WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

АНТОНОВА ЕЛЕНА ИВАНОВНА

Реактивность и пластичность тканевых компонентов печени в сравнительном ряду позвоночных в норме и после гипертермии

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Астрахань - 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО Омский государственный педагогический университет

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор  Мкртчан Офелия Завеновна

доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор  Ерофеева Людмила Михайловна

доктор медицинских наук, профессор Молдавская Анна Аркадьевна

доктор биологических наук, профессор  Правоторов Георгий Васильевич

Ведущая организация:

Институт проблем экологии и эволюции имени А. Н. Северцова РАН, Москва

Защита диссертации состоится  «18» декабря 2009 года в 1000 часов

на заседании Диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1 Естественный институт АГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

Автореферат  разослан «______»  __________________  2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук, доцент  Ю.В. Нестеров



Актуальность исследования

Изучение закономерностей становления в эволюции реактивности и пластичности функционально-аналогичных тканей с позиции теории параллелизма - фундаментальная задача современной биологии (J. C. Venter, 2001; J. B. Pritchard, 2002; H. Scholz, 2002).

В эволюции различных видов температура является одним из факторов, который обеспечивает развитие, рост, пролиферацию, функционирование и гибель клеток в системе целостного организма у экто- и эндотермных животных с различным содержанием ДНК (В. Г. Шахбазов, 2001; М. М. Калашникова, 2006; D. L. Bayne, 2004; A. E. Vinogradov, 2005; P. J. Verschure, 2005; M. Michelle, 2005; T. Ryan, 2005; M. Kelly, 2006; S. Harpreet, 2006; J. Frampton, 2006). Особенно актуальным становится изучение этого вопроса в свете глобального потепления климата (Всемирная метеорологическая организация, 2003; Изменения климата ..., 2002; Конвенция ООН об изменении климата, 2002). В свою очередь, изучение влияния гипертермии на биологические системы имеет адекватную как физиологическую (климато-географическая миграция, условия высокотемпературных технологий), так и клиническую актуальность (Н. В. Зеленина, 2002; М. А. Пальцев, 2004; S. C. Chen, 2001; A. V. Souvernev, 2001; H. Talbot, 2001; M. Muraca, 2002). При этом особое значение приобретает состояние органов, непосредственно участвующих в поддержании гомеостаза организма. Одним из таких органов является печень. Сложность структуры, полифункциональность, быстрота вовлечения печени в деструктивные и репаративные процессы - все это определяет неослабевающий интерес исследователей к проблемам ее регенерации: источники, масштабы, механизмы. Высокая интенсивность метаболических процессов у эндотермных животных, становление у них новых механизмов устойчивости к стрессу способствовали усложнению и совершенствованию морфологии печени, которая, по сути, является «периферическим интегратором метаболизма». Вместе с тем, многие реактивные и пластические аспекты выхода её из шоковых ситуаций эндо- и экзогенной природы даже у млекопитающих изучены недостаточно. Отрывочны сведения об экспериментальном изучении влияния гипертермии на организм других видов экто- и эндотермных позвоночных (М. М. Калашникова, 2000, 2001, 2006; Е. И. Яковлева, 2003; P. P. Warren, 2000; A. N. Rice, 2006). Это не позволяет в полной мере проанализировать закономерности эволюционного направления в развитии срочно реализуемых общих и частных структурных реорганизаций, модификаций активности ферментов печени в процессе развития реактивных и пластических реакций.

В рамках этой фундаментальной проблемы особый интерес вызывает исследование повреждения и восстановления печени в различных моделях гипертермии. Для детального анализа деструктивных и репаративных последствий, а также способов восстановления полноценной структуры и функций печени после экстремальной тепловой нагрузки представлялось целесообразным сравнительное морфофункциональное исследование этого органа у двух классов теплокровных животных — млекопитающих и птиц, у которых терморегуляция складывалась в ходе эволюции самостоятельно.

Недостаточно работ, посвященных анализу становления в эволюции таких количественных и качественных показателей, как стромально-паренхимные соотношения клеток печени и пролиферативно-репликативные соотношения гепатоцитов, пути клеточной гибели и особенности клеточного цикла гепатоцитов в сравнительном ряду позвоночных. Спектр этих вопросов практически не изучен с позиций временнй адекватности, степени выраженности, распространенности в пределах печеночного ацинуса как в норме, так и после воздействия гипертермии в сравнительном ряду позвоночных (В.П. Скулачев, 2001; Д. Н. Маянский, 2002; Е. В. Малышева, 2007; М. Leist, et al., 2001; В. Levine, 2004; M. Artal-Sanz, 2005; Y. P. Yang, 2005; A. Kelekar, 2006, S. A. Lakhani, 2006; C. Indiani, 2006).

Не в полной мере в сравнительном ряду изучена и систематизирована динамика биохимических маркеров пролиферации, путей клеточной гибели, взаимосвязи митохондриальных и цитоплазматических оксидоредуктаз. Не определены направления регуляции активности оксидоредуктаз в системе in vivo, в сравнении с in vitro. Отсутствуют схемы развития метаболических компенсаций в свете сопряженности метаболических процессов биоэнергетической системы позвоночных в модели in vivo и in vitro (Н. О. Бабич, 2000; М. Ю. Еропкин, 2000; С. Я. Проскуряков, 2002; М. В. Левенкова, 2004; Г. В. Ганусова, 2005; Н. С. Зыкина, 2007; S. Filosa, 2003; F. Gao, 2004; M. Camici, 2006). Отсутствуют работы, посвященные анализу реактивности и пластичности печени после действия гипертермии в прямом (система in vitro) и опосредованном (система in vivo) режиме (Животная клетка в культуре, 2000; Е. А. Завьялова, 2006; O.S. Bains, 2004; L. Sez, 2005).

В силу известной полифункциональности печени особую трудность в исследовании представляет классификация наблюдаемых после теплового удара явлений раннего периода активации регенерации, а также зависимости путей гибели клеток паренхимы и принципов их восстановления. Для того чтобы обнаружить и выделить структуры печени и специфические механизмы «противостояния» тепловому стрессу, необходимо изучение последствий общего перегревания также и в ряду эктотермных позвоночных животных — рыб, амфибий и рептилий. Прямое сопоставление структурных и функциональных событий, выявляемых в печени животных разных таксонов, которые обладают разнокачественными системами терморегуляции, детоксикации и различным содержанием ДНК, дало возможность значительно дополнить существующие представления о реактивности и пластичности печени в сравнительном ряду позвоночных.

Все вышеперечисленное определило проблему настоящего исследования, проводимого по федеральному плану (№ гос. регистрации 01 9 10 011014).

Цель работы – выявить гисто-энзиматические закономерности проявления реактивности и пластичности печени на кратковременную гипертермию в сравнительном ряду позвоночных.

Задачи исследования:

  1. Изучить функциональную морфологию печеночного ацинуса, стромально-паренхимные соотношения клеток печени в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии.
  2. Выявить показатели биологии гепатоцитов (ультраструктура, клеточный цикл, пути гибели) в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии.
  3. Исследовать источники физиологической и репаративной регенерации гепатоцитов на клеточном и субклеточном уровне в норме и после острой гипертермии.
  4. Изучить биохимические проявления реактивных и пластических реакций печени (оксидоредуктазы митохондриальной и цитозольной фракции, маркеры путей гибели и пролиферации гепатоцитов) в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии.
  5. Проанализировать особенности биологии гепатоцитов in vitro в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии (ультраструктура, пути гибели), выделить спектр метаболических изменений гепатоцитов в показателях энергетического и пластического обмена, вызванных прямым действием гипертермии, от событий, обусловленных изменениями во внутриорганных взаимодействиях в условиях стресса в системе in vivo.

Научная новизна работы

Впервые в сравнительном ряду позвоночных животных с различной системой терморегуляции установлена видовая специфичность функциональной морфологии печеночного ацинуса, реактивность и пластичность печени на органном, межтканевом, межклеточном, клеточном, субклеточном и биохимическом (молекулярном) уровне после кратковременного действия гипертермии.

Выявлены видовые общие и частные закономерности и клеточные особенности реакции сосудисто-тканевых компонентов печеночного ацинуса, особенности в динамике соотношения количества гепатоцитов и стромальных клеток печени через час после действия гипертермии в сравнительном ряду позвоночных.

Результаты исследования расширяют представления о механизмах, способах и масштабах регенерации печени как показателях пластичности органа, сформированного у изучаемых видов эндо- и эктотермных позвоночных. Выявлена степень выраженности реактивности и пластичности с позиции гистотопографии печени эндо- и эктотермных животных согласно эволюционно обусловленным закономерностям в ответ на действие гипертермии в моделях in vivo и in vitro.

Установлены и сопоставлены особенности клеточного цикла, соотношения путей гибели гепатоцитов, определены морфобиохимические маркеры пролиферации, путях программируемой клеточной гибели гепатоцитов, энергетического и пластического обмена в сравнительном ряду позвоночных в клеточных культурах in vitro в норме и после острой гипертермии.

Мультипараметрический принцип исследования реактивности и пластичности печени в модели in vivo и гепатоцитов в модели in vitro, в норме и после гипертермии позволили выявить в сравнительном ряду направление, в котором формировались особенности реорганизации структур печени, обеспечивающих выживание и последующие этапы репаративной регенерации в восстановительном периоде.

Теоретическая и практическая значимость

Показаны сравнительно-гистологические аспекты биологии гепатоцитов: особенности клеточных циклов, соотношения путей гибели гепатоцитов, способов репарации печени. Полученные данные расширяют представления о развитии реактивных и пластических процессов печени в зависимости от системы терморегуляции организма.

Выявлены источники восстановления эпителия печеночного ацинуса, определен диапазон реактивных и пластических структурных компонентов печени у животных с различной системой терморегуляции и различным количеством ДНК.

Показана топография реактивных и пластических изменений печеночного ацинуса в сравнительном ряду позвоночных, динамика биохимических процессов печени и гепатоцитов.

Выявлена связь реактивных изменений ультраструктуры гепатоцитов с изменениями активности внутриклеточных ферментов, особенности этих корреляций в сравнительном ряду позвоночных.

Результаты исследований представляют практический интерес для уточнения показаний к использованию гипертермии, позволяют обосновать механизмы нарушений, развивающихся в организме животных при тепловом ударе, а применение предложенных методов исследования – оценить тяжесть воздействия.

Полученные результаты могут быть использованы для научных исследований с использованием модельных систем in vivo/in vitro для выявления эволюционных механизмов реализации структурно-функциональных компенсаций и их регуляции.

Полученные нами первичные культуры гепатоцитов различных видов животных являются оптимальными модельными системами для решения таких фундаментальных и прикладных проблем, как исследование процессов пролиферации, дифференциации и межклеточных взаимодействий и предоставляют возможности для изучения управляемых модификаций метаболизма в условиях физиологической нормы и в эксперименте. Отработанная схема получения и культивирования обеспечивает возможность использования культур гепатоцитов для изучения размножения, выявления спектра чувствительности к различным вирусам в данных культурах.

Внедрение в учебный процесс.

Полученные результаты пополнили разделы общих лекционных курсов: "Цитология", "Гистология с основами эмбриологии", "Генетика", «Биология клетки», "Молекулярная биология", спецкурсов: "Частная сравнительная гистология", "Основы современной биологии и экологии", «Общая биология» - в Омском государственном педагогическом университете, Омской государственной медицинской академии, Ханты-Мансийском государственном медицинском институте, Тюменской государственной медицинской академии, Новосибирской государственной медицинской академии, Институте ветеринарной медицины ФГОУ ВПО Омского государственного аграрного университета, Московского государственного медико-стоматологического университета, Саранском государственном университете.

Внедрение в практическую деятельность. Получен номер государственной регистрации заявки на изобретение «Способы выделения гепатоцитов животных с различной системой терморегуляции (амфибии, черепахи, птицы)» Рег. № 2008132219 от 08.08.2008.

Результаты исследования внедрены в практику научно-исследовательского учебного центра Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО Омского государственного аграрного университета с 20.01.2007 года.

Первичные культуры гепатоцитов in vitro изучаемых животных нашли применение в практике Федерального государственного учреждения науки Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций, Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в качестве объекта для вирусологических исследований в рамках проводимых исследований биологических и генетических характеристик флави–, тога- и хантавирусов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В сравнительном ряду позвоночных определено становление структурно-функциональных единиц печени, а также морфометрические показатели хроматина, источники физиологической регенерации, соотношения путей гибели гепатоцитов, стромально-паренхимные соотношения клеточных типов печени, апоптоз/некрозные соотношения и ряд общих и отличительных ультраструктурных показателей гепатоцитов.

2. Однократная гипертермия в группах животных «амфибии/птицы», и «рыбы/рептилии/млекопитающие» вызывает видоспецифичные изменения морфометрических показателей сосудистого русла печеночного ацинуса, увеличение количества стромальных клеток печени с изменением их топографии в пределах ацинуса; изменения показателей клеточного цикла, состояния фракций хроматина гепатоцитов; смену источников физиологической регенерации и путей гибели гепатоцитов.

3. Ультраструктурные изменения ядра и цитоплазмы гепатоцитов носят мозаичный характер, зависят от степени биологической и функциональной зрелости, топографии в пределах ацинуса и видовой принадлежности. В зависимости от развития либо гипо-, либо гиперметаболических реакций эти изменения отражают увеличение количества двуядерных или PCNA-позитивных гепатоцитов, или обеих популяций гепатоцитов. Выявлена активация стромальных клеток печени.

4. В сравнительном ряду выявлены видоспецифичные отличия активности изучаемых оксидоредуктаз митохондрий и цитозоля, биохимических маркеров гибели гепатоцитов, содержания ионов [Са2+]i, [К+]i и [Nа+]i. Гипертермия определяет дифференцированную модификацию активности оксидоредуктаз, содержания ионов, соответственно реализацию в большей мере программы гибели гепатоцитов по пути некроз/аутофагия и реализацию реакций как гипо-, так гиперкатаболизма.

5. В клеточных культурах гепатоцитов, в сравнении с in vivo, установлены видовые различия в индексе пролиферации, направлениях гибели и показателях энергетического и пластического обмена гепатоцитов. Гипертермия приводит к ультраструктурным изменениям гепатоцитов, смене путей клеточной гибели, разнонаправленному изменению активности оксидоредуктаз, биохимических маркеров клеточной гибели, отражая развитие реакции как гипо-, так и гиперкатаболизма гепатоцитов.

Апробация результатов научных исследований

Результаты исследований обсуждены на Международной конференции орнитологов «Актуальные проблемы изучения и охраны птиц Восточной Европы и Северной Азии», Казань, 2001; Международной научно-практической конференции «VI Царскосельские чтения», С-Петербург, 2002; VI конгрессе международной Ассоциации морфологов, г. Уфа, 2002; Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии», «Современные технологии лабораторной диагностики XXI века» и Международном симпозиуме «Пиридоксальфосфат – зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина», Москва, 2002; Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», С-Петербург, 2003; Всероссийской научной гистологической конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экспериментальных и патологических условиях», посвященной памяти Ф.М. Лазаренко, Оренбург, 2003; III Региональной научной конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды, Челябинск, 2004; V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов с международным участием, г. Казань, 2004; VII Международном конгрессе ассоциации морфологов, Москва, 2004; XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004; VII Всероссийской конференции по патологии клетки, Москва, 2004; Международном научном эмбриологическом симпозиуме «Югра-Эмбрио. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных», Ханты-Мансийск, 2004; Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере», Сургут, 2004; II Международном эмбриологическом симпозиуме «Югра-Эмбрио-2006» Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных», Ханты-Мансийск, 2006; Научном совещании гистологов «Актуальные проблемы учения о тканях», С.-Петербург, 2006; V Научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Таиланд (Паттайа), 2008; Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвященной памяти член корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко, Оренбург 2008; Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» посвященной П.В. Дунаеву, Тюмень, 2008; IX Международной ассоциации морфологов и IV съезде ассоциации морфологов Узбекистана, Бухара, 2008.

Публикации. Основные положения диссертации представлены в 32 печатных работах. В изданиях, рекомендованных ВАК, - 11. Одно учебное пособие.

Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 397 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: обзор литературы, изложение материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждение полученных данных, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 187 фотографиями и схематичными рисунками, 18 таблицами. Список использованной литературы включает 768 работ, в том числе зарубежных 578 зарубежных авторов.

Выражаем благодарность профессору, д.м.н. член. кор. АНТ Киясову А.П., ст.н.с., доценту Вакулину Г.М., к.м.н. доценту Гумеровой А.А., к.б.н. Калашниковой М.М., д.в.н., профессору Плешаковой В.И., д.б.н., профессору Рябчиковой Е.И., д.м.н. Спиридонову В.К., д.м.н., профессору Семченко В.В., к.м.н Хижняк А.С, д.м.н., профессору Шурлыгиной А.В. за помощь, оказанную на всех этапах проведения исследования.

ОБЪЕКТЫ  И  МЕТОДЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ

Для решения поставленных задач по выявлению и оценки деструктивных и восстановительных процессов использованы две экспериментальные модели: in vivo и in vitro, которые включали 5 групп позвоночных животных:

1. Рыбы - вид Carassius auratus gibilio Bloch, 1782, карась серебряный (двухлетки – 2+).

2. Амфибии - вид Rana terrestris Andrzejewski, 1832 (Rana arvalis Nilsson, 1842), остромордые лягушки самцы (трехлетки).

3. Пресмыкающиеся (рептилии) - вид Pscudemia (Chrysemys scripta var. Elegans 1889, Trachemys scripta elegans) красноухие половозрелые черепахи самцы (пять лет развития).

4. Птицы - вид Columba livia (forma domestica) Gmelin, 1789, половозрелые сизые голуби самцы (6 месяцев развития).

5. Млекопитающие - вид Rattus norvegicus (var. alba) Berkcnhout, 1769, половозрелые беспородные крысы самцы (2 месяца постнатального развития).

Эксперимент перегревания поставлен на 180 животных (из них 75 служили контролем). Острого перегревания в системе in vivo эндотермных животных достигали путем пребывания животных в течение 30 минут в воздуховентилируемой камере «Chirana» при температуре 42°С. Для группы эктотермных животных перегревание проводили, в зависимости от видовых границ температурного оптимума, в водной среде при температуре 32°С для рыб и амфибий и 42°С для рептилий, в условиях свободного плавания с дополнительной аэрацией в течение 30 минут. Температурное воздействие в заданном режиме приводило к развитию теплового удара средней тяжести (G. N. Somero, 2002; A. E. McKechnie, 2004; Y.-M. Chang, 2005). Исследование модели in vitro проводилось на 30 животных, анализировалось 750 закладок клеточных культур гепатоцитов. Перегревание гепатоцитов в системе in vitro осуществляли на вторые сутки культивирования на водяной бане в течение 30 минут при температуре для культур гепатоцитов млекопитающих, птиц и рептилий 42°С, а для культур рыб и амфибий 32°С.

Методы исследования

Световая микроскопия. Образцы печени фиксировали в жидкости Карнуа, 10% - нейтральном забуференном формалине (М. А. Валовая, и др., 1993), заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином, по методу Ван-Гизон. На гистологических срезах определяли диаметр сосудов ацинуса (артериолы, венулы, желчного протока, лимфатического сосуда, синусоидов, центральной вены). Морфометрические показатели объема ядер (мкм3) и цитоплазмы (мкм3) гепатоцитов определяли в 3-х зонах ацинуса с помощью окуляр-микрометра МОВ-I-15х (объектив х40, 90), тест - сетки на 1мм2 и 0,04 мм2 (Г. Г. Автандилов, 2002). Количество живых и погибших гепатоцитов определяли в гомогенатах, окрашенных трипановым синим (107кл/мл) в камере Горяева (A. Lang, 2000).

Иммунофенотипирование клеток печени. Стромально-паренхимное соотношение клеточных типов печени, пролиферативную активность и полиплоидизацию гепатоцитов определяли с помощью выявления антител к белкам-маркерам этих клеток (М. В. Угрюмов, 1991; А. П. Киясов, 1998, 2000). Интенсивность и топографию процессов пролиферации и полиплоидизации по зонам печеночного ацинуса определяли путем подсчета на 1000 гепатоцитов количества двуядерных форм и PCNA-позитивных гепатоцитов. Парафиновые срезы окрашивали антителами к PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen; Ig – мышиные МАТ; клон РС 10; разведение 1:100; DAKO) гепатоцитов стрептавидин-биотиновым методом. Клетки Ито окрашивали антителами к десмину (Ig – МАТ; клон – десмин D 33; разведение 1:30; DAKO, DENMARK) так же стрептавидин-биотиновым методом. Антигены выявлялись после предварительной демаскировки методом HIAR (Нeat-Induced Antigen Retrieval) (S. H. Shi, et.al., 1991; R. Von Wasielewski, et.al., 1994). После инкубации с первичными антителами далее инкубировали биотинилированными вторыми антителами (Link, DAKO LSAB+Kit Peroxidase), со стрептавидином, коньюгированным с пероксидазой хрена (Streptavidin, DAKO LSAB+Kit Peroxidase). В качестве субстрата пероксидазной реакции использовали раствор аминоэтилкарбазола (АЭК) и перекиси водорода. Гистохимическая реакция определения активности эндогенной пероксидазы на парафиновых срезах проводилась с целью выявления клеток Купфера по методу МакФи (R. Moll, 1990, Д. Н. Маянский, и др., 1992, J. L. McPhie, 1979). Подсчет числа типов и пролиферирующих гепатоцитов проводился на площади в 0,04 мм2.

Цитофотометрия ДНК гепатоцитов. Методом оптико-структурного анализа (ОСА) ДНК определяли долю гепатоцитов по фазам клеточного цикла - G0, S, G2+M, гиподиплоидные. Мазки печени окрашивали по Фельгену в модификации G. Olson, в реактиве Шиффа. На препаратах определяли состояние обеих фракций хроматина: интегральную плотность, общую интегральную плотность, площадь распределения, площадь ядра, оптическую плотность, среднюю оптическую плотность, периметр, коэффициент округлости хроматина. В каждой группе у каждого животного количество ДНК было измерено в 200 ядрах (одноядерные) (Г. И. Козинец, 2002). Фотографирование и обработка препаратов проводилась на автоматизированном морфометрическом комплексе «Axioplan" («Karl Zeiss», Германия).

Флуоресцентная микроскопия. Тест «живое и мертвое» (life and dead assay) (Liu et al., 2000, Лямзаев 2007) проводили путем прижизненного окрашивания гепатоцитов ядерными красителями Hoechst 33342 (Sigma, США; р-р в концентрации 20 мкг/мл на среде МЗ в течение 15 мин) (A. Lang, 1995; J. N. Harada, 2005) и йодистым пропидием (Sigma, США; р-р в концентрации 20 мкг/мл на среде МЗ в течение 25 мин), для разделения гепатоцитов на группы, основываясь на критериях - состояние плазматической мембраны и ядра с целью выявления апоптоз/некрозного соотношения гепатоцитов (Е. О. Данченко, 1999; А. А. Чиркин, 1999; T. Patel, 1995, К. Г. Лямзаев, 2007). Использовался флуоресцентный микроскоп «Axioscope» («Karl Zeiss», Германия) с применением блока фильтров «Голубая» при длине волны 500-550 и 600-700. Проводился подсчет фрагментированных ядер в расчете на 300 клеток.

Культивирование гепатоцитов in vitro. Гепатоциты выделяли методом двойной перфузии печени раствором коллагеназы (P. Rijnties, 1986). Выделение гепатоцитов проводили согласно запатентованным модификациям этапов выделения гепатоцитов (Рег. № 2008132219 от 08.08.2008). Гепатоциты культивировали на покровных стеклах, предварительно обработанных 0,2% раствором желатина в чашках Петри (Sigma, США). Инкубировали в среде F12, которая содержала 0,2мг/мл альбумина (Sigma, США) и 0,5мкг/мл инсулина (Sigma, США), а также 40 мкг/мл гентамицина, 10% фетальной сыворотки (PAA, Австрия), 25 ед/мл фактора LIF (Sigma, США). Воздушная среда – 5% СО2 и 95% воздуха. Культивирование проводили при температуре 37/20С. Подсчет клеток проводили с помощью теста на исключение красителя (A. Lang, 2000; H. Wendler, 2005). В эксперименте использовались суспензии с количеством жизнеспособных гепатоцитов <96% (H. Ikeda, et. al., 2003; P. L. Else, 2004, M. Busk, 2005; T. Joseph, 2006). Для морфометрических исследований через двое суток культивирования покровные стекла фиксировали в абсолютном ацетоне и хранили при 20C. Индекс пролиферации (ИП) культур определяли отношением А/Б, где А- численность клеток в культуре после окончания времени инкубации; Б – исходная численность клеток в момент посева культур. С помощью МТТ-теста - (Sigma, США) выявляли потенциальную жизнеспособность клеточных культур определяли по величине оптической плотности формазана на фотометре («MultiScan MCC340, Labsystems») при длине волны 570нм (М. Ю. Еропкин, 2000).

Электронная микроскопия. Электронномикроскопическое исследование проводилось для оценки объемной плотности (мкм/мкм/%), поверхностной плотности (мкм2 /мкм3) и численной плотности (мкм0/мкм3) митохондрий, хроматина, ГЭС, АЭС, ядрышка, липидов, лизосом, гликогена гепатоцитов. Анализировали 50 полей зрения паренхимы печени, произвольно отснятых при просмотре материала в электронном микроскопе при увеличении 3000–20000. Объемную, поверхностную и численную плотность изучаемых структур проводили на электроннограммах с использованием встроенной программы «UTHSCSA ImageTool 3.0». Количественные параметры оценивали на единицу площади (100мкм2) паренхимы печени. Образцы печени животных фиксировали в 4% растворе параформа на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5%). После фиксации материал заключали в парафин, готовили срезы толщиной 10мкм, окрашивали 0,1% толуидиновым синим. Далее образцы печени дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Просмотр и фотографирование ультратонких срезов производили на электронном микроскопе «Hitachi-600H» (Япония).

Биохимические методы. Монослой культуры гепатоцитов in vitro предварительно обрабатывали 0,1% раствором тритона Х-100, снимали со стекла раствором версена 0,2 г/л раствора Хенкса по методике Р.Адамса (1983). Митоходриальную и цитозольную фракции в обеих моделях получали методом дифференциального центрифугирования. Активность оксидоредуктаз: ИДГ-НАД (КФ 1.1.1.41), ИДГ-НАДФ (КФ 1.1.1.42), МДГ-НАД (КФ 1.1.1.37), МДГ-НАДФ (КФ 1.1.1.40), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) (КФ 1.1.1.49), а так же ЛДГ (КФ 1.1.1.27) определяли на СФ-26 при =340 нм, регистрируя оптическую плотность при изменении концентрации восстановленных форм НАД/НАДФ в нмоль субстрата/мин на мг белка (М. И. Прохорова, 1982; А. Е. Медведев, 1994; A. C. Gibb, 2002; A. M. Neyrinck, 2005). Активность каспазы-3 (CPP-32) проводили с помощью коммерческого набора «Caspase-3 Assay Kit» «Sigma» на спектрофотометре «Platr Reader Star-30 KENSTAR» в мкм/мг белка. Свободную активность кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2) определяли спектрофотометрически в цитозольной фракции по скорости гидролиза n-нитрофенилфосфата/г/мин (Merck, Германия) (R. Maciejewski, 2001). Содержание ионов определяли ионоселективным методом в цитозольной фракции с помощью прибора «EasyLyte Calcium» в 100 мкл субстрата, выражали в миллиэквивалент/литр и в ммоль/л. Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури (С. Н. Лызлова, и др., 1997).





Статистическая обработка полученного материала осуществлена с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA-5» (О. Ю. Реброва, 2002). За критический уровень значимости принимали р=0,05. Определяли статистические характеристики изучаемых параметров: средняя квадратическая, медиана, дисперсия. Выявляли критерий согласия 2 Пирсона, равенство дисперсий (Фишера-Снедекора) согласно которым определяли возможность применения параметрических и непараметрических методов анализа характера различий между независимыми выборками (критерий Манн-Уитни, Стьюдента, однородности Вилкоксона-U, Лапласа-Z, 2 Пирсона). Для выявления степени сопряженности исследуемых показателей, межвидовых различий применялся корреляционный анализ Пирсона (r), Mann-Whitney тест, многофакторный дисперсный анализ MANOVА.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

  1. Реактивность и пластичность печени на органном уровне

Печень рыб, амфибий, рептилий и птиц представляет собой железу трубчатого строения. Однако у птиц отмечается формирование коротких трабекул из гепатоцитов в два ряда, подобно млекопитающим. Пигментные клетки выявлены у всех изучаемых животных, за исключением млекопитающих. По всей видимости, у млекопитающих система детоксикации гепатоцитов более совершенна и не требует дополнительного участия пигментных клеток и меланомакрофагальных центров, как это выявлено у других групп животных. Соединительнотканная строма печени лучше (окраска Ван-Гизон) развита у млекопитающих. За счет слабо развитой стромы органа опорную функцию у рыб, амфибий и рептилий выполняют межклеточные контакты и коллагеновые волокна в пространстве Диссе.

У интактных животных внутренний диаметр резистентного звена ацинуса – артериолы больше в группе эндотермных животных. Прослеживается тенденция к увеличению диаметра артериолы от рыб к млекопитающим, с разницей между показателями более чем в два раза. Внутренний диаметр емкостного звена интактных животных – венулы, центральной вены, лимфатических сосудов различен: наибольший диаметр венулы и центральной вены выявлен у амфибий, наименьший диаметр венулы у рыб и млекопитающих, с разницей между показателями в три раза. Диаметр центральной вены группы рыбы/птицы, а так же рептилии/млекопитающие одинаков. В последней паре диаметр центральных вен больше. Разница между наибольшим и наименьшим показателем диаметра центральных вен составляет только 35%. Диаметр лимфатических сосудов так же, как и артериолы, больше у эндотермных животных с тенденцией увеличения просвета от рыб к млекопитающим. Как и у артериол, наибольший показатель диаметра лимфатических сосудов в два раза превышает наименьший. Бльший просвет желчного протока выявлен в группе рептилий и птиц. Разница между наибольшим и наименьшим показателями составляет 37% в сравнительном ряду.

У всех видов животных прослеживается порто-венулярный градиент в размерах ядер гепатоцитов, и самые крупные локализованы в области центральных вен. Объем ядер гепатоцитов интактных животных в области портального тракта и центральных вен проявляется в распределении от большего к меньшему: амфибии рыбы рептилии птицы и млекопитающие. В центролобулярной зоне распределение несколько изменяется: амфибии рептилии рыбы млекопитающие птицы. В среднем по трем зонам у амфибий объем ядер на 29% больше, чем у рыб, на 33% - чем у рептилий, на 47% - чем у млекопитающих и на 59% - чем у птиц.

После гипертермии у рыб, амфибий и рептилий выявляется значимое уменьшение диаметра артериолы. Диаметр венулы у амфибий, птиц и млекопитающих увеличивается, а у рептилий сужается. Диаметр центральной вены уменьшается у амфибий и рептилий, увеличивается у птиц. Расширение терминального звена микроциркуляторного русла обеспечивает усиление оттока крови из ацинуса, минимизируя негативный эффект гипоксии и аутоинтоксикации. Диаметр лимфатического сосуда увеличивается у рептилий, птиц и млекопитающих, сужается у рыб. Расширение лимфатического сосуда отражает интенсивный процесс транскапиллярного обмена и может быть связано с мобилизацией внеклеточной воды за счет компенсаторного перераспределения интерстициальной жидкости и с активацией уровня метаболизма, дренажно-иммунологической функцией и лимфообращения в печени, выравниванием ионного баланса между внутриклеточным и внеклеточным пространством (Ю. И. Бородин, 2000; А. А. Веренинов, 2004; И. Ю. Ищенко, 2005; А. Ю. Цибулевский, 2005). Гипертермия через час после воздействия вызывает уменьшение массы тела у рыб на 8%, у птиц - на 4% и у млекопитающих - на 14%.

Значимые изменения внутреннего диаметра желчного протока выявлены у рептилий и птиц. Но морфометрические изменения носят разнонаправленный характер: если у рептилий отмечается сужение, то у птиц, наоборот, расширение просвета. Диаметр синусоидов ацинуса проявляет зонально-дифференцированную реакцию - у рыб увеличивается просвет синусоидных капилляров только в области портального тракта, у амфибий только в области центральных вен. У рептилий увеличение просвета синусоидных капилляров затрагивает перипортальную и перивенулярную зону, у птиц область портального тракта и центролобулярной зоны.

После гипертермии у рыб в перипортальной зоне объем ядер гепатоцитов уменьшается (87,0±1,6 и 64,4±5,0*), а объем цитоплазмы увеличивается (582,0±1,2 и 1250,1±15,6*). У гепатоцитов центролобулярной зоны оба показателя увеличиваются (82,4±6,0 и 98,9±14,0*/634,2±1,8 и 799,2±18,9*), а в перивенулярной уменьшаются (157,3±4,0 и 99,4±6,0*/1211,0±2,3 и 694,3±22,3*). Средние значения объема ядер у рыб в трех зонах уменьшаются на 20%, а объем цитоплазмы напротив, увеличиваются на 54%. У амфибий уменьшается объем ядер в перивенулярной зоне ацинуса (238,8±0,3 и 177,0±0,9х), объем цитоплазмы увеличивается в перипортальной и центролобулярной, а в перивенулярной зоне уменьшается. В среднем у амфибий уменьшение объёма цитоплазмы гепатоцитов происходит на 33% (1597,3±13,2 и 1070,3±16,8х). У рептилий отмечается уменьшение объема ядер (124,6±1,5 и 91,8±2,4*) и цитоплазмы (1133,7±2,9 и 835,5±20,1*) в перивенулярной зоне и в центролобулярной (91,8±1,2 и 77,9±1,3*/835,4±5,4 и 708,2±28,5*). В среднем объем ядер и цитоплазмы уменьшается на 17%. Объем ядер гепатоцитов птиц (65,4±0,3 и 96,9±0,4*) и цитоплазмы (188,9±8,7 и 248,6±19,9*) увеличивается в области центральных вен и в области портального тракта (36,0±0,2 и 61,5±0,3*/98,2±1,2 и 162,8±25,3*). В среднем у птиц объем ядер гепатоцитов увеличивается на 36%, цитоплазмы на 32%. В группе млекопитающих объем ядер и цитоплазмы увеличивается в перипортальной (36,0±0,2 и 82,4±0,9*/100,2±1,0 и 306,2±2,1*) и в центролобулярной (63,4±0,2 и 107,4±0,8*/167,2±1,2 и 384,6±1,8*) зоне ацинуса, тогда как в перивенулярной уменьшается (113,0±0,3 и 77,9±1,0*/353,5±2,6 и 289,5±2,2*). В среднем увеличение объема ядер гепатоцитов у млекопитающих происходит на 26%, цитоплазмы на 64%. Порто-венулярный градиент в распределении размеров ядер сохраняется только у рептилий и рыб.

  1. Реактивность и пластичность печени на тканевом/межтканевом уровне

Выявлены особенности в стромально-паренхимных соотношениях клеточных типов печени и соотношениях полиплоидизации/пролиферации гепатоцитов. Так, в контроле у млекопитающих, рыб и рептилий двуядерные гепатоциты распределены равномерно в пределах ацинуса. У амфибий распределение двуядерных форм гепатоцитов характеризуется венуло-портальным, а у птиц порто-венулярным градиентом. По трем зонам общий процент двуядерных гепатоцитов у рыб, рептилий и птиц составляет 10%, у амфибий – 12%. Самая большая доля двуядерных гепатоцитов выявлена у млекопитающих – 24%. Отличительной особенностью рептилий является наличие как у контрольных, так и у экспериментальных животных 4-х ядерных гепатоцитов.

Наибольшее количество PCNA-позитивных гепатоцитов интактных животных выявлено в печени птиц – 11%, у рыб – 5%, у других групп животных 4%. Локализация данной популяции гепатоцитов в пространстве ацинуса у всех животных характеризуется порто-венулярным градиентом. Исключение составляет группа птиц, где количество PCNA-позитивных гепатоцитов во всех зонах ацинуса одинаково (рис. 1).

У интактных животных пероксидазо-позитивные клетки Купфера распределены равномерно в пределах ацинуса у амфибий и млекопитающих. Преобладание органоспецифичных макрофагов наблюдается в перипортальной зоне у рыб, рептилий и птиц. Десмин-позитивные клетки Ито рыб распределены равномерно в пределах ацинуса, у амфибий и млекопитающих более всего десмин-позитивных клеток Ито выявлено в области центральных вен, у рептилий в центролобулярной зоне, у птиц как в центролобулярной зоне, так и области центральных вен (рис. 1).

У рыб, рептилий, птиц и млекопитающих доля хехст-позитивных гепатоцитов от общего количества погибших гепатоцитов составляет 62-70%. Самое большое количество погибших гепатоцитов с апоптическим фенотипом - у птиц. У амфибий выявлена обратная тенденция. Примерно одинаковое апоптоз/некрозное соотношение выявлено у птиц (2,3), рептилий (2,1) и млекопитающих (2), у рыб 1,7 и у амфибий 0,6.

После гипертермии снижение количества живых гепатоцитов в перивенулярной зоне выявлено у всех групп животных, а также в центролобулярной зоне у амфибий и млекопитающих, в перипортальной у рептилий, птиц и млекопитающих. В отличие от других животных, в центролобулярной области печени рептилий наблюдается увеличение количества живых гепатоцитов, по всей видимости, за счет увеличения двуядерных форм. Увеличение количества двуядерных гепатоцитов обеспечивает закладку зон потенциальных источников будущего клона одноядерных гепатоцитов в области портального тракта (рис. 1) у амфибий, птиц; в центролобулярной - у амфибий, рептилий; в перивенулярной зоне - у рептилий и рыб (И. В. Урываева, 2001; Г. А. Сакута, 2005; S. Gupta, 2000). Так, если в контроле двуядерные гепатоциты были равномерно распределены по зонам ацинуса у рыб и млекопитающих, то после гипертермии равномерное распределение сохраняется только у млекопитающих. У амфибий и птиц распределение проявляет венуло-портальный градиент, у рыб и рептилий распределение меняется на порто-венулярный. В среднем по трем зонам количество двуядерных гепатоцитов после гипертермии у рыб составляет 14%, у амфибий 20%, рептилий 16%, у птиц 22% и у млекопитающих 22%.

После перегревания соответствует контрольным показателям количество PCNA-позитивных гепатоцитов у рептилий и птиц; у рыб и амфибий оно уменьшается в перипортальной зоне, отражая ингибирование процессов полиплоидизации. У амфибий PCNA-позитивные гепатоциты в области центральных вен вообще не выявляются, но в центролобулярной зоне их количество увеличивается. Млекопитающие - это единственная группа, у которой во всех зонах ацинуса количество PCNA-позитивных гепатоцитов увеличивается до 28% (рис. 1). Чтобы предотвратить повреждающее действие последствий гипертермии на структуру ДНК (соответственно и генов) в эволюции у животных сформировались механизмы, которые ограничивают быстрое увеличение количества тетраплоидных гепатоцитов как по пути формирования двуядерных, так и по пути полиплоидизации одноядерных форм клеток (S. P. Otto, 2007). Кроме того, тетраплоидные клетки имеют тенденцию к активации p53, что, в свою очередь, ведет к развитию блока клеточного цикла в G1-стадии, и, в конечном счете, к активации апоптоза, что выявлено нами у всех групп животных (N. J. Ganem, 2007). Потребность в PCNA (факторов процессивности PCNA-зависимых ДНК-полимераз), который обнаружен у всех организмов, по всей видимости, возрастает в условиях теплового стресса отражая не только активацию пролиферативных процессов, но и деструктивных, связанных с повреждением ДНК и активацией различных ПКГ (M. G. Jeschke, et al, 2001; R. M. Douglas, 2003; J. Frampton, 2006). Увеличение количества PCNA-позитивных гепатоцитов так же может быть индуцировано синтезом клетками Ито рядом важных цитокинов, что подтверждается выявленным увеличением количества у всех животных данной популяции стромальных клеток печени (C. Schmidt, et al., 2004, 2006; P. L. Andersen, 2008 J. G. Aparicio, et al., 2004; J. Frampton, 2006).

Выявленное нами в эксперименте дифференцированное снижение активности оксидоредуктаз цикла Кребса, по всей видимости, сопряжено с активацией полиплоидизации гепатоцитов по пути формирования двуядерных форм у всех групп животных, за исключением млекопитающих. Источником двуядерных гепатоцитов, вероятно, могли стать резервные гепатоциты, готовые к митозу, и гепатоциты, находящиеся в фазе синтеза ДНК к моменту начала эксперимента и, следовательно, способные вступать в митоз (В. А. Шкурупий, 1989; Г. Г. Автандилов, 2001, 2004). Увеличение количества двуядерных гепатоцитов может быть компенсаторной реакцией для восстановления межклеточных контактов с клетками Ито, а следовательно, ингибирования их активации и трансформации в миофибробласты. В то же время полиплоидизация одноядерных гепатоцитов на фоне снижения пролиферации в группе млекопитающих является защитным механизмом от метаболических последствий, связанных с действием гипертермии. У амфибий отмечается активация как процессов пролиферации, так и полиплоидизации (Сакута Г.А., 2005).

Увеличение количества погибших гепатоцитов и количества двуядерных и PCNA-позитивных гепатоцитов во всех зонах ацинуса у млекопитающих сопряжены, по-всей видимости, с аутокринной активацией. В группе рыб выявлена зональная сопряженность между увеличением количества погибших и двуядерных форм гепатоцитов в области центральных вен. У амфибий в центролобулярной зоне на фоне увеличения погибших гепатоцитов увеличивается количество как двуядерных, так и PCNA-позитивных гепатоцитов. У птиц в области портального тракта сопряжено увеличение количество погибших гепатоцитов и двуядерных форм, а у рептилий таковой зоной является перивенулярная. У млекопитающих увеличение количества погибших гепатоцитов положительно коррелирует с увеличением количества PCNA-позитивных гепатоцитов.

Количество органоспецифичных макрофагов у рыб после перегревания соответствует контрольному показателю; тем не менее нельзя исключить развитие качественных, а не количественных изменений в этой группы клеток (Р. А. Knolle, 2000, 2003). У амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих отмечается увеличение количества пероксидазо-позитивных клеток Купфера в области портального тракта. В то же время у млекопитающих количество органоспецифичных макрофагов увеличивается так же и в зоне центральных вен. Следовательно, выявленный в контроле у птиц и рептилий порто-венулярный градиент в распределении пероксидазо-позитивных клеток Купфера меняется на венуло-портальный, у амфибий, млекопитающих и рыб органоспецифичные макрофаги распределяются равномерно по зонам ацинуса (рис. 1).

Динамика количества и топографии десмин-позитивных клеток Ито после

Перипортальная зона

 

Центролобулярная зона

 

Перивенулярная зона

Рис. 1. Динамика соотношения стромально-паренхимных клеточных типов печени в норме и после гипертермии (при р0,05). ДГ – двуядерные гепатоциты, К – контроль, П – перегревание, PCNAПГ – PCNA-позитивные гепатоциты, КК – клетки Купфера, КИ – клетки Ито.

Рис. 2. Динамики цитокоммуникаций в пределах зон ацинуса (при r 0,7).

перегревания проявляется в увеличении их количества у всех групп животных в области центральных вен, в группе птиц - в центролобулярной и перипортальной, в группе млекопитающих - в центролобулярной. Столь ранняя активация данного типа клеток печени подтверждается нашими электронномикроскопическими исследованиями. Увеличение количества десмин-позитивных клеток Ито происходит, по всей видимости, за счет перехода десмин-негативных в десмин-позитивные клетки Ито: ранее не экспрессировавшие данный протеин клетки или содержащие его в минимальных количествах могут начинать его синтез при повреждении печени (H. Senoo, 2000, 2004; R. Issa, 2001; G. Carpino, 2004; G. Schlaf, 2004; C. Schnabel, 2004; M. R. Alison, 2004; R. G. Wells, 2005; M. H. Ismail, 2009). Причиной активации клеток Ито может служить прекращение мембранного контакта с гепатоцитами, выброс поврежденными гепатоцитами «раневых гормонов» и АФК. В свою очередь, активированные клетки Ито паракринно определяют активацию клеток Купфера; последние обладают стимулирующей активностью в отношении клеток Ито для удаления клеточного детрита и реконструкции межклеточного вещества (S. K. Meurer, 2005; A. M. Figueiredo-Fernandes, 2006).

Исходя из современной концепции, вышеприведенные деструктивно-репаративные события разворачиваются согласно топографическим зонам ацинуса (рис. 2) (А. П. Киясов, 2002; А. Lang, 1999; N. Milosevic, 2000; Z. Kmiec, 2001; J. E. Dumont, 2002; А. М. Figueiredo-Fernandes, 2006;). У рыб в перипортальной зоне не наблюдается активации показателей раннего репаративного процесса. У амфибий и млекопитающих активация органоспецифичных макрофагов оказывает разнонаправленное влияние на эпителиальные источники регенерации. Положительная сопряженность между количеством органоспецифичных макрофагов и количеством погибших гепатоцитов выявлена у рептилий и птиц. В отличие от других групп, у птиц выявлена положительная корреляция между количеством двуядерных гепатоцитов и увеличением количества десмин-позитивных клеток Ито (рис. 2). В центролобулярной зоне у амфибий и рептилий проявляется в большей мере аутокринная активация эпителиальных источников регенерации паренхимы. У млекопитающих активация десмин-позитивных клеток Ито положительно соотносится с увеличением количества как погибших, так и PCNA-позитивных гепатоцитов. Подобная тенденция проявляется в перивенулярной зоне у рыб и рептилий. У амфибий активация клеток Ито перивенулярной зоны сопряжена с увеличением количества погибших гепатоцитов. У птиц выявляется активация только клеток Ито. У млекопитающих активация стромальных клеток положительно соотносится как друг с другом, так и с увеличением количества погибших и PCNA-позитивных гепатоцитов (рис. 2). (Н. Ding, 2003; G. Schlaf, 2004; O. Kohji, 2007).

Нельзя исключить, что активация стромальных типов клеток печени обеспечивает выявленные переключения стратегий метаболизма после действия гипертермии. В частности, известно, что увеличение продукции ИЛ-6 ингибирует активность ключевых ферментов глюконеогенеза в печени, а ФНО обладает антилиполитическим действием. Следовательно, синтез стромальными цитотипами цитокинов пара- и аутокринного действия во многом способствуют метаболическим сдвигам с дальнейшей реализацией либо толератной, либо резистентной стратегии метаболизма (В. И. Кулинский, 1992).

  1. Реактивность и пластичность печени на клеточном уровне (гепатоциты)

Максимальная интегральная оптическая плотность конденсированной фракции ДНК хроматина ядер гепатоцитов выявлена у интактных животных в группе амфибий и млекопитающих. Вторую группу образуют рыбы и рептилии, третью птицы. Но, согласно анализу MANОVA, значимых отличий в интегральной оптической плотности между второй и первой группой животных не выявлено. Согласно интегральной оптической плотности декондесированной фракции ДНК (эухроматин) в первую группу можно отнести амфибий (рис. 4), во вторую - млекопитающих (рис. 7), в третью - рыб (рис. 3) и рептилий (рис. 5) и в четвертую - птиц (рис. 6). Уровень оптической плотности конденсированной фракции уменьшается в направлении млекопитающие амфибии рыбы рептилииптицы. Уровень оптической плотности деконденсированной фракции одинаков у эктотермных, но меньше, чем у эндотермных животных. Самый высокий уровень оптической плотности деконденсированной фракции хроматина выявлен у млекопитающих. По результатам сравнительного анализа уровня оптической плотности деконденсированной фракции, значимых отличий не выявлено в группе рептилии/рыбы и амфибии/рыбы. Максимальная же разница в уровне оптической плотности де- и компактизированной фракции хроматина выявлена у амфибий и рыб (рис. 3, 4).

Площадь распределения деконденсированной фракции хроматина больше в ядрах гепатоцитов амфибий, меньше у рыб, млекопитающих и рептилий и минимальная у птиц. Конденсированная фракция локализована более компактно с убыванием от амфибий рептилиирыбымлекопитающиептицы. Согласно площади распределения обеих форм хроматина, самая большая площадь ядра выявлена у амфибий, далее рыбырептилиимлекопитающиептицы. При этом значимых отличий данного показателя не выявлено только в группе рептилии/млекопитающие, а распределение компактизированной фракции хроматина в группе млекопитающие/рыбы.

Наибольшее количество гепатоцитов в G0-G1 стадии (2n2с) выявлено у интактных рыб (рис. 3) за счет минимального количества гиподиплоидных гепатоцитов и гепатоцитов в S, G2-M – стадии клеточного цикла. Вследствие этого у данной группы животных выявляется и минимальный индекс пролиферации. Обратная тенденция выявляется у птиц и рептилий (рис. 5, 6). Тем не менее, в группе рептилий выявлено самое большое количество гиподиплоидных гепатоцитов, менее всего у млекопитающих и рыб (рис. 3, 4, 5, 6, 7). При этом наиболее высокий показатель индекса пролиферации - у птиц и рептилий. Анализ соотношения «митотической активности/количества гиподиплоидных гепатоцитов» интактных животных (G2-M/D) выявил, что в группе рептилий, рыб и амфибий количество митотически делящихся гепатоцитов меньше, чем гиподиплоидных. У птиц и у млекопитающих – обратная реакция. Соотношение «полиплоидизации/пролиферации» (S/G2-M) таково, что из гепатоцитов, находящихся в S-стадии, у рыб 10% гепатоцитов вступают в G2-M-стадию, у амфибий 19%, у рептилий – 17%, а у птиц и млекопитающих этот показатель одинаков – 13%.

Корреляционный анализ показал, что у интактных рептилий, рыб, млекопитающих и птиц площадь ядра гепатоцитов положительно сопряжена с площадью распределения деконденсированной фракции хроматина и отрицательно - с уровнем его оптической плотности. У амфибий площадь ядра значимо коррелирует только с площадью распределения деконденсированной фракции. Только в группе рыб и амфибий выявлена корреляция между средней интегральной плотностью хроматина и площадью ядра. Во всех группах были выявлены корреляции между средней интегральной и оптической плотностью хроматина (r0,7).

После гипертермии в группе «амфибии/птицы» отмечается увеличение количества гепатоцитов в G0-G1-стадии клеточного цикла, уменьшение в S- и в G2-M-стадии и соответственно индекса пролиферации, это может быть следствием метаболической депрессии (рис. 4, 6). Группа «рыбы/рептилии/млекопитающие» наоборот, характеризуется тем, что количество гепатоцитов в G2-M-стадии у рыб уменьшается (рис. 3), а у рептилий и млекопитающих увеличивается (рис. 5, 7). У рыб и рептилий дополнительно выявлено увеличение количества гепатоцитов в S-стадии клеточного цикла.

Увеличивается количество гиподиплоидных гепатоцитов у всех групп животных, и в большей мере у птиц, в меньшей мере у рыб и рептилий. При этом в большей мере увеличивется доля пропидиумиодид-позитивных гепатоцитов, исключение составляет группа амфибий. Выявленные изменения отражаются на показателях апоптоз/некрозного соотношения: у млекопитающих происходит самое большое снижение показателя до 1,2; у рептилий и рыб соотношение также уменьшается и составляет 1,8 и 1,4 соответственно. Практически не меняется апоптоз/некрозное соотношение у птиц. Только у амфибий отмечается увеличение соотношения с 0,6 до 0,8, за счет увеличения в большей мере количества хехст-позитивных гепатоцитов. Выявленное у птиц самое большое превышение и в контроле и после перегревания доли хехст-позитивных гепатоцитов над пропидиумиоди-позитивными, по всей видимости, связано с наличием биохимических приспособлений к полету, размером генома, особенностью физиологии дыхания.

Динамика соотношения «пролиферирующие/гиподиплоидные» гепатоциты (G2-M/D) проявляется в снижении соотношения у рыб, амфибий, птиц, а у млекопитающих и рептилий соответствует контрольным показателям.

Согласно проведенному корреляционному анализу, у млекопитающих после гипертермии выявлены только положительные связи, но количество связей уменьшается. Снижение оптической плотности деконденсированной фракции хроматина ассоциировано с увеличением площади его распределения и увеличением площади ядра, как и у интактных животных. Снижение оптической плотности де- и конденсированной фракции хроматина находится в тесной зависимости, что еще раз указывает на дифференцированную активацию синтетических, катаболических и пролиферативных процессов в различных гепатоцитах. В группе рептилий, как и в группе млекопитающих, наблюдается функциональная активация ядер гепатоцитов,

КОНТРОЛЬ  ПЕРЕГРЕВАНИЕ

Рис. 3. Двумерное распределение ядер по TI – интегральной оптической плотности ДНК и T_RS – средней оптической плотности ДНК гепатоцитов рыб вида Carassius auratus gibilio. Многофакторный дисперсный анализ MANOV.

Контроль перегревание

Рис. 4. Амфибии вида Rana terrestris.

Контроль  перегревание

Рис. 5. Рептилии вида Trachemys scripta elegans.

Контроль  Перегревание

Рис. 6. Птицы вида Columba livia.

Контроль Перегревание

Рис. 7. Млекопитающие вида Rattus norvegicus.

что проявляется в установлении связи между уровнем оптической плотности обеих фракций хроматина и увеличением площади их распределения. Выявленная деконденсация хроматина затрагивает высокотемпературные ГЦ-участки ДНК, на фоне увеличения содержания цитоплазматического иона [Са2+]i при этом уменьшается жесткость ДНК (S. I. Grewal, 2002; S. Memedula, 2003). Эухроматизация может быть следствием действия кортикостероидных гормонов, усиления процессов транскрипции и репликации (В. А. Шкурупий, 1989).

У птиц увеличивается количество связей. Уменьшение площади деконденсированной фракции связано с увеличением уровня его оптической плотности, и как следствие, с уменьшением площади ядра. Уменьшение площади ядра ассоциировано с увеличение уровня оптической плотности обеих фракций хроматина.

У амфибий проявляется сопряженность между увеличением интегральной плотности конденсированной фракции хроматина и площадью его распределения.

Уменьшение площади ядра у рыб коррелирует с уменьшением площади занимаемой деконденсированной фракцией.

Увеличение объема ядер гепатоцитов у рептилий и млекопитающих может быть следствием функционального набухания при изменении транскрипционной активности, что ведет к оптимизации активности ферментов, кодируемых ядерным и митохондриальным геномом, обеспечивет адаптацию гепатоцитов к изменению газового режима, что является ключевым параметром установления соответствия между состоянием хроматина и метаболической активностью органа в рамках переключения стратегий метаболизма (H. A. Woods, 1999; T. Miyahara, 2000; W. G. Muller, 2001; M. Dundr, 2001; J. R. Chubb, 2002; J. Frampton, 2006; M. R. Bennett, 2008; N. S. Kenneth, 2008).. Следовательно, особенности в модификации активности ферментов цикла Кребса у изучаемых групп животных - чрезвычайно координированный процесс установления соответствия между уровнем функционирования митохондрий и метаболическими процессами в цитозоле (Г. Г. Автандилов, 2001, 2004; П. О. Вардеванян, 2001; N. L. Mahy, et al., 2002a, b; J. R. Chubb, 2002; R. M. Douglas, 2003; S. P. Otto, 2007).

Известно, что увеличение в эволюции размера генома, соответственно и объема ядер, вовлечено в регулирование метаболизма клетки, что обеспечивает реализацию разнообразных метаболических путей при адаптации к гипертермии (D. A. Petrov, 2002; A. E. Vinogradov, 2003, 2004; В. Г. Шахбазов, 1990; L. J. Borkin, 2001, 2004; T. R. Gregory, 2004; T. Cavalier-Smith, 2005). Это подтверждается выявленным нами выбором различных стратегий метаболической адаптации у животных с большим размером генома – рыбы, рептилии (толерантная) и амфибии (резистентная). Этот же процесс наблюдается при активации генома у рептилий и млекопитающих (толерантная стратегия).

  1. Реактивность и пластичность гепатоцитов на субклеточном уровне

Анализ ультратонких различий структур гепатоцитов интактных животных выявил, что от рыб к млекопитающим увеличивается объемная плотность митохондрий. В то же время численная плотность митохондрий больше у эктотермных видов (амфибии), а у млекопитающих она самая низкая (рис. 9, 12) (Н. Н. Безбородкина, 2008). Поверхностная плотность мембран митохондрий выше у рептилий (рис. 10), птиц и млекопитающих (рис. 11, 12) в отличие от рыб и амфибий (рис. 8, 9). Существует мнение, что у животных с толерантной стратегией адаптации в тканях меньше митохондрий. Нами выявлено, что у эктотермных групп животных количество митохондрий больше, чем у эндотермных видов. У эндотермных этот показатель ниже, а у Rattus norvegicus в сравнении со всеми группами животных численная плотность самая низкая. По всей видимости, адаптивное развитие структурно-функциональной организации в эволюции шло по пути формирования более крупных митохондрий. Большая численная плотность митохондрий у эктотермных организмов является механизмом адаптации к естественной гипоксии и реоксигенации с увеличением функциональной нагрузки на митохондрии, что также является источником их повреждения. Тип хондриома, представленный единичными мелкими митохондриями, вероятно, является самым ранним этапом программы гепатоцитов, направленной на защиту всей клетки от митохондрий с поврежденными функциями, предотвращая повреждение других митохондрий.

Самый большой объем ядрышка выявлен у млекопитающих (рис. 12), наименьший - у амфибий (рис. 9). Объемная плотность ГЭС выше у рыб (рис. 8), амфибий (рис. 9) и млекопитающих (рис. 12), самая низкая объемная плотность у рептилий (рис. 10). Наибольшая объемная плотность липидных капель наблюдается в группе рептилий, при этом численная плотность выше в гепатоцитах млекопитающих и рептилий. Минимальное количество липидных капель, как и объем, у птиц (рис. 11). Максимальные показатели объемной плотности гликогена выявлены у птиц (рис. 11) и минимальный - у млекопитающих (рис. 12).

Максимальная объемная плотность лизосом обнаруживается у птиц, минимальная - у рептилий и млекопитающих. Однако большая численная плотность лизосом отмечается у рыб, амфибий и млекопитающих, минимальная - у птиц и рептилий.

На основании сравнительного межгруппового анализа интактных животных выявлено, что значимые различия в численной плотности митохондрий наблюдаются у амфибий со всеми группами животных, в поверхностной плотности митохондрий - у амфибий с млекопитающими; у рыб с млекопитающими, рептилиями и с птицами. Объемная плотность митохондрий выше у эндотермных, и она значимо отличается от показателей эктотермных животных. Объемная плотность липидов значимо различается у рептилий с млекопитающими и с рыбами. Численная плотность липидов отличается в группе млекопитающих, рептилий и рыб. Различия в объемной плотности гликогена выявлены у амфибий с млекопитающими; рыб с рептилиями, а также между группой млекопитающих и рептилий. Поверхностная площадь лизосом значимо отличается у рептилий и птиц; рептилий и млекопитающих, объемная плотность лизосом - у птиц с рыбами. Значимые изменения в численной плотности лизосом выявлены только между группой млекопитающих и рептилий. Объемная плотность ГЭС значимо отличается у амфибий с рептилиями и млекопитающими; у рептилий с рыбами; млекопитающих и птиц.

После гипертермии выявлены морфологические признаки последовательной интеграции первичных звеньев регенераторного процесса в общую систему компенсаций нарушенных функций, сохранения гомеостаза и обеспечения восстановления гепатоцитов на субклеточном уровне. На действие гипертермии у всех групп животных проявляется ультраструктурный полиморфизм гепатоцитов и их органелл, который отражает разную степень их реакции на гипертермию, что связано с различным ритмом их функционирования, биологической зрелостью, положением в системе ацинуса, эволюционным положением организма в таксономической системе, следовательно, и уровнем устойчивости к гипертермии (М. М. Калашникова, 1993; Т. Cavalier-Smith, 2005; J. Das, 2006).

В гепатоцитах рыб (рис. 8) отмечается значимое увеличение объемной и поверхностной плотности митохондрий, но численная плотность уменьшается, вероятно, в связи со слиянием их в единую сеть. В гепатоцитах амфибий (рис. 9) увеличивается только поверхностная плотность. У рептилий и птиц (рис. 10, 11) увеличивается не только поверхностная, но и численная плотность, это может свидетельствовать о делении митохондрий, которое сопровождается увеличением суммарной поверхностной плотности наружных мембран. У рептилий, как у рыб и амфибий отмечается, наряду с делением митохондрий, и процесс их слияния, с формированием гигантских митохондрий. Слияние митохондрий обеспечивает увеличение транспорта энергетических субстратов в митохондрии, позволяет использовать ее в качестве «внутриклеточного кабеля», передающего энергию в виде мембранного потенциала с периферии гепатоцита, где уровень кислорода, необходимого для дыхания, относительно высок, к центральной части гепатоцита, где потребность в окислительных метаболитах и АТФ особенно высока (К. Г. Лямзаев, 2007; H. A. Woods, 1999; C. T. Taylor, 2008). В отличие от других групп, у млекопитающих выявлено снижение объемной и поверхностной плотности митохондрий, с увеличением только численной. Гиперплазия митохондрий у млекопитающих, по всей видимости, может отражать, с одной стороны, усиление пролиферативной активности гепатоцитов, с другой - увеличение функциональной нагрузки. В то же время фрагментация может быть следствием как ингибирования дыхания, так и повышения уровня АФК, генерируемых дыхательной цепью поврежденными митохондриями. Таким образом, фрагментация митохондрий при окислительном стрессе, гипоксии у млекопитающих, вероятно, является самым ранним этапом программы гепатоцитов, выявленной у интактных эктотермных животных, направленной на защиту от митохондрий с поврежденными функциями и служит для предотвращения повреждения всех митохондрий слитых в единую сеть (Е. Ф. Лушников, 2001; Л. Е. Панин, 2004; К. Г. Лямзаев, 2007; Э. Л. Холмухамедов, 2008; S. Desagher, 2000; J. E. Flanigan, 2004; S. Desagher, 2000; J. M. Lee, 2006; O. Y. Pletjushkina, 2006).

Необходимо отметить, что внутри одного гепатоцита у всех исследуемых групп животных выявлено увеличение объемной и численной плотности как лизосом, так и митохондрий, что указывает на пересечение танатогенных подпрограмм внутри гепатоцита (С. Я. Проскуряков, 2002; Л. Е. Бакеева, 2006). Увеличение численной плотности лизосом у амфибий, рептилий (рис. 9, 10), объемной плотности у млекопитающих (в отличие от птиц и рыб) отражает, с одной стороны, повышение синтетической активности в гепатоцитах, с другой стороны - инициацию процессов аутофагии. Активация аутофагии сопряжена с затратой энергии, вследствие этого отдельная популяция митохондрий проявляет признаки максимальной функциональной активности (D. R. Green, 2004; S. Rodriguez-Enriquez, 2004; M. E. Guicciardi, 2004; В. Winchester, 2005; H. Erdal, 2005).

На изменение интенсивности утилизации липидов указывает увеличение содержания липидов в гепатоцитах всех групп животных. Отмечается активация процессов утилизации гликогена в качестве основного источника энергии у амфибий (рис. 9), рептилий и млекопитающих (рис. 10, 12). На этом фоне у данных групп животных альтернативным источником энергии могут являться продукты лизосомального гидролиза белков и липидов мембран.

Увеличение численной, объемной и поверхностной плотности лизосом соотносится как со снижением объемной плотности гликогена, так и с увеличением объемной плотности липидов. Исключение составляет группа птиц (рис. 11), у которых соотношения показателей гликогена и липидов проявляют обратную тенденцию. Увеличение объемной плотности гликогена у птиц и рыб (рис. 8, 11) указывает на превращение жира в гликоген, этим достигается снижение энергетической нагрузки на митохондрии при окислении жирных кислот, что способствует освобождению гепатоцита от избытка липидов. Необходимо также учитывать, что в печени рыб меньше активность ферментов гликогенолиза, и гликоген даже в период голодания расходуется медленно. По-всей видимости, основным источником энергии, наряду с гликогеном, являются липиды. Это подтверждается тесным топографическим контактом у всех животных митохондрий с липидными каплями, что отражает активацию АТФ-зависимого процесса -окисления жирных кислот с помощью митохондриальных ферментов (М. М. Калашникова, 2006). У амфибий и рептилий увеличение объема липидных капель составляет не более 30%, тогда как у птиц и млекопитающих значительно увеличивается поверхностная, объемная и численная плотность липидных капель. В цитоплазме накапливаются гранулы липофусцина в зоне локализации митохондрий, у которых отмечается формирование миэлиноподобных образований.

На основании полученных данных можно выявить соотношение «липогенез/гликогенез» (Vл/Vг), которое отражает приоритет запасающей функции и депонирование включений. Так, соотношение объемных показателей липидов и гликогена в контроле у рыб составляет 57/43 соответственно, после гипертермии - 25/75. У амфибий выявленное в контроле соотношение 80/20 после перегревания сохраняется. У рептилий контрольной группы соотношение объема липидов и гликогена равны – 50/50, после перегревания 95/5. У птиц сохраняются выявленные в контроле соотношения включений 1/99, за счет очень быстрого включения метаболической депрессии, так же как и у амфибий. У млекопитающих выявленное в контроле соотношение 82/18 после перегревания представлено только липидами, за счет полной утилизации гликогена (S. Mitev, 2005).

У рыб проявляется характерная для данного вида животных сегрегация ядрышка, которая может отражать инактивацию белоксинтетической деятельности на уровне угнетения сборки прерибосомальных субъединиц. В то же время подобная структура ядрышка встречается в гепатоцитах интактных животных. Возможно, это один из морфологических эквивалентов, который обеспечивает более низкий уровень метаболизма в норме, с последующей модуляцией транскрипции, реализации эволюционно сформированных механизмов устойчивости к гипертермии (H. A. Singh, 2006).

Функциональная морфология ядрышка гепатоцитов амфибий и млекопитающих отражает угнетение процессов биосинтеза рРНК, в отличие от птиц. Следовательно, структура хроматина ядра гепатоцитов проявляет адаптивную реорганизацию в соответствии с потребностями гепатоцитов в синтезе РНК и белка, обеспечивая, таким образом, согласование между уровнем транскрипции и трансляции (C. R. Currens, 2002).

Развитию метаболической депрессии также способствует универсальная черта, связанная с увеличением/уменьшением в эволюции размера генома у амфибий и птиц, что определяет снижение скорости метаболизма на клеточном и организменном уровнях согласно стратегии экономного метаболизма, как одного из показателей адаптивной метаболической пластичности.

Уменьшение численной плотности лизосом у птиц (рис. 11), снижение свободной активности кислой фосфатазы гепатоцитов морфобиохимически определяют самое большое превышение количества хехст-позитивных гепатоцитов над количеством проипидиумиодид-позитивных. Проявление метаболической депрессии у птиц отражает то, что новые возможности (функции) в эволюции возникают на базе уже достигнутого, вызывают активацию эволюционно более древних механизмов функционирования и энергообеспечения гепатоцитов. Можно предположить, что при экстремальных состояниях у эндотермных животных могут активизироваться эктотермные механизмы терморегуляции.

После гипертермии отмечается активация со стороны стромальных клеток печени. Во всех группах животных выделяется две популяции клеток Ито – с увеличенным содержанием липидов, в другой популяции клеток Ито проявляются признаки активации и трансформации в миофибробласты (K. Imai, 2000). Активация клеток Купфера проявляется в скоплении в фагосомах цитоскелетных структур из разрушенных клеток, большом количестве захваченного клеточного детрита.

Следовательно, после гипертермии реактивность и пластичность

Рис. 8. Ультраструктурные показатели гепатоцитов Carassius auratus gibilio в норме и после перегревания в системе in vivo.

Рис. 9. Ультраструктурные показатели гепатоцитов Rana terrestris в норме и после перегревания в системе in vivo.

Рис. 10. Ультраструктурные показатели гепатоцитов Trachemys scripta elegans в норме и после перегревания в системе in vivo.

Рис. 11. Ультраструктурные показатели гепатоцитов Columba livia в норме и после перегревания в системе in vivo.

Рис. 12. Ультраструктурные показатели гепатоцитов Rattus norvegicus в норме и после перегревания в системе in vivo.

гепатоцитов характеризуется асинхронной работой органелл. В процессе эволюции клеточный состав печени не менялся, а количество и топография стромальных типов клеток печени не связаны с системой терморегуляции и экологической специализацией организма. Выявленные особенности в структуре гепатоцитов отражают развитие в эволюции интенсификацию функций печени, а в основе способа филогенетического преобразования печени лежит принцип мультифункциональности и закон параллельных рядов тканевой эволюции. Примером возникновения нового качества в строении гепатоцитов могут служить выявленные рекомбинантные и количественные преобразования. Неоднотипность реакции рядом лежащих гепатоцитов и даже органелл внутри одного и того же гепатоцита является отражением закона перемежающейся активности функционирующих структур, благодаря этому клетки печени в состоянии оптимально функционировать в условиях стресса (Г. Н. Крыжановский, 1973; Д. С. Саркисов, 1977, 1994; М. М. Калашникова, 1993; A. J. Koster, 2003; J. Das, 2006).

  1. Реактивность и пластичность печени на биохимическом (молекулярном) уровне

Анализ «компенсации интенсивности метаболизма», как составной части различных статегий, в сравнительном аспекте у интактных животных в модели in vivo, выявил, что более интенсивно катаболизм субстратов оксидоредуктазами и обеспечение дыхательной цепи восстановленными эквивалентами на уровне ИДГмх (НАД)-реакций наблюдается у млекопитающих и амфибий, самая низкая активность фермента выявлена у рептилий.

В большей мере активность ИДГмх (НАДФ) обнаружена у амфибий и рептилий и в меньшей мере у млекопитающих, это отражает особенность биологии организма амфибий и водных рептилий – наличие естественной гипоксии, и как следствие более высокий уровень регуляции энергетической направленности оксидоредуктаз ЦТК, координации и интеграции углеродного, азотистого обмена.

Самый высокий уровень активности МДГмх(НАД) установлен в группе млекопитающих и амфибий (рис. 14), минимальный у рептилий (рис. 15).

Более активно протекают реакции, катализируемые МДГмх(НАДФ) митохондрий, у амфибий и птиц (рис. 14, 16), и в меньшей мере у млекопитающих (рис. 17).

Активность цитоплазматических форм оксидоредуктаз проявляют сходную динамику с митохондриальными.

Самый высокий уровень активности ЛДГ у рыб (рис. 13), наименьший у амфибий (рис. 14). Соотношение в активности «митохондриальные оксидоредуктазы/ЛДГ» у рыб составляет 40/60; у амфибий 87/13; у рептилий 36/64; у птиц 43/57 и у млекопитающих 53/47,что отражает направленность энергетического обмена у данных групп животных.

Максимальная, на порядок выше, чем у других животных, активность каспазы3 и свободной активности кислой фосфатазы выявлена у птиц (рис. 16), минимальная у амфибий и рыб (рис. 13, 14). Самое большое соотношение в активности данных ферментов у птиц – 6,2, значительно ниже у рыб – 1,4 и минимальное у амфибий (0,3), рептилий (0,9) и млекопитающих (0,7).

Активность Г-6-ФДГ у всех интактных животных одинакова, за исключением млекопитающих активность фермента которых, более чем в 5 раз ниже (рис. 17).

Содержание в цитозоле гепатоцитов ионов [Са2+]i у всех животных одинаково. Содержание ионов [К+]i в большей мере выявлено у рыб и млекопитающих (рис. 13, 17), у остальных животных одинаково. Содержание ионов [Nа+]i больше всего содержится в цитозольной фракции млекопитающих, менее всего у рептилий (рис. 15). В группах рыб и амфибий содержание ионов [Nа+]i одинаково.

Выявленный первичный комплекс метаболических модификаций и сопряженностей метаболических путей в модели in vivo после гипертермии проявляется в активации начального этапа ЦТК за счет увеличения активности НАД-зависимой ИДГ митохондрий на 51% в группе рыб и в 1,8 раза у рептилий (рис. 13, 15). В то же время в группе птиц (рис. 16) активность фермента на 36% снижается, это по-всей видимости определяет уменьшение генерации восстановленных эквивалентов для дыхательной цепи, снижение соотношения НАД+/НАДН и НАДФ+/НАДФН, уровня катаболизма субстратов в ЦТК. Увеличение активности НАДФ-зависимой ИДГ митохондрий выявляется только у млекопитающих – на 47% (рис. 17), а у амфибий и рептилий активность фермента наоборот снижается на 41% и 89% соответственно (рис. 14, 15). Увеличивается активность МДГ(НАД) митохондрий на 15% у рептилий; снижается в группе птиц на 18% и в группе млекопитающих на 30%. Увеличение активности МДГ(НАДФ) митохондрий на 50% у рептилий и более чем в три раза у млекопитающих по всей видимости сопряжено с увеличением количества липидов в гепатоцитах (Н. Eisler et al, 2004; E. T. Sadowska, 2005). У рыб и птиц, активность фермента наоборот угнетается (на 19% и 40% соответственно). Следствием снижения активности ферментов, по всей видимости, определяет снижение скорости -окисления жирных кислот, это так же определяет увеличение в гепатоцитах всех группах животных содержания липидов.

Не исключено, что выявленное повышение активности энергопродуцирующих реакций ЦТК у рыб, рептилий и млекопитающих обусловлено тем, что процесс АОС обеспечивает протекание ряда ферментативных реакций в ЦТК, несмотря на дефицит кислорода (И. Е. Маевский, 2000). Увеличение активности данных НАДФ-зависимых ферментов также отражает развитие процессов репаративной регенерации гепатоцитов. Эти результаты вполне согласуются с предположением о том, что митохондрии являются селективной мишенью при действии гипертермии (Л. Е. Бакеева, 2006; R. G. Boutilier, 2000; G. Kroemer, et.al, 2005). В то же время снижение активности митохондриальных оксидоредуктаз ЦТК - регуляторов активности дыхательной цепи, определяет уменьшение продукции АТФ, как защитный механизм, который влияет на поддержание целостности гепатоцитов и его структур, уменьшение продукции АФК, определяя так же модуляцию соотношения на биохимическом уровне путей гибели гепатоцитов (J. St-Pierre, 2000; J. E. Flanigan, et al., 2004).

В цитозольной фракции печени рыб на 52% увеличивается, а у амфибий на 47% и у рептилий на 18% снижается активность НАД-зависимой ИДГ (рис. 14, 15).

Активность НАДФ-зависимой ИДГ цитозоля значимо на 48% снижается у млекопитающих (рис. 17). Активность МДГ НАДФ цитозоля у амфибий и рептилий снижается (на 58%, 43% соответственно), вследствие этого по-всей видимости имеет место угнетение начальных этапов глюконеогенеза, биосинтетических, пролиферативных процессов и детоксикации. У млекопитающих наоборот увеличивается активность НАДФ-зависимой МДГ, отражая усиление биосинтетических и пролиферативных процессов в гепатоцитах (рис. 13, 14, 15, 16, 17).

В период реоксигенации активация Г-6-ФДГ, во многом определяет усиление репаративно-пролиферативных процессов у всех изучаемых видов животных (у рыб более чем в два раза, в два раза у амфибий и птиц, а у млекопитающих на 61,9%). Увеличение активности фермента ПФП по-всей видимости индуцируется ПОЛ, высокими концентрациями глюкозо-6-фосфата, как продукта расщепления глюкозы и показателя мобилизации запасов гликогена со снижением его объемной плотности в группе амфибий, рептилий и млекопитающих. При этом промежуточные продукты окислительного этапа ПМП обеспечивают выявленное переключение потока метаболитов на анаэробный путь окисления глюкозы. Образование восстановленных эквивалентов в реакциях пентозофосфатного пути является основным источником для функционирования ГП/ГР АОС, а так же синтеза пентоз нуклеотидов и жирных кислот (Л. Е. Панин, 2002; P. W. Hochachka, et.al., 2001; S. Filosa, 2003; D. R. Nelson, 2003; R. Woodyer, 2005; G. Tozzi, 2006; L. Agius, 2008).

Увеличивается активность ЛДГ, как показатель интенсификации анаэробного пути окисления глюкозы. В большей мере активация ЛДГ наблюдается в группе амфибий, млекопитающих и рыб (в 8 раз, более чем в 4 раза и более чем в 3 раза соответственно) (рис. 13, 14, 17) и в меньшей в группах птиц, рептилий (рис. 15, 16). Так на фоне снижения активности оксидоредуктаз ЦТК, в группе амфибий гликолиз становится единственным источником АТФ в условиях стресса.

Практически равноценных вклад обоих путей в метаболизм гепатоцитов после гипертермии выявлен у птиц. У амфибий и млекопитающих наблюдается резкое в короткий срок переключение с аэробного на анаэробный путь окисления глюкозы. Усиление субстратного обеспечения гликолиза осуществлялось за счет компенсаторного пополнение субстратного потока ЦТК метаболитов с аминокислотного обмена. Это подтверждается увеличением активностью МДГ-реакции перерабатывающий субстрат за счет образования в процессе гликолиза пирувата (C. Cande, 2002; T. Washizu, 2002, 2005).

Выявленное увеличение активности ЛДГ отражает развитие гипоксии, опосредованное действием гипертермии. В связи с этим снижается количество субстрата для цитратного цикла и как следствие, выявленное дифференцированное снижение активности ферментов цикла Кребса (Ю. В. Зимин, 2001; S. M. Lee, 2002; М. Nikinmaa, 2002; G. N. Somero, 2002; G. E. Hofmann, 2005; A. M. Neyrinck,. 2005; N. A. Fangue, 2006; S. E. Gilman, 2006; C. L. Sans, 2006).

На фоне увеличения ионов [Са2+]i в цитозольной фракции гепатоцитов амфибий выявлено увеличение количества ионов [Nа+]i; у рептилий уменьшение концентрации ионов [К+]i; у млекопитающих увеличивается как содержание ионов [К+]i так и содержание ионов [Nа+]i. Выявленные изменения в содержании ионов ведет к открытию потенциал-зависимых ионных каналов, дифференцированному нарушению ионного и осмотического гомеостаза гепатоцитов. Выявленное в ходе эксперимента у всех исследуемых видов животных многократное увеличение содержания цитозольного [Са2+]i так же обеспечивает удаление апоптических клеток и клеточного дебриса органоспецифичными макрофагами. Количество последних согласно наших исследований увеличивается у всех групп животных (J. Chang, 2000; V. I. Lushchak, 2001; Н. Scholz, 2002).

В свою очередь увеличение содержания ионов [Са2+]i в цитозоле, определяет реализацию различных путей ПКГ гепатоцитов, это подтверждается увеличением свободной активности кислой фосфатазы и каспазы3 (С. Я. Проскуряков, 2002; K. Paszty, 2002, 2005; C. Cande, 2002; N. Itano, 2003; V. P. Skulachev, 2004; E. H. Baehrecke, 2005; O. J. Holt, 2006; T. Yorimitsu, 2006; L. Galluzzi, 2007, 2008; S. Kumar, 2007). Увеличение активности каспазы3 стала почти синонимом клеточной гибели (B. McLaughlin, et al. 2003; K. Kivinen, 2005; S. A. Lakhani, 2006). Так, у интактных рыб активности каспазы3 и свободная активность кислой фосфатазы одинаков. Соотношение их активности, в контроле составляет 1,4, в эксперименте 0,9, что можно объяснить увеличением активности обоих ферментов более чем в два раза. У амфибий активность каспазы3 увеличивается в шесть раз и свободная активность кислой фосфатазы в два раза, соответственно соотношение активности ферментов с 0,3, после перегревания увеличивается до 0,8 за счет резкого увеличения активности каспазы3. Активность ферментов у рептилий также увеличивается: свободная активность кислой фосфатазы более чем в два раза, а каспазы3 в три раза. Таким образом, соотношение в активности ферментов с 0,9 в контроле снижается до 0,66 в эксперименте. У птиц уровень свободной активности кислой фосфатазы после перегревания не меняется, а активность каспазы3 увеличивается в 1,8 раза в сравнении с контролем. В связи с этим выявленное в контроле соотношение 6,2 после перегревания увеличивается до 10,4. У млекопитающих увеличивается свободная активность кислой фосфатазы более чем в два раза, а каспазы3 в два раза. Вследствие этого разница в уровнях активности ферментов увеличивается и соотношение снижается с 0,7 до 0,57 (рис. 13-17).

Активаторами ферментов лизосом, в частности свободной активности кислой фосфатазы у всех животных можно считать ПОЛ, дегенеративные изменения митохондрий и, как следствие, выявленное нами формирование миелиновых структур (M. G. Jeschke, et al, 2001; M. J. Tisdale, 2002; N. Mizushima, 2004; В. Levine, 2004; P. Codogno, 2005; T. Yorimitsu, 2006; A. Kelekar, 2006 С. Я. Дергунова, 2006; M. G. Jeschke, et al, 2001; M. J. Tisdale, 2002; N. Mizushima, 2004; В. Levine, 2004; P. Codogno, 2005; T. Yorimitsu, 2006; A. Kelekar, 2006). В связи с этим выявляется увеличение пропидиумиодид-позитивных гепатоцитов, отражает развитие с участием лизосом программы некроза и аутофагии (M. E. Guicciardi, 2004; J. J. Lum, 2005).

Увеличение активности каспазы3 и свободной активности кислой фосфатазы так же отражает нарушение функций митохондрий, вследствие увеличения скорости образования АФК комплексом III дыхательной цепи, с последующей фрагментацией/набуханием митохондрий (Л. Н. Цветикова, 2008; G. Balogh, 2005; M. Mandi, 2006; Zhang, Y., 2007 T. Yorimitsu, 2005; E-L. Eskelinen, 2005; P. Boya, 2005; H. Malhi, 2006; S. Luo, 2007; N. Kourtis, 2008). (Л. Е. Бакеева, 2006; Е. А. Александрова, 2003; J. Shi, 1991; J. J. Lemasters, 1999). Уменьшение численной плотности лизосом у птиц и низкая активность свободной кислой фосфатазы, по всей видимости, и определяет сохранность гликогена на фоне выраженной метаболической депрессии.

Гиперкатаболическая стратегия метаболизма реализуется на основе стресс-реакции. В нашем эксперименте после перегревания данная стратегия выявлена у рептилий, млекопитающих и в меньшей мере у рыб, и осуществляется под контролем ГКГ, глюкагона, вазопрессина, лейкотриенов и т.д. (В. И. Кулинский, 1992; И. А. Волчегорский, и др., 2000). Филогенетически более древняя - толерантная (гипометаболическая, толерантный гипобиоз) стратегия в наших экспериметах выявлена у амфибий и птиц (R-P. Sabat, 2006). Метаболической основой такой стратегии является уменьшение катаболизма, энерготрат и потребления кислорода, эффекторами данной стратегии являются ГАМК, аденозин, серотонин (В. И. Кулинский, 1992; A. Makarieva, 2006).

Метаболическая депрессия у эктотермных животных имеет естественную основу, когда гипоксическое состояние сменяется гипероксическим вследствие реоксигенации (J. B. Pritchard, 2002). В этих условиях основным источником энергии являются липиды (M. Hermes-Lima, 2002; D. C. Jackson, 2004). У эндотермов отсутствует температурная компенсация физиологической активности. Тем не менее, у птиц выявляется значительная метаболическая депрессия на уровне как митохондриальных, так и цитозольных оксидоредуктаз. Это отражает положение о том, что новые возможности/функции в эволюции возникают на базе уже достигнутого, за счет активации эволюционно более древних механизмов функционирования и энергообеспечения гепатоцитов. В свою очередь выявленная активация оксидоредуктаз ЦТК и цитозоля у рептилий объясняется тем, что, являясь потомками древних амфибий, рептилии, в частности черепахи, дали начало двум крупнейшим ветвям современных высших позвоночных - птицам и млекопитающим. Отряд черепахи являются прямыми потомками котилозавров и, следовательно, наиболее близко стоят к рептилиеподобным предкам млекопитающих. Следовательно, экстремальная гипертермия у птиц и млекопитающих вызывает активацию эволюционно более древних механизмов функционирования и энергообеспечения гепатоцитов (P. W. Hochachka, 1997). Можно предположить, что при экстремальных состояниях у эндотермов могут активизироваться пойкилотермные механизмы терморегуляции и наоборот.

Таким образом, первичная метаболическая реакция гепатоцитов всех изучаемых видов животных на действие гипертермии, согласно стратегии «соответствия кислорода» обеспечивается дифференцированным снижением активности оксидоредуктаз ЦТК, интенсивности энергопотребляющих процессов в цитоплазме, обеспечивая сохранность метаболических источников АТФ и целостность гепатоцитов. Выявленные изменения в активности изучаемых ферментов, согласно принципа «минимальных энерготрат», решают две задачи - приспособление метаболизма к гипертермии, а так же защита от оксидативного стресса в течение периода реоксигенации (Н. Д. Озернюк, 2000, 2004; R. G. Boutilier, et al., 2000; V. I. Lushchak, 2001; P. L. Lutz, 2002; P. W. Hochachka, et al., 2002; G. N. Somero, 2002; B. G. Lovegrove, 2003; P. R. Brauer, 2005; C. T. Taylor, 2008). Направление метаболической стратегии реализуется за счет перекрытия клеточных компенсаторных реакций, каскада ответных реакций более высоких уровней биологической иерархии (G. E. Shulman, 1999; N. D. Charles, 2005).

  1. Реактивность и пластичность гепатоцитов в системе in vitro

В экспериментах по анализу биологии интактных гепатоцитов в системе in vitro выявлено, что максимальное количество погибших гепатоцитов на 1мл/106 определяется у рыб и рептилий, минимальное – у птиц.

Самый высокий показатель индекса пролиферации выявлен в культурах гепатоцитов млекопитающих, а в культурах гепатоцитов рыб, амфибий и рептилий одинаковый, наименьший - в культурах гепатоцитов птиц. Апоптоз/некрозное соотношение культур гепатоцитов рыб и рептилий составляет 1, у амфибий (так же как в модели in vivo) выявляется преобладание пропидиумиодид-позитивных гепатоцитов над хехст-позитивными; в культурах гепатоцитов птиц (так же как в модели in vivo) - наоборот. При этом в культуре гепатоцитов птиц выявлен самый высокий показатель апоптоз/некрозного соотношения. В культурах млекопитающих количество хехст-позитивных гепатоцитов больше, в сравнении с моделью in vivo.

Механизмы метаболической адаптации интактных гепатоцитов в системе in vitro отражают как сходство, так и различия в сравнении с моделью in vivo, в которой значительную роль на биохимические процессы оказывают сигнальные молекулы системы регуляции организма (E. Rissanen, 2006). Так, активность оксидоредуктаз митохондрий в культурах рыб (рис. 13) соответствует активности ферментов в системе in vivo, но активность цитоплазматических форм оксидоредуктаз ниже в сравнении с моделью in vivo. В культурах гепатоциты амфибий (рис. 14) адаптируются за счет снижения скорости НАД-зависимых реакций оксидоредуктаз в митохондриях и пластического обмена в цитоплазме в сравнении с моделью in vivo, на фоне увеличения количества погибших гепатоцитов по пути апоптоза. Метаболические адаптации гепатоцитов рептилий in vitro (рис. 15) характеризуются более высоким уровнем активности оксидоредуктаз митохондрий, в цитозоле уровень активности оксидоредуктаз, каспазы3, Г-6-ФДГ и свободной активности кислой фосфатазы соответствует модели in vivo, тогда как активность ЛДГ ниже. В модели in vitro культур гепатоцитов птиц (рис. 16) активность оксидоредуктаз митохондрий соответствет модели in vivo, в цитозоле активность оксидоредуктаз, Г-6-ФДГ ниже в сравнении с моделью in vivo. В культурах гепатоцитов млекопитающих (рис. 17) активность митохондриальных оксидоредуктаз ЦТК протекает более интенсивно за счет более высокой активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ, на фоне более низкой активности ферментов цитозоля и усиления катаболических процессов.

Следовательно, в митохондриях под контролем регуляторных систем организма, в модели in vivo у всех интактных животных (за исключением рептилий) в сравнении c in vitro более интенсивно протекают процессы катализируемые ИДГмх(НАД); у амфибий и рептилий - катализируемые ИДГмх(НАДФ); у млекопитающих - МДГмх(НАД). Менее интенсивно протекают реакции, катализируемые ИДГмх(НАДФ) у рыб и млекопитающих (рис. 13, 17); МДГмх(НАДФ) у рептилий и млекопитающих (рис. 15, 17); ИДГ и МДГ НАД-зависимые реакции у рептилий. В обеих моделях с одинаковой скоростью протекают реакции катализируемые у рыб, амфибий и птиц МДГмх(НАД и НАДФ), а у птиц дополнительно и ИДГмх(НАДФ) (рис. 16). Наибольшее отличие в активности ферментов в модели in vitro и in vivo выявлено у рептилий и млекопитающих. Следовательно, у всех видов животных регуляторная система организмов обеспечивает более высокую продукцию АТФ (в сравнении с in vitro), за счет поставки восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь митохондрий, поддерживая баланс НАД/НАДН, так как именно ИДГ(НАД)мх является ферментом, который выполняет роль основного контрольного пункта за функционированием ЦТК.

МДГмх(НАД)-реакции проявляют большую активность в системе in vivo у млекопитающих, отражая приоритетное течение НАД-зависимых реакций ЦТК.

ИДГмх(НАДФ)-реакции протекают на более высокм уровне в системе in vivo у амфибий и рептилий, это, с одной стороны, обеспечивает поставку восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь митохондрий, с другой стороны отражает более высокую интенсивность координации и интеграции углеводного и азотистого обмена, т.к. является точкой пересечения этих важнейших метаболических путей.

Одинаковая активность НАДФ-зависимых МДГ митохондрий в обеих системах у рыб, амфибий и птиц в митохондриях отражают стабильность биосинтетических процессов – глюконеогенеза и синтеза жирных кислот в цитозоле.

В цитозоле в системе in vivo, в сравнении с моделью in vitro, у всех интаткных животных реакции, катализируемые ИДГцит (НАД) протекают более интенсивно, так же как и ИДГцит (НАДФ)-реакции (за исключением птиц). Более интенсивно протекают реакции, катализируемые МДГцит (НАД) у рыб и млекопитающих, тогда как у амфибий, рептилий и птиц уровень активности в обеих моделях одинаков. Активность НАДФ-заивисмой МДГ цитозоля протекает более интенсивно у всех животных, за исключением амфибий.

Активность Г-6-ФДГ в контроле проявляет сходную динамику с системой in vitro у рептилий, птиц и млекопитающих. И более интенсивно в модели in vivo протекает у рыб и амфибий (рис. 13, 14) (K. Mounaji, 2003). Следовательно, количество восстановленных эквивалентов (S. Filosa , 2003; L. Gao, 2004), которые необходимы для биосинтетических процессов, детоксикации и работы ГР/ГП АОС с целью снижения оксидативных повреждений ДНК и белков (F. Gian, 2005; R. Bjarne, 2005), уровнь окисления малата в цитозоле до не митохондриального оксалоацетата и интенсивность начальных этапов глюконеогенеза и синтеза аминокислот в циозоле гепатоцитов имеют стабильные молекулярные механизмы регуляции и в меньшей мере регулируются механизмами организма.

В системе in vivo, более интенсивно протекают реакции, катализируемые ЛДГ у рыб, рептилий и млекопитающих, а в группе амфибий и птиц активность ЛДГ наоборот выше в модели in vitro. Активность каспазы3 ниже в модели in vivo у амфибий (рис. 14), свободная активность кислой фосфатазы у амфибий и рыб (рис. 13, 14). Уровень активности каспазы3 у остальных групп животных одинаков в обеих моделях, а свободной активности кислой фосфатазы у рептилий, птиц и млекопитающих. Сходная динамика в свободной активности кислой фосфатазы обеих систем выявлена у рептилий, птиц, млекопитающих и активность каспазы3 у всех групп животных за исключением амфибий. Более низкую активность в системе in vivo проявляет активность каспазы3 у амфибий, а активность свободной кислой фосфатазы у амфибий и рыб.

В экспериментах по анализу прямого действия гипертермии на гепатоциты выявлено увеличение количества погибших гепатоцитов во всех культурах, и в большей мере в культурах эндотермных животных (А. В. Седых, 2004). Основной формой гибели гепатоцитов рыб является апоптоз; в культурах амфибий и рептилий увеличение количества хехст-позитивных и пропидиумиодид-позитивных гепатоцитов отмечается в равных долях; в культурах птиц и млекопитающих в большей мере увеличивается количество пропидиумиодид-позитивных гепатоцитов (Y. Ichimura, 2004). В культурах рыб и млекопитающих наблюдается максимальное снижение индекса пролиферации, в культурах птиц индекс пролиферации соответствует показателям интактных культур.

Если сравнивать динамику изменения активности ферментов митохондрий в двух системах после перегревания, то выявлено, что разнонаправленно проявляется активность у рыб и птиц митохондриальных МДГ и ИДГ(НАДФ). У амфибий и млекопитающих отличия проявляются по двум показателям – ИДГ(НАД) и МДГ(НАД и НАДФ). Самое большое количество отличий выявлено в активности оксидоредуктаз рептилий – ИДГ (НАД), МДГ (НАД и НАДФ). Остальные реакции ферментов ЦТК проявляют сходную динамику в обеих системах, отражая направление развития системы эволюционной зависимости в регуляции функций митохондрий. Следовательно, все ферменты митохондрий имеют древнее эволюционное происхождение и максимально адаптированы к одинаково эффективной работе в живых организмах с различной системой терморегуляции (J. Das, 2006; B. Ulrich, 2006).

В модели in vitro в культурах гепатоцитов рыб, в большей мере проявляется увеличение активности ИДГ(НАД) цитозоля, в отличие от модели in vivo, где активность фермента значимо не менялась. Увеличение активности НАДФ-зависимой МДГ, по-видимому, компенсирует недостаток восстановленных эквивалентов, т.к. активность Г-6-ФДГ значимо не меняется и соответствует контрольным показателям (E. Rissanen, 2006). Активность ИДГцит (НАДФ) амфибий увеличивается, а в модели in vivo снижалась. По всей видимости, у данной группы животных увеличение активности фермента так же носит компенсаторный характер. В культурах гепатоцитов рептилий активность ИДГцит(НАДФ) снижается, и в отличие от первых двух групп животных активность фермента Г-6-ФДГ увеличивается, так же увеличивается активность МДГ(НАДФ) цитозоля (K. Mounaji, 2003).

В культурах гепатоцитов птиц снижается активность ИДГ(НАДФ) цитозоля, тогда как в модели in vivo активность фермента не менялась в сравнении с контролем; так же как в модели in vivo, увеличивается активность Г-6-ФДГ.

Активность ферментов НАД и НАДФ-зависимой ИДГ цитозоля увеличивается в культурах гепатоцитов млекопитающих (в модели in vivo увеличивалась активность только НАДФ-зависимой формы); примерно равноценно в обеих моделях снижается активность МДГ(НАД) цитозоля.

Активность ЛДГ, за исключением амфибий, так же как и в модели in vivo, увеличивается во всех клеточных культурах (Ю. В. Зимин, 2001; М. Nikinmaa, 2002; A. M. Neyrinck, 2005; K. Augoff, 2004).

Активность каспазы3 в модели in vitro у эктотермных видов животных и птиц значительно выше в сравнении с моделью in vivo. У млекопитающих значимого изменения в активности фермента в условиях in vitro не выявлено, а в модели in vivo она увеличивается. Динамика изменения свободной активности кислой фосфатазы в обеих моделях у эктотермных животных та же что и у каспазы3. В группе птиц в системе in vitro активность фермента соответствует контрольным показателям, а у млекопитающих увеличивается.

Изменяется соотношение активности ферментов. Так если у интактных культур гепатоцитов рыб (в отличие от модели in vivo) соотношение свободной активности кислой фосфатазы и каспазы3 составляет 0,8. После перегревания, так же как и в модели in vivo, соотношение увеличивается до 1,1.

У гепатоцитов in vitro амфибий в контроле (так же как и у рыб), свободная активность кислой фосфатазы выше в сравнении с активностью каспазы3, соотношение составляет 0,9, та же тенденция проявляется и в модели in vivo. После перегревания,

Рис. 13. Активность ферментов Carassius auratus gibilio в системе in vivo Активность ферментов Carassius auratus gibilio в системе in vitro

Рис. 14. Активность ферментов Rana terrestris в системе in vivo  Активность ферментов Rana terrestris в системе in vitro

Рис. 15. Активность ферментов Trachemys scripta elegans в системе in vivo  Активность ферментов Trachemys scripta elegans в системе in vitro

Рис. 16. Активность ферментов Columba livia в системе in vivo Активность ферментов Columba livia в системе in vitro

Рис. 17. Активность ферментов Rattus norvegicus в системе in vivo  Активность ферментов Rattus norvegicus в системе in vitro

за счет большего увеличения активности каспазы3 соотношение увеличивается до 1,5.

У гепатоцитов in vitro рептилий в контроле выявляется то же соотношение в активности ферментов, что у первых двух групп животных, которое составляет 0,3. После перегревания соотношение увеличивается до 0,8.

Превышение свободной активности кислой фосфатазы над активностью каспазы3 интактных гепатоцитов in vitro наблюдается и у млекопитающих, соотношение при этом составляет 0,6, после перегревания оно сохраняется. Отличительной группой обеих моделей является группа птиц, у которых и в контроле и в эксперименте выявляется резкое превышение активности каспазы3 над свободной активностью кислой фосфатазы. Соответственно соотношение в контроле равно 5, после перегревания практически не меняется и составляет 5,7.

После гипертермии у всех изучаемых культур гепатоцитов in vitro выявлены общие мозаичного характера проявления реорганизации ультраструктуры гепатоцитов во многом сходные с таковыми в модели in vivo (W.T. Willis, 2000).

Выявленная сходная динамика в количестве погибших клеток и соотношение путей ПКГ в обеих моделях эксперимента отражает уровень биологических потенций гепатоцитов выработанных в эволюции, что позволяет в условиях гипертермии поддерживать и сохранять органоспецифическую дифференцировку и способность проявлять свойственные им гистогенетические потенции в условиях in vitro. Выявленные нарушения и модификации биохимических реакций в биологической системе иерархии обеспечивают поддержание гомеостаза на высших уровнях за счет одновременного функционального участия множества элементов низшего уровня, параметры которых обладают «менее гомеостатируемым» статусом. «Компенсация интенсивности метаболизма», как форма обеспечения метаболического гомеостаза организма, обеспечивает поддержание колебания метаболических реакций (В. Б. Молодцов, 2001). Выявленные реакции носят гомеостатический характер, и во многом определяют скорость, масштабы, способы и эффективность последующих этапов репаративной регенерации в печени изучаемых видов животных (Н. Д. Озернюк, 2003; M. J. Angilletta, 2002; A. N. Rice, 2006).

ВЫВОДЫ:

1. Гистологическое строение печеночного ацинуса в сравнительном ряду животных изменяется от трубчатого типа (рыбы, амфибии, рептилии) к трубчато-трабекулярному (птицы) и трабекулярному (млекопитающие). От экто- к эндотермным животным увеличиваются количественная плотность печеночных ацинусов, апоптоз/некрозные соотношения, количество и уровень компактизации эу- и гетерохроматина гепатоцитов, формируется порто-венулярный градиент размеров ядер гепатоцитов.

2. В сравнительном ряду позвоночных животных не выявлено особенностей в локализации двуядерных, PCNA-позитивных гепатоцитов, в то время как структура этих клеток имеет видовую специфичность по количественным показателям размеров ядер, строению ядрышкового аппарата, митохондрий, ГЭС, лизосом, по содержанию гликогена и липидов. Типичные стромальные клетки печени (пероксидазо-позитивные клетки Купфера, десмин-позитивные клетки Ито) имеют видоспецифический характер распределения в органе. Характерным способом физиологической регенерации гепатоцитов у млекопитающих является полиплоидизация за счет ацитокинетических митозов, у птиц одноядерные полиплоидные гепатоциты, у эктотермных оба способа в равной мере. Максимальное количество гибнущих гепатоцитов выявлено у рептилий, а минимальное у рыб и млекопитающих, из которых хёхст-позитивные гепатоциты составляют от 62-70%, и обратная тенденция выявлена у амфибий.

3. У интактных рыб соотношение НАД- и НАДФ-зависимых путей окисления в митохондриях, а у амфибий НАД- и НАДФ-зависимые митохондриальные пути окисления выражены в одинаковой степени; у рептилий и птиц установлена более высокая активность НАДФ-зависимых, а у млекопитающих НАД-зависимых дегидрогеназ. Наибольшая активность биохимических маркеров путей гибели гепатоцитов выявлена у птиц, наименьшая у амфибий и рыб. Содержание ионов видоспецифично.

4. Гипертермия у всех групп животных вызывает нарушение кровоснабжения печеночного ацинуса, смену форм регенерации. Увеличивается количество и меняется топография стромальных клеток печени, характер цитокоммуникаций согласно пространственным особенностям ацинуса.

5. Гипертермия изменяет структуру клеточного цикла гепатоцитов: в группе «амфибии/птицы» увеличивается количество гепатоцитов в G0-G1-стадии клеточного цикла, а в группе «рыбы/рептилии/млекопитающие» в S- и в G2-M-стадии. Увеличивается количество гиподиплоидных гепатоцитов у всех групп животных, основным путем гибели становится некроз/аутофагия.

6. Ультраструктурные изменения гепатоцитов носят мозаичный и разнонаправленный характер. Изменяются объемная, численная и поверхностная плотность митохондрий, ядрышкового аппарата, ГЭС, лизосом, соотношения «липогенез/гликогенолиз». Отмечается активация стромальных клеток печени, которая проявляется в увеличении их количества, трансформации клеток Ито в миофибробласты и в увеличении в клетках Купфера аутофаголизосом и фрагментов клеточного детрита.

7. Гипертермия у рептилий вызывает увеличение активности НАД- и НАДФ-содержащих оксидоредуктаз митохондрий, у млекопитающих НАДФ-содержащих, у рыб НАД-содержащих, что отражает развитие гиперкатаболизма. У птиц и амфибий угнетается активность митохондриальных НАД- и НАДФ-зависимых оксидоредуктаз, отражая развитие гипометаболизма. Видовые отличия проявляют активность цитозольных оксидоредуктаз, содержание ионов, активность биохимических маркеров пролиферации и путей гибели гепатоцитов.

8. В нашем эксперименте видовые особенности культивирования гепатоцитов касаются этапов выделения и культивирования, индекса пролиферации, апоптоз/некрозного соотношения. Метаболическая адаптация интактных гепатоцитов к системе in vitro у рыб и птиц обеспечивается снижением активности оксидоредуктаз митохондрий; у амфибий снижением активности НАД-содержащих, у млекопитающих НАДФ-содержащих оксидоредуктаз митохондрий; у рептилий активизируются как НАД- так и НАДФ-зависимые оксидоредуктазы ЦТК. В цитозольной фракции снижается активность оксидоредуктаз (за исключением птиц и амфибий). Сравнение метаболических показателей in vitro и in vivo свидетельствует о более выраженном воздействии регуляторных систем организма у млекопитающих и рептилий на активность оксидоредуктаз и уровень биохимических маркеров путей гибели и пролиферации гепатоцитов.

9. Прямое действие гипертермии на клеточные культуры гепатоцитов выявило увеличение активности НАД- (рыбы) и НАДФ-зависимых (млекопитающие) или обеих форм оксидоредуктаз митохондрий (рептилии), отражая активацию катаболизма. Снижение активности НАД- и НАДФ-зависимых оксидоредуктаз митохондрий птиц и амфибий характеризует развитие гипометаболизма. Биохимические маркеры путей гибели гепатоцитов выявили, что ведущей формой гибели гепатоцитов у рыб является апоптоз, у амфибий и рептилий - апоптоз/некроз; у птиц и млекопитающих - некроз/аутофагия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

  1. Антонова Е.И., Мкртчан О.З., Высокогорский В.Е., Чернявская Т.С. Сопряженность метаболических и структурных показателей печеночного ацинуса в условиях моделирования этаноловой интоксикации. / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан, В.Е. Высокогорский, Т.С. Чернявская // Материалы научной конференции, посвященной 150 – летию П.М. Альбицкого «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов». С-П. 2003. – С. 7-9.
  2. Мкртчан О.З., Антонова Е.И., Чернявская Т.С., Тысло Л.Ю. Микроциркуляторное русло и репродукция эпителия печени птиц на разных стадиях онтогенеза после однократного перегревания. / О.З. Мкртчан, Е.И Антонова, Т.С. Чернявская, Л.Ю. Тысло // Морфология. 2005.- №4.- С.-109-110.
  3. Антонова Е.И «Текстурный анализ» хроматина гепатоцитов черепахи вида Trachemys scripta elegans в зависимости от фазы клеточного цикла в норме и после гипертермии. / Е.И. Антонова // Вестник Челябинского государственного педагогического университета. 2006.- №5.- С.217-229.
  4. Антонова Е.И. Ранние, репаративные, срочно реализуемые реорганизации субклеточных структур клеток печени птиц вида Columbia livia после гипертермии. / Е.И. Антонова // Морфологические ведомости. 2007.- №3-4. С. 5-8.
  5. Антонова Е.И Стромально-паренхимные и ультрамикроскопические проявления первичной компенсаторно-приспособительной реакции печени млекопитающих после гипертермии. / Е.И. Антонова // V научная международная конференция «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» Таиланд (Паттайа). Фундаментальные исследования. 2008.- №1.- С.138-140.
  6. Антонова Е.И Морфометрические показатели ультраструктурных проявления репаративной регенерации в печени черепах вида Trachemys scripta elegans после действия гипертермии. /Е.И. Антонова // Вестник Российского государственного университета им. И Канта. Вып.7: Серия естественные науки.- Калининград: РГУ. 2008.-С. 67-75.
  7. Антонова Е.И. Ультраструктурные проявления первичной компенсаторно-приспособительной реакции гепатоцитов животных с различной системой терморегуляции после воздействия гипертермии / Е.И. Антонова // Морфология. 2008.- №4.- С.24-28
  8. Антонова Е.И. Стромально-паренхимные проявления регенерации печени рыб Сarassius auratus gibelio после гипертермии / Е.И. Антонова // Морфологические ведомости. 2008.- №1-2. С.8-11.
  9. Антонова Е.И. Динамика показателей клеточного цикла гепатоцитов амфибий вида Rana terrestris индуцируемая тепловым стрессом как проявление первичной компенсаторно-приспособительной реакции организма / Е.И. Антонова // Вестник Оренбургского государственного университета. 2008.- №3.- С. 122-129.
  10. Антонова Е.И Стратегия структурно-метаболической адаптации первичной компенсаторно-приспособительной реакции гепатоцитов Columbia livia после гипертермии /Е.И. Антонова // Сибирский экологический журнал. 2009.- №3.- С. 413-422.
  11. Антонова Е.И Механизмы краткосрочной тепловой компенсаторно-приспособительной реакции печени рыб вида Carassius aurata gibelio /Е.И. Антонова // Сибирский экологический журнал. 2010. №1.- С.  (в печати)
  12. Колпакова Т.Ю., Антонова Е.И., Мкртчан О.З., Рудакова С.В. Некоторые структурные особенности Emberiza leucocephala в зависимости от биотопического распределения в Омской области. / Т.Ю. Колпакова, Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан, С.В. Рудакова // Сб. тр. «Актуальные проблемы изучения и охраны птиц Восточной Европы и Северной Азии». Казань.- 2001. С.304-305.
  13. Мкртчан О.З., Антонова Е.И., Плешакова В.И., Бизина А., Чернявская Т., Щербань Е. Особенности роста гепатоцитов in vitro в различных средах культивирования после воздействия повреждающих факторов. / О.З. Мкртчан, Е.И. Антонова, В.И. Плешакова, А. Бизина, Т.С. Чернявская, Е. Щербань // Материалы научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития науки в институте ветеринарной медицины ОмГАУ». Омск: ИВМ ОмГАУ.- 2002.-С. 162-168.
  14. Антонова Е.И., Высокогорский В.Е., Мкртчан О.З., Лопухов Г.А. Ферментно - структурные корреляции печени после моделирования термального стресса. / Е.И. Антонова, В.Е. Высокогорский, О.З. Мкртчан, Г.А. Лопухов // Труды Всероссийской конференции: «Проблемы медицинской энзимологии», «Современные технологии лабораторной диагностики XXI века». Международный симпозиум «Пиридоксальфосфат – зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина».- Москва, «Акваиздат».- 2002.- С. 18-19.
  15. Антонова Е.И., Мкртчан О.З., Высокогорский В.Е. Морфо-функциональные показатели печеночного ацинуса и периферической крови в условиях действия этаноловой интоксикации. / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан, В.Е. Высокогорский // Межрегиональная научная конференция: «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии». Томск: Сибирский госмедуниверситет.- 2002.- Вып. 2- С. 85-87.
  16. Антонова Е.И., Высокогорский В.Е., Мкртчан О.З. Активность дегидрогеназ и морфометрические индексы в печени при алкоголизации в условиях термального стресса. / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан, В.Е. Высокогорский // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии». Томск: МГП «РАСКО».- 2003. С. 17-21.
  17. Антонова Е.И., Мкртчан О.З., Высокогорский В.Е. Индукция протективного действие этанола в условиях комбинированного действия стресс факторов. / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан, В.Е. Высокогорский // Сборник науч. работ «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии». Томск.-2004.- Т.3, №1. С. 130-132.
  18. Мкртчан О.З. Антонова Е.И. Чернявская Т.С. Некоторые морфометрические показатели сосудов печеночного ацинуса птиц в онтогенезе после однократного термального стресса. / О.З. Мкртчан, Е.И. Антонова, Т.С. Чернявская // Материалы III региональной научной конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды. Челябинск.- 2004.- С. 302-305.
  19. Антонова Е.И., Мкртчан О.З., Высокогорский В.Е. Реактивные и пластические свойства тканевых компонентов печени млекопитающих в условиях многократного термального стресса. / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан, В.Е. Высокогорский // Всероссийская научная конференция, посвященная памяти А.А. Никифоровой. Омский научный вестник. 2004.- №1. Вып. 26.- С. 198-201.
  20. Антонова Е.И. Внутрисистемные и внесистемные ассоциации, индуцированные алкогольной интоксикацией у млекопитающих. / Е.И. Антонова // Материалы международного научного эмбриологического симпозиум «Югра-Эмбрио. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных». Ханты-Мансийск. 2004.- С. 185-189.
  21. Антонова Е.И. Специфичность проявления первичной тепловой устойчивости у эвритермных и стенотермных животных. / Е.И. Антонова // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Клинико - морфологические аспекты общепатологических процессов при социально-значимых заболеваниях» посвящается М.Я. Субботину и Ю.Г. Целлариусу. Новосибирск. 2004. - С. 70-71.
  22. Антонова Е.И., Мкртчан О.З., Высокогорский В.Е. Апоптоз-некрозное соотношение в клеточных культурах гепатоцитов позвоночных животных после тепловой нагрузки / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан, В.Е. Высокогорский // Сборник научных трудов VII Всероссийская конференция по патологии клетки. 2004.-С. 11-12.
  23. Мкртчан О.З., Антонова Е.И., Чернявская Т.С. Репаративная регенерация гепатоцитов и морфометрические показатели микроциркуляторного русла печени птиц после однократного теплового шока / О.З. Мкртчан, Е.И. Антонова, Т.С. Чернявская // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Клинико - морфологические аспекты общепатологических процессов при социально-значимых заболеваниях» посвящается М.Я. Субботину и Ю.Г. Целлариусу. Новосибирск. 2004. - С. 130-131
  24. Антонова Е.И., Мкртчан О.З., Высокогорский В.Е. Динамика реактивных и пластических показателей печени, у гомойо.- и пойкилотермных животных, индуцированная гипертермией. / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан, В.Е. Высокогорский // V Общероссийский съезд анатомов, гистологов и эмбриологов с международным участием. Казань. Морфологические ведомости.- 2004.- С. 6-7.
  25. Антонова Е.И. Молекулярная биология (учебное пособие) / Е.И. Антонова.-Омск: ОмГПУ, 2004.- 334с. (ISBN 5-8268-0823-3).
  26. Мкртчан О.З., Антонова Е.И., Чернявская Т.С. Морфометрические изменения в печени птиц после действия острого однократного перегревания. / О.З. Мкртчан, Е.И. Антонова, Т.С. Чернявская // Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных: материалы Междунар.науч.конф.-Саранск: Мордов.ун-т. 2005.- С.163-165.
  27. Антонова Е.И., Тысло Л.Ю., Регер Е.Н., Щербаков Д.В. Эпителио - мезинхимальные взаимодействия цитотипов печени и апоптоз / некрозное соотношение у позвоночных животных в сравнительном эволюционном ряду. / Е.И. Антонова, Л.Ю. Тысло, Е.Н. Регер, Д.В. Щербаков // Научные материалы  XIX научного совещания гистологов «Актуальные проблемы учения о тканях» С-П.-2006.- С. 9-10.
  28. Антонова Е.И. Динамика паренхимо-непаренхимных цитокоммуникативных взаимоотношений в печени Muridae Rattus norvegicus в условиях физиологической нормы и после воздействия гипертермии. / Е.И. Антонова // II Междун. эмбриологическом симпоз. «Югра-Эмбрио-2006. Закономерности эмбрио - фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных». Х-М.- 2006.- С. 12-14
  29. Антонова Е.И., Мкртчан О.З., Белецкая Е.Я., Регер Е.Н., Щербаков Д.В. Ультраструктурные проявления первичной тепловой устойчивости в гепатоцитах животных с различной системой терморегуляции и экологической специализации. / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан, Е.Я. Белецкая, Е.Н. Регер, Д.В. Щербаков // Сборник научных трудов «Естествозниние и гуманизм» - Томск.- 2006.- Т.3. №1.- С. 114-115.
  30. Антонова Е.И. Текстурно - цитофотометрические показатели хроматина в зависимости от фазы клеточного цикла гепатоцитов черепахи вида Trachemys scripta elegans в норме и после гипертермии. / Е.И. Антонова // Омская биологическая школа. Межвузовский сборник научных трудов. Омск: ОмГПУ. 2006. Вып.3.- С. 72-77.
  31. Антонова Е.И., Мкртчан О.З. Регенерация печени позвоночных животных с различной системой терморегуляции после гипертермии / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан // Всероссийская научная конференция «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвященную памяти член корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко. Оренбург. Морфология. 2008.- №3.- С. 19.
  32. Антонова Е.И., Мкртчан О.З. Динамика пространственно-топографического становления ранних этапов регенерации в печени птиц вида птиц после гипертермии / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан // Международная гистологическая конференция «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» посвященная П.В. Дунаеву. Морфология.- 2008.- № 2.- С.
  33. Антонова Е.И., Мкртчан О.З. Динамика цитокоммуникаций у млекопитающих Muridae Rattus norvegicus индуцируемые гипертермией / Е.И. Антонова, О.З. Мкртчан // IX международной ассоциации морфологов и IV съезде ассоциации морфологов Узбекистана. Бухара. Морфология. 2008.- №2.- С. 11.
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.