WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

  На правах рукописи

АББАСОВА Светлана Георгиевна

Растворимый Fas при онкологических заболеваниях

 

14.00.14. онкология

03.00.04. биохимия

 

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

 

МОСКВА 2008

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН

Научные консультанты:

Член-корреспондент РАМН, профессор  Н.Е.Кушлинский

Член-корреспондент РАН,  профессор В.М. Липкин

Официальные оппоненты:

Заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, доктор биологических наук, профессор Красильников Михаил Александрович

Заместитель Генерального директора ОАО «Всероссийский научный центр диагностики и лечения», заведующий отделом биотехнологии ВНЦДЛ, доктор биологических наук, профессор Свешников Петр Георгиевич

Заведующий лабораторией прогноза эффективности консервативной терапии опухолей ФГУ «Московский НИИ онкологии им. П.А. Герцена Росмедбиотехнологий», доктор биологических наук, профессор Сергеева Наталья Сергеевна

Ведущая организация:

ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии МЗ и СР РФ

Защита диссертации состоится «____»_______________2009 г. в «___» часов на заседании Диссертационного совета (Д.001.017.02) ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, г.Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, г.Москва, Каширское шоссе, 24)

Автореферат разослан «____» ___________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор  Барсуков Ю.А.

Список условных сокращений

ДОМЖ  - доброкачественные опухоли молочной железы

ДОЯ  - доброкачественные опухоли яичников

ДТЗ  - диффузный токсический зоб

ИФА  - иммуноферментный анализ

KPP - колоректальный рак

МА - моноклональные антитела

НК  - натуральные киллеры

РМЖ  - рак молочной железы

РТМ - рак тела матки

РЩЖ  - рак щитовидной железы

РЯ - рак яичников

УКЗ - узловой коллоидный зоб

ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты

ЩФ  - щелочная фосфатаза

FADD  - белок, содержащий домен смерти, ассоциированный с активированным Fas

FasL - Fas-лиганд

FLICE  - FADD-подобная ICE-протеаза

FLIP - FLICE-ингибирующий белок

IFN  - интерферон

IL - интерлейкин

sFas  - растворимый Fas

uPA - активатор плазминогена урокиназного типа

VEGF - фактор роста  эндотелия сосудов

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Гомеостаз многоклеточного организма поддерживается точно выверенным балансом между процессами пролиферации, дифференцировки и гибели клеток. Одним из основных механизмов элиминации опасных для организма клеток, к числу которых относятся вирус-инфицированные, опухолевые клетки, а также клетки, закончившие свой жизненный цикл, является апоптоз, или программированная клеточная гибель. Это очень сложный механизм, на различных этапах которого задействованы многочисленные факторы и рецепторы клеточной гибели, а также ряд адапторных белков, приводящий, в конечном итоге, к активации внутриклеточных протеаз и самоуничтожению опасной для организма клетки. Любые сбои в этом сложном процессе приводят к развитию серьезных патологий, в том числе к возникновению и росту злокачественных опухолей. Злокачественность новообразований определяется не только огромным пролиферативным потенциалом составляющих их клеток, но и устойчивостью этих клеток к действию факторов, регулирующих процессы дифференцировки и клеточной гибели.

Fas/APO-1/CD95 – является одним из ключевых рецепторов, запускающих программу самоуничтожения клетки (Itoh и соавт., 1991; Oehm и соавт., 1992). Экспрессия Fas показана почти во всех органах - в тимусе, почках, печени, сердце, легких, он также экспонирован на поверхности активированных лимфоцитов, натуральных киллеров, вирус-инфицированных и опухолевых клеток (Nagata and Golstein, 1995).

Индукция Fas-опосредованного апоптоза в клетке происходит после взаимодействия Fas с его лигандом - FasL. Механизм Fas-опосредованного апоптоза хорошо изучен: идентифицированы основные белки, участвующие в передаче апоптотического сигнала от активированного Fas, установлены их структура и функции. Устойчивость клеток к Fasзависимому апоптозу определяется как нарушениями в экспрессии, структуре, и функционировании белков, опосредующих Fas-зависимый апоптоз, так и повышенной продукцией растворимого Fas (sFas) этими клетками. Растворимый Fas дистантно ингибирует действие FasL, позволяя клеткам-продуцентам растворимого Fas уйти от противоопухолевой защиты организма. С помощью молекулярно-биологических методов было показано, что sFas является продуктом альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas (Cheng и соавт., 1994; Cascino и соавт., 1995). Идентифицировано несколько растворимых изоформ Fas, среди которых преобладает одна – FasdelTM, или FasExo6Del, остальные изоформы продуцируются в незначительных количествах (Cascino и соавт., 1995; Cascino и соавт., 1996).

Актуальность настоящего исследования определяется необходимостью определения значения растворимого Fas в сыворотке крови при онкологических заболеваниях различного гистогенеза и локализации в прогнозе заболевания, а также в оценке устойчивости опухоли к применяемой терапии в конкретной кли­нической ситуации.

Цель исследования Разработка и характеристика сэндвич-ИФА для определения концентрации растворимого Fas в сыворотке крови, изучение связи показателей sFas с основными клиническими, морфологическими и некоторыми биохимическими характеристиками опухолевых процессов и его значения в прогнозе онкологических заболеваний.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать разработанный нами сэндвич-ИФА для количественного определения sFas в сыворотке крови человека – оценить предел детекции тест-системы и воспроизводимость результатов анализа. Дать иммунохимическую характеристику моноклональных антител (МА), на основе которых разработан сэндвич-ИФА.

2. С помощью пептидного фагового дисплея определить структуру эпитопов для МА к полноразмерному Fas человека, на основе которых разработан сэндвич-ИФА, с целью выявления спектра изоформ sFas, которые должна детектировать разработанная тест-система.

3. Определить концентрацию sFas в сыворотке крови онкологических больных с наиболее часто выявляемыми опухолями (новообразования молочной железы, яичников, эндометрия, костей, толстой кишки, надпочечников и щитовидной железы) и провести анализ показателей sFas в зависимости от основных клинических, морфологических и некоторых биохимических критериев опухолевых процессов и определить его значение в прогнозе заболеваний.

4. Изучить корреляцию показателей sFas в сыворотке крови онкологических больных с показателями наиболее важных патогенетических факторов: активатора процесса неоангиогенеза в опухоли – VEGF, провоспалительного цитокина, ингибитора Fas-зависимого апоптоза – IL-6, уровня содержания рецепторов эстрогенов в опухоли при раке молочной железы, общей активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови при новообразованиях костей, уровня содержания активатора плазминогена (uPA) в ткани опухолей щитовидной железы.

Научная новизна. Разработана и охарактеризована оригинальная отечественная тест-система для количественного определения растворимого Fas в сыворотке крови человека, не уступающая аналогичным тест-системам, описанным в литературе.

С помощью разработанной тест-системы впервые на большом клиническом материале определена концентрация и проведен анализ показателей растворимого Fas в сыворотке крови больных новообразованиями различного морфогенеза и локализации в сравнении с соответствующими показателями практически здоровых людей. Впервые определены связь sFas с основными клиническими, морфологическими и некоторыми биохимическими характеристиками опухолевых процессов и его значение в прогнозе заболевания при раке яичников, раке тела матки, раке коры надпочечников и остеогенной саркоме, а также предиктивное значение sFas в оценке эффективности неоадъювантной лучевой терапии при колоректальном раке.

Практическая значимость исследования состоит в разработке оригинальной отечественной иммуноферментной тест-системы для количественного определения растворимого Fas в сыворотке крови человека, а также в установлении значения этого белка как фактора прогноза при раке яичников, раке тела матки, раке коры надпочечников и остеогенной саркоме, а также его предиктивного значения в оценке эффективности неоадъювантной лучевой терапии при раке толстой кишки.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Разработанная тест-система на основе МА SA-7 и SA-8 может применяться для количественного определения sFas в сыворотке и плазме крови человека и других биологических жидкостях. Присутствие sFasL и других компонентов сыворотки крови не влияет на результаты количественного определения sFas. Разработанная нами тест-система должна детектировать основную изоформу sFas - FasExo6Del и три минорных изоформы sFas -FasExo4Del, FasExo4,6Del и FasExo4,7Del.
  2. Концентрация и частота выявления sFas в сыворотке крови больных новообразованиями различного морфогенеза и локализации достоверно превышают соответствующие показатели практически здоровых людей.
  3. Показатели sFas в сыворотке крови связаны с основными клиническими характеристиками заболевания (стадия опухолевого процесса, размер опухолевого узла, степень дифференцировки опухоли и характер ее роста) при раке яичников, раке тела матки, раке толстой кишки и адренокортикальном раке.
  4. Показатели sFas достоверно не различаются при злокачественных и доброкачественных новообразованиях молочной железы, костей, яичников и надпочечников, тогда как рак щитовидной железы характеризуется более высокими показателями sFas в сыворотке крови, чем доброкачественные и гиперпластические процессы щитовидной железы. Одновременно высокие уровни sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови характерны для злокачественных новообразований.
  5. Высокий уровень sFas в сыворотке крови является неблагоприятным фактором прогноза для больных остеогенной саркомой, раком яичников, раком тела матки и адренокортикальным раком.
  6. Высокая концентрация sFas в сыворотке крови является неблагоприятным предиктивным фактором эффективности применения неоадъювантной лучевой терапии при колоректальном раке в пожилом возрасте.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены на научно-практическом симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века: синтез традиций и новаций», (Москва, 12-14 октября 1999 года); на VII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 10-14 апреля 2000 года); на 2-ом съезде онкологов стран СНГ (Киев, 23-26 мая 2000 года); на 7th Biennial Meeting of the International Gynecological Cancer Society (Rome, Italy, September 26-30, 1999); на XI Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 19-23 апреля 2004 года); на Конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины России-2004» (Москва 20-22 октября 2004г.); на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 24-25 июня 2004 г.); на XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005 г.); на I Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Орел, 31 мая-2 июня 2005 г.); на X Российском онкологическом конгрессе (Москва, 21-23 ноября 2006 г.); на XIII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006 г.). Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции лаборатории клинической биохимии, лаборатории клинической иммунологии, х/о опухолей молочной железы, х/о проктологии, х/о диагностики опухолей НИИ КО, лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН; кафедры онкологии и кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО МГМСУ; лаборатории нейрохимии ФИБХ РАН 14 октября 2008 г.

Полученные результаты используются в практике лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и в учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 41 работа в отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов и 8 глав результатов собственных исследований; заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Общий объем диссертации 272 страниц машинописного текста. Список литературы включает 84 отечественных и 448 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 67 таблицами и 26 рисунками.

Материалы и методы исследования

Общая характеристика обследованных больных

В настоящее исследование были включены 1061 первичных больных злокачест­венными и доброкачественными новообразованиями различного гистогенеза и лока­лизации, из них 861 женщины и 200 мужчин, в возрасте от 14 до 80 лет. В общей группе пациентов были больные новообразованиями молочной железы (141), костей (99), яичников (347), тела матки (111), толстой кишки (113), щитовидной железы (141) и коры надпочечников (109).

Группу контроля составили 457 практически здоровых людей, 332 женщины и 125 мужчин, в возрасте от 17 до 76 лет.

Диагнозы всем больным были установлены впервые на основании результатов клинических исследований и подтверждены данными гистологического исследования, определение концентрации sFas в сыворотке крови проводили до начала специфи­ческого лечения.

Больных классифицировали по стадиям согласно международной классификации по системе TNM (Cancer TNM>

Группу больных новообразованиями молочной железы составили 119 женщин от 28 до 82 лет с первичным РМЖ и 22 пациентки с доброкачествен­ными новообразованиями и фиброзно-кистозной болезнью в возрасте от 33 до 58 лет, которые были обследованы и получали лечение в НИИ клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН в период с декабря 1999г. по ноябрь 2003г.

Проводили определение концентрации sFas и общей активности щелочной фосфатазы у 99 больного новообразованиями костей (61 мужчина и 38 жен­щин) в возрасте от 14 до 59 лет. Определение концентрации VEGF проводили только у больных остеогенной саркомой и опухолью Юинга. Новообразования костей были представлены следующими нозологическими едини­цами: первичная остеогенная саркома (32), вторичная остеогенная саркома (1), паростальная остеогенная саркома (1), периостальная остеогенная саркома (1), первич­ная хондросаркома (17), вторичная хондросаркома (1), опухоль Юинга (10), злокачественная фиброзная гистиоцитома кости (9), гигантоклеточная опухоль кости (10), плазмоцитома (1), гемангиоэндотелиома (1), гемангиоперицитома (1), хордома (3), липома кости (1), доброкачественная ос­теобластома (2), хондробластома (3), хондрома (1), костно-хрящевой экзостоз (2), анев­ризмальная костная киста (2).

В группе больных новообразованиями яичников было 141 больная злокачествен­ными новообразованиями в возрасте от 24 до 80 лет и 206 пациенток с добро­качественными новообразованиями в возрасте от 18 до 69 лет, которые прошли обследование и лечение в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в период с января 2000 по март 2006 г.г. В группе больных ДОЯ были представлены следующие морфологические варианты опухоли: дермоид (24), киста желтого тела (20), фолликулярная киста (14), цистаденома (56), цистаденофиброма (6), простая киста (4), папиллярная цистаденома (10), опухоль Бреннера (8), пограничная опухоль (18), муцинозная пограничная опухоль (4), эндомет­риоидная киста (24), муцинозная киста (6), фиброма (8). В общей группе больных РЯ были следующие нозологические единицы: папилляр­ная цистаденокарцинома (22), серозная цистаденокарцинома (53), эндометриоидная аде­нокарцинома (27), муцинозная аденокарцинома (26), аденогенный рак (3), серозный рак (10).

В исследование были включены 111 больных раком тела матки (РТМ) в возрасте от 31 до 80 лет. Гистологическое исследование выявило следующие морфологические варианты строения опухолей у больных РТМ: аденокарцинома (102), железисто-плоскоклеточный рак (7), светлоклеточный рак (2). Больные находились в разных стадиях опухолевого про­цесса, большинство (62.8%) из них было в 1 и 2 стадии.

В исследование были включены 113 больных колоректальным раком, из них 57 муж­чин и 56 женщин в возрасте от 35 до 72 лет.

В общую группу больных были включены 141 пациент с различными патологиями щитовидной железы, из них 127 женщин и 14 мужчин, в возрасте от 17 до 73, которые находились на обследовании и лечении в отделении опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН г.Москвы за период с декабря 1998 по январь 2002 года. Новообразования щитовидной железы были представлены следующими морфологи­ческими типами опухолей: 1) рак щитовидной железы – 32; 2) аденома щитовидной железы – 16; 3) узловой коллоидный микро-макрофолликулярный зоб с признаками адено­матоза – 20; 4) узловой коллоидный микро-макрофолликулярный зоб без признаков аде­номатоза – 48; 5) диффузный токсический зоб с признаками аденоматоза – 9; 6) диффуз­ный токсический зоб без признаков аденоматоза – 14; 7) аутоиммунный тиореоидит Хошимото – 2.

В общей группе пациентов было 109 больных опухолями надпочечников, из них 59 мужчин и 50 женщин, в возрасте от 45 до 75 лет. Гистологическое исследование выявило следующие нозологические единицы: рак коры надпочечника – 32, аденома коры надпочечника – 52, адренокортикальная опухоль с неопределенным потенциалом злокачественности – 6, феохромоцитома – 18 и миелоли­пома – 1.

Сопутствующая патология выявлена более чем у половины (56%) всех больных новообразованиями. Среди сопутствующих заболеваний были гипертоническая болезнь, хроническая ишемическая болезнь сердца, стенокардия, миома матки, полип матки, мастопатия, хронический гастрит, хронический колит, хронический пиелонефрит, мочекаменная болезнь, сахарный диабет II типа. Сочетание нескольких хронических заболеваний в анамнезе выявлено у 212 (20%) больных.

Лабораторные методы исследования

Определение концентрации sFas в сыворотке крови. МА против Fas SA-8 (IgG1 (κ); (4.0±0.6)x107 М-1) сорбировали на ИФА-планшеты (“Linbro”) в 0,05 М карбонатном буфере (рН 9.6) в концентрации 5 мкг/мл в течение ночи при 4оС. Для блокирования остаточных свободных центров связывания планшеты инку­бировали с 1% раствором БСА в фосфатно-солевом буфере (РВS) (рН 7.2) 1 час при 37оС. Затем в планшеты вносили сыворотки больных и практически здоровых людей, которые хранили при -20оС до анализа. Для построения калибровочного графика в каждый планшет вносили последовательные двукратные разведения пол­норазмерного рекомбинантного бакуловирусного Fas от 40 нг/мл до 0.1 нг/мл. Планшеты инкубировали 1.5 часа при 37оС. После инкубации планшеты промывали раствором РВS, содержащим 0.1% Tween 20 (“Sigma”) (буфер для отмывки). Процедуру отмывки далее повторяли после каждой стадии теста. После отмывки в планшеты вносили биотинилированные МА против Fas SA-7 (IgG1 (κ); (5.8±0.7)x108 М-1) в концентрации 10 мкг/мл в буфере для отмывки, содержащем 0.1% БСА и инкубировали 2 часа при 37оС. Затем в планшеты вносили раствор стрептавидин-пероксидазы (“Amersham”) в рабо­чем разведении в буфере для отмывки. Планшеты инкубировали 1 час при 37оС. В качестве субстрата использовали свежеприготовленный раствор 0.04% орто-фенилендиамина в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5.0), содержащем 0.03% пере­киси водорода. Планшеты инкубировали 15-20 минут при комнатной температуре до раз­вития окраски. Реакцию останавливали 10% серной кислотой, оптическую плотность из­меряли при длине волны 492 нм на спектрофотометре MR 700 Microplate Reader (“Dynatech Labs”, США). Концентрацию sFas определяли по калибровочному графику, построенному заново для каждого планшета.

Определение эпитопов, узнаваемых МА SA-7 и SA-8, проводили с помощью биб­лиотеки гептапептидов в варианте фагового дисплея – PH.D.7ТМ (BioLabs, Cat. #E8100S) по прилагаемой инструкции.

Синтез пептидов проводили твердофазным методом в ручном твердофазном реак­торе (Rodionov I.L. и соавт., 1992) с использованием Fmoc-стратегии (Reid G.E. и Simpson R.J., 1992).

Приготовление сыворотки крови пациентов и практически здоровых людей

Кровь у больных и практически здоровых людей забирали натощак из кубитальной вены с 8 до 9 утра. После свертывания крови пробирки центри­фугировали при 500g в течение 10 минут, сыворотку аккуратно отбирали, разливали по промаркированным пробиркам и хранили при 20оС до анализа.

Определение концентрации IL-6 в сыворотке крови проводили с помощью имму­ноферментного набора «human IL-6» компании “R&D”, США по прилагаемой к набору инструкции производителя.

Определение концентрации VEGF в сыворотке крови проводили с помощью иммуноферментного набора “CytElisatm Human VEGF” компании “Cytimmune Science inс.” (США) по прилагаемой к набору инструкции производителя.

Определение концентрации uPA в гомогенизированной ткани опухоли проводили с помощью иммуноферментного набора реактивов, разработанных в Католическом Университете г. Наймегена в лаборатории проф. Т.Benraad'a (Нидерланды).

Определение рецепторов эстрадиола-17β в экстрактах опухоли молочной железы проводили радиолигандным методом при насыщающих концентрациях лиганда [2,4,6,7-3H]-эстрадиола-17β (“Amersham Int. PLC”, Англия). Неспецифичное связывание опреде­ляли при 100-200-кратном молярном избытке диэтилстильбэстрола. Для разделения свободных и связанных с рецептором стероидов пробы после инкубации обрабатывали суспензией активированного угля, покрытого декстраном. Радиоактивность образцов определяли на спектрометре “LS 6500” (“Beckman”, США).

Определение общей активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови проводили оптимизированными методами при использовании автоматического анализатора «Hitachi 911».

Статистический анализ результатов исследования

Выбор центральных характеристик исследуемых количественных данных осущест­вляли после изучения формы их распределения. Оценку различия формы распределения от формы распределения Гаусса проводили по критерию согласия Колмогорова-Смир­нова. При логнормальном распределении проводили математическое преобразование зна­чений. Рассчитывали среднее значение показателя и его 95% доверительные границы, ошибку среднего, а также медианы (для логнормальных показателей) и пределы колеба­ния.

Рассчитывали абсолютные и относительные частоты качественных и ординальных признаков. Оценку различий частот проводили непараметрическим критерием i-2, для малых выборок – точным критерием Фишера. Расчет доверительных интервалов для малых долей проводили с учетом биноминального распределения.

Для выяснения диагностической способности показателей проводили дискриминантный анализ. Рассчитывали точное значение р. При множественных сравнениях значения р определяли с помощью специальных тестов с поправкой на множественность сравнений (test Scheffe). При корреляционном анализе рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона, а также значимость его отличия от нуля. Выживаемость рассчитывали по методу Каплана-Майера.

При выборе статистических процедур учитывали методологические требования Международного конгресса по гармонизации GGP “Статистические принципы для клини­ческих исследований” (ICH Guidelines//Good Clin.Pract.J.-1998.-Vol.5, №4.-р.27-37).

Все вычисления проводили с помощью математических пакетов «Статистика» и SPSS.

Результаты собственных исследований

Разработка и характеристика сэндвич-ИФА для количественного определения sFas
в сыворотке крови на основе моноклональных антител

Получение моноклональных антител против человеческого Fas

Для иммунизации брали 8-недельных мышей линии BALB/c, в качестве антигена использовали полноразмерный рекомбинантный бакуловирусный Fas (“Сoultronics”, Франция). Гибридизацию иммунных спленоцитов мыши с клетками мышиной линии NSO/1 проводили по стандартной методике. Отбор положительных гибридом проводили методом непрямого ИФА. Одиночные положительные клоны получали методом лимитирующих разведений.

МА нарабатывали в асцитной жидкости мышей линии BALB/c. Выделение МА из асцитной жидкости осуществляли преципитацией сульфатом аммония и последующей жидкостной хроматографией умеренного давления на колонке MonoQ. Определение типов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов проводили непрямым ИФА с помощью набора для типирования антител (“Amersham”, Великобритания).

Иммунохимическая характеристика полученных антител приведена в таблице 1.

Таблица 1. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител кFas

Антитело

Тип тяжелой и легкой цепи

Константа аффинности, М-1

SA-1

IgG2a(λ)

(7.8±1.3)x107

SA-2

IgG1(κ)

(4.1±0.3)x107

SA-3

IgG1(κ)

(6.4±0.5)x107

SA-4

IgG1(κ)

(2.1±0.4)x109

SA-5

IgG1(κ)

(3.8±0.3)x107

SA-6

IgG1(κ)

(3.3±0.2)x107

SA-7

IgG1(κ)

(5.8±0.7)x108

SA-8

IgG1(κ)

(4.0±0.6)x107

SA-9

IgG1(κ)

(6.5±0.5)x107

С целью разработки тест-системы для количественного опре­деления растворимого Fas в сыворотке крови были получены конъюгаты МА против Fas с биотином. Были проверены все возможные варианты сэндвич-ИФА, наилучшие результаты определения sFas показала «пара» антител SA-7 и SA-8. МА SA-7 и SA-8 выявляли одну мажорную полосу, соответствующую молекуляр­ному весу полноразмерного Fas в клеточных экстрактах человеческих линий HL-60, MCF7 и Jurkat, и не взаимодействовали с экстрактом клеток мышиной линии L929 в иммуноблоттинге, что может свидетельствовать о видовой специфичности этих антител.

Проводили определение минимальной концентрации sFas, детектируемой разрабо­танной тест-системой, для этого делали последовательные двукратные разведения полно­размерного Fas от 10 до 0.08 нг/мл. Нижним пределом детекции sFas, определяемым сэндвич-ИФА, считали кон­центрацию Fas, достоверно превышающую фоновое значение оптической плотности тест-системы плюс три стандартных отклонения. Минимальный предел детекции sFas тест-системы на основе МА SA-7 и SA-8, определенный в 6 независимых экспериментах, составил 0.3 нг/мл (рис. 1).

Рис. 1. Калибровочный график для определения концентрации растворимого Fas

В литературе описано несколько тест-систем для определения концентрации sFas в варианте сэндвич-ИФА, нижний предел детекции которых колеблется от 2 нг/мл (Tomokuni A. и соавт., 1997) до 0.1 нг/мл (Seishima M. и соавт., 1996), по данному показателю разработанный сэндвич-ИФА не уступает аналогичным тест-системам.

Показали, что присутствие sFasL в концентрации 10 нг/мл не влияет на результаты количественного определения sFas разработанной нами тест-системой (рис. 2).

Рис. 2. Определение концентрации sFas в присутствии sFasL

С целью оценки воспроизводимости результатов определения концентрации sFas в сыворотке крови человека с помощью разработанного сэндвич-ИФА проводили определе­ние уровня sFas в 8 различных образцах сыворотки в 6 параллельных повторах для каж­дого образца в пределах одного ИФА-планшета (intra-assay) и рассчитывали коэффициент вариации. Эксперимент повторяли 3 раза в независимых экспериментах (inter-assay) и рас­считывали коэффициент вариации для данного теста, учитывая результаты 18 определе­ний для каждого образца сыворотки. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2. Результаты определения концентрации sFas в сыворотке крови
в пределах одного ИФА-планшета

Образец сыворотки

Концентрация sFas, нг/мл

Коэффициент вариации, %

1

2.67,  2.75,  2.60,  2.59,  2.73,  2.65

2.5

2

5.45,  5.39,  5.55,  5.59,  5.48,  5.62

1.6

3

0.76,  0.85,  0.70,  0.81,  0.74,  0.77

6.9

4

3.59,  3.48,  3.75,  3.55,  3.67,  3.64

2.6

5

8.40,  8.90,  8.65,  8.56,  8.73,  8.57

2.0

6

1.78,  1.83,  1.64,  1.75,  1.68,  1.67

4.2

7

0.53,  0.64,  0.59,  0.58,  0.61,  0.57

6.3

8

3.67,  3.75,  3.53,  3.58, 3.64,  3.52

2.5

Средний коэффициент вариации (M±m), %

3.7±0.7

Коэффициент вариации изменялся от 1.6% до 6.9% и в среднем составил 3.7%. Полученные данные свидетельствуют о хорошей воспроизводи­мости результатов измерения концентрации sFas в данном виде теста (intra-assay). Коэф­фициент вариации был выше при низкой концентрации sFas в сыворотке крови, что объясняется бльшим вкладом ошибки метода (разброс значений оптической плотности, краевые эффекты) вблизи значения минимального предела детекции тест-системы.

Таблица 3. Результаты определения уровня sFas в независимых экспериментах

Образец сыворотки

Эксперимент №1

Эксперимент №2

Эксперимент №3

Коэффициент вариации, %

1

2.67

2.80

2.50

5.6

2

5.51

5.30

5.45

2.0

3

0.77

0.67

0.73

6.9

4

3.61

3.70

3.55

2.1

5

8.64

8.80

8.54

1.5

6

1.73

1.68

1.65

2.4

7

0.59

0.55

0.63

6.8

8

3.62

3.54

3.58

1.1

Средний коэффициент вариации (M±m), %

3.6±0.8

Проводили сравнение результатов определения концентрации sFas в сыворотке и плазме крови онкологических пациентов с использованием сэндвич-ИФА на основе МА SA-7 и SA-8.

Таблица 4. Сравнительные результаты определения концентрации sFas в сыворотке и плазме крови онкологических больных в сэндвич-ИФА на основе МА SA-7 и SA-8

Тип образца

Концентрация sFas, нг/мл

Коэффициент вариации, %

Сыворотка

4.28

4.30±0.06

1.3

EDTA-плазма

4.36

Гепарин-плазма

4.25

Из данных таблицы 4 видно, что разработанный нами сэндвич-ИФА дает близкие результаты определения концентрации sFas как в сыворотке, так и в плазме крови человека, при этом метод приготовления плазмы не влияет на результаты определения концентрации.

Определяли, насколько полно разработанный нами сэндвич-ИФА выявляет sFas в сыворотке крови, для этого в сыворотку, в которой первоначально не был выявлен sFas, вносили различные количества Fas и определяли его концентрацию, затем сравнивали определяемый показатель концентрации Fas в сыворотке с ожидаемой величиной. Результаты данных экспериментов отражены в таблице 5.

Таблица 5. Сравнительные результаты выявления привнесенного в сыворотку крови Fas

Концентрация добавленного Fas, нг/мл

% выявления добавленного Fas

9.0

86,  98,  93

6.0

88,  105,  99

3.0

87,  118,  113

1.5

102,  112,  95

0.8

105,  95,  98

Средний % выявления Fas

99.6

Из данных таблицы 5 видно, что присутствующие в сыворотке крови компоненты не влияют на выявление sFas c помощью разработанной нами тест-сис­темы.

Определение структуры эпитопов, узнаваемых МА SA-7 и SA-8, с помощью пептидного фагового дисплея

Растворимый Fas является продуктом альтернативного сплайсинга мРНК Fas. В литературе описано несколько изоформ sFas и показано их количественное соотношение на уровне экспрессии мРНК: Fas ≈ FasExo6Del >>> FasExo3,4,6Del > FasExo4Del ≈ FasExo4,6Del ≈ FasExo4,7Del ≈ FasExo3,4Del. Также идентифицированы изоформы FasExo3Del и FasExo8Del (Cascino I. и соавт., 1995, 1996).

Поскольку МА SA-7 и SA-8 взаимодействуют с денатурированным Fas в иммуно­блоттинге, то мы предположили, что эпитопы Fas, узнаваемые каждым из этих антител, являются не конформационными, а линейными. Поэтому для локализации минимальных эпитопов, с которыми взаимодействуют антитела, мы выбрали пептидную фаговую библио­теку PH.D.7ТМ (New England BioLab) с представленностью около 2х109 возможных вари­антов гептапептидов и проводили четыре раунда аффин­ной селекции фаговых частиц из данной библиотеки. После клонирования были отобраны фаги, взаимодействующие с МА SA-7 и SA-8, которые использовали для иммунохимического анализа и определения cтруктуры аминокислотной последователь­ности пептидов, представленных данными фагами. Первичная структура пептидов, экспо­нированных фагами, показана в таблице 6.

Таблица 6. Структура пептидов, экспонированных фагами библиотеки PH.D.-7ТМ, взаимодействующими с МА SA-7 и SA8 против полноразмерного человеческого Fas

Название
клона

Структура пептида в составе фага

Кa, М-1

Название
клона

Структура пептида в составе фага

Кa, М-1

SA-8/III-1

A

K

I

H

F

Y

S

3.9x106

SA-7/IV-1

G

K

I

H

F

F

R

7.0x107

SA-8/III-2

D

K

I

H

F

K

S

5.6x106

SA-7/IV-2

G

Y

K

P

T

F

S

1.1x107

SA-8/III-3

V

N

K

P

H

F

H

7.0x106

SA-7/IV-3

G

Y

K

P

T

F

S

1.1x107

SA-8/V-1

A

Y

I

H

F

L

P

1.4x107

SA-7/IV-4

S

K

I

H

F

H

P

8.0x106

SA-8/IV-2

S

E

I

H

L

M

G

5.0x106

SA-7/IV-5

G

K

I

H

F

F

R

7.0x107

SA-8/IV-3

A

K

I

H

F

H

S

4.5x106

SA-7/IV-6

G

K

I

H

F

F

R

7.0x107

SA-8/IV-4

H

K

P

H

F

P

S

2.6x106

SA-7/IV-7

N

K

I

H

F

Y

P

6.6x106

SA-8/IV-5

A

L

Q

I

H

T

M

3.9x106

SA-7/IV-8

G

K

I

H

F

F

R

7.0x107

SA-8/IV-6

A

Q

I

H

F

L

P

4,0x106

SA-7/IV-9

S

K

I

H

F

L

S

9.4x106

SA-8/IV-7

D

N

P

H

Y

T

T

3.6x106

SA-7/IV-10

S

K

I

H

F

H

P

8.0x106

SA-8/IV-8

G

K

P

H

F

T

T

3.4x106

SA-7/IV-11

G

K

I

H

F

H

P

9.8x106

SA-8/IV-9

S

F

H

I

Y

F

L

7.5x106

SA-7/IV-12

S

K

I

H

F

P

E

1.8x107

SA-8/IV-10

S

K

I

H

F

H

T

5.0x106

SA-7/IV-13

C

K

I

H

F

F

R

1.7x108

SA-8/IV-11

R

K

P

H

F

T

G

6.8x106

SA-7/IV-14

D

K

I

H

F

Y

P

1.0x107

SA-8/IV-12

L

K

L

H

F

N

T

4.2x106

SA-7/IV-15

R

Y

Y

P

Y

F

P

1.1x107

SA-8/IV-13

A

K

I

H

F

Y

S

5.8x106

SA-7/IV-16

A

K

I

H

F

P

P

1.5x107

SA-8/IV-14

R

K

I

H

F

H

P

3.6x106

SA-7/IV-17

E

K

P

H

F

L

V

9.8x106

SA-7/IV-18

A

K

I

H

F

L

P

7.0x106

SA-7/IV-19

H

K

I

H

F

L

P

1.5x107

SA-7/IV-20

R

K

L

H

F

L

P

9.3x106

SA-7/IV-21

S

K

I

H

F

Y

H

5.3x106

Примечание: в таблице жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки, совпадаю­щие со структурой предполагаемого эпитопа для антител; подчеркнуты аминокислотные остатки, являющиеся гомологичной заменой аминокислотного остатка в структуре пред­полагаемого эпитопа для антител.

С целью определения структуры консенсусных мимотопов для антител вычисляли и анализиро­вали частоту встречаемости каждого аминокислотного остатка (а.о.) в пептидах, представленных отобранными фагами. Таким образом, консенсусный мимотоп для антитела SA-7 определили а.о. XKIHFFP. Cовмещение консенсусного мимотопа для антитела SA-7 со структурой полноразмерного Fas позволило предполо­жить, что эпитоп для этого антитела определяют а.о. экстраклеточной части Fas 130—134. Из 6 а.о. консенсусной мимотопной последовательности три остатка совпали со структурой предполагаемого эпитопа. Консенсус­ный мимотоп для антитела SA8 определяли а.о.: XKIHFХS. Совмещение консенсусного мимотопа с аминокислотной последовательностью полноразмерного Fas позволило сделать предположение, что эпитоп для антитела SA8 определяют а.о. 94 — 99 экстраклеточной части Fas. Четыре из семи а.о. консенсусного мимотопа соответство­вали структуре полноразмерного Fas, а остаток изолейцина между остатками лизина и гистидина может считаться гомологичной заменой остатку аланина в структуре предпола­гаемого эпитопа для антитела SA8.

Надо отметить, что структуры консенсусных мимотопов для МА SA-7 и SA-8 сходны между собой, поэтому мы определяли константы аффинности всех отобранных фагов по отношению к МА, на которых проводили селекцию. Для фагов, специфичных к антителу SA-8, не было обнаружено прямой корреляционной зависимости между числом а.о. в мимотопной последовательности, совпадающих со структурой предполагаемого эпитопа, и значением константы аффинности (табл. 6). В то же время для фагов, специ­фичных к антителу SA-7, было показано, что константы аффинности фаговых частиц, в составе которых были представлены пептиды ХKХХFFХ (3 совпадающих остатка из 7), были одними из самых высоких – 7.0х107 M-1. Для фагов, экспонирующих мимотопную последовательность СKХХFFХ (четыре совпадающих аминокислотных остатка из семи), определили самую высокую константу аффинности–1.7х108 М-1. Видимо, остаток цис­теина очень важен для взаимодействия антитела SA-7 с Fas, поэтому в предполагаемый эпитоп, узнаваемый МА SA-7, мы включили остаток цистеина. Таким образом, мы пред­положили, что эпитоп для МА SA-7 определяется а.о. 129—134 экстраклеточной части Fas.

Были синтезированы гексапептиды: пептид №1, соответствующий предполагаемому эпитопу для антитела SA-8 — 94-99: KAHFSS, и пептид №2, соответствующий предпола­гаемому эпитопу для антитела SA-7 — 129-134: CKPNFF. Для подтверждения структуры эпитопов, узнаваемых антителами, были проведены эксперименты по конкурентному ингибированию синтетическими пептидами №1 и №2 взаимодействия антител SA-7 и SA8 с полноразмерным Fas (рис. 3).

Из рисунка 3 видно, что пептид №1, соответствующий предполагаемому эпитопу для МА SA-8, предпочтительно ингибирует взаимодействие антитела SA-8 с полноразмерным Fas, а на взаимодействие МА SA-7 с Fas значительного влияния не оказывает. В то же время пептид №2, соответствующий предполагаемому эпитопу для МА SA-7, предпочти­тельно ингибирует взаимодействие антитела SA-7 с полноразмерным Fas. Отсюда мы сделали заключение, что пептид №1 специфичен к антителу SA-8, а пептид №2 специфи­чен к антителу SA-7.

Таким образом, была определена структура эпитопов для МА SA-7 и SA-8 против полноразмерного человеческого Fas. Эпитоп для антитела SA-7 определяют а.о. Fas 129134 — CKPNFF, а для антитела SA8  – а.о. Fas 94 – 99 — KAHFSS.

Рис. 3. Конкурентное ингибирование взаимодействия антител SA-7 и SA-8 с Fas пептидами №1 и №2

Изоформы sFas являются результатом альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas, состоящей из 9 экзонов. Идентифицировано несколько вариантов сплайсиро­ванной мРНК Fas с делециями различных экзонов, при этом основной изоформой растворимого Fas является FasExo6Del, в которой делетирован только трансмембранный домен, ее экспрессия на несколько порядков превышает суммарную экспрессию остальных минорных изоформ (Cascino I. и соавт., 1995, 1996). Все изоформы sFas содержат а.о., соответствующие первому и второму экзо­нам полноразмерного транскрипта fas. Эпитоп для МА SA-8 определяют а.о. 94-99, коди­руемые нуклеотидами второго экзона fas, т.о. МА SA-8 взаимодействует со всеми изоформами sFas. Делеция третьего экзона происходит при вырезании из полноразмерной мРНК Fas нуклеотидов 391-529, т.е. удаляются а.о. 131200 первичной аминокислотной последовательности полноразмерного Fas. Эпитоп для антитела SA-7 определяют а.о. 129134 полноразмерного Fas, кодируемые нуклеотидами, находящимися на границе вто­рого и третьего экзонов fas, поэтому МА SA-7 не способно взаимодействовать с изофор­мами sFas с делецией а.о., соответствующих третьему экзону.

Таким образом, сэндвич-ИФА на основе антител SA-7 и SA-8 должен детектировать основную изоформу sFas - FasExo6Del и три минорных изоформы: FasExo4Del; FasExo4,6Del; и FasExo4,7Del.

sFas, IL-6, VEGF в сыворотке крови и содержание рецепторов эстрогенов в опухолях при новообразованиях молочной железы

Нами проведено определение концентрации sFas и IL-6 в сыворотке крови 119 больных РМЖ и у 22 больных ДОМЖ в сравнении с соответствующими показателями 55 практически здоровых женщин. Результаты данного исследования показаны в таблице 7.

Таблица 7. Показатели sFas и IL-6 в сыворотке крови больных новообразованиями молочной железы и практически здоровых людей

Категории обследованных

Количество пациентов

sFas, нг/мл

IL-6, пг/мл

M±m,
медиана

Пределы колебаний

M±m,
медиана

Пределы колебаний

Контроль

55

0.8±0.1
0.81

0.3-1.2

1.0±0.1
0.94

1.0-2.0

РМЖ

119

1.9±0.1
1.72

0.4-5.8

1.8±0.1
1.65

0.1-9.7

ДОМЖ

22

1.7±0.3
1.23

0.4-2.4

2.0±0.3
1.96

0.7-3.2

Примечание: р2vs1=0.0004; р3vs1=0.001; р3vs2>0.05; р5vs4=0.01, р6vs4=0.02.

Частота выявления sFas в сыворотке крови у больных РМЖ и ДОМЖ (59% и 73%, соответственно) была достоверно выше, чем у практически здоровых женщин (37%). Концентрация sFas в сыворотке крови больных была достоверно выше, чем в контрольной группе, при этом не было выявлено достоверных различий в показателях sFas между боль­ными РМЖ и ДОМЖ. Частота выявления IL-6 у практически здоровых женщин составила 73%, а в группах больных ДОМЖ и РМЖ IL-6 был выявлен у всех пациенток. Медианы концен­трации IL-6 достоверно не различались между боль­ными РМЖ и ДОМЖ, но при этом достоверно превышали соответствующий показатель группы контроля. Уровни sFas и IL-6 в сыворотке крови достоверно не зависели от возраста больных РМЖ (r=-0.05) и больных ДОМЖ (r=0.19), однако была выявлена отрицательная корреляционная связь между концентрацией sFas и возрас­том в группе больных папилломой (r=-0.85).

У 119 больных первичным РМЖ определяли концентрацию sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови, а также содержание РЭ в ткани опухоли и проводили анализ определяемых показателей в зависимости от основных клинико-морфо­логических критериев заболевания. В нашем исследовании рецептороположительными (РЭ+) мы считали опухоли, в которых содержание РЭ было 10 и более фмоль на 1 мг общего белка цитозольной фракции (фмоль/мг белка). Опухоли, содержащие РЭ в коли­честве ниже 10 фмоль/мг белка, считали рецепторотрицательными (РЭ-). Из 119 первич­ных опухолей при РМЖ в 102 случаях уровень РЭ был выше нуля (86%), однако РЭ+-опухолей было всего 67 (56%). Результаты проведенных исследований представлены в таблице 8.

Содержание РЭ в первичных опухолях изменялось в широких пределах, при этом не выявили корреляционной связи уровня РЭ в опухоли с возрастом больных (r=0.20).

Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови больных РМЖ были достоверно выше, чем в группе контроля (р<0.001), при этом не выявлено зависимости показателей sFas, IL-6 и VEGF от возраста ни в контрольной группе, ни в группе больных РМЖ.

Таблица 8. Показатели sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови и гормональной чувствительности опухоли при раке молочной железы

Исследуемые показатели

Практически здоровые люди

Рак молочной железы

Частота выявления, %

Диапазон колебаний

M±m, медиана

Частота выявления, %

Диапазон колебаний

M±m, медиана

РЭ, фмоль/мг

-

-

-

56

10.1–382.5

73.9±8.6;
46.9

sFas, нг/мл

47

0.3 – 1.2

0.8±0.1;
0.8

59

0.5-2.6

1.9±0.1;
1.7

IL6, пг/мл

73

0.2 – 2.0

1.0±0.1;
0.9

100

0.6-2.9

1.8±0.1;
1.6

VEGF, пг/мл

100

15.0-315.0

179.0±13.4
154.0

100

35.6–1090.0

312.8±27.2;
263.9

Был проведен анализ показателей рецепторного статуса опухоли и sFas, IL6 и VEGF в сыворотке крови больных в зависимости от стадии заболевания (табл. 9).

Таблица 9. Показатели sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови и гормональной чувствительности опухоли при различных стадиях РМЖ

Исследуемые показатели

Стадия РМЖ и количество обследованных больных (n)

Ia, n=22

IIa, n=46

IIb, n=20

IIIa, n=14

IIIb, n=13

IV, n=4

Частота выявления,  медиана

РЭ, фмоль/мг

52%
70.3

62%
75.9

60%
42.0

34%
25.6

30%
21.8

не было выявлено

IL6, пг/мл

0.9

1.7

1.5

1.5

1.8

2.0

sFas, нг/мл

63%
1.7

68%
2.2

58%
1.7

55%
1.5

40%
1.8

не был выявлен

VEGF, пг/мл

173.6

267.4

265.0

286.2

306.4

447.5

IL-6 и VEGF были выявлены у всех больных. Прогрессирование РМЖ характеризовало снижение частоты выявления sFas в сыворотке крови, при этом концентрация sFas достоверно не изменялась. В отличие показателей sFas, медианы концентрации IL6 и VEGF достоверно повышались с увеличением стадии заболевания. Корреляционный анализ не выявил зависимости между показателями IL6 и VEGF, но при этом была обнаружена отри­цательная корреляционная связь между уровнями sFas и IL-6 при III-IV стадии заболева­ния (r=-0.54). Было также отмечено, что с увеличением стадии заболевания наблюдается снижение частоты выявления и содержания РЭ в опухолях (р=0.08).

Показатели sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови и РЭ-статуса опухолей были про­анализированы в зависимости от гистологического строения опухолей, данные анализа приведены в таблице 10.

Таблица 10. Показатели sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови и гормональной чувствительности опухоли при РМЖ в зависимости от гистогенеза новообразования

Морфология опухолей

РЭ

IL-6

sFas

VEGF

% выявления

медиана, фмоль/мг

% выявления

медиана, пг/мл

% выявления

медиана, нг/мл

% выявления

медиана, пг/мл

Протоковый инфильтратив-ный рак,

73 больных

52

60.6

100

1.7

61

1.8

100

254.5

Дольковый инфильтратив-ный рак,

33 больных

59

39.8

100

1.1

44

1.8

100

259.8

Смешанный рак,

9 больных

77

65.2

100

1.8

33

1.5

100

270.0

Редкие варианты,

4 больных

100

11.5

100

1.6

100

0.7; 0.7; 1.3; 2.9

100

272.0

Статистические методы анализа удалось применить только для групп больных протоковым и дольковым инфильтративным раком, так как остальные морфологические варианты РМЖ были редко представлены. Показатели sFas и VEGF значимо не зависели от гистогенеза РМЖ, при этом медиана концентрации IL-6 была выше при протоковом раке, чем при дольковом (р=0.02).

У больных с сохраненной менструальной функцией частота выявления sFas соста­вила 57%, средний уровень – 1.8±0.2 нг/мл, у больных в менопаузе – 63% и 1.9±0.2 нг/мл, соответственно. Частота выявления sFas в первой фазе менструального цикла составила 66%, во второй – 52%, средний уровень sFas был немного выше во второй фазе (2.1±0.4 нг/мл), чем в первой (1.7±0.2 нг/мл), но достоверных различий показателей sFas в крови больных РМЖ в зависимости от их репродуктивной функции и фазы менструального цикла не выявили. Концентрация VEGF также значимо не отличалась между больными РМЖ в репродуктивном периоде и в постменопаузе. Уровень IL-6 был достоверно выше у больных в постмено­паузальном периоде, чем в репродуктивном. У больных РМЖ в репродуктивном периоде выявили слабую, но достоверную (r=-0.32; p=0.048) обратную корреляционную зависи­мость между возрастом пациенток и уровнем IL-6 в сыворотке крови, причем эта зависи­мость была более выражена у больных протоковым инфильтративным РМЖ (r=-0.38; p=0.049). Среди больных с сохраненной менструальной функцией только у 37% женщин были выявлены РЭ+ опухоли, тогда как в менопаузе частота выявления РЭ+ опухолей была 68%. Средний уровень РЭ в опухолях больных в менопаузе составил 87.1±11.5 фмоль/мг (медиана 69.9) и был достоверно выше, чем в опухолях больных репродуктив­ного возраста – 45.4±8.46 фмоль/мг (медиана 34.1) (р=0.027).

Частота выявления sFas у больных с РЭ+ опухолями составила 64%, средний уровень – 1.9±0.2 нг/мл (медиана – 1.7). При РЭ- опухолях частота выявления была ниже – 50%, средний уровень – 1.9±0.3 нг/мл (медиана – 1.8). Таким образом, в сыворотке крови больных с РЭ+ опухолями частота выявления sFas была выше (р=0.049), чем у пациенток с РЭ-отрицательными опухолями, при этом достоверных различий кон­центрации sFas между этими группами не отмечено. Корреляционная связь между уров­нями sFas и РЭ отсутствовала (r=-0.03).

Показатели IL-6 и VEGF в сыворотке крови не различались при положительном и отрицательном статусе опухолей (р=0.9).

Анализ показателей sFas в сыворотке крови больных РМЖ в зависимости от отдаленных результатов лечения показал, что уровень sFas в сыво­ротке крови не был достоверно связан с показателями общей (р=0.213) и безрецидивной выживаемости (р=0.245) за 5-летний период наблюдения.

sFas, VEGF и общая активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови больных новообразованиями скелета

В настоящем исследовании проводили определение концентрации sFas и общей активности ЩФ у 99 больных новообразованиями костей (61 мужчина и 38 женщин) в возрасте от 14 до 59 лет. Определение концентрации VEGF проводили только у больных остеогенной саркомой и опухолью Юинга.

Частота выявления sFas в сыворотке крови в общей группе больных новообразо­ваниями костей составила 88%, что в 2.4 больше, чем у практически здоровых людей (табл. 11). Концентрация sFas в сыворотке больных колебалась от 0.5 до 24.6 нг/мл, сред­ний уровень составил 4.5±0.5 нг/мл, что в 5.2 раза выше, чем у практически здоровых людей (р=0.0001). Пороговым значением концентрации sFas в сыворотке крови считали верхнюю границу диапазона колебаний в контрольной группе – 1.2 нг/мл, уровень sFas, превышающий данное значение, считали повышенным. Не было выявлено достоверных различий в показателях sFas между больными злокачественными и доброкачественными опухолями костей: частота выявления 89% и 92%, средний уровень - 4.5±1.7 нг/мл и 3.9±0.8 нг/мл, соответственно. В общей группе больных не было выявлено зависимости уровня sFas от локализации опухоли в трубчатых или плоских костях, а также от пола больных (табл. 12). У больных в возрасте до 19 лет средний показатель sFas в сыворотке крови равнялся 5.2±0.5 нг/мл, у пациентов старше 19 лет – 3.9±0.4 нг/мл, что в 1.3 раза ниже (р=0.049).

Общая активность ЩФ у пациентов с новообразованиями скелета колеба­лась в широких пределах – от 102 до 6979 ЕД/л, и в среднем составила 535±106 ЕД/л. Повышение общей активности ЩФ в общей группе больных отметили у 47 пациентов (49%), 11 женщин и 36 мужчин, при этом содержание sFas было повышено у 78 пациентов (81%), 32 женщин (33%) и 46 мужчин (48%). В общей группе больных кор­реляционной связи между уровнем sFas и общей активностью ЩФ в сыворотке крови не выявили.

Таблица 11. Показатели sFas в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными новообразованиями костей

Категория обследованных

Возраст, годы

Число наблюдений

Частота выявления sFas, %

sFas, нг/мл (M±m)

Практически здоровые люди

17-67

102

36

0.9±0.3

Новообразования скелета

26.4±1.3

99

88

4.5±0.5

Первичная остеогенная саркома

19.0±1.3

32

87

3.7±0.9

Первичная хондросаркома

32.3±3.8

17

88

4.3±1.1

Опухоль Юинга

19.0±2.5

10

100

8.3±3.4

Злокачественная фибро-гистиоцитома кости

35.1±2.6

9

78

3.4±0.6

Гигантоклеточная опухоль кости

28.1±2.3

10

100

4.9±2.6

Доброкачественные опухоли

31.6±5.7

26

98

4.7±2.5

У 10 пациентов при первичном обследовании были обнаружены одиночные и множественные метастазы опухоли в легких. Средний уровень sFas в этой группе был в 2.4 больше, чем у практически здоровых людей и в 2.4 раза меньше, чем средний показатель содержания sFas общей группы больных новообразованиями скелета, однако различия не достоверны (табл. 12). Общая активность ЩФ была повышена у 4 (40%) из них. Выявить достоверной зависимости между уровнем sFas и общей активностью ЩФ в сыворотке крови больных опухолями костей в стадии прогрессирования не удалось, возможно, из-за незначительного количества обследованных.

Таблица 12. Показатели sFas в сыворотке крови больных опухолями костей
в зависимости от пола, локализации опухоли, возраста и наличия метастазов

Категория обследованных

Число наблюдений

Частота выявления sFas, %

Средний уровень sFas (M±m), нг/мл

Практически здоровые люди

102

36

0.9±0.31

Новообразования костей

101

88

4.5±0.52

Новообразования костей без метастазов

91

88

4.8±0.63

Новообразования костей с метастазами

10

80

2.1±0.44

Пол

Мужчины

53

88

4.3±0.7

Женщины

48

90

4.7±0.6

Локализация опухоли

Трубчатые кости

61

85

4.3±0.7

Плоские кости

30

93

4.9±0.7

Примечание: p1vs2<0.001; p1vs3<0.001; p3vs4>0.05; p5vs6<0.001.

В группе больных опухолью Юинга было 7 мужчин и 3 женщины в возрасте от 15 до 33 лет. sFas в сыворотке крови был выявлен у всех пациентов, его средний уровень был одним из самых высоких среди всех нозологических форм новообразований скелета, при этом повышенная концентрация sFas была отмечена у 7 человек (70%) (табл. 11). Средний уровень концентрации VEGF больных опухолью Юинга (448.0±98.6 пг/мл) достоверно превышал соответствующий показатель контрольной группы, корреляционной зависимости между показателями sFas и VEGF и sFas и общей активностью ЩФ выявлено не было.

При первичной остеогенной саркоме у 72% (23) больных наблюдали повышенное содержание sFas и у 72% (23) отмечали также повышение общей активности ЩФ. У 6 из них показатели активности фермента во много раз превышали норму и находились в пределах 1165-5394 ЕД/л, повышенное содержание sFas было отмечено у 5 из этих больных (от 1.3 до 5.7 нг/мл). Статистический анализ выявил достоверную положительную корреляцию между показателями sFas и общей активности ЩФ при первичной остеогенной саркоме (r=0.75, p=0.049). В этой группе больных проводили определение концентрации VEGF в сыворотке крови (табл. 13).

Таблица 13. Показатели sFas и VEGF в сыворотке крови больных остеогенной саркомой и практически здоровых людей в зависимости от пола

Категория обследованных

Число наблюдений

Возраст, годы

sFas, нг/мл

VEGF, пг/мл

M±m

Пределы колебаний

M±m

Пределы колебаний

Практи-чески здоровые люди

Муж.

20

18.0±0.5

0.9±0.4

0.3 – 1.2

68.4±29.51

14.4-149.3

Жен.

11

28.0±4.6

0.9±0.3

0.3 – 1.2

230.2±20.1

190.3-250.3

Остеоген-ная саркома

Муж.

23

17.2±1.3

4.0±1.2

0.5 – 24.6

240.1±75.42

78.5-521.4

Жен.

9

26.3±4.1

3.1±0.6

0.6 – 16.2

198.0±45.8

110.2-287.6

Примечание: p1vs2<0.05.

Средний уровень VEGF у женщин контрольной группы превышал соответствующий показатель мужчин. Средний уровень VEGF у мужчин с первичной остеогенной саркомой достоверно превышал средний уровень VEGF в сыворотке крови практически здоровых мужчин, но не отличался от показателя женщин контрольной группы. Различий в среднем уровне VEGF в сыворотке крови между женщинами с первичной остеогенной саркомой и женщинами контрольной группы выявлено не было. Не было выявлено корреляции между уровнями sFas и VEGF в группе больных первичной остеогенной саркомой.

Мы изучали связь уровня sFas в сыворотке крови больных остеогенной саркомой с прогнозом данного заболевания.

Максимальный срок наблюдения за обследованными больными составил 3 года, за этот период времени удалось проследить только одного больного, который умер от основного заболевания через 36 месяцев от начала лечения. Общая выживаемость в группе за указанный срок составила 0%, безрецидивная – за 35 месяцев – 15.6%.

У 9 из 32 больных остеогенной саркомой уровень sFas в сыворотке крови не превышал 1.2 нг/мл. 4 (44.8%) из них за время наблюдения умерли от основного заболевания, 5 – остались живы. Общая выживаемость, как и безрецидивная, за 35 месяцев в этой группе больных составила 55.2%.

В крови 23 больных при первичном обследовании определили повышенное содержание sFas, за время наблюдения 20 (87%) из них умерли. Общая выживаемость в этой группе больных за 35 месяцев составила 13%, безрецидивная – 8.7%.

Таким образом, у больных остеогенной саркомой с повышенным содержанием sFas (>1.2 нг/мл) в крови показатели общей (р=0.018) и безрецидивной (р=0.012) выживаемости больных первичной остеогенной саркомой за 35 месяцев были хуже, чем у больных с содержанием sFas в крови в пределах нормы.

Содержание sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови больных новообразованиями яичников

sFas выявляли в сыворотке крови у 80.2% (162) больных ДОЯ, у 55.3% (78) больных РЯ и у 40% женщин контрольной группы (48). Концентрация sFas в сыворотке крови больных новообразованиями яичников была достоверно выше, чем в группе контроля (р=0.0001), при этом различия уровней sFas между группами больных ДОЯ и раком яичников были статистически не достоверны (р=0.58) (табл. 14).

Таблица 14. Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови контрольной группы и больных новообразованиями яичников

Группы

Число больных

Пределы колебаний, медиана sFas, нг/мл

Пределы колебаний, медиана VEGF, пг/мл

Пределы колебаний, медиана IL-6, пг/мл

Контроль

120

0.4 - 1.2
0.9

15.0 – 323.0
198.0

0.6 - 3.1
1.0

Больные ДОЯ

206

0.7 - 20.0
2.2

16.9 – 1098.0
208.4

0.7 - 13.4
2.9

Больные РЯ

141

0.7 - 20.5
2.5

75.6 – 1029.0
56.01

0.4 - 40.9
8.9

Концентрация VEGF в сыворотке крови больных РЯ была достоверно выше, чем у больных ДОЯ и женщин контрольной группы, различий между группой контроля и группой больных ДОЯ не выявили, при этом медиана уровня IL-6 у больных ДОЯ была выше, чем в группе контроля, но ниже, чем у больных РЯ. Были определены пороговые значения показателей, наилучшим образом разделяющих обследованные группы. Так, уровни sFas и VEGF, разделяющие группы больных опухолями яичников и группу контроля, равнялись 1.2 нг/мл и 350.0 пг/мл, соответственно, а уровни IL-6 – 1.5 и 4.0 пг/мл были пороговыми значениями, разделяющими группы контроля и больных ДОЯ, и пациентов ДОЯ и РЯ, соответственно.

Уровни sFas и IL-6 в сыворотке крови достоверно не зависели от возраста и фазы менструального цикла больных во всех обследованных группах, тогда как у больных ДОЯ концентрация VEGF повышалась пропорционально возрасту пациенток (р=0.005).

Концентрация sFas зависела от гистогенеза опухоли у больных ДОЯ и РЯ. Так, при эндометриоидной кисте концентрация sFas была достоверно выше, чем при кисте желтого тела (р=0.038) и при фолликулярной кисте (р=0.01). При папиллярной цистаденоме, опухоли Бреннера, муцинозной кисте и муцинозной пограничной опухоли выявляли только «высокие» уровни sFas. Следует отметить, что содержание sFas в сыворотке крови больных фибромой и у половины пациенток с фолликулярной кистой, цистаденофибромой, простой серозной кистой яичников соответствовали уровню sFas группы контроля. Уровень sFas при папиллярной цистаденокарциноме был достоверно выше, чем при серозной (р=0.018). «Низкие» уровни sFas у больных раком яичников реже выявляли при папиллярной цистаденокарциноме (10.5%), муцинозной аденокарциноме (33.3%) и при эндометриоидной аденокарциноме (35.7%), но различия между группами были не достоверны из-за несопоставимого количества больных в группах (р=0.1).

Концентрация VEGF в сыворотке крови больных ДОЯ также зависела от гистологического строения опухоли (р=0.027). Наибольшие медианы концентрации VEGF были у больных опухолью Бреннера (733.3 пг/мл), пограничной цистаденомой (454.3 пг/мл) и муцинозной пограничной опухолью (624.4 пг/мл), а наименьшие – у больных дермоидной кистой (84.4 пг/мл), кистой желтого тела (78.0 пг/мл), фолликулярной кистой (67.5 пг/мл), папиллярной цистаденомой (59.5 пг/мл) и простой серозной кистой (73.3 пг/мл). «Высокие» значения sFas и VEGF в сыворотке крови больных этими опухолями позволяют предположить злокачественный потенциал этих новообразований. Наиболее высокую концентрацию VEGF при РЯ отмечали у больных серозной цистаденокарциномой (796.0 пг/мл), папиллярной цистаденокарциномой (670.5 пг/мл) и серозным раком (625.0 пг/мл), а наименьшие – у больных эндометриоидной аденокарциномой (409.0 пг/мл). При этом у 25% больных серозной цистаденокарциномой уровни VEGF соответствовали значениям показателя в контрольной группе (все больные с 3 стадией заболевания с выраженным асцитом, с метастазами в сигмовидную и тонкую кишку).

Содержание IL-6 в сыворотке крови больных простыми серозными и фолликулярными кистами яичников достоверно не отличалось от соответствующего показателя контрольной группы. В то же время уровень IL-6 при серозной и папиллярной цистаденоме и при цистаденофиброме достоверно не отличался от соответствующего показателя больных раком яичников.

Концентрация sFas достоверно зависела от размера опухоли у больных ДОЯ и РЯ. Так, в группе больных ДОЯ при размере опухоли до 5 см медиана концентрации sFas составила 1.6 нг/мл, а при размере опухоли более 5 см – 2.5 нг/мл (р=0.001). В группе больных РЯ с опухолью до 5 см медиана концентрации sFas была 0.8 нг/мл, а при бльших размерах опухоли – 2.0 нг/мл (р=0.0005). При этом выявили корреляционную связь уровня sFas и размера опухоли у больных эндометриоидной кистой яичников (r=0.86; p=0.003), серозной цистаденомой во II фазе менструального цикла (r=0.86; p=0.044) и папиллярной цистаденокарциномой (r=0.49; p=0.033). Уровни VEGF и IL-6 достоверно не зависели от размера опухоли у больных ДОЯ и РЯ, при этом у больных ДОЯ пропорциональное изменение концентрации IL-6 относительно размера опухоли наблюдали только при «низких» значениях sFas в сыворотке крови (r=0.6; p=0.003).

Концентрация sFas также достоверно зависела от стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли (табл. 15 и 16).

Таблица 15. Показатели sFas больных РЯ в зависимости от стадии заболевания

Стадия заболевания

Число больных

sFas, нг/мл

M±m

Медиана

1

28

1.2±0.4

0.8

2

34

1.8±0.4

1.2

3

74

2.0±0.5

1.4

4

5

2.4±0.9

1.6

Уровни VEGF и IL-6 достоверно не зависели от стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли.

У больных РЯ выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнями sFas и VEGF при концентрации IL-6 более 4 пг/мл (r=0.75; p=0.001) и обратная корреляционная зависимость между концентрацией sFas и IL-6 при метастазах в толстую кишку (r=-0.68; p=0.014). В группе больных РЯ с размером первичной опухоли более 10 см обнаружили прямую корреляционную зависимость между содержанием IL-6 и VEGF в сыворотке крови (r=0.62; p=0.07).

Таблица 16. Показатели sFas у больных РЯ в зависимости от степени дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки опухоли

Число больных

sFas, нг/мл

M±m

Медиана

Низкая и умеренная

62

2.7±0.5

1.7

Высокая

79

1.6±0.4

1.1

В сыворотке крови практически здоровых женщин преобладали одновременно «низкие» значения как IL-6, так и sFas в 75% наблюдений. У четверти женщин контрольной группы при «низком» уровне sFas концентрация IL-6 колебалась от 1.5 пг/мл до 4 пг/мл. В сыворотке крови больных ДОЯ преобладали «высокие» концентрации sFas, а значения концентрации IL-6 колебались в том же диапазоне – от 1.5 пг/мл до 4.0 пг/мл (63% наблюдений). Таким образом, для ДОЯ характерна высокая концентрация sFas в сыворотке крови при концентрации IL-6, сопоставимой с показателями контрольной группы. Одновременно «низкие» значения sFas и IL-6 были выявлены в сыворотке крови только у 8.6% больных ДОЯ.

Обнаружено, что в сыворотке крови 50% больных РЯ преобладали одновременно «высокие» значения обоих показателей. Одновременно «низкие» значения sFas и IL-6 выявлены только у 8.3% больных раком яичников. Различия между группами больных ДОЯ и РЯ были высоко достоверными (р=0.001) (рис. 4).

Рис. 4. Распределение больных доброкачественными новообразованиями, раком яичников и женщин контрольной группы в зависимости от пороговых значений sFas и IL-6 в сыворотке крови

Следует отметить, что у 57% больных 1 стадии РЯ обнаруживали повышенные значения всех трех показателей, у 35.7% больных был повышен либо sFas, либо IL-6 и таким образом, диагностическая ценность показателей была очень высока уже при 1 стадии заболевания.

Была изучена связь первичного уровня sFas с показателями общей и безрецидивной выживаемости больных РЯ за 5летний период наблюдения. Общая выживаемость больных РЯ с концентрацией sFas в сыворотке крови выше 5 нг/мл уменьшалась не достоверно (р=0.3). При этом в группе больных папиллярной цистаденокарциномой с уровнем sFas выше 5 нг/мл показатели 5-летней общей выживаемости (31.1±17.9%) были хуже, чем у этой же категории больных с первичной концентрацией sFas менее 5 нг/мл (83.3±15.2%), р=0.01. Выявили также статистически значимое снижение общей выживаемости (р=0.0042) больных РЯ с размерами опухоли 5-10 см при содержании sFas в сыворотке крови более 5 нг/мл: 5-летняя выживаемость в этой группе составила 31.3±25.5%, а при уровне sFas менее 5 нг/мл – 89.9±6.9%. Можно предположить, что sFas в сыворотке крови в концентрации выше 5 нг/мл влияет на общую выживаемость больных РЯ в сочетании с некоторыми другими неблагоприятными факторами.

Выявлено достоверное снижение безрецидивной выживаемости больных РЯ без метастазов (р=0.028) при содержании sFas в сыворотке крови выше 5 нг/мл. Так, 3-летняя безрецидивная выживаемость больных раком яичников этой группы составила 30.0±9.4%, а медиана срока жизни без рецидива болезни равнялась 2.3 года. В то же время 3-летняя безрецидивная выживаемость больных раком яичников с уровнем sFas в сыворотке крови ниже 5 нг/мл составила 52.8±6.9%, а медиана безрецидивной выживаемости – 3 года (рис. 5).

Рис. 5. Безрецидивная выживаемость больных раком яичников в зависимости
от уровня sFas в сыворотке крови

Таким образом, нами показана связь показателей sFas в сыворотке крови больных раком яичников с показателями общей и безрецидивной выживаемости пациенток.

Содержание sFas, VEGF, IL-6 в сыворотке крови больных раком тела матки

Определяли концентрацию sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови у 111 больных раком тела матки и у 120 практически здоровых женщин в возрасте от 18 до 67 лет. Концентрация всех изучаемых факторов в сыворотке крови больных РТМ высоко достоверно превышала соответствующие показатели контрольной группы (табл. 17).

Таблица 17. Показатели sFas, и VEGF IL-6 в сыворотке крови больных РТМ

Группы,
число
обследованных

sFas, нг/мл

VEGF, пг/мл

IL-6, пг/мл

M±m

Медиана

Диапазон колебаний

M±m

Медиана

Диапазон колебаний

M±m

Медиана

Диапазон колебаний

Контроль,
120

0.9±0.1
0.9

0.3 - 1.2

179.7±13.4
198.0

15.0-323.0

1.1±0.4
1.0

0.56 - 3.1

Больные РТМ,
111

5.3±0.5
3.7

0.6 - 21.0

293.1±30.9
349.0

15.0 -1090.0

13.6±1.2
5.5

0.9 - 40.9

Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови высоко достоверно зависели от размера опухоли больных РТМ (табл. 18).

Таблица 18. Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови больных РТМ
в зависимости от размера опухоли

Размер опухоли, число больных

sFas, нг/мл

VEGF, пг/мл

IL-6, пг/мл

M±m

Медиана

Диапазон колебаний

M±m

Медиана

Диапазон колебаний

M±m

Медиана

Диапазон колебаний

До 2 см,
68

3.0±0.3
1.9

0.6-12.0

76.3±18.8
23.3

15-1024

6.0±0.8
3.1

0.9-40.8

2.1 - 5.0 см,
34

8.4±1.0
6.9

0.9-21.0

678.4±37.9
676.5

41-1067

26.5±1.7
27.9

2.0-40.9

5.1 см и более,
9

11.4±1.4
12.6

5.9-18.9

834.0±78.3
915.0

432-1090

35.4±1.6
36.8

25.9-40.5

Обнаружена корреляционная связь между содержанием sFas и размером опухоли (r=0.65; p=0.0001), причем степень тесноты этой зависимости была выше в 1 фазе менструального цикла (r=0.68; p=0.001). Уровень VEGF при РТМ также коррелировал с размером опухоли (r=0.8; p=0.001).

Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови больных РТМ достоверно зависели от стадии заболевания (табл. 19).

Таблица 19. Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови больных РТМ
в зависимости от стадии заболевания

Стадия заболевания,
число больных

sFas, нг/мл

VEGF, пг/мл

IL-6, пг/мл

M±m

Медиана

Диапазон колебаний

M±m

Медиана

Диапазон колебаний

M±m

Медиана

Диапазон колебаний

1,
n=24

1.8±0.3
1.0

0.7-6.3

29.0±3.3
19.0

15-123

3.5±0.6
2.5

0.9-21.5

2,
n=40

3.4±0.5
2.4

0.6-12.0

50.6±10.9
23.5

15-345

6.0±0.9
3.6

0.9-26.6

3,
n=37

8.5±1.0
6.8

0.9-21.0

688.1±36.6
678.0

45.7-1067.0

26.5±1.8
27.9

1.5-40.9

4,
n=10

9.2±1.2
8.4

4.0-14.3

842.7±68.8
906.0

456-1090

35.5±1.4
36.9

25.9-40.5

Частота выявления одновременно «высоких» значений концентрации sFas, VEGF и IL-6 была наибольшей в 3 и 4 стадии болезни, при этом у половины больных 1 стадии обнаруживали одновременно «низкие» уровни изучаемых факторов.

Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови высоко достоверно зависели также от степени дифференцировки опухоли больных РТМ (табл. 20).

Таблица 20. Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови больных РТМ
в зависимости от степени дифференцировки опухоли

Степень дифференци-ровки опухоли, число больных

sFas, нг/мл

VEGF, пг/мл

IL-6, пг/мл

M±m,

медиана

Диапазон колебаний

M±m,

медиана

Диапазон колебаний

M±m,

медиана

Диапазон колебаний

G1,
n=34

1.9±0.3
1.4

0.7-6.3

33.9±5.4
23

15-234

4.0±0.5
2.9

0.9-21.5

G2,
n=40

4.5±0.6
3.7

0.6-14.1

193.4±44.6
34.0

15-1024

10.7±1.8
3.6

1.3-40.9

G3,
n=37

9.3±1.0
7.1

1.0-21.0

717.0±37.5
781.0

156-1090

28.4±1.7
29.6

7.6-40.8

При низкой степени дифференцировки опухоли у больных РТМ частота выявления в сыворотке крови одновременно высоких значений концентрации sFas, VEGF и IL-6 была наибольшей.

Концентрация изучаемых факторов не зависела от морфогенеза опухоли, но достоверно повышалась при увеличении глубины прорастания опухоли в стенку матки (табл. 21).

Таблица 21. Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови больных РТМ
в зависимости от глубины прорастания опухоли в стенку матки

Глубина прорастания в стенку матки,

число больных

sFas, нг/мл

VEGF, пг/мл

IL-6, пг/мл

M±m

Медиана

Диапазон колеба-ний

M±m

Медиана

Диапазон колеба-ний

M±m

Медиана

Диапазон колеба-ний

До 1 см,

n=39

3.3±0.4
2.4

0.6-12.0

61.1±17.4
23.5

15-670

6.2±0.9
3.6

0.9-28.1

Более 1 см, n=10

5.7±1.0
6.6

1.0-9.8

563.2±112.2
678.0

19-1024

24.6±4.7
28.8

1.5-40.8

Менее миометрия,
n=4

9.0±4.1
6.6

1.9-21.0

527.8±45.5
551.5

398-610

33.7±3.4
35.9

23.7-39.1

Более миометрия,
n=26

8.9±1.1
6.9

1.7-20.5

737.7±42.1
785.0

345-1090

27.8±1.9
27.8

9.6-40.9

В пределах

эндометрия,

n=32

3.0±0.7
1.4

0.7-14.5

74.6±25.3
23.0

15-895

4.7±0.9
2.8

0.9-31.2

Выявили достоверные корреляционные связи уровней sFas и IL-6 (r=0.56; p=0.01), sFas и VEGF (r=0.58; p=0.01) и VEGF и IL-6 (r=0.79; p=0.01) в сыворотке крови больных РТМ.

У 36.9% больных РТМ обнаружили одновременно «высокие» уровни всех трех показателей в сыворотке крови, у 27.9% пациенток – «высокое» содержание sFas при «низких» концентрациях IL-6 и VEGF, у 10.8% больных — «высокие» уровни sFas и IL-6 при «низком» содержании VEGF, у 18.9% – одновременно «низкие» значения всех показателей. Наиболее редко выявляли сочетание «высоких» уровней sFas и VEGF при «низком» содержании IL-6 в сыворотке крови больных раком тела матки, а также сочетание «высоких» концентраций VEGF или IL-6 при «низком» уровне sFas (4.5%) (рис. 6). Частота выявления неблагоприятного уровня sFas в сыворотке крови больных раком тела матки составила 76.6% (85) и была выше частоты выявления неблагоприятных уровней IL-6 и VEGF.

Рис. 6. Распределение больных раком тела матки в зависимости от уровней sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови

Важно отметить, что у большинства больных в 1 стадии заболевания концентрация изучаемых факторов не превышала соответствующих значений группы контроля. Повышенную концентрацию sFas наблюдали у 37.5% больных РТМ в 1 стадии, IL-6 – у 4.2%, sFas и IL-6 – у 8.4%. Таким образом, при 1 стадии РТМ прогностическая информативность VEGF составляла 0%, IL-6 – 12.5%, sFas – 45.9%. Следовательно, при выявлении ранней стадии РТМ наибольшей диагностической ценностью обладал sFas.

С целью установления диагностической значимости sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови больных РТМ и практически здоровых женщин контрольной группы проводили дискриминантный анализ. Были получены хорошие результаты распознавания: в классе контрольной группы – 92.3% правильных распознаваний, в классе больных раком тела матки – 91%, общая ошибка составила 8.9% при учете показателей sFas, VEGF и IL-6 и возраста больных. При учете только концентрации sFas в сыворотке крови, возраста обследуемой и фазы менструального цикла качество распознавания было несколько ниже, однако также удовлетворительным (1 класс – 85.7%, 2 класс – 92.9%, общая ошибка – 10.3%).

«Высокие» и «низкие» уровни sFas в сыворотке крови были достоверно связаны с показателями общей выживаемости больных РТМ (р=0.0021). Так, 5-летняя общая выживаемость больных раком тела матки с «низкими» значениями sFas составила 95.7±4.3% (медиана выживаемости не достигнута), а при «высоких» его значениях — 65.3±5.9% (медиана не достигнута).

Наблюдали также достоверное (р=0.0008) различие показателей безрецидивной выживаемости у больных РТМ при «низких» и «высоких» уровнях sFas в сыворотке крови (рис. 7). У больных раком тела матки с «низким» содержанием растворимого Fas 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 19.2±7.7% (медиана 4 года), а при «высоких» — 7.6±3.8% (медиана 2.9 лет).

Рис. 7. Безрецидивная выживаемость больных РТМ в зависимости от уровня sFas
в сыворотке крови

sFas и VEGF в сыворотке крови больных колоректальным раком

Проводили определение концентрации sFas и VEGF у 113 первичных больных КРР и анализ изучаемых показателей в зависимости от основных клинических характеристик заболевания. Растворимый Fas был выявлен в сыворотке крови 104 больных колоректальным раком (92.5%), концентрация sFas колебалась от 0.6 до 14.5 нг/мл, медиана – 2.3 нг/мл. Эти показатели были достоверно выше, чем в контрольной группе. Большинство значений концентрации sFas у больных КРР находилось в интервалах от 2 до 3 нг/мл – (33.3%), у 8 пациентов (7.0%) sFas выявлен не был. Не было достоверных различий в уровне sFas в сыворотке крови между мужчинами и женщинами, больными колоректальным раком (р=0.45).

VEGF был выявлен у всех обследованных больных КРР. Концентрация VEGF колебалась от 125.0 до 557.0 нг/мл, медиана равнялась 222.5 нг/мл. Большинство значений концентрации VEGF у обследованных нами больных злокачественными новообразованиями ободочной и прямой кишок находилось в интервалах от 200 до 300 пг/мл (38.2%). Средний уровень VEGF у мужчин, больных КРР был достоверно выше, чем у мужчин группы контроля (72.3±28.3 пг/мл). Различия концентрации VEGF между женщинами, больными КРР, и женщинами контрольной группы были не достоверны – средние уровни VEGF 287.9±34.4 и 227.3±16.4 пг/мл, соответственно.

Уровни sFas и VEGF в сыворотке крови обследованных нами больных колоректальным раком повышались с увеличением стадии заболевания (табл. 22).

Таблица 22. Показатели sFas и VEGF в сыворотке крови больных колоректальным раком при разных стадиях заболевания

Стадия заболевания (по Duke’s)

Число больных

sFas, нг/мл

VEGF, пг/мл

M±m

медиана

M±m

медиана

A

30

1.7±0.6

1.2

175.1±9.2

174.0

B

39

1.9±0.3

2.1

223.1±13.7

215.0

C

30

3.5±0.6

2.7

396.2±33.7

405.0

D

14

4.6±0.1

4.7

465.0±39.4

454.0

Не выявлено различий в показателях sFas между мужчинами и женщинами при одинаковых стадиях заболевания, тогда как концентрация VEGF на поздних стадиях болезни была выше у женщин, чем у мужчин.

Дисперсионный анализ не выявил различий в уровнях sFas в зависимости от степени дифференцировки опухоли у больных КРР (р=0.8), в то же время концентрация VEGF при низкой степени дифференцировки опухоли была выше, чем при умеренной и высокой (р=0.036). Не выявлено различий в средних уровнях VEGF между мужчинами и женщинами в зависимости от степени дифференцировки колоректальной аденокарциномы.

Обнаружили достоверное (р=0.044) повышение концентрации sFas при увеличении глубины инвазии опухоли в стенку кишки (табл. 23), при этом значительно более низкие уровни sFas были выявлены у больных КРР при прорастании опухоли в мышечный слой (0.7±0.2 нг/мл) по сравнению с прорастанием во все слои кишки (2.3±0.6 нг/мл) (р=0.03). Также выявили достоверное (р<0.05) повышение концентрации VEGF в сыворотке крови в зависимости от глубины инвазии опухоли.

Таблица 23. Показатели sFas и VEGF в сыворотке крови больных колоректальным раком в зависимости от глубины инвазии

Глубина инвазии

Число больных

sFas, нг/мл

VEGF, пг/мл

M±m

медиана

M±m

медиана

Р2

12

1.7±1.0

1.1

201.4±19.4

195.0

Р3

15

2.2±0.7

1.4

190.0±19.3

188.0

Р4

54

2.7±0.7

2.4

292.7±25.3

250.0

Средний уровень VEGF у больных КРР с глубиной инфильтрации Р4 был достоверно выше, чем при Р2-3 (р=0.04). Уровни sFas и VEGF были достоверно выше при инфильтративном характере роста, чем при смешанном типе инвазии (р=0.02).

У больных КРР без метастазов в регионарных лимфатических узлах или при наличии только одного метастаза концентрация sFas была достоверно ниже (р=0.03), чем у больных с 2 и более метастазами (1.8±0.3 нг/мл, 1.7±0.7 нг/мл и 3.6±0.4 нг/мл, соответственно).

Концентрация VEGF у больных КРР также высоко достоверно зависела от наличия и числа метастазов: при отсутствии метастазов средний уровень VEGF был наименьшим –202.2±9.9 пг/мл, при наличии одного метастаза возрастал до значения 290.0±20.0 пг/мл, а у больных с 2 и более метастазов был наибольшим – 437.5±0.7 пг/мл (р=0.00001). Самый высокий уровень VEGF (557.0 пг/мл) выявлен у больной КРР с наибольшим числом метастазов (5) в регионарных лимфатических узлах.

Не было обнаружено корреляционной связи уровней sFas и VEGF с возрастом больных во всех группах больных, также не выявили корреляции между значениями концентрации sFas и VEGF при КРР.

Нами оценена эффективность проведения предоперационной лучевой терапии у больных КРР по данным морфологического изучения степени выраженности лечебного патоморфоза после хирургического удаления опухоли в зависимости от первичных показателей sFas в сыворотке крови. У больных КРР с отсутствием эффекта от лучевой терапии концентрация sFas до лечения была высокой (4.7±1.3 нг/мл), а при наибольшей выраженности постлучевого патоморфоза опухоли – на уровне показателей контрольной группы (1.0±0.3 нг/мл). Коэффициент корреляции между sFas в сыворотке крови больных КРР и степенью выраженности лечебного патоморфоза составил rs= -0.52 (p=0.049).

Наилучшие результаты предсказания ответа больных колоректальным раком на предопреционную лучевую терапию (р=0.005) получили при использовании в модели уровня sFas (β=-0.72±0.23; p=0.017) и возраста пациента (β=-0.51±0.23; p=0.06). Приводим уравнение регрессии:

Величина лечебного патоморфоза = 5.47 – 0.05хвозраст – 0.56хsFas

Не выявлено достоверной связи между степенью выраженности лечебного патоморфоза опухоли после лучевой терапии и значениями концентрации VEGF в сыворотке крови больных КРР (р=0.3).

Таким образом, пожилой возраст и высокие показатели sFas в сыворотке крови больного колоректальным раком являются неблагоприятными предиктивными факторами ответа пациента на предоперационную лучевую терапию.

sFas в сыворотке крови и uPA в опухолевой ткани при новообразованиях щитовидной железы

Проводили количественное определение sFas в сыворотке крови и uPA в опухолевой ткани у больных с различными патологиями щитовидной железы. Обследовали 141 больного в возрасте от 17 до 73 лет.

Растворимый Fas в сыворотке крови и uPA в опухоли больных РЩЖ

Частота выявления sFas и его средний уровень в сыворотке крови больных РЩЖ были достоверно выше, чем в группе контроля (р=0.001). Так, частота выявления sFas при РЩЖ составила 96.8%, а в контрольной группе –36.0%. Концентрация sFas у больных изменялась от 0.8 до 13.9 нг/мл (средний уровень 3.1±0.5 нг/мл), в контрольной группе диапазон колебаний sFas был значительно уже – 0.3-1.4 нг/мл (средний уровень 0.9±0.30 нг/мл). Надо отметить, что у 62% обследованных больных РЩЖ уровни sFas в сыворотке крови были выше верхнего предела этого показателя в группе контроля.

У женщин, больных РЩЖ, обнаружена более низкая концентрация sFas в возрасте от 41 до 52 лет (1.9±0.5 нг/мл), при этом в возрастной группе от 45 до 52 лет показатели sFas в сыворотке крови не отличались от соответствующих показателей контрольной группы (0.9±0.1 нг/мл). У больных женщин старше 53 лет средний уровень sFas был достоверно выше (3.4±0.9 нг/мл, p<0.05). Выявлена обратная корреляционная зависимость между уровнем sFas в сыворотке крови и возрастом больных РЩЖ женщин в возрасте 4552 лет.

Показатели uPA в ткани опухоли при РЩЖ не зависели от возраста пациентов. Не выявили корреляционной связи между показателями sFas в сыворотке крови и содержанием uPA в опухоли.

Показатели sFas в сыворотке крови и uPA в ткани опухоли были проанализированы в зависимости от стадии опухолевого процесса (табл. 24).

Таблица 24. Содержание sFas в сыворотке крови и uPA в опухоли больных РЩЖ
в зависимости стадии опухолевого процесса

Стадия заболевания

Число наблюдений

Пределы колебаний

M±m

I стадия

sFas*

6

1.0 – 5.7

2.3±0.7

uPА**

6

0.11 – 0.43

0.2±0.05

II стадия

sFas

12

0.9 – 13.9

4.0±1.0

uPА

12

0.03 – 1.68

0.52±0.15

III стадия

sFas

11

0.8 – 4.6

2.4±0.4

uPА

12

0.03 – 2.17

0.85±0.26

Примечание: *концентрация sFas - нг/мл; **содержание uPA - нг/мг белка.

Уровень sFas в сыворотке крови больных РЩЖ не зависел от стадии болезни, в то же время отмечали достоверное повышение содержания uPA в цитозольной фракции опухоли при увеличении стадии опухолевого процесса (p<0.05). Достоверной корреляционной зависимости между показателями sFas и uPA у больных РЩЖ в различных стадиях болезни не выявлено (I стадия – r=-0.33; II стадия – r= -0.42; III стадия – r= 0.34).

Было обнаружено, что уровень sFas в сыворотке крови больных РЩЖ зависел от размера опухолевого узла (p=0.035) (табл. 25).

Таблица 25. Содержание sFas в сыворотке крови и uPA в опухоли больных РЩЖ
в зависимости от размера опухоли

Размер опухолевого узла, см

Число наблюдений

Пределы колебаний

M±m

< 2.5 

sFas*

16

0.9 – 5.7

1.9±0.41

uPА**

16

0.09 – 1.68

0.50±0.20

=>2.5

sFas

16

0.8 – 6.8

3.6±0.72

uPА

16

0.03 – 2.17

0.89±0.40

Примечание: *концентрация sFas - нг/мл; **содержание uPA - нг/мг белка; р1vs2<0.05.

Была выявлена достоверная корреляционная зависимость (r=0.71) между уровнем sFas в сыворотке крови и размером опухоли при I и II стадиях заболевания. Следует отметить, что в группе больных женщин во II стадии РЩЖ в возрасте 45-65 лет эта зависимость носила более выраженный характер (r=0.9). В этой группе больных при размере опухоли менее 2.5 см средний уровень sFas составил 1.1±0.4 нг/мл, а при размере новообразования, равном или превышающем 2.5 см, – 5.5±1.6 нг/мл. Уровень содержания uPА в цитозоле опухолей достоверно не зависел от размера опухоли.

Уровень sFas в сыворотке крови и содержание uPA в опухоли не зависели от гистогенеза опухоли больных РЩЖ. Средний уровень sFas при папиллярном раке был равен 3.1±0.8 нг/мл, а при фолликулярном – 3.2±0.5 нг/мл, показатели uPA тоже практически не различались между собой. Статистический анализ не выявил корреляционной зависимости между изучаемыми показателями.

Изучали зависимость показателей sFas в сыворотке крови и uPA в ткани опухоли от степени дифференцировки новообразования (табл. 26).

Таблица 26. Содержание sFas и uPA у больных РЩЖ в зависимости от степени дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки
опухоли

Число наблюдений

Пределы колебаний

M±m

Высоко дифференцированный рак

sFas*

25

0.8 – 13.9

2.9±0.6

uPА**

25

0.03 – 2.17

0.55±0.14

Умеренно дифференцированный рак

sFas

7

1.8 – 6.1

3.7±0.7

uPА

7

0.08 – 2.17

0.84±0.39

Примечание: *концентрация sFas - нг/мл; **содержание uPA - нг/мг белка.

Отмечали более высокие уровни sFas в сыворотке крови и uPА в опухоли при умеренно дифференцированном раке (р=0.1).

При множественных узлах опухоли в щитовидной железе обнаружили более высокие уровни sFas в сыворотке крови больных РЩЖ, чем при одиночном опухолевом узле, однако эти различия статистически не достоверны. Содержание uPA в опухоли также не зависело от характера ее роста.

При наличии метастазов в регионарных лимфатических узлах содержание uPА в опухоли было значительно выше, тогда как средние показатели sFas в сыворотке крови этих двух групп пациентов достоверно не различались. Кроме того, выявлена обратная корреляционная связь между уровнями sFas и uPА у больных с наличием метастазов опухоли в регионарных лимфатических узлах (r= -0.85).

Не было выявлено достоверной зависимости показателей общей (р=0.23) и безрецидивной (р=0.35) выживаемости больных РЩЖ от показателей sFas в сыворотке.

Растворимый Fas в сыворотке крови больных аденомой щитовидной железы

В общей группе больных новообразованиями щитовидной железы было 16 пациентов с аденомой. Из 16 обследованных больных sFas в сыворотке крови был выявлен у 12, что составило 75% против 36% в группе контроля (табл. 27).

Таблица 27. Показатели sFas в сыворотке крови здоровых людей, больных раком и аденомой щитовидной железы

Группы обследованных больных

Число наблюдений

Возраст (годы)

Частота выявления sFas, %

sFas, нг/мл
(M±m)

Группа контроля

60

50.0±2.3

36.0

0.9±0.31

Рак щитовидной железы

32

51.7±2.7

96.9

3.0±0.52

Аденома щитовидной железы

16

53.4±2.4

75.0

1.4±0.43

Примечание: p1vs2<0.05; p1vs3>0.05; p2vs3<0.05.

Показатели sFas у больных аденомой были достоверно выше, чем в контрольной группе и ниже, чем в группе больных РЩЖ. Экспрессия uPА при аденоме щитовидной железы была выявлена в 93% случаев, уровни uPА колебались в широких пределах, среднее содержание составило 0.15+0.02 нг/мг. Корреляционной зависимости между показателями sFas в сыворотке крови и содержанием uPА в опухоли в общей группе больных аденомой щитовидной железы не выявлено.

Не было выявлено зависимости показателей sFas в сыворотке крови и uPА в опухоли от возраста больных аденомой щитовидной железы. У больных в возрасте от 40 до 52 лет значения uPA колебались от 0.11 до 0.23 нг/мг (0.16±0.03 нг/мг), а в возрасте более 70 лет – от 0.03 до 0.3 нг/мг (0.13±0.03 нг/мг). Вместе с тем, нами обнаружена положительная корреляционная связь между уровнем sFas в сыворотке крови и показателями uPA в опухоли у больных аденомой щитовидной железы в возрасте старше 55 лет (r=0.95; р=0.03).

Показатели sFas и uPA не зависели от длительности анамнеза заболевания, хотя диапазон колебаний концентрации sFas у пациентов с коротким анамнезом был значительно шире.

Не было выявлено различий показателей uPA в опухолях больных аденомой щитовидной железы женщин в зависимости от их репродуктивной функции: у больных репродуктивного возраста содержание uPA – 0.15±0.02 нг/мг белка; в постменопаузе – 0.14±0.02 нг/мг белка. Однако показатели sFas в сыворотке крови у больных репродуктивного возраста имели более широкие пределы колебания (от 0.8 до 7.3 нг/мл), по сравнению с группой пациенток в постменопаузе (0.4-2.4 нг/мл). Средние значения sFas в этих группах больных равнялись: в постменопаузе – 1.2±0.2 нг/мл, в репродуктивном возрасте – 3.4±2.0 нг/мл белка, однако различия статистически не значимы.

Не выявлено существенных различий в показателях sFas и uPA в зависимости от характера роста аденомы щитовидной железы. Так, у больных аденомой щитовидной железы с солитарной опухолью показатели sFas и uPA равнялись 2.2±0.9 нг/мл и 0.16±0.03 нг/мг, соответственно, а при многофокусном росте – 1.3±0.3 нг/мл и 0.13±0.04 нг/мг, соответственно.

Средний уровень sFas в сыворотке крови пациентов при размере аденомы до 4.0 см был достоверно ниже – 1.1±0.3 нг/мл, (пределы колебания – 0.4-2.4 нг/мл), чем при размере опухоли более 4 см – 3.3±1.3 нг/мл (диапазон колебаний от 1.4 до 7.3 нг/мл). Частота выявления sFas в сыворотке крови первой группы пациентов была 55%, во второй группе – 100%, (р<0.05). Показатели uPA при аденоме щитовидной железы не зависели от размера опухолевого узла.

Растворимый Fas в сыворотке крови и uPA в опухоли больных узловым коллоидным зобом и диффузным токсическим зобом щитовидной железы

В группе пациентов, страдавших узловым коллоидным зобом, было 68 больных в возрасте 15 до 72 лет. Эту группу мы разделили на две подгруппы по одному из важных морфологических признаков, а именно, наличию пролиферативных аденоматозных очагов на фоне узлового коллоидного зоба (табл. 28). К аденоматозным пролиферативным очагам относили небольшие (средний диаметр 2-3 мм) очаги пролиферации тиреоидного эпителия, выявляемые на фоне УКЗ и диффузного токсического зоба (ДТЗ).

Таблица 28. Показатели sFas в сыворотке крови здоровых людей и больных узловым коллоидным зобом

Обследованные группы

Число наблюдений

Возраст (годы)

Частота выявления sFas, %

sFas, нг/мл
(M±m)

Группа контроля

60

48.0±2.5

36.0

0.9±0.31

Узловой коллоидный зоб с признаками аденоматоза

20

49.1±2.9

45.0

2.9±1.32

Узловой коллоидный зоб без признаков аденоматоза

48

47.7±2.2

70.8

2.7±0.43

Примечание: p1vs2<0.05; p1vs3<0.05; p2vs3>0.05.

sFas в сыворотке крови достоверно чаще выявляли при УКЗ без признаков аденоматоза, чем с таковыми признаками, достоверных различий в среднем уровне sFas между этими группами не отмечено.

Показатели sFas в сыворотке крови больных УКЗ без аденоматоза не зависели от репродуктивной функции пациенток, а при наличии аденоматозных признаков частота выявления и средний уровень sFas в репродуктивном периоде (50% и 4.6±2.7 нг/мл) были выше, чем в менопаузе (36% и 1.7±1.0 нг/мл), р=0.047.

uPА выявляли практически во всех исследованных образцах больных УКЗ без аденоматоза, так частота обнаружения uPА в постменопаузе была 100%, в репродуктивном периоде – 86%, при этом среднее содержание uPA в опухоли было выше в постменопаузе (0.33±0.13 нг/мг белка) по сравнению с репродуктивным возрастом (0.2±0.1 нг/мг белка), но различия статистически не значимы.

Cредний уровень содержания uPА при УКЗ с аденоматозом в солитарных узлах был выше (0.36±0.16 нг/мг белка), чем при многоочаговом характере роста опухоли (0.21±0.04 нг/мг). Подобная закономерность была характерна и для показателей sFas в сыворотке крови. Так, например, в группе больных с одиночным узлом средний уровень sFas был равен 3.9±1.0 нг/мл (пределы колебания – 0.6-12.7 нг/мл), а при мультифокальном росте опухоли – 2.1±0.8 нг/мл (диапазон колебаний – 0.5-4.8 нг/мл). Вместе с тем, достоверных различий в показателях sFas в сыворотке крови между этими группами пациентов не выявлено.

В группе больных ДТЗ было 23 больных – 9 с признаками аденоматоза и 14 без признаков аденоматоза. Частота выявления sFas в группе больных ДТЗ была достоверно выше, чем в группе контроля и достоверно ниже, чем в группах больных раком, аденомой и УКЗ щитовидной железы. Концентрация sFas в сыворотке крови больных ДТЗ достоверно не отличалась от уровня sFas контрольной группы и не зависела от наличия или отсутствия признаков аденоматоза в опухоли (табл. 29).

Таблица 29. Показатели sFas в сыворотке крови здоровых людей, больных диффузным токсическим зобом и аутоиммунным тиреоидитом Хошимото

Обследованные группы

Число наблюдений

Возраст (годы)

Частота выявления sFas, %

sFas, нг/мл
(M±m)

Группа контроля

60

48.0±2.5

36.0

0.9±0.31

Диффузный токсический зоб с признаками аденоматоза

9

45.7±4.0

55.5

1.9±0.72

Диффузный токсический зоб без признаков аденоматоза

14

41.9±2.9

42.8

2.2±1.03

Аутоиммунный тиреоидит Хошимото

2

55.0±3.0

50.0

1.0±0.2

Примечание: p1vs2>0.05; p1vs3>0.05; p2vs3>0.05.

Изучаемые показатели не зависели от репродуктивной функции пациенток этой группы.

sFas, IL-6, VEGF в сыворотке крови больных опухолями надпочечников

Определяли концентрацию sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови 109 больных опухолями надпочечников и 60 практически здоровых людей соответствующего пола и возраста.

Показатели sFas в общей группе больных опухолями надпочечников были достоверно (p=0.0001) выше, чем в контроле (табл. 30). Концентрация sFas в контрольной группе не превышала 1.2 нг/мл, при этом у больных новообразованиями надпочечников уровень sFas менее 1 нг/мл был выявлен у 9.4%, от 1 до 3 нг/мл – у 28.4%, от 3 нг/мл и более – у 46.9% пациентов. Уровень sFas - 1.2 нг/мл считали пороговым уровнем, разделяющим группы больных новообразованиями надпочечников и контроля.

Показатели VEGF и IL-6 в общей группы больных опухолями надпочечников были также выше, чем в контрольной группе (р=0.002). Пороговыми значениями, разделяющими группы практически здоровых людей и больных опухолями надпочечников, считали уровень VEGF, равный 300 пг/мл, и уровень IL-6, равный 3 пг/мл.

Таблица 30. Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови больных опухолями надпочечников и в группе контроля

Группы,
число наблюдений

sFas, нг/мл

VEGF, пг/мл

IL-6, пг/мл

M±m,

медиана

Диапазон колебаний

M±m,

медиана

Диапазон колебаний

M±m,

медиана

Диапазон колебаний

Больные,
109

3.0±0.7

1.9

0.6–24.7

302.7±56.2

254.3

80.0–1052.0

5.0±1.3

3.1

0.3-33.5

Контроль,
60

0.9±0.3

0.8

0.3–1.2

150.9±45.3

156.5

20.6–321.0

1.7±0.8

1.3

0.2-8.0

Показатели sFas и VEGF не зависели от пола и возраста в общей группе больных новообразованиями надпочечников, тогда как концентрация IL-6 в сыворотке крови достоверно зависела от пола пациентов, но не зависела от их возраста. Так, у больных мужчин средний уровень цитокина составил 7.3±1.6 пг/мл (медиана – 4.0 пг/мл), у женщин – 3.9±0.5 пг/мл (медиана – 3.0 пг/мл), p=0.03. При этом в группе больных раком коры надпочечников уровень цитокина в сыворотке крови у мужчин был в 3 раза выше (11.4±3.6 пг/мл; медиана – 10.0 пг/мл), чем у женщин (3.2±0.8 пг/мл; медиана – 3.1 пг/мл).

Вместе с тем, при анализе показателей sFas в зависимости от гистологического строения опухоли и пола больных было отмечено, что у мужчин, больных феохромоцитомой, показатели sFas были достоверно (p=0.05) выше, чем у женщин. При адренокортикальном раке значения sFas у мужчин также были значительно выше, чем у женщин, однако различия были статистически не значимы (p=0.08). Кроме того, у мужчин, больных раком коры надпочечника, выявлена прямая линейная зависимость между уровнем sFas и их возрастом (r=0.74; p=0.03) и у больных адренокортикальным раком наблюдали линейную зависимость между концентрацией VEGF и их возрастом (r=0.5; р=0.049). При феохромоцитоме содержание sFas в сыворотке крови также увеличивалось прямо пропорционально возрасту пациентов, хотя и в меньшей степени (r=0.49; p=0.04).

Показатели sFas и IL-6 не зависели от длительности основного и наличия сопутствующих заболеваний в анамнезе в общей группе больных, вместе с тем, у больных феохромоцитомой надпочечника с сопутствующими заболеваниями, концентрация IL-6 была выше (5.5±1.1 пг/мл; медиана – 5.9 пг/мл), чем без сопутствующих заболеваний (1.4±0.5 пг/мл; медиана – 1.4 пг/мл) (р=0.005). Концентрация VEGF была достоверно выше (353.2±41.1 пг/мл, медиана – 270.8 пг/мл) при наличии сопутствующих заболеваний, чем без них (226.0±35.3 пг/мл, медиана – 198.3 пг/мл) (р=0.025).

В общей группе больных опухолями надпочечников не было выявлено достоверной зависимости показателей sFas в сыворотке крови от размера первичной опухоли. При этом у больных адренокортикальным раком отмечали достоверное повышение медианы концентрации sFas при увеличении размера опухоли (р=0.041) (табл. 31).

Таблица 31. Показатели sFas в сыворотке крови больных раком надпочечников
в зависимости от размера опухоли

Размер опухоли

Число больных

sFas, нг/мл

(М±m)

Медиана, нг/мл

Пределы колебаний, нг/мл

До 5.0 см

7

1.8±0.5

1.6

1.4–2.8

5.0-9.9 см

15

2.7±0.5

2.1

2.5–7.2

10.0 см и более

10

3.5±0.5

2.4

5.5–8.0

Обнаружили достоверную зависимость концентраций VEGF (r=0.4; р=0.009) и IL-6 (r=0.41; р=0.0009) в сыворотке крови от размера первичной опухоли в общей группе больных опухолями надпочечников.

Не было выявлено достоверных изменений показателей sFas в сыворотке крови в зависимости от гистогенеза опухоли, при этом уровни VEGF и IL-6 у больных раком коры надпочечника были достоверно (р=0.04) выше, чем у больных феохромоцитомой и адренокортикальной аденомой. Статистически значимых различий изучаемых показателей между группами больных аденомой и феохромоцитомой надпочечников выявлено не было.

Изучали зависимость определяемых показателей от стадии заболевания при адренокортикальном раке (табл. 32).

Таблица 32. Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови больных адренокортикальным раком в зависимости от стадии заболевания

Стадия заболевания

Число больных

sFas, нг/мл

(медиана)

VEGF, пг/мл

(медиана)

IL-6, пг/мл

(медиана)

1

3

1.4

181.0

2.8

2

6

1.8

256.0

3.1

3

17

2.1

439.0

3.9

4

6

3.0

730.0

6.2

Как видно из данных таблицы 32, концентрация всех изучаемых факторов достоверно повышалась при увеличении стадии заболевания. При этом уровни VEGF и IL-6 не зависели от стадии заболевания при раке с синдромом Кушинга.

Уровень sFas достоверно повышался с увеличением распространенности опухолевого процесса, р=0.023. У больных адренокортикальным раком с наличием метастазов в регионарных лимфоузлах, печени и легких медиана концентрации sFas (4.2 нг/мл) была достоверно выше (р=0.02), чем у пациентов без регионарных и отдаленных метастазов (1.4 нг/мл).

В общей группе больных опухолями надпочечников не было выявлено достоверной зависимости показателей sFas в сыворотке крови от ИМТ, в то же время у женщин, больных феохромоцитомой, уровень sFas в крови увеличивался прямо пропорционально величине ИМТ (r=0.64; p=0.017).

Выявлена недостоверная корреляционная зависимость между уровнем sFas и VEGF в сыворотке крови при адренокортикальном раке (r=0.56; p=0.2) и феохромоцитоме (r=0.46; p=0.2), а у женщин, больных адренокортикальным раком, уровни IL-6 и sFas были связаны прямой линейной зависимостью (r=0.78, р=0.023).

Обнаружена достоверная корреляционная зависимость между уровнями VEGF и IL-6 в сыворотке крови у больных феохромоцитомой (r=0.6; р=0.045).

Концентрация изучаемых факторов в сыворотке крови не зависела от гормональной активности опухоли.

У больных адренокортикальной аденомой общий фактор, объясняющий 39.8% общей дисперсии, включал в себя согласованное изменение sFas и IL-6. У больных феохромоцитомой выявили первый общий фактор, объяснявший 55.4% общей дисперсии указанных признаков и включавший в себя согласованное изменение VEGF, возраста, sFas и IL-6. У больных раком коры надпочечника первый общий фактор также объяснял почти половину всей изменчивости указанных признаков (49.0%) и включал в себя согласованное изменение sFas и IL-6, второй общий фактор отражал изменение VEGF и возраста пациентов (24% общей изменчивости). Таким образом, для всех групп больных было наиболее характерно связанное изменение sFas и IL-6, особенно ярко выраженное у больных адренокортикальным раком и феохромоцитомой. Кроме того, показатель VEGF также входил в число главных общих факторов в группе больных раком коры надпочечника и феохромоцитомой.

Выживаемость оценена у 31 больного раком надпочечника, максимальный срок наблюдения составил 84 месяца. У одного больного смерть наступила в раннем послеоперационном периоде от сердечно-сосудистой недостаточности. 9 больных умерли от прогрессирования заболевания в сроки от 2 до 18 месяцев. Еще у 1 пациентки со злокачественной феохромоцитомой была ранняя послеоперационная смерть от ОССН. Эту больную в расчеты не включали. Медиана срока жизни за 5-летний период наблюдения не была достигнута, однако четверть больных умерла в короткие сроки – до 12 месяцев. Оценка функции риска смерти показала, что повышенный риск смерти у больных раком надпочечников наблюдался в раннем периоде (до 1 года), и значительно возрастал через 5 лет после операции.

Повышенная концентрация sFas  в сыворотке крови достоверно ухудшала показатели общей выживаемости больных раком надпочечников (р=0.049), таблица 33. При концентрации sFas менее 2 нг/мл медиана выживаемости не была достигнута, при концентрации sFas более 2 нг/мл – половина больных умерли до 9.2 месяцев.

Таблица 33. Показатели общей выживаемости больных раком надпочечников
в зависимости от концентрации sFas в сыворотке крови

sFas, нг/мл

Число больных

Выживаемость (%)

1-летняя

3-летняя

5-летняя

<2

16

87.5±14.9

62.5±17.1

62.5±17.1

2 и более

15

41.7±22.2

-

-

Количество больных с рецидивом заболевания составило 10, сроки развития рецидива были от 2 до 42 месяцев, медиана срока до развития рецидива равнялась 36.7 месяцев. 3-х летняя выживаемость до рецидива составила 40.5±18.0%. Повышенная концентрация sFas в сыворотке крови была достоверно связана с ухудшением показателей безрецидивной выживаемости (р=0.048).

Таким образом, повышенное содержание sFas (более 2 нг/мл) в сыворотке крови больных раком надпочечников было достоверно связано с уменьшением показателей общей и безрецидивной выживаемости пациентов.

В заключение необходимо отметить, что в результате проведенного нами исследования разработана высоко чувствительная и специфичная тест-система на основе МА для определения концентрации растворимого Fas человека в сыворотке и плазме крови, с помощью которой определили концентрацию sFas у 1061 больного новообразованиями различного гистогенеза и локализации и 457 практически здоровых людей. Сравнительный анализ полученных данных позволил выявить связь уровня sFas в сыворотке крови онкологических больных с основными клиническими, морфологическими, некоторыми биохимическими критериями болезни, определить прогностическое и предиктивное значение уровня sFas в сыворотке крови онкологических пациентов в конкретной клинической ситуации. Выявленные корреляционные связи уровня sFas с показателями ключевого активатора неоангиогенеза – VEGF и мультифункционального цитокина, обладающего способностью ингибировать Fas-зависимый апопотоз, – IL-6, с общей активностью щелочной фосфатазы при остеогенной саркоме отражают важные биологические особенности опухолевых процессов, одновременно высокие уровни sFas, IL-6 и VEGF определяют высокий потенциал злокачественности новообразований.

ВЫВОДЫ

  1. Впервые разработана оригинальная отечественная тест-система на основе МА SA-7 и SA-8, которая позволяет надежно определять концентрацию sFas в сыворотке и плазме крови человека. Предел детекции сэндвич-ИФА – 0.3 нг/мл sFas, диапазон линейности измерения концентрации составляет 0.3-10.0 нг/мл sFas, коэффициент вариации при определении концентрации sFas в сыворотке и плазме крови не превышает (3.7±0.7)%.
  2. МА SA-7 (IgG1(κ); (5.8±0.7)x108 M-1) взаимодействует с эпитопом полноразмерного Fas человека, определяемым аминокислотными остатками 129134, эпитоп для МА SA-8 (IgG1(κ);(4.0±0.6)x107 M-1) определяют аминокислотные остатки 9499. Таким образом, разработанный сэндвич-ИФА на основе МА SA-7 и SA-8 должен детектировать основную изоформу растворимого Fas – FasExo6Del и три минорных изоформы sFas: FasExo4Del, FasExo4,6Del и FasExo4,7Del.
  3. Показатели sFas определены у 457 практически здоровых людей, (332 женщины и 125 мужчин) в возрасте от 17 до 78 лет, при этом частота выявления sFas равнялась 40%, концентрация sFas колебалась от 0.3 нг/мл до 1.2 нг/мл, средний уровень составил 0.9±0.3 нг/мл, медиана концентрации – 0.8 нг/мл. Показатели sFas достоверно не зависели от возраста и пола обследованных, а у женщин не зависели от репродуктивной функции, длительности постменопаузы и фазы менструального цикла.
  4. Изучены показатели sFas в сыворотке крови у 1061 больного новообразованиями молочной железы, костей, яичников, матки, щитовидной железы, толстой кишки и надпочечников. Частота выявления и концентрация sFas в сыворотке крови во всех обследованных группах пациентов превышала соответствующие показатели контрольной группы (р=0.00001). Так, в общей группе онкологических больных частота выявления sFas равнялась 78%, средняя концентрация – 6.7±1.4 нг/мл, медиана концентрации – 2.9 нг/мл. Показатели sFas у подавляющего числа больных достоверно не зависели от возраста, пола, сопутствующих заболеваний в анамнезе, а у женщин – от репродуктивной функции, длительности постменопаузы и фазы менструального цикла.
  5. Высокий уровень sFas был связан с поздними стадиями болезни при раке яичников, тела матки, толстой кишки и коры надпочечников, с низкой степенью дифференцировки опухоли при раке яичников и тела матки, с наличием регионарных метастазов при колоректальном и адренокортикальном раке, а также с глубиной прорастания опухоли в ткань миометрия, стенку кишки и в окружающие ткани при раке тела матки и толстой кишки.
  6. Показатели sFas зависели от гистогенеза опухолей при злокачественных и доброкачественных новообразованиях яичников, повышенную концентрацию sFas выявляли при больших размерах опухоли у больных раком яичников, раком тела матки, раком толстой кишки, аденомой и раком щитовидной железы, а также у пациентов с раком коры надпочечников.
  7. Уровень sFas в сыворотке крови более 1.2 нг/мл достоверно ухудшал показатели общей и безрецидивной выживаемости больных остеогенной саркомой и раком тела матки, а также был неблагоприятным предиктивным фактором ответа больных колоректальным раком пожилого возраста на неоадъювантную лучевую терапию. Уровень sFas в сыворотке крови более 2 нг/мл определял неблагоприятный прогноз болезни у больных адренокортикальным раком. Уровень sFas в сыворотке крови более 5 нг/мл был связан с неблагоприятным прогнозом болезни для пациенток с папиллярной цистаденокарциномой и раком яичников с размером опухоли более 5 см.
  8. Выявлена прямая корреляционная зависимость уровня sFas от концентрации ключевого активатора процесса неоангиогенеза – VEGF у больных раком яичников (при концентрации IL-6 более 4 пг/мл) (r=0.75; p=0.001) и раком тела матки (r=0.58; p=0.01), от концентрации мультифукционального цитокина – IL-6 при раке тела матки (r=0.56; p=0.01) и адренокортикальном раке (r=0.78, р=0.023) и общей активностью щелочной фосфатазы в сыворотке крови при первичной остеогенной саркоме (r=0.75, p=0.049). Одновременно высокие уровни sFas, IL-6 и VEGF определяют высокий потенциал злокачественности новообразований.

Практические рекомендации

Разработанная тест-система может применяться в клинических и лабораторных исследованиях для определения концентрации sFas в сыворотке и плазме крови человека, а также в других биологических жидкостях, содержащих растворимый человеческий Fas.

Уровень sFas в сыворотке крови онкологических больных достоверно превышает этот показатель у практически здоровых людей. Концентрация sFas у больных злокачественными новообразованиями яичников, тела матки, коры надпочечника и толстой кишки зависит от основных клинических характеристик заболевания – размера опухоли, степени ее дифференцировки и стадии болезни. Растворимый Fas является фактором прогноза болезни для некоторых категорий онкологических больных. Высокая концентрация sFas в сыворотке крови связана с ухудшением показателей общей и безрецидивной выживаемости больных остеогенной саркомой, раком яичников, раком тела матки и адренокортикальным раком. Высокий уровень sFas в сыворотке крови следует считать неблагоприятным предиктивным фактором ответа пациента с колоректальным раком на неоадъювантную лучевую терапию. Определение концентрации sFas в сыворотке крови онкологических больных имеет большое практическое значение для выбора препаратов и назначения индивидуальной схемы лечения.

Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови с учетом основных клинических и морфологических критериев болезни могут быть использованы для оценки степени злокачественности новообразований яичников и эндометрия, а также для дифференцированного выбора адекватных методов лечения этой категории пациенток.

Работы, опубликованные по теме диссертации

  1. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников Н.Н., Кушлинский Н.Е. FasFasL-система в норме и при патологии // Вопр.биол.мед.фарм.химии.-1999.-№2.-с.78-94.
  2. Kushlinsky N., Abbasova S., Nikogosyan S., Obusheva M., Kostanyan I., Lipkin V., Laktionov K., Kozachenko V. Soluble Fas-antigen (sFas) in the serum of patients with ovarian tumors. Seventh Biennial Meeting of the International Gynecologic Cancer Society (September 26-30, Rome, Italy) // Int. J. Gynecol. Cancer.-1999.-Vol.9, Supp.1.-р.186.
  3. Аббасова С.Г., Кушлинский Н.Е., Мурашев А.Н., Костанян И.А., Обушева М.Н., Никогосян С.О., Бритвин Т.А., Багирова Н.Ф., Соловьев Ю.Н., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Растворимый Fas в сыворотке крови онкологических больных // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1999.-N.3.-с. 328-331.
  4. Pirogov A.V., Abbasova S.G., Dyakova N.A., Kushlinsky N.E., Deichman G.I. In vivo dissemination of tumor cells and acguisition of sFas-secreting activity // The 27th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM, 1999). (Kyoto, Japan, October 31- November 4). (Abstract book).-1999.-Suppl. 2.-p-56.
  5. Обушева М.Н., Аббасова С.Г., Кушлинский Н.Е., Никогосян С.О., Ермилова В.Д., Чеснокова А.В., Костанян И.А. Растворимый Fas-антиген (sFas) в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными новообразованиями яичников // Клиническая лабораторная диагностика.-1999.-№9.-с.7-8.
  6. Аббасова С.Г., Кушлинский Н.Е., Степанов Ю.М., Костанян И.А., Липкин В.М.. Ингибитор апоптоза – растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных хроническим гастритом и раком желудка // Журнал “Академия медицинских наук Украины”.-1999.-том 2, №2-с.347-351.
  7. Кушлинский Н.Е., Бабкина И.В., Аббасова С.Г., Соловьев Ю.Н., Изгородин А.С., Алиев М.Д., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Ингибитор апоптоза – растворимый Fas-антиген (sFas) в сыворотке крови больных хондросаркомой, с механическими травмами костей и у здоровых людей // Кремлевская медицина (клинический вестник).-2000.-№4.-с.70-72.
  8. Кушлинский Н.Е., Соловьев Ю.Н., Бабкина И.В., Аббасова С.Г., Костанян И.А., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Лептин и ингибитор апоптоза – растворимый Fas-антиген - в сыворотке крови больных остеосаркомой и опухолями костей нейроэктодермального происхождения // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2000.-№5.-с.583-586.
  9. Kushlinsky N., Abbasova S., Solovyev Yu., Kostanyan I., Babkina I., Izgorodin A., Lipkin V., Trapeznikov N. Soluble Fas-аntigen (sFas) in the serum of bone tumour patients. European Musculo-Skeletal Oncology Society // Abstracts and Poster Presentations.-2000.-p.65.
  10. Аббасова С.Г., Кушлинский Н.Е., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Факты и перспективы изучения Fas-FasL-системы в норме и при патологии // Успехи современной биологии.-2000.-том 120, №3.-с.303-318.
  11. Kushlinsky N.E., Prorokov V.V., Britvin T.A., Abbasova S.G., Kostanyan I.A., Lipkin V.M. Soluble Fas-Antigen (sFas) in the sera of colon cancer patients. 10-th International congress on anti-cancer treatment (Paris, January 31st to February 3rd, 2000).-2000.-p.240.
  12. Бабкина И.В., Кушлинский Н.Е., Аббасова С.Г., Соловьев Ю.Н., Трапезников Н.Н. Fas-антиген в сыворотке крови больных опухолями костей. В материалах II съезда онкологов стран СНГ (Киев, 23-26 мая 2000г.) // Киев.-2000.-N.112.
  13. Кушлинский Н.Е., Бритвин Т.А., Аббасова С.Г., Перевощиков А.Г., Пророков В.В., Костанян И.А., Кныш В.И., Липкин В.М. Растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных раком толстой кишки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2001.-том 131, №4.-с.430-433.
  14. Kushlinsky N.E., Britvin T.A., Polyakova G.A., Abbasova S.G., Bogatyryev O.P., Kalinin A.P., Lipkin V.M. Soluble Fas-antigen (sFas) in the serum with tumors of adrenal gland // XXIX International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM, 2001) (Barselona, Spain, September 29th-October 3rd, 2001) (Abstract book).-2001.-p.208.
  15. Кушлинский Н.Е., Соловьев Ю.Н., Бабкина И.В., Аббасова С.Г., Костанян И.А., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Экспрессия ингибитора апоптоза – растворимого Fas-антигена у больных со злокачественными и доброкачественными новообразованиями костей // Вестник Российской Академии медицинских наук.-2001.-№3.-с.3-8.
  16. Кушлинский Н.Е. Бритвин Т.А. Полякова Г.А. Аббасова С.Г. Баронин А.А. Богатырев О.П. Калинин А.П. Липкин В.М. Растворимый Fas-антиген (sFas) в сыворотке крови больных с опухолями надпочечников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2001.-том 132, №10.-с.443-445.
  17. Кушлинский Н.Е. Бабкина И.В. Аббасова С.Г. Любимова Н.В. Изгородин А.С. Алиев Б.М. Костанян И.А. Соловьев Ю.Н. Липкин В.М. Трапезников Н.Н. Изучение взаимосвязи между активностью щелочной фосфатазы и содержанием растворимого Fas-антигена (sFas) в сыворотке крови больных первичными и вторичными новообразованиями костей // Воронеж 2001 “Новое в онкологии” (под ред. И.В.Поддубной и Н.А.Огнерубова), выпуск 5. Изд-во Воронежской государственной медицинской академии им.Н.Н.Бурденко.-2001.-с.597-609.
  18. Пирогов А.В., Аббасова С.Г., Дьякова Н.А., Кушлинский Н.Е., Дейчман Г.И.. Изменения в соотношении мембраносвязанной и растворимой форм CD95 (Fas) при отборе опухолевых клеток in vivо // Биохимия.-2002.-том 67, вып. 2.-с.286-292.
  19. Кушлинский Н.Е., Бритвин Т.А., Полякова Г.А., Аббасова С.Г., Баронин А.А., Тишенина Р.С., Молчанова Г.С., Сельчук В.Ю., Пирогов Д.А., Богатырев О.П., Липкин В.М., Калинин А.П. Сравнительное исследование уровней растворимого Fas-антигена в сыворотке крови больных опухолями и опухолеподобными поражениями надпочечников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2002.-том 134, №8.-с.197-201.
  20. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников Н.Н., Кушлинский Н.Е. Fas-опосредованный апоптоз при раке предстательной железы // Глава в кн.: «Рак предстательной железы» (под ред. Н.Е.Кушлинского, Ю.Н.Соловьева, М.Ф.Трапезниковой) // М.-Редакционно-издательский совет при Президиуме РАМН.-2002.-с.250-280.
  21. Kushlinsky N.E., Britvin T.A., Polyakova G.A., Abbasova S.G., Pirogov D.A.. Seltchuk V.Yu., Bogatyryev O.P., Lipkin V.M., Lyakina L.T., Baronin A.A., Kalinin A.P. Comparative study of sFas levels in the sera of patients with adrenal gland tumors and hyperplastic processes // Twelth international congress on anti-cancer treatment. – Proceeding book. – (Paris, February 4th-7th, 2002).-p.244.
  22. Кушлинский Н.Е., Аббасова С.Г., Бабкина И.В., Соловьев Ю.Н., Тарасова Т.А., Петраев Ю.Г., Липкин В.М. Трапезников Н.Н. Стимуляторы ангиогенеза – фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиогенин (ANG) и ингибитор апоптоза – растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных остеосаркомой и опухолью Юинга. Сборник научных трудов конференции “Проблемы патологии сосудов у онкологических больных” под ред. проф. А.Н.Фокина и проф. А.В.Важенина // Челябинск.–2002.-с.63-64.
  23. Кушлинский Н.Е., Полякова Г.А., Аббасова С.Г., Бритвин Т.А., Сельчук В.Ю., Пирогов Д.А., Богатырев О.П., Лякина Л.Т., Баронин А.А., Калинин А.П. Изучение механизмов апоптоза в первичных опухолях и при гиперпластических процессах надпочечников – основа разработки новых методов их патогенетической лекарственной терапии // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса “Человек и лекарство” (Москва, 8-12 апреля 2002г.) // М.-2002.-с.255.
  24. Чеснокова А.А., Аббасова С.Г., Обушева М.Н., Лактионов К.П. Сравнительный анализ уровней растворимого Fas-антигена (sFas) в сыворотке крови больных раком и доброкачественными новообразованиями яичников // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса “Человек и лекарство” (Москва, 8-12 апреля 2002г.) // М.-2002.-с.503.
  25. Кушлинский Н.Е., Бритвин Т.А., Полякова Г.А., Аббасова С.Г., Баронин А.А., Сельчук В.Ю., Поликарпова С.Б., Калинин А.П. Система активации плазминогена и ингибиторы апоптоза при патологии надпочечников. Труды Всероссийской конференции “Проблемы медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия” (Москва, 28-31 мая 2002г.) // М.-2002.-с.133-134.
  26. Kushlinsky N.E., Britvin T.A., Abbasova S.G., Polyakova G.A., O.P. Bogatyrev O.P., Kalinin A.P., Lipkin V.M. Comparative study of soluble Fas-antigen (sFas) serum levels in patients with adrenal tumors // 18th UICC International Cancer Congress (30 June-5 July) (Abstract book).-2002.-p.361.
  27. Аббасова С.Г., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Щепрова Ж.М. Эпитопное картирование Fas-антигена // Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова.-2002.-с.80.
  28. Арзыкулова М.Ж., Кушлинский Н.Е., Никогосян С.О., Обушева М.Н., Ермилова В.Д., Аббасова С.Г., Горелова И.А. Растворимый Fas-антиген у больных новообразованиями яичников // «Вестник Казахского национального медицинского университета».-2002.-том 23, №3.-с.148-150.
  29. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезникова М.Ф., Кушлинский Н.Е. Fas-опосредованный апоптоз при раке предстательной железы. Глава в книге: «Рак предстательной железы» под ред. Н.Е.Кушлинского, Ю.Н.Соловьева, М.Ф.Трапезниковой // М.-Редакционно-издательский совет при Президиуме РАМН.-2002.-с.250-280.
  30. Бритвин Т.А., Кушлинский Н.Е., Аббасова С.Г., Пирогов Д.А., Поликарпова С.Б., Богатырев О.П., Калинин А.П., Сельчук В.Ю. Молекулярно-биологические исследования при опухолях надпочечников. Тезисы докладов X Российского Национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 7-14 апреля 2003г.) // М.-2003.-с.127.
  31. Высоцкий М.М., Верулашвили Т.Г., Аббасова С.Г., Обушева М.Н., Липкин В.М., Манухин И.Б. Растворимый Fas-антиген (sFas) в сыворотке крови больных раком и простыми кистами яичников. В материалах докладов XI Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство» (Москва 19-23 апреля 2004г.) // М.-2004.-с.115.
  32. Аббасова С.Г., Обушева М.Н., Высоцкий М.М., Чеснокова А.В., Манухин И.Б. Растворимый Fas-антиген у больных серозной аденокарциномой яичников. В материалах Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии», посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 24-25 июня 2004г.) // Томск.-2004.-Часть II.-с.160-161.
  33. Чеснокова А.В., Высоцкий М.М., Обушева М.Н., Карабеков У.К., Аббасова С.Г., Лактионов К.П. Показатели sFas и лептина, а также их соотношение у больных с новообразованиями яичников с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания. В материалах Конгресса «Национальные дни лабораторной медицины России-2004» (Москва, 20-22 октября 2004г.) // М.-2004.-с.120.
  34. Чеснокова А.В., Высоцкий М.М., Обушева М.Н., Карабеков У.К., Аббасова С.Г., Лактионов К.П. Показатели sFas и лептина, а также их соотношение у больных с новообразованиями яичников с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания // Клиническая лабораторная диагностика.-2004.-№9.-с.12.
  35. Кушлинский Н.Е., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А., Сомасундарам С., Скрипниченко М.Л., Джабаров А.К., Аббасова С.Г., Тулеуов А.Е. Растворимый Fas-антиген в сыворотке крови здоровых людей, больных раком и аденомой щитовидной железы. В материалах третьего Всероссийского тиреоидологического конгресса «Диагностика и лечение узлового зоба» (Москва, 29-30 ноября 2004г.) // М.-с.185-186.
  36. Борисов Д.А., Аббасова С.Г., Соловьев Ю.Н., Кузнецов И.Н., Бабкина И.В., Липкин В.М., Дурнов Л.А., Кушлинский Н.Е. Растворимая форма ключевого рецептора апоптоза – Fas-антигена (sFas) у детей, больных остеосаркомой и опухолью Юинга. В материалах III Российского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 26-28 октября 2004г.) // М.-2004.-с.403.
  37. Аббасова С.Г., Обушева М.Н., Лякина Л.Т., Ермилова В.Д., Чеснокова А.В., Лактионов К.П. Растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных с эпителиальными опухолями яичников // Клиническая лабораторная диагностика.-2005.-№9.-с.18.
  38. Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А., Аббасова С.Г., Лякина Л.Т., Тулеуов А.Е. Растворимый Fas-антиген при заболеваниях щитовидной железы // Клиническая лабораторная диагностика.-2005.-№9.-с.23-24.
  39. Обушева М.Н., Ермилова В.Д., Аббасова С.Г., Лякина Л.Т., Сатенова Ж.К., Тулеулов А.Е. sFas у больных новообразованиями яичников. В материалах XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006 г.) // М.-2006.-с.232.
  40. Обушева М.Н., Ермилова В.Д., Аббасова С.Г., Лякина Л.Т., Костанян И.А., Липкин В.М. Интерлейкин-6 (ИЛ-6), растворимый Fas-антиген (sFas) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) в сыворотке крови больных новообразованиями органов женской репродуктивной системы. В материалах Х Российского онкологического конгресса (Москва, 21-23 ноября 2006 г.) // М.-2006.-с.224.
  41. Аббасова С.Г., Щепрова Ж.М., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Байдакова Л.К., Родионов И.Л., Кушлинский Н.Е. Эпитопное картирование человеческого Fas с помощью пептидного фагового дисплея // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2007.-том 44, №10.-с.395-400.
 



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.