WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

АДИЕВА АЙНА АХМЕДОВНА

РОЛЬ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В ПАТОЛОГИИ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО. ПОИСК НОВЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СРЕДСТВ.

03.00.06. – Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2009 г.

Работа выполнена в Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Научные консультанты:

доктор биологических наук,  КУЩ

профессор  Алла Александровна 

доктор медицинских наук, НИСЕВИЧ

профессор  Лика Львовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, МИЛЛЕР

профессор Галина Генриховна

доктор биологических наук  БРАГИНА

профессор  Елизавета Ефимовна

доктор медицинских наук, ЧЕШИК

профессор  Святослав Георгиевич

Ведущая научная организация: НИИ переливания крови Научного гематологического центра РАМН

Защита состоится «___» _______________ 2009 г. в ____часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д.16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Автореферат диссертации разослан «___» __________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, БУРЦЕВА

доктор медицинских наук  Елена Ивановна

Список использованных сокращений

АГ   антиген

АПФ – аминокислотные производные фуллерена С60

АТ – антитело

БКМ быстрый культуральный метод

БОЕ – бляшкообразующая единица

ВКЖ – вируссодержащая культуральная жидкость

ВПР – врожденные пороки развития

ВУИ – внутриутробное инфицирование

ГВИ – герпесвирусные инфекции

ГЦВ -   ганцикловир

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ИА – индекс авидности

ИППП – инфекции, передаваемые половым путем

ИФА – иммуноферментный анализ

ИФН – интерферон

МИ – множественность инфицирования

МКА – моноклональные антитела

ОАГА – осложненный акушерско-гинекологический анамнез

ПСА   поликлональные антитела

ПЦР –  полимеразная цепная реакция

ПЦР IS - полимеразная цепная реакция in situ

ПЦР RT - полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени

РИФ  (РНИФ) реакция прямой (непрямой) иммунофлюоресценции

УФ - ультрафиолет

ФЛЭЧ – фибробласты легкого эмбриона человека

ХТИ – химиотерапевтический индекс

ЦД – цитотоксическая доза

ЦМВ – цитомегаловирус человека

ЦМВИ – цитомегаловирусная инфекция

ЦНС – центральная нервная система

ЦПД – цитопатическое действие

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Внутриутробная инфекция (ВУИ) занимает одно из ведущих мест в структуре перинатальной смертности, являясь основной причиной смерти или осложняя течение основного заболевания у 37,5% умерших новорожденных [Цинзерлинг и др., 2002]. Достоверных данных об истинной распространенности ВУИ нет, однако согласно данным ряда исследователей, инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и 70% недоношенных новорожденных [Володин и др., 2004; Сидорова и др., 2006].

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее распространенных внутриутробных инфекций, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка [Gibson et.al., 2008; Kenneson et.al., 2007; Kriebs et.al., 2008].

Прогресс в изучении ЦМВИ связан с разработкой и широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий – высокочувствительных и специфичных методов иммунохимии, молекулярной и клеточной биологии. В связи с этим оценка эффективности современной специфической диагностики ЦМВИ приобретает особую актуальность.

Трудности анте - и постнатальной диагностики ЦМВИ связаны с неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса из-за особенностей иммунной системы новорожденных и неспецифичностью клинических проявлений. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, устоявшихся канонов пренатальной диагностики ЦМВИ в мире не существует. Разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ  и в России остается нерешенной задачей. Высокая инфицированность недоношенных новорожденных детей ЦМВ ставит вопрос о своевременной диагностике ЦМВИ у беременных женщин и о вертикальной передаче вируса. В связи с этим тактика ведения беременных женщин с высоким риском инфицирования плода должна включать эффективную диагностику и своевременное начало лечения ЦМВИ. 

На клеточном уровне цитопатический эффект ЦМВ проявляется в изменении морфологии клетки и ядра (увеличение размера, изменение формы), в образовании многоядерных клеток и в появлении внутриядерных включений [Mocarski et.al., 2001]. В связи с этим, исследования, направленные на анализ действия ЦМВ на клеточную пролиферацию, вызывают особый интерес. Так, группой авторов было показано, что ЦМВ стимулирует репликацию клеточной ДНК в зараженных клетках [Hume et.al., 2008; Kalejta et.al., 2003; McElroy et.al, 2000; Prichard et.al., 2008], описывалось существенное возрастание митотического индекса в инфицированной культуре [Sanchez et.al., 2003; Tran et.al., 2008; Wiebusch et.al., 2005]. Позже появились работы, опровергающие эти данные. Было показано, что вирус может блокировать прохождение клеточного цикла клетками в нескольких точках, включая переход из G1 – периода в фазу синтеза ДНК [Lu and Shenk, 1999; Murphy et.al., 2000; Sinclar et.al., 2000] и  переход из стадии G2 в М, в точке, обозначаемой как G2/М [Castillo et.al., 2005; Lu and Shenk, 1999; Sanchez et.al., 2006]. Таким образом, данные о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию оказались противоречивыми и требовали дальнейшего исследования.

Фундаментальные данные о влиянии ЦМВ на клеточные структуры и жизненный цикл клетки необходимы для понимания процессов, приводящих к патологии при внутриутробном развитии детей и их гибели, а также для выбора адекватной терапевтической тактики новорожденных с ЦМВИ. Существующие на сегодняшний день единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности.  Кроме того, эффективность лечения существующими препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном применении [Biron et.al., 2006; Chou et.al., 1999]. Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотерапевтических средств при ЦМВИ,  остается важной проблемой. Все вышеизложенное в совокупности явилось обоснованием для проведения данного исследования.

Цель исследования.

Цель настоящей работы состояла в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией в течение первого года жизни и в материалах аутопсии; мониторинга метаболической и иммунной терапии; в изучении антивирусной активности аминокислотных производных фуллерена С60; в исследовании действия ЦМВ жизненный цикл инфицированных клеток.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

  1. Выявить прямые (ДНК и инфекционная активность) и непрямые маркеры (специфические IgM, IgG  и индекс авидности IgG антител) ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и изучить динамику их выявления в течение первого года жизни.
  2. Установить возможность выявления инфекционно - активного ЦМВ с помощью быстрого культурального метода (БКМ) в материалах аутопсии плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.
  3. Разработать метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках различных органов. Оценить эффективность использования четырех методов лабораторной диагностики при детекции ЦМВ в материалах аутопсии.
  4. Установить частоту выявления ЦМВ у беременных из группы высокого риска по перинатальному инфицированию плода и новорожденного. Оценить эффективность использования метаболических препаратов в предгравидарной подготовке и во время беременности.
  5. Оценить эффективность использования Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности и у недоношенных детей с клиническими проявлениями ВУИ.
  6. Изучить цитотоксичность и антивирусную активность аминокислотных производных фуллерена С60 (АПФ) на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro. Сравнить эффективность указанных соединений при использовании лечебной, профилактической  и вирулицидной схем воздействия. Оценить сочетанный эффект АПФ и Виферона и продукцию вируса под действием АПФ.
  7. Изучить изменение пролиферативной активности в асинхронно - делящейся  и синхронизированной культуре фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) под влиянием ЦМВ. Определить способность клеток ФЛЭЧ, инфицированных в разные периоды клеточного цикла, вступать в митоз.
  8. Оценить развитие патологии митоза при инфицировании ЦМВ в присутствии ингибитора репликации вирусной ДНК и при инфицировании ЦМВ инактивированным УФ.

Научная новизна.

  1. Впервые разработан и использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ вирусологическими методами (БКМ) и с помощью генодиагностики (ПЦР, ПЦР - real time) для выявления возбудителей герпесвирусных инфекций.
  2. Впервые разработан метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках и парафиновых срезах органов мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни, который сочетает морфологический и молекулярный подходы и позволяет не только выявлять внутриклеточную вирусную ДНК в инфицированных клетках, но и оценить её сравнительное количество.
  3. Впервые установлено, что в материалах аутопсии плодов (мертворожденных) и умерших новорожденных чаще определяется инфекционно активный ВПГ, а у детей, умерших на первом году жизни – инфекционно активный ЦМВ.
  4. Впервые показана низкая цитотоксичность и высокая антивирусная активность аминокислотных производных фуллерена С60 – натриевой соли аминокапроновой кислоты (С60-Na-АКК) и натриевой соли аминомасляной кислоты (С60-Na-АМК); химиотерапевтический индекс в различных схемах воздействия для С60-Na-АКК равен  260-2600; для С60-Na-АМК – 2500-5450.
  5. Впервые установлено, что в клетках, инфицированных в S-фазе клеточного цикла, удлиняется период синтеза ДНК, при этом клетки сохраняют способность вступать в митотическое деление. Остановка деления происходит в метафазе митоза.
  6. Впервые показано, что патология митоза развивается в одинаковой степени в клетках, инфицированных интактным вирусом, при подавлении репликации ДНК ЦМВ, а также при заражении ЦМВ, инактивированным УФ облучением.

       Практическая значимость.

       На основании полученных данных о распространенности цитомегаловирусного инфицирования среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

       Установлено, что для достоверной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста необходимо использование БКМ и ПЦР для исследования различных биологических жидкостей (кровь и моча). Серологические методы диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, рекомендованы для уточнения фазы течения инфекции. Показана эффективность определения авидности анти-ЦМВ.

       Впервые при изучении динамики маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни доказана необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования недоношенных новорожденных с низкой и экстремально низкой массой тела до года.

       У недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими признаками врожденной инфекции обосновано использование Виферона с первых дней жизни.

       Применение Виферона у беременных со второго триместра беременности показало возможность более ранней антенатальной коррекции иммунопатологических состояний плода и отсутствие и/или снижение количества рецидивов ГВИ у беременных с ОАГА.

       Предложен новый современный метод диагностики аутопсийного материала и плацент – ПЦР in situ, позволяющий оценить количество внутриклеточной ДНК и тканевую тропность, что особенно важно в изучении патогенеза ЦМВИ. Сравнительная оценка различных методов лабораторной диагностики при анализе структуры перинатальной патологии и смерти способствует совершенствованию организации лабораторно-клинического обеспечения мониторинга перинатальных потерь, этиологически связанных с герпесвирусами, а также повышению достоверности оценки их роли в перинатальной патологии и разработке на их основе адекватных лечебных и профилактических мер по снижению удельного веса ВУИ.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.

Результаты работы стали основой ряда документов, применяющихся в практическом здравоохранении: Методические рекомендации «Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций», Роспотребнадзор. - №02.030-08. – Москва, 2008.

Методические рекомендации по использованию Виферона у недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ с первых дней жизни (2009, в печати).

       Практические рекомендации используются в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ №8 КЗ г. Москвы и ДКБ №13 им. Филатова  г. Москвы.

       Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедры клинической лабораторной диагностики РГМУ, кафедры неонатологии РГМУ, аспирантов и ординаторов НИИ педиатрии НЦЗД РАМН.

       Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Маркеры ЦМВИ у недоношенных маловесных новорожденных с сочетанной врожденной патологией выявляются существенно чаще, чем у доношенных новорожденных. Недоношенные маловесные новорожденные являются группой риска по развитию ЦМВИ на первом году жизни, что диктует необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования этих детей.
  2. ПЦР in situ - информативный, точный и быстрый метод, открывающий новые возможности в диагностике герпесвирусных инфекций, позволяющий оценить относительное количество внутриклеточной ДНК и тропность вируса к определенным тканям при изучении отпечатков органов. Метод эффективен для диагностики и изучения патогенеза инфекций, вызываемых ЦМВ и ВПГ при фетоинфантильных потерях и летальных врожденных дефектах развития. Верификация инфекционных агентов при мертворождении, при выявлении врожденных пороков развития, несовместимых с жизнью, способствует адекватной терапии женщин с мертворождениями в анамнезе и прогнозированию исходов будущих беременностей.
  3. Аминокислотные производные фуллерена С60 эффективно подавляют экспрессию поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках. Синергизм Виферона с АПФ дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии ЦМВИ, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений.
  4. ЦМВ увеличивает длительность S – периода в инфицированных диплоидных фибробластах легкого эмбриона человека. Клетки, находящиеся в момент заражения в S – периоде клеточного цикла способны вступить в митоз, но необратимо блокируются в метафазе.
  5. Для развития патологии митоза достаточно взаимодействия вирусной частицы с клеточной мембраной и/или проникновения вирусных белков в клетку. Синтез вирусной ДНК не является обязательным условием формирования патологических митозов.

       Апробация работы.

       Основные положения работы были представлены в мат. 5 международной конференции «Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2000), на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Glasgow, Шотландия, 2000); на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Saariselka, Финляндия, 2008); на 11, 12, 13 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2001, 2002, 2003); на 3 Российском научном форуме “Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии” (Москва, 2001), на 3 Международной конференции “Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем” (Махачкала, 2001), на 5 Международной конференции “Фуллерены и атомные кластеры” (С.-Петербург, 2002), на 8 Съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), на Международной конференции “Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины” (Москва, 2002), на Российском конгрессе “Генитальные инфекции и патология шейки матки” (Москва, 2004), на 3, 4 Конгрессе педиатров-инфекционистов “Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей” (Москва, 2004, 2005), на 8 Российском Форуме “Мать и дитя” (Москва, 2005), на 10, 11, 13 Конгрессе педиатров России “Актуальные проблемы педиатрии” (Москва, 2006, 2007, 2009), на Международном конгрессе «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Pattaya-Bangkok, Тайланд, 2007), на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в ХХI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), на VI Конгрессе детских инфекционистов России “Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики” (Москва, 2007), на III Ежегодном конгрессе и VI Cъезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (Москва, 2008).

       В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела прикладной вирусологии и иммунологии, Отдела молекулярной вирусологии и лаборатории биохимии института экспериментальной ветеринарии и Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ Учреждения РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН от 24 сентября 2009 года.

       Публикации.

       По теме диссертации опубликовано 65 научных работ, в том числе 23 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, статей за рубежом – 1, в сборниках международных конгрессов за рубежом – 3, в сборниках материалов международных конгрессов и форумов  – 38.

       Структура и объем диссертации.

       Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 6-ти глав с изложением результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 273 страницах текста, иллюстрирована 29 таблицами и сколько 38 рисунками. Список цитированной литературы включает 124 отечественных и 325 иностранных источников.

       Степень личного участия автора: разработка дизайна исследования беременных женщин, недоношенных новорожденных и материала аутопсии, изучение влияния ЦМВ на пролиферативную активность клеток и антивирусной активности АПФ, организация работы на всех этапах от определения возбудителей ВУИ различными методами до систематизации и анализа, а также статистическая обработка результатов проведены лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Культура клеток. В работе использовали диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), полученные из лаборатории клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и из Медико-генетического научного центра РАМН (Москва). Культуру клеток выращивали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2мМ L-глутамина, 50мкг/мл гентамицина.

Вирус. Использовали референс штамм ЦМВ человека AD 169, любезно предоставленный доктором D. Emanuel (США). Вирус поддерживали путем пассирования на культуре клеток ФЛЭЧ. Определение инфекционной активности вируса проводили модифицированным методом «черных» бляшек. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса. Очаги инфицированных клеток (бляшек) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси моноклональных антител (МКА) к белкам IEp72 и рр65. Окрашенные бляшки идентифицировали и подсчитывали с помощью светового микроскопа. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл).

Пациенты. Объектами исследования были женщины репродуктивного возраста, беременные и новорожденные дети, а также материалы аутопсии различных органов плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни. Объем исследований характеризуют данные таблицы 1. Для обследования пациентов использовали комплекс лабораторных методов: ПЦР (HCMV, HSV, Chlam.trach., Myc. gen.,Ureapl., HPV 16/18, Neis.gon., Trich.vag.); ПЦР real time (HCMV); ПЦР in situ (HCMV; HSV); БКМ (HCMV); РИФ (HCMV, HSV, enterovirus - Коксаки А, Коксаки В 6, 68-71 серотипов, краснуха, вирусы гриппа, парагриппозные вирусы 1-3 серотипов, аденовирусы, Myc. pneum., RSV, Chlam. Pneum.); ИФА; микробиологический посев флоры, патологоанатомические исследования органов и плацент и анализ анамнестических данных матерей умерших детей.

Таблица 1. 

Группы

Количество обследованных

Количество анализов

Скрининговое обследование беременных и небеременных женщин в РИФ с поиском широкого спектра вирусных антигенов

n=3796

n=18675

Исследование материала аутопсии плодов и умерших новорожденных в РИФ с поиском широкого спектра вирусных антигенов

n=650

n=9750

Исследование плацент

n=181

n=665

Мониторинг включения метаболической терапии  (n=260) и Виферона (n=74) в комплексное лечение беременных и небеременных женщин с ОАГА

n=260

n=74

n=5980

n=1314

Комплексное обследование доношенных и недоношенных новорожденных детей (n=204), в динамике до года (n=174)

n=204

n=2850

Исследование материала аутопсии плодов и детей, умерших на первом году жизни на ГВИ

n=135

n=1764

Клинический материал. Объектами исследования у новорожденных служили моча, кровь, слюна и ликвор - по показаниям, в случаях смерти ребенка - отпечатки и лизаты  от 3-5 органов. У беременных женщин исследовали кровь, мочу и урогенитальный соскоб. Цельную кровь и мочу центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об./мин. В лунки 24 - луночной панели с  клетками ФЛЭЧ вносили по 0,2 мл лейкоцитарной фракции и по 0,2 мл клеток из осадка мочи. Ликвор и слюну разводили в 2 раза средой ИГЛА-МЕМ без сыворотки и вносили в культуру клеток в объеме 0,2 мл.

       Выявление возбудителей ВУИ  в материале аутопсии. Выявление возбудителей ВУИ в пробах органов погибших плодов и новорожденных, у которых при жизни или при патологоанатомическом исследовании возникло подозрение на врожденную инфекцию, проводили четырьмя методами: иммуноцитохимическим, быстрым культуральным методом (БКМ), ПЦР  и ПЦР in situ.  Были исследованы материалы аутопсии различных органов (мозга, сердца, легких, печени, почек, селезенки, тимуса, плаценты). Детекцию антигенов Adeno, HRSV, Rub, HSV в мазках – отпечатках органов осуществляли прямым методом иммунофлюоресценции с помощью антител, разработанных в НИИ гриппа РАМН (ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов», Санкт-Петербург). Антигены HSV 1,2 и HCMV определяли с помощью МКА к белкам р72, рр65 и gB HCMV, 4А1 и gB HSV, полученных ранее в лаборатории клеточной инженерии (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва). Антигены энтеровирусов выявляли в РНИФ с помощью ПКА (ФГУП «ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», Москва).

Быстрый культуральный метод (БКМ). Для определения инфекционной активности ЦМВ в клиническом материале использовали количественный вариант БКМ, который проводили согласно Методическим рекомендациям Роспотребнадзора №02.030-08 [Москва, 2008]. Клетки ФЛЭЧ высаживали в 24-луночные панели в концентрации 250 тыс. клеток в 1 мл. В культуру вносили клинический материал и проводили совместное центрифугирование клеток ФЛЭЧ с клиническими образцами в течение 35 мин. при 2500 об./мин. После отмывки вносили среду поддержки – среду Игла-МЕМ с 2% ЭТС. Через 24 часа клетки фиксировали в холодном ацетоне – 10 минут для проведения реакции непрямой иммунофлюоресценции, либо в охлажденном метаноле (-200С) в течение 20 минут для реакции иммунопероксидазного окрашивания. Для обнаружения ЦМВ использовали МКА к белкам ЦМВ [Макарова и др., 1994]. Выявляющими антителами служили антимышиные антитела, коньюгированные с FITC или конъюгированные с пероксидазой хрена. Подсчет окрашенных клеток проводили на 2,5х105 клеток ФЛЭЧ. Положительные результаты представляли в количестве вирусных частиц (в.ч.) на 0,2 мл клинического материала. Чувствительность БКМ соответствовала активности 5 вирусных частиц в 1 мл [Адиева и др., 2008].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК производили с помощью сертифицированных коммерческих наборов  «ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В», «ДНК-сорб-С» и «Реамикс» согласно инструкции фирмы-производителя. ПЦР в качественном варианте проводили с помощью коммерческих наборов ООО НПФ "Гентех» и ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора согласно инструкции фирмы-производителя. Исследование аутопсийного материала проводили с помощью модифицированного совместно с НПФ “Литех” nested варианта ПЦР. Чувствительность определения ДНК составила 103 молекул вирусной ДНК в 1 мл.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР real time). ДНК ЦМВ из лизированных клеток выделяли с помощью «ДНК-сорб-АМ» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. ПЦР - амплификацию проводили с применением набора реагентов для выявления ДНК цитомегаловируса человека (HCMV) в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно - флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® CMV-FL» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Детекцию продуктов ПЦР - амплификации в количественном варианте осуществляли при помощи прибора «iQ iCycler» (Bio-Rad, США), согласно рекомендации производителя тест-систем.

Полимеразная цепная реакция in situ (ПЦР in situ). Метод ПЦР in situ был модифицирован и использован для анализа фиксированных препаратов-отпечатков аутопсийного материала и препаратов монослойных культур клеток. Препараты готовились на стеклах с адгезивным покрытием (Histobond). В качестве положительных контролей  использовали зараженные клетки ФЛЭЧ и Vero. В работе были использованы праймеры, направленные к гену ДНК-полимеразы ВПГ и к консервативному сверхраннему региону ЦМВ. Визуализацию проводили  с помощью светового микроскопа. В препаратах от пациентов, инфицированных ВПГ и ЦМВ, наблюдались темно-коричневые точки - метки на поверхности или внутри клеток. Далее подсчитывали количество клеток, содержащих метку, и общее количество клеток на препарате.

       Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА). Определение антител к ЦМВ классов M и G в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА), используя коммерческие тест-системы НПО «Диагностические системы» (Нижний Новгород). Для выявления антител класса IgM использовали тест-систему «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М», для выявления антител класса IgG «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G. Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Авидность антител. Индекс авидности (ИА) специфических IgG к ЦМВ в сыворотке крови определяли с помощью тест-систем «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G Авидность» (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород). Оценку результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (Рниф). Клетки ФЛЭЧ, неинфицированные и инфицированные ЦМВ,  промывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,4 и фиксировали. Использовали различные способы фиксации в зависимости от поставленных задач. Для анализа препаратов при пероксидазном окрашивании - абсолютным метанолом фиксировали 10 мин при -20С; охлажденным ацетоном для Рниф - 10 мин при +4С; для анализа морфологии клеток 3% параформальдегидом на фосфатном буфере 15 мин при комнатной температуре с последующей обработкой 0,1% раствором Тритона Х-100 на буфере PBS в течение 8 мин.

На фиксированные препараты наносили очищенные моноклональные антитела  (МКА) и инкубировали в течение 1 часа при 370С. Затем клетки промывали буфером PBS и инкубировали с антителами, конъюгированными с флуорохромом ФИТЦ в течение 30 минут при 370С, с пероксидазой хрена - в течение 1 часа при 370С (DakoCytomation, Дания). Для окраски хроматина ядер использовали флуорохром DAPI в концентрации 1мкг/мл. После окраски стекла заключали в глицерин или в мовиол. Препараты анализировали с помощью флюоресцентного/светового микроскопа Olympus BX – 51 (Япония), оснащенного объективами 4х, 10х, 40х и цифровой камерой Olympus U-CMAD3.

       Интерфероновый статус. Изучение интерферонового статуса проводили в лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерферона НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (заведующая лабораторией – д.б.н., проф. В.В. Малиновская). Концентрации альфа-ИФН и гамма-ИФН определяли методом твердофазного ИФА. Для альфа-ИФН использовали тест-систему производства ООО «Протеиновый контур» (С.-Петербург, Россия), для тестирования гамма-ИФН применяли набор реагентов Biosource IFN (Бельгия). В качестве индукторов использовали: для альфа-ИФН – вирус болезни Ньюкасла (ВБН), для гамма-ИФН – ФГА. Чувствительность тест-систем для иммуноферментного определения альфа-ИФН составляла 5 пкг/мл, для определения гамма-ИФН – 3 пкг/мл.

       Определение цитотоксичности производных фуллерена. Цитотоксичность определяли по влиянию на жизнеспособность клеток ФЛЭЧ, которую оценивали методом исключения витального красителя трипанового синего. Цитотоксичность (ЦД) характеризовали как концентрацию каждого из тестируемых соединений, вызывающую гибель подавляющего большинства клеток или 50% клеток в популяции (ЦД95 и ЦД50, соответственно) на 4-е сутки после внесения АПФ – так называемая хроническая цитотоксичность или (ЦД50). Определяли также концентрацию, вызывающую гибель 50% клеток в течение 24 часов, соответствующую острой цитотоксичности (ОЦД50).

Пролиферативная активность клеток ФЛЭЧ в присутствии АПФ. Влияние АПФ на репликацию ДНК ФЛЭЧ анализировали методом радиоавтографии. Клетки ФЛЭЧ вносили в 24-луночные панели в низкой концентрации (6х104кл./мл). На следующий день после посадки вносили АПФ в различных концентрациях. Через 24, 48 и 72 часа инкубации вносили в  культуральную жидкость радиоактивно меченый тимидин (3Н-ТД). За  50%-ую ингибирующую дозу (ИД50) принимали концентрацию препарата, вызывающую 50% подавление включения радиоактивного тимидина в ДНК клеток.

Определение антивирусной активности АПФ. Для определения анти-ЦМВ активности использовали три схемы воздействия АПФ: лечебную, профилактическую и вирулицидную.

Лечебная схема. Монослой клеток заражали вирусом с различной множественностью инфицирования (1,0 БОЕ/кл. – 0,001 БОЕ/кл). После адсорбции в течение 1 часа при 37С дважды промывали и вносили поддерживающую среду, содержащую 2% сыворотки и аминопроизводные фуллерена в различных концентрациях.

Профилактическая схема. На клеточный монослой вносили среду поддержки, содержащую АПФ в различных концентрациях, и инкубировали в течение 24 часов. После обработки клетки дважды промывали и заражали вирусом с различной множественностью инфицирования (1,0 БОЕ/кл. – 0,001 БОЕ/кл) в течение 1 часа при 370С. Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Вирулицидная схема. Вирус с МИ 0,01 БОЕ/кл инкубировали совместно с АПФ в различных концентрациях в течение 1 часа при 370С. Затем вирус, инкубированный с АПФ, наносили на монослой клеток и выдерживали в течение 1 часа. Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Антивирусную активность во всех схемах оценивали по способности ЦМВ к бляшкообразованию и по цитопатогенному действию вируса (ЦПД). Концентрацию вещества, вызывающую подавление ЦПД вируса на 50% по отношению к контролю, принимали за 50%-ую эффективную дозу (ЭД50). Химиотерапевтический индекс (ХТИ), или индекс селективности (ИС), рассчитывали как отношение концентрации препарата, вызывающей клеточную деструкцию (ЦД50) или снижающую синтез клеточной ДНК на 50% (ИД50), к концентрации, вызывающей 50% антивирусный эффект (ЭД50).

Определение продукции инфекционно активного вируса. Для определения влияния АПФ на репродукцию ЦМВ клетки заражали вирусом с МИ 0,1 БОЕ/кл. и 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вносили АПФ в различных концентрациях. При развитии в контроле (без АПФ) 100%-ого ЦПД отбирали культуральную среду из опытных и контрольных культур и заражали неинфицированные клетки ФЛЭЧ, которые культивировали в среде Игла с 2% сыворотки без АПФ. Об активности урожая вируса судили по цитопатогенному действию в динамике инфекционного процесса.

Изучение динамики накопления ДНК ЦМВ методом ПЦР в реальном времени. Монослой ФЛЭЧ заражали ЦМВ с МИ 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вируса вносили изучаемые вещества в соответствующей концентрации. На 4, 7 и 10-е сутки клетки промывали 0,1М фосфатно-солевым буфером и обрабатывали трипсином. Осадок клеток обрабатывали лизирующим буферным раствором и исследовали методом ПЦР real-time.

Радиоавтография. В клетки ФЛЭЧ, выращенные на покровных стеклах в 24- луночных панелях, вносили радиоактивно меченый 3Н-ТД на 1 час в концентрации 1 мкКю/мл для включения в реплицирующуюся ДНК. Фиксацию проводили через различные интервалы времени смесью этилового спирта и концентрированной уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 40 минут. Затем стекла с клетками обрабатывали холодной 5% трихлоруксусной кислотой 3 раза в течение 5-10 минут для удаления невключившегося предшественника и промывали водой. После высушивания на воздухе покровные стекла  монтировали на предметные стекла клетками вверх. Все препараты с радиоактивной меткой покрывали фотоэмульсией типа М (НИИ химфотопроект, Москва) и экспонировали в течение 6-7 дней в темноте. Проявляли амидоловым проявителем и окрашивали гематоксилином Карацци.

Статистическая обработка. Для статистической обработки полученных результатов использован ПК и пакет прикладных программ Statistika V6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для оценки факторов риска внутриутробного инфицирования большое значение имеет состояние здоровья матери. Мы провели ретроспективный анализ анамнестических данных 658 матерей  умерших (плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни). Было отмечено, что только 35% матерей умерших считали себя практически здоровыми. Даже среди матерей до 20 лет, где были и подростки, здоровых было только 51,2%. С увеличением возраста матерей количество здоровых снижалось, и уже в возрасте от 25 до 30 лет их оказалось достоверно меньше (40%; р <0,001), чем среди молодых матерей, а среди женщин старше 30 лет здоровыми себя считали только 20,9%. Подавляющее большинство имели те или иные хронические болезни, среди которых наиболее частыми были болезни мочеполовой системы.

У матерей умерших был отмечен и отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (ОАГА). В анамнезе у женщин было отмечено большое количество искусственного прерывания беременности. Даже у женщин до 20 лет их количество составило 12,8%. С увеличением возраста женщин количество медабортов значительно увеличивалось, и у женщин старше 30 лет их количество достигло 69,6% (нередко не по одному разу). Кроме искусственного прерывания беременности в анамнезе отмечались выкидыши, мертворождения, замершая беременность, смерть ребенка в раннем неонатальном периоде, в том числе и у женщин моложе 20 лет. Настоящая беременность и роды независимо от возраста практически у всех протекали с обострением хронических болезней, с острыми респираторными заболеваниями (иногда по несколько раз), с различными осложнениями (анемия, угроза прерывания часто на протяжении всей беременности, маловодие, многоводие, длительный безводный промежуток, слабость родовой деятельности, стремительные роды), которые могли стать причиной острой или хронической гипоксии плода. В подавляющем большинстве случаев женщины не проходили предгравидарную подготовку.

Активная ЦМВИ  у беременных по данным серологического анализа имела место в 30% случаев смерти ребенка. Рецидивы кожной формы простого герпеса были зарегистрированы у 60,7% беременных женщин.

Скрининговое вирусологическое исследование 3796 небеременных и беременных женщин выявило в подавляющем большинстве случаев смешанную инфекцию. Энтеровирусы в популяции были выявлены от 34,6% до 90% случаев (в том числе, антигены Коксаки А - в 34,6% случаев, Коксаки В – в 38% случаев), вирус краснухи был обнаружен у 19-23% обследованных. Частота определения антигенов ВПГ составила 11-13%. В 7,8% случаев в обеих группах была выявлена папиломавирусная инфекция, ВПЧ преимущественно 16 типа. Важно отметить, что ЦМВ был обнаружен в 19,1% случаев у небеременных женщин и статистически значимо чаще (26,2%; р=0,001) -  у беременных женщин.

Таким образом, ухудшающееся состояние здоровья женщин и инфекционные заболевания, в числе которых ЦМВИ занимает существенное место, являются фактором риска перинатального инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте.

Разработка алгоритма диагностики ЦМВИ у новорожденных детей с осложненным течением раннего неонатального периода.

Недоношенные новорожденные дети представляют особую группу риска по развитию внутриутробной ЦМВИ, однако до настоящего времени нет общепринятого алгоритма диагностики ЦМВИ у новорожденных детей с признаками ВУИ. В связи с этим были обследованы 204 новорожденных ребенка, родившихся в ГБ №8 Департамента здравоохранения города Москвы. Обследованные дети были разделены на 4 группы: первую группу (группа 1) составили недоношенные новорожденные дети (n=107) c гестационным возрастом (ГВ) 29,8±2,8 недель с клиническими признаками ВУИ. Во 2-ю группу были включены недоношенные новорожденные дети без клинических признаков ВУИ (18 детей, ГВ - 34,6±1,2  недель). Контрольную группу (группа 3) составили доношенные новорожденные дети без признаков ВУИ (32 ребенка, ГВ - 38,9±0,8 недель). Отдельную группу (группа 4) составили 47 детей с признаками ВУИ, первично обследованных в возрасте 1-3 месяцев.

Проведен анализ частоты выявления ЦМВ у детей на первой неделе жизни. Ребенка рассматривали как инфицированного, если маркеры ЦМВИ были обнаружены, по крайней мере, в одном из полученных от него образцов клинического материала. Данные по частоте выявления маркеров ЦМВИ приведены в таблице 2. Анализ показал, что ДНК ЦМВ была выявлена во всех группах, в том числе доношенных и недоношенных новорожденных без признаков ВУИ. Наиболее часто ДНК ЦМВ выявлялась в 4-й группе, даже значительно чаще (р <0,001), чем у новорожденных с ВУИ, обследованных на первой неделе жизни.

Таблица 2. Выявление прямых маркеров  ЦМВИ у новорожденных детей.

Группы детей

ДНК  (ПЦР)

Инфекционная активность (БКМ)

группа 1 (основная)

недоношенные с ВУИ

15,9% (17/107)

16,8% (18/107)

группа 2 (сравнения)

недоношенные без ВУИ

5,6% (1/18)

0% (0/18)

группа 3 (контрольная)

доношенные

6,3% (2/32)

0% (0/32)

группа 4 (дополнительная)

46,8% (22/47)

29,7% (14/47)

       Инфекционно активный вирус был выявлен только у детей с ВУИ и ни в одном случае во 2 и 3 группах. Более частое выявление ДНК  и инфекционно активного вируса в 4 группе может свидетельствовать об обострении врожденной инфекции или о постнатальном инфицировании.

       Если учитывать результаты обследования двумя методами, то ДНК и/или инфекционно активный вирус у новорожденных с ВУИ, обследованных на первой неделе жизни был выявлен у 28 из 107 обследованных (26,2%), то есть на 9-10% чаще, чем каждым методом отдельно. Таким образом, обследование двумя метода повышает эффективность  лабораторной диагностики.

  При анализе выявления маркеров ЦМВИ в различных биологических средах было установлено, что наиболее часто инфекционно активный ЦМВ выявлялся в моче (14,5%), а в крови только в 1% случаев. ДНК ЦМВ в моче выявлялась в 18,7%, и несколько реже - в крови 13,3%. Суммарно тем или другим методом в моче ЦМВ обнаружен в 41% случаев, в слюне – в 27%, в крови и в ликворе у 14-18% детей с признаками ВУИ. Наши данные  согласуются с результатами других исследователей, которые показали, что в моче ЦМВ обнаруживается в количествах в 180 раз больших, чем в крови [Halwachs-Baumann G., 2002].  В целом ДНК ЦМВ выявлялся в 85 из 710 проб (12,1%), а инфекционно активный вирус в 52 из 710 проб (7,3%), то есть достоверно чаще (р=0,003). 

Представляло интерес выяснить вирусную нагрузку в клинических материалах от обследованных детей. Данные количественного изучения ЦМВ во всех положительных образцах показали, большая часть образцов, в которых был обнаружен инфекционно активный ЦМВ, содержали 10-50 вирусных частиц, максимальные значения достигали 5000 вирусных частиц, что свидетельствует о большей вирусной нагрузке при инфицировании недоношенных новорожденных детей. Сходная тенденция была выявлена в результате анализа ДНК. Результаты показали, что в группе детей с признаками ВУИ вирусная нагрузка и инфекционная активность ЦМВ достоверно выше по сравнению с контрольной группой. Прямая корреляция между величиной вирусной нагрузки и интенсивностью клинических симптомов при врожденной ЦМВИ была недавно констатирована в работе исследователей США [Arav-Boger R., Pass R., 2007].

Для выяснения связи между данными БКМ и ПЦР был проведен анализ относительного количества ДНК в клинических образцах методом ПЦР - RT.  Вычисляли значение порогового цикла Ct для каждого образца путем определения точки, при которой флюоресценция превышала фоновое значение. Сравнивали результаты для проб, в которых БКМ была обнаружена инфекционная активность ЦМВ, с результатами для проб, отрицательных по БКМ. Статистическая обработка показала, что в образцах, положительных по данным БКМ, вирусная нагрузка была достоверно выше, чем в пробах, отрицательных по результатам БКМ. Данные настоящей работы совпадают с результатами исследователей, изучавших прямые маркеры герпесвирусных инфекций методами ПЦР - RT и БКМ [J.van Doornum G., 2003].

Изучение показателей специфического гуморального иммунитета у новорожденных детей (выявление антител классов IgG  и IgM и определение индекса авидности специфических антител) представлено в таблице №3.

Таблица 3. Результаты обследования новорожденных детей с помощью серологических методов.

Группы детей

Выявление анти-ЦМВ

IgM-АТ

Отсутствие

анти-ЦМВ

IgG-АТ

Авидность анти-ЦМВ-IgG-АТ (ИА)

<0,6

>0,6

1-я

(основная)

0,93%

(1/107)

8,4%

(9/107)

38,6%

(32/83*)

61,4%

(51/83*)

2-я

(сравнения)

0%

(0/18)

16,7%

(3/18)

33,3%

(5/15*)

66,7%

(10/15*)

3-я

(контрольная)

0%

(0/32)

9,4%

(3/32)

13,8%

(4/29*)

86,2%

(25/29*)

4-я (дополнительная)

23,4%

(11/47)

19,1%

(9/47)

33,3%

(12/36*)

66,7%

(24/36*)

* авидность IgG определяли только у детей, у которых было достаточно материала и в сыворотках крови которых были выявлены АТ к ЦМВ класса IgG;

Анализ показал, что у подавляющего большинства детей всех групп присутствовали антитела класса IgG. У 1 ребенка из основной группы на первой неделе жизни были идентифицированы маркеры острого инфекционного процесса – анти-ЦМВ-IgM. Невысокая частота выявления анти-ЦМВ-АТ класса IgM у новорожденных детей отмечалась и другими авторами [Nelson et.al., 1997]. В 4-й группе (впервые обследованные в 1-3 мес.) показатель частоты выявления анти-ЦМВ IgM составил 23,4% (р<0,001). Важно отметить, что у 9 из 11 детей с анти-ЦМВ-IgM антитела класса G отсутствовали, но были выявлены ДНК и инфекционно активный вирус.

Оценка авидности IgG-АТ показала, что  у большинства обследованных были выявлены высокоавидные АТ. Антитела с низким или промежуточным значением ИА выявлялись практически с одинаковой частотой у детей с ВУИ и в группе сравнения. В контрольной группе была отмечена наиболее низкая частота выявления низкоавидных антител (13,8%; р=0,026). Необходимо отметить, что у 65,4% детей с ВУИ, в крови которых АТ класса IgG отсутствовали, либо обладали ИА<0,6, были выявлены прямые маркеры ЦМВ.

При количественном анализе IgG анти-ЦМВ антител в группе детей с признаками инфицирования (группа 1 и 4) выявлялись антитела с низкой концентрацией достоверно чаще, чем в группах без ВУИ (p<0,05).

Анализ прямых и непрямых маркеров ЦМВИ (рис. 1) при оценке риска развития инфекционного процесса у новорожденных детей показал, что в группе инфицированных детей ДНК и инфекционная активность вируса выявляются в больших количествах, антитела IgG - в низкой концентрации и с низким индексом авидности.

РИС. 1. Частота выявления прямых и непрямых маркеров ЦМВИ  у недоношенных новорожденных.

У детей без признаков инфицирования инфекционный вирус не выявляется, ДНК вируса обнаруживается в низких количествах и в небольшом проценте случаев (5-6%).  IgG антитела характеризуются высокой концентрацией и ИА>60. Наличие низких концентраций материнских типоспецифических нейтрализующих антител у новорожденных детей увеличивает риск постнатального инфицирования ребенка [Hill J. and Roberts S., 2005]. Надо учитывать, что у недоношенных новорожденных детей доля антител, обладающих нейтрализующими свойствами, зависит от гестационного возраста. Так, только к 34-й неделе гестации 99% нейтрализующих материнских антител обнаруживаются в периферической крови плода [Karen et.al., 2006]. Это указывает на то, что специфическая диагностика ЦМВИ при оценке риска развития активного инфекционного процесса у новорожденных детей, особенно у недоношенных, требует использования комплекса лабораторных методов.

Изучение маркеров в динамике показало, что через 1-3 месяца после рождения у 19,2%, отрицательных при первичном обследовании, вирус был обнаружен впервые, через 4-7 мес. еще у 11,5% детей, отрицательных по ЦМВ при рождении впервые появились прямые маркеры ЦМВИ. Эти данные свидетельствуют о том, что для достоверной диагностики ЦМВИ необходимо неоднократное обследование.

Таким образом, на первом году жизни у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ в 65,4% случаев на разных сроках были выявлены прямые маркеры ЦМВИ, что согласуется с результатами других исследований [Maschmann et.al., 2001; Меджидова и др., 2005], подтверждающими высокий риск развития ЦМВИ у этой группы новорожденных детей.  Следует отметить, что в целом при повторных исследованиях количество вирусной нагрузки увеличивалось. Это может быть связано с инфицированием в неонатальном периоде при вскармливании грудным молоком [Lawrence et.al, 2006], а также с отсроченным проявлением внутриутробной бессимптомной ЦМВИ, которое отмечалось рядом авторов [Barbi et.al., 2003; Maligner et.al., 2003].

Частота выявления серологических показателей и вирусных маркеров в динамике проведено у 75 недоношенных детей с ВУИ из 1-й группы (рис.2).

РИС. 2. Динамика выявления серологических маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей.

Изучение маркеров в динамике показало прямую корреляцию между обнаружением или отсутствием ЦМВ и серологическими показателями. При активации ЦМВИ в 68,4% случаев при повторном исследовании происходило либо выведение высокоавидных (по всей видимости, материнских IgG-АТ), либо появление собственных низкоавидных IgG-АТ с ИА<0,6 (52,6%), либо резкое снижение активности IgG-АТ и выявление анти-ЦМВ IgM (15,8%). Это и могло служить основной причиной обнаружения ЦМВ в клинических материалах и развития ЦМВИ при последующих исследованиях. В 75% случаев элиминация вируса сопровождалась появлением собственных анти-ЦМВ IgG или сменой низкоавидных IgG-АТ (50%) на высокоавидные или повышением активности IgG антител в несколько раз (25%). Известно, что низкоавидные антитела циркулируют в периферической крови приблизительно в течение 20 недель после первичной инфекции, затем авидность IgG-АТ увеличивается и остается высокой в течение всей жизни [Lazzarotto T., 2008]. За время проведения исследования в 1-й группе отмечены 12 летальных исходов (11,2%); при этом у 7 из 12 детей (58,3%) были выявлены прямые маркеры ЦМВИ. В контрольной группе летальных исходов не было.

Для анализа частоты выявления ЦМВИ в различных органах  было исследовано 147 органов от 47 мертворожденных  и 252 органа от 88  умерших, умерших на первом году жизни и (таблица 4). Патологоанатомические исследования проводились сотрудниками кафедры патологической анатомии (зав. кафедрой – д.м.н., проф. Талалаев А.Г.).

Таблица 4. Выявление ЦМВ в различных органах у мертворожденных и детей, умерших в течение первого года жизни.

Изученные органы

Мертворожденные

Дети, умершие на первом году жизни

Общее число проб (n)

Число положительных проб, (%)

Р

Общее число проб (n)

Число положительных проб, (%)

мозг

41

9 (21,9%)

р=0,33

61

20 (32,8%)

печень

37

7 (18,9%)

р<0,02

55

25 (45,5%)

легкое

33

5 (15,2%)

р<0,0001

48

44 (91,6%)

почка

27

7 (25,9%)

р<0,03

43

24 (55,8%)

сердце

9

1 (11,1%)

р=0,87

45

9 (20,0%)

Всего

147

29 (19,7%)

р<0,0001

252

122 (48,4%)

При патологоанатомическом исследовании у умерших были выявлены признаки врожденной генерализованной вирусной инфекции, которая проявлялась как различными воспалительными изменениями (менингит, энцефалит, гепатит, миокардит, пневмония и др.), так и фетодиспластическими изменениями и/или с пороками развития органов. Анализ показал, что ЦМВ выявляется практически во всех исследованных органах:  легкие, сердце, печень, почки, мозг. При этом в материалах аутопсии обнаружен как ДНК вируса (ПЦР), так и антигены (РНИФ) и инфекционно активный ЦМВ (БКМ).

В целом у умерших на первом году жизни маркеры ЦМВ обнаруживались значительно чаще, чем у мертворожденных (48,4% против 19,7%, р<0,0001). Необходимо отметить, что в группе детей, умерших на первом году жизни, инфекционно активный ЦМВ определялся значительно чаще, чем у мертворожденных (р<0,05).

Если говорить о суммарном выявлении прямых маркеров ЦМВИ хотя бы одним из методов в любом из исследованных органов, то в группе детей, умерших на первом году жизни ЦМВ был обнаружен в 61,5% случаев, в случаях мертворождения - в 35,4% случаев.

Более частое выявление ЦМВ в материалах детей, умерших на первом году жизни, может свидетельствовать о реактивации врожденной инфекции (учитывая положительные результаты быстрого культурального метода, который позволяет выявить инфекционно активный вирус). Но при этом нельзя исключить и факт постнатального инфицирования. Одной из причин этого может быть иммунодефицитное состояние в группе детей высокого риска. Как показало исследование отпечатков тимуса 60 умерших детей, у 48 (80%) были выявлены антигены различных вирусов. При патологоанатомическом исследовании в 8% случаев был поставлен диагноз врожденного неклассифицированного иммунодефицита (в 65,7% случаев на фоне врожденной вирусной инфекции), что позволяет предположить ее участие в развитии иммунодефицита и наоборот: активацию инфекционного процесса на фоне иммунодефицита.

Проведенное вирусологическое исследование отпечатков органов мертворожденных и плацент с использованием сывороток к широкому спектру антигенов показало совпадение частоты выявления одних и тех же возбудителей в 82% случаев. При параллельном исследовании отпечатков органов умерших и клеток осадка мочи их матерей вскоре после мертворождения или смерти ребенка в раннем неонатальном периоде ВПГ и ЦМВ существенно чаще (р<0,002) выявлялись у плодов и умерших в течение первых суток новорожденных, чем в клетках осадка мочи их матерей, что может свидетельствовать об активном инфекционном процессе в организме плода.

При гистологическом исследовании плацент умерших детей то или иное поражение плаценты выявлено в 100% случаев. Наиболее часто выявлялась гипоплазия плаценты (79%), в 51,3% - морфологическая незрелость. Кроме того были выявлено преждевременное старение плаценты, кровоизлияния, тромбоз сосудов, флебит пупочной вены, краевое прикрепление, абсолютно короткая или длинная пуповина, тощая пуповина, хроническая фетоплацентарная недостаточность. В плаценте и пуповине выявлялись различные воспалительные изменения (базальный и париетальный децидуит, интервиллузит, хориоамнионит, фуникулит, мембранит), которые достоверно чаще отмечались в случаях мертворождения (68,6% и 39,4%, р<0,001). При исследовании плацент мертворожденных или умерших новорожденных методом ПЦР ДНК ЦМВ выявлена в 56% случаев, в группе детей без клинических признаков ВУИ ДНК ЦМВ была обнаружена в 3,2% случаев. Воспалительные реакции в плаценте имели как альтеративно-продуктивный, так и гнойный характер, в ряде случаев с некрозом. Обнаружение ЦМВ сопровождалось некротическими и другими изменениями в плаценте.

Выявленные изменения в тканях и органах плодов и умерших детей при патологоанатомическом исследовании в подавляющем большинстве случаев являются следствием ассоциированного (одновременного или последовательного) инфицирования различными возбудителями в разные сроки гестации. При анализе частоты выявления различных патогенов было установлено, что самым частым компонентом смешанной инфекции был один или несколько серовариантов энтеровирусов. В отличие от ВПГ, ЦМВ нам не удалось выявить существенных различий в частоте выявления энтеровирусов у плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни. Если учитывать только результаты выявления герпесвирусных инфекций, то смешанная ВПГ и ЦМВ инфекция одновременно у мертворожденных была выявлена в 45,4%, тогда как, у умерших на первом году жизни в 86%. То есть частота смешанной ВПГ и ЦМВ инфекции с увеличением возраста умерших детей существенно возрастает (р=0,001). 

Нами был впервые использован метод ПЦР in situ для выявления ЦМВ в отпечатках органов. Метод ПЦР in situ  был разработан на основе двух методов – метода полимеразной цепной реакции и метода гибридизации in situ и сочетал в себе их достоинства: высокую чувствительность с возможностью морфологического исследования. Сравнительный анализ эффективности различных лабораторных методов показал, что метод ПЦР in situ обладает не меньшей чувствительностью по сравнению с классическим методом ПЦР. Анализ количества инфицированных клеток в препаратах методом ПЦР in situ показал, что наиболее интенсивно накопление ДНК ЦМВ происходит в тканях мозга и почек.

Суммируя полученные данные можно заключить:

- для повышения эффективности диагностики врожденной ЦМВИ и прогноза ее развития у недоношенных новорожденных детей необходимо использовать комплекс методов, в том числе определение авидности анти-ЦМВ;

- при вирусологическом обследовании недоношенных детей с признаками ВУИ недостаточно однократного изучения клинических материалов на первой неделе жизни. У большинства новорожденных ЦМВ  элиминировал к 1-3 мес. жизни, тогда как у некоторых детей вирусы впервые обнаруживался лишь через 1-3 мес. после рождения, еще у части других детей - в возрасте 4-7 мес. 

- предпочтительным объектом скринингового исследования для диагностики внутриутробной ЦМВИ является моча, в которой вирус накапливается чаще всего и в больших количествах, чем в других клинических материалах;

- выявление высокоавидных анти-ЦМВ IgG антител имеет положительное прогностическое значение, так как у большинства обследованных детей в динамике оно сопровождалось отсутствием выявления прямых маркеров ЦМВ. Напротив, отсутствие анти-ЦМВ антител или присутствие низкоавидных антител к ЦМВ имеют отрицательное прогностическое значение, так как ассоциируются с появлением маркеров ЦМВ через 1-6 месяцев после рождения;

- герпесвирусные инфекции, также как и инфекции иной этиологии, играют существенную роль в перинатальной патологии, а также в смерти плода и новорожденного;

- метод ПЦР in situ обладает не меньшей чувствительностью по сравнению с классическим методом ПЦР и позволяет оценить не только интенсивность синтеза вирусной ДНК, но также выявить индивидуальную внутритканевую и внутриклеточную локализацию вирусов.

С учетом вышеизложенного, предлагается следующий алгоритм лабораторного обследования недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ и материала аутопсии плодов и умерших детей:

- анализ мочи на 1-й неделе жизни (до 3 недель жизни) методом БКМ для выявления внутриутробной ЦМВИ;

- исследование клинических материалов в динамике через 1, 3 и 6-7 месяцев после рождения для установления возможной реактивации ЦМВИ и развития инфекции у недоношенных новорожденных детей с ВУИ;

- определение активности и авидности специфических антител класса IgG в совокупности с определением прямых маркеров ЦМВ для оценки риска развития активного инфекционного процесса у новорожденных детей;

- при обнаружении ЦМВ в клинических материалах БКМ в количествах, превышающих по инфекционной активности 10-50 и более вирусных частиц в 1 мл, оценивать необходимость использования терапевтических средств;

- использование молекулярно-биологических методов, основанных на выявлении ДНК (ПЦР и ПЦР in situ) для установления этиологического агента и изучения патогенеза ЦМВИ в материалах аутопсии.

В 76,5% случаев у недоношенных детей с подозрением на ВУИ был подтвержден диагноз на первой неделе жизни. При этом ВУИ вирусной этиологии встречалась значительно чаще, чем бактериальной (34,6% против 18,5%). У недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ показатели индуцированной продукции альфа-ИФН и гамма–ИФН значительно варьировали и потому особый интерес представлял вопрос о влиянии лечения Вифероном на интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ при рождении.

Анализ уровней ИФН-альфа и ИФН-гамма до лечения и через 1 – 2 месяца после лечения был проведен при обследовании 30 детей. Было установлено, что количества сывороточного и спонтанного альфа-ИФН были низкими и не различались  до и после лечения (медианы 5 пкг/мл).

В связи с высокой вариабельностью значений  индуцированного  альфа-ИФН дети  данной  группы  были разделены на 2 подгруппы: в подгруппу 1А (n=13) вошли дети с высоким исходным уровнем (>100 пкг/мл) индуцированного альфа-ИНФ, в подгруппу 1Б (n=17) – с низким уровнем цитокина (<100 пкг/мл) до лечения.

РИС. 3. Изменение уровня индуцированного альфа-ИФН у новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ в результате базового лечения с применением Виферона.

По вертикали – значения медианы альфа-ИФН, пкг/мл; По горизонтали – недоношенные новорожденные дети с ВУИ: подгруппа А – дети с исходно высоким уровнем альфа-ИФН, получавшие базовое лечение с Вифероном; подгруппа Б – дети с исходно низким уровнем альфа-ИФН, получавшие базовое лечение с Вифероном; подгруппа В – дети, получавшие базовое лечение без Виферона; контроль – здоровые доношенные дети.

Количественный анализ альфа-ИНФ показал, что в подгруппе 1А в результате базового лечения с применением Виферона уровень альфа-ИНФ снижался в 4 раза. В подгруппе 1Б, напротив, выявлено увеличение уровня индуцированного альфа-ИНФ, который приближался к уровню в контрольной группе. У детей без виферона уровни альфа–ИНФ фактически не изменялись. Это свидетельствует об иммунокорригирующем действии Виферона. Оно проявлялось в разнонаправленном изменении уровней индуцированной продукции альфа-ИФН лейкоцитами недоношенных детей из обеих подгрупп группы детей с ВУИ.

Результаты повторного вирусологического обследования детей представлены в таблице №5.

Таблица 5. Результаты повторного исследования биологических сред у детей методом БКМ на ЦМВ и ВПГ.

Базисная терапия

+ Виферон

Базисная терапия

Элиминация вирусов

38,5%

23,1%

Снижение кол-ва ЦМВ и ВПГ

30,8%

-

Прежнее кол-во ЦМВ и ВПГ

30,7%

76,9%

Положительная динамика

69,3%

23,1%

Исследование показало, что при применении базисной терапии элиминация вирусов отмечена в 23,1%, а при включении Виферона - в 38,5% (таблица №5). В целом, при использовании Виферона в 69,3% случаев у недоношенных детей обнаружена положительная динамика (снижение количества инфекционного вируса или его элиминация), тогда как при базисной терапии - только в 23,1% случаев.

Совместно с д.м.н., проф. Дегтяревой М.В. для оценки эффективности действия Виферона дополнительно были обследованы две группы детей с ВУИ  при различных жизнеугрожающих состояниях неонатального периода. Первую группу составили недоношенные новорожденные дети (n=87) с клиническими признаками ВУИ, находившиеся в отделении реанимации и интенсивной терапии Городской Больницы №8 и получавшие Виферон в дополнение к базовой терапии. Во вторую группу (n=108) были включены дети, получавшие только базовую терапию.

Таблица 6. Сравнение показателей летальности у детей с ВУИ, получавших и не получавших терапию Вифероном.

Патологические состояния

Количество летальных исходов

(базисная терапия + Виферон)

Количество летальных исходов

(базисная терапия)

Статистическая значимость различий

(2-сторонний точный критерий Фишера)

Энтероколит

2/45

(4,4%)

6/20

(30%)

0,008 OШ=0,109 95% ДИ (0,013-0,706)

ОР=0,148 95% ДИ (0,021-0,739)

Пневмония

2/63

(3,2%)

7/29

(24,1%)

0,004  OШ=0,103 95% ДИ (0,014-0,607)

  ОР=0,132 95% ДИ (0,019-0,64)

ВУИ смешанной этиологии

4/81

(4,9%)

7/38

(18,4%)

0,036 OШ=0,23 95% ДИ (0,05-0,96)

  ОР=0,27  95% ДИ (0,07-0,96)

Анализ показателей смертности при всех изученных патологических состояниях показал, что уровни летальности между группами леченых и не леченых Вифероном детей в большинстве случаев различались в 2-3 раза. В таблице 6 представлено количество летальных исходов у детей с энтероколитом, пневмонией и с ВУИ смешанной этиологии.

Всего при использовании базисной терапии умерло 20 из 87 детей (22,3%), тогда как при терапии с применением Виферона показатель летальности был существенно ниже и составил 4,2%. Таким образом, применение Виферона позволило снизить показатели летальности в 5,3 раза.

Анализ включения метаболической и иммунной терапии в комплексное лечение беременных женщин и недоношенных детей.

Исследование биологических сред новорожденных детей с признаками ВУИ и материала аутопсии плодов и умерших новорожденных методом БКМ установило присутствие инфекционно-активного ЦМВ в 16,8% - 49% случаев. Высокий процент выявления ЦМВ требует мероприятий по укреплению неспецифического иммунитета и противовирусной терапии. При этом существенное значение имеет состояние здоровья беременных, которым при выявлении активной вирусной инфекции назначают специфические антивирусные препараты, которые высокотоксичны для плода и не всегда разрешены во время беременности. Возможной альтернативой этому является использование иммунокоррегирующей  и метаболической терапии. В данном разделе работы проведена сравнительная оценка влияния метаболической терапии и Виферона на течение и исход беременности женщин с ОАГА.

Метаболические препараты в предгравидарной подготовке были использованы у 260 женщин, инфицированных ЦМВ в возрасте от 22 до 28 лет, у которых проведен анализ анамнестических данных, мониторинг течения беременности, и прослежены исходы родов. Работа была проведена на базе вирусологической и бактериологической лабораторий НПП «Питательные среды» (директор – проф., академик РАМНТ Меджидов М.М.). Женщины состояли на учете в ЖК №2 г. Махачкалы и были обследованы  совместно с к.м.н. Сулеймановой И.Г. Женщины были разделены на три группы: основную группу (1) составили 106 женщин с ОАГА в возрасте 22-28 лет, взятых под наблюдение за 2-4- месяца до наступления настоящей беременности. В этой группе проведен полный комплекс клинико-лабораторного обследования с последующей предгравидарной подготовкой. На основании выявления наиболее значимых факторов риска внутриутробного инфицирования проводилась комплексная традиционная терапия, после чего была запланирована беременность. Женщины основной группы кроме традиционной терапии получали метаболическую терапию до беременности и во время беременности. Продолжительность терапии составляла 10-12 дней в месяц. Вторую группу (n=82) составили женщины с ОАГА, находившиеся под наблюдением с конца II триместра беременности и прошедшие неполный курс метаболической терапии. В третью группу вошли 72 женщины с ОАГА, взятые на учет с первых недель беременности без подготовки к ней. Все женщины были обследованы, получали  специфическое лечение, коррекцию биоценоза, но не получали метаболическую терапию.

Обследование проводили дважды – при становлении на учет в женскую консультацию и за 3-6 недель до родов. По выявлению возбудителей ИППП на первый срок обследования все группы были идентичны. При повторном обследовании частота обнаружения микоплазмы, уреаплазмы и вторичной бактериальной флоры у женщин в первой группе была значительно снижена. Обследование женщин второй и третьей групп перед родами показало достоверно высокую частоту таких заболеваний как микоплазмоз и ВПГИ во второй группе. В женщин в третьей группе были обнаружены микоплазмы, уреаплазмы, ВПГ и иная патогенная и условно-патогенная флора.

Анализ течения беременности показал, что ранний и поздний гестоз во 2 и 3-й группах отмечались несколько чаще, чем в 1-й группе. Угроза прерывания беременности в сравниваемых группах отмечалась в 1,8-1,9 раз достоверно чаще, чем у женщин 1-й группы. Женщины из 2 и 3-й группы в три раза чаще, чем женщины 1-й группы болели острыми респираторными вирусными инфекциями,  протекающими в более тяжелой форме. Острые респираторные заболевания могли быть одной из причин обострения хронических болезней, которые в группах сравнения наблюдались у каждой второй женщины (56,1% и 55,6%) по сравнению с 21,7% - в основной группе. Хроническая гипоксия и задержка внутриутробного развития плода отмечались во 2 и 3-й группах значительно чаще (р<0,005). Преждевременные роды в группах сравнения отмечались в 2,5 раза достоверно чаще, чем в основной группе. В 1-й группе 65% родов прошли без каких-либо акушерских осложнений, в то время как в группах сравнения различные осложнения в родах и послеродовом периоде были отмечены у большинства женщин (76,4%-78%). Из 260 живыми родились 258 младенцев. Исходы родов у женщин сравниваемых групп представлены в таблице №7. У 23,6% новорожденных 1-й группы были отмечены признаки ВУИ. В группах сравнения 63,8% - 66,7% детей, родились с признаками ВУИ. У 26 новорожденных из второй группы (32,5%) и 34 новорожденных из третьей группы (47,2%) в среднем через 2,5-36 часов ухудшилось состояние с нарастанием симптомов сердечной и легочной недостаточности и инфекционного токсикоза, что требовало перевода их в отделение реанимации новорожденных. Всего в отделение реанимации было переведено 46 детей, из которых в 61,3% случаев было подтверждено  ВУИ.

Таблица 7. Состояние новорожденных в сравниваемых группах.

Состояние новорожденных

1 группа

(n=106)

2 группа

(n=82)

3 группа

(n=72)

Родились живыми 

106

80

72

Умерли в пери- и неонат. периодах

0% ±1,9

8,5% ±3,1 (p< 0,02)

13,9%± 4,1(p< 0,01)

Недоношенные

9,4%± 2,8

23,2%± 4,7(p<0,02)

23,6±%5,0 (p< 0,02)

Масса тела донош.

3486,2 ±548,3

3322,2 ±340,1

3322,2± 341,1

Оценка по шкале Апгар:  6-7 баллов

0%± 1,9

31,3% ±5,2(p< 0,001)

38,9%± 5,8(p< 0,001)

  7-8 баллов

58,5%±4,8

31,3%± 5,2 (p<0,001)

27,8%± 5,3(p<0,001)

  8-9 баллов

40,6%± 4,7

37,5%± 5,4

33,3% ±5,5

Гипотрофия

2,8% ± 1,6

8,8% ±3,2 (н/з)

11,1%± 3,7 (p< 0,05)

Клинические признаки ВУИ

23,6% ±4,1

63,8% ±5,4 (p<0,001)

66,7± 5,6 (p< 0,001)

Примечание: Оценка по шкале Апгар, относительное количество новорожденных с признаками гипотрофии и внутриутробного инфицирования во второй группе вычислялся от числа живорожденных (n=80).

Таким образом, проведение предгравидарной подготовки за 2-4 месяца до беременности с использованием метаболической терапии приводит к существенному снижению осложнений в родах и послеродовом периоде, снижает вероятность внутриутробного инфицирования плода и новорожденного. Позволяет улучшить течение периода адаптации новорожденных и ведет к снижению перинатальной и младенческой смерти.

В ранее проведенных исследованиях была показана высокая эффективность применения генно-инженерного рекомбинантного препарата виферон, представляющего собой α-2-интерферон, ассоциированный с антиоксидантами, и обладающего иммуностимулирующим и противовирусным эффектом, в профилактике внутриутробного инфицирования плода (ВУИ). Исследования проводились в  третьем триместре беременности, начиная с 28 недель [Тареева Т.Г., 2000]. Для обоснования возможности более ранней иммунокоррекции при помощи виферона-500000 МЕ мы провели сравнительный анализ включения виферона в комплексное лечение беременных, начиная со второго триместра беременности. Работа проводилась совместно с лабораторией онтогенеза и коррекции системы интерферона НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (заведующая лабораторией – д.б.н., проф. В.В. Малиновская)  и 2-м акушерским отделением МОНИИАГ МЗ РФ (заведующая отделением – д.м.н. С.В. Новикова).

Под наблюдением находилось 74 беременные с ОАГА. Исследования проводились в динамике гестации, начиная  с 12-16 недель беременности до родов. Были применены общеклинические, ультразвуковые, вирусологические (ПЦР, ПЦР-RT, БКМ, ИФА) и иммунологические (определение альфа-ИФН, гамма-ИФН) методы исследования. Исследования проводились до начала терапии вифероном, после окончания лечебного курса и  накануне родоразрешения. У 40,9% женщин во время предыдущих беременностей отмечено обострение герпесвирусной инфекции (ГВИ), вызванной ВПГ и/или ЦМВ. Смешанная урогенитальная инфекция была выявлена у 42 из 74 беременных (56,8%).

Частота суммарного обнаружения маркеров ГВИ у беременных женщин в динамике показана на рисунке 4. Женщину считали инфицированной, при обнаружении маркеров ГВИ в любом из исследованных биологических сред хотя бы одним из методов. При обследовании на 12-16 неделе у 15 из 74 женщин (20,3%) были выявлены прямые маркеры ГВИ, при повторном обследовании (26-32 неделя беременности) у 18 из 46 женщин (39,1%).  Различия в выявлении маркеров ГВИ на 12-16 и на 26-32 неделях гестации статистически значимы (р=0,008). Надо отметить, что у 8 из 18 женщин маркеры ГВИ были впервые обнаружены при вторичном обследовании на 26-32 неделях беременности. 

При третьем обследовании (37-39 недели беременности) маркеры ГВИ были выявлены у 8 из 23 беременных, что составило 34,8%. У 4 из 8 женщин маркеры ГВИ впервые были обнаружены при третьем обследовании, уже непосредственно перед родами.

РИС. 4. Частота обнаружения маркеров ГВИ у беременных женщина на различных сроках беременности.

Из 27 случаев первичного обнаружения маркеров ГВИ на разных сроках беременности 15 случаев было выявлено к концу 1 триместра, 8 случаев к концу 2 триместра и 4 случая к концу третьего триместра. Как видно из рисунка 4, почти у четверти беременных женщин  (26,1%) вирус впервые обнаруживается к концу 2 и 3 триместра беременности. Это указывает на необходимость неоднократного обследования беременных на наличие маркеров ГВИ. Исследование, проведенное в динамике, показало, что с увеличением срока гестации частота выявления маркеров ЦМВ и ВПГ остается на относительно высоком уровне, при этом вирусная нагрузка оставалась низкой.

Для выявления различных форм ЦМВИ мы пользовались классификацией, предложенной ранее [С.Г. Чешик и др., 2001]. Латентная форма ГВИ, при которой определяются только антитела IgG, была выявлена у 40,3% женщин. Реактивированная форма ГВИ, при которой определяются специфические антитела класса IgM одновременно с IgG, была диагностирована у 2,9% женщин. Персистирующая форма ГВИ, характеризующаяся вирусовыделением при отсутствии антител класса IgM в крови, на разных сроках беременности впервые была установлена в 51,4% случаев.

В дополнение к базисной терапии с 14 недель беременности 28 женщин получали Виферон-500000 МЕ по следующей схеме: ежедневно в течение 10 дней по 1 свече 2 раза в день (20 свечей); затем дважды в неделю по 1 свече 2 раза в день– 10 свечей. Базисную терапию получали 46 беременных. Результаты повторного вирусологического обследования женщин представлены в таблице №8.

Таблица 8. Результаты повторного обследования беременных на наличие маркеров ЦМВ и ВПГ.

Базисная терапия

+ Виферон

Р

Базисная терапия

Элиминация вирусов

8 (28,5%)

р=0,025

3 (6,5%)

Реактивация ЦМВ и ВПГ

0 (0%)

р=0,014

11 (23,9%)

Прежнее кол-во ЦМВ и ВПГ

3 (10,7%)

p ›0,05

5 (10,9%)

Анализ показал, что у 28,5% беременных, получавших в дополнение к базисной терапии препарат Виферон, вирус элиминировал из организма.  В группе беременных, не получавших Виферон, вирус элиминировал только в трех наблюдениях из 46 (6,5%). Ни в одном наблюдении  у женщин, получавших Виферон, не отмечено реактивации ЦМВ и ВПГ инфекции во время беременности, в то время как у женщин, получавших только базисную терапию, реактивация инфекции была зарегистрирована почти у четверти (23,9%). В прежнем  количестве  ЦМВ и ВПГ сохранялись  почти у 11% обследованных из обеих групп.

Суммируя результаты применения метаболической и иммунной терапии у беременных можно констатировать:

  • статистически значимую элиминацию вируса при повторных лабораторных исследованиях биологических сред после применения метаболической и иммунной терапии по сравнению с базисной терапией;
  • отсутствие и/или снижение количества рецидивов ВПГ и ЦМВ – инфекций у беременных с ОАГА;
  • снижение общего числа случаев внутриутробной инфекции более чем в 3 раза, в том числе тяжелых ее форм (внутриутробная пневмония, сепсис) с 26,7% до 5,2%;
  • уменьшение с 25% до 11,3% случаев перинатальной патологии неинфекционного генеза (ЗВУР, хроническая гипоксия, асфиксия при рождении, нарушение мозгового кровообращения);
  • снижение в 2-2,5 раза общей частоты осложнений беременности (ФПН, гестоз, угроза прерывания беременности).

Поиск новых субстанций природного происхождения, обладающих противовирусной активностью в отношении ЦМВ человека in vitro.

Новые препараты для лечения ЦМВИ у беременных и новорожденных, несомненно, должны обладать высокой антивирусной активностью в сочетании с незначительной токсичностью для клеток и организма в целом. Поэтому поиск природных, натуральных веществ, представляется весьма перспективным для создания лекарственных средств нового поколения.

За последнее время быстро развивающейся областью медицинской химии является химия фуллеренов и соединений на их основе. Установлена уникальная химическая структура этих соединений, ряд из которых обладают разнообразной биологической активностью: повышение устойчивости клеток к токсическим соединениям, образуют аддукты, являются антиоксидантами, обладают адъювантными свойствами, не вызывают аллергенных реакций, проникают через липидные мембраны, модулируя трансмембранный перенос ионов, обладают нейропротективными свойствами. Расширение спектра веществ, обладающих анти-ЦМВ активностью, позволило бы решить проблему резистентности, неизбежно возникающую при применении химиопрепаратов однонаправленного действия.

Часть работы была посвящена изучению противовирусной активности аминокислотных производных фуллерена и оценке возможности использования АПФ в комбинированной терапии вместе с патентованными препаратами для лечения ЦМВИ в системе in vitro. Три водорастворимые аминокислотные производные фуллерена - аминокапроновая кислота (С60-АКК), Na – соли аминокапроновой кислоты (С60- Na – АКК) и Na – соли аминомасляной кислоты (С60- Na – АМК) были синтезированы в ИНЭОС им. С.И. Несмеянова РАН.

Исследование цитотоксического действия АПФ на фибробласты человека показало, что степень цитотоксического действия АПФ выраженная в 50% цитотоксической дозе (СС50) составила для С60-Na-АКК- 1500мкг/мл и С60-Na-АМК- 1200 мкг/мл, а для С60-АКК – 100мкг/мл.

Изучение противовирусной активности всех трех АПФ в лечебной схеме показало, что соли АПФ оказывают более выраженное антивирусное действие по сравнению с С60-АКК. Анализ кривых позволил определить эффективную концентрацию препаратов, необходимую для подавления вирусной активности на 50% (эффективная доза - ЭД50). ЭД50  для С60-Na-АКК составила 0,6 мкг/мл, ЭД50 для С60-АКК – 2,7 мкг/мл, а для С60-Na-АМК- 22 мкг/мл. Низкая токсичность и выраженный антивирусный эффект С60-Na-АМК и С60-Na-АКК  определили наш выбор этих препаратов для дальнейшего анализа, где был определен индекс пролиферации (IP50), который подтвердил, что изученные вещества обладают относительно низким антипролиферативным действием. IP50 для С60-Na-АКК составил 160 мкг/мл, а для  С60-Na-АМК - 550 мкг/мл. По совокупности полученных данных соли АПФ представлялись весьма перспективными, и в дальнейшем было изучено их влияние на репродукцию инфекционно активного вируса в культуре клеток. Заражение клеток ЦМВ с ИМ 0,01БОЕ/кл. позволило установить, что С60-Na-АКК вызывает 50% подавление инфекционной активности вируса при концентрации 1,3 мкг/мл, а С60-Na-АМК – при 2,2 мкг/мл, ХТИ = 1153 и 545, соответственно.

Как показали полученные данные, АПФ достоверно подавляют инфекционную активность ЦМВ, выявленную в культуральной жидкости от клеток, зараженных с высокой и низкой множественностью.  При этом степень подавления репродукции вируса находилась в зависимости от концентрации вещества и инфекционной множественности ЦМВ.

Для определения профилактического противовирусного эффекта АПФ культуру клеток обрабатывали за 24 часа до инфекции. При заражении с МИ 0,001 БОЕ/кл и концентрации С60-Na-АМК от 22мкг/мл до 0,022 мкг/мл, 100% вирусспецифическое поражение  клеток в обработанном АПФ варианте задерживалось на 1-2 дня. При 220 мкг/мл – на 7 дней. 50% подавление бляшкообразования  отмечалось при концентрации 0,22 мкг/мл при МИ 0,001 БОЕ/кл. ХТИ составил 5454. При постановке опытов по профилактической схеме с С60-Na-АКК заметного изменения по времени появления и по проценту пораженных клеток в опыте и контроле не наблюдалось.

При вирулицидной схеме воздействия вирус (МИ 0,01 БОЕ/кл) инкубировали в течение 1 часа при 370С с различными концентрациями веществ - С60-Na-АКК в концентрациях от 0,1  до 10 мкг/мл; а С60-Na-АМК в концентрациях от 0,022  до 220 мкг/мл. При использовании С60-Na-АМК в концентрации 220 мкг/мл инактивация вируса происходила полностью. В течение времени наблюдения (14 дней) не отмечалось появление характерного ЦПД вируса, в то время как в контроле в 100% клеток наблюдалось ЦПД. При концентрации С60-Na-АМК 22 мкг/мл активность вируса была снижена на 2,0 lg. Подсчет БОЕ показал, что 50% ингибирующая доза соответствует 0,22 мкг/мл. ХТИ составил 5454. При использовании этой концентрации наблюдали задержку в развитии ЦПД на 4 суток. Аналогичная постановка опыта для С60-Na-АКК  при различных концентрациях (10,0,  1,0 и 0,1 мкг/мл) показала, что 50% подавление образования бляшек наблюдается при 1,0 мкг/мл. ХТИ = 1500. С60-Na-АКК в концентрации 0,1мкг/мл не влияла на вирусную активность, а в концентрации 10 мкг/мл снижала титр вируса на 0,97 lg.

Таким образом, 2 из 3-х производных фуллерена являются высокоэффективными ингибиторами репродукции ЦМВ человека в системе in vitro. ХТИ в различных вариантах схем и концентраций для С60-Na-АКК составил  1150-2600; для С60-Na-АМК – 545-5450.

Одной из задач исследования была оценка сочетанного антивирусного эффекта фуллерена и виферона in vitro. Для этого АПФ и ганцикловир вносили в культуральную среду однократно через час после заражения в концентрации 1мкг/мл, С60-Na-АМК вносили в концентрации 0,22 мкг/мл. Для виферона использовали профилактическую схему, когда клетки обрабатывали за 24 часа до заражения раствором, содержащим 50МЕ виферона. При комбинированной схеме ганцикловир вносили в концентрации 0,24 мкг/мл, т.е. в концентрации в 4 раза меньшей, чем рекомендовано в инструкции. АПФ использовали в концентрации 0,1 мкг/мл. Концентрация виферона в комбинированной схеме также была уменьшена до 10 МЕ/мл.

При иммуноцитохимическом исследовании на 7 сутки после заражения в контрольной инфицированной культуре было 42,8% (900/2100) пораженных клеток. Статистическая обработка результатов показала, что все вещества значительно подавляют развитие ЦПД по сравнению с зараженной культурой (Р<0,0005). В культуре, обработанной ганцикловиром,  количество зараженных клеток не превышало 8,0% (186/2300), фуллереном 9,2% (211/2300). При обработке вифероном количество инфицированных клеток было больше 498/2900 (17,1%). При изучении сочетанного эффекта фуллерена с вифероном и ганцикловира с вифероном оказалось, что антивирусный эффект более выражен у пары ганцикловир+виферон. Количество инфицированных клеток при обработке культуры ганцикловиром и вифероном не превышало 2,1% (50/2300), в культуре обработанной вифероном и АПФ обнаружено 3,6% (85/2300) инфицированных клеток. Данные однозначно указывают на то, что при комбинированном использовании препаратов достижение противовирусного эффекта происходит при снижении концентраций соединений, что имеет явное преимущество перед использованием анти-ЦМВ препаратов в отдельности.

Для суждения о механизме действия АПФ на ЦМВИ in vitro были проведены дальнейшие опыты. Эффективность С60-Na-АМК в профилактической и в вирулицидной схемах позволила предположить, что вещество действует на ранних этапах взаимодействия вирус – клетка. Для проверки данного предположения фибробласты инфицировали ЦМВ в присутствии исследуемого соединения и фиксировали через 2 часа после внесения вируса, а затем окрашивали МКА к белку ЦМВ рр65, который в случае инфицирования вирусом клетки уже через час обнаруживается в ее ядре [Landolfo S., 2003]. Было установлено, что при МИ 0,01 БОЕ/кл. С60-Na-АМК  в концентрации 22 мкг/мл достоверно подавляло проникновение ЦМВ в клетки на 69,8%  (p<0,0005) по отношению к инфицированной культуре (48% окрашенных клеток в контроле против 14,5% в присутствии АПФ).

Для того, чтобы выяснить, на какие стадии жизненного цикла вируса оказывают влияние АПФ, было проведено иммуноцитохимическое окрашивание клеток с использованием МКА к сверхраннему, раннему и позднему белкам ЦМВ. В качестве положительного контроля были использованы фоскарнет и ганцикловир. Известно, что подавляя активность вирусной ДНК полимеразы, данные препараты ингибируют репликацию ДНК ЦМВ и блокируют экспрессию поздних генов, кодирующих структурные белки в ЦМВ – инфицированных клетках [De Clercd, 2001].

При концентрации 2,2 мкг/мл С60-Na-АМК снижала количество клеток окрашенных МКА к IEp72 и рр65, на 37% и 62%, соответственно. Эти значения находятся на уровне снижения экспрессии этих белков в инфицированных клетках в присутствии  фоскарнета, С60-Na-АКК не влияла на синтез сверхранних и ранних белков.

Наиболее эффективно вещества подавляли экспрессию поздних генов. Динамика экспрессии позднего структурного белка gB ЦМВ в культуре ФЛЭЧ в присутствии различных химиопрепаратов представлена на рисунке 5.

РИС. 5. Динамика выявления белка gB в ЦМВ-инфицированных фибробластах человека в присутствии различных химиопрепаратов.

       В инфицированной культуре около 40% клеток на 5 сутки экспрессировали gB. В культуре обработанной АПФ количество клеток экспрессирующих gB достигало только 8-9% (р<0,0001). В культуре, обработанной  Ганцикловиром или Фоскарнетом, экспрессия gB отмечалась в 6-7,5%. Полученные результаты позволяют заключить, что АПФ подавляют синтез поздних вирусных белков подобно Ганцикловиру и Фоскарнету, что является косвенным свидетельством ингибирования репликации вирусной ДНК.

       Для подтверждения данного вывода прямым методом была проведена серия экспериментов по количественному изучению динамики накопления ДНК ЦМВ в культуре инфицированных фибробластов методом ПЦР в реальном времени (таблица №9).

Таблица 9. Накопление ДНК ЦМВ в инфицированных клетках методом ПЦР  в реальном времени при действии различных веществ.

Дни после заражения

Виферон

Фуллерен

Фуллерен+

Виферон

Ганцикловир

Ганцикловир+

Виферон

Контроль вируса

4 сутки

отр

отр

отр

отр

отр

26,80*

7 сутки

27,23

25,96

отр

27,55

26,62

18,73

10 сутки

19,22

21,70

22,97

22,60

26,09

13,72

*  Значение Ct. Положительный контроль тест-системы  (Сt =19.11) соответствует 20000 копий ДНК/мл.

       В качестве препаратов сравнения были использованы Виферон и Ганцикловир. Результаты ПЦР и ПЦР real – time показывают, что АПФ, Виферон и Ганцикловир препятствуют накоплению вируса в клетке до 7 суток после заражения. Надо отметить, что значения Сt на 7 сутки для всех использованных веществ были на уровне нижнего предела использованной тест-системы (25,96 - 27,55). На 7 сутки количество ДНК в исследованных образцах было снижено на 2,0 lg. Ингибирующая активность проявлялась также и через 10 дней после заражения. При совместном использовании Виферона с АПФ и Ганцикловиром ингибирующий эффект был более длительным и выраженным.

       Суммируя полученные данные, можно заключить, что в ЦМВ - инфицированных клетках существует несколько вирусных мишеней воздействия для С60-Na-АКК и С60-Na-АМК, направленных на подавление инфекционного процесса в пермиссивных клетках in vitro. Для раскрытия молекулярных механизмов антивирусного действия каждого из изученных соединений необходимы дальнейшие исследования.        

       Возможность комбинирования Виферона с другими лекарственными средствами специфической противовирусной терапии дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии цитомегаловирусной инфекции, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений и, следовательно, избежать проявления побочных токсических эффектов при сохранении высокой противовирусной эффективности. Использование препаратов с различными механизмами действия позволит также избежать появления устойчивых к терапии мутантных штаммов вируса. Для того, чтобы выявить клеточные мишени, на которых направлено действие С60-Na-АКК и С60-Na-АМК, необходимо понимать процессы, происходящие в инфицированной клетке после проникновения внутрь клетки и влияние вируса на жизненный цикл клетки.  Для этого были проведены опыты, описанные в следующем разделе работы.

Действие ЦМВ на пролиферативную активность клеток ФЛЭЧ.

Одним из показателей пролиферативной активности клеток является митотический индекс. Подсчет митотических фигур в контрольной и инфицированной ЦМВ культурах ФЛЭЧ показал, что в неинфицированной культуре митотический индекс достигал максимального уровня (2,3/) на 2-й день после пересева клеток, после чего снижался до 0,2 / к 4 дню. В то же время в культуре, зараженной ЦМВ с МИ 1-5 БОЕ/кл, величина митотического индекса постоянно возрастала, достигая на 4-й день после инфицирования 13,6 /.

В инфицированной культуре к концу первого дня инфекции наблюдались митотические фигуры, в которых расположение хромосом и их морфология не соответствовали ни одной из нормальных стадий митоза и характеризовались неправильным расположением хромосом, повышенной степенью их конденсации и фрагментацией части хромосом. Доля патологических митозов среди общего числа митотических клеток к 40 часам после заражения достигала 80%.

Было высказано предположение, что митотические клетки с аномальной морфологией не способны завершить деление. Подсчет митотических фигур, соответствующих стадиям анафазы и телофазы, показал, что если в контрольной культуре ФЛЭЧ их доля от общего числа митозов составляла в среднем 17%, то на 3-й и 4-й день суммарная доля анафазных и телофазных пластинок снижалось до 1%.

На тех же препаратах проводился подсчет клеток на единицу площади. Оказалось, что в то время как в контрольной культуре эта величина возрастала с 1-го по 4-й день культивирования, в инфицированной культуре число клеток на единицу площади существенно не увеличивалось. Следовательно, в ЦМВ-инфицированной культуре наблюдалась остановка деления клеток. Возможно, что блок клеточного цикла наблюдается на стадии митоза и связан с появлением патологии митотических клеток. Аномальные митотические фигуры при инфицировании активно делящихся клеток ФЛЭЧ появлялись в течение первых суток после заражения. Это наводило на мысль, что патология митоза развивается вне зависимости от синтеза вирусной ДНК, репликация которого начинается, в среднем, через 24 часа после проникновения вируса в клетку.

Для ответа на вопрос, связана ли патология митозов с репликацией вирусной ДНК и экспрессией вирусных белков была проведена серия опытов. Культуру заражали ЦМВ в присутствии ганцикловира, являющегося ингибитором репликации вирусной ДНК и вирусом, предварительно инактивированным УФ. Степень подавления синтеза ДНК ЦМВ оценивали по числу клеток, содержащих поздний вирусный белок gB с помощью МКА. На 3-и сутки после заражения интактным вирусом 35% клеток содержали белок gB. В культуре обработанной ганцикловиром число клеток, содержащих поздний антиген, не превышало 3%. Проникновение вирусных частиц внутрь клеток контролировали путем окраски МКА к белку рр65, который является мажорным белком тегумента. Было обнаружено, что 82% клеток содержали белок рр65 после обработки культуры  инактивированным вирусом. Обработка вируса ультрафиолетом (УФ) приводила к снижению экспрессии сверхранних и ранних генов в 15 раз. При этом, появление патологических митозов в одинаковой степени наблюдалось во всех трех культурах.

Результаты подсчета митотического индекса и доли патологических митозов во всех  культурах на 3 сутки показали, что в контрольной культуре было 9,3о/оо, в инфицированной культуре 19,8о/оо,  из которых 9,7о/оо (48,9%) были патологическими. В культуре, зараженной вирусом, обработанным УФ, митотический индекс составил 15,7 о/оо, из них 7,2 о/оо (45,9%) митозов были с различной степенью патологии. В культуре, обработанной ганцикловиром, митотический индекс был несколько меньшим и составил 10,6 о/оо. Патология митоза наблюдалась в 6,0 о/оо, т. е. в 56,6% из всех митотических фигур в культуре. К 5-м суткам в культуре клеток после заражения вирусом обработанным УФ и в присутствии ганцикловира, также как и в культуре, инфицированной интактным вирусом, количество митозов с аномальной морфологией было близким и превышало 50%. Таким образом, было установлено, что подавление репликации ДНК ЦМВ, а также инактивация УФ транскрипции вирусных генов не препятствуют появлению патологических митозов. 

Влияние ЦМВ на пролиферативную активность клеток, зараженных в стадиях G0, G1 и S клеточного цикла.

Для изучения влияния ЦМВ на митотический цикл была использована система с индуцированной пролиферацией: клетки вводили  в состояние покоя G0, затем стимулировали к делению сывороточными ростовыми факторами. Заражали в различных стадиях клеточного цикла (G0, G1 и S).

Данные, полученные при заражении фибробластов, находившихся в момент инфицирования в состоянии покоя G0, представлены на рисунке 7, где точка 0 соответствует 48 часам после удаления сыворотки (G0 - период) и является моментом заражения клеток. Подсчет меченых клеток в контрольной культуре показал стандартный характер увеличения числа клеток, содержащих 3Н – тимидин. В зараженной культуре доля меченых клеток оставалась на низком уровне. Очевидно, что клетки инфицированной культуры не смогли выйти из состояния покоя и вступить в фазу синтеза ДНК после стимуляции.

Подсчет митотических клеток в инфицированной культуре, также показал снижение количества митозов с 3% в момент заражения, до 0% и оставался на этом уровне.

РИС.7. Включение 3Н - тимидина в ядра клеток ФЛЭЧ,

инфицированных в G0 периоде.

Принципиально сходные данные были получены при заражении ФЛЭЧ в стадии G1 клеточного цикла. Только 8% клеток инфицированных в G1 – периоде клеточного цикла включают 3Н-тимидиновую метку при стимуляции к делению.

Данные литературы о пролиферативной активности клеток, инфицированных в G1, противоречивы. Так, в ряде работ приведены данные, свидетельствующие об остановке ЦМВ – инфицированных клеток на границе G1/S [Dittmer and Mocarski, 1997; Kalejta et.al., 2003; Salvant et. al., 1999]. Weibusch and Hagemeier полагают, что к блоку клеточного цикла на стадии G1 может приводить экспрессия сверхраннего вирусного белка IE2 – 86 [Weibusch and Hagemeier, 1999].

Напротив, другая группа исследователей обнаружила, что IE2р86 не препятствует вхождению в S период пермиссивных к ЦМВ клеток [Murphy et. al., 2000]. В пользу этого говорят данные, полученные ранее Bresnahan с соавт., что IE2р86 активизирует промотор гена циклина Е и увеличивает уровень этого циклина, необходимого для вступления клетки в S – период [Bresnahan et. al., 1998]. Показано также, что ЦМВ приводит к деградации ингибитора циклин-зависимых киназ р21 СIP1 и, таким образом, индуцирует вхождение клеток в S – фазу [Bresnahan et. al., 1996; Sinclair et.al., 2000; Chen et. al., 2001]. Таким образом, наши данные подтверждают способность клеток, инфицированных в G1 – периоде преодолевать границу G1/S и дополняют их. Нами установлено, что лишь часть G1 – клеток способны вступить в стадию синтеза ДНК после заражения ЦМВ, но они не способны вступить в митоз. Динамика вступления клеток в фазу синтеза ДНК в культуре, инфицированной ЦМВ в S – периоде клеточного цикла, приведена на рисунке 8.

РИС. 8. Включение 3Н - тимидина в ядра клеток ФЛЭЧ,

инфицированных в S  периоде.

Точка 24 соответствует моменту заражения клеток и 24 часам после добавления сыворотки (S - период). Подсчет меченых клеток показал, что в инфицированной культуре максимальное число клеток в стадии синтеза ДНК было достигнуто на 6 часов позднее, чем в контрольной популяции. Это позволяет предположить, что длительность S фазы в инфицированных клетках увеличивается.

Результаты по подсчету митотического индекса представлены на рисунке 9, где точка 0 соответствует моменту заражения клеток и 24 часам после добавления сыворотки.

РИС. 9. Митотический индекс в культуре клеток ФЛЭЧ, инфицированных в S периоде клеточного цикла.

 

Количество митозов в контрольной и инфицированной  культурах на протяжении 48 часов наблюдения практически не отличалось. Через 12 часов после заражения в культуре были зарегистрированы митотические фигуры с аномальным расположением хромосом, число которых постоянно возрастало. К 42 часам их число составило половину от общего количества митозов.

Таким образом, в культуре ФЛЭЧ, инфицированной в S-фазе, клетки, способны завершить период синтеза ДНК, хотя и с замедлением. Установлено, что, по крайней мере, в первые часы после заражения инфицированные клетки, находившиеся в S-периоде, способны войти в стадию G2, преодолеть границу G2/M и вступить в митоз подобно неинфицированной культуре.

Опубликованные в литературе данные, свидетельствуют о том, что под действием ЦМВ пролиферирующие клетки проходят S – период и останавливаются до вступления в митотическую фазу клеточного цикла на границе G2/M [McElroy et.al, 2000; Prichard et.al., 2008].

Данные, представленные в нашей работе показывают, что, по крайней мере, в первые часы после проникновения ЦМВ, вирус не препятствует вхождению в митоз клеток, находящихся в периоде синтеза ДНК. Полученные результаты находят подтверждение в работе Jault  с соавт., которые установили, что в инфицированных фибробластах, находящихся в момент заражения в S – фазе клеточного цикла, регистрируется высокий уровень содержания циклина В и соответствующей циклин - зависимой киназы cdk-2 [Jault et. al., 1995]. Заключение авторов о блоке G2/М в ЦМВ - инфицированных клетках был сделан на основе данных проточной цитометрии ДНК, который не позволяет дифференцировать клетки, находящиеся в фазе G2 и в митозе, так как обе популяции содержат одинаковое (удвоенное) количество ДНК. Использованные нами методы (радиоавтографическое выявление S – фазных клеток и морфологический анализ митотических фигур) позволил доказать, что клетки зараженные в S – фазе, способны вступить в митоз.

Влияние ЦМВ на длительность фаз клеточного цикла.

Предположение о том, что в ЦМВ-инфицированных ФЛЭЧ прохождение S-фазы клеточного цикла происходит медленнее, чем в неинфицированной популяции, было проверено в дальнейших экспериментах с использованием метода меченых митозов (рис. 10). В обеих культурах митотические клетки, содержащие метку над хромосомами, впервые наблюдались через 4 ч после отмывки 3Н-тимидина, что соответствует продолжительности фазы G2 в диплоидных фибробластах человека. Это свидетельствует о том, что ЦМВ не влияет на прохождение стадии G2 клеточного цикла, по крайней мере, в первые часы после заражения - до 14 часов. Позже динамика меченых митозов существенно отличались в двух культурах. Снижение их доли до 50% было отмечено через 28 ч после начала опыта, в то время как в контроле этот показатель был достигнут уже к 18 часам.

РИС. 10. Изменение доли меченых митозов после импульсного внесения 3Н- тимидина в культуре диплоидных фибробластов человека, инфицированной ЦМВ.

Более медленное снижение числа меченых митозов в инфицированной культуре по сравнению с контрольной подтверждает высказанное предположение об увеличении длительности S-фазы в клетках, инфицированных ЦМВ. Расчеты по графику показали, что  S период для контрольной культуры ФЛЭЧ составил 8 часов, а для культур, инфицированных ЦМВ, - 18 часов.

Приблизительно половина всех меченых митозов имели отклонения от стандартной морфологии. Другая половина патологических митозов оставалась немеченой. Как было установлено, около половины патологических митозов возникают при инфицировании клеток, находящихся в S – периоде клеточного цикла. Учитывая отсутствие митозов при инфицировании клеток в G1 – фазе, можно заключить, что остальные, немеченые патологические митозы возникают при инфицировании клеток в стадии, предшествующей митозу – G2 или после вступления клеток в митоз.

Таким образом, взаимодействие с клеточной мембраной или проникновение белков ЦМВ в клетку влечет за собой появление патологических митозов и изменение пролиферативной активности клеток. Показано, что влияние ЦМВ на клетку находится в зависимости от пролиферативного состояния клетки в момент заражения.

ВЫВОДЫ.

  1. Сравнительная оценка эффективности лабораторных методов выявления маркеров ЦМВИ у 204 недоношенных новорожденных детей показала, что частота определения ДНК ЦМВ методом ПЦР составила  15,9%, методом БКМ – 16,8%, двумя методами – 26,2%. Серологический анализ авидности противовирусных антител выявил прогностическую значимость низкоавидных антител. Показана необходимость комплексного использования перечисленных методов.
  2. Впервые разработан  и использован для диагностики внутриутробной ЦМВИ метод ПЦР in situ при исследовании отпечатков органов и тканей умерших новорожденных. Метод позволяет визуализировать инфицированные клетки, оценить локализацию и сравнительное количество внутриклеточной вирусной ДНК.
  3. У новорожденных с признаками внутриутробного инфицирования (ВУИ) прямые маркеры ЦМВ обнаруживаются в 26% случаев, а у новорожденных без признаков ВУИ - в 5 раз реже (в 5% случаев). Через 1-3 месяца у 68% внутриутробно инфицированных происходит элиминация ЦМВ. У 19,2% к трем месяцам, еще у 11,5% к 6 месяцам неинфицированных детей маркеры ЦМВ появляются впервые. Эти данные свидетельствуют о том, что для достоверной диагностики ЦМВИ необходимо неоднократное обследование.
  4. Установлено, что применение виферона со второго триместра беременности приводит к  снижению частоты осложнений беременности в 2-2,5 раза и к снижению патологии у новорожденных детей с 26,7% до 5,2%. Включение Виферона в комплексное лечение недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ оказывает иммунокорригирующий эффект и снижает смертность при жизнеугрожающих состояниях неонатального периода.
  5. Использование в предгравидарной подготовке женщин метаболической терапии за 2-4 месяца до наступления беременности позволяет существенно улучшить течение беременности и исходы родов. Использование метаболической терапии только в период беременности по этим показателям является недостаточной.
  6. Впервые установлено, что развитие ЦМВИ зависит in vitro от фазы клеточного цикла в момент заражения. ЦМВ блокирует вступление клеток ФЛЭЧ в S-период при заражении в G0- и G1-периодах клеточного цикла; в клетках, зараженных в S-периоде, удлиняется период синтеза ДНК, сохраняется способность вступить в митоз, который блокируется в метафазе.
  7. Индукция патологических митозов ЦМВ может происходить при действии на клетки вируса, инактивированного УФ, а также при подавлении синтеза вирусной ДНК ганцикловиром, что демонстрирует определяющую роль сигнальной трансдукции в регуляции вирусом митотических генов.
  8. Впервые установлено, что водорастворимые аминокислотные производные фуллерена С60 (Nа соль аминомасляной - С60-Na-АМК и Nа соль аминокапроновой кислот - С60-Na-АКК) являются высокоэффективными ингибиторами репродукции ЦМВ в системе in vitro. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) при различных схемах воздействия для С60-Na-АКК составил 1150-2600; для С60-Na-АМК – 545-5450, что выше значений ХТИ для известных анти-ЦМВ препаратов.
  9. Установлена синергидность антивирусного действия аминокислотных производных фуллерена и виферона на модели ЦМВИ в культуре клеток. Это указывает на перспективность разработки комбинированного лекарственного средства, сочетающего антивирусные, иммуномодулирующие и антиоксидантные свойства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

  1. Влияние цитомегаловируса на прохождение клеточного цикла и формирование патологических митозов в культуре диплоидных фибробластов человека. // Онтогенез - 2001, том 32, №1, стр.29-34. / соавт.: Барсукова А.С., Федорова Н.Е., Зацепина О.В., Кущ А.А.
  2. Сравнение эффективности лабораторных методов выявления цитомегаловируса в аутопсийном материале. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии - 2002, Т.2, стр.63-69. / соавт.: Нисевич Л.Л., Федорова Н.Е., Ильина Е.Н., Талалаев А.Г., Адуева С.М., Хижнякова Т.М.., Малахова М.В., Говорун В.М., Кущ А.А.
  3. Острые респираторные вирусные заболевания и синдром внезапной смерти у детей раннего возраста. // Пульмонология - 2002, №5, стр.6-9. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Яцык Г.В., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л.
  4. Подавление цитомегаловирусной инфекции в клеточной системе аминокислотными производными фуллерена. // Вопросы вирусологии - 2002, Т.47, №1, стр.30-34. / соавт.: Федорова Н.Е., Адуева С.М., Романова В.С., Парнес З.Н., Галегов Г.А., Кущ А.А.
  5. Врожденные вирусные инфекции и маловесные дети. // Вопросы современной педиатрии - 2002, Том 1, №4, стр.9-13. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Миронюк О.В., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л., Кущ А.А., Климова Р.Р., Федорова Н.Е.
  6. Иммуноцитохимическая реорганизация ядрышка в условиях цитомегаловирусной инфекции. // ДАН - 2002, Том 387, №3, стр.589-592. / соавт.: Жарская О.О., Федорова Н.Е., Кущ А.А., Зацепина О.В.
  7. Активация транскрипции рибосомных генов при цитомегаловирусной инфекции фибробластов эмбриона человека in vitro. // Цитология 2003, Том 45, №7, стр. 690-701. / соавт.: Жарская О.О., Барсукова А.С., Федорова Н.Е., Кущ А.А., Зацепина О.В.
  8. Nanobionics of pharmacologically active derivatives of fullerene C60. // Jornal of Nanoparticle Research, Netherlands - 2003, Vol. 5, P.561-566. / соавт.: Kotelnikova R.A., Bogdanov G.N., Frog E.C., Kushch A.A., Fedorova N.E., Miller G.G
  9. Блок клеточной пролиферации и патология митоза в клетках, инфицированных цитомегаловирусом: роль периода клеточного цикла в момент заражения. // ДАН - 2003, Том 392, №4, стр.552-555. / соавт.: Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Кущ А.А
  10. Значение врожденных вирусных инфекций как причины перинатальной и младенческой смертности. // Вопросы современной педиатрии - 2005, Том 4, №2, стр.19-25. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л., Миронюк О.В., Кущ А.А.
  11. Выявление прямых маркеров цитомегаловируса и противовирусных антител у детей раннего возраста. // Вопросы вирусологии - 2005, Том 50, №1, стр. 14-19. / соавт.: Алямовская Г.А., Кешишян Е.С., Адуева С.М., Федорова Н.Е., Pustowoit B., Малахова М.В., Ильина Е.Н., Говорун В.М., Кущ А.А.
  12. Антивирусная активность липосомных препаратов антибиотика гелиомицина. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2005, Том 139, №3, стр. 330-333. / соавт.: Подольская С.В., Нарышкина Н.А., Сорокоумова Г.М., Каплун А.П., Федорова Н.Е., Кущ А.А., Швец В.И
  13. Лабораторная диагностика врожденных вирусных инфекций. // Детские инфекции - 2006, Том 5, №2, С. 12-18. / соавт.: Нисевич Л.Л., Бахмут Е.В., Аширова А.А., Кущ А.А., Коноплева Т.Н., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л.
  14. Влияние аминокислотных производных фуллерена С60 на развитие цитомегаловирусной инфекции. // Технологии живых систем - 2006, Том 3, №2, С. 42-46. / соавт.: Фрог Е.С., Котельникова Р.А., Богданов Г.Н., Штолько В.Н., Файнгольд И.И., Кущ А.А., Федорова Н.Е., Романова В.С.
  15. Перинатальные факторы риска внутриутробного инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте. // Вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии - 2007, Том 6, №4, С. 13-17. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л., Кущ А.А.
  16. Преконцепционная подготовка женщин к беременности и ее влияние на плод и новорожденного. // Педиатрическая фармакология - 2008, Том 5, № 6, С. 45-51. / соавт.: Нисевич Л.Л., Меджидова Д.Б., Сулейманова И.Г., Гаджиева З.С., Шищенко В.М., Кущ А.А.
  17. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций. Методические рекомендации - Москва 2008, С. 21 / соавт.: Кущ А.А., Федорова Н.Е., Климова Р.Р.
  18. Интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции и его коррекция вифероном. // Российский аллергологический журнал - 2008, №6, С.74-81. / соавт.: Малиновская В.В., Гусева Т.С., Паршина О.В., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Климова Р.Р., Володин Н.Н., Гетия Е.Г., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Кущ А.А.
  19. Динамика маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии. // Педиатрия - 2008, Том.87, №3, С.143-144. / соавт.: Гаджиева З.С., Павлова М.В., Гетия Е.Г., Н.Н.Володин, Ж.В. Евсегнеева, С.Н. Щербо, Е.Н. Выжлова, Р.Р. Климова, Н.Е. Федорова, М.В. Дегтярева, В.В. Малиновская, A.A. Кущ.
  20. Внутриутробная инфекция: мать-плацента-плод. // Детские инфекции - 2008, Том 7, №2, С.9-13. / Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Туманова Е.Л., Парсегова Т.С., Кущ А.А.
  21. Алгоритм вирусологического лабораторного обследования недоношенных новорожденных детей с врожденной цитомегаловирусной инфекцией в течение первого года жизни и влияние терапии Вифероном на исход внутриутробной инфекции. // Педиатрия 2009, Т.87, № 2, С.55-62. / соавт.: Павлова М.В., Федорова Н.Е., Гаджиева З.С., Евсегнеева Ж.В., Щербо С.Н.,  Гетия Е.Г., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Володин Н.Н., Малиновская В.В., Кущ А.А.
  22. Выявление прямых маркеров ВПГ и ЦМВ в аутопсийном материале плодов и умерших новорожденных с помощью быстрого культурального метода и полимеразной цепной реакции. // Вопросы практической педиатрии 2009, №6, С. / соавт.: Нисевич Л.Л., Гаджиева З.С., Цибизов А.С., Климова Р.Р., Кущ А.А.
  23. Эффективность лечения рекомбинантным интерфероном -2 (Вифероном®) недоношенных детей с тяжелыми внутриутробными инфекциями // Детские инфекции 2009, №3, С.40-44. / соавт.: Кущ А.А., Дегтярева М.В., Малиновская В.В., Солдатова И.Г., Климова Р.Р., Серова Е.В., Гетия Е.Г., Цибизов А.С., Гаджиева З.С.
  24. Герпесвирусные инфекции и перинатальная патология. // Русский педиатрический журнал 2009, №6 , С. / Адиева А.А.
  25. Nontoxic fullerene analogs, еffectively suppressing of HIV and CMV infectivity. // Russian Jornal of HIV/AIDS and related problems; Vol.4, №1 Sankt-Petersbourg - 2000, p.179-180. / соавт.: Kuschch A., Parnes Z, Romanova V., Pokidysheva L., Titova I., Makarova N., Adueva S.
  26. Involvement of congenital cytomegalovirus-infection in fetus and infant mortality. // Jornal of Clinical Virology. Vol.18, Nos.1-3, Glasgow, Scotland - 2000, p.195-196. / соавт.: Kushch A.,  Adueva S., Talalaev A., Fedorova N., Nisevich L.
  27. Изменение параметров митотического цикла в диплоидных фибробластах человека под действием цитомегаловируса. // Межд. конференция “Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем”- Махачкала - 2001, стр.102-103. / соавт.: Барсукова А., Федорова Н.
  28. Использование диплоидных фибробластов человека для изучения противовирусной активности аминокислотных производных фуллерена. // Межд. конференция “Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем”- Махачкала - 2001, стр. 101-102. / соавт.: Федорова Н., Адуева С., Романова В., Парнес З., Галегов Г.
  29. Нетоксичные производные фуллерена, эффективно подавляющие инфекционную активность ЦМВ in vitro. // 5 Междунар. конференция “Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы”, Т.4, №1 Санкт-Петербург - 2000, стр. 76-77. / соавт.: Кущ А.А., Парнес З.Н., Романова В.С., Макарова Н.Е., Адуева С.М.
  30. Выявление маркеров цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста. // 3 Межд. конференция “Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем”- Махачкала - 2001, стр.105-106. / соавт.: Адуева С., Федорова Н., Алямовская Г., Сахарова Е., Кешишян Е.
  31. Острые респираторные вирусные заболевания и синдром внезапной смерти. // 11 Нац. конгресс по болезням органов дыхания - Москва - 2001, стр.180. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Миронюк О., Кущ А., Климова Р.
  32. Острые и хронические внутриутробные вирусные инфекции в перинатальной и младенческой смерти. // Мат. 3 Рос. Научного форума “Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии” – Москва - 2001, стр.358-361. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Кущ А., Климова Р., Федорова Н., Корнюшин М.
  33. Различная чувствительность эмбриональных клеток человека к цитомегаловирусу. // Межд. конференция “Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем”- Махачкала -2001, стр.103-104. / соавт.: Адуева С., Хижнякова Т., Смирнова Т., Федорова Н.
  34. Сравнение эффективности методов лабораторной диагностики для выявления ЦМВ в аутопсийных материалах. // Межд. конференция “Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем”- Махачкала - 2001, стр.106-107. / Нисевич Л., Федорова Н., Адуева С., Говорун В., Ильина Е., Малахова М.
  35. Использование методов лабораторной диагностики при оценке роли цитомегаловируса человека в смертности новорожденных и детей раннего возраста. // 8 Съезд всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.- Москва - 2002, стр.301. / соавт.: Нисевич Л., Федорова Н., Адуева С., Говорун В., Ильина Е., Малахова М., Кущ А.
  36. Nanobionics of farmacologicaly active derivates of fullerene C60. // 5 Международная конференция  “Фуллерены и атомные кластеры”, С.-Петербург - 2002, 15-18 мая. / соавт.: Котельникова Р., Богданов Г., Фрог Е., Котельников А., Романова В., Андреев С., Кущ А., Федорова Н., Миллер Г.
  37. Врожденные аномалии легкого и бронхов у детей с внутриутробной инфекцией. // 12 Нац. Конгресс по болезням органов дыхания, Москва - 2002, стр.166. / соавт.: Нисевич Л., Кущ А., Миронюк О., Парсегова Т., Туманова Е.
  38. Значение острых респираторных вирусных заболеваний в танатогенезе новорожденных и детей первого года жизни. // 12 Нац. Конгресс по болезням органов дыхания, Москва - 2002, стр.201. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Кущ А., Миронюк О., Корнюшин М.
  39. Применение метода полимеразной цепной реакции для диагностики цитомегаловирусной инфекции. // Межд. конференция “Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины”, Москва - 2002, стр.251-252. / соавт.: Малахова М., Ильина Е., Федорова Н., Адуева С., Кущ А., Нисевич Л., Талалаев А.
  40. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста. // Научн. - практ. симпозиум “Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении”, Москва - 2002, стр.249-251. / соавт.: Адуева С.,  Меджидова М., Федорова Н., Кущ А., Ильина Е., Малахова М., Говорун В., Алямасольская Г., Кешишян Е., Воронцова Ю., Солдатова И., Дегтярева М.
  41. Врожденные пороки развития желудочно-кишечного тракта у детей с внутриутробной инфекцией. // 8 Конгресс Педиатров России “Детская гастроэнтерология: настоящее и будущее”, Москва - 2002, стр.199-200. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Миронюк О., Кущ А.
  42. К вопросу лабораторной диагностики урогенитальных инфекций. // 4 Межд. конференция ”Разработки и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем ”, Махачкала - 2003, стр.81-83. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С., Меджидов М., Алиева С.
  43. Нарушения клеточного цикла фибробластов человека, инфицированных цитомегаловирусом. // Цитология, С-Петербург - 2003,стр.939-940. / соавт.: Федорова Н., Меджидова М., Кущ А.
  44. Поражение бронхолегочной системы в перинатальной и младенческой смерти. // 13 Нац. конгресс по болезням органов дыхания, С-Петербург - 2003, стр.225. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.
  45. Поражение ЦНС при врожденных инфекциях по данным п/а и вирусологических исследований. // Научно - практ. конф. педиатров России и фармакотерапия в педиатрии, Москва - 2004, стр.28-29. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Миронюк О., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.
  46. Применение биологически активных добавок в лечении урогенитальных инфекций. // Всероссийская научно - практ. конф. “Медицинская микробиология-хх1 век”, Саратов - 2004, стр.7-9. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С., Меджидов Ш., Алиева С.
  47. Использование метода биорезонансного тестирования в лабораторной диагностике урогенитальных инфекций. // Всероссийская научно - практ. конф. “Медицинская микробиология-хх1 век”, Саратов - 2004, стр. 12-13. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С.
  48. Выявление количественного состава ассоциаций хламидий при смешанной урогенитальной инфекции. // Росс. конгресс “Генитальные инфекции и патология шейки матки”, Москва - 2004, стр.77. / соавт.: Сулейманова И., Омарова С., Меджидов М., Акаева Ф., Алиева С.
  49. Клинико-диагностическая значимость ЦМВИ в развитии патологий плода и новорожденных. // Росс. конгресс “Генитальные инфекции и патология шейки матки”, Москва - 2004, стр.15-16. / соавт.: Сулейманова И.
  50. Поражения тимуса при внутриутробном инфицировании по результатам п/а и вирусологических исследований. // 3 Конгресс педиатров-инфекционистов “Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей”, Москва - 2004, стр.163. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.
  51. Клинико-диагностические аспекты хламидийных уретритов у мужчин в городе Махачкале. // Всеросс. научн. конф ”Медицинские иммунобиологические препараты в 21 веке: разработка, производство и применение”, Уфа - 2005, стр.185-187. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С., Садуллаева А., Гаджиева З., Алиева С., Меджидов М.
  52. Поражение ж/к тракта у детей с внутриутробной инфекцией по результатам аутопсий. // 10 Съезд педиатров России “Пути повышения эффективности медицинской помощи детям”, Москва - 2005, стр.379-380. / соавт.: Нисевич Л.,  Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Миронюк О., Кущ А.А.
  53. Удельный вес внутриутробных вирусных инфекций. // 8 Росс. Форум “Мать и дитя”, Москва - 2005, стр.581-582. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л.
  54. К вопросу о роли пневмоний в танатогенезе детей с внутриутробной инфекцией. // 4 Конгресс педиатров-инфекционистов России, Москва - 2005, стр.133. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.А.
  55. Врожденный сифилис у детей с внутриутробной инфекцией (по результатам п/а и вирусологических исследований). Нисевич Л., Меджидова А., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Миронюк О., Кущ А.А.- 10 Конгресс педиатров России “Актуальные проблемы педиатрии”, Москва - 2006, стр.423.
  56. Факторы риска развития патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте. // 11 Конгресс педиатров России ”Актуальные проблемы педиатрии”, 5-8февраль, Москва - 2007, стр.488-489. / соавт.: Нисевич Л, Талалаев А., Каск Л., Туманова Е., Парсегова Т., Сулейманова И., Меджидова Д.
  57. Значение врожденной вирусной инфекции в формировании аномалий развития по результатам аутопсий. // Астраханский медицинский журнал, Том 2, № 2. Астрахань – 2007, стр.133. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л. Н., Туманова Е., Парсегова Т., Кущ А. 
  58. Гепатиты при врожденной вирусной инфекции. // Научно - практ. конф. и школа по инфекционной патологии, 20-24 ноябрь, Москва – 2007. / соавт.: Нисевич Л, Талалаев А., Каск Л., Туманова Е., Парсегова Т., Кущ А.
  59. Risk factors of intrauterine infection, preventive measures. // Proc.of international scientific-practical interdisciplinary workshop “New technology in medicine and experimental biology”, Thailand (Pattaya-Bangkok) - 2007, p.49-50. / соавт.: Nisevich L., Medjidova D., Suleimanova I., Kushch A.
  60. Цитомегаловирусная инфекция у недоношенных новорожденных детей: количественные методы лабораторного анализа. // VIII Международный конгресс “Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации”, 14-17 ноябрь, РУДН, Москва - 2007, стр.473-474. / соавт.: Павлова М.В., Федорова Н.Е., Гаджиева З.С., Гетия Е.Г., Дегтярева М.В., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Гущин В.С., Выжлова Е.Н., Малиновская В.В., Кущ А.А.
  61. Выявление маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей. // VI Конгресс детских инфекционистов России “Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики”, 13-14 декабрь, Москва - 2007, стр. 18-19. / соавт.: Гаджиева З.С., Павлова М.В., Климова Р.Р., Федорова Н.Е., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Гущин В.С., Выжлова Е.Н., Малиновская В.В., Кущ А.А, Гетия Е.Г., Дегтярева М.В. 
  62. Персистенция герпесвирусов у детей с осложненным течением раннего неонатального периода изменяет цитокиновый статус новорожденных детей. // Мат. III Ежегодного конгресса и VI Cъезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (29-30 сентября) в журнале «Вопросы практической педиатрии», Москва - 2008, Том 3, №5, с. 17-18. / соавт.: Гетия Е.Г., Паршина О.В., Гусева Т.С., Кущ А.А., Климова Р.Р., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Володин Н.Н., Малиновская В.В., Дегтярева М.В. 
  63. Quantitative methods of analysis of cytomegalovirus infection in preterm infants during the 6 months.  // Clinical Virology Annual Meeting, Saariselk, Lapland, Finland, 12-15 March, Финляндия - Лапландия - 2008, Р.28. / соавт.: Pavlova M.V., Fedorova N.E., Gadzhieva Z.S., Kushch A.A. Getiya E.G., Degtyareva M.V., Malinovskaya V.V., Shcherbo S.V., Evsegneeva Zh.V.
  64. Врожденные пневмонии как одно из проявлений внутриутробной инфекции. // Сборник материалов XVI съезда педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», 16-19 февраль, Москва  - 2009, С.285. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Кущ А.А.
  65. Проявления внутриутробного инфицирования у доношенных и недоношенных детей (по материалам аутопсии). // Сборник материалов XVI съезда педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», 16-19 февраль, Москва  - 2009, С.286. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Кущ А.А.

Соискатель А.А. Адиева

 






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.