WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Мирзорахимов Акобир Каримович

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА У ВЫСШИХ  РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

Душанбе – 2012

Работа выполнена на кафедре биохимии и лаборатории ферментологии при кафедре физиологии растений Таджикского национального университета, Лаборатории молекулярной биологии и генной инженерии Института ботаники,. физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан.

Научный консультант: заслуженный работник

Республики Таджикистан

доктор биологических наук,  профессор

Бабаджанова Мухаббат Абдурахмановна

Официальные оппоненты: заслуженный работник Высшей школы           Российской Федерации, доктор

  биологических  наук,  профессор

  Карначук Раиса Александровна

доктор химических наук, профессор

  Халиков Ширинбек Халикович

  доктор биологических наук, главный

  научный сотрудник

  Нугмонов Мукбил

Ведущая организация:        Таджикский аграрный университет

им. Ш. Шотемура

Защита состоится «______» ____________2012 года в __ __ часов на заседании диссертационного совета Д 737.004.05 по защите докторских диссертаций при Таджикском национальном университете по адресу: 734025, Республика Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского национального университета

Автореферат разослан  «______» _______________ 2012 года.

Размещён на сайте ВАК www.ed.gov.ru

Учёный секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук,

доцент                                                       З.М.Хамрабаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Эффективность функционирования фотосинтетического аппарата оказывает существенное влияние на рост, развитие и продуктивность растений. Ведущая роль фотосинтеза в  продукционном процессе доказана работами многих исследователей (Ничипорович, 1956; 1967; 1982; 1988; Насыров, 1975; 1982; 1982а; 1986; Мокроносов, 1981; 1983; 1988; 1992; Тарчевский, 1977).

В процессе фотосинтеза синтезируются первичная энергия (АТФ, НАДФ . Н) и первичные органические вещества, используемые для роста, развития и плодоношения растений. Какие по химической природе вещества, в каком количестве, на каком этапе онтогенеза и в какие органы они будут поступать, зависит продуктивность растений и качество урожая. Каждый из этих этапов подвержен действию имеющихся в живом организме различных типов регуляторных механизмов. Координация всех метаболических процессов и способность организма выполнять свои разнообразные функции осуществляется через регуляцию активности ферментов в клетке.  Поэтому выявление регуляторных механизмов, действующих на уровне сложной кооперативной взаимосвязи между ферментной системой фотосинтеза и эпигенетическими процессами является актуальным.

П.Д. Усмановым (1984) была установлена широкая генотипическая  изменчивость признаков фотосинтетического аппарата высших растений.

В 1972-1990 – тые годы М.М. Якубовой с сотрудниками и М.А.Бабаджановой  с сотрудниками были проведены комплексные исследования структурно-функциональных особенностей фотосинтетического аппарата у мутантных форм растений с низкой и высокой интенсивностью фотосинтеза и продуктивностью. Проведённые исследования показали, что фотосинтетический аппарат мутантов отличающихся по продуктивности характеризуется рядом физиолого–биохимических особенностей влияющих на его функциональную активность (Якубова и др. 1980; Якубова, Юлдашев, 1983; 1984; 1986; 1989; Бабаджанова, 1990; Бакаева, 1996) .

Любое изменение в организме, в конечном счёте, связано с изменениями, происходящими на молекулярном уровне. По современным представлениям, одним из ведущих регуляторных механизмов метаболизма на молекулярном уровне является образование разнообразных надмолекулярных комплексов ферментов. Такие комплексы обнаружены при протекании гликолиза, цикл Кребса, окисления жирных кислот, биосинтеза белков и нуклеиновых кислот. (Наградова и др., 1984; Фридрих, 1986; Курганов, 1978; 1984; 1986; 1986а;1992; Курганов и др., 1986; 1989;1991; Капрельянц, 1988; Каган, 1989;  Наградова, 1990;  Наградова, Муромец, 1985;1991;  Ермаков, 1993).

Ответ на вопрос, способны ли ключевые ферменты фотосинтеза образовывать мультиферментные комплексы, имеет принципиальное значение, так как механизмы регуляции активности ферментов в свободном состоянии и ферментов, встроенных в мультиферментный комплекс различаются.

С 1980-ых годов Бабаджановой М.А. с сотрудниками ведутся комплексные исследования молекулярно-кинетических свойств ключевых ферментов темновой фазы фотосинтеза–рибозофосфатизомеразы (РФИ, КФ 5.3.1.6), фосфорибулокиназы (ФРК, КФ 2.7.1.19)  и рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О, КФ 4.1.1.39) из листьев арабидопсиса и хлопчатника. Была установлена кинетическая комплементарность этих ферментов и координированная регуляция  активности одними и теми же эффекторами, что указывало на объединение их в функциональный кластер (Бабаджанова, 1981; 1981а; 1990; 1990а; Бабаджанова и др., 1985; Бабаджанова, Бакаева, Бабаджанова, 1998; Бабаджанова, Бакаева, Алиев, 1989; 1990). Объединение этих ферментов в структурно-функциональный кластер было доказано выделением из листьев хлопчатника электрофоретически гомогенного ферментного препарата с молекулярной массой 520 кД, у которого были определены рибозофосфатизомеразная, фосфорибулокиназная и РБФ-карбоксилазная активности (Бабаджанова, 1990а; Мирзорахимов и др., 1993; 1994).

Затем из листьев хлопчатника, гороха, пшеницы и арабидопсиса при использовании разных методов очистки были выделены мультиферментные комплексы цикла Кальвина с различными величинами молекулярных масс: 180, 240, 400, 480 и 520 кД. У этих отдельно выделенных специфическим для каждого мультиферментного комплекса методом были изучены кинетические параметры ферментов РФИ, ФРК и РБФК/О (Бакаева и др., 1993; 1993а; 1993б; 1994; Мирзорахимов и др., 1993;1994).

Из листьев хлопчатника были одновременно выделены свободный и менбраносвязанный мультиферментные комплексы  и проведено сравнительное изучение их каталитических  свойств и кинетических параметров  (Бабаджанова М.П., Алиев К.А. и др., 1999; 2001; 2001а;2002;2003;2003а).

К настоящему времени установлено, что ферменты цикла Кальвина могут образовывать мультиферментные комплексы с различным числом ферментов - от двух до восьми, различающиеся по молекулярной массе – от 200 до 1000 кД и функциональным свойствам (обзоры: Романова, Павловец, 1997; Бабаджанова М.П.  2003; Gontero, 2002).

Однако, оставались невыясненными причины образования мультиферментных комплексов с такими различными величинами молекулярных масс и функциональной активности и какую роль они играют при фотосинтетической ассимиляции СО2 в различных условиях роста и развития растений.

На основании анализа, литературных данных и результатов собственных многолетних исследований нами сделано предположение, что образование разных по молекулярной массе и функциональным свойствам мультиферментных комплексов может быть связано с различным морфофизиологическим состоянием растений, их возрастом, с условиями их выращивания, влиянием факторов внешней среды.

Всё выше изложенное даёт основание считать, что исследование молекулярно–функциональных свойств мультиферментных комплексов цикла Кальвина, выделенных в различные фазы развития растений и влияния на их ферментативную активность разнообразных факторов окружающей среды является весьма актуальным.

Отсутствие комплексных сравнительных исследований структурно-функциональных особенностей мультиферментных комплексов цикла Кальвина у мутантов, отличающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности от исходных форм растений, делают эту работу ещё более актуальной.

Целью настоящей работы являлось: сравнительное исследование возрастных изменений спектра (набора) и функциональной активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина в листьях хлопчатника, выявление регуляторных механизмов фотосинтетической ассимиляции СО2 на основе анализа структурно-функциональных свойств мультиферментных комплексов у различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности исходных и мутантных форм растений, а так же изучение механизмов адаптации активности мультиферментных комплексов к изменяющимся факторам внешней среды.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

  • подобрать для листьев хлопчатника и арабидопсиса такие условия выделения электрофоретически – гомогенных препаратов свободных мультиферментных комплексов, которые не вызывали бы денатурацию белков;
  • выделить из листьев растений хлопчатника различного возраста свободные мультиферментные комплексы цикла Кальвина и определить у них величины молекулярных масс и активности трёх ферментов рибозофосфатизомеразы (КФ 5.3.1.6), фосфорибулокиназы (КФ 2.7.1.19) и рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназы (КФ 4.1.1.39);
  • выделить из листьев трёх генотипов хлопчатника (сорт 108-Ф, мутант Дуплекс, линия Л-461,) и трёх генотипов арабидопсиса (раса Энкхайм, мутанты – триплекс, 58/15), различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности, мультиферментные комплексы, сравнить их содержание и величины ферментативных активностей;
  • изучить влияние условий выращивания растений хлопчатника и гороха на спектр (набор) и ферментативные активности  свободных мультиферментных комплексов.

Научная новизна. Из листьев растений хлопчатника различного возраста с помощью методики щадящего выделения получены электрофоретически гомогенные препараты свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина. Впервые установлены возрастные изменения спектра (набора) и ферментативных активностей мультиферментных комплексов цикла Кальвина: в фазе 5-6 настоящих листьев обнаружен один мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 ± 20 кД, а начиная с  фазы бутонизации два - с молекулярными массами 520 ± 20 кД и 480 ± 15 кД.

Установлено, что независимо от величины молекулярной массы мультиферментных комплексов наибольшая рибозофосфатизомеразная, фосфорибулокиназная и рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилазная активность этих комплексов, как и интенсивность фотосинтеза, проявлялась в фазах бутонизации и цветения растений, то есть в репродуктивную фазу. Такая закономерность свидетельствует о том, что необходимое при формировании репродуктивных органов увеличение количества ассимилятов связано с возрастанием функциональной активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина.

Обнаружено, что на всех фазах развития растений величины  фосфорибулокиназной и рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилазной активности мультиферментных комплексов в присутствии собственных специфических субстратов были ниже, чем  при использовании рибозо-5-фосфата – субстрата первого фермента метаболической последовательности, состоящий из пяти ферментов – рибозофосфатизомеразы (КФ 5.3.1.6), фосфорибулокиназы (КФ 2.7.1.19), рибулозобисфосфаткарбоксилаза/ оксигеназы (КФ 4.1.1.39), фосфоглицераткиназы (КФ 2.7.2.3.) и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.13).

Полученные данные являются весьма существенным доказательством  преимуществ работы комплекса ферментов в сравнении со свободными формами ферментов. Более высокая каталитическая эффективность работы  ферментов в комплексе свидетельствует о проявлении таких механизмов регуляции активности ферментов в мультиферментном комплексе как – «направленный  или туннельный перенос метаболитов», координированная и диссоциативная регуляция. Снижение РБФ-карбоксилазной активности по мере уменьшения величины молекулярной массы мультиферментных комплексов указывает  на функциональную значимость диссоциативного механизма регуляции карбоксилазной активности РБФК/О, встроенной  в мультиферментные комплексы с различной молекулярной массой.

Результаты проведенных исследований контрастных по интенсивности фотосинтеза и продуктивности трёх генотипов хлопчатника и трёх генотипов арабидопсиса дают основание считать, что повышение эффективности фотосинтеза у продуктивных мутантов хлопчатника, и арабидопсиса наряду с другими факторами обусловлено действием двух основных биохимических механизмов регуляции метаболизма: увеличением количественного содержания мультиферментных комплексов и  возрастанием каталитической активности входящих в их состав ферментов, причём эти различия сохранялись при значительном изменении факторов внешней среды (понижение температуры и освещённости). Следовательно, содержание и функциональная активность мультиферментных комплексов являются важнейшими механизмами регуляции фотосинтеза и эпигенеза.

Впервые изучено влияние изменений факторов внешней среды – температуры и освещённости на количественное содержание и ферментативную активность мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника и гороха взятого в качестве классического объекта биохимических исследований.

Установлено, что при пониженных температурах и освещённости независимо от генотипа растения образуется новый тип мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400кД. Полученные результаты дают основание считать, что образование новой разновидности мультиферментного комплекса, является проявлением третьего биохимического механизма регуляции активности ферментов при адаптации растений к изменяющимся условиям окружающей среды.

Практическая ценность. Результаты полученных экспериментальных исследований имеют значение для понимания и дальнейшего изучения механизмов регуляции физиолого-биохимических процессов в течение жизни растения и его адаптации к постоянно меняющимся внешним факторам, при решении ряда теоретических и прикладных задач физиологии и биохимии продукционного процесса растений, при разработке тестов в биотехнологической и селекционной работе для оценки продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений, теоретических и прикладных аспектов энзимологии фотосинтеза, а так же  для развития теории ферментативного катализа.

Полученные данные можно рекомендовать для чтения лекций по общим курсам биохимии, физиологи растений, спецкурсов по фотосинтезу, энзимологии и экологии на биологических факультетах ВУЗ-ов, а разработанные методы – использовать при проведении различных лабораторных практикумов, выполнении дипломных и диссертационных работ. 

Положения, выносимые на защиту:

  • ведущими биохимическими механизмами регуляции фотосинтетической ассимиляции углекислоты в онтогенезе растений являются изменения спектра (набора)  мультиферментных комплексов цикла Кальвина, их количественного содержания и функциональной активности  ферментов, встроенных в эти комплексы;
  • более высокая каталитическая эффективность ферментов цикла Кальвина встроенных в мультиферментные комплексы в сравнении со свободными формами этих ферментов обусловлена проявлением действия важнейших механизмов регуляции активности ферментов в мультиферментных комплексах – «направленный» перенос метаболитов («интермедиатов») координированная и диссоциативная регуляция;
  • характерными физиолого-биохимическими особенностями продуктивных мутантов хлопчатника и арабидопсиса в сравнении с исходными формами растений являются увеличение количественного содержания водорастворимых белков, содержания мультиферментных комплексов и их функциональной активности. Следовательно, возрастание фотосинтетической активности у исследуемых мутантов обусловлено на ряду с другими факторами состоянием ферментной системы цикла Кальвина.
  • Адаптация фотосинтетического аппарата к пониженным температурам и освещённости осуществляется благодаря действию находящихся под генетическим контролем трёх биохимических механизмов регуляции метаболизма:
  1. увеличение количественного содержания уже имеющихся типов мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520 и 480 кД.
  2. возрастание каталитической активности этих мультиферментных комплексов
  3. появление нового типа мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400 кД.

Устойчивость мультиферментных комплексов цикла Кальвина в неблагоприятных условиях роста может быть использована в числе других признаков используемых в селекции при выделении высокопродуктиных сортов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на ежегодных апрельских конференциях профессорско-преподавательского состава Таджикского национального университета (Душанбе, 1986; 1987; 1989; 1990; 1991; 1993; 1994; 2007; 2009, 2010; 2011), II-ом Всесоюзном съезде физиологов растений (Минск, 1990), международной конференции «Итоги и перспективы энзимологических исследований метаболизма углерода при фотосинтезе» (16-20 сентября, 1991г., г. Душанбе), V-ой Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991), I-ой Конференции биохимиков  Таджикистана (Душанбе, 1993), II-ой Конференции биохимического общества республики Таджикистан «Проблемы биохимии» (Душанбе, 1996), международной научной конференции «Достижения современной физиологии растений: теоретические и прикладные аспекты», посвященной памяти академика АН Республики Таджикистан Ю.С.Насырова (Душанбе, 2008), международной конференции «Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане» (Душанбе, 2009).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на … страницах и состоит из введения, 6 глав (обзор литературы; экспериментальная часть – объекты и методы исследований; четырёх глав – результаты исследований), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего в себя 281 источника, из них 79 иностранных авторов. Работа содержит 28 таблиц, 32 рисунка.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 31 работ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследований

Источником получения ферментных препаратов служили листья  сельскохозяйственной культуры - средневолокнистого хлопчатника (Gossypiym hirsutum L., семейство Malvaceae) сорта 108-Ф, его мутанта Дуплекс и инбредной линии Л-461, модельного объекта -  арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh), семейство Cruciferae расы Энкхайм, его мутантов – триплекс, 58/15, а также  гороха (Pisum sativum L., семейство Leguminosae), сорта Крепыш как классического объекта биохимических исследований.

Исследованиями Якубовой М.М. и сотр. (Якубова и др., 1980; 1984; Кононенко, 1983; Юлдашев, 1985; Хамрабаева, 1992) установлено, что листья исходных и мутантных форм хлопчатника и арабидопсиса различались по структурно-функциональным особенностям фотосинтетического аппарата, эффективности протекания первичных световых реакций, скорости синтеза транспортного продукта – сахорозы и т.д., а также интенсивности фотосинтеза и продуктивности.

Хлопчатник сорта 108-Ф,. мутант Дуплекс и инбредная линия Л-461 выращивались в полевых условиях на экспериментальном участке Института ботаники, физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан (Гиссарская долина, г. Душанбе, 830 м над ур. моря).

Исходная раса арабидопсиса Энкхайм и мутанты триплекс, 58/15  выращивались в ящиках в оранжерее при оптимальных условиях  - температура 20-25С, почва (перегной, песок, 1:2), относительная влажность 70-80%, освещённость 20-25 тыс. люкс. (Иванов, 1974).

Определение содержания белка. Количественное содержание белка определяли по методу Лоури и др. (Lowry et al, 1951) или с реактивом Бенедикта (Кочетов, 1980). Измерения велись при длине волны 330 нм на высокочувствительном спектрофотометре ULTROSPEC II (LKB, Швеция) с полной шкалой от 0 до 0,001 экстинции.

Определение ферментативных активностей мультиферментных комплексов. Рибозофосфатизомеразную активность определяли по модифицированному методу Аксельрода и Янг (Axelrod, Jang, 1954). Определение продукта реакции - кетосахара рибулозо-5-фосфата проводили карбазольным методом по реакции Дише (Dische, Borenfreund, 1951).

Фосфорибулокиназную активность определяли по методу Гурвитца и др. (Hurwitz et al., 1956). Количество щелочегидролизуемого фосфора определяли по методу Фиске-Суббароу (Лоури-Лопас) в модификации Скулачева (Кочетов, 1980).

Активность РБФК/О определяли радиометрически или спектрофотометрическим по методике Рэккера, модифицированной А.К.Романовой (1980).

Получение электроферетически гомогенных ферментных препаратов. При получении ферментных препаратов из листьев хлопчатника в соответствии со специфическими особенностями объектов использовали общепринятые приёмы очистки, модифицировав методику получения и  очистки экстракта.

Определение гомогенности и молекулярной массы ферментных препаратов. Аналитический диск-элекрофорез в 7.5% полиакриламидном геле использовали для определения гомогенности ферментных препаратов и их молекулярной массы. Молекулярную массу определяли по калибровочному графику, построенному по относительной электрофоретической подвижности белков-метчиков.

Полученные результаты обработаны статистически (Урбах, 1964; Методы биохимического анализа,1978; Лакин,1973).

Представленные данные достоверны при доверительной вероятности 97-99%.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ НА РАЗДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА И ИХ ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ АКТИВНОСТИ ИЗ ЛИСТЬЕВ ХЛОПЧАТНИКА СОРТА 108-Ф.

Хлопчатник является для энзимологических исследований очень трудным, специфическим объектом из-за содержания в его листьях большого количества фенольных соединений. В связи с этим нами была модифицирована методика получения и очистки экстракта, а так  же изучено влияние на выделение мультиферментных комплексов различных величин рН в течение всех процедур очистки и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе при ступенчатом и линейном градиентах концентраций NaCl.

3.1. Выделение мультиферментных комплексов при pH 8.0 и ионообменной хроматографии при различных градиентах концентрации NaCl.

Для наших методических исследований были выбраны растения хлопчатника в фазе начала бутонизации.

На рисунках 1,3 представлены профили элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе свободных белков, выделенных при значении рН 8.0 в течение всех процедур очистки и ионообменной хроматографии ступенчатым (1) и линейным (2) градиентом концентраций NaCl.

   

 

На рис. 1 видно, что белки элюировались в виде двух нечётких пиков, причём второй был очень широким. Для определения гомогенности, молекулярной массы и активности ферментов нами были выбраны белки фракций 5 и фракции 15.

Для определения величин молекулярных масс белковые фракции 5 и 15 по отдельности и их смесь подвергали диск-электрофорезу в 7.5% ПААГ. На рис. 2а видно, что смесь белков фракций 5 и 15 (рис. 1) разделилась на две полосы. Белки фракции 5, а также фракции 15, нанесенные по отдельности, проявились в виде одной полосы (рис. 2б и 2в). Молекулярная масса белков фракции 15 (рис. 2б) составляла 520 ± 20 кД. Белок фракции 5 (рис. 2в) имел бльшую электрофоретическую подвижность по сравнению с белком фракции 15 (рис. 2б), и его молекулярная масса равнялась 480 ± 15 кД.

Рис.2. Электрофорез в 7.5% ПААГ белков, выделенных при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе из листьев хлопчатника в фазе бутонизации.

а – смесь белков фракций 5 и 15; б – фракция 15; в – фракция 5.

На рис. 3 видно, что белок элюировался в виде двух более чётких пиков, чем при ступенчатом  градиенте концентраций NaCl. Для определения гомогенности, молекулярной массы и активности ферментов были выбраны белки фракций 4 и 18. Белок фракции 4 имел молекулярную массу 480±15кД, а белок фракции 18 - 520 ±20.

В табл. 1 приведены данные о величинах активностей обоих мультиферментных комплексов выделенных при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе при рН 8.0 ступенчатым и линейным градиентом  концентрации NaCl.

Из приведенных в табл. 1 данных видно, что мультиферментные комплексы не различались по величинам рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности. По величинам же РБФ-карбоксилазной активности мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520кД выделенный при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе при рН 8.0 ступенчатым градиентом  концентрации NaCl превосходил мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480кД в 4 раза, а выделенный линейным градиентом NaСl превосходил мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480кД по РБФ-карбоксилазной активности в 3.6 раз.

Таблица 1.

Активности мультиферментных комплексов (МФК) выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф при рН 8.0 и ионообменной хроматографии при ступенчатом и линейном градиенте концентраций NaCl рН 8.0. Фаза развития растений начало бутонизации.

Мол.

масса

МФК,

кД

Тип

активности

Субстрат

Удельная активность,

мкмоль продукта/ мин. на 1 мг белка.

Ступенчатый

Линейный

480

520

Рибозофосфатизомеразная

Рибозо-5-фосфат

1298 ± 17

1357 ± 21

1372±22

1366±19

480

520

Фосфорибулокиназная

Рибулозо-5-фосфат

1348±20

1341±20

1341±20

1322±19

480

520

РБФ-карбоксилазная

РБФ

0.13±0.01

0.53±0.01

0.22±0.01

0.82±0.01

В результате проведённых экспериментов можно сделать вывод, что  независимо от ступенчатого или линейного градиента концентраций  NaCl при ионообменной хроматографии мультиферментные комплексы не различались по величинам  рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности. Что же касается величины РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов с различной молекулярной массой выделенных при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе линейным градиентом концентраций NaCl, то они были значительно выше, чем при использовании ступенчатого градиента концентраций NaCl. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД, выделенный линейным градиентом концентраций NaCl, превосходил в 2 раза по РБФ-карбоксилазной активности аналогичный комплекс, выделенный ступенчатым градиентом концентраций NaCl. РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса с молекулярной массой  480 кД, выделенного линейным градиентом концентраций NaCl, была выше на 56% в сравнении с активностью мультиферментного комплекса, выделенного ступенчатым  градиентом концентраций NaCl.

3.2. Выделение мультиферментных комплексов при pH 8.5 и  ионообменной хроматографии при различных градиентах концентрации NaCl.

       На рисунках 4-5 представлены профили элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе свободных белков, выделенных при значении рН 8.5 во время получения экстракта и буфера с рН 8.3 в течение всех остальных процедур очистки и ионообменной хроматографии ступенчатым  и линейным градиентом концентраций NaСl.

   

На рис. 4 видно, что белки элюировались в виде одного большого пика с пологами плечами и одного маленького. Для анализов  были выбраны белки фракции 4 и 13. Молекулярная масса белка фракции 4 составляла 480±15кД, а фракции 13 - 520±20кД.

На рис. 5 видно, что белки элюировались в виде двух чётких пиков. Для анализов были выбраны белки фракции 4 и 16. Молекулярная масса белка фракции 4 составляла 480±15кД, а фракции 16 - 520±20кД.

Результаты определения активности этих мультиферментных комплексов представлены в таблице 2.

Таблица 2

Активности мультиферментных комплексов (МФК), выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф при рН 8.5 и ионообменной хроматографии при  рН 8.3 ступенчатым и линейным градиентом концентраций NaСl. Фаза развития растений начало бутонизации.

Мол.

масса

МФК,

кД

Тип

активности

Субстрат

Удельная активность,

мкмоль продукта/ мин. на 1 мг белка.

Ступенчатый

Линейный

480

520

Рибозофосфатизомеразная

Рибозо-5-фосфат

2116 ±23

2281±24

3210±27

3418±30

480

520

Фосфорибулокиназная

Рибулозо-5-фосфат

2267±19

2307±20

3199±17

3375±21

480

520

РБФ-карбоксилазная

РБФ

0.19±0.01

1.44±0.01

0.95±0.01

1.51±0.01

Из представленных в таблице 2 данных видно, что мультиферментные комплексы почти не различались по рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности. По величинам же РБФ-карбоксилазной активности независимо от градиента концентраций NaCl мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 кД значительно превосходили мультиферментные комплексы с молекулярной массой 480 кД. Выделенные линейным градиентом NaСl мультиферментные комплексы по РБФ-карбоксилазной превосходили аналогичные мультиферментные комплексы, выделенные ступенчатым градиентом концентраций NaCl.

Таким образом, чёткое разделение мультиферментных комплексов и наибольшие величины всех ферментативных активностей были получены при использовании для получения экстракта из листьев буфера со значением рН 8.5 и при ионообменной хроматографии с буфером рН 8.3 линейным градиентом концентраций NaСl. В связи с этим, данный метод выделения свободных мультиферментных комплексов был использован нами в последующих исследованиях.

ГЛАВА 4.  ОБРАЗОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ОНТОГЕНЕЗЕ ХЛОПЧАТНИКА

4.1. Возрастные изменения  активности свободных мультиферментных комплексов.

В работе (Suss et al., 1993) установлено, что свободные мультиферментные комплексы цикла Кальвина элюировались в широком диапазоне концентраций KCl – 0-600мМ. Молекулярная масса мультиферментных комплексов составляла от 200 до 1000 кД.

Ранее из листьев хлопчатника были выделены свободные мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 и 240 кД (Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев К.А., 2006). Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 240 кД был выделен в денатурирующих условиях, как и комплекс из листьев шпината с молекулярной массой 284 кД (Rault et al., 1993). Денатурирующие условия при выделении мультиферментных комплексов были использованы для диссоциации их на мультиферментные комплексы с меньшими величинами молекулярных масс.

При выделении из листьев хлопчатника в фазах бутонизации и цветения мультиферментного комплекса в обычных щадящих условиях на профиле элюции свободных белков при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ–целлюлозе суммарный белок выходил в виде двух отчётливых пиков, резко различавшихся по содержанию белка. Фракция с наибольшим содержанием белка представляла собой мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД. У фракции с меньшим содержанием белков не была определена ни величина молекулярной массы, ни ферментативные активности  (Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев, 2002, 2006).

На рис. 6 изображён профиль элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе  линейным градиентом концентраций NaCl свободных белков, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе 5-6 настоящих листьев. Как видно на рисунке 6, белки элюировались в виде одного отчётливого  пика. Наибольшее количество белка элюировалось во фракциях 3,4,5 при концентрации NaCl 100,150 и 200 мМ соответственно. В фазе бутонизации (рис. 7) отчётливо видны два пика (фракция 4 и 8), резко различавшихся по содержанию белка. При выделении мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника в фазе массового цветения профиль элюции белков был такой же, как и в фазе бутонизации. Белки фракции 4 элюировались при концентрации NaCl 150-160 мМ, а белки фракции 8 – при концентрации NaCl 370-380 мМ.  Белки фракции 4 (рис.6,7) и 8 (рис. 7)  брали для определения молекулярной массы и активности ферментов.

Белки 1-го пика (рис. 5.6, фракция 4) проявились в виде одной полосы, молекулярная масса которого оказалась равной 520 ± 20 кД. Начиная с фазы бутонизации растений обнаруживался второй мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 ± 15 кД (рис. 7, фракция 8).

В  табл. 3 приведены результаты определения активностей этих мультиферментных комплексов.

Таблица 3

Активности мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф на различных фазах развития растений.

Мол.м.,

кД

Тип активности

Субстрат

Активность на различных фазах, мкмоль продукта/(мин. мг белка)

5-6 настоящих листьев

Бутонизация

Цветение

520

Рибозофосфатизо-меразная (РФИ)

рибозо-5-фосфат

2673 ± 16

3080 ± 18

3376 ± 20

480

не обнаружен

3041 ± 17

3345 ± 20

520

Фосфорибулокиназная

(ФРК)

рибозо-5-фосфат +

АТФ

3490 ± 21

4185 ± 26

4432 ± 28

480

не обнаружен

3597± 21

3794 ± 25

520

рибулозо-5-фосфат +АТФ

3122 ± 19

3604 ± 24

3715 ± 23

480

не обнаружен

3412 ± 20

3518 ± 22

520

Рибулозобисфос-фат

рибозо-5-фосфат + АТФ

1.38 ± 0.01

1.92 ± 0.01

2.33 ± 0.01

480

не обнаружен

1.68 ± 0.01

2.11 ± 0.01

520

РБФ

1.14 ± 0.01

1.55 ± 0.01

1.86 ± 0.01

480

не обнаружен

1.45 ± 0.01

1.74 ± 0.01

В приведённых в табл. 3 данных видно, что независимо от величины молекулярной массы на всех фазах развития растений фосфорибулокиназная и РБФ-карбоксилазная активности мультиферментных комплексов были выше при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата + АТФ, а не в присутствии собственных специфических субстратов рибулозо-5-фосфата+АТФ для фосфорибулокиназы и рибулозо -1.5-бисфосфата для РБФ-карбоксилазы .

В фазе массовой бутонизации по сравнению с фазой 5–6 настоящих листьев величины различных типов активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД была значительно выше. Рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность возросла на 16%, фосфорибулокиназная активность при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата + АТФ была выше на 20%, а в присутствии собственного специфического субстрата рибулозо-5-фосфата + АТФ – на 15%. РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса при использованиив качестве субстрата рибозо-5-фосфата + АТФ увеличилась на 39%, а в присутствии собственного специфического субстрата рибулозо-1,5-бисфосфата – на 36%.

Величины всенх типов активностей мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД  были ниже  в сравнении с величинами акимвностей мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520кД.

В фазе цветения по сравнению с фазой бутонизации рибозофосфатизомеразная активность у обоих мультиферментных комплексов возрасла на 10%. Фосфорибулокиназная активность как в присутствии собственного специфического субстрата, так и в присутствии рибозо-5-фосфата+АТФ почти не изменилась у обоих мультиферментных комплексов. РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса  с мол. м. 520 кД независимо от субстрата была выше на 7–10%, чем у мультиферментного комплекса с мол. м. 480 кД. При этом активность комплекса с мол. м. 520 кД в присутствии собственного специфического субстрата возрасла на 20%, а при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата+АТФ – на 26%.

Таким образом, в фазе цветения ферментативная активность мультиферментных комплексов была наибольшей независимо от величины молекулярной массы.

ГЛАВА 5. АКТИВНОСТЬ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ИСХОДНЫХ И МУТАНТНЫХ ФОРМАХ РАСТЕНИЙ.

5.1. Ферментативные активности свободных мультиферментных комплексов, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, его мутанта Дуплекс и инбредной линии Л-461.

Выделение и очистка ферментных препаратов, определение их активности проводились многократно. Поскольку во всех случаях были получены очень близкие результаты, в работе  приведены типичные примеры.

       Сравнительные исследования активностей мультиферментных комплексов из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс проводились на электрофоретически гомогенных препаратах, выделенных одновременно (в один и тот же день, в один и  тот же час) в фазе бутонизации растений.

       Профиль элюции свободных белков выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе линейным градиентом концентраций NaCl приведён на рис. 8.

Рис. 8. Профиль элюции свободных белков выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф (1) и его мутанта Дуплекс (2) в фазе бутонизации при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ – целлюлозе  линейным градиентом концентраций NaCl.

Из представленных на рисунке 8 данных видно, что в обоих случаях белки элюировались в виде двух отчётливых пиков, резко различающихся по содержанию белков. По содержанию белка во фракции 6 (пик I) и во фракции 15 (пик II) мутант Дуплекс превосходил исходный  сорт хлопчатника 108-Ф. Белки фракции 6 и 15 брали для определения молекулярной массы и активности ферментов.

Для обоих объектов получены аналогичные результаты. Молекулярная масса белка I пика (фракция 6) составляла 520±20кД, а белка II-го пика (фракция 15) - 480±15кД.

Результаты определения  активностей электрофоретически гомогенных мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс приведены в таблице 4.

Таблица 4

Активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его продуктивного мутанта Дуплекс в фазе бутонизации растений.

Мол.

масса,

кД

Тип активности

Субстрат

Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка

Сорт

108-Ф

Мутант

Дуплекс

520

480

Рибозофосфатизомеразная

Рибозо-5-фосфат

3010±31

2975±30

3175±33

3080±29

520

480

Фосфорибулокиназная

Рибулозо-5-фосфат

3625±38

3360±37

3820±41

3405±36

520

480

Рибулозобисфосфат-карбоксилазная

Рибулозо-1,5-бисфосфат

1.46±0.05

0.92±0.05

1.98±0.05

1.25±0.05

Из приведённых в табл. 4 данных видно, что мультиферментные комплексы выделенные из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и у мутанта Дуплекс в фазе бутонизации, почти не различались по величинам рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности. Различия между мультиферментными комплексами были выявлены только по величинам РБФ-карбоксилазной активности. По величинам РБФ-карбоксилазной активности мультиферментные комплексы с различной молекулярной массой, выделенные из листьев мутанта Дуплекс значительно – на 35-36% превосходили аналогичные мультиферментные комплексы, выделенные из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф.

Поскольку листья инбредной линии Л-461, как и у мутанта Дуплекс отличались от листьев хлопчатника сорта 108-Ф по форфобиологичеким характеристикам, показаниям фотосинтеза и продуктивности, то было важно выделить мультиферментные комплексы из листьев этого генотипа хлопчатника. Из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и инбредной линии Л-461 в фазе массового цветения - начала плодообразования, одновременно были выделены электрофоретически гомогенные препараты свободных мультиферментных комплексов и определена их рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность.

Профиль элюции свободных белков, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и линии Л-461 при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе линейным градиентом концентраций NaCl представлен на рис. 9.

Рис. 9. Профиль элюции свободных белков, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и линии Л-461, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе  линейным градиентом концентраций NaCl.

На рис. 9 видно, что белки элюировались в виде двух отчётливых пиков, резко различающихся по содержанию белка. По содержанию белка во фракции 4 сорт 108-Ф уступал линии Л-461 почти на 50%. Белок фракции 4 (1 пик) – это  мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД, а белок фракции 8 (2 пик) - мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 кД.

Результаты определения рибулозобисфосфаткарбоксилазной активности мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520 и 480 кД приведены в табл. 5.

Таблица 5

Рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность мультиферментных комплексов цикла Кальвина из листьев различающихся по продуктивности генотипов хлопчатника. Фаза развития растений массовое цветение начало плодообразования.

Объект

РБФ-карбоксилазная активность

МФК, мкмоль СО2/мин на 1 мг белка

520 кД

480 кД

Сорт 108-Ф

2.19 ± 0.01

1.36 ± 0.01

Линия Л-461

2.73 ± 0.01

2.13 ± 0.01

Из приведенных в табл.5 данных видно, что мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД (1 пик, фракция 4), выделенный из линии хлопчатника Л-461, по рибулозобисфосфаткарбоксилазной активности превосходил сорт 108-Ф на 24%. Величина рибулозобисфосфаткарбокси-

лазной активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД (2 пик, фракция 8), выделенного из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, была меньше на 56% в сравнении с активностью такого же мультиферментного комплекса, выделенного из листьев продуктивной линии Л-461.

Таким образом, мутант Дуплекс и инбредная линия Л-461 отличались от сорта 108-Ф и высоким содержанием водорастворимых белков в экстрактах из листьев, и  высоким содержанием мультиферментных комплексов и большей рибулозобисфосфаткарбоксилазной активностью (Бабаджанова; Мирзорахимов и др., 1993; 2007б; 2010).

5.2. Ферментативные активности мультиферментных комплексов из листьев арабидопсиса исходной расы Энкхайм и его мутантов триплекс, 58/15.

       Сравнительные исследования ферментативных активностей мультиферментных комплексов из листьев исходной формы арабидопсиса Энкхайм и его двух мутантов проводились на электрофоретически гомогенных ферментных препаратах, выделенных одновременно из листьев растений в фазе сформировавшейся розетки.

Профиль элюции свободных белков, выделенных из листьев арабидопсиса расы Энкхайм и его мутанта триплекс при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в фазе формировавшейся розетки представлен на рис. 10.

Рис.10. Профиль элюции свободных белков, выделенных из листьев арабидопсиса расы Энкхайм (I) и его мутантов триплекс (II) в фазе розетки при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе линейным градиентом концентраций NaCl.

На рис. 10 видно, что белки элюировались в виде двух отчётливых пиков, резко различавшихся по содержанию белка. По содержание белка во фракции 8 (пик 1) мутант триплекс превосходил исходную расу Энкхайм. Белки фракций 8 и 20 брали для определения молекулярной массы и активности ферментов. Молекулярная масса белка фракции 8 была равна 520 ± 20 кД, а белка фракции 20 – 480 ± 15 кД.

В табл. 6 приведены результаты определения ферментативных активностей  этих мультиферментных комплексов

Таблица 6

Активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина  с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев арабидопсиса расы Энкхайм и его продуктивного мутанта триплекс в фазе сформировавшейся розетки.

Мол.масса,

кД

Тип активности

Субстрат

Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка

Роса Энкхайм

Мутант триплекс

520

480

Рибозофосфатизомеразная

рибозо-5-фосфат

2972±28

2986±27

3021±32

2992±30

520

480

Фосфорибулокиназная

рибулозо-5-фосфат

2425±22

2375±24

3606±38

3101±33

520

480

Рибулозобисфосфат-карбоксилазная

рибулозо-1,5-бисфосфат

1.67±0.05

1.24±0.05

1.96±0.05

1.45±0.05

       Из представленных в табл. 6 данных видно, что у обоих объектов мультиферментные комплексы не различались по величинам рибозофосфатизомеразной активности.

Мультиферментные комплексы с различной молекулярной массой выделенные из листьев исходной расы арабидопсиса Энкхайм не различались по величинам фосфорибулокиназной активности. У мутанта  же триплекс мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил по фосфорибулокиназной активности на 16% мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 кД.

       По величинам РБФ-карбоксилазной активности мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 кД у обоих объектов превосходили  мультиферментные комплексы с молекулярной массой 480 кД на 34-35%.

Величины всех ферментативных активностей мультиферментных комплексов, выделенных из листьев исходной расы Энкхайм были значительно ниже в сравнении с активностями мультиферментных комплексов, выделенными из листьев мутанта триплекс. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД, выделенный из листьев мутанта триплекс превосходил аналогичный мультиферментный комплекс листьев исходной расы Энкхайм по фосфорибулокиназной активности на 48%, а по РБФ-карбоксилазной –на 17%.

Величины активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного из листьев мутанта триплекс, в сравнении с активностями аналогичного  комплекса листьев исходной расы Энкхайм также были выше: фосфорибулокиназная – на 31%, РБФ-карбоксилазная – на 20%.

На рис. 11 представлен профиль элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе свободных белков, выделенных из листьев арабидопсиса росы Энкхайм и его  низкопродуктивного мутанта 58/15.

Рис. 11. Профиль элюции свободных белков, выделенных из листьев арабидопсиса расы Энкхайм (I) и его мутанта 58/15 (II) в фазе розетки, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе с линейным градиентом концентраций NaCl.

Как видно из рис. 11 белки элюировались в виде двух отчётливых пиков, резко отличающихся по содержанию белка. Белки первого пика (фракция 8) имели молекулярную массу 520±20 кД, молекулярная масса белков второго пика (фракция 20) оказалась равной 480 кД.

В табл. 7 представлены результаты  определения  активностей мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520 и 480 кД, выделенных из листьев мутанта 58/15 в фазе сформировавшейся розетки.

Из представленных в табл. 7 данных видно, что мультиферментные комплексы почти не различались по величинам рибозофосфатизомеразной активности. Различия между мультиферментными комплексами наблюдались по фосфорибулокиназной и РБФ-карбоксилазной активности.  Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520кД превосходил мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480кД по величине фосфорибулокиназной активности на 11%, а по величине РБФ-карбоксилазной активности - в 2.6 раза.

Таблица 7

Активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев низкопродуктивного мутанта арабидопсиса 58/15.

Мол.масса,

кД

Тип активности

Субстрат

Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка

520

480

Рибозофосфатизомеразная

рибозо-5-фосфат

2042±23

1811±20

520

480

Фосфорибулокиназная

рибулозо-5-фосфат

2056±22

1895±19

520

480

Рибулозобисфосфат-карбоксилазная

рибулозо-1,5-бисфосфат

1.41±0.05

1.12±0.05

При сравнении ферментативных активностей мультиферментных комплексов, выделенных из листьев исходной расы Энкхайм и его мутантов наибольшие различия между ними выявлены по величинам фосфорибулокиназной и РБФ-карбоксилазной активности. По величинам этих активностей мультиферментные комплексы, выделенные из листьев продуктивного мутанта триплекс, значительно превосходили аналогичные мультиферментные комплексы, выделенные из листьев исходной расы  Энкхайм и его низкопродуктивного мутанта 58/15.

Таким образом, независимо от генотипов растений мультиферментные комплексы, выделенные из листьев продуктивных мутантов, значительно превосходили исходные формы по содержанию водорастворимых белков в экстрактах из листьев мультиферментных комплексов и РБФ-карбоксилазной активности .

ГЛАВА 6. МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К  ВНЕШНИМ ФАКТОРАМ АКТИВНОСТИ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ЛИСТЬЯХ ХЛОПЧАТНИКА И ГОРОХА.

Адаптация к высоким температурам и освещённости мультиферментных комплексов листьев хлопчатника в фазе бутонизации  растений.

       Для хлопчатника характерен длинный вегетационный период (120-150 дней). В течение этого периода происходят значительные сезонные изменения температуры, влажности воздуха, освещённости и т.д. В годы, когда лето было прохладным, температура и освещённость понижены, нами наблюдалось увеличение содержания водорастворимых белков в листьях хлопчатника в расчёте и на г сырого веса листьев, и на дм2 площади листа (Бакаева, Бабаджанова, 1984; Бабаджанова, Мирзорахимов и др., 1993). Для других культур(Удовенко, 1979; 1979а; Дроздов и др., 1980; Акимова и др., 1982; Филимонов, 1984) также было установлено увеличение содержания водорастворимых белков как при холодовом, так и при тепловом закаливании активно вегетирующих растений.

       В связи с этим представляется важным для выяснения адаптивности провести сравнительные исследования ферментативных активностей свободных мультиферментных комплексов, выделенных из листьев растений исходного сорта хлопчатника 108-Ф и его мутанта Дуплекс, высеянных как обычно весной и в августе. При посеве семян хлопчатника в августе в «естественной» лаборатории происходило постепенное или резкое изменение комплекса внешних факторов – температуры и влажности воздуха, почвы, освещённости и т.д.

В таблице 8 представлены результаты определения ферментативной активности мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф весеннего посева в фазе бутонизации растений.

Таблица 8

Активность мультиферментных комплексов (МФК) с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и высокопродуктивного мутанта Дуплекс в фазе бутонизации растений (1991).

Мол.масса

кД

Дата

выделе

ния

МФК

Температура

С

Тип

активно

сти

Субстрат

Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1 мг белка

День

Ночь

108-Ф

Дуплекс

520

480

6-10

июля

30-36

18-23

Рибозофос-

фатизо-

меразная

рибозо-5-

фосфат

3119±33

2981±30

3237±34

3117±33

520

480

фосфорибу-

локиназная

рибозо-5-

фосфат

4012±43

3575±37

4126±45

3680±38

520

480

РБФ-карбокси-лазная

рибулозо-

1,5-бисфосфат

1.40±0.05

0.90±0.05

1.91±0.05

1.13±0.05

Из представленных в табл. 8 данных видно, что величины ферментативных активностей мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев исходного сорта хлопчатника 108-ф и его мутанта Дуплекс, имели очень близкие величины рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности, но различались по РБФ-карбоксилазной активности. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД, выделенный из листьев мутанта Дуплекс, по РБФ-карбоксилазной активности превосходил на 36%  мультиферментный комплекс с такой же молекулярной массой, выделенный из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф. РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного из листьев мутанта Дуплекс, была выше на 25% активности мультиферментного комплекса, выделенного из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф.

6.2. Защитно-приспособительные механизмы адаптации к пониженным температурам  и освещённости активности мультиферментных комплексов листьев хлопчатника в фазе бутонизации.

       В табл. 9 представлены результаты определения ферментативной активности мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс при выделении  их из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и мутанта Дуплекс осеннего посева, в фазе бутонизации растений, когда была солнечная погода и температура воздуха для хлопчатника днём и ночью имела благоприятные физиологические значения (1-ое выделение).

Таблица 9

Ферментативная активность мультиферментных комплексов (МФК) с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и мутанта Дуплекс в фазе бутонизации растений (осенний посев, август 1991г.)

Мол.масса

кД

Дата

выде

ления

МФК

Температура

С

Тип

активности

Субстрат

Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка

День

Ночь

108-Ф

Дуплекс

520

480

8-10 октя-бря

24-29

16-21

Рибозофос

фатизо

меразная

Рибозо-5-

фосфат

3542±37

3388±35

4074±42

4049±41

520

480

солнечно

Фосфорибу

локиназная

Рибозо-5-

фосфат

4496±46

3345±35

4542±48

4113±43

520

480

РБФ-карбокси-лазная

Рибулозо-

1,5-бис

фосфат

2.52±0.05

2.0  ±0.05

2.72±0.05

2.31±0.05

Независимо от времени выделения и величины молекулярной массы  мультиферментные комплексы, выделенные из листьев мутанта Дуплекс, имели большие значения величин всех типов ферментативных активностей в сравнении с мультиферментным комплексами  выделенными из листьев исходного сорта хлопчатника сорта 108-Ф.

При сравнении величин ферментативных активностей мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс выделенных из листьев хлопчатника весеннего и осеннего посева (I - выделение) в фазе бутонизации растений видно, что выделенные осенью мультиферментные комплексы имели более высокие величины всех ферментативных активностей.

       Выделенный осенью из листьев хлопчатника сорта 108-Ф мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил аналогичный мультиферментный комплекс, выделенный весной, по рибозофосфатизомеразной активности – на 13%, по фосфорибулокиназной активности - на 11%, а по РБФ-карбоксилазной активности  - на 80%. У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного осенью, в сравнении с аналогичным комплексом, выделенная весной, рибозофосфатизомеразная активность была выше на 13%, фосфорибулокиназная активность – на 12%, РБФ-карбоксилазная – в 2.2 раза.

       Выделенный осенью из листьев мутанта Дуплекс мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил аналогичный мультиферментный комплекс, выделенный весной, по рибозофосфатизомеразной активности – на 25%, по фосфорибулокиназной активности  - на 10%, а по РБФ-карбоксилазной активности  - на 42%. У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного осенью, в сравнении с мультиферментным комплексом, выделенным весной, рибозофосфатизомеразная активность была выше на 29%, фосфорибулокиназная активность – на 24%, РБФ-карбоксилазная – в 2.0 раза.

В табл. 10 представлены результаты определения ферментативных активностей мультиферментных комплексов, выделенных через 2 недели после I-го выделения из листьев  хлопчатника сорта 108-Ф и мутанта Дуплекс осеннего посева, в фазе бутонизации растений.

Из представленных в табл. 10 данных видно, что в сравнении с первым выделением мультиферментных комплексов при втором выделении температура воздуха, снизилась на 8-9С, освещённость также была ниже, погода была пасмурной. При этих условиях был выделен мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД и мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400 кД.

Таблица 10

Ферментативная активность мультиферментных комплексов (МФК) с различными величинами молекулярных масс,  выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф  и мутанта Дуплекс в фазе бутонизации растений (осенний посев, август 1989г.).

Мол.масса

кД

Дата

выде

ления

МФК

Температура

С

Тип

активности

  Субстрат

Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка

День

Ночь

108-Ф

Дуплекс

520

480

24-26 октяб- ря

15-20

8-12

Рибозофос

фатизо

меразная

Рибозо-5-

Фосфат

3456±36

2924±31

3990±30

3711±39

520

480

Пасмурно

Фосфорибу

локиназная

Рибозо-5-

Фосфат

3470±37

2961±32

4425±48

3788±39

520

480

РБФ-карбоксилазная

Рибулозо-

1,5-бисфосфат

2.21±0.05

1.64±0.05

2.58±0.05

2.04±0.05

Из представленных в табл. 10 данных видно, что выделенные из листьев обоих объектов мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 кД превосходили мультиферментные комплексы с молекулярной массой 400 кД по величинам рибозофосфатизомеразной, фосфорибулокиназной и РБФ-карбоксилазной активности.

У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД, выделенного из листьев мутанта Дуплекс, в сравнении с аналогичным комплексом, выделенным из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, величина рибозофосфатизомеразной активности была выше на 15%, фосфорибулокиназной  на 27%, РБФ-карбоксилазной на 11%

Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400 кД листьев мутанта Дуплекс превосходил аналогичный комплекс листьев хлопчатника сорта 108-Ф по рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности на 27%, а по РБФ-карбоксилазной на 24%.

При сравнении величин ферментативных активностей мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс при I-ом и II-ом выделении видно снижение величин их активности, особенно у обнаруженного при II-ом выделении мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400 кД, но все величины ферментативных активностей  были выше, чем у мультиферментных комплексов выделенных из растений весеннего посева.

При всех условиях роста и развития растений у мультиферментных комплексов, выделенных из листьев мутанта Дуплекс, величины всех ферментативных активностей были значительно выше, чем у мультиферментных комплексов, выделенных из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф. В работе (Бабаджанова, Мирзорахимов, Алиев,. 1990; Мирзорахимов, 1992) установлено, что РБФК/О мутанта обладает большим сродством к субстратам, т.е. имеет меньшие значения величин константы Михаэлиса Км  табл.11.

Таблица 11.

Величины Км(каж)s 0,5 для обоих субстратов РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс.

О б ъ е к т

С у б с т р а т ы

РБФ, Км(s 0,5)х10-4м

NaH14CO3

Км(s 0,5)х10-5м

Хлопчатник, сорт 108-Ф

0.89±0.01

1.75± 0.01

мутант Дуплекс

0.38±0.01

0.95± 0.05

Из представленных в табл. 11 данных видно, что в сравнении с исходным сортом хлопчатника РБФ-карбоксилаза мутанта Дуплекс имеет меньшую величину  константа Михаэлиса для рибулозо-1.5-бисфосфата и NaH14CO3,  что свидетельствует об увеличении сродства с субстратом фермента листьев мутанта.

6.3. Активность мультиферментных комплексов, выделенных из листьев гороха в фазе вегетации, выращенных при пониженных температурах и освещённости.

Поскольку растения гороха являются классическим объектом биохимических исследований, то представлялось важным изучить влияние пониженных температур и освещённости на образование и функциональные свойства мультиферментных комплексов. В связи с этим горох был  высеян в почву (месяц - февраль) в лабораторных условиях. При зимнем посеве из листьев двухнедельных проростков гороха были выделены после ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе  линейным градиентом концентраций NaCl три мультиферментных комплекса с молекулярной массой 520, 480 и 400 кД. В табл. 12 приведены результаты определения величин активностей этих мультиферментных комплексов.

Таблица 12

Активность мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев двухнедельных проростков гороха сорта Крепыш при  зимнем выращивании растений (февраль).

Ферментативная активность

Молекулярная масса

Субстрат

Активность, мкмоль продукта/ мин. на 1мг белка

Рибозофосфат-

изомеразная

520

480

400

рибозо-5-фосфат

2870±30

2742±28

2716±28

Фосфорибуло-

киназная

520

480

400

рибулозо-5-фосфат

1863±19

1560±16

1450±15

РБФ-карбоксилазная

520

480

400

РБФ

1.06±0.05

0.75±0.05

0.66±0.05

Из представленных в табл. 12 данных видно, что мультиферментные комплексы не различались между собой по величинам рибозофосфатизомеразной активности.

       По фосфорибулокиназной активности мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил мультиферментный комплекс с молекулярной массой  480 и 400 кД на 80-78% соответственно.

       Наибольшие различия  мультиферментные комплексы имели по величине рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазной активности. У  мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД  РБФ-карбоксилазная активность была выше активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400 кД – на 38%. Из представленных результатов видно, что чем меньше величина молекулярной массы, тем ниже их РБФ-карбоксилазная активность. 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

       Результаты многолетних исследований позволяют заключить, что образующиеся на разных фазах развития растений свободные мультиферментные комплексы цикла Кальвина с различной молекулярной массой и каталитической активностью обеспечивают онтогенетические особенности изменений интенсивности фотосинтеза, связанные с необходимостью удовлетворения возрастающей потребности эпигенетических процессов в ассимилятах.

Полученные нами результаты подтверждают данные об онтогенетических изменениях интенсивности фотосинтеза и  количества образующегося продукта реакции карбоксилирования ФГК у хлопчатника (Якубова, Юлдашев, 1983; Якубова, 1984; Юлдашев, 1996). Образование различных типов мультиферментных комплексов цикла Кальвина  вызвано необходимостью увеличения фотосинтетической фиксации СО2 в период формирования репродуктивных органов и их созревания, так как активность ферментов фосфорибулокиназы и РБФ-карбоксилазы/оксигеназы, встроенных в мультиферментные комплексы, значительно выше, чем у свободных форм ферментов. Это обусловлено действием в мультиферментных комплексах особых регуляторных механизмов – «направленного или туннельного переноса метаболитов», координированной регуляции одними и теми же эффекторами и диссоциативного механизма регуляции.

Использование сравнительного подхода при изучении активности ферментов цикла Кальвина фазы карбоксилирования у исходных форм растений хлопчатника и арабидопсиса и их мутантов с низкой и высокой интенсивностью фотосинтеза и продуктивностью позволило выявить независимо от генотипа растения специфические физиолого-биохимические особенности, характерные для высокопродуктивных мутантов. Высокопродуктивные мутанты хлопчатника и арабидопсиса отличались от низкопродуктивных форм более высоким содержанием мультиферментных комплексов и их большей каталитической активностью.

Результаты наших исследований подтверждают данные, полученные in vivo при комплексных исследованиях листьев хлопчатника, что генотипическое разнообразие и онтогенетическая динамика фотосинтетической фиксации листа обусловлена, главным образом, концентрационными изменениями в единице листовой поверхности активного фермент – субстратного комплекса, осуществляющего первичную фиксацию СО2 (Расулов, 1994; Каспарова, 2006).

Полученные данные свидетельствуют о том, что возрастание активности ферментов фазы карбоксилирования является необходимым условием для повышения фотосинтетической фиксации растения наряду со многими другими факторами. К таким факторам относятся, прежде всего, морфофизиологические особенности растений, например, форма листьев и такое расположение их  на стебле, которое способствовало бы лучшему радиационному режиму в посеве и повышению интенсивности фотосинтеза; близость плодовых органов к донорным, что оптимизировало бы донорно-акцепторные отношения и т.д.

Важным условием для нормального протекания продукционного процесса является устойчивость растений к постоянно изменяющимся факторам внешней среды. Поэтому нами была предпринята попытка моделирования изменений факторов внешней среды не в искусственной камере, как это было сделано А. Абдуллаевым (1991; 1994), а в «естественной» лаборатории при осеннем посеве (август) хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. В период выращивания растений хлопчатника с августа по ноябрь происходило постепенное снижение температуры воздуха и освещённости причём величины температуры воздуха были физиологически благоприятными, для С3 - вида растения.

Величины РБФ-карбоксилазной активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина, выделенных в начале июля (фаза бутонизации), когда была высокая освещённость, а температура воздуха днём в тени достигала 30-36С, были значительно ниже величин РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов, выделенных в начале октября, когда освещённость была ниже, а температура воздуха днём в тени достигала 24-29С. Аналогичные результаты были получены в искусственной камере (Магомедов и др., 1991.; Абдуллаев , 1994), где растения хлопчатника выращивали  при температурах 25 и 35С комбинируя  низкую и высокую освещённость. Длительное охлаждение растений (от нескольких суток до месяцев) при неповреждающей температуре, сопряжённое, как правило, с ростом их холодоустойчивости, приводит к существенным изменениям активности рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназы (Филимонов, 1984). У целого ряда объектов с различными путями ассимиляции углерода, адаптации к холоду сопровождалось ускорением карбоксилирования РБФ. Подобная закономерность показала и для растений хлопчатника (Downton, Statyer, 1972).

В работе А. Эргашева (1997) также установлено, что температуры выше 37 С в сочетании с воздушной засухой в период от начала бутонизации до массового формирования коробочек приводили к существенным сдвигам физиолого-биохимических процессов: снижалось содержание водорастворимых белков, хлорофилла, аскорбиновой кислоты, интенсивность фотосинтеза, сухого вещества, при этом одновременно повышалась интенсивность темнового дыхания и активность каталазы. 

Важнейшим типом приспособительных реакций организма к изменяющимся температурным условиям являются изменения каталитических свойств ферментов в результате модификаций их молекул.

В результате индукции стрессовых генов при адаптации растений к температурному сдвигу могут появиться новые разновидности ферментов с кинетическими свойствами, отвечающими новым температурным условиям. Они могут появиться даже тогда, когда температура среды колеблется в пределах всего лишь 8-6С.

Снижение освещённости и температуры воздуха днём до 15-20С приводило к появлению новой разновидности мультиферментного комплекса, что является, по всей вероятности, одной из защитно-приспособительных реакций хлоропласта.

При всех вариантах варьирования факторов внешней среды (температуры и освещённости) величины ферментативных активностей мультиферментных комплексов цикла Кальвина, выделенных из листьев мутанта Дуплекс были всегда значительно выше величин активности мультиферментных комплексов, выделенных из листьев исходного сорта 108-Ф. Следовательно, стабильность при различных условиях отличий мутанта Дуплекс от исходного сорта 108-Ф по содержанию мультиферментных комплексов и их каталитической активности свидетельствует об устойчивости его фотосинтетического аппарата к воздействию таких постоянно изменяющихся факторов внешней среды как температура и освещённость.

Результаты наших исследований согласуются с данными, полученными К.А.Алиевым и Ш.А.Эсаналиевой (2010) при изучении у четырёх генотипов хлопчатника влияния пониженных температур и освещённости на РБФ-карбоксилазную активность свободных мультиферментных комплексов. У продуктивных инбредных линий хлопчатника Л-461 и Л-601мультиферментные комплексы цикла Кальвина оказались более устойчивыми к продолжительному действию положительных пониженных температур и освещённости, компенсируя их влияние на скорость реакций мультиферментного комплекса двумя путями – снижением каталитической активности ферментов в пределах физиологической нормы и увеличением содержания ферментов в единице площади листа.

Познание регуляторных механизмов адаптации растений к изменяющимся факторам внешней среды имеет важное значение для управления продукционным процессом. Фотосинтез не только обеспечивает строительным материалом и энергией процессы роста, но и генерирует вещества гормональной и ингибиторной природы, которые сами являются регуляторами дифференциальной активности генов, т.е. фотосинтез участвует в реализации генетической программы развития и, следовательно, активно воздействует на процессы эпигенеза. Таким образом происходит интеграция фотосинтеза и роста (Мокроносов, 1981; 1981а; Кефели, 1992; Кузнецов, Дмитриева, 2006; Алёхина, Балнокин и др., 2007; Якубова, 2011).

Совокупность литературных данных и полученных нами результатов экспериментальных исследований позволяет заключить, что в селекционной работе на высокую продуктивность растений необходимо сочетать генетико-селекционное совершенствование различных функциональных систем хлоропласта методами направленной мутационной селекции с традиционными методами селекции на улучшение морфофизиологических особенностей растения, оптимизации донорно-акцепторных отношений и повышение устойчивости (приспособляемости) к различным факторам внешней среды и т.д.

ВЫВОДЫ

  1. Подобраны оптимальные условия выделения электрофоретически гомогенных препаратов свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина из листьев хлопчатника и арабидопсиса позволяющие сохранить на достаточно высоком уровне ферментативную активность.
  2. Обнаружено, что в зависимости  от возраста  растений хлопчатника изменяется спектр (набор) мультиферментных комплексов: в фазе 5-6 настоящих листьев был выделен один мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520±20 кД, а в фазах бутонизации  и цветения растений - два с молекулярной массой 520 и 480±15 кД.
  3. Установлено, что мультиферментные комплексы проявляли наибольшие величины ферментативных активностей, в фазах формирования репродуктивных органов – бутонизации и цветения. Для этих же фаз развития растений характерны наибольшие величины интенсивности фотосинтеза, Это указывает на то, что возрастание интенсивности фотосинтеза в эти фазы, наряду с другими факторами, обеспечивается увеличением ферментативных активностей различных типов мультиферментных комплексов цикла Кальвина.

Раскрыты механизмы регуляции активности мультиферментных комплексов в зависимости от морфофизиологического состояния растений. Показано, что активизация метаболизма, необходимая при переходе растения с фазы вегетации к репродуктивной фазе развития осуществляется благодаря вступлению в действие следующих биохимических механизмов регуляции: 1- образования нового типа мультиферментных комплексов; 2-диссоциативного механизма регуляции активности фосфорибулокиназы  и рибулоза-1.5-бисфосфаткарбоксилазы в мультиферментных комплексах.

  1. Образование на различных фазах развития растений мультиферментных комплексов цикла Кальвина с различными величинами молекулярных масс и ферментативных активностей, по всей вероятности находится под генетическим контролем, регулируется дифференциальной экспрессией генов и обусловлено  необходимостью обеспечения эпигенетических процессов  большим количеством ассимилятов в период формирования репродуктивных органов.
  2. Показано, что независимо от величины молекулярной массы и возраста растений величина активностей фосфорибулокиназы и рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у обоих мультиферментных комплексов при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата+АТФ были значительно выше, чем в присутствии собственных специфических субстратов: рибулозо-5-фосфата + АТФ для фосфорибулокиназы и рибулозо-1,5-бисфосфата для рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилазы/  оксигеназы. Меньшая скорость протекания фосфорибулокиназной и РБФ-карбоксилазной реакций при использовании собственных специфических субстратов в сравнении с суммарной реакцией при добавлении рибозо-5-фосфата – первого субстрата метаболической цепи из пяти ферментов, свидетельствует о «каналировании» интермедиатов без выхода их за приделы микрокорпартмента мультиферментного комплекса Выявлены важнейшие механизмы регуляции активности ферментов в мультиферментных комплексах цикла Кальвина: «направленный» перенос метаболитов (интермедиатов), координированная и диссоциативная регуляция. Эти механизмы обеспечивают более высокую каталитическую эффективность ферментов, встроенных в мультиферментные комплексы в сравнении со свободными формами этих ферментов.
  3. Установлено, что для различных генотипов хлопчатника, арабидопсиса и гороха - растений относящихся к разным семействам, спектр (набор) свободных мультиферментных комплексов одинаков. Имеющиеся в литературе данные и полученные нами результаты дают основание полагать, что свободные мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520±20кД и 480±15кД являются, по-видимому универсальными и  характерными для всех видов высших растений.
  4. Показано, что у трёх генотипов хлопчатника  и трёх генотипов арабидопсиса продуктивные мутанты превосходили исходные формы по содержанию и количеству водорастворимых белков в экстрактах из листьев, количеству электрофоретически гомогенных мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520±20кД и 480±15кД, и по их ферментативной активности. Следовательно у мутантов произошло возрастание биосинтеза белков, в том числе белков – ферментов, а так же на модификационные изменения молекул ферментов, обусловивших повышение их каталитической активности. Об этом свидетельствует изменения кинетических параметров РБФК/О мутанта – возрастание максимальной скорости реакции Vmax и сродства фермента к обоим субстрат, т.е.  уменьшение величин константа Михаэлиса Км. Таким образом, повышение продуктивности мутантов обусловлено наряду с другими факторами (форма куста, расположение листьев на нём, возрастание синтеза АТФ и НАД⋅Н, улучшение донорно-акцепторных отношений и т.д.) состоянием ферментативной системы цикла Кальвина.
  5. Обнаружено, что при выращивании растений хлопчатника в естественных условиях при пониженных, но благоприятных физиологических температурах воздуха (днём в тени 24-30С, ночью 16-21 С) набор (спектр) мультиферментных комплексов в фазе бутонизации растений не изменился, но возросли содержание и ферментативные активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина.

Установлено, что при дальнейшем понижении освещённости и температуры воздуха на 8-9С (днём в тени  15-200С, ночью 8-120С) в листьях хлопчатника наряду с мультиферментным комплексом с молекулярной массой 520±20кД обнаружен свободный  мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400±10кД. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400кД был обнаружен и  в листьях гороха при зимнем (февраль) выращивании растений. Обнаружение в листьях хлопчатника и гороха, относящихся к различным генотипам, мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400кД даёт основание считать, что появление этого  нового типа мультиферментного комплекса связано по всей вероятности, с адаптацией растений к пониженным температурам и освещённости.

При понижении освещённости и температуры воздуха из листьев хлопчатника выделены два мультиферментных комплекса, а из листьев гороха – три. Это свидетельствует о специфическом для каждого вида растения ответе на изменившиеся условия внешней среды.

  1. Выявлено, что обеспечение необходимой метаболической активности организма при перестройке его функциональной деятельности  в различном возрасте и при усилении действия различных факторов окружающей среды осуществляется с помощью трёх основных биохимических механизмов: синтеза новых типов мультиферментных комплексов цикла Кальвина, изменения количеств или концентраций уже имевшихся различных типов мультиферментных комплексов и адаптивной регуляции каталитической активности этих мультиферментных комплексов.
  2. Предложена схема механизмов регуляции активности ферментов цикла Кальвина  и их мультиферментных комплексов при адаптации фотосинтетического аппарата растений к постоянно изменяющимся температуре воздуха  и освещённости (рис. 12) с учётом литературных данных и собственных результатов.

 

 

       

Рис. 12.  Механизмы адаптация активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина к изменяющимся

температуре и освещённости.

Список работ опубликованных по теме диссертации

  1. Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К., Алиев К.А. Некоторые кинетические свойства рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. // Докл. АН ТаджССР, 1990, т.33, №2, с. 129-132.
  2. Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Влияние температуры и рН на активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О) на листья хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс: Тезисы докладов Y-и Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. – Ташкент, 1991, с. 203.
  3. Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.П., Бабаджанова М.А., Лебедева Г.П., Множественные молекулярные формы рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О) из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. // Труды конференции молодых учёных «Проблемы биологии и химии в Таджикистане».- Душанбе, 1991, с. 23.
  4. Мирзорахимов А.К., Рубцова Т.В., Фархади З.Н., Бабаджанова М.А., Алиев К.А. Карбоксилазная активность и полипептидный состав РБФ-карбоксилазы в связи с продуктивностью растений.// Докл. АН ТаджССР, 1991, т.12, №2, с. 129-132.
  5. Мирзорахимов А.К. Сравнительная характеристика РБФ-карбоксилазы различных по продуктивности форм хлопчатника. Множественные молекулярные формы фермента: Автореф.дис. кан. биол.наук. – Душанбе, 1992, 22 с.
  6. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Лебедева Г.П., Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Проявление рибулозобисфосфаткарбоксилазой-

оксигеназой других ферментативных активностей. //Апрельская научно-теоретическая конференция профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного национального университета: Тезисы докладов - Душанбе, 1993, с.78.

  1. Бабаджанова М.А., Лебедева Г.П., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Бакаева Н.П. Функциональный мультиферментный  комплекс цикла Кальвина. // 1-ая Конференция биохимиков Таджикистана: Тез.докл. - Душанбе, 1993, с.78.
  2. Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Бакаева Н.П., Лебедева Г.П. Множественные молекулярные формы рибулозобисфосфат- карбоксилазы из  листьев хлопчатника. // Докл. АН ТаджССР.- 1993б, т.3, №3, с. 230-233.
  3. Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Бакаева Н.П. Изучение активности РФИ, ФРК и РБФК/О хлопчатника при различных условиях хранения препаратов. //Труды Апрельской научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного  национального университета: Тезисы докладов - Душанбе, 1994, с.76.
  4. Бакаева Н.П., Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Определение  ионизирующихся групп активных центров фосфорибулокиназы и рибулозобисфосфаткарбоксилазы хлопчатника.//Труды Апрельской научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного  национального университета: Тезисы докладов.- Душанбе, 1994, с.74-77.
  5. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Мирзорахимов А.К. Определение  ионизирующихся групп активных центров фосфорибулокиназы и рибулозобисфосфаткарбоксилазы хлопчатника.// Наука в ТГНУ, Душанбе, Сино, 1994, Вып.17, с. 74-76.
  6. Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.П., Бабаджанова М.П. Исследование условий для проявления высокой активности ферментов РФИ, ФРК и РБФК хлопчатника сорта 108-Ф// Труды Апрельской научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного  национального университета: Тезисы докладов.- Душанбе, 1994, с.77.
  7. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Мирзорахимов А.К. Тест-системы на  высокую продуктивность фотосинтетического аппарата.// Фотосинтез, продукционный процесс и регуляция плодообразования у хлопчатника. - Душанбе, ТГНУ, 1996, с.  7-8.
  8. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Бакаева Н.П. Динамические мультиферментные ассоциации цикла Кальвина. // Труды 11-ой научной конференции биохимического общества Республики Таджикистан - «Проблемы биохимии». - Душанбе, ТГНУ, 1996, с.10-12.
  9. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.П. Молекулярные формы рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы из листьев гороха сорта «Крепыш». // Труды кафедры физиология человека и животных Таджикского государственного национального университета. «Морфологические и физиологические основы адаптации организма».- Душанбе, 1997, с. 32-33.
  10. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К. Молекулярные формы рибулозобисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы из листьев различающихся по продуктивности форм арабидопсиса. // Труды Республиканской конференции посвящённое 50-летию Таджикского национального университета. - Душанбе, 1998, с. 7-8.
  11. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Бакаева Н.П. Динамические мультиферментные комплексы цикла Кальвина: Тезис докладов Международной конференции «Физиология растений - наука III-го тысячелетия». - Москва, 1999, т.1, с.  20-21.
  12. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П. Ферментативные активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина из листьев гороха.// Вестник. ТГНУ. - Душанбе, 2004, №3, с.  27-31.
  13. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Нарзуллоев М.С. Определение молекулярной массы мультиферментного комплекса РФБК/О из листьев хлопчатника. // Материалы научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава и студентов посвящённые «15-й годовщине  Республики Таджикистан», «2700-летию города Куляба» и «Году арийской цивилизации». Душанбе, 2006, т.1, с. 104.
  14. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Нарзуллоев М.С. Влияние кинетина на активность фосфорибулокиназы в экстрактах из листьев хлопчатника. // Докл. АН РТ. - Душанбе, 2007,  т. 50, №4, с. 382-385.
  15. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Влияние кинетина на активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы в ферментативных препаратах  различной степени очистки. // Докл. АН РТ. - Душанбе, 2007,  т. 50, № 8, с.711-715.
  16. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Эсаналиева Ш.А. Активность мультиферментных комплексов цикла Кальвина листьев различающихся по продуктивности форм хлопчатника. // Докл. АН РТ. - Душанбе, 2007,  т. 50, № 9, с. 789-801.
  17. Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.А., Нарзуллоев М.С. Выделение и отчистка мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его высокопродуктивной линии Л-461. // Материалы научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава и студентов посвящённые «800-летию поэта, великого мыслителя М.Д.Балхи» и «16-й годовщине Независимости Республики Таджикистан». - Душанбе, 2007, ч.1, с. 122-123.
  18. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Эсаналиева Ш.А. Образование различных мультиферментных комплексов в онтогенезе растений хлопчатника.// Достижения современной физиологии растений: теоретические и практические аспекты. Материалы  научной конференции, посвящённой памяти академика АН РТ Ю.С. Насырова: Тезисы докладов – Душанбе, 2008, с.15-17.
  19. Бабаджанова М.А., Эсаналиева Ш.А.,  Мирзорахимов А.К  Влияние кинетина на активность мультиферментного комплекса цикла Бенсона –Кальвина в экстрактах из листьев хлопчатника.// Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане. Материалы  Международной конференции, посвящённой 35-летию кафедры биохимии Таджикского национального университета: Тезисы докладов – Душанбе, 2009,с. 31-33.
  20. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П.,  Эсаналиева Ш., Алиев К.А. Выделение свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина в онтогенезе растений хлопчатника. // Докл. АН РТ, 2009, т.52, №2, с. 150-157.
  21. Babajanova M.A., Mirzorakhimov A.K., Babajanova M.P., Esanalieva Sh.A.. Development pattern in the formation of various myltienzyme complex associated with Benson-Kalvin cycle in cotton leaves. // Rus.Plant Physiol. 2010, т.57, №2, р.175-180.
  22. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Эсаналиева Ш. Онтогенетическая  зависимость образования различных мультиферментных комплексов цикла Бенсона-Кальвина. // Физиология растений, 2010, т.57, № 2, с. 186-191.
  23. Мирзорахимов А.К. Зависимость от внешних факторов ферментативных активностей свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина в листьях исходной и мутантной форм хлопчатника.//«Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане». Материалы республиканской конференции: Тезисы докладов – Душанбе, 2011,с. 38-40.
  24. Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.А., Эсаналиева Ш.А., Нарзуллаев М.С., Сайфутдинов А.К., Нематова К.Н. Онтогенетическая зависимость активирующего влияния кинетина на ферментативные активности свободного мультиферментного комплекса цикла Кальвина в листьях хлопчатника.// «Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане». Материалы республиканской конференции: Тезисы докладов – Душанбе, 2011,с. 48-50.
  25. Мирзорахимов А.К. Активность мультиферментных комплексов цикла Кальвина, листьев исходной и мутантной форм хлопчатника.//Докл.АН РТ,  Душанбе, 2011, т.54 №7, с. 614-617.
  26. Мирзорахимов А.К. Регуляция фотосинтеза и активности ферментов цикла Каливина.  Изд-во Контраст, Душанбе, 2011 г., 48с.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.