WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

МАТВЕЕВА

ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ПРОМЫШЛЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ МОНО- И КОМПЛЕКСНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖИВОТНЫХ

03.00.23-биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Щелково-2008 г.

Работа выполнена в ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" РАСХН

Научный консультант:  доктор биологических  наук

Клюкина Валентина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических  наук, профессор 

  Цыбанов Содном Жамьянович

  доктор биологических наук, профессор

  Смоленский Владимир Иванович

  доктор ветеринарных наук, профессор

  Мищенко Владимир Александрович

Ведущая организация:  ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский 

  институт экспериментальной ветеринарии

  им. Я.Р. Коваленко" Россельхозакадемии

Защита состоится "26" декабря 2008 года в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 при ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский р.-н., пос. Биокомбината, п/о Кашинцево, ВНИТИБП; е-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан  "  "  2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук  Ю.Д.Фролов

1.  ОБЩАЯ ХАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.        



Актуальность темы. Одним из основных направлений биотехнологического производства является обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами.

Несмотря на  то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических препаратов, увеличение номенклатуры, совершенствование, улучшение качества, стандартизация диагностикумов для практических лабораторий по-прежнему остается актуальной задачей.

Реализация идеи создания диагностических  наборов требует решения сложных и разнообразных задач. Это, прежде всего, выделение и изучение структуры, физико-химических и иммунобиологических свойств антигенных фракций вирусов и бактерий, детерминант или эпитопов, определяющих специфичность конкретного антигена, и определение их роли в иммунитете. Приготовление  высокоактивных специфических  сывороток требует наличие максимально очищенных антигенов, хорошо воспроизводимых схем иммунизации, оптимального донора, а также изучение возможности применения современных эффективных  иммуностимуляторов.

Каждый диагностический набор содержит строго индивидуальный состав специфических и химических компонентов, применение которых по отработанной для данной инфекции методике, позволяет достигать желаемой цели исследования.

Многообразие симптомов проявления вирусных и бактериальных болезней, а часто их ассоциация, затрудняет постановку диагноза, поэтому этиологический диагноз должен основываться на результатах лабораторных исследований, включая серологический анализ.

В этой связи актуальным является совершенствование методов диагностики вирусных и бактериальных инфекций и разработка технологии изготовления моно- и комплексных диагностикумов.

Оперативный анализ структуры заболеваний, определение этиологической роли каждого возбудителя  в условиях ассоциативных форм инфекций предполагает использование ИФА как метода комплексной дифференциальной диагностики в составе поликомпонентных диагностических тест-систем.

1.2. Обоснование выбора объектов исследования. К важнейшим задачам ветеринарной науки относится ликвидация опаснейшего заболевания животных и человека - бешенства. В настоящее время в Российской Федерации сложилась напряженная эпизоотическая ситуация с бешенством животных, имеющим большое социально-экономическое значение. Активные природные очаги бешенства зарегистрированы в различных регионах страны. Эпизоотии бешенства поддерживаются в основном за счет диких животных, однако в процесс активно вовлекаются бродячие собаки и кошки. (Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001)

Основным средством борьбы с бешенством является эффективная специфическая иммунопрофилактика и своевременная диагностика.

Достоверность диагностики находится в зависимости от качества используемых реагентов: активности и специфичности антирабических иммуноглобулинов. Поэтому очень важно своевременно совершенствовать и проводить промышленный выпуск эффективных компонентов диагностикумов бешенства  животных.

Лептоспироз относится к числу  распространенных природноочаговых, зооантропонозных, опасных в социальном и экономическом отношениях болезней.

Молекулярно-биологичсекие методы играют важную роль при изучении систематики патогенных лептоспир, поиска возможностей их дифференциации и идентификации на основании сравнения генотипов. Наличие фундаментальных исследований нуклеиновых кислот лептоспир, а также работ по геносистематике этих организмов позволяет сделать вывод о возможности применения методов биотехнологии для решения проблем, связанных с лептоспирозом. Так, используя метод ДНК-ДНК гибридизации, возможно выявление специфических фрагментов генома возбудителя лептоспироза, на основании которых делается заключение о наличии или отсутствии лептоспир в инфекционном материале. Интенсивные исследования генома многочисленных сероваров лептоспир позволяют проводить анализ возможностей практического применения рестриктазного анализа и различных вариантов ДНК-ДНК гибридизации. В связи с этим были предложены или разрабатываются методы, позволяющие выявлять индивидуальные особенности сероваров на уровне хромосомной ДНК лептоспир (Le Febure R.B.,1987; Van Eys G., 1989; Pacciarini M.L.,1992, Merien F. et al.1992).

Неоценимый вклад в изучение лептоспироза внесли отечественные ученые Токаревич К.Н. (1947г.), Ананьин В.В. (1949,1951 г.), Киктенко В.С.(1938,1970-1983гг.), Любашенко С.Я.(1945г.), Малахов Ю.А. (1971,1979,1992), Ежов Г.И. (1979,1983,1985гг.) и  другие. До настоящего  времени  общепринятым  методом  диагностики лептоспироза  остается реакция  микроагглютинаци (РМА).

Массовые заболевания телят с симптомами поражения дыхательных путей представляют наиболее сложную серьезную проблему для животноводческих хозяйств во многих регионах России.

В связи с этим остаётся актуальной проблема серологического мониторинга и ликвидации ряда инфекций, которые при большой концентрации животных на ограниченных площадях, при постоянном перемещении из одной технологической группы в другую, формировании  новых групп не всегда однородных по возрасту и иммунному статусу, часто проявляются у молодняка.

Так как в инфекционном процессе могут участвовать большое число микроорганизмов различной природы, как правило, значительная роль принадлежит нескольким возбудителям - инфекционному ринотрахеиту (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС), парагриппу-3, респираторно-синцитиальной (РС) и аденовирусной (АВ) инфекциям. Эти заболевания представляют значительную проблему в ветеринарии ещё и потому, что протекают со сходными клиническими симптомами. По этой причине особенно велика роль лабораторной диагностики указанных выше вирусных болезней крупного рогатого скота.

Значительный вклад в изучение вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота внесли Бучнев К.Н. (1965), Назаров В.П. (1967), Макаревич В.Г. (1967), Куличкин В. (1951), Сюрин  В.Н. (1978), Халенев  Г.А. (1975), Гуненков В.В (1975),  Мищенко В.А. (2001), Красочко П.А. (1997), Глотов Г.П.(1998), Кузнецова С.В. (1991), Жидков С.А. (1994), Юров К.П. (2003)  и другие ученые.

Респираторные болезни являются основной причиной вынужденного убоя и гибели телят в послеотъемный  период. По широте распространения, смерти, вынужденному убою, недополучению привесов  они превалируют над всеми другими  патологиями.

Популярность ИФА для изучения бактериальных и вирусных  инфекций широка. ИФА пришел на смену трудоёмким,  малопроизводительным и часто недостаточно чувствительным методам, основанным на феноменах агглютинации, преципитации, связывания комплемента.

Важным этапом контроля и искоренения заболеваний  является лабораторная диагностика инфекций, которая в большинстве случаев основывается на выявлении специфических антител в сыворотках  крови инфицированных и переболевших животных. В настоящее время разработаны средства и методы диагностики, позволяющие в короткие сроки  выявлять большинство инфекционных заболеваний. Однако диагностика при смешанных инфекциях представляет сложную, но актуальную проблему и требует разработки и внедрения в ветеринарную практику  современных диагностических наборов  на основе высоко чувствительных  множественно -антигенных тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА).

Несмотря на то, что диагностика многих  моно - инфекций  решена на уровне практического применения наборов ИФА, ветеринарная практика России не располагает диагностическими наборами для проведения комплексного дифференциального серологического мониторинга  респираторных  инфекций крупного рогатого скота. Одним из возможных подходов к решению этой проблемы может служить создание тест-систем ИФА, в которых число антигенов и их природа зависит от цели исследования.

Перечисленные выше нерешенные вопросы, указывают на актуальность намеченных исследований.

1.3.        Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является совершенствование и разработка современных биотехнологических процессов и иммунобиологических методов при промышленном производстве компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Усовершенствовать получение антирабических гипериммунных, а также противовирусных, специфических анти-ИРТ, анти-ПГ-3, анти-ВД- БС, анти-РС, анти-АВ  и отрицательных-референс сывороток крови животных.

2.         Разработать методику постановки, учета и интерпретации результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и аденовирусной инфекций  в  биологических жидкостях организма животных.

3.        Оптимизировать условия проведения комплексной тест-системы ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, взятых в одном разведении.

4.        Определить диагностическую ценность разработанной комплексной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и аденовирусной инфекций в сравнении с методами аналогичной направленности.

5.        Разработать технологию производства и применения комплексного  ИФА-набора с определением стабильности его компонентов при хранении.

6.        Провести испытание комплексной тест-системы ИФА по выявлению специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС, АВ в практических условиях с использованием сывороток крови крупного рогатого скота,  полученных от иммунных и неиммунных животных различных половозрастных групп.

7.        Клонировать ДНК L. interrogans  серовара pomona в плазмидном векторе, создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащих случайные фрагменты генома L. pomona. Получить банк препаратов нуклеиновых кислот лептоспир различных серогрупп.

8.        Провести серию гибридизаций отдельных клонированных фрагментов ДНК с полученными препаратами нуклеиновых кислот лептоспир и выявить фрагмент ДНК L. interrogans  серовара pomona, пригодный для использования  в качестве видоспецифичного гибридизационного зонда. Исследовать возможность применения клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации.

1.3. Научная новизна.

Усовершенствована схема получения гипериммунной антирабической сыворотки.

На основе иммунохимически охарактеризованных специфических реагентов разработан метод комплексного непрямого твердофазного ИФА для выявления специфических антител к антигенам  вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ инфекций в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота и оптимизированы условия его проведения при исследовании сывороток крови животных, взятых в одном разведении. В сравнительных исследованиях показана высокая чувствительность и специфичность разработанного теста и установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью разноплановых методов оценки специфического гуморального иммунного ответа (положительные решения на изобретение № 2008126759 и №2008126758).

В результате проведенной работы, разработан одноэтапный метод получения высокоактивных специфических положительных и отрицательных референс-сывороток.

Разработана технология изготовления иммунореагентов  комплексной иммуноферментной тест-системы для определения уровня специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БC, РС и АВ инфекций крупного рогатого скота.

Проведено молекулярное клонирование фрагментов ДНК  L. interrogans серовара pomona и на основе этого создан банк нуклеотидных последовательностей генома лептоспир. Получен ДНК-зонд, позволяющий дифференцировать производственные штаммы лептоспир.

Новизна полученных результатов подтверждена положительным решением: по заявкам на изобретение № 2008126759 и №2008126758.

1.4. Практическая значимость работы. Результаты НИР внедрены в ветеринарную практику.

Схема получения антирабической сыворотки иммунизацией  баранов фиксированным вирусом бешенства штамм "Овечий" с полиэлектролитами включена в  "Инструкцию по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", выпускаемых ВНИТИБП по Госконтракту с Департаментом ветеринарии МСХ РФ.  Получение антирабической сыворотки собаки фиксированным вирусом бешенства штамм "CVS"  с полиэлектролитами включена в  "Инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".

Материалы диссертационной работы использованы при составлении "Методических рекомендаций по идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации вида Leptospira  interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", которые утверждены научно-методической комиссией ВНИТИБП 17 сентября 1993 года и используются во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов при паспортизации производственных штаммов лептоспир и изучении культур лептоспир, выделенных от сельскохозяйственных и диких животных.

Хроматографически очищенный белок А золотистого стафилококка, конъюгированный с ферментами (пероксидазой), микроносителями, сорбентами использовали в "Инструкции по изготовлению и контролю глобулина флуоресцирующего для диагностики бешенства животных", утвержденной 22.01.2006 г. директором ВНИТИБП и в "Инструкции по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".

Результаты проведенных исследований позволили разработать "Методические рекомендации по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (РС), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на методической комиссии ВНИТИБП и на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1; Временную инструкцию по изготовлению набора реагентов для определения уровня антител к антигенам вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых,  респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе и проект нормативной документации.  Тест-система ИФА  предназначается для индикации и количественного определения антивирусных антител в сыворотках крови, молоке и молозиве крупного рогатого скота.

Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора для определения уровня антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи-болезни слизистой, респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций позволит решить проблему массового серологического  обследования поголовья КРС, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данных  заболеваний.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и методической комиссии ВНИТИБП, в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях:

-на 7 европейской и 9 всесоюзной конференции по лептоспирозу в Москве, 1991 г.;

- на научно-практической конференции "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных", 1993 г.;

- на международной научно-практической конференции молодых ученых "Научные основы производства ветеринарных биологических биопрепаратов", Щелково,1991 г., 2002 г., 2005 г.;

- на международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г., "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных", г. Москва, 2006 г.;

- на международной научно-производственной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных", посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А., г. Воронеж, 2006 г.;

- на научно-практической конференции "Актуальные проблемы молекулярной диагностики ветеринарной медицины и биологии" Феодосия, Крым, 2007 г.;

- на Всероссийской научной конференции, "Диагностика, лечение  и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология", Киров, 2008 г.;

- на заседаниях секции "Ветеринарная биотехнология" РАСХН, Щелково-2007 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано - 46 печатных работ, получены положительные решения по заявкам на изобретение 2008126758 и 2008126759.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 46 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 604 наименования, из которых 282 отечественных и 322 зарубежных авторов. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь А.Я. Самуйленко, В.И. Клюкина, Д.П. Кузнецов, С.В. Кузнецова, С.К. Артюшин, В.И. Белоусов, И.И. Кочиш, Т.Ю. Кочиш, С.Ю.Филиппов, Н.Н. Быкова, за что приносим им сердечную благодарность. Выражаем искреннюю признательность за помощь и сотрудникам, перечисленным в качестве соавторов в списке публикаций по теме.

1.5. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

-        теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствования схемы получения высокоактивной антирабической сыворотки;

-        клонирование ДНК L. interrogans  серовара pomona в плазмидном векторе и применение  клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации;

-        результаты экспериментов по разработке комплексной иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БC, РС и АВ инфекций;

-        результаты испытаний комплексной тест-системы ИФА в экспериментальных и практических условиях.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в ГНУ ВНИТИБП, в  лаборатории молекулярной биологии (1991-2007 гг.) в  соответствии с планами НИР и ОКР ГНУ ВНИТИБП, отраслевых научных программ, в рамках Программы  фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации; по теме 010401 "Получить компоненты набора для дифференциальной диагностики респираторных болезней животных (ИРТ, ПГ-3, РС, ВД-БС или аденовирусной инфекции)", по заданию 06, теме "Разработка методов генетической инженерии для идентификации и дифференциации лептоспир", № гос. регистрации 01.86.0 031246 и договору №3-К (Заказчик НПК Роагробиопром).

2.1. Материалы и методы.

Вирусологические исследования проводили согласно стандарту МЭБ (OIE Manual, Manual of Standarts// Chapter 2.3.5.,2000; Chapter 2.10.6., 2004).

Культивирование культур клеток и вирусов проводили в биореакторах в суспензии и на микроносителях.

Штаммы. В работе был использован фиксированный вирус бешенства, штаммов Щелково-51, "Овечий" и "CVS".

В качестве исходного материала применяли РС-вирус, штамм "Randall", вирус ИРТ штамма "ТК А (ВИЭВ) В2",  вирус диареи-болезни слизистых оболочек КРС штамма "Oregon C24V",  вирус парагриппа-3, штамма "ЗКСМ", штамм аденовирусов Вovine-10 серотип 1.

В работе использовали вакцинные, а также музейные культуры референтных штаммов патогенных лептоспир 23 серогрупп и 3 штаммов двух серогрупп L. biflexa, любезно предоставленные кафедрой микробиологии Университета Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы и лабораторией лептоспироза научно-исследовательского института им. Н.Ф. Гамалеи.

В исследованиях по получению протеина А применяли полевой изолят золотистого стафилококка, любезно предоставленный сотрудниками бактериологической лаборатории Центра Госсанэпиднадзора в Щелковском районе и  метициллинрезистентный штамм А-676 s. aureus, полученный из НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.

Инфекционность вируса. Инфекционную активность препаратов вируса бешенства определяли титрованием на 4-5 недельных мышах массой 10-12 г.

Определение титра инфекционности РС-вируса  проводили в 24-луночных панелях по ТЦД 50/мл  на культуре клеток ПТ-80. Результаты оценивали по цитопатическому действию через 3-5 суток после заражения  клеток и рассчитывали титр вируса по методу  И.П. Ашмарина.

Определение титра инфекционности  вируса ВД-БС, ИРТ проводили в 96-луночных панелях по  ТЦД50 /мл  на культуре клеток ПТ-80. Инфекционную активность вируса ПГ-3 определяли титрованием  в пробирочных культурах клеток ПТ-80.

Гемагглютинирующий титр вируса ПГ-3 КРС определяли в РТГА с эритроцитами мыши по методике Н.Н. Крюкова и соавт. (1982).

Инфекционную активность  аденовирусов определяли путём титрования в чувствительных культурах клеток, выражая титр вируса в Lg TЦД 50/ см3, по общепринятой методике Reed  и  Mench (1938).

Культуры клеток и среды. Для репродукции и титрования вирусов использовали перевиваемые линии клеток МДВК,  ПТ-80, Таurus-1 (Т-1), Тауэр; первично-трипсинизированные культуры клеток почки (ПЭК), лёгкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК), сердца (СЭК)  эмбриона коровы. В качестве ростовой и поддерживающей среды применяли среды 199, ГлаХ, производства Института полиомиелита  и вирусных энцефалитов РАМН, г. Москва.

Культивирование лептоспир для получения бактериальной массы проводили на твин(полисорбат)-альбуминовой среде F. Russel, C. Russel (1986).

Антитела, антигены. Специфические антитела к вирусам ИРТ и ВД-БС выявляли в ИФА, реакции нейтрализации (РН) в культурах клеток МДВК  и ПТ-80 на 96-луночных культуральных планшетах со 100 ТЦД50/50 мкл соответствующего вируса.

Антитела к вирусу респираторно-синцитиальной инфекции исследовали в РН в культуре клеток почки эмбриона коровы, а антитела против ПГ-3 - в РТГА с эритроцитами морской свинки по общепринятым методикам.

Вирусовыделение проводили в культурах клеток МДВК и ПТ-80, идентификацию изолятов - в реакции нейтрализации со специфической иммунной сывороткой.

Препараты антигенов и антител концентрировали в 20-100 раз методом ультрафильтрации на лабораторных ультрафильтрационных ячейках типа ФМО2-200 (СКБ АП АН, Ленинград) с мембранами "Владипор" УАМ-150.

Концентрирование препаратов вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС и РС проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием. В работе по очистке вирусов от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы.

Очищенные и концентрированные вирусы ПГ-3, ИРТ, ВД-БС и РС из вируссодержащей суспензии, обрабатывали  ультразвуком при 22кГц импульсивно 6 раз в течение 10 секунд на установке УЗДН-2Т и объединяли с антигенами, выделенными из содержащих вирус клеток. Антигены, выделенные из содержащих вирус клеток и вирус-содержащей суспензии, использовали для иммобилизации на твердой фазе полистироловых панелей. Титр в ИФА антигенов был равен 1:640-1280. Иммунные к вирусам сыворотки получали на кроликах. Для каждого вируса тщательно отрабатывали оптимальные условия постановки ИФА.

Для получения гипериммунных антирабических сывороток с высокой антивирусной активностью баранов иммунизировали инактивированной бетта-пропиолактоном 1:4000, очищенной центрифугированием 10% мозговой суспензией фиксированного вируса бешенства штамма "Овечий", собак - мозговой суспензией штамма  "CVS". Иммунизацию животных проводили по одной схеме, цикличным введением вируса бешенства с полиэлектролитами  с 7-8 дневным интервалом подкожно в 4 точки спины (150 мкг  вирусного белка и 200 мкг полиэлектролита на голову),  с последующим введением вируса внутримышечно.  В качестве контроля использовали введение продуцентам только вируса бешенства. Сыворотки от баранов и собак брали на 7, 21, 28, 35, 42, 49, 56 и 63 дни от начала иммунизации и изучали динамику накопления  в  сыворотках крови вируснейтрализующих антител на мышах в реакции нейтрализации (РН), комплементсвязывающих в реакции связывания комплемента (РСК), преципитирующих антител в  реакции диффузной преципитации (РДП) согласно рекомендациям ВОЗ по бешенству.

Содержание антител (МЕ/мл) в исследуемых сыворотках определяли методом иммуноферментного анализа с использованием стандартного препарата  антирабического глобулина человека с содержанием вируснейтрализующих антител 9 МЕ/мл (НПО "Вектор").

Антирабические сыворотки и препараты IgG исследовали в иммуноферментном анализе с использованием в качестве антигенов  гликопротеина и нуклеокапсида вируса бешенства штамм "Овечий", очищенного тритоном Х-100  по методике, разработанной  в отделе иммунологии. Фракцию IgG антител из антирабических сывороток барана получали высаливанием и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе А-50 в 10 мМ фосфатном буфере рН-7,4.

Классовый спектр IgG  антирабических сывороток барана и IgG препаратах определяли иммунодиффузией с использованием кроличьих антител к IgG, субклассам IgG1 и IgG2  барана ("Sigma"). Количество Т- и В- лимфоцитов в периферической крови продуцентов определяли с помощью общепринятого метода спонтанного розеткообразования.

Выделение и очистка иммуноглобулинов класса G. IgG КРС выделяли из цельной сыворотки крови аффинной хроматографией на протеин А Сефарозе-4В.

Очистку анти-IgG КРС проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на BrСN-агарозу очищенными иммуноглобулинами. Общий белок определяли по методу Лоури и на спектрофотометре СФ-26.

Для получения коньюгатов анти-IgG КРС с пероксидазой из хрена использовали перйодатный метод Nakane P. и A. Kawaoi (1974).

В работе применяли стандартные  методы прямого и непрямого твердофазного ИФА на 96 луночных микропланшетах по Engvall и др.

При отработке параметров выявления антител к вирусам ИРТ, ПГ-3, РС и ВД-БС в сборных пробах молока молоко предварительно центрифугировали и концентрировали молочные иммуноглобулины ПЭГ ММ 6000 в 15% насыщении.

Молекулярное клонирование ДНК L. pomona осуществляли в плазмидном векторе рUС 19 (С. Yanish-Perron et al.,1985).

Банк фрагментов ДНК L. pomona создавали, используя стандартные методики молекулярного клонирования (Маниатис Т. и др.,1984).

В качестве клетки-хозяина для рекомбинантных плазмид применяли бактериальный штамм JM 109 Е. coli. При выращивании бактериальных культур использовали среду LB.

Идентификацию рекомбинантных клонов осуществляли на чашках с агаризованной LB, содержащей по 1 мМ селективного гистохимического красителя Х-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бетта-галактозид) и индуктора lac-промотора IPTG (7-изопропил-1-тио-бетта-Д-галактозид), а также 75 мкг ампициллина.

Для выделения плазмидной ДНК использовали метод кипячения (Holmes,Quigjey,1981) и метод щелочного лизиса (Birnboim H. С. и Doly J.A.,  1979),

Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот проводили в 0,8 %  агарозном геле (Л. А. 0стерман,1981).

Рестрикционный анализ бактериальной и плазмидной ДНК проводили  в соответствии с рекомендациями Маниатис и др., 1984, с использованием эндонуклеаз рестрикции, полученных из НПО "Фермент"(Литва).        .

Включение радиоактивной метки в ДНК-зонды осуществляли методами ник-трансляции (Rigby P.V.J. et al.,1977) и рассеянной затравки (Feinberg и Vogelstein,1984).

Нерадиоактивное мечение (биотинилирование) ДНК-зондов по методу В.А. Адаричева и соавт. (1987).

Перенос ДНК на нейлоновую мембрану Hybond-N ("Amersham") осуществляли по методике, предложенной Е. Southern, 1975, с использованием для переноса 10 X SSC буфера.

В одних случаях предгибридизацию и гибридизацию ДНК осуществляли при 47°С в растворе, содержащем 30 % формамид, 2 X SSC, 5 X раствор Денхардта, 0,1 % SDS и 100 мкг/мл денатурированной  ДНК спермы лосося. В других  случаях предгибридизацию и гибридизацию ДНК осуществляли при 65°С в растворе, содержащем 30 % формамид, 2 X SSC, 5 X раствор Денхардта, 0,2 % SDS и 100 мкг/мл денатурированной  ДНК спермы лосося.

Культуру стафилококка выращивали в биореакторе АК-210, который  оснащен системами автоматического контроля и регулирования параметров культивирования (температура, рН, парциальное давление растворенного кислорода-рО2, окислительно-восстановительный потенциал-еН, расход воздуха на аэрацию, скорость вращения мешалки и оптическая плотность бактериальной суспензии). Морфологию s. aureus изучали путем микроскопирования мазков, окрашенных по Граму. Для определения фаз роста и максимальной удельной скорости использовали графический метод.

При анализе и статистической  обработке  результатов вычисление средней арифметической, средней геометрической, стандартного отклонения, коэффициента корреляции результатов проводили  с использованием программы Excel для Windows. При этом были приняты следующие обозначения: М - средняя арифметическая, m - ошибка средней арифметической, n  - число наблюдений или животных в опыте, г - коэффициент корреляции результатов (коэффициент корреляции Пирсона), Р - критерий достоверности.

Значение критерия достоверности оценивали по таблице  вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала. Вероятность различий считалась существенной при Р < 0,05.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1.Усовершенствование  получения антирабической гипериммунной сыворотки.

Наиболее широко распространенным тестом для диагностики бешенства является тест флюоресцирующих антител, который рекомендован Всемирной организацией здравоохранения. Тест флюоресцирующих антител обеспечивает надежный результат в течение нескольких часов в 98-100% случаев. Чувствительность  теста зависит от активности  флюоресцирующих коньюгатов, которые готовят на основе поликлональных антител, выделенных из антирабических сывороток. В связи с этим, получение высокоактивных антирабических сывороток является сложной задачей, включающей  многократное введение большого объема инактивированного вирусного материала, включая грундиммунизацию. Одним из эффективных способов повышения активности  гипериммунных сывороток, является применение адьювантов.

Поиск адьюванта для иммунизации животных-продуцентов антирабической сыворотки, заставил нас обратить внимание на отечественные синтетические полиэлектролиты (полиоксидоний, вегетан) успешно применяемые в настоящее время в медицине и  в ветеринарии в качестве адьювантов и иммуномодуляторов.  Полиэлектролиты  обладают иммуностимулирующим действием и избирательно влияют на отдельные звенья иммуногенеза,  вызывают значительное повышение интенсивности антителообразования, не нарушая резервных возможностей кроветворной системы. Описанные свойства и послужили основанием для применения полиэлектролитов в качестве адьюванта при иммунизации животных против бешенства.

В результате проведенных экспериментов была разработана схема иммунизации  животных, состоящая из нескольких циклов: на первом этапе баранов и собак инокулировали вирусом бешенства в смеси с полиэлектролитом подкожно вдоль позвоночника точечно, а затем  внутримышечно без адьюванта.

Комплексное исследование антивирусной активности  антирабических сывороток показало,  что содержание  специфических антител в них зависело от способа введения вирусных препаратов  и сроков взятия сыворотки.  Исследование серологической активности  гипериммунных сывороток не установило преимуществ одного из применяемых полиэлектролитов.  Применение полиэлектролитов позволило получить антирабические сыворотки с  титром специфических к вирусу бешенства антител к 6-му циклу введения вируса  в 2-4 раза выше в сравнении с контролем. Количество антител к остаточным белкам мозговой ткани в сыворотках крови иммунизированных животных с применением полиэлектролитов,  в сравнении с контролем, было незначительно и после 1 цикла введения существенно не менялось, и к 6-му циклу не обнаруживалось.





Максимальные титры вируснейтрализующих антител в сыворотках баранов, иммунизированных  вирусом бешенства штамм "Овечий" с полиэлектролитами, в титрах 1:16-1:64, выявлялись в реакции нейтрализации на 30 день от начала иммунизации, комплементсвязывающих- в титре 1: 80- 1:320 - на 42 день, преципитирующих - в титрах 1:256-1:512 на 63 день от начала иммунизации. Антирабическая сыворотка собак, иммунизированных  очищенной мозговой суспензией вируса бешенства штамм "CVS"  совместно с полиэлектролитами, с максимальные титром вируснейтрализующих антител 1:64 и активностью 8 МЕ/мл,  была получена на  35 день.

Изучение методом ИФА изменения спектра антирабических антител на разных стадиях иммунизации показало, что после 2-х циклов введения вируса в сыворотках крови барана и собаки титры антител к гликопротеину составили 1:800-1: 1600, к белкам нуклеокапсида -1:200-1:400. После 4-го цикла титры антител к нуклеокапсиду возросли и достигли максимума  1:12800 к 9-му циклу иммунизации. Установлено также, что в ходе 2-х циклов иммунизации антитела в сыворотках крови барана относились как к IgG1, так и IgG2, причем удельная активность последнего увеличивалась, и к 9 циклу антителам IgG2 соответствовал наибольший индекс нейтрализации и  преципитации. Антитела к мозговым белкам были сосредоточены во фракции, содержащей IgG1, и в ходе очистки иммуноглобулинов легко удалялись, что является положительным моментом  при получении диагностических препаратов на основе IgG.

На повышение активности Т- и В- системы иммунитета в процессе иммунизации указывает увеличение процентного содержания в крови розеткообразующих Т- и В- лимфоцитов. Применение полиэлектролитов способствовало увеличению как относительного числа  Т-лимфоцитов в сыворотке крови иммунизированных собак, образующих интенсивные розетки (16,2+ 1,8 -16,4+ 1,1% против 11,8 +0,9- 13,07+ 0,1%  в контроле), так и регистрировали достоверное повышение розеткообразующей способности В-лимфоцитов (24,4+0,4% против 18,5+ 0,1% в контроле).

Таким образом, при получении антирабической сыворотки высокую эффективность показало применение полиэлектролитов, таких как полиоксидоний и вегетан, в качестве иммуностимуляторов. Применение данных полиэлектролитов, при сравнении с применяемым ранее, способом  получения антирабической сыворотки,  выявило следующие преимущества: повышение активации иммунокомпетентных клеток, увеличения антителообразования у животных-продуцентов и повышение выхода и специфической активности  антирабической сыворотки, сокращение сроков иммунизации с 90 до 62 дней,  за счет исключения этапа подготовки животных к иммунизации и применения одновременных инъекций антигена и полиэлектролитов, и уменьшения расхода антигенного материала.

Схема получения антирабической сыворотки иммунизацией  баранов фиксированным вирусом бешенства штамм "Овечий" с полиэлектролитами включена в  "Инструкцию по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", выпускаемых ВНИТИБП по Госконтракту с Департаментом ветеринарии МСХ РФ.  Получение антирабической сыворотки собаки фиксированным вирусом бешенства штамм "CVS"  с полиэлектролитами включена в  "Инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".

2.2.2. Результаты исследований по молекулярному клонированию ДНК L. interrogans серовара pomona

2.2.2.1. Выделение и характеристика ДНК лептоспир.

Препараты нуклеиновых кислот референтных штаммов сероваров pomona, tarassovi, polonica, djatzi, szwajizak. ballum, whitcombi, shermani, pyrogenes, сanlcola, louisiana, panama, grippotyphosa, kabura, bratislava, copenhageni, patoc, andamana, semaranga, sejroe, celledoni, castellonis, hebdomadis, poi, ranarum, djasiman, lichuan, sarmin, autumnalis, а также производственных штаммов лептоспир и полевых изолятов серогруппы Роmoпа были получены для анализа специфичности рекомбинантных плазмид.

Используя фенол - додецилсульфатный метод, было выделено и очищено 65 препаратов ДНК штаммов лептоспир.

На каждое выделение брали 5-7 мл культуры лептоспир. При этом среднее количество ДНК, полученное из биомассы лептоспир, составляло 1,5 мг.

Оптические характеристики ДНК, рассчитанные как соотношение поглощений при заданных длинах волн ультрафиолетового спектра, в среднем составляли А 260/230-1,8 (контаминация полисахаридами) и для А 260 / 280 - 1.9 (контаминация белками).

Усредненная величина гиперхромного эффекта для препаратов ДНК достигла 28 % .

Полученные данные по спектральным характеристикам свидетельствуют о том, что изученные образцы содержали нативную ДНК, не контаминированную примесями белков и полисахаридов. Препараты ДНК отвечают требованиям и могут быть использованы для проведения генносистематических исследований.

2.2.2.2.  Создание клонотеки ДНК L. interrogans серовара pomona.

Источником хромосомной ДНК служил штамм ВГНКИ-6 серогруппы Pomona, который выделен от свиньи в 1966 г. в Московской области. Выбор штамма этой серогруппы обусловлен тем, что на территории нашей страны Pomona является одной из наиболее распространенных серогрупп, поражающих как сельскохозяйственных животных (особенно свиней), так и человека.

Хромосомную ДНК штамма ВГНКИ-6 расщепляли на отдельные фрагменты эндонуклеазой рестрикции EcoR I в условиях неполного гидролиза. Были подобраны такие условия рестрикции, при которых максимальное количество продуктов реакции составляли фрагменты ДНК размера 1-4 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Эта фракция ДНК выделялась препаративным электрофорезом из агарозного геля.

Выделенные фрагменты ДНК лигировали с плазмидой  pUC  19, предварительно  расщепленной рестриктазой EcoR I.

Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма JM 109 и высевали на чашки с агаризованной средой LB, содержащей ампициллин, индикатор бетта-галактозидазной активности X-gal и индикатор бетта-галактозидазы IPTG.

Рекомбинантные клоны были отобраны по отсутствию бетта-галактозидазной активности, поскольку у них нарушена способность к синтезу фермента вследствие сдвига рамки его считывания при встраивании в векторную плазмиду фрагмента чужеродной ДНК, т.е. клоны рекомбинантного фенотипа на селективной среде формировали бесцветные колонии в отличие от обычных колоний синего цвета.

В результате молекулярного клонирования было отобрано 44 колонии рекомбинантного фенотипа.

2.2.2.3. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид.

Из биомассы случайно отобранных 44 клонов были выделены препараты плазмидной ДНК. Размеры клонированной ДНК L.  роmonа в составе рекомбинантных плазмид определяли с помощью рестрикции EcoR I и электрофореза в агарозном геле. Рекомбинантные плазмиды содержали по 1-3 фрагмента чужеродной ДНК, размеры которых варьировали от 0,4 до 3,6 тысяч пар нуклеотидов. Сумма клонированнных фрагментов ДНК лептоспир достигла 88,9 т. п. н., что составляет 4 %  бактериального генома.

Поскольку для клонирования из агарозного геля после рестрикции ДНК штамма ВГНКИ-6 препаративно выделяли фрагменты, находящиеся в пределах полосы 1-4 т.п. н., то очевидно, что выделенные из рекомбинантных плазмид вставки соответствуют по размерам диапазону клонированных фрагментов.

При рестрикционном анализе рекомбинантных клонов было также установлено, что из некоторых плазмид выделялось 2 или 3 фрагмента чужеродной ДНК. Это объясняется тем, что клонированный фрагмент чужеродной ДНК содержит внутри себя сайты рестриктазы EcoR I и в результате полного гидролиза препаратов ДНК, в местах узнавания данной рестриктазы происходит полное расщепление ДНК по этому сайту. Возможно, однако, что наличие этих сайтов обусловлено одновременным лигированием в одном векторе двух и более мелких фрагментов ДНК лептоспир.

2.2.2.4.  Анализ рекомбинантных плазмид в реакции ДНК-ДНК гибридизации.

Принадлежность клонированных фрагментов к ДНК лептоспир была подтверждена в реакции дот - гибридизации с радиоактивно мечеными ДНК-зондами, в качестве которых использовали тотальные ДНК штаммов: ВГНКИ-6 серогруппы Pomona, RP-29 серогруппы Tarassovi,  Pinos серогруппы Canicola.

Результаты дот-гибридизационного анализа свидетельствовали, что клонированные в плазмидном векторе pUC 19 фрагменты ДНК действительно лептосиирозной природы- все 42 рекомбинантные плазмиды обнаруживали интенсивные положительные сигналы на радиоавтографе после гибридизации с меченой радиоактивным фосфором ДНК штамма ВГНКИ-6. Десять рекомбинантных плазмид имели комплементарные последовательности в геноме штамма Pinos серогруппы Canicola и лишь одна единственная рекомбинантная плазмида (pLp 41) гибридизовалась с тотальной ДНК штамма RP-29 серогруппы Tarassovi. Эти данные не противоречат результатам экспериментов P. Yasuda et al. (1987), P. Ramadass et al. (1992), определившим, что по степени гомологии ДНК представители серогрушшы Tarassovi генетически отдалены от представителей серогрупп Pomona и Canicola.

Из созданной клонотеки рекомбинантных плазмид для дальнейших исследований отобрали pLp 23,pLp 37 и pLp 41.

По результатам дот - гибридизации установлено, что рекомбинантная плазмида pLp 23 гибридизовалась с ДНК штаммов ВГНКИ-6 и Pinos, pLp 37 показала положительный сигнал на радиоавтографе только с хромосомной ДНК ВГНКИ-6, a pLp 41 - с ВГНКИ-6 и RP -29.

Однако выбор наиболее перспективной рекомбинантной плазмиды из числа предварительно отобранных структур может быть сделан на основе дальнейших исследований с использованием в гибридизационных экспериментах более широкого круга представителей бактериального мира.

2.2.2.5. Плазмиды pLp 23, pLp 37 и pLp41 как гибридизационные зонды для идентификации референтных штаммов лептоспир.

Согласно цели исследования осуществили препаративное выделение фрагментов ДНК L. pomona из рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41. Рекомбинантные плазмиды pLp 23, pLp 37, pLp 41 по результатам рестриктазного анализа содержали 3,2,1 фрагментов ДНК L. pomona соответственно. Выделенные из рекомбинантных плазмид шесть фрагментов-вставок ДНК L. pomona метили радиоактивным фосфором и использовали в качестве зондов в реакции слот-блот гибридизации. В эксперименте использовали препараты ДНК, выделенные из музейных культур референтных штаммов лептоспир. Всего с использованием данной методики было исследовано 42 препарата суммарных нуклеиновых кислот лептоспир.

Сравнение результатов слот - блот гибридизации тотальных ДНК различных штаммов лептоспир с ДНК-зондами из рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41 показало, что штаммы патогенных лептоспир отличаются друг от друга по интенсивности сигналов радиоавтографии. Возможно, что различия в степени гибридизации с молекулярными зондами в штаммах патогенных лептоспир могут быть связаны с разной степенью гомологии этих зондов комплементарным им нуклеотидным последовательностям в ДНК штаммов L. interrogans. Однако различия могут быть обусловлены и разным числом копий последовательности исследованных ДНК-зондов внутри генома лептоспир того или иного штамма.

Одновременно, было показано, что ни один из исследуемых ДНК-зондов не гибридизовался с ДНК сапрофитных штаммов лептоспир. Полученные данные позволяют утверждать, что ДНК-ДНК гибридизация с ДНК-зондом, приготовленным из рекомбинантной плазмиды pLp 23, pLp 37 или pLp 41, позволит дифференцировать вид L. interrogans от вида L. biflexa.

При определении специфичности полученных рекомбинантных плазмид в реакции слот-блот гибридизации с референтными штаммами патогенных лептоспир было обнаружено, что одни фрагменты-вставки гибридизовались с более узкой, а другие - с более широкой группой бактериальных штаммов. Так, например, фрагмент - вставка ДНК L. pomona размером 1,56 т. п. н. из рекомбинантной плазмиды pLp 37 активно гибридизовалась со штаммами лептоспир следующих сероваров: pomona, panama, canicola, polonica, grippotyphosa, kabura, szwajizak, pyrogenes, louisiana, autumnalis, djasiman, copenhageni, whitcombi, poi; исключение составили bal1um, ranarum, sejroe, 1ichuan, sarmin, castellonis, tarassovi, shermani, сelledoni.

Однако фрагменты-вставки рекомбинантиой плазмиды pLp 23 обнаруживали при радиоавтографии интенсивные положительные сигналы с препаратами ДНК немногих сероваров (для фрагмента размером 0,67 т. п. н. это серовары: polonica, kabura, sarmin, cynopteri, pyrogenes; для фрагмента 0,40 т.п.н. -polonica, cynopteri, kabura; а для фрагмента размером 0,75 т.п.н.- это  серовары: grippotyphosa, cynopteri, panama, celledoni, lichuan, sarmin, hebdomadis).

Для фрагментов-вставок из рекомбинантных плазмид pLp 23 и pLp 37 слот - блот гибридизацией отмечено одно обшее свойство -отсутствие положительных гибридизационных сигналов с образцами ДНК лептоспир патогенного серовара tarassovi. Таким образом, можно полагать, что хромосомные ДНК штамма Perepelicyn (из музейных коллекций кафедры микробиологии университета Дружбы Народов им. Лумумбы и лаборатории лептоспироэа НИИЭМ им. Н.Ф.  Гамалеи) не несли комплементарных pLp 23 и pLp 37 последовательностей нуклеотидов.

Одновременно результаты исследований показали, что в хромосомных ДНК сероваров tarassovi, pomona, sejroe, kabura, grippotyphosa, panama, sarmin, szwajizak, bratislava, castellonis, louisiana, whitcombi, djatzi, cynopteri присутствуют области, гомологичные ДНК-зонду pLp 41.

Описанные выше результаты слот - блот гибридизаций не противоречат сообщениям из литературы (Terpstra V. J., Schoone G. j. et ai.,1986,1987; Zaal J. et al.,1988). Проведенные опыты по идентификации патогенных лептоспир при использовании в качестве зондов геномной или клонированной ДНК лептоспир показали перекрестную гибридизацию между сероварами даже в строгих (жестких) условиях дот-блот анализа.

2.2.2.6. Плазмиды pLp 23,37,41 как ДНК-зонды для идентификации полевых изолятов и производственных штаммов лептоспир.

Выполнены эксперименты по гибридизации шести фрагментов ДНК L. pomona из рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37, pLp 41 с препаратами ДНК штаммов лептоспир серогруппы Pomona, которые были изолированы от сельскохозяйственных животных и человека на территории России. Одновременно изучалась гибридизационная активность клонированных фрагментов по отношению к ДНК производственных штаммов лептоспир (Таблица 1).

Как следует из полученных данных, наименьшая гибридизационная активность с препаратами ДНК, характерна для фрагментов ДНК L. pomona размером 0,75 т.п.н., 0,67 т.п.н. и 0,40 т.п.н. из рекомбинантной плазмиды pLp 23. Эти фрагменты ДНК рекомбинантной плазмиды pLp 23 в низкой степени гибридизовались с образцами ДНК изолятов лептоспир сероваров monjakov, pomona и производственных штаммов ВГНКИ-2, ВГНКИ-5, ВГНКИ-4. Однако высокое сродство к штаммам - изолятам лептоспир, серологически идентифицированным к серовару mozdok,  обнаруживали все три фрагменты-вставки L. pomona рекомбинантной плазмиды pLp23.

Таблица 1

Характеристика штаммов лептоспир, используемых в опыте

________________________________________________________________

штамм       серовар       Характеристика:

  вид животного, год и место выделения

_____________________________________________________________________________________________________

1.Сарпинский  pomona бычок,1951, Cталинградская обл.

2.Гиацинт  pomona бычок,1946, Московская обл.

3.Иванченко  mozdok человек,1961,СОАССР

4. Т-8021  mozdok бычок,1961, СОАССР

5. Моняков  monjakov  человек,1937,Приморский край

6. Танк monjakov лошадь,1954,Татарская АССР

7. Свинья 185  monjakov  свинья, 1959, Калининградская обл.

8. ВГНКИ-1  grippotyphosa овца,1969 --- 

9. ВГНКИ-2  icterohaemorrhagiae свинья,1972,Московская обл.

10. ВГНКИ-3  canicola свинья, 1973, Московская обл.

11. ВГНКИ-4  tarassovi  свинья, 1973,Московская обл.

12. ВГНКИ-5  balcanica бычок,1974,  Оренбургская обл.

13. ВГНКИ-6  pomona (monjakov) свинья,1966,Московская обл.

__________________________________________________________________

       Исследования показали, что с ДНК - зондами pLp 37 и pLp 41 положительный эффект в реакции гибридизации проявляли в равной мере все исследуемые штаммы - изоляты сероваров pomona, monjakov и mozdok. Однако только ДНК-зонд, приготовленный на основе рекомбинантной плазмиды pLp 41, обнаруживал высокую гибридизационную способность со всеми используемыми в этом эксперименте производственными штаммами лептоспир. Рекомбинантные плазмиды pLp 23 и pLp 37 в высокой степени гибридизовались с образцами ДНК производственных штаммов ВГНКИ-1, ВГНКИ-2, ВГНКИ-3, ВГНКИ-5,ВГНКИ-б, за исключением ВГНКИ-4.

2.2.2.7. Проверка специфичности рекомбинантньх плазмид на коллекции ДНК штаммов различных видов микроорганизмов.

Препараты ДНК различных культур микроорганизмов Е. coli, Leptospira interrogans, Yerslnia pseudotuberculosis, Bordetella bronchioseptiсa, Corynebacterium pyogenes, Corynebacterium rinale, Pasterella multocida, Brucella abortus, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma luteus гибридизовали по стандартной методике с ДНК-зондами pLp 23 и pLp 41.

Результаты эксперимента показали, что нуклеотидные последовательности ДНК L. роmопа рекомбинантных плазмид pLp 23 и pLp 41, не обнаруживают перекрестную гибридизацию с образцами ДНК чужеродных источников. В местах нанесения препаратов ДНК cероваров патогенных лептоспир отмечали положительные сигналы гибридизации.

2.2.2.8. Реакция блот-гибридизации для дифференциации производственных штаммов лептоспир.

Ряд молекулярно-генетических методов позволяют осуществить дифференциацию возбудителя заболевания при анализе структуры ДНК.

Препараты суммарной ДНК лептоспир в количестве 0,8 мкг расщепляли рестриктаэой Hind III, рестриктные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 0,8 % агарозном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, используя блоттинг по Саузерну.

В качестве маркера молекулярной массы использовали фрагменты ДНК фага лямбда, полученные при расщеплении Pst I. Фильтры с иммобилизованными фрагментами ДНК лептоспир гибридизовали с фрагментами рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41.

Результаты блот-гибридизации Hind III фрагментов тотальной ДНК штаммов лептоспир с ДНК - зондами pLp 23, pLp 37, pLp 41 представлены в таблице 2.

  Таблица 2.

Результаты блот-анализа.

__________________________________________________________________

№ штаммы Размеры гибридизующихся Hind III - 

Фрагментов ДНК лептоспир с ДНК-зондом  (т.п.н.) 

_______________________________________________

pLp 23 pLp 37  pLp 41

__________________________________________________________________

1. ВГНКИ-1  4,9; 4,8; 4,7  5,0 5,1;4,7;4,5;2,8;1,4

2        ВГНКИ-2  3,6  4,7;4,0;2,9 4,5; 3,5

3        ВГНКИ-3  4,8; 3,6  4,6; 4,0; 2,9 5,0; 4,5

4        ВГНКИ-4  4,8; 3,6  4,8; 4,5; 4,0 5,1-2,9;2,4;2,0;1,7

5        ВГНКИ-5  4,8; 3,6  4,7;4,0;2,0 4,8;4,5;3,5

6        ВГНКИ-6  4,8 4,8;4,7;2,9  4,8;3,5;2,6

7        MoskvaV 4,9;4,6;3,6 5,0;4,0  5,1;4,7;4,5;2,8;1,4

8        Каширский 4,8;3,6 4,8;4,6;4,0;2,9 5,0;4,5

9        Perepelicyn 4,8;3,6  4,8;4,0 5,1-4,5-2,9;2,4;2,0;1,7

10        493 Poland  4,8;4,7;4,6         4,8  5,1;4,7;4,5;3,5;2,9

11        Pomona 4,8;3,6         4,8;4,6;4,0;2,9  5,0;4,5;3,5

__________________________________________________________________

С ДНК-зондом pLp 23 идентичные профили гибридизации характерны для штаммов ВГНКИ-3,ВГНКИ-4 и ВГНКИ-5, хотя все производственные и референтные штаммы давали чрезвычайно низкий гибридизационный сигнал.

При гибридизации с ДНК-зондом pLp 37 не отмечено существенных различий у штаммов ВГНКИ-3, ВГНКИ-2, а для штамма ВГНКИ-1 интенсивная гибридизационная полоса была локализована в верхней части трека, при этом не наблюдалось никаких дискретных полос.

Отсюда можно полагать, что существуют отдельные места в геноме BГHKИ-1, где комплементарные ДНК-зонду pLp 37 нуклеотидные последовательности концентрируются в значительной степени.

Из представленных данных следует, что pLp 23 и pLp 37 не пригодны для дифференциации производственных штаммов лептоспир методом блот-гибридизации по Саузерну.

Различие гибридизационных профилей ДНК лептоспир, рестрикцированных эндонуклеазой Hind III, оказались наиболее демонстративными, когда в качестве ДНК - зонда, использовали фрагмент -вставку размером 1,20 т. п. н., которая выщепляется из рекомбинантной плавмиды pLp 41. Производственные штаммы лептоcпир отличались друг от друга числом к размером гибридизующихся фрагментов, а также интенсивностью сигнала радиоавтографии. Характерно наличие пяти дискретных полос для штамма ВГНКИ-1 и интенсивного гибридизационного пятна по всему треку для штамма ВГНКИ-4, что, вероятно, указывает на хороший разброс по геному данной клонированной последовательности. Результаты блот-гибридизации позволяют предполагать, что фрагмент - вставка рекомбинантной плазмиды pLp 41 представлен в геноме ВГНКИ-4 как большое количество копий, повторяющихся друг за другом.

Таким образом, каждый производственный штамм характеризовался наличием как общих, так и индивидуальных различающихся по молекулярной массе и специфичности отдельных фрагментов' ДНК.

Блот-гибридизация Hind III фрагментов ДНК штаммов лептоспир с ДНК-зондом pLp 41 показала идентичные профили гибридизации для производственного штамма ВГНКИ-1 и референтного штамма Moskva V, а в случае гибридизации с ДНК-зондами pLp 23 и pLp 37 профили этих штаммов были отчетливо различимы. Также нами установлено, что нельзя точно отличить блот - гибридизацией c ДНК-зондом pLp 41 производственный штамм ВГНКИ-3  и референтный штамм Каширский. Однако, блот- гибридизация с ДНК-зондом pLp 41  различала производственные штаммы ВГНКИ-4, ВГНКИ-5 и ВГНКИ-6 серогрупп Tarasoovi, Sejroe и Pomona cоответственно от их референтных штаммов Perepelicyn, 493 Poland  и Pomona.

2.2.3. Разработка комплексной иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител  к антигенам респираторных вирусных инфекций КРС

За основу разрабатываемой иммуноферментной тест-системы взят стандартный вариант непрямого твердофазного ИФА.

Основные этапы работ в этом направлении были следующими:

-        получение и иммунохимическая характеристика основных иммунологических реагентов, входящих в тест-систему;

-        разработка иммуноферментной тест-системы и определение её основных диагностических параметров;

-        оценка эффективности разработанной тест-системы в сравнении с методами аналогичной направленности.

Основными иммунологическими реагентами, используемыми для разработки непрямого варианта твердофазного ИФА, служили очищенные антигены, вирус-специфические анти-ИРТ, анти-ПГ-3, анти-ВД-БС, анти-РС, анти-АВ и отрицательные сыворотки; конъюгат анти-IgG-КРС с пероксидазой. Получение и иммунохимическая характеристика данных реагентов являлись ключевым звеном технологической цепи по производству иммуноферментной тест-системы.

Культивирование культур клеток и вирусов  в биореакторах в суспензии и на микроносителях.

Управляемое суспензионное культивирование клеток ПТ-80 проводили в биореакторе емкостью 25 л (разработка ВНИТИБП, Иркутск НИИХИММАШ) в комплекте с микропроцессорными управляющими комплексами «Биоцикл»  и индивидуальными модулями технологической обвязки и управления (разработка и изготовление ВНИТИБП и НПО «Промавтометика»).

Для культивирования клеток животных и вирусов использовали традиционные питательные среды. Индекс пролиферации клеток ПТ-80 был 2-4, а накопление клеток в 1 см3 – 0,9-1,3 х106.

На автоматизированных блочно-модульных установках отработаны оптимизированные режимы выращивания клеток линии ПТ-80 на микроносителях «Cytodex», что позволило сравнить продуктивность клеточных культур в зависимости от различных систем культивирования. (Табл.3)

  Таблица 3

Средняя продуктивность различных систем

культивирования клеток животных

№п/п

Система культивирования

Количество клеток в 1 мл питательной среды

1

Биореактор с перемешиванием и протоком среды

5х106

2

Эрлифтный биореактор

5х106

3

Биореактор с биофильтром и протоком среды

7х106

4

Культивирование в микрокапсулах, микроносителях типа «Cytodex»

107 (перфузия)

5

Биореактор с пористыми ячейками

108(перфузия)

6

Биореактор с полыми волокнами

108(перфузия)

7

Мембранные биореакторы (керамический модуль)

109 (перфузия)

Для практической реализации процесса культивирования клеток животных и вирусов наиболее перспективным является метод культивирования в микрокапсулах и на микроносителях.

В результате пяти культивирований клеток ПТ-80 на микроносителе «Cytodex-3» при среднем времени культивирования 72 ч, средний индекс пролиферации был равен 2.

В процессе культивирования стадию адсорбции клеток на микроносителе осуществляли непосредственно в биореакторе.

При отработке промышленной технологической схемы адсорбции  клеток на микроносителе в биореакторе установлено, что оптимальной посевной концентрацией клеток ПТ-80 является 8-12 кл на микроносителе. Распределение  клеток на поверхности микроносителя в конце стадии адсорбции через 2,5-3 ч после добавления в биореактор клеточной суспензии оказалось более равномерным при посевной концентрации 10-12 кл на микроносителе. При этом число прикрепившихся к микроносителю клеток составляло около 95%. Теоретически рассчитанный при такой посевной концентрации  индекс пролиферации клеток ПТ-80 может достигать 6-8, максимальный, полученный в наших опытах, составлял 4,2.

Очистка и концентрирование вируса ИРТ КРС.

На первом этапе отрабатывали условия получения очищенного препарата вируса ИРТ. Методологической основой для проведения этих исследований служили данные отечественных и зарубежных исследователей в этой области (Кузнецова С.В., 1991, Кузнецов Д.П., 2001).

Исходным материалом для получения антигена служила суспензия вируса ИРТ  в перевиваемой культуре клеток ПТ-80. При этом необходимым условием для получения высокоактивного очищенного антигена было наличие высокого его титра в исходном культуральном вирус-содержащем материале. Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирус ИРТ-108 ТЦД50/см3.

Поэтому для выделения, концентрирования и очистки использовали вирус с инфекционной активностью не ниже 10 8,0ТЦД50/см3.

Для концентрирования ИРТ вирус-содержащий материал подвергали трехкратному замораживанию и оттаиванию с последующим осветлением его путем центрифугирования (4000 об/мин в течение 40 мин). Полученный супернатант собирали и подвергали дальнейшей обработке по следующей прописи: на 1 л вируссодержащего материала добавляли 75 г полиэтиленгликоля (ПЭГ, М.М. 6000), 20 г NaCl, 0,2 г NaN3, тщательно перемешивали и выдерживали в течение 3-х суток при +4°С. Осадок отделяли центрифугированием (4000 об/мин в течение 40 мин), затем его ресуспендировали в 15 см3 ФСБ (0,01 М Na2HPO4, 0,15 М NaCl, рН 7,2) и диализовали против этого же буфера в течение 12 ч.

Концентрированный вирусный препарат очищали методом ультрацентрифугирования (125000 g в течение 1,5 часов) в линейном (30-45%) градиенте плотности сахарозы.

На каждом этапе специфическую активность вируса контролировали: комплементсвязывающую активность - по методу Rossi G., преципитирующую -по методу Ouchterlony L., гемагглютинирующую - по методу Крюкова Н.Н.

Результаты исследований показали, что после осаждения вирус концентрировался в 100-200 раз в 20-30 мл ФСБ с сохранением своих антигенных свойств. При очистке в линейном градиенте плотности сахарозы вирус располагался в компактной опалесцирующей зоне, из которой его отбирали, и использовали в дальнейшей работе. Конечная концентрация белка в вирусном антигене составляла 0,5- 0,8 мг/мл в зависимости от концентрации исходного препарата. Биологическая активность препарата вируса ИРТ по мере очистки и концентрирования достоверно увеличивалась. В РДП с 1:16 в исходной суспензии до 1:64 при 50 -кратном концентировании, в РГА -с 1:16 до 1:56, в РСК - с 1:4 до 1:64 соответственно.

Результаты проведенных исследований показали, что данный метод получения высококонцентрированного и очищенного препарата вируса ИРТ позволяет получать его в препаративных количествах и впоследствии эффективно использовать в качестве антигена в разрабатываемой иммуноферментной тест-системе.

Очистка и концентрирование РС-вируса.

Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирус РС -106 ТЦД50/см3.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов РС-вируса было использовано несколько принципов выделения вируса из вируссодержащих суспензий (Кочиш Т.Ю., 2004).

При концентрировании РС-вируса, штамм "Randall", были изучены различные условия осаждения его полиэтиленгликолем (ПЭГ) с различным молекулярными массами: 3000, 6000 и 20 000 дальтон в концентрации 5,0; 7,0 и 10,0%.

При концентрировании РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, полиэтиленгликолем очистка вируса варьирует от 11,5 до 90,5%. Потеря вируса равна 6,5 - 19,4%. Лучшие результаты получены в случае применения ПЭГ с молекулярной массой 6000 дальтон в концентрации 7%. Очистка вируса равна 90,5%, а потеря 6,5%.

Для концентрирования РС-вируса также был использован принцип осаждения вируса высаливанием. Для этой цели использовали 40% сульфат аммония - (NH4)2SO4. До 90,4% вируса осаждается 40% сульфатом аммония при концентрировании в 100 раз. Очистка от балластных белков составляет в этом случае 66,4%.

Метод ультрафильтрации позволяет концентрировать препараты РС-вируса в 10 - 100 раз. Особенностью концентрирования вирусной суспензии на полупроницаемых мембранах является небольшая потеря инфекционной активности вируса от 5,7% при концентрировании в 10 раз до 14,5% - в 100 раз. Однако общее количество белка в концентрате при этом многократно увеличивается, что не позволяет добиться очистки вируса. Так при концентрировании вирусной суспензии по объему в 10 раз количество белка в расчете на инфекционную дозу вируса увеличивается на 13,8%, а при концентрировании в 100 раз на 42,3%.

Наряду с концентрированием вышеописанными методами испытывался также метод осаждения вируса высокоскоростным ультрацентрифугированием. Вирус из предварительно осветленной низкоскоростным центрифугированием культуральной жидкости осаждали при 90000g в течение 1, 2, 3, 4 и 5 часов. Высокоскоростное центрифугирование при 90000g в течение 5 часов позволяет практически полностью без потерь осадить РС-вирус из вирус-содержащей суспензии. Очистка при этом достигает 91,0%

Концентрированную и частично очищенную вируссодержащую суспензию центрифугировали при 90000g в ступенчатом градиенте сахарозы от 15 до 55% с диапазоном изменения концентрации в 10%. По окончании ультрацентрифугирования собирали фракции по 1 мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр комплементсвязывающей активности и титр в ИФА. Пик инфекционной активности приходится на фракции с плотностью 1,20г/см3, соответствующий уровню 45% сахарозы, с выходом вируса до 91,7%. Одновременно происходит очистка на 97,3%. Максимумы активности в ИФА и РСК совпадают с пиком инфекционной активности. Однако, в нижней фракции на дне центрифужной пробирки наблюдалась небольшая активность, как в РСК (1:4), так и в ИФА при полном отсутствии инфекционности данной фракции.

Определение плавучей плотности РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, позволило при очистке вируса использовать центрифугирование на "подушке" сахарозы или иначе на градиентную интерфазу. На дно центрифужной пробирки помещали "подушку" из 55% сахарозы с плотностью 1,25г/см3, затем наслаивали 45% сахарозу с плотностью 1,20г/см3, а сверху - 25% сахарозу с плотностью 1,10г/см3. На такой преформированный ступенчатый градиент наслаивали вирусный препарат. Центрифугирование проводили при 90000g в течение 5 часов. Вирус локализовался в интерфазе между 25% и 55% сахарозы. Посторонние компоненты, с меньшей плавучей плотностью (белки и нуклеиновые кислоты), через зону 45% сахарозы не проходят и остаются в верхней части центрифужной пробирки. При этом достигается не только очистка на 99,6% (0,5мг/мл белка в исходном препарате и 0,01мг/мл - в конечном), но и концентрирование его в 10 раз. Выход вируса составил 99,2%.

Была также определена плавучая плотность вируса в градиенте Фиколла - 400. Для этого очищенный и концентрированный вирус на этапе осаждения ПЭГ М-6000 ресуспендировали в 0,06 М трис-HCl буфере, содержащем 0,1М NaCl и 1мМ ЭДТА (ТНЕ буфер), рН 7,3 и осветляли низкоскоростным центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. Вирус из надосадка осаждали ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов. Осадок ресуспендировали в ТНЕ буфере и наносили на линейный 10% - 40% градиент Фиколла-400. Центрифугирование проводили при 90000g в течение 5 часов.

По окончании центрифугирования собирали фракции по 1мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр комплементсвязывающей активности и активность в непрямом твердофазном ИФА. РС-вирус концентрировался в зоне, соответствующей 37% Фиколла-400 с плотностью 1,19 г/см3, так как здесь был наивысший титр инфекционности вируса, его комплементсвязывающая активность и активность в ИФА.

Фракции, содержащие РС-вирус, объединяли. Степень очистки определяли по отношению титра инфекционности вируса к количеству общего белка. В результате проведенной работы вирус был очищен на 99,5%, потери составили 7%.

Суммируя результаты экпериментов по концентрированию и очистке РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, можно заключить, что осаждение вируса ПЭГ с молекулярной массой 6000 Д в концентрации 7% наиболее оптимальный способ для первоначального концентрирования и очистки, так как при концентрировании в 100 раз позволяет, во-первых, удалить до 90% баласного белка при потере не более 7% инфекционных частиц вируса, во-вторых, работать единовременно с большим объемом вируссодержащей суспензии. Сульфат аммония осаждает вместе с вирусным материалом большое количество баластного белка - очистка не превышает 67%. Ультрафильтрация, несморя на возможность работы с большими объемами вируссодержащего материала и сохранение до 85% инфекционных вирусных частиц, не позволяет добиться одновременной очитки, так как количество баластного белка, в расчете на инфекционную дозу, увеличивается при концентрировании в 100 раз на 42%. Осаждение вируса ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов позволяет практически без потерь осадить вирус на дно центрифужной пробирки при очистке до 91%, но очень трудоемка и позволяет единовременно очищать не более 40 мл вируссодержащей культуральной среды. Тоже самое относится и к ультрацентрифугированию в градиентах сахарозы и Фиколла 400.

Определив условия концентрирования РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, вышеописанными методами, была составлена схема получения концентрированного и очищенного вируса, включающая осаждение вируса из культуральной среды ПЭГ с молекулярной массой 6000 Д в концентрации 7%, переосаждение осадка ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов и осаждением полученного материала на градиентную интерфазу сахарозы.

Таким образом, получены препараты РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, которые использовались для изучения белкового состава вируса, выделения гликопротеинов, обладающих антигенной активностью, с целью синтеза иммуносорбента для выделения анти-РС антител из сывороток естественно переболевших животных.

При определении условий хранения РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, его помещали в условия, при которых, температура соответствовала -500, -200, -70, +40, +200 и +370С.

РС-вирус хранится в условиях температуры от +40 до -500С практически без снижения титра инфекционности в течение 1 месяца. При дальнейшем хранении вируса происходит снижение титра инфекционности на 1 lg ТЦД50/МЛ прaктичecки ежемесячно.

В течение первых суток титр инфекционности РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, снижается с 5,75 до 5,5 lg в условиях температуры +200 и до 4,5 lg - при +З70С. Далее при температуре +370С титр инфекционности снижается до 0 через 4 суток и до 2,25 lg при +200С.

Антиген РС-вируса для определения уровня антител в иммуноферментном анализе.

Для изучения белков, входящих в состав РС-вируса, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию обрабатывали 2% тритоном Х-100 и инкубировали при +200С в течение 60 минут на шейкере. Затем нуклеокапсид и неразрушенные вирусные частицы осаждали центрифугированием при 100 тыс. g в течение четырех часов, а белки из надосадка концентрировали ультрафильтрацией на мембране с пределом исключения 3 кД до концентрации 500 мкг/мл. Далее белки разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ. Тритоном X-I00 отщепляется 9 белков с ММ от 28 до 180 кД.

Вирусные белки, индуцирующие выработку анти-РС антител у восприимчивых к РС-инфекции КРС животных, определялись посредством иммуноблотинга с индикацией белков в непрямом методе ИФА. В качестве анти-РС антисыворотки использовали сыворотку от переболевших животных в разведении I:50 (титр в непрямом ИФА 1:12800). Иммуноглобулины КРС выявляли антивидовым иммунопероксидазным коньюгатом. У переболевших животных вырабатываются антитела к 6 вирусным белкам с ММ от 42 до 180 кД.

Таким образом, в составе РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, выявлено 9 белков, отщепляющихся при обработке тритоном X-I00 с ММ от 28 до 180 кД. Шесть из них с ММ от 42 до 180 кД индуцируют выработку анти-РСВ антител у восприимчивых к РС-инфекции животных.

Концентрированные ультрафильтрацией белки РС-вируса, отщепленные Тритоном Х-100 были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.

Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения анти-РС антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки анти-РС IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000об/мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные анти-РС IgG пришивали к активированной BrCN-Сефарозе 4В в количестве 8мг белка на 1мл геля, согласно инструкции производителя.

После заполнения колонки анти-РС IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1М глицин-HCl и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритон Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение ночи при +40С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1М глицин HCl, pH 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1М NaOH.

Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5 - 50мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения 3кД при давлении 0,3мПа до концентрации белка 0,1мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.

Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины РС-вируса практически без примесей.

Специфичность аффинно очищенных гликопротеинов определяли в иммуноблотинге с анти-РС сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ. Все гликопротеины сохранили свою антигенную активность после аффинной очистки на иммуносорбентах с анти-РС IgG.

Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов РС-вируса из вирус-содержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены РС-вируса.

Очистка и концентрирование вируса парагриппа-3.

Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирус ПГ-3 -108 ТЦД50/см3.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса ПГ-3 применяли методику, разработанную в отделе молекулярной биологии ВНИТИБП (Быкова Н.Н.,1989; Филиппов С.Ю., 2004).

Клетки выращивали на культуральной среде, содержащей половину среды Игла, половину среды 199, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия и 40 единиц гентамицина на литр среды.

После образования монослоя клеток инокулировали вирус ПГ-3, штамм "ЗКСМ" в течение часа при 37°С из расчета 1-2 ТЦД50 на клетку. Репродукцию вируса проводили в бессывороточной среде ГЛАХ, содержащей 40 единиц гентамицина на литр среды.

После проявления 80% ЦПД клетки разрушали однократным замораживанием-оттаиванием и клеточный детрит осаждали центрифугированием.

Надосадочную вирус-содержащую среду исследовали на инфекционную и гемагглютинирующую активность. Вирус, выращенный в перевиваемой культуре ПТ-80, проявлялся в реакции ГА в титрах 1:64 - 1:128, обладал инфекционностью на уровне 6,8 - 8,0 lg ТЦД50/мл. Во всех проведенных экспериментах он по всем показателям превосходил вирус, репродуцированный в монослое клеток легкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК) эмбриона коровы и куриных эмбрионов (ККЭ). Однако величины этих различий от опыта к опыту были не однозначными и варьировали в значительном диапазоне.

В образцах перевиваемой культуры клеток ПТ-80, инфицированных дозой 1-2 ТЦЦ50/клетку, вирусные частицы с типичной для вируса парагриппа-3 морфологией обнаруживаются уже через 24 ч, достигая максимума к 72 ч культивирования.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса ПГ-3 КРС было использовано несколько принципов выделения вируса из вируссодержащих суспензий.

Для концентрирования вируса ПГ-3 КРС были изучены различные условия осаждения его полиэтиленгликолем (ПЭГ). Был испытан ПЭГ с различным молекулярной массой: 3000, 6000 и 20 000 дальтон в концентрации 5,0; 7,5 и 10,0%.

При концентрировании вируса ПГ-3 КРС ПЭГ очистка вируса достигает 88,1 - 97,9%. Потеря вируса равна 36,9 - 84,2%. Лучшие результаты получены в случае применения ПЭГ с молекулярной массой 6000 дальтон.

Для концентрирования вируса ПГ-3 КРС также был использован принцип осаждения вируса высаливанием. Для этой цели использовали 40% сульфат аммония. До 80% вируса ПГ-3 КРС осаждается 40% сульфатом аммония при концентрировании в 10 раз. Очистка от балластных белков составляет в этом случае 91,6%.

Концентрирование вирус-содержащей суспензии проводили с использованием ядерных фильтров, изготовленных в лаборатории ядерных реакций Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна). О кратности концентрирования судили по накоплению фильтрата в мерном сосуде на выходе из ячейки.

В препаратах культурального вируса ПГ-3 КРС до и после концентрирования определяли титр инфекционной активности, общий белок и агглютинирующую активность. Метод ультрафильтрации позволяет концентрировать препараты вируса ПГ-3 КРС в 10 - 50 раз. Особенностью концентрирования вирусной суспензии на ядерных фильтрах является снижение в концентрате количества общего белка. При концентрировании вирусной суспензии по объему в 10 -50 раз количество белка в расчете на инфекционную дозу вируса снижается на 85,0 - 87,4%. При концентрировании препарата в 10 раз потерь вируса не наблюдалось, с повышением кратности концентрирования до 50 раз потеря вируса составляла 20,4%.

Биологическая активность препарата вируса ПГ-3 КРС по мере концентрирования ультрафильтрацией достоверно увеличивается. В РГА с 1:64 в исходной суспензии при 50 - кратном концентрировании до 1:516.

Наряду с концентрированием вируса ПГ-3 КРС вышеописанными методами испытывался также метод осаждения вируса высокоскоростным ультрацентрифугированием. Вирус из предварительно осветленной низкоскоростным центрифугированием культуральной жидкости осаждали при 100 000g в течение 1, 2, 3, 4 и 5 часов. Высокоскоростное центрифугирование позволяет практически полностью без потерь осадить вирус ПГ-3 КРС из вируссодержащей суспензии. Очистка при этом достигает 97,5 - 98,6%.

Для изучения возможности очистки вируса ПГ-3 КРС осаждением в градиенте сахарозы концентрированный и частично очищенный вирус ПГ-3 КРС центрифугировали при 100000g в ступенчатом градиенте сахарозы от 15 до 55% с диапазоном изменения концентрации в 10%. По окончании ультрацентрифугирования собирали фракции по 1мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр гемагглютинирующей активности и титр в ИФА. Пик инфекционной активности приходится на фракции с плотностью 1,20г/см3, соответствующий уровню 45% сахарозы с выходом до 63,08% вируса. Одновременно происходит очистка вируса ПГ-3 КРС на 97,1%.

Определение плавучей плотности вируса ПГ-3 КРС, штамм "ЗКСМ", позволило при очистке вируса использовать центрифугирование на "подушке" сахарозы или иначе на градиентную интерфазу. Вирус локализуется в интерфазе между 45% и 55% сахарозы. Посторонние компоненты с меньшей плавучей плотностью (белки и нуклеиновые кислоты) через зону 45% сахарозы не проходят и остаются в верхней части центрифужной пробирки. При этом достигается не только очистка на 88,4% (3,2мг/мл белка в исходном препарате и 1,9мг/мл - в конечном), но и концентрирование его в 6 – 7 раз. Выход вируса составил 55,4%.

Таким образом, ультрацентрифугирование вируса ПГ-3 КРС в градиенте плотности 15% - 55% и на "подушке" сахарозы позволяет получить высокоочищенный и концентрированный препарат вируса ПГ-3 КРС.

Была также определена плавучая плотность вируса ПГ-3 КРС в линейном 10 - 40% градиенте Фиколл - 400. Вирус ПГ-3 КРС концентрировался в двух зонах, соответствующих 19% и 29% Фиколла-400 с плотностью 1,065 и 1,098 г/см3, соответственно, так как в этих зонах отмечены наивысшие титры инфекционности вируса, его гемагглютинирующей активности и активности в ИФА.

Фракции, содержащие вирус ПГ-3 КРС, объединяли. Степень очистки определяли по титру инфекционности вируса на количество общего белка. В результате проведенной работы вирус был очищен в 156 раз, потери составили 49%.

Таким образом, в линейном 10% - 40% градиенте плотности Фиколла-400 вирус ПГ-3 КРС штамм "ЗКСМ", располагался в двух зонах и имел плавучую плотность 1,065 и 1,098г/см3, соответственно.

Анализ результатов электронно-микроскопических исследований и сопоставление их с вирусологическими данными, показывает, что высокие и стабильные показатели биологической активности вируса, репродуцированного в перевиваемой культуре ПТ-80, обусловлены прохождением вирионами полного цикла морфогенеза и образованием ультраструктур (пепломеров), ответственных за гемагглютинирующую, инфекционную и в значительной мере антителообразующую активности.

В образцах перевиваемой культуры ПТ-80, инфицированных дозой 1-2 ТЦД50/клетку, вирусные частицы с типичной для вируса парагриппа-3 морфологией обнаруживаются уже через 24 ч, достигая максимума к 72 ч культивирования. По мере снижения заражающей дозы первые вирусные частицы обнаруживаются в пробах, полученных спустя 72 и даже 144 ч после инфицирования.

Следует отметить, что количество вирионов с пепломерами, являющимися морфологическими структурами, содержащими гемагглютинин и нейраминидазу, возрастает по мере снижения дозы заражения и удлинения сроков культивирования.

Таким образом, получены препараты вируса ПГ-3, которые использовались для изучения белков вируса, отщепляющихся при обработке последнего тритоном Х-100, обладающих антигенной активностью, с целью синтеза иммуносорбента для аффинного выделения анти-ПГ-3 антител из сывороток естественно переболевших животных.

 

Очистка  и концентрирование вируса  диареи-болезни слизистых.

Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирус ВД-БС – с инфекционностью на уровне 107 ТЦД50/см3.

Исходным материалом для получения антигена служила суспензия вируса ВД-БС  в перевиваемой культуре клеток ПТ-80.

Для концентрирования ВД-БС вирус-содержащий материал подвергали трехкратному замораживанию и оттаиванию с последующим осветлением его путем центрифугирования. Полученный супернатант собирали и подвергали дальнейшей обработке  полиэтиленгликолем (ПЭГ, М.М. 6000).

Концентрированный вирусный препарат очищали методом ультрацентрифугирования (125000 g в течение 1,5 часов) в линейном (30-45%) градиенте плотности сахарозы.

На каждом этапе контролировали специфическую активность вируса.

Результаты исследований показали, что после осаждения вирус концентрировался  с сохранением своих антигенных свойств. При очистке в линейном градиенте плотности сахарозы вирус располагался в компактной опалесцирующей зоне, из которой его отбирали, и использовали в дальнейшей работе. Конечная концентрация белка в вирусном антигене составляла 0,8-1,0 мг/мл в зависимости от концентрации исходного препарата. Биологическая активность препарата вируса ВД-БС по мере очистки и концентрирования достоверно увеличивалась. В РИД с 1:16 в исходной суспензии до 1:64 при 50-кратном концентрировании, в РНГА -с 1:16 до 1:64.

Результаты проведенных исследований показали, что данный метод получения высококонцентрированного и очищенного препарата вируса ВД-БС позволяет получать его в препаративных количествах и впоследствии эффективно использовать в качестве антигена.

Альтернативно активный антиген ВД-БС получали обработкой зараженных клеток Тритоном Х-100 или  1-оctyl-beta-D-glucopyranoside (OGP).

Очистка и концентрирование вируса аденовирусной инфекции. Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирус – с инфекционностью на уровне 106 ТЦД50/см3.

Вирус АВИ, штамм "Bovine 10" (cеротип 1), с титром инфекционности 4,0-4,5 lg ТЦД 50/мл репродуцировали в перевиваемой культуре клеток почки теленка - Т-1.

Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.

Концентрирование вируса АВИ проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.

В работе по очистке вируса АВИ от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400.

Получение и характеристика положительного и отрицательного контролей для тест-системы

Известно, что ключевыми реагентами любой системы иммунологического анализа являются вирус-специфические антитела, специфичность и аффинность которых, во многом предопределяет основные аналитические параметры всех иммунохимических методов, и, прежде всего ИФА

Низкое содержание специфических антител в неочищенной сыворотке (20-30% от общего количества) снижает ее эффективность в одних тестах и может приводить к повышению фоновых значений в других.

Наиболее эффективным, позволяющим существенно повысить чистоту препарата, является метод аффинной хроматографии, с помощью которого выделяют антитела только к определенному  антигену. Идеальным методом очистки антител является иммуноаффиннная хроматография. Иммуноаффинные колонки можно готовить после активации перйодатом  натрия обычно используемых матриц, таких как агароза (сефароза) или целлюлоза.

Получение антител иммуносорбционным методом  является наиболее универсальным, так как антитела могут быть получены к любому антигену. Другое достоинство метода - высокая степень избирательности, которая связана с индивидуальной специфичностью  антител, а значит и возможность получения индивидуальных антигенов. Главное его преимущество - одноступенчатость процессов, гомогенность получаемого препарата и практически отсутствие потерь.

Для получения положительных анти-ИРТ, анти-ПГ-3, анти-ВД-БС, анти-РС, анти-АВ контрольных сывороток и отрицательного контроля использовали метод аффинной хроматографии.

Таким образом, были получены контрольные положительные и отрицательные  образцы, представляющие собой препараты гомогенных иммуноглобулинов, содержащих и не содержащих вирус-специфические антитела, соответственно.

Определение допустимых величин оптической плотности  (ОП) контрольных сывороток.

Для получения достоверных результатов при тестировании сывороток по одному разведению необходимо было определить допустимые величины оптической плотности контрольных сывороток. Для исследования брали 17 повторностей проб положительной и отрицательной контрольных сывороток в разведении 1:400. Получили, что значения оптической плотности контрольных сывороток в диапазоне от 0,949 до 1,309 для положительного контроля и от 0,102 до 0,142 для отрицательного контроля являются оптимальными.(Табл.4)

Таблица 4

Допустимые значения ОП контрольных сывороток.

показатели

Положительный контроль (Р)

Отрицательный

Контроль (N)

Разница между контролями

(Р- N)

Среднее значение стандартного отклонения+&

1,129+0,18

0,122+0,02

1,006+0,135

Доверительный интервал

0,949-1,309

0,102-0,142

0,871-1,141

Если значения оптической плотности контрольных сывороток выходят за рамки допустимых значений, то результаты реакции будут считаться сомнительными, и пробы должны быть исследованы заново.

Оптимизация условий проведения ИФА

Концентрацию антигенов, рабочие разведения контролей и конъюгата определяли в предварительных экспериментах методом "шахматного" титрования, делая последовательные разведения компонентов по горизонтальным и вертикальным рядам одной микропанели.

 

  Таблица 5

Результаты "шахматного" титрования антигена вируса ИРТ и контролей в

ИФА

Концен­трация анти­гена

(мг/мл)

ОП 450 положительного/отрицательного контролей, взятых в разведении:

1:50

1:100

1:200

1:400

1:800

1: 1600

0,5

1,36/0,15

1,23/0,15

1,11/0,12

0,99/0,12

0,78/0,11

0,62/0,11

0,25

1,19/0,16

1,05/0,13

0,90/0,12

0,75/0,12

0,60/0,12

0,45/0,11

0,125

1,11/0,15

1,01/0,13

0,84/0,13

0,66/0,11

0,50/0,11

0,36/0,11

0,06

1,01/0,15

0,99/0,13

0,82/0,13

0,64/0,11

0,50/0,11

0,34/0,11

Примечание: в данном эксперименте использован конъюгат в разведении 1:10000.

Оптимальной концентрацией антигена и рабочими разведениями компонентов иммуноферментной тест-системы считали их конечные значения, обеспечивающие в лунках с положительным контролем ОП 450 > 1,0, а в лунках с отрицательным - < 0,2. Из данных, приведенных в табл.5, видно, что данным условиям отвечают следующие параметры реакции: концентрация антигена ИРТ- 0,06 мг/мл / разведения контролей - 1:50 или концентрация антигена - 0,125 мг/мл / разведения контролей - 1:100 и т.д. Оптимальным временем для адсорбции антигена была 18-ти часовая его инкубация при +4°С.

Аналогично устанавливали оптимальные рабочие концентрации  антигенов вирусов ПГ-3, ВД-БС, РС  и АВ инфекций - 1,0, 1,5, 0,75 мкг/ см3 и 1,25 мкг/ см3  соответственно.

В этих же экспериментах для повышения чувствительности и специфичности тест-системы подбирали буфер для сорбции антигена и антител, блокирующий белок и время инкубации иммунологических реагентов на твердой фазе. Исследования проводили эмпирически в системе непрямого варианта твердофазного ИФА, сравнивая различные варианты буферных смесей, временные и температурные показатели. Для предотвращения неспецифической реакции проводили подбор блокирующего белка, испытывая БСА, желатину, казеин, овальбумин, фетальную сыворотку крупного рогатого скота и сыворотку крови лошади. Во всех опытах в качестве субстратной смеси использовали раствор ТМБ, а в качестве раствора, останавливающего реакцию (стоп-раствор) - 0,1 М Н2SО4. Реакцию оценивали по показателям ОП450 в лунках с положительным и отрицательным контролями и референтными сыворотками крови.

Полученные результаты показали, что оптимальными буферами являются ФСБТ (для промывки лунок), ФСБ и БРК (для разведения антигена и конъюгата соответственно). В качестве раствора, блокирующего несвязавшие белок участки пластика, был выбран ФСБТ, содержащий 5% сыворотки крови лошади. Этот же раствор использовали для разведения испытуемых и контрольных проб. При соблюдении этих условий и использовании специфических реагентов в следующих концентрациях (разведениях):  антигена вируса ИРТ  - 0,06 мг/мл, контролей - 1:50 и конъюгата - 1:10000 при 60 минутной инкубации на каждом этапе, неспецифическое взаимодействие компонентов полностью исключалось, а показатели ОП 450 в лунках с положительными и отрицательными пробами были > 1,0 и < 0,2 соответственно.

ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ РАЗРАБОТАННОЙ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

Следующим этапом нашей работы было определение показателей качества разработанной тест-системы для выявления специфических антител к респираторным вирусам, в сравнении с методами аналогичной направленности. В качестве референтных методов были использованы реакция нейтрализация и РНГА.

В исследованиях использовали сыворотки крови иммунных и неиммунных животных различного пола и возраста, полученные из 15  хозяйств РФ. Кроме того, апробировали тест-систему для исследования проб молозива и молока, полученных от коров из этих же хозяйств. Чувствительность и специфичность тест-системы оценивали согласно стандартам МЭБ (Мапиаl of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004.)

Заявляемая тест-система была испытана при сравнительном титровании исследуемых сывороток методами РН, РНГА и ИФА для каждой вирусной инфекции соответственно. (Таблицы 6-11)

Установлено, что в 86 % случаях положительные результаты были получены во всех предложенных методах. Все отрицательные сыворотки в ИФА были отрицательны и в РН, РНГА. 

Таблица 6

Сравнительная оценка титров антител к РС-вирусу КРС в РНГА, РН и ИФА.

количество

сывороток

титр в ИФА

титр в РН *

титр в РНГА

41

-

-

-

6

200

-

-

83

400

2-4

4-8

56

400-800

4-16

16-64

27

800-1600

16-32

32-256

17

3200-6400

32-64

128-512

6

12800

64-128

1024

Примечание *: представлены данные обратные значениям титров РН, РНГА и ИФА.

Таблица 7.

Сравнительная оценка титров антител к вирусу ИРТ в РН и ИФА.

Общее количество

сывороток

Количество сывороток, положитель-ных в РН

Титр в РН *

Количество

сывороток, положитель-ных в ИФА

Титр в ИФА

28

14

2-4

28

200

12

12

2-4

12

800-1600

18

18

8-16

18

800-1600

22

22

32-64

22

3200-6400

27

27

128-256

27

12800-25600

17

17

>256

17

>25600

*: представлены данные обратные значениям титров РН и ИФА.

Таблица 8.

Сравнительная оценка титров антител к вирусу ВД-БС в РН, РНГА и ИФА

количество

сывороток

Титр в ИФА*

Титр в РН *

Титр в РНГА*

77

-

-

-

16

200

-

-

183

400

2-4

4-8

156

400-800

4-16

16-64

99

800-1600

16-32

32-256

17

3200-6400

32-64

128-512

*: представлены данные обратные значениям титров РН, РНГА и ИФА.

Таблица 9.

Сравнительная оценка титров антител к вирусу ПГ-3 в РН, РНГА и ИФА

количество

сывороток

Титр в ИФА

Титр в РН *

Титр в РНГА

41

-

-

-

6

200

-

-

83

400

2-4

4-8

56

400-800

4-16

16-64

27

800-1600

16-32

32-256

17

3200-6400

32-64

128-512

6

12800

64-128

1024

*: представлены данные обратные значениям титров РН, РНГА и ИФА.

Таблица 10.

Сравнительная оценка титров антител к аденовирусной инфекции (АВИ) в РН, РНГА и ИФА

количество

сывороток

титр в ИФА

титр в РН *

титр в РНГА

41

-

-

-

6

200

-

-

73

400

2-4

4-8

54

400-800

4-16

16-64

28

800-1600

16-32

32-256

37

3200-6400

32-64

128-512

6

12800

64-128

1024

*: представлены данные обратные значениям титров РН и ИФА.

  Таблица 11

Сравнительная оценка результатов в ИФА и РН.

Результат РН, количество проб: положительных  отрицательных (n=195) (n=117)

Результаты в разрабо- положительных

танной тест-системе,  отрицательных количество проб:

192

7

3

110

Результаты, приведенные в таблице 11,  свидетельствуют о том,  что:

диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к РН составила 192:195х 100 %=98,46%; диагностическая специфичноcть 110:117 x 100 % = 94,02%; совпадаемость результатов двух методов 302:312 x 100 % = 96,8% .

Анализ полученных данных свидетельствует о положительной корреляции результатов по определению сывороточных антител, полученных с помощью разработанного ИФА и РН (г=0,9, Р < 0,05), совпадаемость результатов двух методов составила 96,8%. Однако при исследовании сывороток крови, полученных от заведомо негативных (клинически здоровые контрольные животные и рожденные от них телята из благополучных  хозяйств, n=58) или заведомо позитивных (подопытные вакцинированные животные, n=36) коров, наблюдалась 100%-я совпадаемость результатов ИФА и РН. В первом случае, все результаты исследований были отрицательными, во втором - положительными.

Таким образом, проведенные исследования показали, что разработанная нами иммуноферментная тест-система сопоставима по специфичности и чувствительности с РН и вследствие дополнительных своих преимуществ (экспрессность и простота проведения анализа, наличие инструментального учета реакции и возможность автоматизации всех ее этапов, стабильность при хранении всех необходимых реагентов и воспроизводимость результатов) может быть использована в качестве основного скринирующего теста при массовом обследовании животных.

Определение позитивно-негативного порога тест-системы.

Для этого были проведены исследования по определению закономерностей распределения значений ОП 450 и коэффициента связывания (Ксв.) вирус-отрицательных и положительных сывороток, т.е. порогового значения (cut off" или позитивно-негативный порог - ПНП), разграничивающего положительную и отрицательную реакции.

В первом эксперименте было использовано 89 сывороток крови коров, не содержащих, по данным РН, антител к антигенам вирусов респираторных вирусных инфекций и 52 сыворотки крови вакцинированных животных с различным уровнем специфических антител в РН. Отрицательные и положительные сыворотки исследовали в трех разведениях 1:50, 1:100, 1:200; каждая сыворотка крови, взятая в определенном разведении, проверялась в трех параллельных лунках.

Перед учетом реакции по формуле, приведенной ниже, высчитывали среднее значение ОП 450 для каждой испытуемой пробы. Относительное содержание вирус-специфических антител в положительных пробах определяли по: а) титру антител, т.е. по конечному разведению испытуемой пробы, превышающему ОП 450 отрицательного контроля в 2,1 раза и б) коэффициенту связывания (Ксв.) отражающему содержание антител в испытуемой пробе по отношению к содержанию антител в положительном контроле. Математически это выражается следующей формулой:

Ксв =(ОП450ИПср-ОП450К-ср) x 100

  (ОП450К+ср-ОП450К-ср)

где: ОП450 ИПср, ОП450 К- и ОП450К+ - средние арифметические значения оптической плотности в лунках с испытуемой пробой, отрицательным и положительным контролями соответственно.

Проведенные исследования показали, что для получения достоверных результатов в разработанной тест-системе, испытуемые пробы сывороток крови КРС необходимо исследовать в разведении аналогичном контролям, т.е. 1:50.

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что при значении ОП 450 положительного и отрицательного контролей 1,5-1,8 и 0,14-0,2 соответственно, величина ОП 450 всех заведомо отрицательных проб была в пределах 0,05-0,21, при этом значения Ксв. составляли от -4 до 8. В заведомо положительных сыворотках крови значение ОП 450 превышало 0,45, а значения Ксв. были от 21 до 196.

При изучении зависимости значения Ксв. от титра вирус-специфических антител в положительных пробах была установлена положительная коррелятивная связь между двумя показателями (г= 0,75, Р < 0,05).

Далее были проведены расширенные исследования по определению закономерности распределения значений Ксв отрицательных (n=114) и положительных (n=147) по данным РН сывороток. Постановку ИФА и учет полученных результатов проводили аналогично предыдущему эксперименту.

Анализ результатов проведенных экспериментов позволил заключить следующее. В большинстве случаев (98,1%) значение Ксв. отрицательных проб не превышало 20. Из них Ксв. < 0 был в 65,9% сывороток, в 32,5% случаев данный показатель был в пределах от 0 до 20. Только в 2 пробах (1,7%) значение Ксв. находилось в пределах 20-40. В большинстве вирус-специфических сыворотках крови (97,4%) величина Ксв. составляла более 20.

При этом в 69% проб Ксв. был более 60, в 16,3% случаев он колебался от 40 до 60 и в 12,2% - был в пределах 20 - 40. В 4 пробах (2,5%) значение Ксв. было ниже 20.

Таким образом, был сделан общий вывод о том, что анализируемые сыворотки, имеющие Ксв. менее 20, с большой вероятностью (0,98) не содержат вирус-специфических антител. В вирус-специфических сыворотках в большинстве случаев (98%) значение ОП 450 превышало аналогичный показатель отрицательного контроля в 2,1 раза, а Ксв. был более 20. Исходя из этого, величина ПНП или cut off для Ксв., являющаяся критерием дифференциации положительных и отрицательных проб и при котором минимально количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов, составляет 20. В дальнейшем все пробы, значение Ксв. для которых было меньше ПНП, считали отрицательными, а пробы со значением Ксв. равным или превышающем этот показатель - положительными.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана универсальная методика постановки ИФА.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ к  респираторным ВИРУСАМ в МОЛОЗИВЕ ИММУННЫХ КОРОВ.

Поскольку пассивный лактогенный иммунитет является важнейшим механизмом в предотвращении инфекционных респираторных вирусных инфекций новорожденных телят, то очевидно, что его эффективная стимуляция составляет основу стратегического подхода к их иммунопрофилактике. Поэтому, при использовании вакцинных препаратов для профилактики инфекционных болезней  респираторного тракта животных, первостепенное значение имеет определение уровня специфических антител в секрете молочной железы иммунизированных коров. Это имеет прогностическое значение в ответе на вопрос о возможности формирования лактогенного иммунитета у новорожденных телят.

Нами проведены исследования по оценке эффективности разработанной тест-системы на основе ИФА по определению уровня антител к респираторным вирусам в молозиве иммунных коров в сравнительном аспекте с РН.

В опыте использованы пробы молозива, полученные от 51 вакцинированных коров из 3-х хозяйств РФ. Перед постановкой РН и ИФА испытуемые пробы прогревали в водяной бане при 56°С в течение 30 мин, затем добавляли равный объем физиологического раствора и замораживали при -20°С. После оттаивания полученные пробы центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин, отбирали водную фракцию и использовали ее для исследования. Постановку РН и ИФА осуществляли, как описано в разделе "Материалы и методы", полученные результаты приведены в таблице 12.

Таблица 12.

Результат РН,

количество проб:

положитель- отрицательных ных  (n=48)  (n=3)

Результаты в разрабо-  положительных

тайной тест-системе,  отрицательных количество проб:

45

1

3

2

Анализ результатов исследований по выявлению вирус-специфических антител в испытуемых пробах свидетельствует о том, что в данном эксперименте совпадаемость результатов ИФА и РН составила 92,16%. Кроме того, установлена положительная корреляция между результатами, полученными с использованием данных методов (г = 0,82, Р < 0,05).

При этом распределение проб, давших положительный результат в ИФА (в пробах Ксв. составлял 20 - 40, в 20-ти - 40 -60 и в 15-ти был более 60).

По результатам опыта был сделан вывод о том, что уровень вирус-специфических антител в секретах молочной железы коров, также как и срок циркуляции материнских антител в организме телят могут служить дополнительными критериями оценки эффективности применяемых вакцинных препаратов.

КОНТРОЛЬ ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ

Одним из важных критериев эффективности использования иммуноферментных тест-систем  является воспроизводимость результатов определения, которая проверяется как в рамках одной микропанели (набора ИФА), так и между разными наборами ИФА одной серии и наборами разных серий. В целом воспроизводимость результатов лабораторных исследований оценивается как степень разброса результатов, получаемых данным методом.

Мерой контроля воспроизводимости является значение коэффициента вариации (К.В.), который отражает зависимость между разбросом и среднеарифметическим значением и, согласно утвержденному Методическому руководству (Р.А.Тигранян, Н.Ф.Калита, А.С.Роганов, 1994).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что не установлено различий в интерпретации результатов, полученных в рамках одной серии ИФА-набора и при использовании наборов разных серий.

Величина К.В. значений Ксв. при исследовании положительных проб (n=5) наборами разных серий не превышала 6,76%, а при исследовании отрицательных (n=11) - 4,76%, что соответствует рекомендуемым параметрам и не превышает 10%. При этом коэффициент корреляции результатов при исследовании положительных проб составил 0,9, а при исследовании отрицательных - 0,97.

Анализ полученных данных, позволил нам сделать общее заключение о том, что, разработанная тест-система можно  применяться для массовых скрининговых исследований в благополучных хозяйствах и осуществлять, таким образом, мониторинг респираторных инфекции, а также оценивать эффективность вакцин  в тех хозяйствах, которые проводят целенаправленную специфическую профилактику. Кроме того, данный набор может служить дополнительным средством исследований в системе комплексной диагностики.

2.2.4.Получение протеина А

Иммуноглобулины класса G выделяли из цельной сыворотки крови  аффинной хроматографией на протеин А-Сефарозе 4В в один этап.

Для глубинного  культивирования штамма золотистого стафилококка с целью отработки оптимальных условий для получения биологически активного протеина А использовали биореактор АК-210. Культуру стафилококка выращивали  при температуре 37 оС, скорости перемешивания  100об/мин., рН поддерживали на уровне  7,2, автоматически добавляя 1  N NaOH.

Для культивирования микроорганизма  в биореакторе использовали питательную среду на основе перевара Хоттингера и  мясо-пептонный бульон (МПБ). Посевную дозу определяли по оптическому стандарту мутности  Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Клетки золотистого стафилококка инактивировали  прогреванием при 60оС 30 мин. Динамику роста s.aureus изучали с помощью спектрометрического анализа  с интервалом 1 час. Аэрацию осуществляли начиная со 2 часа культивирования до окончания процесса  с расходом воздуха 1,4 л/мин. Биологическую активность протеина  А определяли в реакции  прямого твердофазного ИФА.

Фаза логарифмического роста начиналась с 2 ч и заканчивалась к 5 ч культивирования. К 6 ч культура стафилококка вступала в стационарную фазу роста.

Протеин А получали из инактивированной и обработанной ультразвуком микробной массы золотистого стафилококка  на колонках, заполненных аффинным сорбентом - Ig G крупного рогатого скота, иммобилизованным  на сефарозе 4В.  Так как штамм А 676 продуцирует значительную часть белка А питательную среду, то и осветленную центрифугированием, инактивированную прогреванием  культуральную среду после выращивания стафилококка в биореакторе, обработанную ультразвуком использовали для проведения аффинной  хроматографии.

Белоксодержащий материал пропускали через колонки, заполненные иммуносорбентом, размером 3,0х15,0 см со скоростью 5-10 мл/ч см3 при +4 оС в режиме замкнутого реактора. Сорбцию белка проверяли методом прямого ИФА. Колонку промывали двадцатикратным объемом фосфатно-буферного раствора 0,15 М, содержащим 0,15 М NaCl, рН 7,2. Затем элюировали ацетатным буферным раствором рН 3,0. Фракции немедленно нейтрализовали 0,5 н NaOH и исследовали в ИФА на биологическую активность протеина А. Затем белок А диализовали против дистиллированной воды (2 суток) и лиофилизировали на установке КС-30. Препарат выдерживали  2 суток при среднем остаточном давлении 50-70 мкм рт. ст. и температуре конденсатора от -55 до -65 оС и затем в течение 6-8 часов при температуре +24 оС.

Полученный препарат белка А проверяли на гомогенность по результатам электрофореза в 7% ПААГ  в трис-глициновом буфере рН 8,9 по методике Davis J.B.  на приборе фирмы  "Reanal".

Антитела из гипериммунных антивидовых сывороток крови выделяли методом аффинной хроматографии. Специфические сорбенты получали ковалентной иммобилизацией иммуноглобулинов класса G или протеина А на активированных глутаровым альдегидом смешанном полиакриламид-агарозном геле АсА 34 (фирмы "ЛБК", Швеция) и акрилексе П-300 (фирмы "Реанал", ВНР) по методике, описанной Т.Ternynck и S.Avrameas , на BrGN -сефарозе 4 В (фирмы "Фармация", Швеция и BrCN -агарозе отечественного производства - в соответствии с рекомендациями фирмы "Фармация".

Хроматографически очищенный белок А золотистого стафилококка, конъюгированный с ферментами (пероксидазой), микроносителями, сорбентами использовали в "Инструкции по изготовлению и контролю глобулина флуоресцирующего для диагностики бешенства животных", утвержденной 22.01.2006 г. директором ВНИТИБП и в "Инструкции по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".

3. ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована схема получения активной антирабической сыворотки. Применение эффективных современных отечественных полиэлектролитов в качестве адъювантов и иммуномодуляторов (полиоксидония и вегетана), при сравнении с применяемым ранее, способом  получения антирабической сыворотки,  выявило следующие преимущества: повышение активации иммунокомпетентных клеток, увеличения антителообразования у животных-продуцентов и повышение выхода и специфической активности  антирабической сыворотки, сокращение сроков иммунизации с 90 до 62 дней,  за счет исключения этапа подготовки животных к иммунизации и применения одновременных инъекций антигена и полиэлектролитов, и уменьшения расхода антигенного материала.

2. Клонирование ДНК штамма ВГНКИ-6 серогруппы Pomona позволило создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащую 67 фрагментов бактериального генома лептоспир. Получен банк препаратов нуклеиновых кислот лептоспир, содержащий 42 препарата ДНК референтных штаммов, 6-производственных, а также семь образцов ДНК штаммов серогруппы Pomona, изолированных от больных сельскохозяйственных животных и человека в различных регионах страны. Разработан метод выделения высокоочишенных препаратов ДНК из биомасcы лептоспир.

3. В результате реакций ДНК-ДНК гибридизации полученной клонотеки с нуклеиновыми кислотами лептоспир была выделена рекомбинантная плазмида pLp 41 размером 3 880 пар нуклеотидов, содержащая фрагмент ДНК L. interrogans серовара pomona, нуклеотидная последовательность которого пригодна для использования в качестве видоспецифического гибридизационного зонда. Установлено, что плазмидный зонд гибридизуются только с ДНК лептоспир вида L. interrogans, и не гибридизуются с препартами суммарных нуклеиновых кислот сапрофитных лептоспир, иерсиний, кишечной палочки, бруцелл, микоплазм и других бактерий.

4. В хромосомных ДНК сероваров tarassovi, sejroe, pomona, kabura, polonica, whitcombi, grippotyphosa, panama, castellonis, sarmin, szwajizak, bratislava, djatzi, louisiana, сynopteri присутствуют области, гомологичные фрагменту ДНК L. pomona в составе рекомбинартной плазмиды pLp 41. Показано, что ДНК-зонд pLp 41 позволяет выявлять образцы ДНК штаммов лептоспир, представляющих основные серогруппы Pomona, Tarassovi, Sejroe, Grippotyphosa, которые вызывают заболевание у свиней и крупного рогатого скота на территории России и других стран СНГ.

5.  Показана возможность использования фрагмента ДНК L. pomona. из рекомбинантиой плазмиды pLp 41 в качестве ДНК-зонда для дифференциации производственных  штаммов  лептоспир  в  реакции блот-гибридизации. Установлено, что в хромосоме производственных штаммов лептоспир присутствуют различные по молекулярной массе области, несущие участки ДНК,  гомологичные фрагменту ДНК

L. роmопа, входящего в состав плазмиды pLp 41.

6. Определены молекулярно-генетические характеристики указанного фрагмента, обеспечивающие его идентификацию. При этом установлено, что клонированный фрагмент ДНК имеет размер 1 200 пар нуклеотидов, ограниченный сайтами рестриктазы EcoR I, a также не содержит сайты следующих рестриктаз: Pst I, Sma I, Xba I и EcoR V. Плазмида содержит ген bla, детерминирующий синтез бетта-лактомазы, что обеспечивает устойчивость к ампициллину штамма Е. coli, несущего данную плазмиду. Плазмида мультикопийна и неконъюгативна.

7. Разработана комплексная иммуноферментная тест-система для выявления антител к антигенам респираторных вирусов в биологических жидкостях организма животных и оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови КРС, взятых в одном разведении (1:50).

8. Определен критерий дифференциации положительных и отрицательных результатов ИФА (Ксв.) равный 20.

9.  При исследовании сывороток крови КРС установлено, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к реакции нейтрализации составила 98,46%, специфичность - 94,02%. Результаты ИФА и РН совпадали в 96,8% случаев, коэффициент корреляции результатов составил 0,9; Р < 0,05. Разработанная иммуноферментная комплексная тест-система сопоставима по специфичности и чувствительности с РН и вследствие дополнительных своих преимуществ (экспрессность и простота проведения анализа, наличие инструментального учета реакции и возможность автоматизации всех ее этапов, стабильность при хранении всех необходимых реагентов и воспроизводимость результатов) может быть использована в качестве основного скринирующего теста при массовом обследовании животных.

10. При исследовании молозива иммунных коров совпадение  результатов двух методов  (ИФА и РН) зарегистрировано в 92,16% случаев, при г = 0,82, Р < 0,05.

11. Показана возможность одноэтапной препаративной очистки антигенов РС-вируса и ПГ-3 из вирус-содержащих суспензий с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-РС IgG Сефарозе 4В и анти-ПГ-3 IgG Cефарозе 4В соответственно.

12. При изучении состава белков вируса ПГ-3 КРС, штамма "3КСМ", полученных при обработке вирус-содержащей суспензии тритоном Х-100 выявлено 8 структурных белков с ММ от 14 до 180 кД. По результатам иммуноблотинга все восемь белков индуцировали выработку анти-ПГ-3 антител в организме восприимчивых к ПГ-3 животных.

13. При изучении состава белков РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, полученных при обработке вирус-содержащей суспензии Тритоном Х-100, выявлено 9 структурных белков с ММ от 28 до 180 кД. По результатам иммуноблотинга 6 белков с ММ от 42 до 180 кД индуцируют выработку анти-РС антител в организме восприимчивых к РС-инфекции животных.

14. Усовершенствованы способы получения и очистки специфических антител при промышленной технологии производства диагностикумов для практического применения.

15. Изучены оптимальные условия промышленного культивирования и инактивации штамма Staphilococcus  aureus  с целью получения биологически активного протеина А.

16. В результате проведенной работы, разработан одноэтапный метод получения высокоактивных специфических положительных и отрицательных референс-сывороток (заявки  на изобретение №200813290 и №200813287).

17. Использование современных автоматизированных биореакторов и методов оптимизации технологического процесса позволило при суспензионном и псевдосуспензионном культивировании клеток  ПТ-80 увеличить получение их концентрации до 3 млн. кл в мл.

18. Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирусы ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, АВ и РС, обладающих достаточной инфекционной активностью.

4. Практические предложения.

На основании проведенных исследований предлагаются для практики:

1. Получена рекомбинантная плаамида pLp 41, используемая в качестве источника молекулярного зонда, разработанного для идентификации патогенных лептоспир и дифференциации производственных штаммов лептоспир.

2. Разработаны "Методические рекомендации по идентификации производственных штаммов и дифференциации Leptospira interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", утвержденные научно-методической комиссией ВНИиТИБП от 17.09.93, протокол N2; Методические рекомендации по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (РС), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на методической комиссии ВНИТИБП и на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1, утвержденные 18.03.2007 г. академиком РАСХН А.М. Смирновым.

3.  Полученные результаты внесены в "Инструкцию по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", выпускаемых ВНИТИБП по Госконтракту с Департаментом ветеринарии МСХ РФ; в  "Инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".

5.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Тюрина И.Н., Артюшин С.К., Белоусов В.И., Быкова Н.Н. ДНК-зонд для идентификации и дифференциации лептоспир//Ветеринария.-1993.-№8.-С.53.
  2. Матвеева И.Н.  Тест-система ИФА для дифференциальной диагностики  респираторных болезней крупного рогатого скота //Ветеринария и кормление.- 2006. №3.- С. 14-15.
  3. Матвеева И.Н.  Тест-система ИФА для серологического мониторинга заболеваний крупного рогатого скота// Ветеринария и кормление.-2006. №5.- С. 26-27.

4. Матвеева И.Н. Иммуноферментный анализ в диагностике вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС) крупного рогатого скота Ветеринария.-2007. №6 .-С.54-57 .

5. Матвеева И.Н. ИФА для определения уровня антител к вирусу ВД-БС//Ветеринария.-2008.№ 4 .-С. 54-56.

6. Матвеева И.Н. Получение антигена респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота для использования в ИФА // Ветеринария.- 2007.№ 11.-С. 49-51.

7. Матвеева И.Н. Оздоровление стад от массовых респираторных заболеваний //Ветеринария.-2008.-№ 12 .-С. 54.

8. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В., Филиппов С.Ю., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Тест-система ИФА для определения антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота //Ветеринария и кормление.-2006.  № 6.-С.28-29.

9. Матвеева И.Н. Разработка компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антител к вирусу диареи-болезни слизистых оболочек в сыворотке крови, молоке крупного рогатого скота.// Ветеринария и кормление.- 2007. № 2- С.24-25.

Другие публикации

1. Быкова Н.Н., Белоусов В.И., Лукина В.А., Самуйленко А.Я., Тюрина  И.Н. // Сравнительная оценка методов определения вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота при разработке тест-системы ИФА. // Научные основы технологии промышленного производства  ветеринарных  биологических препаратов /Мат.докладов четвертой Всесоюз. конф.-М.- 23-25 апреля 1991.-C.112

2. Тюрина И.Н., Быкова Н.Н., Лукина В.А., Белоусов В.И., Самуйленко А.Я. Сравнительная оценка методов очистки вируса парагриппа-З крупного рогатого скота при разработке диагностического ИФА-набора. Актуал.вопр.вет.вирусологии. -Владимир, 1990.-С. 63-64 

3. Белоусов В.И.; Тюрина И.Н. Дифференциация штаммов ВГНКИ-1 и Moskva-5 возбудителя лептоспироза серогруппы Grippotyphosa на субсеровариантном уровне с помощью ДНК-зондов в реакции блот-гибридизации. - Науч.основы технологии пром. пр-ва вет. биол. препаратов. -Щелково, 1996.-С. 132

4. Белоусов В.И.; Тюрина И.Н. Использование твин-альбуминовой  питательной среды при производстве вакцины против лептоспироза животных. - Науч.основы технологии пром. пр-ва вет. биол. препаратов. -Щелково, 1996.-С. 116-117

5. Филиппов С.Ю., Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П. Изучение репродукции вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в первично-трипсинизированной культуре клеток почки теленка // Сб. докладов междунар. конф.  молодых ученых "Научные основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково- 5-6 декабря 2002. - С. 36.

6. Филиппов С.Ю., Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П.Очистка и концентрирование вируса ПГ-3 крупного рогатого скота// Сб. докладов междунар. конф.  молодых ученых "Научные основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково- 5-6 декабря 2002 - С. 39.

7. Матвеева И.Н., Кузнецова С.В., Лунин В.Г., Воронина О.Л., Кузнецов Д.П. Репродукция вируса диареи в культуре клеток ПЭК.//Сб. докладов междунар. конф.  молодых ученых "Научные основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково- 5-6 декабря 2002 - С. 42.

8. Матвеева И.Н., Кузнецова С.В., Лунин В.Г., Воронина О.Л., Кузнецов Д.П. Очистка вируса диареи крупного рогатого скота.//Сб. докладов междунар. конф.  молодых ученых "Научные основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково- 5-6 декабря 2002 - С. 45.

9. Меньшенин В.В., Яковлев Т.Е., Самуйленко А.Я., Шкварук Т.Я., Быкова Н.Н., Тюрина И.Н. //  Получение антивидового конъюгата анти-IgG утки, меченого ферментом пероксидазой, для использования в иммуноферментном анализе (ИФА)./ Научные основы технологии промышленного производства  ветеринарных  биологических препаратов /Мат. докладов четвертой Всесоюз. конф.-М.- 23-25 апреля 1991.-С.141.

10. Матвеева И.Н., Гринь С.А., Кузнецов Д.П., Мальгин Ю.А., Мальгина Т.А. Получение биологически активного протеина А из золотистого стафилококка //Материалы междунар.научно-практич.конференции, посвященной 35-летию института  26-27 мая 2005 г. "Научные основы технологии промышленного производства  ветеринарных  биологических препаратов"- Щелково.-С. 423.

11. Матвеева И.Н., Гринь С.А., Кузнецов Д.П., Мальгин Ю.А., Мальгина Т.А. Выделение биологически активного протеина А для использования в биологических исследованиях //Материалы междунар.научно-практич.конференции, посвященной 35-летию института  26-27 мая 2005 г."Научные основы технологии промышленного производства  ветеринарных  биологических препаратов ".- Щелково.-С.421.

12. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Гринь С.А. Промышленный способ получения  биологически активного протеина А  //Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г. "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных".-Москва "ИзографЪ" .-С.275

13. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А. Изучение репродукции респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота// Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г. "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных".-Москва "ИзографЪ".-2006.- С.277

14. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А.  Разработка тест-системы для детекции антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в ИФА //Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г. "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных".-Москва "ИзографЪ" .-2006.-С.279

15. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А. Очистка и концентрирование респираторно-синцитиального  вируса крупного рогатого скота //Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г. "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных".-Москва "ИзографЪ".-2006.-С.282

16. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В., Гринь С.А. Разработка тест-системы для детекции антител к вирусу парагриппа-3 крупного рогатого скота в ИФА //Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г. "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных".-Москва "ИзографЪ" .-2006.-С.284

17. Матвеева И.Н., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Филиппов С.Ю., Кузнецов Д.П.  Очистка и концентрирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота// Материалы Междунар научно- производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А., 22-23 июня 2006 года, "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных" Воронеж, "Научная книга".-2006 г.- С. 327-330.

18. Матвеева И.Н. Кузнецов Д.П. Промышленный способ получения биологически активного протеина А//  Материалы Междунар. научно- производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А., 22-23 июня 2006 года, "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных".- Воронеж, "Научная книга".-2006 г.- С. 330.-332.

19. Матвеева И.Н., Кузнецова С.В., Филиппов С.Ю., Кузнецов Д.П. Разработка тест-системы для детекции антител к вирусу диареи крупного рогатого скота в ИФА //  Материалы Междунар. научно- производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А., 22-23 июня 2006 года, "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных".- Воронеж, "Научная книга".-2006 г.- С. 333-337.

20. Матвеева И.Н.,  Кузнецов С.В.,  Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Филиппов С.Ю., Кузнецов Д.П. Разработка тест-системы для детекции антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в ИФА //  Материалы Междунар. научно- производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А., 22-23 июня 2006 года, "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных".- Воронеж, "Научная книга".-2006 г.- С. 337-342.

21.  Матвеева И.Н., Кочиш Т.Ю.,  Кочиш И.И., Филиппов С.Ю., Кузнецов Д.П. Изучение репродукции респираторно-синцитиального  вируса  крупного рогатого скота  //  Материалы Междунар. научно- производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А., 22-23 июня 2006 года, "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных".- Воронеж, "Научная книга".-2006 г.- С. 342-345.

22. Матвеева И.Н. Результаты серологического мониторинга вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота  в животноводческих хозяйствах//Материалы Междунар. научно- практической  конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова,15 декабря 2006 года, "Научные основы производства  ветеринарных  биологических препаратов ".- Щелково.-С.86-87.

23. Матвеева И.Н., Филиппов С.Ю. Оценка эффективности иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота//Материалы Междунар. научно- практической  конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова,15 декабря 2006 года, "Научные основы производства  ветеринарных  биологических препаратов ".- Щелково.-С.88-93.

24. Матвеева И.Н., Кузнецов С.В., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Филиппов С.Ю., Кузнецов Д.П. Набор реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в ИФА // Материалы Междунар. научно- практической  конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова, 15 декабря 2006 года, "Научные основы производства  ветеринарных  биологических препаратов ".- Щелково.-С.97-100.

25. Матвеева И.Н. Биологические микрочипы -это диагностика будущего// Материалы Междунар. научно- практической  конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова,15 декабря 2006 года, "Научные основы производства  ветеринарных  биологических препаратов ".- Щелково.-С.126-128.

26. Кочиш И.И., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Филиппов С.Ю., Чулков А.К., Кржижановская Е.В. Разработка тест-системы ИФА для диагностики респираторно-синцитиальной инфекции Ветеринарная медицина Научно-практическая конференция "Актуальные проблемы молекулярной диагностики ветеринарной медицины и биологии" 22-25 мая 2007 г - Феодосия, Крым. Выпуск, 88 с.116-119

27. Кочиш И.И., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Филиппов С.Ю., Чулков А.К., Кржижановская Е.В. Тест-система ИФА для диагностики парагриппа-3  Ветеринарная медицина Научно-практическая конференция "Актуальные проблемы молекулярной диагностики ветеринарной медицины и биологии" 22-25 мая 2007 г - Феодосия, Крым, выпуск 88.- с.120-122.

28. Cамуйленко А.Я., Рубан Е.А., Еремец В.И., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Клюкина В.И., Люлькова Л.С., Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В., Павленко В.С., Ломакина Т.А., Лихашерстова С.В. Современные биологические процессы и иммунобиологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов Материалы Междунар. научно- практической  конференции, 20-21 декабря 2007 года, "Научные основы производства  ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково.-С.6-10.

29. Матвеева И.Н., Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Изучение репродукции вируса аденовирусной инфекции крупного рогатого скота Материалы Междунар. научно- практической  конференции, 20-21 декабря 2007 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково.-С.126-129.

30. Матвеева И.Н., Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Чулков А.К., Крыжановская Е.В. Концентрирование и очистка вируса аденовирусной инфекции крупного рогатого скота //Материалы Междунар. научно- практической конференции, 20-21 декабря 2007 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов".- Щелково.-С.129-132.

31. Матвеева И.Н., Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Чулков А.К., Крыжановская Е.В. Разработка компонентов тест-системы ИФА для определения уровня антител к возбудителю аденовирусной инфекции крупного рогатого скота //Материалы Междунар. научно- практической конференции, 20-21 декабря 2007 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково.-С.132-137.

32. Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Кржижановская Е.В. Чулков А.К. Разработка тест-системы ИФА для изучения иммунологической активности вакцин против пастереллеза животных определения //Материалы Междунар. научно- практической конференции, 20-21 декабря 2007 года, "Научные основы производства  ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково.-С.234-238.

33. Матвеева И.Н. Разработка тест-системы иммуноферментного анализа для выявления специфических антител к вирусу аденовирусной инфекции крупного рогатого скота по одному разведению сывороток// Материалы Всероссийской научной конференции, 20-21 ноября 2008 года, "Диагностика, лечение  и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология".- 2008.-Киров.-С.125-127

34. Матвеев И.Н., Еремец Н.К. Усовершенствование  методов получения специфических антител при производстве биологических препаратов// Материалы Всероссийской научной конференции, 20-21 ноября 2008 года, "Диагностика, лечение  и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология".- Киров.-С. 127-128.

35. Тюрина И.Н., Артюшин С.К., Белоусов В.И., Быкова Н.Н. Идентификация и дифференциация производственных штаммов лептоспир методом ДНК-ДНК гибридизации// Профилактика и меры борьбы с инфекц. заболеваниями животных: -Тез. докл. научно-практ. конф. 21-22 апреля 1993 г.-М., 1993.

  36. Artushin S., Belousov V., Bikova N., Turina I. Development of DNK-hybridization probe for identification of Leptospira interrogans serovar pomona//VII European and IX USSR leptospirosis research conference Moskov, February 20-22.-M., 1991.-P.53

37. Тюрина И.Н., Артюшин С.К., Белоусов В.И., Быкова Н.Н.  // Молекулярное клонирование ДНК Leptospira Pomona// Науч. основы технологии пром. пр-ва вет. биол. препаратов: Тез. Докл. всесоюз. Науч. конф. 23-25 апреля 1991 г. – М., 1991.-С. 106






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.