WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 
  На правах рукописи

АЛИЕВА Елена Васильевна

Разработка лабораторных экспресс-методов  и технологии производства иммунодиагностических препаратов для выявления возбудителей листериоза и кампилобактериоза

03.00.07 Микробиология

03.00.23 Биотехнология


Автореферат
диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских  наук

Москва - 2008

Работа выполнена в  Федеральном государственном учреждении здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора

Научный консультант: 

доктор медицинских наук,

профессор Тюменцева Ирина Степановна

 

Официальные оппоненты: 

доктор медицинских наук,

профессор Ильин Вячеслав Константинович

доктор медицинских наук,

профессор Митрохин Сергей Дмитриевич 

доктор биологических наук,

профессор  Владимцева Ирина Владимировна 

 

Ведущая организация: Государственное образовательное

  учреждение высшего профессио-

  нального образования Московская

  медицинская академия им. И.М.Се- 

  ченова Росздрава

Защита состоится «____»________________2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета  Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г.Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт  эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского»

Автореферат разослан «____»___________2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук С.Ю.Комбарова 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Структура инфекционной патологии человека за последние десятилетия претерпела существенные изменения, обусловленные как открытием целого ряда неизвестных ранее инфекционных агентов (возбудители ВИЧ-инфекции; гепатитов В, С и Д; геморрагических и арбовирусных лихорадок; легионеллеза и т.д.), так и изменением роли и удельного веса хорошо известных возбудителей. Ко второй группе наряду с возбудителями туберкулеза, условно патогенными бактериями широкого спектра, вызывающими гнойно-септические заболевания и пневмонии, в полной мере можно отнести кампилобактерии и листерии (Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А., 2002; Покровский В.И. и др., 2004). Хотя упомянутые микроорганизмы давно известны,  в последние годы заметно расширился удельный вес вызываемых ими инфекций, равно как и спектр их клинических проявлений.

Кампилобактериоз (вибриоз) – инфекционная болезнь животных и человека, вызываемая патогенными микроорганизмами рода Campylobacter, которые интенсивно циркулируют во внешней среде (вода, домашние и дикие животные). Анализ данных литературы показывает, что кампилобактериоз довольно широко распространен на всех континентах и во многих странах мира. Вследствие довольно широкого географического распространения, циркуляции среди животных и людей, у которых это заболевание протекает чаще всего  как токсикоинфекция, кампилобактериоз приобретает существенное социально-экономическое значение.

Листериоз относится к числу природно-очаговых инфекций. Возбудителем листериоза является грамположительная аспорогенная бактерия Listeria monocytogenes.  Листериоз у людей проявляется спорадически, но также описаны многочисленные вспышки пищевого листериоза и внутрибольничные заболевания в родильных домах. Заражение в основном происходит при употреблении в пищу инфицированных продуктов животного и растительного происхождения. 

Внимание  к листериозу возросло после расшифровки в конце 80-х годов  прошлого столетия вспышек пищевого листериоза  у людей с летальностью до 33 %  в США, Канаде, Мексике, Швейцарии, Великобритании, то есть в странах с традиционно высоким уровнем здравоохранения и технологий приготовления продуктов питания. 

Анализ состояния лабораторной диагностики как кампилобактериоза, так и листериоза позволяет предположить, что зарегистрированный уровень заболеваемости представляет лишь «вершину айсберга» и при совершенствовании организационных и методических вопросов лабораторной диагностики число зарегистрированных больных может значительно возрасти.

Ранняя лабораторная диагностика, т.е. своевременное выявление источника инфекции занимают основное место в системе противоинфекционных мероприятий. Современная микробиология характеризуется развитием диагностических технологий, основанных на глубоких фундаментальных знаниях биологии микроорганизмов и передовых инженерно-технических решениях задач автоматизации и повышения эффективности анализа (Онищенко Г.Г. с соавт., 2003). В связи с этим возникает необходимость в совершенствовании имеющихся иммунобиологических методов, создании новых экспресс-методов диагностики и индикации, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении надежности и легкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности.

Цель исследования:  научная разработка экспресс-методов лабораторной диагностики возбудителей кампилобактериоза, листериоза и создание  технологии производства медицинских иммунобиологических диагностических препаратов.

Основные задачи исследования:

1. Разработать транспортную, селективные и накопительные питательные среды для возбудителей кампилобактериоза и листериоза.

2. Подобрать эффективный метод извлечения специфических антигенов белковой природы из микробных  масс возбудителей кампилобактериоза и листериоза для использования их при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов.

3. Разработать производственные схемы получения иммунных сывороток с высокими титрами агглютининов и преципитинов и провести сравнительную оценку методов выделения из них иммуноглобулинов для дальнейшего их применения в качестве биологического сырья при производстве иммунобиологических препаратов.

4. Определить оптимальные параметры биотехнологии производства иммуноферментных и иммунофлуоресцентных кампилобактериозных и листериозных иммуноглобулиновых конъюгатов.

5. Разработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами и на их основе создать тест-системы магноиммуносорбентные, а также методики их применения в экспресс-методах лабораторного анализа.

6. Определить параметры единого режима сублимации биополимеров (биологического сырья и МИБП) с целью сохранения их исходных свойств.

7. Оценить эффективность применения разработанных диагностикумов на экспериментальном, клиническом и полевом материале.

Научная новизна работы. Унифицирована питательная основа для транспортной, селективных, накопительных питательных сред, которые позволяют успешно выделять Campylobacter jejuni и Listeria monocytogenes от людей, животных, из пищевых продуктов, объектов внешней среды.

Подобраны эффективные методы, дающие возможность получения нативных специфических водорастворимых антигенных комплексов белковой природы из биомассы кампилобактерий и листерий. 

Разработаны новые, высокоэффективные схемы иммунизации кроликов для получения специфических агглютинирующих и гипериммунных сывороток с высокими титрами.

Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства кампилобактериозных и листериозных микрогранулированных органокремнеземных иммуносорбентов с магнитными свойствами, обладающих высокой сорбционной емкостью, стабильностью, чувствительностью, специфичностью.

Впервые сконструированы кампилобактериозные и листериозные магноиммуносорбентные тест-системы для иммуноферментного (ИФА) и количественного иммунофлуоресцентного (КИФА) анализов, позволяющие исследовать пробы из внешней среды с высокой степенью загрязнения неограниченного объема, низкой концентрацией патогена, с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей традиционные.

Материалы выполненных исследований легли в основу двух патентов РФ на изобретение № 2135210 от 27.08.1999 г. «Способ получения диагностической сыворотки» ; № 2290641 от 27.12.2006 г.  «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)».

Практическая значимость работы.

Разработаны накопительные питательные среды с соответствующими добавками для наращивания биомасс кампилобактерий и листерий.

Подобраны эффективные методы и приемы по извлечению антигенного материала, получению иммунных сывороток и выделению иммуноглобулинов.

Оптимизация параметров конъюгации лигандов и маркеров позволили унифицировать биотехнологию производства ряда МИБП для экспресс-диагностики кампилобактериоза и листериоза, индикации их возбудителей (эритроцитарные, иммуноферментные, иммунофлуоресцентные), стабильно отвечающие общим медико-биологическим требованиям (ОМБТ), предъявляемым к индикационным препаратам.

Разработан единый ускоренный экономичный режим стабилизации биологического сырья и МИБП методом сублимации, позволяющий сохранять их исходные свойства длительное время.

Таким образом, создан алгоритм технологического процесса  получения диагностических препаратов для индикации и идентификации возбудителей кампилобактериоза и листериоза, включающий в себя все этапы производства: от накопления биомассы на питательной среде до стабилизации полученных диагностических препаратов методом сублимационной сушки.

Внедрение результатов в практику.

Методики применения разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП изложены в «Методических рекомендациях по лабораторной диагностике листериоза у людей»; «Методических рекомендациях по лабораторной диагностике кампилобактериоза у людей»; «Методических рекомендациях «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях».

На диагностикумы листериозные эритроцитарные, флуоресцирующие, магноиммуносорбентные кампилобактериозные и листериозные для ИФА и КИФА составлена первичная нормативная документация (регламенты производства, фармакопейные статьи  предприятия, инструкции по применению), прошедшая экспертизу в ОБТК СтавНИПЧИ, одобренная Ученым советом (протоколы №2 от 28.02.2002 г.; №6 от 26.06.2003 г.;  № 2 от 28.02.2007 г.) и утвержденная директором института.

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по повышению первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ, семинарах для практических врачей и научных работников МЗ РФ по экспресс-диагностике инфекционных заболеваний и применению магноиммуносорбентных препаратов в мониторинге инфекционных агентов.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Предложены научно-методические подходы к получению  биологического сырья (антигенов и антител) для производства кампилобактериозных и листериозных МИБП, которые  дают возможность повысить их качество.
  2. Разработаны  методические приемы конструирования эритроцитарных, иммуноферментных, иммунофлуоресцентных диагностикумов, обеспечивающие высокую эффективность обнаружения антигенов кампилобактерий и листерий и антител к ним.
  3. Создана биотехнология изготовления кампилобактериозных и листериозных твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных органоминеральных магноиммуносорбентов; тест-системы магноиммуносорбентные для экспрессных методов иммуноанализа (ИФА, КИФА) позволяют максимально концентрировать патоген в исследуемом материале, что дает возможность  повысить разрешающуюся способность экспересс-методов.
  4. Результаты практического применения разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП, демонстрирующие повышение эффективности лабораторных исследований клинического и полевого материала.

  Апробация работы. Диссертация обсуждена  и одобрена на заседании Ученого совета ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора, протокол № 3 от 15 мая 2007 года. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научной конференции «Проблемы биологии и химии на Северном Кавказе», посвященной 70-летию биолого-химического факультета СГУ (Ставрополь, 2001); научной конференции Ставропольской медицинской академии (Ставрополь, 2002); международной научно-практической конференции «Биоресурсы, биотехнологии, инновации Юга России», 21-24 октября 2003 г. (Ставрополь-Пятигорск); научно-практической конференции «Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагополучия и защите прав потребителей (Ставрополь, 2005);

II съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации на базе Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова 15-17 ноября 2006 г. (Санкт-Петербург).

Основное содержание диссертации,  выполненной в рамках 3 НИР, отражено в 37 научных публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,  6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, приложений.

Она изложена на 245 страницах, содержит 24 таблицы  и 28 рисунков. Список литературы включает 295  отечественных и 196 зарубежных литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе использованы 33  штамма микроорганизмов  II, III, IV групп патогенности родов: Campylobacter,  Listeria, Yersinia, Salmonella, Vibrio, Staphylococcus, Escherichia.

Использованы 35 кроликов породы «Шиншилла». При выполнении  работы  обследовано 800 человек  (от  них 920 проб), исследованы  931 проба от животных и птиц, 1005 проб из объектов внешней среды, в том числе 275 – пищевых продуктов, 280 – воды, 200  - почвы, 20 – сточных вод птицефабрик, 50 смывов с технологического оборудования и 20 проб промывных вод  сырного производства.

Антигены микроорганизмов изолировали водно-солевой экстракцией с последующей ультразвуковой дезинтеграцией микробных клеток. Дезинтегрирование осуществляли  на аппарате УЗДН -2Т (Россия).

Иммунизацию животных проводили с применением иммунокорректоров тималина, циклофосфана  и тимогена.  Контроль титра специфических антител в сыворотках определяли в непрямой реакции иммунофлуоресценции по T.H.Weller, A.H.Coons (1954). Для осаждения белков использовали сульфатный метод  (Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1980); метод фракционирования белковых смесей с использованием высокомолекулярного, незаряженного, линейного полимера – полиэтиленгликоля - 6000  (ПЭГ) по A.Polson и др. (1964). Иммуноглобулины также преципитировали каприловой (октановой) кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969).

Количественное определение белка проводили по методу O.Warburg  и  W.Christian (1941) сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).

Специфическую активность антигенов микроорганизмов и полученных иммунных сывороток определяли в реакции иммунодиффузии в 1 % агаровом геле (Difco, USA) по O. Ouchterlony (1949).

Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных каприловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1974),  с флуоресцеином изотиоцианатом (ФИТЦ)  фирмы «Sigma» проводили по X.Шторц (Stortz, 1987). Прямой метод окраски препаратов осуществляли по A.H.Coons, M.H. Kaplan (1950). Очистку конъюгатов от непрореагировавшего флуорохрома осуществляли  методом восходящей хроматографии на бумаге (Носков Ф.С., 1985).

Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.К.Nakane, А.Kawaоi (1974) в модификации Е.А.Ткаченко  с соавт.  (1982). Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике M.Clark и A.Adams (1977) в “сэндвич”- варианте ИФА. Очистку конъюгатов от несвязавшихся иммуноглобулинов и фермента проводили на хроматографической колонке фирмы LKB, используя сефадекс G-100.

Микроструктуру поверхности магносорбентов (МС) определяли на сканирующем электронном микроскопе (1М2-Т3000, Япония) по методу, описанному в работе Д.Фрайфелдера (1980), удельную поверхность МС -  по  методу  А.А.Клячко-Гурвича  (1961),  основанному на низкотемпературной адсорбции азота.  Суммарный объем  и  радиус пор определяли по  методу Н.В.Кельцева (1984). Количественный иммунофлуоресцентный анализ  проводили по методу К.Г.Стоева, В.А.Чибисовой, К.Л.Шаханиной (1981). 

  Сублимацию проводили в камерах TG-5 (Германия) и LZ-9c (Чехия).

Математическую обработку результатов экспериментов осуществляли  на компьютере (программа EXCEL). Для подтверждения достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы (Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П., 1969; Скуч Д.,  Уэст Д., 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ

  Конструирование  питательных сред  для кампилобактерий

и листерий

Взяв за  питательную основу мелассу свекловичную, мы сконструировали  транспортную, селективные и накопительные питательные среды, в которых учтены  биологические особенности кампилобактерий и листерий. Транспортная среда для кампилобактерий и листерий представляет собой основу, содержащую 0, 05% тиогликолята натрия и 0,025 % цистеина. Селективная среда для листерий, кроме основы, содержит агар- агар микробиологический (15 г/л), дрожжевой экстракт ( 5 г/л ), глюкозу ( 1 г/л ),  глицерин безводный (10,0 г/л), лецитин соевый (1,0 г/л)  и антимикробную добавку: полимексин М ( 3 мг/л ), амфоглюкамин В ( 5 м/г ), цефазолин ( 30 мг/л ), колимицин ( 30 мг/л). Селективная среда для кампилобактерий дополнительно содержит  эритрит,  гемолизированную кровь барана или лошади (7 %) и аэ-

ротолерантную добавку (железо сернокислое, железо закисное, натрий пировинограднокислый по 0,025 %).

Для изготовления накопительных сред  ( для наращивания биомасс микроорганизмов) взята рецептура селективных сред без антимикробной добавки, в которую введен стимулятор роста – «ЭСРМ» (7±1) мг/л. Этот универсальный стимулятор роста был разработан и с успехом применен при наращивании биомассы L.monocytogenes штамма АУФ при производстве листериозной вакцины (Панова Н.В., 2006). В препарате использовано сочетание биологических потенций куриного яйца и эмбриональной ткани, которые имеют наличие широкого набора составных частей, обладающих положительным катализирующим действием на метаболизм бактерий.

В сериях опытов при засеве 100 м.к. C.jejuni 1/NCTC  11168, C.coli 602, L.monocytogenes сероваров 1/2а  и 4а на контрольных (глюкозо-глицериновый агар - для листерий, железоэритритный кровяной агар (ЖЭКА) – для кампилобактерий) при инкубации листерий при 37 0С через 24-48 часов,  а кампилобактерий – при 42 0С в микроаэрофильных условиях через 48-72 часа наблюдался рост, типичный для каждого вида микроорганизмов. Количество выросших колоний на селективных средах при вычислении среднего показателя равнялось (85,3±1,4), а на накопительных – (93,8±1,83), в то время как в контролях среднее количество выросших колоний не превышало (73,2±2,1). На накопительных питательных средах показатель прироста бактериальной  массы, вычесленный по формуле Э.М.Олиферовой (1998), в среднем составил (1,55±0,27) г/л, в то  же время на контрольных средах он был ниже: на глюкозо-глицериновом агаре  – (0,68±0,06), на ЖЭКА – (0,82±0,11) (таблица 1).

Консервирующую способность транспортной среды изучали в условиях комнатной температуры (22±2) 0С и холодильной камеры (40С). При 4 0С культуры кампилобактерий и листерий сохраняли жизнеспособность  в течение 4 – 6 суток, а при (22±2) 0С – 3-4 суток. Достоинством этой среды является её пригодность для сохранения как кампилобактеров, так и листерий, что позволяет вести поиск этих микроорганизмов в одной и той же пробе.

Разработанные среды позволили успешно выделять  патогены из материала от больных людей, животных, птицы, объектов внешней среды, а также для получения антигенов наращивать биомассы кампилобактерий и листерий в количествах, достаточных для этих целей.

Таблица 1. Сравнительное изучение ростовых свойств опытных и

контрольных питательных сред

Вид питательной среды

Количество колоний, выросших при посеве 100 м.к. (M±m)

L. monocytogenes

Campylobacter

С е р и и  п и т а т е л ь н ы х  с р е д

1

3

5

2

3

5

Селективные

питательные

среды

83,7 ± 1,4

84,5 ± 1,2

84,7 ± 1,3

88,2 ± 4,7

86,7 ± 3,2

84,5 ± 2,8

Накопительные

питательные

среды

91,2 ± 2,3

96,9 ± 4,2

93,7 ± 3,1

95,8 ± 2,4

94,5 ± 3,2

91,2 ± 1,9

Глюкозо-глицериновый агар

70,7 ± 1,08

68,9 ± 2,71

71,1 ± 1,92

-

-

-

Железоэритритный

кровяной агар

-

-

-

71,8 ± 1,8

73,2 ± 2,1

72,9 ± 1,92

*Примечание: - статистически достоверные результаты (от Р<0,001 до Р<0,1).

Использование доступного, дешевого, непродовольственного сырья в качестве основы  позволило значительно снизить себестоимость питательных сред и ускорить процедуру их приготовления, так как отпала необходимость проведения гидролиза продуктов животного происхождения, традиционно используемого при приготовлении сред.

Разработка биотехнологии получения листериозных и кампилобактериозных диагностикумов для реакции агглютинации и реакции непрямой  гемагглютинации

  Одним из доступных и простых методов индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний является реакция агглютинации. Качество агглютинирующей сыворотки зависит от высокоактивной схемы специфической иммунизации животных. Проведена серия экспериментов по отработке оптимальной схемы иммунизации с варьированием концентрации антигенов, способов, кратности и периодичности их введения. Для иммунизации животных использовали обеззараженные 1 %  раствором формалина с последующим кипячением в течение одного часа двухсуточные агаровые культуры L.monocytogenes сероваров 1/2а, 1/2в, 3а, 4а, 4в, 5, 7, доведенные до концентрации 1х109 м.к./мл по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-59-85, взятые в равных долях. Корпускулярным кампилобактериозым полигрупповым антигеном служили объединенные в равных пропорциях бакмассы из C. jejuni 1/NCTC 1168, 33291, C. coli 602, C. fetus 322, обработанные при 1000С в течение одного часа с  добавлением 1 % раствора формалина, доведенные до концентрации 1х109 м.к./мл.

  Наиболее результативной оказалась схема иммунизации, предусматривающая три способа введения антигена: внутривенный, в подушечки лап, в лимфатические узлы. Важным достоинством этой схемы является непродолжительность периода иммунизации кроликов-продуцентов, который составляет 17-18 дней, атравматичность  для них, получение высоких титров специфических антител – до 1:3200 – 1:6400. Кампилобактериозные полигрупповые сыворотки для РА оказались высокоспецифичными, в то же время полученные листериозные агглютинирующие сыворотки давали в низких титрах перекрестные реакции с гетерологичными культурами (сальмонеллами, шигеллами, стафилококками). Специфичные полигрупповые листериозные сыворотки удалось получить после проведения иммуносорбции с помощью твердофазных  ПААГ – сорбентов (таблица 2).

  Традиционным и эффективным методом диагностики инфекционных заболеваний является реакция агглютинации с применением корпускулярного диагностикума. При окраске микробных клеток  анилиновыми или други-

Таблица 2. Результаты сравнительного изучения специфической

  активности и специфичности полигрупповых агглю-

  тинирующих  адсорбированных листериозных  и

  кампилобактериозных  сывороток

пп

Наименование штаммов

микроорганизмов

Листериозные сыворотки

Кампилобактериозные сыворотки

Схемы  иммунизации

I

II

III

I

II

III

1

2

3

4

5

6

7

8

1.

L. monocytogenes 1/2a

1:6400

1:3200

1:6400

Специфическая

агглютинация

отсутствует

2.

L. monocytogenes 1/2в

1:3200

1:3200

1:6400

3.

L. monocytogenes 3а

1:3200

1:3200

1:6400

4.

L. monocytogenes 4а

1:3200

1:6400

1:6400

5.

L. monocytogenes 4в

1:3200

1:3200

1:6400

6.

L. monocytogenes 5

1:3200

1:6400

1:3200

7.

L. monocytogenes 7

1:6400

1:6400

1:6400

8.

Campylobacter jejuni

1/NCTC 11168

Специфическая

агглютинация

отсутствует

1:6400

1:3200

1:6400

9.

C. jejuni 33291

1:3200

1:6400

1:6400

10.

C. coli 602

1:3200

1:3200

1:3200

11.

C. fetus 322

1:3200

1:3200

1:3200

12-

14

Yersinia enterocolitica

178, 64, 383(9)

Специфическая

агглютинация

отсутствует

15-

17

Shigella dusenteriae 1954,

Sh. flexneri 1250,

Sh. Sonnei 396

18.

Vibrio cholerae eltor 5695,

Ogawa

19.

V. cholerae cholerae M-143, Ogawa

20-21

Salmonella typhi 818,4446

22-23

Staphylococcus epidermidis, Staph.ACCT 25923

24.

Salmonella typhimurium

25M

25.

Salm.typhiabdominalis 7407

26-27

Escherichia coli  010,011

28-33

Yersinia pseudotuberculesis 1-6 серотипы

ми  красителями реакция становится наиболее наглядной. Нами разработана биотехнология изготовления полигрупповых диагностикумов цветных листериозного и кампилобактериозного для реакции агглютинации. Из 12 испытанных красителей (малахитовый зеленый, бромкрезоловый синий, бромфеноловый синий, метилен виолет, фуксин кислый,  фуксин основной, кристалл виолет,  феноловый красный, тиомин синий, трепан синий, метилен синий, бриллиантовый зеленый) наиболее пригодным оказался бромфеноловый синий. Диагностикумы, окрашенные этим красителем, выявляли агглютинины в полигрупповых сыворотках для РА в разведении 1:1600 - 1:3200, при этом оптимальная концентрация микробной взвеси в нем – 3х109 м.к./мл (таблица 3).

При изучении специфичности использовали коммерческие агглютинирующие сыворотки: сальмонеллезную поливалентную основных (АВСДЕ) групп, туляремийную агглютинирующую сухую, холерную «О», шигеллезную дизентерийную поливалетную, бруцеллезную поливалентную.

Таблица 3. Результаты объемной реакции агглютинации цветных

  диагностикумов в зависимости от использованного

  красителя

№№

п/п

Наименование

красителя

Разведения полигрупповых агглютинирующих листериозной и кампилобактериозной сывороток

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

1:3200

1.

Малахитовый зеленый

3+

отр

отр

отр

отр

отр

2.

Бромкрезоловый

пурпурный

4+

4+

отр

отр

отр

отр

3.

Фуксин основной

4+

4+

4+

2+

отр

отр

4.

Бриллиантовый зеленый

3+

3+

3+

отр

отр

отр

5.

Бромфеноловый синий

4+

4+

4+

4+

4+

2+

6.

Метилен виолет

2+

2+

отр

отр

отр

отр

7.

Фуксин кислый

4+

4+

4+

3+

отр

отр

8.

Кристалл виолет

4+

4+

2+

отр

отр

отр

9.

Феноловый красный

4+

2+

отр

отр

отр

отр

10.

Тиомин синий

4+

3+

3+

3+

отр

отр

11.

Трепан синий

4+

4+

4+

отр

отр

отр

12.

Метилен синий

4+

4+

4+

отр

отр

отр

Со всеми перечисленными сыворотками реакция агглютинации была отрицательная.

До сих пор остаются актуальными и широко используются простые, достаточно чувствительные, не требующие применения специальной аппаратуры и потому общедоступные серологические тесты и, в частности, РНГА. При отработке биотехнологии изготовления эритроцитарных антигенных диагностикумов было необходимо решить следующие задачи: подобрать эффективную методику извлечения специфического лиганда из микробных клеток; отработать условия формалинизации эритроцитов барана; подобрать условия сенсибилизации эритроцитов специфическими антигенами. Для извлечения нативных водорастворимых антигенов листерий и кампилобактерий мы сочли целесообразным использовать режим ультразвуковой  дезинтеграции микробных клеток  в сочетании с водно-солевой экстракцией и последующим осаждением белка (Афанасьев Е.Н., 1984). Экстракция осадка 5% раствором хлористого натрия и выделение второго супернатанта позволяют в максимальной степени извлечь антигены из бактериальной массы, а фракционирование антигенов из супернатантов сульфатом аммония,  помимо концентрирования и очистки, приводит к стабилизации белков (рисунок 1).

В связи с тем, что у всех серотипов кампилобактерий имеется общий белковый антиген, содержащийся в жгутиках, а одним из важнейших поверхностных антигенов является кислоторастворимая белковая фракция (Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я., 1999), дополнительно в вышеназванную схему при получении кампилобактериозного полигруппового антигена мы ввели этап экстрагирования раствором соляной кислоты. При этом антигеный комплекс изолировали из биомасс кампилобактерий подвидов jejuni, coli, fetus.

  Полигрупповые антигены иммобилизовали на поверхности эритроцитов барана, формализованных по методу М.И.Леви с соавт. (1962), при этом активацию их поверхности проводили 2 %  раствором вторичного ал-

килсульфата натрия. Оптимальная нагрузка лигандов равнялась 1000 мкг/мл по белку при следующих условиях конъюгации: концентрация эритроцитов  -20 %; температура их связывания с сенситином – 450С; pН раствора – 5,0 в течение (18 ±2) часов.

  При контроле полученных серий эритроцитарных антигенных листериозного и кампилобактериозного диагностикумов титры специфических антител в РНГА выявлялись в разведениях 1:5120 – 1:10240. При изучении специфичности на коммерческих агглютинирующих сыворотках перекрестных реакций не наблюдалось.

Конструирование листериозных и  кампилобактериозных полигрупповых иммуноглобулиновых  флуоресцирующих и иммунопероксидазных коньюгатов

Для экспресс-индикации возбудителей кампилобактериоза и листериоза нами изготовлены полигрупповые флуоресцирующие и иммунопероксидазные конъюгаты.  При их получении было необходимо иметь высокока-

чественное сырье – высокоспецифичную и высокоактивную гипериммунную сыворотку.

С учетом накопленного опыта и теоретических предпосылок ранее мы предложили и экспериментально обосновали схему иммунизации животных-продуцентов гипериммунных сывороток: антигенный материал  пятикратно

вводили  внутривенно, одновременно внутримышечно в качестве иммуномодулятора инъецировали  тималин, в третью инъекцию  дополнительно  вводили внутримышечно циклофосфан (N1- бис/-хлорэтил)- N1-O-триметиловый эфир диамида фосфорной кислоты) (таблица 4). 

Таблица 4. Схема иммунизации кроликов с применением

иммуномодуляторов тималина и циклофосфана

инъекции

Интервал

между

инъекциями

сутки

Количество вводи-

мого антигена,

мкг

Способ введения

антигена

Иммуномодуляторы

Тималин

Циклофосфан

Листе-

риозный

Кампи-

лобакте

риозный

Доза,

мг

Способ

введе-

ния

Доза,

мг

Способ

введе-

ния

1

-

1000

1000

в/в

5

в/м

-

-

2

6-7

1250

1250

в/в

5

в/м

-

-

3

6-7

1500

1500

в/в

5

в/м

100

в//м

4

6-7

1750

1750

в/в

5

в/м

-

-

5

6-7

2000

2000

в/в

5

в/м

-

-

Использование в качестве иммуномодулятора тималина способствует значительному повышению титров специфических сывороток антител за счет увеличения числа антителообразующих клеток в результате стимуляции функции макрофагов и хелперных Т-клеток. Циклофосфан, являясь классическим иммуносупрессором, также активизирует макрофаги, стимулируя фа-

гоцитарную, цитотоксическую и супрессивную (в отношении главным образом Т- лимфоцитов) функции (Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985). Такая избирательность в действии иммуностимулятора, с одной стороны, и определенная селективность в действии иммуносупрессора – с другой, служат оптимальной комбинацией препаратов обеих групп и режимов их использования для активации одних механизмов иммунитета и выключения других.

При данном способе продолжительность цикла иммунизации составляла 31-35 дней, расход антигенного материала – 7550 мкг на одного кролика. Титры специфических антител в сыворотках животных-продуцентов при определении в РИД достигали показателей 1:15,4 ± 1, 25 – 1:28,8 ± 2,5, а в НРИФ – не ниже 1:13926,4 ± 1372,16.

Такие характеристики соответствовали требованиям оценки сырья для производства иммунобиологических препаратов. Материалы защищены патентом РФ на изобретение № 2135210 «Способ получения диагностической сыворотки» (Бюл. №24 от 27.08.99).

Дальнейшее проведение исследований позволило нам предложить новую схему гипериммунизации кроликов с одним иммунокорректором – тимогеном, при этом удалось значительно снизить антигенную нагрузку при иммунизации.

Применение тимогена сопровождается мобилизацией регуляторных и эффекторных механизмов адаптации организма к воздействию ксенобиотических факторов. Эффекты препарата на клеточном уровне включают в себя специфическое связывание с мембраной лимфоцитов, активацию систем вторичных посредников и регуляцию функционального состояния лимфоидных клеток через цАМР-зависимые протеикиназы. Важно отметить, что доза тимогена, при которой наблюдается усиление процессов дифференцировки лимфоидных клеток и экспрессия рецепторов на лимфоцитах, в 10-1000 раз меньше, чем в природных препаратах вилочковой железы, в том числе и тималина (Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 1982, Демидов С.В., Костромин А.П., Чернушенко Е.Ф. и др., 1990; Морозов В.Г., 1990).

Схема иммунизации состояла из следующих манипуляций: кроликам-продуцентам вводили внутривенно  каждые пять дней водорастворимые полигрупповые антигенные комплексы листерий и кампилобактерий в увеличивающихся дозах. В эти же сроки внутримышечно  инъецировали по 10 мкг тимогена. На 7-10 день после последнего введения иммуногена животных кровопускали (таблица 5).

Активность гипериммунных сывороток, полученных по этой схеме, в РИД составляла 1: 28,8 ± 2,5 – 1:53,3 ± 5,01, в НРИФ – 1:13926,4 ± 1372,16 – 1:24576 ± 2744,32.

Таблица  5. Схема иммунизации кроликов с применением тимогена

инъекции

Интервал между инъекциями, сутки

Количество вводимого

антигена, мкг

Способ

введения

антигена

Тимоген

Листериозный

Кампило-

бактериоз-

ный

Доза,

мкг

Способ

введения

1

-

30

30

в/в

10

в/м

2

5

60

60

в/в

10

в/м

3

5

120

120

в/в

10

в/м

4

5

240

240

в/в

10

в/м

Благодаря применению иммунокорректора тимогена, обладающему полифункциональным действием, значительно сокращены дозировки вводимого антигенного материала (с 7550 мкг до 450 мкг), иммунокорректора – в 500 раз, длительность процесса иммунизации с 35 дней до 22 дней, при этом повышен выход целевого продукта за счет увеличения антителообразования у животных-продуцентов с одновременным уменьшением трудозатрат.

  При сравнительном анализе методов выделения специфических иммуноглобулинов класса G (сульфатом аммония, каприловой кислотой, полиэтиленгликолем – 6000) и дальнейшей их метке флуорохромом и ферментом оказалось, что наиболее активные флуоресцирующие конъюгаты были получены при использовании IgG, выделенные каприловой кислотой, а энзиммеченные – IgG -  полиэтиленгликолем. При этом для повышения специфичности листериозных полигрупповых иммуноглобулиновых конъюгатов были использованы F(ав)2 – фрагменты, выделенные из соответствующих IgG ферментативным гидролизом в кислой среде. Разработанные биотехнологии позволили получать высокоактивные, чувствительные и специфичные диагностические препараты, отвечающие ОМБТ, предъявляемым к подобным диагностикумам.

Разработка тест-систем магноиммуносорбентных для экспресс-диагностики кампилобактериоза и листериоза в иммуноферментном анализе и количественной реакции иммунофлуоресценции

 

  Эффективность ряда методов индикации и выделения возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов может быть значительно увеличена после предварительного концентрирования микробов и антигенов с отделением их от контаминирующей микрофлоры и примесей. Эта цель может быть достигнута путем применения методов иммуносорбции, особое место среди которых занимают методы с использованием сорбентов с магнитными свойствами. Магноиммуносорбенты служат в качестве  твердой фазы для селективного концентрирования на их поверхности патогенов (Брыкалов А.В., Жарникова И.В., 1995; Тюменцева И.С., 1996; Ефременко В.И., 1996; Афанасьев Е.Н., 2000; Yu H., 1998; Jaykus Lee, 2000).

  Нами впервые разработаны кампилобактериозные и листериозные  магноиммуносорбенты на основе органокремнезема – алюмосиликата, модифицирование поверхности которого осуществляли в присутствии полимера – декстрана и поверхностно-активного вещества – вторичного алкилсульфата натрия. Для придания сорбенту магнитных свойств в его состав вводили оксид железа. Для оптимизации структурных характеристик МС проведены исследования по варьированию состава компонентов синтеза (алюмосиликат, полиглюкин, F2O3), а также изучено влияние времени гелеобразования и pH среды на величину удельной поверхности сорбента, объем и размер пор (таблица 6). На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оптимальные условия получения алюмосиликатных МС: соотношение компонентов синтеза 1:1:2, соответственно алюмосиликат, декстран, F2O3; время гелеобразования - 2 часа, рН гелеобразования – 7,0. Исследование удельной поверхности  показало, что сорбент, не содержащий в своем составе F2O3, имеет удельную поверхность – 58 м2/г, объем пор – 1,70 см3/г, радиус – 42,5 нм. Введение оксида железа в структуру кремнеземного сорбента изменяет его структурные характеристики: удельная поверхность имеет значение 18 м2/г, объем пор – 1,19 см3/г, радиус пор – 132,2 нм.

Таблица  6. Структурные характеристики МС в зависимости от количества Fe2O3 и времени гелеобразования

Массовое соотношение компонентов синтеза

Время гелеобразо-

вания, ч

Удельная поверх-

ность, м2/г

Объем пор,

см3/г

Радиус пор,

нм

Al – SiO2

декстран

Fe2O3

2,5

2,5

0,5

2

25,6±0,5

1,23±0,08

95,3±0,08

8

27,6±0,49

1,23±0,008

93,3±0,06

2,5

2,5

1,0

2

24,8±0,64

1,23±0,005

97,6±0,49

8

28,5±0,51

1,23±0,007

95,7±0,12

2,5

2,5

1,5

2

24,3±0,48

1,21±0,008

101,6±0,12

8

31,5±0,74

1,22±0,006

99,6±0,1

2,5

2,5

2,0

2

22,6±0,49

1,21±0,006

105,2±0,06

8

32,3±0,25

1,21±0,003

99,7±0,08

2,5

2,5

2,5

2

18,5±0,51

1,19±0,008

126,4±0,1

8

33,8±0,15

1,19±0,008

101,7±0,1

2,5

2,5

5,0

2

17,5±0,51

1,18±0,009

132,3±0,1

8

34,6±0,25

1,18±0,01

103,1±0,08

Аффинность сорбенту придавали белковые специфические лиганды, которыми при конструировании кампилобактериозных МИС служили  иммуноглобулины из гипериммунных полигрупповых сывороток, выделенные полиэтиленгликолем, а для листериозных МИС – F(ab)2 – фрагменты иммуноглобулинов листериозных.

  Исследования показали, что концентрация белка лигандов 2,5-3 мг/мл является оптимальной для полного насыщения сорбента в объеме 0,4 мл 10 % взвеси МИС. При использовании белка с концентрацией больше 2,5

мг/мл адсорбционная емкость МИС снижалась. При изучении кинетики процесса иммобилизации и оценке связывания белковых лигандов с сорбентом установлено, что для полного насыщения МС белком достаточно 2 часов при значении рН раствора белка 6-7 и температуре от 22 до 370С. Полученные магноиммуносорбенты характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической, микробиологической устойчивостью, не подвержены набуханию. Принципиальная схема получения МИС представлена на рисунке 2.

На основе МИС нами впервые сконструированы диагностические тест-системы для проведения сочетанного метода индикации возбудителей кампилобактериоза и листериоза МИС+ИФА, подобраны условия постановки ИФА с МИС. При использовании МИС в ИФА для проведения реакции не требовались полистероловые планшеты, сокращалось время сенсибилизации твердой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твердой фазы, время проведения анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым  ИФА. Нами также впервые сконструированы магноиммуносорбентные диагностические тест-системы для проведения сочетанного метода детекции возбудителей кампилобактериоза и листериоза в количественном иммунофлуоресцентном анализе, оптимизированы варианты постановки КИФА. МИС+КИФА обладает селективным концентрированием, высокой чувствительностью (1х102 м.к./пробе), значительно превышающей чувствительность традиционного иммунофлуоресцентного анализа, специфичностью, быстротой постановки реакции (50-60 мин), возможностью учитывать реакцию не только визуально, но и инструментально ( в условных единицах по показаниям вольтметра), при этом отпадает необходимость приготовления мазков и их фиксации.

Способность магноиммуносорбентов прочно (на уровне реакций антиген-антитело) фиксировать не своей поверхности искомый патоген дает возможность исследовать широкий диапазон проб, в том числе и сильно загрязненных, и их объемов (от нескольких микролитров до многих кубических метров жидкости), осуществлять тщательную промывку проб от загрязнений, мешающих проведению индикационных реакций, тем самым  повышая достоверность как положительных, так и отрицательных результатов. 

Все разработанные нами МИБП, а также биологическое сырье для  их производства нуждались в стабилизации исходных свойств. В настоящее время наилучшим методом для сохранения свойств биополимеров является лиофильное высушивание препаратов. В связи с тем, что названные выше диагностические препараты и сырье для них имеют свой порог биодеградации, необходимо было отработать единый, оптимальный, экономичный режим их высушивания. При  сублимации  мы использовали различные криозащитные среды, подобранные нами для каждого биообъекта.  Сублимацию проводили на установке для сублимационной сушки (LZ-9С или TG -5) с использованием двух режимов: «умеренного» (длительность удаления свободной воды – (12,5±1) час, связанной влаги – (10,5±1) час, конечная температура подогрева – (25±1)  0С) и «жесткого» (длительность периода сублимации и изотермического отторжения влаги в течение 6 часов с подогревом материала до (45 ±2,5)0С, общая длительность процесса сушки – 16 часов). После лиофилизации «умеренным» и «жестким» режимами, а также через 5 лет хранения (срок наблюдения) показатели контроля специфической активности и чувствительности всех медицинских иммунобиологических препаратов, разработанных нами, а также биологического сырья для их производства оставались на уровне исходных. Результаты этих экспериментов позволяют рекомендовать довольно жесткий экономичный режим сублимации при производстве диагностических препаратов.

В итоге проведенных исследований составлена принципиальная схема производства, которая складывается из последовательных стадий и операций, характерных для каждого конкретного препарата, определены критические контрольные точки на этапах производства (рисунок 3).

       

               

  Диагностическую ценность разработанных нами МИБП подтвердили многочисленные лабораторные и полевые испытания. Так, например, возбудители кампилобактериоза (К) и листериоза (Л) были выделены от 6,7% и 3,8% больных с диагнозом ОКИ соответственно. Наличие этих возбудителей определены в 14,1% (К) и 19,7 % (Л) пищевых продуктов; 56,7 % (К) и 6,7 % (Л) смывов с рук ветеринарных работников; 9 % (К) и 12,5% (Л) проб почвы; 25 % (К) и 24,3 % (Л) проб воды; 23,3 % (К) и 16,7 % (Л) у диких птиц; 1,3 % (К) и 15 % (Л) у грызунов.  Результаты бактериологических и серологических исследований материала от людей, животных, домашних и диких птиц, грызунов,  пищевых продуктов, воды водоемов, сточных вод, почвы и других объектов показали многообразие резервуаров и источников листериозной и кампилобактериозной инфекций и свидетельствуют о широком распространении Campylobfcter jejuni и L.mjnocytogenes  и о  совпадающих путях циркуляции и передачи этих возбудителей (рисунок 4).

Таким образом, нами создан алгоритм технологического процесса производства  диагностических препаратов для индикации и идентификации возбудителей кампилобактериоза и листериоза, который в дальнейшем позволит унифицировать схему лабораторной диагностики этих инфекций.

ВЫВОДЫ

  1. Разработаны транспортная, селективные и накопительные питательные среды для возбудителей кампилобактериоза и листериоза.

2. Определены методические приемы и их последовательность для извлечения специфических антигенов белковой природы из микробных  масс возбудителей кампилобактериоза и листериоза для использования их при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов.

3. Разработаны эффективные производственные схемы получения полигрупповых кампилобактриозных и листериозных иммунных сывороток с использованием иммунокорректора - тимогена и проведена сравнительная оценка методов выделения из них иммуноглобулинов для дальнейшего их применения в качестве биологического сырья при производстве иммубиологических препаратов.

4. Определены оптимальные параметры биотехнологии производства иммуноферментных и иммунофлуоресцентных кампилобактериозных и листериозных иммуноглобулиновых конъюгатов.

Рисунок 4. Схема циркуляции возбудителей листериоза и кампилобактериоза во внешней среде и пути заражения человека и животных

  5. Впервые сконструированы кампилобактериозные и листериозные магноиммуносорбентные тест – системы для иммуноферментного и количественного иммунофлуоресцентного анализов, позволяющие исследовать пробы из внешней среды с высокой степенью загрязнения неограниченного объема, низкой концентрацией патогена, с чувствительностью в 1000 и более раз превышающей традиционные, что  значительно повышает достоверность как положительных, так и отрицательных результатов. Применение магнитоуправляемых твердофазных  аффинных сорбентов позволило повысить выявляемость возбудителей кампилобактериоза и листериоза в объектах внешней среды на 9,4 – 11,8 %.

  6. Определены оптимальные параметры лиофильного высушивания МИБП и биологического сырья для их производства при сокращении  времени сублимации с 24 до 16 часов, позволяющие одномоментно лиофилизировать биополимеры с различными характеристиками при сохранении их исходных свойств.

  7. Лабораторные, клинические и полевые испытания разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП показали их высокую специфичность, чувствительность, экспрессность, информативность, что в совокупности повышает эффективность лабораторной диагностики и свидетельствует о перспективности их использования в лабораториях практического здравоохранения.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Тюменцева, И.С. Способ получения диагностической сыворотки / И.С. Тюменцева,  А.Е. Афанасьев, В.И. Ефременко, И.А. Базиков, Е.В.Алиева //Патент на изобретение №2135210. Зарегестрировано в Гос. Реестре изобретение РФ 27 августа 1999 г. Бюл. № 24 от 27.08.1999 .
  2. Алиева, Е.В. Проблемы листериоза на территории Ставропольского края / Е.В.Алиева, Т.И.Егшатян // Сборник научных трудов. Здоровье (проблемы теории и практики) УДК 61:157.7 (3) ISBN – 5 – 89822 –029 – 1. Ставрополь,2001, с. 472 – 473.
  3. Егшатян, Т.И. Циркуляция возбудителя листериоза в экологической системе /Т.И.Егшатян, Е.Н.Афанасьев, И.С.Тюменцева, Е.В.Алиева //Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. – Ставрополь, 2001. – 7 с. Депонировано  в ВИНИТИ 07.01. № 1668 – В2001.
  4. Егшатян, Т.И. Биотехнология приготовления эритроцитарного, антигенного, листериозного диагностикума / Т.И.Егшатян, Е.В.Жданова И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьев, Е.В.Алиева // Проблемы биологии и химии на Северном Кавказе. Материалы научной конференции посвященной 70-летию биолого-химического факультета СГУ.  Ставрополь, 2001. –С.39.
  5. Алиева, Е.В. Некоторые аспекты современного состояния эпидемиологии и  лабораторной диагностики кампилобактериоза / Е.В.Алиева  // Материалы научной конференции Ставропольской государственной  медицинской академии. Ставрополь, 2002.- С.135-136
  6. Алиева, Е.В. Магнитоуправляемая тест-система при диагностике листериоза /Е.В.Алиева // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. Приложение. - №2(2) – Ростов-н/Д, 2003. -С. 43-45.
  7. Алиева, Е.В. Опыт применения новых препаратов для экспресс-индикации возбудителей кишечных инфекций в условиях чрезвычайных ситуаций / Е.В.Алиева  // ЖМЭИ. – 2003. – Приложение. – С.86-88.
  8. Алиева, Е.В. Технология получения Fab-фрагментов  IgG из полигрупповых листериозных сывороток  /Е.В.Алиева  // Биоресурсы, биотехнологии, инновации Юга России: Материалы международной научно-практической конференции (22-24 октября,2003 г.) - Ставрополь-Пятигорск, 2003. – Ч.1. - С. 21-24.
  9. Алиева, Е.В. Основные причины возникновения острых кишечных инфекций на территории Ставропольского края /Е.В.Алиева, Е.В.Гурнович // 11 итоговая  (межвузовская) конференция студентов и молодых ученых -  Ставрополь, 2003, С. 278-279.
  10. Афанасьев, Е.Н. Листериоз и некоторые аспекты распространения и диагностики / Е.Н.Афанасьев, И.С.Тюменцева, Е.В.Алиева, Т.И. Егшатян //. Вестник ветеренарии. – Ставрополь, 2003. - №3. С. 4-7.
  11. Жарникова, И.В.  Магноиммуносорбентные методы диагностики / И.В.Жарникова, Е.В.Алиева, М.Н.Касторная // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. - Приложение. - №2(2). – Ростов-н/Д, 2003. С. 51 -53.
  12. Алиева, Е.В. Кампилобактериоз. Лабораторная диагностика (Обзор литературы) /Е.В.Алиева // Ставрополь, 2004. – Деп. в ВИНИТИ 15.07.2004, №1227. – В2004.
  13. Алиева, Е.В. Разработка кампилобактериозных аффинных магносорбентов для обследования объектов внешней среды /Е.В.Алиева // Вестник СГУ. Вып. 42.- Ставрополь, 2005.-С.163-166.
  14. Алиева Е.В. Совершенствование методов экспресс-диагностики кампилобактериоза /Е.В.Алиева // Материалы научно-практической конференции «Опыт работы учреждений Роспотребнадзора  в  Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагополучия и защите прав потребителей» 9-я ежегодная Неделя медицины Ставрополья. Ставрополь, 2005. – С.180-183.
  15. Алиева, Е.В. Анализ заболеваемости и состояния лабораторной диагностики острых кишечных инфекций на территории Ставропольского края /Е.В.Алиева // Ставрополь, 2006. – 11 с. – Деп. в ВИНИТИ 21.08.2006, №1084. – В2006.
  16. Алиева, Е.В. Получение диагностикумов полигрупповых цветных листериозного и кампилобактериозного для реакции агглютинации / Е.В.Алиева, Е.Н.Афанасьев // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ: Материалы седьмой межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5-октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) /Под ред. Академика РАМН Г.Г.Онищенко, члена корреспондента РАМН В.В.Кутырева, доктора мед. наук, профессора И.А.Дятлова. –Протвино: А – ПРИНТ ЗАО, 2006. – С.172-173.
  17. Алиева, Е.В. Получение диагностических поливалентных агглютинирующих сывороток / Е.В.Алиева, Е.Н.Афанасьев // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ: Материалы седьмой межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5-октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) /Под ред. Академика РАМН Г.Г. Онищенко, члена корреспондента РАМН В.В. Кутырева,  доктора мед.наук, профессора И.А.Дятлова. –Протвино: А – ПРИНТ ЗАО, 2006. – С.171-172
  18. Алиева, Е.В. Разработка биотехнологии приготовления эритроцитарных листериозного и  кампилобактериозного диагностикумов /Е.В.Алиева, Е.Н.Афанасьев // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ: Материалы седьмой межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5-октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) /Под ред. Академика РАМН Г.Г. Онищенко, члена корреспондента РАМН В.В.Кутырева, доктора мед.наук, профессора И.А.Дятлова. –Протвино: А – ПРИНТ ЗАО, 2006. – С.170-171.
  19. Алиева, Е.В. Экология возбудителей кампилобактериоза и листериоза / Е.В.Алиева, Е.Н.Афанасьев //Ставрополь, 2006. – 13 с. - Деп. в ВИНИТИ 09.11.2006. - № 1352 – В2006.
  20. Алиева, Е.В. Новое в диагностике кампилобактериоза и листериоза / Е.В.Алиева, Е.Н.Афанасьев, И.С.Тюменцева // Вестник Российской военно-медицинской академии. – СПб., 2006. – Приложение  1(15). – С.221.
  21. Алиева, Е.В. Получение высокоактивных антигенных фракций из бакмасс возбудителя кампилобактериоза /Е.В. Алиева, И.В.Жарникова,  Е.В.Жданова, И.В.Юркина, С.А.Курчева  //Естествознание и гуманизм. Сборник науч. работ – Т.3, №1. – Томск, 2006. – С.86-87.
  22. Алиева, Е.В.  Современное состояние изученности и лабораторной диагностики возбудителя листериоза (обзор литературы)  / Е.В.Алиева, И.В.Ковальчук //Ставрополь, 2006. – 24 с. Деп. в ВИНИТИ, 09.11.2006. - №1351-В2006.
  23. Алиева, Е.В. Унификация и разработка тест-систем диагностических для мониторинга возбудителей бактериальной (кампилобактериоз, туляремия, лептоспироз)  и  вирусной  (лихорадка  Западного  Нила) природы /Е.В. Алиева, А.В.Таран, Е.Н. Афанасьева, С.А.Курчева, Т.В. Жарникова, И.С.Тюменцева, И.В.Самарина // Вестник Ставропольского государственного университета. – Вып. 47. – Ставрополь, 2006.- С. 292-298.
  24. Алиева, Е.В. Острые кишечные инфекции на территории Ставропольского края / Е.В.Алиева, И.В.Ковальчук // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ: Материалы седьмой межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5-октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.)/Под ред. Академика РАМН Г.Г.Онищенко, члена корреспондента РАМН В.В.Кутырева, доктора мед.наук, профессора И.А.Дятлова. –Протвино: А – ПРИНТ ЗАО, 2006. – С.12-13.
  25. Алиева, Е.В. Конструирование и характеристика листериозных и кампилобактериозных полигрупповых иммуноглобулиновых конъюгатов / Е.В. Алиева, И.С.Тюменцева  // Ставрополь, 2006. – 28 с. – Деп. в ВИНИТИ 21.08.2006, №1085. – В2006.
  26. Алиева, Е.В. Разработка биотехнологии получения листериозных и кампилобактериозных антигенных  диагностических иммунобиологических препаратов / Е.В. Алиева, И.С.Тюменцева  // Ставрополь, 2006. – 26 с. – Деп. в ВИНИТИ 21.08.2006, №1083. – В2006.
  27. Алиева, Е.В. Разработка и получение и получение питательных сред для культивирования  кампилобактерий и листерий / Е.В. Алиева, И.С.Тюменцева  //Ставрополь, 2006. – 14 с. - Деп. в ВИНИТИ  №09.11.2006. – №1353. – В.2006.
  28. Алиева, Е.В. Питательные среды для культивирования  кампилобактерий и листерий / Е.В. Алиева, И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьев  // Вестник Российской военно-медицинской академии. – СПб., 2006. – Приложение  1(15). – С.482-483.
  29. Алиева, Е.В.  Разработка схем иммунизации животных кампилобактериозными и листериозными антигенами  / Е.В. Алиева, И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьев  //Вестник Российской военно-медицинской академии. – СПб., 2006. – Приложение  1(15). – С.192.
  30. Алиева, Е.В.  Разработка и применение иммуноглобулинов диагностических  флуоресцирующих для выявления возбудителей кампилобактериоза и листериоза  /Е.В. Алиева,  И.С.Тюменцева, И.В.Жарникова  и  др.  //Медицинский вестник Северного Кавказа.- Ставрополь,2006. - №1. – С.12-14.
  31. Алиева, Е.В. Выделение кампилобактериозного водорастворимого антигенного комплекса белковой природы /Е.В. Алиева, И.С.Тюменцева, И.В.Жарникова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации.- Вып. № 19. -  Ростов-на-Дону.-2006. - С.89-91.
  32. Афанасьев, Е.Н. Кампилобактериоз и листериоз. /Е.Н.Афанасьев, Е.В.Алиева,  И.В.Ковальчук  //Вестник Российской военно-медицинской академии. – СПб., 2006. – Приложение  1(15). – С.483-485.
  33. Ефременко, Д.В. Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА) / Д.В.Ефременко, И.В.Жарникова, А.А.Ефременко, И.В. Гаркуша, Е.В.Жданова, И.В.Юркина, Е.В.Алиева, Е.Е.Афанасьева.  //Патент РФ на  изобретение № 2290641, опубл. 27.12.2006. Бюл. №36. -  5 с.
  34. Жарникова, И.В.  Разработка и применение иммуноглобулинов  диагностических флуоресцирующих  для выявления возбудителя  кампилобактериоза, лептоспироза / И.В.Жарникова, И.С.Тюменцева, Е.В.Алиева, А.В.Таран, Е.В.Жданова, И.В.Юркина //Медицинский вестник Северного Кавказа. – Ставрополь, 2006. – С.12-14.
  35. Алиева, Е.В. Аффинные сорбенты для экспресс-диагностики различных заболеваний / Е.В.Алиева, И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьев, Н.Е.Афанасьев,  М.П.Лаврешин, Е.Е.Афанасьева, Т.Н.Орлова //Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2008. - №1. – С.5-9.
  36. Алиева, Е.В. Опыт получения иммунных сывороток для производства диагностических препаратов / Е.В.Алиева, И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьев, М.П.Лаврешин, Н.Е.Афанасьев, Е.А.Горобец, А.А.Семирчева // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2008. - №1. – С.10-13.
  37. Алиева, Е.В. Опыт применения твердофазных иммобилизованных систем с магнитными свойствами в экспрессных иммуноанализах некоторых заболеваний инфекционной и неинфекционной природы / Е.В.Алиева, И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьева, М.П.Лаврешин, Е.Н.Афанасьев, Т.Н.Орлова // «Технологии живых систем». – 2008.- № 2-3.- том 5.-С.47-45.
 






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.