНК элементом, последовательность которого была нами выведена с учетом предпочтений в связывании определенных последовательностей ДНК Oct-факторами, мы задались целью выявить природные элементы, связывающие эти факторы в MOREконфигурации. Компьютерные поиск в нуклеотидной базе данных NCBI при помощи программы BLAST выявил среди прочих несколько десятков гомологий консенсусной MORE последовательности в промоторах суперсемейства генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (VH). Выявленные последовательности отличались от синтетического MORE в одной или двух позициях, но, тем не менее, были способны связывать димеры Oct1 в MORE конформации (данные не приведены).

Дальнейший анализ VH MORE показал, что они представляют собой не что иное, как «гептамер/октамер» элементы, охарактеризованные еще в конце 80-х годов как связывающие Oct1 и Oct2 в неизвестной димерной конфигурации [30-32]. Более удивительным оказалось то, что эти «гептамер/октамеры» были использованы для 25  изолирования и клонирования OcaB [36,37], в то время как, согласно нашим данным, они имеют MORE природу и, тем самым, непермиссивны для рекрутирования OcaB.

Кроме того, проведенные генетические исследования показали, что нокаут по OcaB не приводит к нарушениям в транскрипции VH генов [39,40], что находится в согласии с нашими результатами, но противоречило исходным данным [36,37]. Как выяснилось, для изолирования OcaB последовательность «гептамер/октамер» (MORE) была мутирована, за счет делетирования «гептамерной» части, в классический октамерный (ATGCAAAT) сайт [36,37], который действительно был способен рекрутировать OcaB, но через Oct1 мономер. Такая стратегия помогла авторам открыть OcaB, однако в конечном итоге привела к описанному VH-OcaB парадоксу, который нам удалось разрешить, используя наши новые знания о MORE димерах.

а б В следующей части работы нами были более детально исследованы структурнофунциональные аспекты POU-OcaB взаимодействия OcaB c OcaB+Д POU димером Oct1, Д образованным на PORE [11,41]. Во-первых, мы показали, что PORE из регуляторной области PORED гена OPN опосредует Рис. 8. (а) Структура POU1/PORE комплекса и интерфейс транскрипционную димеризации в увеличенном виде; показаны аминокислотные активацию этого гена в остатки, подвергавшиеся сайт-специфическому мутагенезу. (б) Список мутантов POU1, использованных в дальнейшем анализе.

лимфоидных клетках (в) Опыт СЭПГ, демонстрирующий ослабленные требования к интактности интерфейса при PORE димеризации в присутствии через взаимодействие с OcaB.

коактиватором OcaB. Вовторых, мы определили, что состав комплекса на PORE сайте включает две Oct1 и 26  одну OcaB молекулу. Вопрос о том, почему в этом симметричном по структуре комплексе присутствует лишь одна OcaB молекула, предстоит выяснить.

Далее мы установили, что OcaB может выполнять совершенно необычные функции, действуя в роли своеобразной молекулярной прищепки (aнгл. clump), способной (i) увеличивать стабильность димерного комплекса Oct1/PORE на порядки, (ii) обеспечивать PORE димеризацию а Д Д+OcaB даже при мутировании белковой -7 1 PORE ATTTGAAATGCAAAT + ++ поверхности, необходимой для такой --------G------ ++ ++ PORED --G------------ - - димеризации в отсутствие OcaB (Рис. POREM A1C -------C------- - ++ 8) и (iii) обеспечивать димеризацию A6G ------------G-- - ++ A5T -----------T--- + + Oct1 на PORE последовательностях, A7C -------------C- - ++ мутированных до такой степени, что ATTTGAAAATGCAAAT - ++ PORE+они не могут вообще связывать Octб без OcaB (Рис. 9а). Тот факт, что присутствие OcaB существенно ослабляет требования к ДНК специфичности при формировании димеров по типу PORE, существенно Рис. 9. (а) Результат опытов СЭПГ, в которых исследовалась способность PORE мутантов расширяет список потенциальных опосредовать димеризацию в присутствии OcaB. (б) Модель альтернативного соединения POU субгенов-кандидатов, регулируемых доменов в присутствии OcaB (справа). Принятые обозначения как на Рис. 5.

таким комплексом. Кроме того, ввиду полученных результатов нами было выдвинуто предположение об альтернативном способе соединения POU-субдоменов в Oct1 димере, образованном на PORE в присутствии OcaB (Рис. 9б).

В заключительной части этой части работы нами была изучена возможность селективной регуляции димеризации по двум описанным типам за счет фосфорилирования. Нам удалось показать, что фосфо-мимикрирующая мутация S107E Oct1, находящаяся в PORE димер-образующем белковом интерфейсе, выражается в заметном ослаблении димеризации на PORE, но не затрагивает ни мономерное связывание на классическом октамерном сайте, ни димеризацию на 27  MORE сайте. Аминокислота 107 у всех Oct-белков представляет собой либо серин, либо треонин, что косвенно подтверждает биологическую роль этой модификации. В MORE димер-образующем интерфейсе Oct4 и Oct2 находится S159, фосфомимикрирующая мутация по которому ведет к подавлению димеризации на MORE, но не на PORE или октамерном сайтах (данные не приведены). S/T107 и S1располагаются внутри KR(T/S)SIE мотива, являющегося консенсусным сайтом фосфорилирования для цAMФ- и цГТФ-зависимых протеинкиназ. Таким образом, фософорилирование по альтернативным серинам в Oct-белках может играть существенную роль в селективной регуляции димеризации по тому или иному типу.

Модуляция транс-активирующего потенциала Oct4 белком PIASy Известно, что транскрипционный фактор Oct4 взаимодействует с различными клеточными белками, модулирущими его транс-активирующую активность [42-49]. С целью лучшего понимания механизма функционирования Oct4 мы провели поиск дополнительных Oct4-ассоциирующих белков с применением дрожжевой двугибридной системы, используя в качестве «наживки» (от англ. bait) POU домен белка Oct4 (POU4), ковалентно соединённый с ДНКсвязывающим участком белка GAL4. POU домен был выбран по причине того, что он опосредует все известные на сегодняшний день взаимодействия Oct4 с ДНК и другими белками. Среди нескольких подтверждённых Рис. 10. Ко-иммунопреципитация из лизатов 293Т клеток, трансфециропосле двух раундов двугибридного скрининга ванных указанными вверху плазмида-ми.

клонов два кодировали известную SUMO IP – иммуноперципитация с антителами на MT пептид (MT); в вестерн блотах лигазу – PIASy. Помимо двугибридной (WB) использовали антитела на Tпептид (T7). Справа указаны маркеры системы, PIASy и Oct4 взаимодействуют в молекулярного веса.

опытах ко-иммунопреципитации (Рис. 10).

Поскольку PIASy является членом белкового семейства, дополнительно 28  включающего PIAS1, PIAS3 и PIASx/, мы проверили их способность взаимодействовать с Oct4 in vivo. Опыты по коиммунопреципитации показали, что PIAS1 и PIAS3, но не PIASx/, способны связываться с Oct4 (данные не приведены).

PIASy был исходно описан как E3 SUMO лигаза для ряда белков, поэтому мы проверили, может ли он выступать в этом качестве по отношению к Oct4. В белке Oct4 три потенциальных сайта сумоилирования: K118, K215 и K244 (внутри консенсусного мотива KXE). Замена этих аминокислот в Oct4 на аргинины не влияла ни на активность, ни на его способность связывать PIASy. Более того, эффективность получения иПС клеток c использованием этих лизиновых мутантов Oct4 была не ниже, чем при использовании белка дикого типа (данные не приведены). Таким образом, полученные данные говорят о том, что PIASy не является SUMO лигазой для Oct4 и что Oct4/PIASy взаимодействие не зависит от сумоилирования Oct4. Более того, нам удалось показать, что OctРис. 11. Временная трансфекция клеток 293. В верхней половине таблицы указаны репортерные может быть сумоилирован по K118, люциферазные (luc) конструкции под управлением тандемов из шести MORE, PORED, OCT или Fgfно только SUMO конъюгирующим сайтов. Нижняя половина таблицы – эффекторные плазмиды, экспрессирующие указанные белки.

белком Ubc9, который, кстати Стимуляция транскрипции выражена в условных говоря, нами был также изолирован единицах как отношение активности люциферазы к активности -галактозидазы (bgal), использованной для в ходе двугибридного скрининга в нормализации эффективности трансфекции.

дрожжах как партнер Oct4. PIASy же выступает в роли ингибитора этой Ubc9-опосрредованной модификации Oct4.

Механизм такого ингибирования, возможно, вовлекает конкуренцию PIASy и Ubc9 за связывание с Oct4.

29  Далее мы показали, что PIASy может выступать в роли мощного ингибитора транскрипционной активации, опосредованной мономером (сайт OCT) и димерами Oct4 (сайты PORE и MORE), а также Oct4/Sox2 гетеродимером (сайт Fgf4), выступая а д б е в г Рис. 12. (а-г) Иммунофлюоресцентная окраска ядер клеток НеLa, трансфецированных указанными слева плазмидами и меченых антителами на (а) Oct4 и SC35 (интерхроматиновые гранулы), (б) Octи коэлин (тельца Кахала), (в, г) Oct4 и PIASy. (д, е) Иммунофлюоресцентная окраска (д) ранних и (е) поздних бластоцист антителами на Oct4 (красный флюорохром) и PIASy (зеленый флюорохром);

ядра, ко-экспрессирущие оба белка, выглядят желтыми.  тем самым в роли универсального стереонеспецифического негативного транскрипционного ко-регулятора транскрипции (Рис. 11). Обнаруженная активность PIASy не зависела ни от его сумоилирующей активности (mutPIASy, мутация в RING домене) (Рис. 11), ни от присутствия интактного K118 в Oct4 (данные не показаны).

Выяснилось также, что PIAS1 и PIAS3 не способны оказывать аналогичное действие.

Далее мы изучили, как распределен Oct4 внутри клеточного ядра и как меняется это распределение в присутствии PIAS белков, известных своей способностью релокализовывать белки-партнёры. Известно, например, что PIAS1 способен перемещать гомеобоксный транскрипционный фактор Msx1 на периферию ядра, где 30  последний начинает репрессировать промоторы MyoD и Myf5 [50]. При иммунофлуоресцентной окраске трансфецированных HeLa клеток Oct4 показал неравномерное распределение внутри ядра, локализуясь на периферии телец Кахала и интерхроматиновых гранул (Рис. 12а, б). PIASy эффективно перемещает Oct4 на периферию ядра, где оба белка ко-локализуются (Рис. 12в). Опять же, эта PIASy активность не зависела ни от его сумоилирующей активности, ни от присутствия интактного K118 в Oct4 (Рис. 12г). Что касается других членов PIAS семейства, интересным представляется то, что несмотря на неспособность PIAS1 и PIASрепрессировать Oct4-опосредованную транскрипцию, оба эти PIAS белка также могут перемещать Oct4 на периферию клеточного ядра.

Полученные данные говорят о том, что способность связывать и релокализовывать Oct4 ещё не является достаточным условием для членов семейства PIAS1 и PIAS3, чтобы выступать в роли ингибитора Oct4, и что при реализации этой функции белком PIASy включаются какие-то дополнительные механизмы.

Поиск клеточного типа и стадии развития, на которых PIAS-опосредованное ингибирование Oct4 может играть роль, привел нас к доимплантационному развитию.

Oct4, как известно, экспрессируется во всех клетках до стадии ранней бластоцисты (3.5 дпо), а к 4.5 дпо его экспрессия поддерживается в ВКМ, но затухает в ТЭ.

Подобные сведения по экспрессии PIAS белков в литературе отсутствуют, поэтому мы провели иммунофлуоресцентное окрашивание ранних эмбрионов мыши на PIASy и Oct4. Оба белка показывают равномерное распределение во всех клетках 8- и 16клеточной морулы (2.5 дпо). В поздней моруле и ранней бластоцисте PIASy экспрессия по-прежнему обнаруживается во всех клетках, однако заметно снижена в ВКМ (Рис. 12д). К стадии поздней бластоцисты (4.5 дпо) PIASy обнаруживается, главным образом, в ТЭ (Рис. 12е). Таким образом, в ходе доимплантационного развития домены экспрессии Oct4 и PIASy полностью перекрываются на стации морулы, но сегрегируют к моменту формирования зрелой бластоцисты. Такое реципрокное разграничение доменов экспрессии согласуется с гипотезой, что PIASy может выполнять ингибирующую функцию по отношению к Oct4, постепенно ограничивая его активность в созревающей бластоцисте клетками ВКМ.

31  Лентивирусные технологии и их применение для ткане-специфических генных манипуляций В последней, методологической части работы приведены результаты исследований возможного приложения лентивирусных технологий для ткане-специфических генных манипуляции у плацентарных млекопитающих. Лентивирусные векторы в последнее время приобретают все большую популярность для решения фундаментальных и клинических задач ввиду того, что они обладают несколькими важными свойствами: (а) стабильно поддерживать экспрессию при интегрировании в геном, (б) трансдуцировать а б в как делящиеся, так и неделящиеся клетки, (в) трансдуцировать клетки разных видов (политропийность). Кроме того, имеются эффективные, лёгкие и безопасные г д системы упаковки вирусных капсидов [51].

ТЭ бластоцисты является первой эпителиальной тканью, Рис. 13. Экспрессия GFP в 4.5-дпо бластоцистах при заражении GFP-экспрессирующим лентивирусом на стадии возникающей при развитии 3.5-дпо бластоцисты (а) и ранней морулы (б). (в) Контрольная млекопитающих, и группа незараженных вирусом эмбрионов. Экспрессия GFP в 10.5-дпо плодах при заражении GFP-экспрессирующим выполняет сигнальную и лентивирусом на стадии 3.5-дпо бластоцисты (г) и ранней морулы (д). pTE и mТЕ – полярная и муральная ТЭ, PE – питательную функции в первичная эндодерма, De – десидуа, Ep – эпибласт, Em – эмбрион, Pl – плацента, YS – желточный мешок.

доимплантационный период.

Кроме того, ТЭ обеспечивает имплантацию эмбриона в стенку матки и дает начало внеэмбриональным тканям, необходимым для закладки осей и роста эмбриона после имплантации. Поскольку ТЭ представляет собой эпителий, мы предположили, что она может служить естественным барьером для лентивирусных частиц.

32  Действительно, серия проведенных на стадии ранней бластоцисты (3.5 дпо) заражений GFP-экспрессирующим лентивирусом (LVTHM) показала, что только клетки ТЭ оказываются трансдуцированы лентивирусом, тогда как окружённая этим эпителиальным барьером ВКМ – нет (Рис. 13a-в). Экспрессия интегрированного LVTHM затем стабильно поддерживается у потомков ТЭ – гигантских клеток трофобласта, внеэмбриональной эктодермы, эктоплацентарного конуса, клеток губчатого и лабиринтного отделов плаценты (данные не приведены). При инфицировании ранних эмбрионов до формирования трофэктодермы (1.5-2.5 дпо) трансдуцированными оказывались ВКМ и ТЭ и, соответственно, их потомки – сам эмбрион и плацента (Рис. 13г, д).

Наши данные о непроницаемости трофэктодермы для ряда вирусов являются многообещающими в свете возможной тканеспецифичной генетической манипуляции на модели лабораторной мыши, а возможно, в перспективе и на человеке при генной терапии плацентарной недостаточности. Так, например, Рис. 14. (а) Доставка модуляторов предлагаемый нами подход может являться генной экспрессии (кДНК или shRNA) значительно менее трудоемкой альтернативой селективно в ТЭ и плаценту (зеленые) через инфицирование лентивирусом тетраплоидной агрегации – методу, широко (LV) на стадии бластоцисты. (б) Модуляция генной экспрессии в ВКМ и используемому для генетического разделения самом эмбрионе (розовые), осуществляемая за счет поэтапного функций генов в эмбрионе и плаценте [52,53].

инфицирования двумя лентивирусами (LV1 и LV2, аттенюирущим эффект LVКак показано в настоящей работе и в ТЭ и плаценте).

проиллюстрировано на Рис. 14, путём заражения эмбрионов на стадии бластоцисты вирусом, экспрессирующим интересующую кДНК или интерферирующую РНК (как, например, small hairpin RNA, shRNA), можно добиваться селективной экспрессии (кДНК) или, наоборот, подавления экспрессии РНК-мишени (shRNA) в трофобластных тканях плаценты. C другой стороны, метод может быть адаптирован для избирательного манипулирования экспрессией генов в ВКМ и её производных c применением 33  двушагового инфицирования (Рис. 14). Например, при получении трансгенных мышей эмбрионы могут быть сначала инфицированы на стадии 4–8 клеток для доставки кДНК во все клетки зародыша. Затем, когда эмбрионы достигнут стадии бластоцисты, они заражаются уже shRNA-экспрессирущим вирусом, подавляющим экспрессию этой кДНК исключительно в плаценте. Соответственно, для РНК интерференции в производных ВКМ в первом раунде проводится заражение shRNAкодирующим вирусом, а во втором – кДНК-кодирующим вирусом, который будет удалять эффект первого вируса в ТЭ. Естественно, что при обоих сценариях shRNA будет интерферировать не только c РНК-продуктом трансгена, но и с мРНК, кодируемой хозяйским геномом. Этого эффекта при желании можно избегать за счёт сайт-направленного мутагенеза по 3-м позициям в триплетных кодонах в участке кДНК, комплементарном shRNA, т.е. путём введения нонсенс-мутаций. Таким образом, можно добиться того, что shRNA будет узнавать только экзогенную мРНК.

Дальнейшую гибкость рассматриваемой системы тканеспецифической модуляции генной экспрессии может обеспечить дополнительное использование Tetиндуцибельной системы. Для лентивирусных векторов такая возможность была ранее описана [15].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Утеря функции гена Oct4 в различных клеточных контекстах может проявляться либо в виде трофобластной дифференцировки (ранний эпибласт и ЭС клетки), либо в виде апоптотоза (ППК). Нокаутирование по гену Nanog в раннем эпибласте и ЭС клетках ведет к дифференцировке в эндодерму [54,55], а в ППК – к апоптотической гибели (T.Tada, сообщение). Поскольку известно, что Nanog позитивно регулируется Oct4/Sox2 гетеродимером в ЭС клетках [56-58], представляется возможным, что функция Oct4 в ППК осуществляется именно через позитивную регуляцию гена Nanog. Будущие исследования должны установить, посредством каких регуляторных связей Nanog контролирует жизнеспособность ППК.

В работе охарактеризована новая димерная конфигурация Oct-белков, возникающая при связывании нового класса ДНК элементов, MORE.

34  Сформулирована концепция, основанная на структурно-функциональных данных и постулирующая, что альтернативные конформации POU димеров могут по-разному взаимодействовать с транскрипционными кофакторами, такими как OcaB, оказывая тем самым различное влияние на транскрипцию. Такой механизм может обеспечивать регуляцию многообразных биологических процессов сравнительно небольшим числом белков POU семейства.

В работе показано, что OcaB может выполнять совершенно уникальные функции, действуя в роли молекулярной прищепки, способной на порядки увеличивать стабильность димера Oct1 на консенсусном PORE и обеспечивать димеризацию при мутировании (i) интерфейса димеризации и (ii) последовательности в PORE. Объяснить первое наблюдение возможно, если постулировать альтернативный способ соединения POU (см. выше). Для объяснения второго наблюдения потребуются специальные исследования, однако уже ясно, что присутствие OcaB может обеспечивать транскрипционную активацию, за счет Oct(Oct2) димеров, лимфоид-специфических генов, содержащих в своих промоторах и энхансерах мотивы с очень ограниченной гомологией с консенсусным PORE, но, тем не менее, способных связывать Oct1 в PORE конфигурации.

Вопрос о существовании коактиваторов, аналогичных OcaB, модулирующих действие Oct4 димеров на PORE последовательностях в плюрипотентных и половых клетках, а также вопрос о стереоспецифических коактиваторах, взаимодействующие селективно с MORE, но не PORE димерами POU факторов – все это также крайне интересные темы для будущих исследований.

Показанная способность первого эпителиального типа, возникающего при развитии млекопитающих – ТЭ – служить естественным барьером для вирусов может имеет важные приложения в функциональной генетике мыши и, возможно, в лечении плацентарных заболеваний человека.  Полученные в работе результаты важны для понимания механизмов работы POU доменных транскрипционных факторов и, в частности, белка Oct4 как одного из центральных регуляторов фенотипа половых и плюрипотентных клеток. Знание механизмов функционирования Oct4 позволит глубже понять природу клеток 35  «полового пути», а также позволит более эффективно индуцировать и управлять клеточной плюрипотентностью, приближая тем самым перспективу эффективного и безопасного использования этих клеток в тканезаместительной терапии у человека.

ВЫВОДЫ 1. В отличие от трофобластной дифференцировки плюрипотетных клеток ранних зародышей мышей, их непосредственные потомки – ППК – при генетическом нокаутировании гена Oct4 подвергаются апоптотической гибели, что указывает на плейотропные функции в развитии клеток «полового пути».

2. Ген Oct4 не экспрессируется и не нужен для самообновления и дифференцировки взрослых соматических стволовых клеток, таких как нейрональные стволовые клетки, КСК и МСК костного мозга, а также стволовые клетки крипты эпителия кишечника, печени, и волосяного фолликула.

3. Существует новый класс cis-элементов в ДНК (MORE), опосредующих связывание гомо- и гетеродимеров Oct-факторов в ранее не описанной конфигурации, что было подтверждено после определения молекулярной структуры MORE и ранее описанного PORE типа POU димеров. Фосфорилирование серинов и треонинов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях внутри PORE и MORE типов POU димеров, играет важную биологическую роль в селективной регуляции димеризации по двум описанным типам.

4. Димерный комплекс Oct1, образованный на PORE, способен рекрутировать изветный лимфоидный коактиватор OcaB и, тем самым, стимулировать транскрипцию, в то время как конфигурация POU димера, образованного на MORE ДНК, является непермиссивной для взаимодействия с OcaB.

5. Описанные ранее как «гептамерные/октамерные» сайты из семейства промоторов генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (VH) представляют собой природные MORE элементы, которые также непермисивны для OcaB.

6. OcaB может выступать в роли мощного стабилизатора димера Oct1 на PORE ДНК, а также в роли коактиватора, существенно ослабляющего требования к специфичности в последовательности PORE. Полученные нами данные 36  предполагают альтернативное соединение POUS и POUH суб-доменов в димерном Oct1/PORE комплексе в присутствии OcaB.

7. PIASy, один из известных членов семейства SUMO лигаз, является впервые описанным негативным транскрипционным ко-регулятором Oct4, способным взаимодействовать с POU доменом Oct4 через свой SAP домен и репрессировать (независимо от его SUMO-лигазной активности) Oct4-опосредованную транскрипционную активацию посредством релокализации Oct4 на периферию ядра.

8. Лентивирусы способны заражать ТЭ бластоцисты, однако, ввиду эпителиальной природы последней, не способны проникать через нее и заражать клетки ВКМ.

Данное свойство лентивирусов может быть использовано в функциональной генетике мыши для тканеспецифических генных манипуляций.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. #Tomilin A., #Remenyi A., Lins K., Bak H., Leidel S., Vriend G., Wilmanns M., Scholer H.R. 2000. Synergism with the coactivator OBF-1 (OCA-B, BOB-1) is mediated by a specific POU dimer configuration. Cell. 103: 853-864.

2. #Remenyi A., #Tomilin A., Pohl E., Lins K., Philippsen A., Reinbold R., Schler H.R., and Wilmanns M. 2001. Differential transcriptional activity of dimeric Oct-1 by DNAmotif induced domain swapping. Mol. Cell. 8: 569-580.

3. Remenyi A., Tomilin A, Schler HR, Wilmanns M. 2002. Differential activity by DNAinduced quarternary structures of POU transcription factors. Biochem. Pharmacol. 64:

979-984.

4. Lins K., Remnyi A., Tomilin A., Massa S., Wilmanns M., Matthias P. and Schler H.R.

2003. OBF1 enhances transcriptional potential of Oct1. EMBO J. 22: 2188-2198.

5. Kehler J., Tolkunova E., Koschorz B., Pesce M., Gentile L., Boiani M., Lomeli H., Nagy A., McLaughlin K.J., Schler H.R., Tomilin A. 2004. Oct4 is required for primordial germ cell survival. EMBO Rep. 5: 1078-1083.

#  равнозначный вклад 37  6. Tolkunova E., Cavaleri F., Eckardt S., Reinbold R., Christenson L.K., Schler H.R., Tomilin A. 2006. The caudal-related protein Cdx2 promotes trophoblast differentiation of mouse ES cells. Stem Cells. 24: 139-144.

7. Malashicheva A., Kanzler B., Tolkunova E., Trono D., Tomilin A. 2007. Lentivirus as a tool for lineage-specific gene manipulations. Genesis. 45: 456-459.

8. Lengner C.J., Camargo F.D., Hochedlinger K., Welstead G.G., Zaidi S., Gokhale S., Schler H.R., Tomilin A., Jaenisch R. 2007. Oct4 expression is not required for mouse somatic stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 1: 403–415.

9. Tolkunova A., Malashicheva A., Parfenov V.N., Sustmann C., Grosschedl R., Tomilin A.

2007. PIAS proteins as repressors of Oct4 function. J. Mol. Biol. 374: 1200-1212.

10. Малашичева А.Б., Канцлер Б., Толкунова Е.Н., Троно Д., Томилин А.Н. 2008.

Применение лентивирусов для тканеспецифичных генетических манипуляций.

Цитология. Т.50, No. 4, C 370-375.

11. Толкунова Е.Н., Малашичева А.Б., Чихиржина Е.В., Костылева Е.И., Жен В., Луо Ж., Добрински И., Хирхольцер А., Кемлер Р., Томилин А.Н. 2008. E-кадхерин как новый поверхностный маркер сперматогониальных стволовых клеток.

Цитология. Т.51, No.3, C 212-218.

12. Saxe J., Tomilin А., Schler H.R., Plath K., Huang J. 2009. Post-translational regulation of Oct4 transcriptional activity. PLoS One. 4: 1-9.

38  СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Thomson et al. (1998) Science 282: 1145-1147. 28.Staudt et al. (1986) Nature 323: 640-643.

2. Takahashi et al. (2006) Cell 126: 663-676. 29.Scholer et al. (1990) Nature 344: 435-439.

3. Maherali et al. (2008) Cell Stem Cell 3: 595-605. 30.Kemler et al. (1989) EMBO J 8: 2001-2008.

4. Ellis et al. (2009) Cell Stem Cell 4: 198-199; 31.LeBowitz et al. (1989) Genes Dev 3: 1625-1638.

author reply 202. 32.Poellinger et al. (1989) Nature 337: 573-576.

5. Kehler et al. (2004) EMBO Rep 5: 1078-1083. 33.Voss et al. (1991) Genes Dev 5: 1309-1320.

6. Lomeli et al. (2000) Genesis 26: 116-117. 34.Jacobson et al. (1997) Genes Dev 11: 198-212.

7. Lengner et al. (2007) Cell Stem Cell 1: 403-415. 35.Klemm et al. (1994) Cell 77: 21-32.

8. Nagy (2003). Manipulating the mouse embryo : a 36.Luo et al. (1995) Mol Cell Biol 15: 4115-4124.

laboratory manual, 3rd edn (Cold Spring Harbor, 37.Luo et al. (1992) Cell 71: 231-241.

N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 38.Chasman et al. (1999) Genes Dev 13: 2650-2657.

9. Hogan (1994). Manipulating the mouse embryo : 39.Kim et al. (1996) Nature 383: 542-547.

a laboratory manual, 2nd edn (Plainview, N.Y., 40.Schubart et al. (1996) Nature 383: 538-542.

Cold Spring Harbor Laboratory Press). 41.Lins et al. (2003) EMBO J 22: 2188-2198.

10.Wassarman et al. (1993). Guide to techniques in 42.Yuan et al. (1995) Genes Dev 9: 2635-2645.

mouse development (San Diego, Academic 43.Remenyi et al. (2003) Genes Dev 17: 2048-2059.

Press). 44.Boyer et al. (2005) Cell 122: 947-956.

11.Remenyi et al. (2001) Mol Cell 8: 569-580. 45.Okumura-Nakanishi et al. (2005) J Biol Chem 12.Tomilin et al. (2000) Cell 103: 853-864. 280: 5307-5317.

13.Botquin et al. (1998) Genes Dev 12: 2073-2090. 46.Tomioka et al. (2002) Nucleic Acids Res 30:

14.Tolkunova et al. (2007) J Mol Biol 374: 1200- 3202-3213.

1212. 47.Brehm et al. (1999) Mol Cell Biol 19: 2635-2643.

15.Wiznerowicz et al. (2003) J Virol 77: 8957-8961. 48.Scholer et al. (1991) Cell 66: 291-304.

16.Nichols et al. (1998) Cell 95: 379-391. 49.Guo et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99:

17.Gu et al. (1994) Science 265: 103-106. 3663-3667.

18.Ginsburg et al. (1990) Development 110: 521- 50.Lee et al. (2006) Genes Dev 20: 784-794.

528. 51.Trono (2002). Lentiviral vectors (Berlin ; New 19.Anderson et al. (2000) Mech Dev 91: 61-68. York, Springer).

20.Niwa et al. (2000) Nat Genet 24: 372-376. 52.Nagy et al. (1990) Development 110: 815-821.

21.Lengner et al. (2008) Cell Cycle 7: 725-728. 53.Tanaka et al. (2001) Methods Mol Biol 158: 13522.Hochedlinger et al. (2005) Cell 121: 465-477. 154.

23.Looijenga et al. (2003) Cancer Res 63: 2244- 54.Chambers et al. (2003) Cell 113: 643-655.

2250. 55.Mitsui et al. (2003) Cell 113: 631-642.

24.Yamaguchi et al. (2005) Genes Chromosomes 56.Boyer et al. (2002) Genesis 34: 236-243.

Cancer 43: 217-222. 57.Rodda et al. (2005) J Biol Chem 280: 2473125.el Marjou et al. (2004) Genesis 39: 186-193. 24737.

26.Kuhn et al. (1995) Science 269: 1427-1429. 58.Kuroda et al. (2005) Mol Cell Biol 25: 247527.Morris et al. (2004) Nat Biotechnol 22: 411-417. 2485.

39 






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.