WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Селищева Алла Анатольевна

ПРИНЦИПЫ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ФОРМ  ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

СОЛЮБИЛИЗАЦИЕЙ ЛИПОСОМАМИ

03.00.23- Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

Москва -2007

       Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и  в лаборатории физико-химии биомембран биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор,

академик  РАМН Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор,

член-корр. РАМН Северин Сергей Евгеньевич

доктор химических наук, профессор  Левашов Андрей Вадимович

доктор химических наук, доцент Чупин Владимир Викторович

Ведущая организация:

ГУ Всероссийский научно-исследовательский  институт  лекарственных и ароматических растений

Защита диссертации состоится «22» октября 2007г в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского,  д.86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ: http//vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан «_____»_____________2007г

  Ученый секретарь Диссертационного Совета,

  кандидат химических наук,

  старший научный сотрудник

  __________________ Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время с лечением туберкулеза во всем мире сложилась столь неблагополучная ситуация, что Всемирная Организация Здравоохранения  объявила в 2003г туберкулез глобальной угрозой жизни человека. Невысокая эффективность лечения туберкулеза обусловлена многими причинами, в том числе  токсичностью многих противотуберкулезных препаратов (ПТП). Особенно выражены токсические эффекты у препарата первого ряда - рифампицина, которые вынуждают больных отказываться от его  приема.

Для решения проблемы лечения туберкулеза необходимы новые подходы, которые должны включать как поиск новых препаратов, так и разработку новых менее токсичных лекарственных форм ранее применяемых ПТП.

В связи с тем, что микобактерия туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis)), вызывающая это заболевание, размножается в основном внутри клеток легочной ткани (макрофагов), представлялось целесообразным использовать такие лекарственные формы, которые были бы способны  направленно транспортировать ПТП внутрь этих клеток. Эта задача может быть решена с помощью липосом,  которые,  как известно,  фагоцитируются макрофагами.

Наряду с этим представляется необходимым поиск новых препаратов, обладающих антибактериальной активностью, но нетоксичных для  человека. В качестве примера можно привести белки, секретируемые  непатогенными  бактериями (бактериоцины). Однако эти водорастворимые  белки не проникают через мембрану макрофагов и для их внутриклеточной доставки можно использовать  липосомы.

Одним из положительных свойств  липосом в качестве транспортирующей системы является  фармакологическая активность самих фосфолипидов, из которых сформированы липосомы. Известны несколько препаратов на основе фосфолипидов для лечения гепатита, цирроза, токсических поражений печени:  «Эссенциале» (Германия), отечественный препарат «Фосфоглиф», препарат «Липин» (Украина) и др. В литературе имеются отдельные сообщения о противовоспалительном и антиэксудативном действии фосфолипидов. Перечисленные выше данные позволяют прогнозировать значительные преимущества липосомальных форм ПТП по сравнению с таблетированными, в связи с чем разработка таких форм представляется весьма актуальной. Она позволит увеличить растворимость ПТП, усилить их проникновение в макрофаги и возможно, окажет дополнительные эффекты, например, снизит  токсичность или  увеличит время пребывания  препарата в организме.

Наряду с этим следует учесть, что в легких человека и животных  липосомы, содержащие ПТП, целенаправленно взаимодействуют как с инфицированными макрофагами, так и с микобактериями. Известно, что клеточная стенка последних содержит различные фосфолипазы, в том числе фосфолипазу С  и фосфолипазу А2. В связи с этим с целью прогнозирования возможных механизмов деградации компонентов липосом при их введении в организм представлялось  необходимым  оценить свойства липосом после их обработки различными фосфолипазами.

Основной целью  работы являлась разработка научных основ создания липосомальных форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений как способа оптимизации их свойств для повышения эффективности фармакологического действия. Другой целью была оценка антибактериальной активности липосомальной формы рифампицина  в отношении  клеток M. tuberculosis  in vitro  и in vivo.

Научная новизна

1. Впервые обнаружено, что введение в состав липосом  метаболита фосфолипидов - 1,2-диацилглицерина (ДАГ), образующегося при действии фосфолипазы С, приводит к возникновению новых свойств модельных мембран: слиянию однослойных везикул (ОВ); появлению у их мембраны проницаемости для ионов кальция;

2. Установлено, что механизм этого явления сводится к нарушению бислойной структуры фосфолипидов в мембране и формированию внутримембранных частиц;

3. На примере биологической мембраны (мембраны синаптосом)  впервые обнаружено, что ДАГ и образующаяся из него арахидоновая кислота могут участвовать в формировании  специфических  кальциевых каналов проницаемости;

4. Установлено, что ОВ способны  активировать кислородный взрыв в альвеолярных макрофагах человека  и что ДАГ  и арахидоновая кислота усиливают этот эффект.

5. Изучено взаимодействие гидрофильных белков – основного панкреатического ингибитора трипсина и соевого ингибитора типа Баумана-Бирк, обладающих противовоспалительным и противоопухолевым действием, с мультиламеллярными везикулами различного состава. Показано, что в липосомах белки достигают гидрофобной области мембраны, но тем не менее проявляют ингибирующую активность. Уменьшение размеров частиц комплексов под действием ионного детергента приводит к возрастанию активности  ингибиторов.

6. Впервые установлено, что бактериоцины, ингибирующие рост бактерий M. tuberculosis  в культуральной среде, в липосомальной форме способны подавлять рост M. tuberculosis  в макрофагах и увеличивать продолжительность жизни животных, зараженных M. tuberculosis. В водном растворе они не обладают такими свойствами.

7. Впервые показано различие в механизме взаимодействия двух родственных антибиотиков – рифампицина и рифабутина- с модельными мембранами, поскольку при физиологических значениях рН среды рифампицин  является анионом, а рифабутин - катионом.

8. Доказана возможность снижения терапевтических доз рифампицина в липосомальной форме по сравнению с раствором при лечении экспериментального туберкулеза.

Практическая значимость

1.Определены дозы  липосом из фосфолипидов, которые обладают ранозаживляющим действием  и активируют макрофаги человека, что  было учтено при разработке  липосомальной формы рифампицина.

2. Показано, что один из бактериоцинов,  подавляющий рост M. tuberculosis в культуральной среде, в составе липосом способен оказывать тот же эффект и на инфицированные макрофаги, не проявляя в то же время токсичности по отношению к ним. Получен положительный результат при применении липосомальной формы бактериоцина для лечения мышей, зараженных M. tuberculosis. Он свидетельствует о перспективности создания нового  лекарственного препарата для лечения  туберкулеза.

3. Доказана высокая эффективность действия липосомальной формы рифампицина, введенной ингаляционно, при лечении мышей, зараженных M. tuberculosis. Это  позволило снизить дозу рифампицина и тем самым нивелировать его токсические эффекты.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Введение ДАГ и арахидоновой кислоты  в состав модельных мембран приводит к изменению их структурной организации, в результате чего

    • происходит уменьшение стабильности ОВ  и индукция их слияния;
    • в мембранах появляется проницаемость для  ионов кальция.

2. В клетках и тканях введение этих соединений приводит к усилению эффекта липосом:

    • усиливается ток кальция внутрь нервных окончаний;
    • увеличивается  интенсивность кислородного взрыва фагоцитов;
    • ускоряется заживление операционной раны кожи  морских свинок.

3. Бактериоцины в липосомальной форме ингибируют рост M. tuberculosis в макрофагах мышей и на 30% увеличивают продолжительность жизни экспериментальных животных, зараженных смертельной дозой M. tuberculosis

4. Характер  взаимодействия рифампицина и рифабутина с отрицательно заряженными фосфолипидами  определяется  содержанием  их ионизационных форм  при физиологических значениях рН среды.

5. Показано, что разработанная нами липосомальная форма рифампицина с повышенным содержанием его  в водной фазе существенно снижает число клеток  M. tuberculosis в легких и селезенке  зараженных мышей.

Апробация работы. Основные результаты  работы были доложены на  У1 Конференции по биохимии липидов (С.Петербург,1994), У Национальном конгрессе болезней органов дыхания (Москва,1995), 2-ом Съезде Биохимического общества РАН (Москва,1997), Международной Конференции «Биокатализ-98: фундаментальные и прикладные исследования» (Пущино,1998), International  Symposium on  Natural Origin  Substances in Drug Formulation. Bejing, China, 1998;У-ой Международной конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва,1999), Symposion on Lipids  and Surfactant  Dispersed Systems, Moscow, 1999; 27th International  Symposium on Controlled Release  of Bioactive  Materials,  Paris, France. 2000; XII Int. BRG Workshop on Bioencapsulation, Vitoria,  Spain, 2004; 2-, 3-, 4- и 5ом  Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2004, 2005, 2006, 2007 гг); 7-th Eur. Symp. on Saliva, Egmond aan Zee, Netherlands, 2005; 33-th Ann. Meeting Controll. Rel. Society. Vienna, Austria, 2006.

Обьем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 345 страницах машинописного текста, содержит 112 рисунков, 54 таблиц и состоит из введения, литературного обзора, изложения и обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (300 наименований).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 1 монография, 1 методическое пособие, 41 статья в журналах, в том числе 7 в зарубежной печати, 20 тезисов на российских и международных конференциях.

Работа выполнена на  кафедре биотехнологии МИТХТ им. М.В.Ломоносова и  в лаборатории физико-химии биомембран Биофака МГУ им. М.В. Ломоносова, а также при участии  ряда других организаций (ЦНИИ туберкулеза РАМН, Института биохимии им. А.Н. Баха РАН)

Представленная работа является частью проектов по фундаментальным исследованиям и выполнена при поддержке гранта № 01-04-48466 Российского Фонда Фундаментальных исследований, гранта №3-21 НТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки» по направлению  «Новейшие методы биоинженерии», грантов президента по поддержке ведущих научных  школ № НШ-2329.4 и № РИ-112.001.609.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

  1. СВОЙСТВА ЛИПОСОМ,  СОДЕРЖАЩИХ  ПРОДУКТЫ МЕТАБОЛИЗМА ФОСФОЛИПИДОВ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА ФАГОЦИТЫ И ТКАНЬ.

Как отмечалось во введении, в настоящей работе липосомы выбраны в качестве системы доставки ПТП к микобактериям, находящимся в культуральной среде и в инфицированных макрофагах. При воздействии фосфолипаз микобактерий на липосомы свойства последних могут существенно измениться. Задачей начальных этапов исследования являлось изучение стабильности липосом и проницаемости  для ионов кальция мембран липосом разного липидного состава при инкубации с фосфолипазами. В работе использовали следующие фосфолипиды: фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилинозит (ФИ), фосфатидилглицерин (ФГ), фосфатидную кислоту (ФК), выделенные из сои, и кардиолипин (КЛ) из сердца быка; фосфолипазы С из Вас. сereus.  различной специфичности и  фосфолипазу А2 из яда змеи. 

1.1. Гидролиз ФХ, ФЭ и их смесей фосфолипазой С  в присутствии дезоксихолата и в составе липосом. Для накопления ДАГ в модельных и природных мембранах использовали их обработку фосфолипазой С из Вас. сereus различной специфичности. Для определения оптимальных условий гидролиза фосфолипидов использовали ОВ (система фосфолипиды/вода) и смешанные мицеллы (система детергент/фосфолипиды/вода). В качестве детергента использовали дезоксихолат натрия (ДОХ).

При изучении зависимости скорости гидролиза ФЛ разных классов (ФХ, смеси ФХ:ФЭ) от концентрации  фосфолипида под действием фосфолипазы С  установили, что в системе фосфолипиды/ вода эта зависимость имеет линейный характер (рис.1а).

  а)

  б)

Рис.1. Скорость гидролиза фосфолипидов  фосфолипазой С  а) в составе ОВ: 1) ФХ:ФЭ (2:1), 2) ФЭ , 3) ФХ; б)  в составе смешанных мицелл при определенном соотношении ДОХ:фосфолипид: 1) ФХ (ДОХ:ФХ 1:7); 2) ФХ (ДОХ:ФХ 2:8 ); 3)  ФЭ (ДОХ:ФЭ 1:7).

В системе ДОХ/ФЛ/вода изучали  зависимость скорости гидролиза ФЛ от их концентрации при различных соотношениях между ФЛ и ДОХ. В этих условиях при увеличении концентрации субстрата (ФЛ) увеличивалась концентрация ДОХ. При этом, как показали результаты измерения методом динамического светорассеяния, размер частиц из фосфолипидов и детергента  уменьшался, а зависимость от концентрации субстрата имела необычный характер (рис.1б).

Проведенные эксперименты показали, что для получения предсказуемых результатов можно использовать только систему  фосфолипиды/вода.

1.2. Стабильность и проницаемость для ионов кальция мембран ОВ, обработанных фосфолипазой С и фосфолипазой А2. На следующем этапе исследований изучили два свойства модельных мембран, содержащих продукт метаболизма ФИ - 1,2-ДАГ или жирные кислоты: стабильность  и проницаемость для ионов кальция. ОВ разного липидного состава  инкубировали с фосфолипазой С  или фосфолипазой А2 и регистрировали во времени оба этих параметра, а также процент гидролиза фосфолипидов. Кроме того, параллельно  были исследованы изменения структуры мембран мультиламеллярных везикул методом 31Р-ЯМР спектроскопии.

Процесс слияния липосом контролировался  методом флуоресценции. При смешивании содержимого водных фаз двух популяций липосом, одна из которых была нагружена ионами тербия, другая – дипиколиновой кислотой, происходило образование комплекса тербий – дипиколиновая кислота, что сопровождалось ростом интенсивности флуоресценции при 550 нм

Регистрация входа кальция во внутреннюю среду липосом проводилась по изменению характера спектра поглощения адсорбционного металлохромного индикатора арсеназо III по модифицированной нами методике.

а) б)

Рис.2.  Влияние фосфолипазы С  на: а)  стабильность ОВ разного липидного состава, изученную методом  флуоресценции и б) проницаемость мембран для ионов кальция, изученную методом спектрофотометрии ( см.пояснения в тексте).

Анализ липидного состава мембран при незначительных степенях гидролиза фосфолипидов проводили методом тонкослойной радиохроматографии с использованием 1пальмитоил-2-(9,10-3Н)пальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина или  определяя содержание фосфорсодержащих соединений методом Дитмера после экстракции их хлороформом из инкубационной среды.

При действии фосфолипазы А2 интенсивность флуоресценции снижалась, что связано с нарушением целостности мембраны и выходом содержимого липосом во внешнюю среду (данные не приводятся). Аналогичное уменьшение интенсивности флуоресценции происходило в том случае, когда обработке ферментом подвергался только один тип липосом, содержащих Тb3+. Степень гидролиза фосфолипидов после 10 мин инкубации не превышала 1,5—2% в случае фосфолипазы С и 3% в случае фосфолипазы А2.

На рис. 2 представлены результаты обработки липосом, состоящих из различных фосфолипидов, неспецифической фосфолипазой С. Во всех случаях наблюдается как рост F/F0, обусловленный слиянием липосом, так и увеличение оптической плотности на спектре арсеназо. Такой же результат был получен и при инкубации липосом, сформированных из смеси ФИ:ФХ (1:5) фосфолипазой С, специфической к ФИ (данные не приведены).

Как следует из рис.2, скорость обоих процессов увеличивалась при введении в исходную смесь «небислойных» (ФЭ) или отрицательно заряженных  фосфолипидов (КЛ). Скорость  была максимальной  в случае суммарного липидного экстракта синаптосом головного мозга крысы, который  содержит все классы перечисленных фосфолипидов.

Рис.3. Спектры 31Р-ЯМР суспензии мультиламеллярных везикул из ФХ до (а) и после обработки фосфолипазой С: содержание 1,2-ДАГ в мембране 5 (б), 7,5 (в) и 10% (г)

Для изучения  структуры модельной мембраны, обработанной фосфолипазой С, методом 31Р-ЯМР-спектроскопии использовали мультиламеллярные везикулы (МЛВ). В спектрах 31Р-ЯМР такой структуре соответствует сигнал с анизотропией химического сдвига около –50 м.д. и плечом в сторону слабого поля (рис.3). МЛВ из  фосфолипидов, образующих стабильные бислои (ФХ, ФИ), обрабатывались фосфолипазой С до степени гидролиза 10%, далее из среды инкубации удалялись водорастворимые продукты гидролиза - низкомолекулярные фосфаты. На спектре смеси фосфолипидов и гидрофобных продуктов гидролиза (ДАГ) отмечали следующее изменение формы  спектра: на фоне широкого анизотропного сигнала появлялся узкий изотропный сигнал, которому соответствует популяция фосфолипидов, двигающихся изотропно. Данные электронной микроскопии позволяют утверждать, что к этой популяции фосфолипидов относятся молекулы, формирующие внутримембранные частицы липидной природы.

1.3. Проницаемость для ионов кальция природных мембран (мембран синаптосом), индуцированная  фосфолипазами С и А2. Задачей следующего этапа исследований явилось установление принципиальной возможности участия гидрофобных метаболитов фосфолипидов (ДАГ и жирных кислот) в регуляции транспорта Са2+ через биологическую мембрану. В качестве исследуемой системы были выбраны изолированные нервные окончания нейронов головного мозга  мышей (синаптосомы), которые сохраняют многие характеристики исходной клетки: содержат медиаторы, имеют рецепторы на внешней поверхности. и потенциал-чувствительные Са2+-каналы. Это означает, что транспорт Са2+ внутрь синаптосом происходит по градиенту концентраций и регулируется потенциалом на мембране: в условиях покоя (среда, содержащая 145 мМ NaCl, 5 мМ КСl) он незначителен,  в условиях, когда трансмембранный потенциал мембран синаптосом близок к нулю (в среде 5 мМ NaCl, 145 мМ КСl ) поток Са2+ внутрь синаптосом вырастает в 2-3 раза (табл.1).

Синаптосомы, выделенные из мозга  крыс, инкубировались различное время в среде, содержащей 145 мМ NaCl, 5 мМ КСl, а также Са2+  и 45Са2+. После окончания инкубации аликвота инкубационной среды фильтровалась через поликарбонатные фильтры с размером пор 0,4 мкм, фильтр переносился в сцинциляцитонный флакон и определялось число имульсов за 10 мин.

При добавлении в среду инкубации фосфолипазы С (1 мкг/мл), не обладающей специфичностью к разным классам фосфолипидов, наблюдается некоторое снижение накопления ионов кальция. Напротив, специфичная к ФИ фосфолипаза С ускоряет Са2+ - транспорт в  синаптосомы. При этом накопление кальция синаптосомами не превышает уровень поступления ионов кальция при ее деполяризации, и эффект специфичной фосфолипазы С снимается верапамилом.

В опытах, приведенных выше, были использованы экзогенные фосфолипазы С микробного происхождения. Представлялось интересным сопоставить их действие с влиянием на кальциевый транспорт в синаптосомы одной из фракций гомогената головного мозга крыс, обладающей фосфолипазной активностью только по отношению к ФИ. При инкубации синаптосом с лиофилизатом надмикросомальной фракции головного мозга был получен эффект, аналогичный влиянию фосфолипазы С, специфичной к ФИ: в среде инкубации, содержащей 145 мМ NaCl, 5 мМ КСl, уровень накопления кальция увеличивался почти вдвое и блокировался верапамилом.

Полученные результаты говорят об участии в формировании каналов проницаемости  только той фракции ДАГ, которая образуется при метаболизме ФИ, а также о том, что речь идет о специфических каналах проницаемости для ионов кальция, которые блокируются верапамилом. Возможно, участие метаболитов липидов в формировании белковых каналов проницаемости происходит за счет  изменения структуры белковой молекулы- каналоформера благодаря кратковременному образованию внутримембранных частиц  в липидном бислое, окружающем белки.

Добавление арахидоновой кислоты (1·10-4 М) к суспензии синаптосом оказывало такой же эффект, как и специфичная фосфолипаза С: накопление Са2+ в среде покоя увеличивалось. В меньших концентрациях арахидоновая кислота была неэффективна. Верапамил ингибировал  и действие  арахидоновой кислоты.

Табл.1. Влияние продуктов метаболизма и различных фосфолипаз  на накопление кальция синаптосомами

Добавки в среду инкубации

нмоль Са2+ на 1 мг белка синаптосом

КОНТРОЛЬНЫЕ  ПРОБЫ

1

Инкубационная среда 1 (145 мМ NaCl, 5 мМ КСl)

  4,8±0,6

2

Инкубационная среда 2 (5 Мм NaCl, 145 мМ КСl)

15,0±1,0

3

Верапамил (0,5 мМ) в инкубационной среде 2

2,4±0,3

ОПЫТНЫЕ ПРОБЫ  (инкубационная среда 1 )

4

Фосфолипаза С, специфичная к ФИ (1,2 мкг/мл)

11,6±0,6

5

То же + верапамил (0,5 мМ)

2,6±0,4

6

Фосфолипаза С, специфичная к ФИ (0,1 мкг/мл)

5,2±0,3

7

Неспецифичная фосфолипаза  С (1,0 мкг/мл)

3,9±0,2

8

Неспецифичная фосфолипаза  С,  (0,1 мкг/мл)

4,0±0,3

9

Арахидоновая кислота (0,1 мкг/мл )

13,6±0,6

10

То же + верапамил (0,5 мМ)

2,6±0,4

11

Линолевая кислота (0,1 мкг/мл)

3,2±0,3

12

Олеиновая кислота (0,1 мг/мл)

3,9±0,2

13

Фосфолипаза  А2  (0,1 мкг/мл)

2,0±0,3

Выше на примере ОВ из фосфолипидов было показано, что  жирные кислоты в больших концентрациях способны индуцировать неспецифическую проницаемость мембран для Са2+. Чтобы выяснить, насколько специфично действие арахидоновой кислоты на природные мембраны, в качестве контроля изучали действие двух других жирных кислот (линолевой и олеиновой) и фосфолипазы А2. Согласно данным, приведенным в табл.1, обе кислоты в концентрации 10-4 М понижали поступление Са2+ в синаптосомы. Инкубация синаптосом с  фосфолипазой А2 также сопровождалась небольшим уменьшением поступления ионов кальция в синаптосомы аналогично тому, как это наблюдалось для неспецифичной фосфолипазы С. Эффект фосфолипазы А2 оказался обратимым:  при добавлении в среду инкубации БСА, способного связывать жирные кислоты, содержание Са2+ повышалось до нормального уровня. Анализ состава фосфолипидов, экстрагированных из синаптосом по  методу Блай и Дайера показал, что под действием выбранных концентраций фосфолипаз С и А2 гидролизуется 25-31% фосфолипидов.

Известно, что модификация биологических  мембран добавлением жирных кислот или обработкой  фосфолипазами сопровождается изменением ряда физико-химических характеристик мембран, и нельзя исключить того, что она может привести к нарушению нативности  мембраны в целом. Для проверки этого предположения был измерен уровень лактатдегидрогеназы в препарате синаптосом, обработанных фосфолипазами, и не было обнаружено существенных различий между контролем и опытом, что говорит об отсутствии серьезных нарушений в структуре синаптосомальной мембраны под действием фосфолипаз.

Ранее, во введении упоминалось о фармакологическом действии фосфолипидов. Полученные  результаты позволяют сделать предположение о повышенной эффективности действия везикул, содержащих ДАГ и арахидоновую кислоту, на клетки и ткани. Для подтверждения этого предположения на следующем этапе работы исследовали действие  везикул, содержащих эти соединения, на фагоциты человека и рану кожи экспериментальных животных.

1.4. Влияние ДАГ-содержащих липосом на фагоциты человека и рану кожи экспериментальных животных.  Задачей на данном этапе исследований явилось сравнение эффективности действия  липосом  из ФХ, содержащих и не содержащих ДАГ и арахидоновую кислоту,  на клеточном и тканевом уровнях (на альвеолярные макрофаги и на заживление ран на коже морских свинок  после операции).

1.4.1. Влияние липосом на развитие кислородного взрыва в альвеолярных макрофагах человека. Образование в альвеолярных макрофагах первичных метаболитов активированного кислорода под действием липосом различного состава регистрировали методом хемилюминесценции (ХМ) люминола. Использовали липосомы из ФХ, содержащие и не содержащие ДАГ и арахидоновую кислоту. Для сравнения в липосомы вводили эфиры жирных кислот - незаряженные гидрофобные соединения, структурно близкие ДАГ. АМ выделяли из бронхоальвеолярного лаважа  здоровых людей.

В контроле, т.е. в отсутствие каких-либо активаторов интенсивность ХМ  люминола  при инкубации с альвеолярными макрофагами равнялась 300 мV, увеличиваясь при добавлении липосом из ФХ в течение 1-2 мин. Как следует из рис.4., липосомы из ФХ и смеси ФХ и эфиров жирных кислот индуцировали кислородный взрыв в макрофагах с одинаковой эффективностью и этот эффект зависел от их концентрации.

Для оценки величины действия липосом их эффект был сопоставлен с действием на ХМ  активатора протеинкиназы С  миристинового эфира форбола ( МЭФ) (0.1 мкМ ) и ионофора ионов кальция  А 23187 (10 мкМ). Из  табл. 2 видно, что оба соединения усиливали интенсивность ХМ люминола в полтора раза, также как и липосомы в наиболее эффективной концентрации. Но достижение постоянного значения ХМ происходило более медленно по сравнению с липосомами  -  в течение 3-4 мин.

Рис.4. Интенсивность ХМ люминола при инкубации с АМ при добавлении различных концентраций липосом следующего состава : 1-липосомы из ФХ; 2- липосомы из ФХ и ЭЖК;  3- липосомы из ФХ и ДАГ; 4 - липосомы из ФХ и АК.

Введение арахидоновой кислоты в липосомы из ФХ усиливало эффект липосом (см.табл.2 и рис.4), причем достижение максимального значения ХМ происходило значительно быстрее (0,5 мин), чем в случае липосом из ФХ. Следует отметить, что действующая концентрация арахидоновой кислоты ниже, чем ККМ данного соединения, поэтому ее активирующее действие в данном случае не может быть связано с известным детергентным эффектом жирных кислот.

       Аналогичное действие оказывало введение в состав липосом ДАГ (см.рис.4 и табл. 2). Как следует из приведенных данных, все три параметра - величина активирующего эффекта липосом из ФХ, содержащих ДАГ, зависимость их  действия  от концентрации и скорость достижения максимального значения ХМ -  аналогичны данным по липосомам, содержащим в качестве второго компонента арахидоновую кислоту.

       Поглощение липосом клетками является многостадийным процессом, на первой стадии которого липосомы адсорбируются на поверхности макрофагов. Далее происходит процесс слияния липосом с клеточной мембраной и активация  ФИ-цикла, в ходе которого образуются вторичные мессенджеры, ДАГ и арахидоновая кислота. Оба эти соединения способны активировать протеинкиназу С, что делает в свою очередь возможным активацию НАДФН-оксидазы. Этот фермент запускает цепь переноса электрона, в конце которой электрон присоединяется к молекуле кислорода, образуя супероксидный радикал и другие первичные метаболиты активированного кислорода. Одним из доказательств в пользу данной схемы является тот факт,  что  МЭФ, который как известно способен активировать протеинкиназу С, также  индуцирует кислородный взрыв в АМ.

Табл. 2. Зависимость интенсивности хемилюминесценции (ХМ) люминола при  инкубации  с альвеолярными макрофагами в  отсутствие и присутствии различных  активаторов.

Активаторы

Характеристики хемилюминисценции

Название

Концент-рация, мкМ

Интенсив-ность.ХМ,

(мв)

Время дости-жения макс. ХМ  (мин)

1. Контроль

300 ± 20

0

2. +МЭФ

0,001

0,1

-

460 ±30

-

3-4 .

3.+ ионофор  А 23187

10

455± 35

2-3 .

4.+ липосомы из ФХ

270

455± 25

1-2 .

5.+липосомы из ФХ + 1,2-ДАГ

270 + 5,4

630 ± 136

0,5 .

6.+ липосомы из ФХ + ЭЖК

270 + 5,4

455 ± 58

1-2 .

7. +липосомы из ФК + АК

270 + 5,4

700 ±72

0,1-0,5 .

Исходя из вышеописанного процесса, усиление кислородного взрыва  при  введении в мембрану отдельных метаболитов фосфолипидов  может быть обусловлено участием их как в  процессе слияния липосом с клеткой, так и активацией протеинкиназы С.

Итак, липосомы из ФХ или смеси ФХ и эфиров жирных кислот способны вызвать активацию кислородного взрыва в альвеолярных макрофагах человека, по величине сопоставимую с действием  МЭФ и ионофора 27183. Введение в состав  ФХ-липосом ДАГ или арахидоновой кислоты  значительно усиливало этот процесс. Ранее изученные свойства модельных и биологических мембран, в состав которых введены эти соединения, позволяет сделать заключение о том,  они могут действовать как на стадии связывания липосом с поверхностью макрофагов, так и активируя механизмы, задействованные в  физиологическом ответе клетки, например, влияя на  проницаемость мембран для ионов кальция или  активируя протеинкиназу С.

1.4.2. Действие ДАГ-содержащих липосом на операционную рану кожи морской свинки. Завершающим этапом данного направления исследований явилось изучение действия липосом из ФХ, содержащих и не содержащих ДАГ, на  ткани. Для этого сравнивали действие липосом  из ФХ и смеси ФХ+ДАГ  на процесс заживления операционной раны  кожи морских свинок.

Под общим наркозом животным проводили частичную резекцию легкого. В момент повреждения легкого вводили  липосомы внутрилегочно,  в мышцу и кожу. Использовали раствор липосом из ФХ (1,3 мг/мл и 13 мг/мл), и липосомы из смеси ФХ и 1,2-ДАГ в концентрации 13 мг/мл, содержащие 2% ДАГ от содержания ФХ. Липосомы получали методом экструзии через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.

       Характер макроскопических изменений и уменьшение раневой поверхности определяли методом планиметрии. Полученные результаты приведены в табл.3. При сравнении с контролем обнаружилось, что на 7-ой день после операции липосомы из ФХ в концентрации 1,3 мг/мл не оказывали какого-либо эффекта. Заметное и статистически достоверное уменьшение площади раны отмечалось только в группах, где применяли липосомы из ФХ в концентрации 13 мг/мл. Однако в этом случае положительный эффект зависел от дозы : при использовании липосом в дозе 6 мг/кг не было отмечено существенных различий между опытной и контрольной группами; при дозе 25 мг/кг веса наблюдалось уменьшение площади раны на 30 %. Дальнейшее увеличение дозы до 45 мг/ кг веса не приводило к существенному повышению эффективности (см.табл.3).

        Сопоставление результатов, полученных на 7 день после операции при использовании липосом из ФХ и липосом из ФХ+ДАГ в концентрации 13 мг/мл, выявило большую эффективность препарата, содержащего ДАГ: при его применении площадь раны уменьшилась на 55 % по сравнению с контролем. Следует отметить, что действием препарата, содержащего ДАГ, отмечали уже на первый день после операции.

Во введении упоминалось о лекарственных препаратах на основе фосфолипидов, механизмы  фармакологического действия которых интенсивно обсуждаются в  литературе. По мнению большинства исследователей, основным механизмом является  взаимодействие липосом  с клетками системы мононуклеарных фагоцитов. Результаты данного исследования прямо указывают  на то, что при взаимодействии липосом с макрофагами происходит активация последних и при этом образуются активные формы кислорода.

Таблица 3. Влияние липосом  разного липидного состава на площадь раны на коже морской свинки.

Состав

ФЛ

Доза

мг/кг

Площадь раны (мм2)

1-ые сутки

7-ые сутки

1

ФХ

6

25,6±1,2

17,3±0,4

2

ФХ

25

22,3±0,8

12,5±0,3

3

ФХ

40

22,9±1,5

11,3±0,3

4

ФХ+ДАГ

25

20,6±0,9

8,0±0,2

5

Контроль

-

24,2±1,4

18,2±0,4

Эти данные могут объяснить  бактерицидный эффект препаратов фосфолипидов, ранее отмеченный в литературе. В свою очередь это может быть одной из причин лучшего заживления операционной раны, обработанной липосомами и тогда становится ясно, почему ДАГ, более эффективно активирующий макрофаги,  ускоряет заживление раны.

Итак, введение в состав модельных мембран ДАГ, метаболита фосфолипидов, образующегося при активации фосфатидилинозитного цикла, приводит к изменению их структурной организации, в результате чего происходит уменьшение стабильности ОВ  и индуцируется их слияние;  в мембранах появляется проницаемость для  ионов кальция.

В клетках и тканях введение ДАГ и арахидоновой кислоты приводит к увеличению тока кальция внутрь нервных окончаний; к возрастанию интенсивности кислородного взрыва фагоцитов; при этом происходит ускорение заживления операционной раны кожи  морских свинок. Полученные результаты показывают, что предполагаемое воздействие бактериальных фосфолипаз на липосомы  не только не уменьшает, но даже может увеличивать терапевтический эффект последних.

2. КОМПЛЕКСЫ  НЕМЕМБРАННЫХ ВОДОРАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ  С ЛИПИДНЫМИ ЭКСТРАКТАМИ  И СМЕСЯМИ ФОСФОЛИПИДОВ

Известно, что заболевание туберкулезом сопровождается  воспалительным процессом, при котором активируются  гидролазы разных типов, в том числе протеазы.  Ряд лекарственных препаратов противовоспалительного действия (в том числе давно применяемый препарат «Гордокс») содержат основной панкреатический ингибитор трипсина. Другой белковый ингибитор, который также обладает противовоспалительным действием, соевый ингибитор Баумана Бирк, пока проходит клинические испытания. Оба белка хорошо растворимы в воде и достаточно быстро выводятся из организма. Для усиления их проникновения в клетки проводят гидрофобизацию белков с помощью активных производных жирных кислот. Задачами данного этапа исследований явилась гидрофобизация этих белков путем получения белок-липидных комплексов с препаратами фосфолипидов разного состава и определение ингибирующей активности данных белков в составе  комплекса.

2.1. Получение белок-липидных комплексов и определение их состава.  Для исследований были выбраны два белковых ингибитора протеаз: основной  панкреатический ингибитор трипсина (ВРТI) и соевый ингибитор типа  Баумана-Бирк (ВВI). Исследовали процент связывания этих белков в комплексы  с фосфолипидами в различных условиях и ингибирующую активность белков в составе  комплексов  в отношении трипсина.  В связи с тем, что фосфолипиды могут взаимодействовать не только с ингибиторами, но и с ферментом, провели аналогичные исследования для трипсина

В качестве  липидного компонента были использованы различные липиды сои Грубый липидный экстракт ЛП-1 был получен экстракцией соевой муки смесью хлороформ-метанол, далее в ходе дополнительной очистки ЛП-1 водным раствором хлористого натрия  удалены сапонины и таким образом получен экстракт  ЛП-2. Их  составы  приведены на рис.5.  Далее методом адсорбционной хроматографии из липидных экстрактов сои получены индивидуальные фосфолипиды ФХ, ФЭ, ФИ и их смеси ЛП-3  -  ЛП-10 ( см.табл.4). 

Для препаративного получения белок-липидных комплексов была разработана специальная методика и подобраны такие соотношения белок:липид, при которых образовавшиеся комплексы выпадали в осадок при рН среды инкубации, равной 3,0. Осадки отделяли центрифугированием от исходных компонентов. Содержание белка в комплексах определяли модифицированным методом Лоури, а фосфолипидов - методом Дитмера по неорганическому фосфору. Количество белка в комплексе  выражали в процентах к количеству белка в среде инкубации.

Рис.5. Состав липидных экстрактов ЛП-1 и ЛП-2 и смеси фосфолипидов ЛП-3

Рис.5. Состав липидных препаратов ЛП-1 и ЛП-2 и  смеси фосфолипидов ЛП-3

Табл.4. Фосфолипиды и их смеси, используемые для получения комплексов с белковыми ингибиторами

Содержание  индивидуальных фосфоли-пидов, % от  суммы всех фосфолипидов

ФХ

ФЭ

ФИ

ФГ

ФК

л-ФХ

ЛП-1

42

20

18

13

 

7

ЛП-2

42

20

18

13

 

7

ЛП-3

42

20

18

13

 

7

ЛП-4

44

22

34

 

 

 

ЛП-5

88

 

5

 

5

 

ЛП-6

88

 

 

 

10

 

ЛП-7

99

ЛП-8

66

33

ЛП-9

50

50

ЛП-10

33

66

В связи с тем, что комплексы получали при рН 3,0, при расчете содержания отрицательно заряженных компонентов учитывалось рК фосфолипидов, равное 2,1 и то, что  ряд фосфолипидов имеет несколько рК ( ФК имеет имеет два рК,  равные 2,1 и 7,2 соответственно, а  рК1 и рК2  молекулы КЛ равны соответственно 3,0 и 7,4).

На рис.6 представлена зависимость содержания исследуемых белков (масс%)  в комплексах от содержания в липидных препаратах  отрицательно заряженных компонентов. Видно, что по мере возрастания содержания отрицательно заряженных компонентов происходит  усиление связывания с ними водорастворимых белков. Для всех четырех белков наибольшее содержание  белка (70%) наблюдалось в комплексе с препаратом ЛП-1,  содержащим наряду с фосфолипидами отрицательно заряженные сапонины и жирные кислоты.

Полученные результаты однозначно говорят о существенном вкладе электростатических сил во взаимодействие, что согласуется с наиболее распространенной точкой зрения о природе сил взаимодействия водорастворимых белков с фосфолипидами. Однако из рис.6 следует также, что водорастворимые белки связываются не только с заряженными липидами, но и цвиттер-ионами (ФХ или  смесями ФХ:ФЭ). Это означает, что, несмотря на то, что  связывание водорастворимых белков с фосфолипидами определяется в основном электростатическим взаимодействием,  наряду с этим присутствует  и неэлектростатическая составляющая. Под этим понимается вклад любых факторов, оказывающих влияние на связывание белка с липидом, например: гидрофобное взаимодействие между белком и липидом, конформационные изменения молекулы белка,  изменения в структурной организации фосфолипидов и т.д.

Рис.6. Процент связывания водорастворимых белков с липидными препаратами, содержащими различные количества отрицательно заряженных компонентов.

Поэтому задачей следующего этапа работы явилась оценка вклада неэлектростатической составляющей во взаимодействии BPTI и ВВI с  цвиттерионными фосфолипидами: Для исследований были выбраны четыре препарата: ФХ (ЛП-7) и смесь ФХ:ФЭ, в которых доля ФХ и ФЭ составляла соответственно 67:33 (ЛП-8), 50:50(ЛП-9) и 33:67 (ЛП-10).

Предварительно  методом лазерного светорассеяния определили размер частиц, методом 31Р-ЯМР спектроскопии - структурную организацию фосфолипидов в составе мультиламеллярных везикул, а также гидрофобность поверхности частиц по коэффициенту распределения этих препаратов в системе Тритон Х-114/вода. В последнем случае было проведено дополнительное исследование, которое показало, что после расслоения этой системы на фазы (воду и Тритон Х-114) насыщение водной фазы Тритоном  не влияет на структуру и свойства липидных агрегатов в водной фазе.

Обнаружили, что  дисперсия ФХ  вне зависимости от концентрации состоит из частиц размером 1,3-1,7 мкм. Добавление не более 50% ФЭ ( препараты  ФХ:ФЭ (67:33) и (50:50)) приводит к уменьшению размеров частиц до 0,5-0,8 мкм,  в которых сохраняется бислойная упаковка фосфолипидов. При дальнейшем повышении содержания ФЭ (препарат ФХ:ФЭ 33:67) происходит изменение структурной организации фосфолипидов: появляется изотропная фаза (данные по 31Р-ЯМР-исследованию не приводятся).

Параллельно определили коэффициент распределения ОВ исследуемых четырех фосфолипидных смесей  в системе Тритон Х- 114/вода.

Рис.7. Зависимость коэффициента распределения Кр  для ОВ, состоящих из ФХ и ФЭ в различных соотношениях,  в системе Тритон Х114/вода.

Установили, что увеличение содержания ФЭ в смеси сопровождается достоверным увеличением коэффициента распределения (Kр) только в одном случае – для смеси ФХ/ФЭ (33/67) (см. рис.7). Коэффициент распределения определяет стандартную свободную энергию переноса вещества из одной фазы в другую ΔGперенос = - RTlnKр, и для случая переноса из водной фазы в органическую Kр является мерой гидрофобности исследуемого вещества. Таким образом, найденное увеличение Kр  прямо свидетельствует о возрастании гидрофобности поверхности агрегатов при повышении в них содержания ФЭ до 67%, благодаря чему процесс перехода смеси ФХ/ФЭ (33/67) из водной фазы в органическую сопровождается выигрышем в свободной энергии системы  по сравнению с другими образцами. Этот результат хорошо коррелирует с уменьшением гидратации агрегатов фосфолипидов, заданной их составом и структурной организацией.

Анализ содержания исследуемых белковых ингибиторов протеаз в комплексах с цвиттерионами представлен на рис.8. Видно, что для ВРТI содержание белка в комплексе линейно  увеличивается с увеличением содержания ФЭ во всем интервале исследуемых  соотношений ФХ:ФЭ. Для BBI эта зависимость имеет вид кривой, проходящей через максимум.

Итак, несмотря на то, что оба исследуемых белка продемонстрировали одинаковую тенденцию увеличения связывания при увеличении доли  отрицательно заряженных фосфолипидов в препарате, их поведение при взаимодействии с цвиттерионными  фосфолипидами сильно различается.

Рис.8.  Связывание ВРТI (——) и  ВВI (- - - ) в комплексы в зависимости от соотношения ФХ:ФЭ

Это говорит о различном вкладе  гидрофильных и электростатических сил при образовании комплексов. ВРТI  связывается на поверхности агрегата фосфолипида  в основном электростатически и уменьшение гидратации поверхности при увеличении  содержания ФЭ  облегчает связывание. Напротив, BBI, несмотря на отсутствие -спирали в молекуле и хорошую растворимость в воде, способен  проникать в гидрофобную область мембраны

Поэтому увеличение жесткости мембраны при образовании изотропной фазы  в случае ФХ:ФЭ (33:67) приводит к уменьшению связывания. Для подтверждения этого предположения изучили влияние  ионной силы на этот процесс. Результаты, приведенные в рис.9, свидетельствуют о том, что начальное увеличение  ионной силы в случае BPTI ингибирует образование комплекса на 50%. Для BBI, напротив, начальное увеличение ионной силы не влияет на связывание белка, но в присутствии высокой ионной силы доля связанного  в комплекс белка резко возрастает, что характерно для гидрофобного взаимодействия.

Рис.9. Влияние ионной силы на образование комплексов из ФХ/ФЭ (50/50) и белковых ингибиторов: 1 - BBI; 2 - BPTI.

Для подтверждения участия гидрофобных сил в формировании комплекса с BBI использовали метод флуоресценции. Для оценки топологии комплексов применяли две флуоресцентные метки, одна из которых - антрацен - вводится в гидрофобную область мембран. Другая - родамин В - выбрана в качестве флуоресцентной метки для белка. Интенсивность флуоресценции для комплексов из МЛВ, меченных антраценом, и BBI, меченного родамином В, представлена на рис.10. В связи  с тем, что белок поглощает в той же области, что и антраценовая метка, полученные результаты были обработаны с поправкой на внутренний фильтр.

Сдвиг λмакс флуоресценции BBI, меченного родамином В, в коротковолновую область и увеличение интенсивности флуоресценции при образовании комплекса с BBIRh со смесями фосфолипидов различного состава свидетельствуют о переходе белка в менее полярное окружение.  В свою очередь, при образовании комплексов наблюдается снижение интенсивности флуоресценции антраценовой метки, расположенной ближе к концу жирнокислотной цепи. Это означает также, что при взаимодействии с фосфолипидами белок погружается в гидрофобную область мембраны. Эти данные подтверждают результаты, показавшие отсутствие  ингибирующего воздействия ионной силы  на образование комплекса с BBI, и говорят о существенном вкладе гидрофобных взаимодействии  в образование белок-липидного комплекса для данного белка.

Рис.10.  Спектры флуоресценции  А) BBI, меченного родамином В в отсутствие (1) и присутствии МЛВ из смеси ФХ:ФЭ(50:50) (2) или ФХ:ФЭ(33:67) (3); Б)  антрил-ФХ в составе липосом из смеси ФХ:ФЭ(50:50) (1,2) или ФХ:ФЭ(33:67) (3,4) в отсутствие (1,3) и присутствии (2,4) белкового ингибитора.

       Определение белок/липидного состава комплексов, описанное выше, позволило оценить удельную ингибирующую активность белковых ингибиторов в составе комплексов.

2.2. Активность трипсина и его белковых ингибиторов в составе комплексов

2.2.1.ТРИПСИН. Эстеразную активность трипсина в составе комплекса измеряли по скорости гидролиза специфического субстрата этилового эфира N–бензоил-L-аргинина (ВАЕЕ) в диапазоне концентраций комплексов от 0,03 до 0,3 мг/мл.  Активность трипсина в комплексе составляла ~ 35 % по сравнению с его водным раствором.  В присутствии детергента (2,5 % ДОХ), солюбилизирующее действие которого приводит к существенному уменьшению размеров МЛВ, наблюдали повышение активности трипсина до 45% (данные не приводятся).

2.2.2. BPTI. Для определения антитриптической активности комплексов BPTI измеряли скорость гидролиза специфического субстрата  ВАЕЕ  трипсином в присутствии комплекса BPTI с различными липидными препаратами. Параллельно проводили измерения ингибирования гидролиза субстрата раствором  BPTI в той же концентрации, которая содержится в комплексе.  Определение состава полученных осаждением комплексов позволило рассчитать удельную активность ингибитора в составе комплексов, образованных в различных условиях. Из рис. 11 следует, что BPTI проявлял минимальную активность в составе комплексов через 1 ч после получения и при хранении в течение 7 дн.  При добавлении ионного детергента ДОХ (2,5%) к BPTI-липидным комплексам активность ингибитора во всех образцах значительно возрастала. Методом электрофореза  было показано, что инкубация комплексов в присутствии ДОХ не приводит к появлению свободного  ингибитора в дисперсиях комплексов, т.е. при действии ионного детергента белок остается в его составе. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что минимальная активность ингибитора в составе комплекса не связана с его необратимой  инактивацией, а вызвана, по-видимому,  блокированием активного центра ингибитора. Низкая активность ингибитора в составе комплекса говорит о том, что белок связывается с МЛВ  фосфолипидов  областью, расположенной близко к активному центру. Это предположение подтверждается тем фактом, что активность ингибитора в составе комплекса восстанавливается при добавлении ДОХ, который превращает МЛВ в мицеллы. В таком состоянии активный центр ингибитора доступен для трипсина.

Рис. 11. Антитриптическая активность BPTI-липидных комплексов,  через 1 ч после получения (1),через 1 неделю (2) и 1 ч в присутствии ДОХ (3).

2.2.3. BBI. Антитриптическая активность комплексов  с BBI также определялась по их ингибирующему действию на скорость гидролиза ВАЕЕ  трипсином. Содержание белка в составе различных комплексов определяли ранее. Установили (см. рис. 12), что активность ингибитора в комплексах, содержащих отрицательно заряженные фосфолипиды (ЛП-1 - ЛП-5) равна  25-40% , что значительно выше по сравнению с  BPTI.

Существенное ингибирование активности трипсина и антитриптической активности его ингибиторов позволило предположить, что  при образовании  комплексов происходит блокировка их активных центров агрегатами фосфолипидов. Для подтверждения этого предположения изучили антитриптическую активность комплексов  с BBI  в присутствии ДОХ. Установили, что для ЛП-1, ЛП-2, ЛП-4 антитриптическая активность возрастает в 2 – 2,5 раза и мало изменяется в случае с ЛП-3 и ЛП-5 (рис. 12). Это может быть связано с неполной фрагментацией комплексов данного липидного состава при используемой концентрации ДОХ.

Рис.12. Антитриптическая активность BBI в составе липосом из:

(А) отрицательно заряженных липидов  в отсутствие  и в присутствии ДОХ и Б) липидов цвиттер-ионов.

Наряду с препаратами фосфолипидов, содержащих отрицательно заряженные компоненты, было проведено исследование активности BBI  в составе комплексов из фосфолипидов– цвиттерионов, результаты которого представлены на рис.12 б. Видно, что  в составе этих комплексов BBI  имел  более низкий уровень активности по сравнению с комплексами, содержащими отрицательно заряженные компоненты.

Итак, снижение активности исследуемых ферментов (трипсина)  и его белковых ингибиторов при связывании с фосфолипидами  происходит за счет экранирования активных  центров белков. При уменьшении размеров частиц комплекса под действием ДОХ доступ к активным центрам  облегчается и активность возрастает.

2.3. Комплексы фосфолипидов с бактериоцинами и их антимикробная активность.

Как отмечалось выше, одно из направлений  для разработки новых подходов к лечению туберкулеза заключается в поиске новых препаратов, способных ингибировать рост микобактерий туберкулеза и при этом быть нетоксичными для организма человека. Ранее с этой целью сотрудники ЦНИИ туберкулеза РАМН провели анализ антибактеральной активности различных бактериоцинов - пептидов, секретируемых клетками Lactobacillus salivarius, Streptococcus cricetus  и Enterococcus faecalis. Они впервые обнаружили способность ряда бактериоцинов  подавлять рост  M. tuberculosis H37Rv. Механизм действия пептидов основан на том, что они образуют поры в бактериальной мембране, что приводит к гибели  клетки бактерии. Чтобы оценить токсичность  бактериоцинов в отношении клеток организма животного, в частности макрофагов, измеряли уровень лактатдегидрогеназы клеток в присутствии различных бактериоцинов в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкг/мл. Таким образом был выбран  бактериоцин, далее обозначаемый как Ben5, секретируемый E. faecalis, который наиболее эффективно ингибировал рост M. tuberculosis и не вызывал повышения уровня лактатдегидрогеназы при использовании его в минимальной ингибирующей концентрации (МИК90), равной 0.1 мкг/мл. К сожалению,  ими же было установлено, что этот пептид не подавляет рост M. tuberculosis H37Rv в инфицированных макрофагах мышей из-за того, что водорастворимые пептиды не проникают через мембрану макрофагов.

Поэтому  задачей данного этапа работы явилась разработка липосомальной формы наиболее эффективного  Ben5 E.faecalis. Для этого использовали ту же методику, что и для белковых ингибиторов сериновых протеаз: были подобраны такие соотношения  белок:липид, при которых при инкубации обоих компонентов происходит образование осадка. После  центрифугирования осадок отделяли от  супернатанта,  в котором находился свободный белок, диспергировали в среде инкубации микобактерий (среда Дюбо) при рН 7,4. Методом экструзии получали ОВ, в которых  определяли  содержание белка и фосфолипидов.  Для получения липосом использовали либо ФХ, либо смесь ФХ:КЛ (1:4). В первом случае связывалось 10% белка, введение КЛ в липосомы увеличивало связывание до 30%.

         Далее изучали  действие ОВ с бактериоцином на рост M. tuberculosis H37Rv in vitro и  in vivo. Рост микобактерий в культуре в течение 6 дней  определяли по уровню включения 3Н-урацила в РНК микобактерий. Этот же метод применяли для определения роста M. tuberculosis H37Rv в перитональных макрофагах мышей.  Для заражения макрофагов их инкубировали с микобактериями  в течение 18 ч, после чего в среду инкубации вводили либо водный раствор Ben5, либо его  липосомальную форму. Контролем служил водный раствор рифампицина (1 и 0,1 мкг/мл). Полученные результаты по уровню включения 3Н-урацила в РНК микобактерий в присутствии различных добавок приведены на рис.13.

Видно, что водный раствор Ben5 из E. faecalis (0,1 мкг/мл) подавлял рост M. tuberculosis H37Rv (рис.13а), но никак не влиял на размножение микобактерий в макрофагах (рис.13в). Косвенным подтверждением этого служат и данные по увеличенному содержанию лактатдегидрогеназы в среде инкубации инфицированных макрофагов (рис.13б). В отличии от водного  раствора Ben5  его липосомальная форма обладает эффективностью не только в отношении  M. tuberculosis H37Rv (рис.13а), но и инфицированных макрофагов (рис.13в).

Рис.13. а) Число импульсов в минуту при включении 3Н-урацила в РНК M. tuberculosis H37Rv; б) уровень активности лактатдегидрогеназы в среде инкубации нативных и инфицированных макрофагов мыши; в) число импульсов в минуту при включении 3Н-урацила в РНК M. tuberculosis H37Rv  в инфицированных макрофагах мыши.

При этом отмечается практически нормальный уровень активности лактатдегидрогеназы в среде инфицированных макрофагов (рис.13б).

Полученные результаты указывают на возможность использования липосомальной формы Ben5 как противотуберкулезного препарата  in vivo. Для подтверждения этого было исследовано его действие в дозе 10 мкг привнутривенном введении на мышах, зараженных смертельной дозой M. tuberculosis H37Rv (2 х 10+7 КОЕ). Для сравнения с известными ПТП использовали рифампицин  в дозе  75 мкг. Лечение начинали через 1 день после заражения и проводили его в течение последующих 5 дней 1 раз в день. Результаты трех опытов суммированы в табл.5, из которой видно, что внутривенное введение водного раствора Ben5 не оказывало эффекта, а его липосомальная форма удлиняла срок жизни  мышей на 30%.

Следует отметить, что в выбранной модели эксперимента мышам вводится смертельная доза M. tuberculosis. В этих условиях рифампицин в  данной дозе только удлиняет срок их жизни. Поэтому полученное в эксперименте  достоверное увеличение срока жизни зараженных животных при применении липомальной формы Ben5 говорит о перспективности  дальнейших исследований с этим препаратом.

Табл. 5. Влияние  различных препаратов на продолжительность жизни мышей, зараженных летальной дозой M. tuberculosis H37Rv

Экспериментальные группы

Доза  препарата/ на мышь

Время жизни  животных после заражения  (MST ± SD, дни)

1

Лечение отсутствует

-

21 ± 3

2

Водный раствор Ben5

10 мкг

21 ± 3

3

Липосомы из ФХ:КЛ (1:4)

100 мкг

21 ± 2

4

Липосомальная форма Ben5

Ben5 -10 мкг

ФЛ -100 мкг

28 ± 3*

5

Рифампицин

75 мкг

34 ± 6

*P < 0.05 (Gohan’s criterion). 

Проведенные исследования наглядно демонстрируют преимущества липосомальных форм ПТП перед их водным раствором, которые во многом обусловлены способностью липосом фагоцитироваться макрофагами и направленно транспортировать лекарство к месту локализации микобактерии.

В ходе проведения экспериментов, описанных в двух предыдущих разделах работы, были получены важные результаты, касающиеся характера взаимодействия частиц из фосфолипидов, различающихся составом и структурой (мицеллы, однослойные и мультиламеллярные везикулы), с «дополнительными» компонентами (низкомолекулярными гидрофобными соединениями, пептидами, белками) и показано влияние этих соединений на различные свойства (структурную организацию, стабильность и проницаемость) фосфолипидных мембран. В некоторых случаях это приводило к повышению эффективности фармакологического действия везикул из фосфолипидов, установленной например при изучении действия ДАГ-содержащих липосом на процесс заживления операционной раны.

Эти результаты позволили нам перейти к исследованию чрезвычайно важной с медицинской точки зрения проблемы использования фосфолипидов для создания новых форм препаратов для лечения туберкулеза -  рифампицина и рифабутина. Для получения препаратов с максимально высоким включением антибиотиков в фосфолипидные везикулы необходимо было сначала изучить их физико-химические свойства в широком интервале рН и взаимодействие с различными модельными мембранами.

ГЛАВА  3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АНТИБИОТИКОВ  РИФАМИЦИНОВОГО РЯДА С МОДЕЛЬНЫМИ МЕМБРАНАМИ

Проблеме разработки липосомальных форм различных ПТП посвящено большое число исследований. Задачей  данного этапа настоящей работы явилась разработка такого препарата, в котором бы  содержание антибиотика в водной фазе значительно превышало бы его растворимость. Для решения этой задачи  на первом этапе работы  изучили ряд физико-химических параметров  антибиотиков рифампицина и рифабутина, которые эффективно подавляют жизнеспособность возбудителя туберкулеза M. tuberculosis,  и их взаимодействие с модельными мембранами в различных агрегационных состояниях (мультиламеллярные везикулы и ОВ) и при разных рН среды.

Другой задачей данного этапа работы являлась разработка на основе полученных результатов стабильной  липосомальной формы рифампицина и оценка ее эффективности в отношении M. tuberculosis  in vitro  и  in vivo. Выбор именно рифампицина в качестве субстанции  связан в первую очередь с его более выраженной по сравнению с рифабутином токсичностью. Не последнюю роль сыграли  также низкая цена субстанции (по сравнению  с рифабутином рифампицин в 10 раз дешевле) и тот факт, что рифампицин является препаратом первого ряда и широко применяется при лечении туберкулеза.

3.1.Физико-химические характеристики рифампицина и рифабутина. Рифампицин применяется  как противотуберкулезный препарат более тридцати лет, и накоплен значительный материал о его свойствах и действии. Напротив, рифабутин введен в медицинскую практику сравнительно недавно и  о его свойствах (растворимости, константах ионизации и коэффициенте распределения) в литературе представлена очень скудная информация. К сожалению, практически нет данных и о свойствах  рифабутина при  различных рН  среды. Это важно с той точки зрения, что воспалительный процесс, который присутствует при развитии  туберкулеза, приводит к понижению рН  ткани.

В связи с этим задачей на данном этапе явилось изучение влияния рН среды на растворимость антибиотиков и на их взаимодействие с модельными мембранами. Для количественной оценки такого взаимодействия  использовали коэффициент распределения этих соединений в системах липосомы/вода и октанол/вода.

Рифампицин и рифабутин являются полусинтетическими антибиотиками, производными рифамицина  SV. Их формулы приведены на рис.14, а зависимость от рН растворимости антибиотиков и коэффициента распределения в системе октанол/вода представлена на рис. 15 -17.

А)  Б)

Рис.14. Структурные формулы рифампицина (А) и рифабутина (Б)

Рис. 15. Зависимость от рН среды  коэффициента распределения рифампицина в системе октанол/вода ( столбики) и заряда молекулы (линия).

Рис.16. Зависимость от рН среды растворимости рифампицина .

Рис.17.Зависимость растворимости рифабутина () и его коэффициента распределения в системе октанол/вода  () от рН среды.

Как видно из этих данных, свойства обоих антибиотиков изменяются при изменении рН среды, что связано с наличием в их молекуле ряда ионизирующихся групп.

Данные по определению рКа в молекулах обоих антибиотиков будут представлены ниже, а в данном разделе представлялось необходимым остановиться на сравнительном определении коэффициентов распределения антибиотиков в двух системах: октанол/вода и липосомы (ОВ)/вода при рН 6,4. Выбор данного значения обусловлен тем, что при попадании в организм человека M.tuber проникает в макрофаги путем фагоцитоза и именно там, в фагосомах, происходит ее размножение. Известно, что рН фагосомы равно 6,4. Таким образом, исследование свойств антибиотиков при этом рН моделирует  его поведение в фагосоме. Согласно полученным результатам, суммированным  в табл. 6,  рифампицин имеет одинаковые значения Кд для обеих систем. 

Табл.6. Коэффициенты распределения антибиотиков в различных системах  при рН 6,4 и 0,15 М  NACI

Исследуемая система

Метод

Измерения

РИФАМПИ-ЦИН

РИФАБУТИН

1

МЛВ из ФХ

Разделение фаз

80±30

284±55

2

БОЛВ из ФХ

Тушение флуоресценции  метки (антрил-ФХ)

Нет данных

395±75

3

Октанол/вода

Разделение фаз

60±20

1580±300

4

Октанол/вода

Расчет по Программе ACD/PM

50

1900

Это говорит о том, что он одинаково хорошо проникает как в изотропную фазу октанола, так и в липосомы, которые имеют выраженную анизотропию и структуры, и свойств.

Напротив, для рифабутина переход в октанол протекает легче, чем в липосомы.  Возможно, это происходит за счет выраженных электростатических взаимодействий с поверхностью фосфолипидного агрегата, о котором говорилось выше. Для рифампицина такое взаимодействие минимально, и он сразу погружается в гидрофобную область мембраны.

3.1.1. Определение  констант  ионизации Согласно литературным данным, в молекуле рифампицина присутствуют две  ионизирующихся группы с рКа 7,9 и 1,7, которые были соотнесены с  гидроксилом  нафтола и  азотом  пиперидина.

Такие сведения о рифабутине отсутствуют. В результате  собственных исследований методами спектрофотометрии и потенциометрического титрования установили, что в молекуле рифабутина присутствуют три ионизирующиеся группы, имеющие следующие рКа: 1)  6,5, которую приписали ОН-нафтола; 2) 3,5. (N-имидазола); 3) 9,5 (N-пиридина).

Эти результаты позволили рассчитать содержание отдельных ионизационных форм антибиотиков (аниона, цвиттериона, катиона) в зависимости от рН среды. Оказалось, что в  интервале рН 6,4-7,4  рифампицин находится в основном в виде аниона и цвиттериона, а рифабутин, напротив, в виде катиона и цвиттериона (данные не приводятся).

Различие в знаке заряда в молекулах антибиотиков должно отразиться на характере их взаимодействия с модельными мембранами,  содержащими заряженные фосфолипиды. Для подтверждения этого предположения  изучали связывание обоих антибиотиков с липосомами (ОВ) из смеси ФХ:КЛ с различными содержанием КЛ. Для этого ОВ, исходно содержащие один из антибиотиков, методом гель-фильтрации отделяли от свободного антибиотика, а во фракции липосом спектрофотометрически определяли его содержание. На рис.18 представлен процент связывания антибиотиков с ОВ различного липидного состава. Видно, что  рифампицин в наибольшей степени связывается с липосомами из ФХ, а введение КЛ уменьшает связывание. Для рифабутина наблюдается противоположная ситуация: увеличение содержания КЛ в составе липосом увеличивает его связывание. Этот результат представляется логичным, т.к. часть молекул рифабутина несет положительный заряд.

Рис.18. Включение рифабутина (светлые столбики)  и рифампицина (темные столбики) в липосомы из ФХ с различным  содержанием КЛ.  Физраствор, рН среды 6,2-6,4

Для оптимизации условий, при которых достигается наибольшее включение антибиотиков в липосомы помимо варьирования фосфолипидного состава изучили влияние ионной силы  и рН в интервале 6,4-7,4. Обнаружено, что увеличение  ионной силы приводит к уменьшению связывания рифабутина с отрицательно заряженными липосомами (ОВ) и никак не влияет на этот процесс для рифампицина. Изменение рН в этом интервале не сказывалось на степени связывания.

В результате проведенных исследований были определены условия, при которых солюбилизация антибиотиков фосфолипидами позволила значительно увеличить их содержание в водной фазе : рифампицина  в 5-10 раз, рифабутина – в 100 раз  и перейти к разработке лекарственной формы рифампицина.

3.2. Продукты превращения рифампицина в водном растворе и в липосомальной форме при разных режимах хранения. К лекарственной форме препарата предъявляются два основные требования: наличие специфической активности и  стабильность при хранении в течение не менее года. Как известно, рифампицин очень нестабильный препарат, который легко окисляется и подвергается быстрой деструкции. В результате этого  образуются большое число продуктов: хинон рифампицина, 3-формилрифамицин SV, N-оксид рифампицина, 25-дезацетилрифампицин (см. рис.19).

Рис. 19. Структурные формулы: а) рифампицина; б) 3-формилрифамицина SV; в) 25дезацетилрифампицина; г) N-оксид рифампицина; д) хинон рифампицина или 25-дезацетилрифампицина

В связи с тем, что определение его антибактериальной активности в отношении медленно растущей микобактерии туберкулеза занимает как минимум 3 недели, вопрос о стабильности рифампицина являлся первоочередным.

Табл.7. Характеристики РФ, рифамицина SV и продуктов их превращения

Название

Максимумы на электронном спектре (этанол), нм

Rf (системы  А/Б)

Масс-спектры, m/z

1

Рифампицин

475

338

240

0.5 / 0.6

821.4

822.3

823.3

2

Хинон рифампицина

545

340

272

0.6 / 1.0

819.2

820.2

821.4

3

3-формилрифамицин SV

485

322

225

0.35 / 0.4

724.4

725.3

726.3

4

Рифамицин SV

450

312

230

0.0 / 0.70

696.3

697.3

698.3

5

Хинон рифамицина SV

530

312

230

0.70 / 1.0

696.1

697.1

698.1

6

25-дезацетил-

рифампицин

475

338

240

0.35 / 0.5

779.3

780.3

781.3

7

Хинон  25деза-цетилрифампицина

535

336

268

0.40 / 1.0

779.2

780.1

781.6

8

N-оксид рифампицина

475

338

240

0.05 / 0.1

837.4

838.4

839.5

9

Хинон N-оксида рифампицина

540

334

262

0.15 / 1.0

* – масс-спектр получен при детектировании положительных ионов

Для идентификации продуктов, образующихся  при хранении липосомальной формы рифампицина, сначала получили различные продукты деструкции и окисления этого антибиотика при инкубации его водного раствора (1 мг/мл) в различных условиях. Компоненты реакционной смеси разделяли методом двумерной ТСХ в системах А (хлороформ : метанол (9:1)) и Б (хлороформ : этанол (1:1)). Пятна с пластинок элюировали этанолом и анализировали их методом ВЭЖХ- на колонке Hypersil C18 250×3 мм в  градиенте ацетонитрила от 55% до 80% в воде, содержащей 0.2 % трифторуксусной кислоты. Наличие рифампицина и продуктов его деструкции детектировали спектрофотометрически (254 нм). Масс-спектры получали методом электроспрей-ионизации на тандемном масс-спектрометре с ионной ловушкой в режиме детектирования отрицательных ионов.

В табл. 7 представлены характеристики широкого круга продуктов превращения рифампицина, полученных по известным методикам и выделенных методом ТСХ. Их наличие сделало возможным идентификацию и количественное определение продуктов деструкции и окисления рифампицина в составе  липосом при хранении  в различных режимах.

Для стабилизации рифампицина и уменьшения содержания его основного продукта окисления - хинона рифампицина, в липосомальный раствор рифампицина  вводили 0,5 % аскорбиновой кислоты. Этот препарат в виде раствора и в виде лиофилизированного порошка (криопротектор- мальтоза) хранили в течение года при +40 (рекомендуемый режим хранения) и при 250 С в течение 3 мес (ускоренное хранение). Состав образцов  анализировали 1 раз в месяц.

Обнаружено, что при  хранении препарата  при +250С уменьшение содержания рифампицина только за 1 месяц составило более 10%, в то время как при .+40 С  доля антибиотика в первые 6 месяцев сохранялась на уровне 95% от исходного, а через год снизилась до 90% (см. табл.8).

Табл. 8. Содержание рифампицина (РФ)  в  различных препаратах при хранении +40С  и значения МИК этих препаратов в отношении M. tuberculosis H37Rv (108 клеток/мл) при различных сроках хранения.

Препарат

Лекарст.

форма

Содержание , мг/мл*

Срок хран.

мес

МИКРФ,мкг/мл

РФ

3-ФР

Х-РФ

1

РФ*

Р-р

1.0

0

0

0

2-20

2

Липосомы с РФ

Р-р

5.0

0

0

0

2-20

3

Липосомы с РФ

Лиофил порошок

**5.0

0

0

0

2-20

4

Липосомы с РФ

Р-р

4.5

0.4

<0.1

12

12-25

5

Липосомы с РФ

Лиофил порошок

5.0

0

<0.1

12

12-25

6

Липосомы с РФ

Р-р

3.0

1.8

<0.1

18

6-20

7

Липосомы с РФ

Р-р

2.5

2.2

<0.1

24

6-20

*Сокращения  в табл.8: РФ-рифампицин, 3-ФР – 3формилрифамицин SV, Х-РФ- хинон рифампицина. 

** Содержание рифампицина приводится для  лиофилизированного порошка при диспергировании его в 1 мл  физиологического раствора.

При этом в препарате нарастало в основном содержание 3-формилрифамицина SV, в то время как доля хинона рифампицина была незначительна и не превышала 1%. Состав лиофилизированного порошка липосом с рифампицином, напротив, сохранялся неизменным через 1 год хранения.

Полученные результаты говорят о том, что лекарственная форма липосомального рифампицина  возможна только в виде лиофилизированного порошка, стабилизированного добавлением аскорбиновой кислоты. Однако для проведения экспериментов in vitro и in vivo можно использовать раствор липосом с рифампицином в течение  полугода после его получения.

3.3. Антибактериальная активность рифампицина  в липосомальной форме  в отношении M. tuberculosis при различных сроках хранения препарата. Эксперименты по определению антимикробной активности водного раствора рифампицина, его липосомальной формы (раствор и лиофилизированный порошок)  в отношении M. tuberculosis Н37Rv проводили совместно с  сотрудником ЦНИИ туберкулеза РАМН к.м.н. Л.П.Мартыновой.

Исследовалась активность препаратов, которые хранились различные сроки (до 2-х лет) при 4 0С. Полученные результаты приведены в табл. 8, из которой следует, что, во-первых, нет существенной разницы между антимикробной активностью водного раствора рифампицина и его липосомальной формы. Во-вторых, антимикробная активность препаратов при длительном хранении практически не изменяется. Это позволяет утверждать, что продукт деструкции рифампицина 3формилрифамицин SV обладает антимикробной активностью, близкой к рифампицину, что хорошо согласуется с литературными данными. Благодаря полученным результатам о наличии антимикробной активности его липосомальной формы в течение длительного времени оказалось возможным использовать этот препарат в экспериментах  in vivo.

3.4. Действие in vivo. липосом, содержащих рифампицин, в отношении M. tuberculosis. Данная часть  исследований проведена совместно с сотрудниками отдела иммунологии ЦНИИТ РАМН к.б.н. И. В..Бочаровой,  к.м.н. В.В.Мищенко, д.м.н. Л.Л. Посохиным. Схема эксперимента была следующей: мышей заражали внутривенным введением M. tuberculosis Н37Rv в ретроорбитальный синус глаза в дозе 5х105 КОЕ;  лечение осуществляли через 2 недели после заражения, ежедневно, в течение 2-х месяцев; липосомальную форму рифампицина вводили ингаляционно.

В эксперименте использовали 4-е группы мышей (по 10 мышей в каждой группе), первая из которых (№1) была контрольной, в этой группе зараженные  M. tuberculosis животные  не получали лечения. В группе №2  зараженных животных лечили рифампицином и изониазидом (1:1 по весу)  в дозе 1,5 мг смеси на мышь; препараты вводили внутрижелудочно. Чтобы оценить эффективность данной схемы лечения, в группе №3 животные получали внутрижелудочно только один изониазид (доза 750 мкг/мышь). И наконец, в  опытной группе №4 зараженные животные получали и изониазид, и рифампицин, но изониазид вводился внутрижелудочно (доза 750 мкг/мышь), а рифампицин в липосомальной форме ингаляционно (доза 37,5 мкг/мышь). В отдельных экспериментах было показано, что ингаляционное введение липосом, не содержащих антибиотика, не приводит к снижению накопления микобактерий в органах зараженных животных в данной схеме  эксперимента и не предотвращает летальный исход.

Результаты микробиологического исследования, суммированные в табл.9, свидетельствуют о выраженности туберкулезного процесса в контрольной группе животных. В легких и селезенке  этих животных накопление M.tuberculosis  составляло 106 и 105 КОЕ/орган соответственно.

Лечение зараженных животных только одним изониазидом (группа №3) существенно снижало число микробных тел, но не приводило к полному выздоровлению, т.е. болезнь принимала хроническую форму. Напротив, при совместном применении и рифампицина и изониазида в виде растворов, вводимых внутрижелудочно, лечение по предложенной  схеме оказалось высоко эффективным. Согласно  данным табл. 9, в органах животных этой группы (№2) вообще не выявлено  накопления M.tuberculosis.

Табл.9. Количество высеваемых M.tuberculosis из органов зараженных мышей через 2 месяца лечения

______________________________________________________________ 

         Препарат         КОЕ / селезенка                КОЕ /легкоеХ±SD

______________________________________________________________

1.        Контроль                (3.9±0.5)х10^5                 (3.9±0.5)х10^6

2.        Изониазид+

рифампицин                0              0

3.        Изониазид         (4.3±0.6)*10^3                (4.3±0.6)*10^3

4.         Изониазид +липосомы

с РФ (ингаляционно)         0                        0

______________________________________________________________

       Замена водного раствора рифампицина на его липосомальный раствор, который вводили животным ингаляционно (группа №4) в отличии от животных группы №2, дала полностью положительный результат: после окончания лечения в органах животных микобактерий не обнаружено. Однако следует подчеркнуть, что доза рифампицина в липосомальной форме (группа №4) была  в 15 раз меньше дозы водного раствора рифампицина, вводимого внутрижелудочно (группа №2). Кроме того,  согласно гистологическим данным этот препарат не обладает гепатотоксичностью и улучшает структуру легочной ткани по сравнению  результатами, полученными для  группы №2.

       Эти результаты говорят не только о повышенной эффективности действия  рифампицина в липосомальной форме, но и позволяют убедиться в дополнительных терапевтических эффектах самих фосфолипидов.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что физико-химические свойства модельных мембран, изученные на примере однослойных везикул,  изменяются при введении в их состав метаболита фосфолипидов 1.2-диацилглицерина: уменьшается стабильность липосом и их мембраны становятся  проницаемыми для ионов кальция.

2. Показано, что механизм этого явления обусловлен способностью 1.2-диацилглицерина  модифицировать бислойную упаковку фосфолипидов.

3. Установлено, что введение 1.2-диацилглицерина  в биологические мембраны также приводит к формированию кальциевых  каналов проницаемости, которые ингибируются верапамилом. Аналогично действует арахидоновая кислота, но не  другие исследованные  жирные кислоты.

4. Обнаружено, что введение 1.2-диацилглицерина  и арахидоновой кислоты  в однослойные везикулы  усиливает их действие на клетки и ткани: возрастает интенсивность кислородного взрыва макрофагов; увеличивается скорость заживления операционной раны кожи.

5. Показано образование гидрофобных комплексов водорастворимых белков-ингибиторов протеаз (основного панкреатического ингибитора трипсина и соевого ингибитора Баумана Бирк) с мультиламеллярными везикулами не только из отрицательно заряженных фосфолипидов, но и из цвиттер-ионов.

6. Установлено сохранение ингибирующей активности белков в составе комплексов, которая увеличивается в присутствии ионного детергента из-за освобождения активного центра ингибиторов, ранее блокированного в составе комплекса.

7. Получена липосомальная форма бактериоцина, которая  подавляет рост M.tuber H37Rv не только в культуральной среде, но и в инфицированных макрофагах. Лечение этой формой бактериоцина животных, зараженных летальной дозой M.tuber H37Rv,  достоверно увеличивает  продолжительность  жизни.

8. Установлено, что при физиологических условиях рифампицин  и рифабутин  существует в различных ионизационных формах и  по-разному связываются с однослойными везикулами, содержащими отрицательно заряженные фосфолипиды.
9. Включение противотуберкулезных антибиотиков в липосомы при определенных условиях позволяет увеличить содержание в водной фазе рифампицина -в 10 раз, а рифамбутина- в 100 раз.

10. При изучении стабильности липосомальной формы рифампицина в виде раствора и лиофилизированного порошка при хранении обнаружено, что оба препарата сохраняют высокую антибактериальную активность в отношении M.tuber H37Rv, но только один из них (лиофилизированный порошок) выдерживает хранение в течение 1 года.

11. В опытах на животных,  зараженных M.tuber H37Rv, установлено, что разработанная  нами липосомальная форма рифампицина обладает  повышенной эффективностью действия  по сравнению  с водным раствором антибиотика и при этом не является гепатотоксичной.

Публикации по теме диссертации

1. Образцов В.В., Селищева А.А., Козлов Ю.П. Различный характер взаимодействия окисленного.  и восстановленного цитохрома с  с везикулами фосфолипидов // Биохимия, 1978,  т.43, в.11, с.2047-2054.

2. Третьяк А.Г., Селищева А.А., Василенко И.А,  Гросхейде В., Викторов А.В.  Лимаренко И.М. Козлов Ю.П. Влияние фосфоинозитидов на структуру везикул// ДАН, 1979,  т.249, в.1, с.230-234.

3. Сорокоумова Г.М. Василенко И.А.  Швец В.И. Селищева А.А., Боровягин В.Л.  Влияние метаболитов фосфолипидов на структуру модельных мембран// Биоорганич. Химия, 1983, т.8,  в.9, с.1106-1111.

4. Образцов В.В.,  Селищева А.А., Козлов Ю.П.  О влиянии конформации молекулы белка на характер его взаимодействия с везикулами // Биофизика,1983, т.26, в.3, с.412-417.

5. Селищева А.А., Козлов. Ю.П. Роль ионов кальция в процессе синаптической передачи. // Биол. науки ,1984, в.9, с.5-21.

6. Селищева А.А., Брусованик В.И., Неустроева Е.А.,  Маркова Е.Е  Действие фосфолипаз на транспорт Са2+ в синаптосомы // ДАН, 1985, т.281, в.1,  с.223-225.

7. Шрагин А.С. Василенко И.А.  Селищева А.А., Швец В.И. Влияние метаболитов фосфолипидов на слияние модельных мембран // Биол. Мембраны,1985, т. 2, в.8, с 789-795.

8. Брусованик В.И., Селищева А.А., Прилипко Л.Л., Козлов Ю.П., Кулене В.В. Активация транспорта Са2+ в синаптосомы фосфолипазой С, специфичной к фосфатидилинозитам// Биохимия, 1986, т.51, в.8, с.1329-1333.

9. Шрагин А.С. Селищева А.А., Василенко И.А.,  Швец В.И. Проницаемость и слияние мембран, продуцируемое продуктами метаболизма ФИ.// ДАН, 1986, т.287, в.3, с.717-720.

10. Селищева А.А., Козлов Ю.П. Метаболизм фосфолипидов и биологические мембраны, Иркутск,  Изд.ИГУ,  1988, 70 стр.

11. Брусованик В.И. Селищева А.А., Кравцов Г.М.,  Козлов Ю.П. Сопряжение фосфоинозитольного цикла с транспортом Са через мембрану синаптосом мозга крыс// Нейрохимия, 1988, т.7, в.3, с.357-367.

12. Селищева А.А., Василенко И.А. Воронин М.В., Швец В.И.Особенности кинетики гидролиза фосфолипидов фосфолипазой С из Bac.cer. Гидролиз фосфатидилхолина в присутствии ДОХ.// Биохимия, 1990,  т. 55,  с.87-93.

13. Мирошникова Т.А. Воронин М.В. Селищева А.А., Василенко И.А. Особенности кинетики гидролиза фосфолипидов фосфолипазой С в различных агрегатных состояниях // Биохимия, 1993, т.58, в.3,с.340-347.

14. Sorokoumova G.M. Shragin A.S. Vasilenko I.A.  Selishcheva A.A., Shvetz V.I. The effect of diacylglycerol on the structural organization of model membranes and their fusion // J. Lip. Res., 1994, v.4, p.255-271.

15. Атруз О.М. Сорокоумова Г.М., Селищева А.А., Скрябин Г.А.,  Биличенко Т.Н., Орлов С.Н.  Чучалин А.Г. Взаимодействие альвеолярных макрофагов больных и здоровых людей с липосомами // Бюлл. экспер.биол. мед., 1997, т.124, в.11, с.520-523.

16. Атруз О.М., Селищева А.А.,Сорокоумова Г.М., Василенко И.А. Индукция кислородного взрыва в моноцитах крови человека // Бюлл.экспер. биол. мед. 1998,  т.126, в.7, с.63-68.

17. Атруз О.М., Селищева А.А., Сорокоумова Г.М. Скрябин Г.А.,  Василенко И.А. Чучалин А.Г. Влияние липосом различного липидного состава на развитие кислородного взрыва в моноцитах крови и альвеолярных макрофагах человека// Биол. мембраны, 2000, т.17, в.5, с.510-518.

18. Мартынова О.М., Сорокоумова Г.М., Тюрина О.П., Селищева А.А., Швец В.И., Ларионова Н.И. Взаимодействие трипсина с мультиламеллярными везикулами из липидов сои // Биохимия, 2000, т.65, в.9, с.1240-1246.

19. Мартынова О.М., Тюрина О.П., Селищева А.А., Сорокоумова Г.М., Алексеева С.Г., Швец В.И. Отделение периферических полипептидов, содержащихся в липидных экстрактах сои, и их влияние на структурную организацию фосфолипидов // Бюлл. экспер. биол. мед.,  2000, т.129, в.2, с.159-162.

20. Сорокоумова Г.М., Селищева А.А., Каплун А.П.  Фосфолипиды. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде. Учебное пособие.2000. Москва. Моск. Академия тонкой хим.технологии.70с.

21. Корнилова З.Х., Селищева А.А., Перельман М.И. Влияние липосом из фосфатидилхолина на регенерацию операционной раны легкого морской свинки// Бюлл. экспер.биол. мед. 2001, т.131, в. 2, с.228-231.

22. Atruz O.M., Skrjabin G.A.,Vasilenko I.A., Sorokoumova GM., Selishcheva A.A. Effect of liposomes of different phospholipid composition on the induction of respiratory burst in human blood monocytes and alveolar macrophages // Membr. Cell Biol., 2001,  v.14, N 5, p.639-649.

23. Тюрина О.П., Шарф Т.В., Сорокоумова Г.М., Швец В.И., Селищева А.А., Ларионова Н.И. Комплексообразование основного панкреатического ингибитора  протеиназ с мультиламеллярными везикулами фосфолипидов сои // Биохимия, 2001, т.66, в.3, с.419-424.

24. Сорокоумова Г.М. Селищева А.А.,Алексеева С.Г. Шарф Т.В. Швец В.И. Тюрина О.П. Влияние водорастворимых немембранных белков на структурную организацию фосфолипидов //  Биофизика, 2002, т.47, в.2, с.268-276.

25.  Баукова Н.А., Алексеева С.Г., Сорокоумова Г.М.*, Селищева А.А., Мартынова О.М., Рогожкина  Е.А., Швец В.И.  Белки и сапонины присутствуют в липидном препарате, полученном при экстракции соевой муки // Прикл. биохим. микробиол. 2002, т. 38, в.2, с.183-189.

26.  Balkina A., Sharf T., Tiourina О., Ollivon M. Sorokoumova G.,  Larionova N. Interaction of the  water - soluble protein aprotinin with liposomes: gel-filtration, turbidity studies  and  31PNMR studies //  J. Lip. research, 2002, v.13, n.3-4, p.213-219.

27. Селищева А.А., Алексеев С.Б, Смирнова И.П., Подборонов В.М. Эффективность антигерпетического действия различных лекарственных форм L-лизин--оксидазы // Антибиотики и химиотерапия, 2003, т. 48, в.1,с.9-13.

28. Сорокоумова Г.М., Селищева А.А., Маликова Н.М., Минина А.С., Швец  В.И.  Включение изониазида в липосомы разного липидного состава // Бюлл. эксперим. биол. мед. 2004, т. 137, №1,  с.24-26.

29. Минина А.С., Селищева А.А., Сорокоумова Г.М., Маликова Н.М., Калашникова Т.Н., Швец В.И.  Включение рифампицина в многослойные и однослойные везикулы (липосомы) разного липидного состава //Биофизика , 2004, т.49, №4, с. 647-679.

30. Istarova T., Semenova M., Sorokoumova G., Selishcheva A., Belyakova L., Polikarpov Y.,  Anokhina M. Effect of pH on the interactions of sodium caseinate with soy phospholipids in relation to the foaming ability of their mixtures // Food Colloids, 2004, v.19, N3, p.429-440.

31 Шакина Ю.Н., Востриков В.В., Сорокоумова Г.М., Селищева А.А., Швец В.И. Взаимодействие рифабутина с модельными мембранами//  Бюлл. эксперим.  биол.  мед. 2005, № 12 , с.664-667.

32. Шакина Ю.Н., Востриков В.В. Сорокоумова Г.М. Селищева А.А. Швец В.И. Зависимость свойств рифабутина и его включения в липосомы от рН среды//

Антибиотики и химиотерапия 2005, т.50, №7, стр.3-7.

33. Балкина А.С., Селищева А.А., Сорокоумова, Г.М., Ларионова Н.И. Взаимодейс-твие нативного соевого ингибитора типа Баумана Бирк и его гидрофобизирован-ных производных  с мультиламеллярными везикулами соевых фосфолипидов// Биохимия, 2006, т.71, №1, с.84-89.

34. Balkina A.S., Selischeva A.A., Sorokoumova G.M., Ollivon M., Larionova N.I. Encapsulation of Bowman-Birk soybean proteinase inhibitor within zwitterionic phospholipid multilamellar vesicles // J.Drug Delivery. Sсience  Technol. 2006, v.16, №4, p.34-39.

35. Голышевская В.И.,  .Селищева. А.А., Мартынова Л.П.,  Лепеха Л.Н., 

Калашникова Т.Ю, Корнилова З.Х., Ерохин В.В, Розенберг О.А. Оценка эффек-

тивности действия липосомальной формы изониазида  in vitro// Проблемы

туберкулеза и болезней легких, 2006, №8, с.61-64.

36. Востриков В.В., Селищева А.А Сорокоумова Г.М.,  Швец В.И.  Коэффициент распределения рифабутина и его ионизированных форм в различных системах.//  Биомембраны  2007, т.24, №.2, с.169-174.

37. Востриков В.В., Селищева А.А Сорокоумова Г.М.,  Швец В.И.  Определение коэффициента распределения рифабутина методом флуоресценции // Биофизика 2007 , т. 52, №2,  с.125-128.

38. Sosunov V., Mischenko V., Eruslanov B., Svetoch E., Shakina Y., Stern N., Majorov K., Sorokoumova G., Selishcheva A., Apt A. Antimycobacterial activity of bacteriocins and their complexes with liposomes// J Antimicrob Chemother. 2007,  v. 59 (5), p. 919-925.

39. Vostrikov V., Selishcheva A , ,  Sorokoumova G.,. Shakina Y. , Shvetz V.I., Savel’ev O., Polshakov V.  Distribution Coefficient of Rifabutin in Liposome/Water  System as Measured by Different Methods// Eur. J.  Pharm. Biopharm, 2007, v.68 (1), p.120-126.

40. Трошкина О.А., Салина  Е.Г, Сорокоумова  Г.М.,  Капрельянц  А.С., Селищева А.А.  Влияние липосом на рост и чувствительность  M. smegmatis к изониазиду. // Прикладная биохимия и микробиология. 2007,т.43, №1, с.47-52.

41. Шакина Ю.Н., Трошкина О.А.,  Петрова  Е.Е., Салина Е.Г., Сорокоумова Г.М., Швец В.И., Капрельянц А.С., Селищева.А.А. Чувствительность к противотубер-кулезным препаратам  M. smegmatis, выращенной на средах, содержащих различные углеродные субстраты. //  «Ж. микробиол., эпидемиол.иммун.» 2007, в.6, c 24-28.

Подписано в печать ________________. Формат  60х84/16. Бумага писчая.

Отпечатано на ризографе. Уч. изд. листов 1.0. Тираж 100 экз.

Заказ № ______

Лицензия на издательскую деятельность

ИД № 03507 (рег. №003792) код 221

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Издательско-полиграфический центр

119571, г.Москва, пр.Вернадского, 86.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.