WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

СОЛЯНИКОВА Инна Петровна

ОРГАНИЗАЦИЯ биодеградативныХ ПУТЕЙ

у РОДОКОККОВ

специальность 03.00.04. – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Пущино, 2007

Работа выполнена в лаборатории энзиматической деградации органических соединений Института биохимии и физиологии микроорганизмов

им. Г.К Скрябина РАН.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ        Головлева Людмила Алексеевна

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Официальные оппоненты:        

доктор биологических наук Кулаковская Татьяна Валентиновна

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН                

доктор биологических наук, профессор Мальян Александр Нерсессович

Институт фундаментальных проблем биологии РАН

доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна

Институт микробиологии РАН

Ведущая организация:                Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита состоится года в часов мин на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН по адресу: 142290, г.Пущино Московской области, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайте http//www.ibpm.ru

Автореферат разослан « »  2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор биологических наук В.М.Вагабов        

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последние десятилетия в окружающую среду попало огромное количество промышленных отходов, сельскохозяйственных химикатов и продуктов их частичной трансформации, не имеющих аналогов или редко встречающихся в природе. Это оказало огромное влияние на все уровни организации живой материи и, без сомнения, нарушило то равновесие, которое создавалось на протяжении миллионов лет.

Учитывая распространенность, токсичность и устойчивость различных классов ксенобиотиков, мы выбрали для изучения процессов деградации гало-генированные моноароматические производные фенола и бензоата с одним-тремя заместителями. Эти соединения широко используются при производстве пластика, жидкостей для тушения огня, красителей, гербицидов, фунгицидов, растворителей и др. Так, в Финляндии с 1934 по 1988 г было использовано около 30 000 тонн различных хлорфенолов [Kitunen et al., 1987; Kitunen, 1990], До 300 г хлорированных фенольных соединений (фенолы, катехолы, гваяколы, сиринголы и ванилины) образуется на одну тонну пульпы при ее хлорном отбе-ливании, что привело к их накоплению порядка микрограмм на литр воды и миллиграмм на один кг (сухой вес) донных отложений в озерах, принимающих обработанные сливы [Salkinoja-Salonen et al., 1981]. Исследования in vitro показали, что хлорфенолы разобщают окислительное фосфорилирование, нарушают микросомальную детоксификацию, влияют на синтез белков и РНК [Lundberg et al., 1980; Erlich et al., 1987; Priston et al., 1987].

Физико-химические методы обезвреживания либо не обеспечивают деток-сификацию хлорфенолов, либо чрезвычайно дороги по сравнению с биологи-ческими (электронно-лучевой метод подготовки питьевой воды, считающийся одним из наиболее эффективных и надежных, требует 5 кВт-ч/м3 при производительности 50 м3/ч [Строкин, 2007]). То же касается сжигания хлорфе-нолов, - при недостаточно высокой температуре неизбежно образуются неизмеримо более токсичные полихлордиоксины, а проведение процесса при необходимо высоких температурах делает весь процесс дорогостоящим.

Составляя основу круговорота углерода в биосфере, бактерии являются перспективными объектами для решения проблем рационального природо-пользования, а именно: 1) создания технологий эффективного обезвреживания отходов на стадии производства, что будет препятствовать попаданию в окружающую среду вредных соединений, и 2) создания технологий и методов обезвреживания токсикантов, уже попавших в окружающую среду.  Только энзиматическое дегалогенирование позволяет получать безопасные продукты разложения галогенированных фенолов.

Вышесказанным обусловлена необходимость всестороннего изучения фер-ментативных процессов разложения ксенобиотиков. Такой подход позволяет не только интенсифицировать микробную деградацию трудно разлагаемых соеди-нений, но способствует пониманию процессов эволюции путей метаболизма, что, в свою очередь, может служить основой для лабораторного создания био-деградативных путей и отдельных ферментов с заранее заданными свойствами.

Исторически изучение микробного разложения ксенобиотиков начали с грам-отрицательных бактерий, преимущественно псевдомонад. Однако более поздние исследования грам-положительных бактерий показали, что их метаболический потенциал не ниже, чем у микроорганизмов других групп, а ряд физиологических отличий, в частности,  устойчивость к стрессовым воздей-ствиям и способность к длительному периоду метаболической активности, делают их перспективным объектом как для изучения фундаментальных вопросов (например, изучение основ субстратной специфичности ферментов), так и в прикладном аспекте. Все это, плюс широкое распространение бактерий рода Rhodococcus в почве, и, самое главное, - способность разлагать широчай-ший круг абиотических соединений, определило наш интерес к этой группе бактерий.

Состояние вопроса. К началу настоящей работы было известно, что первые этапы разложения разнообразных ароматических соединений микро-организмами приводят к образованию ограниченного числа ключевых интерме-диатов, дальнейшее превращение которых проходит по нескольким метаболи-ческим путям. Одним из ключевых интермедиатов является пирокатехин [Ornston, 1966], его разложение по орто-пути последовательно катализируют пирокатехин 1,2-диоксигеназа (ПК 1,2-ДО), муконатциклоизомераза (МЦИ), муконолактонизомераза и еноллактонгидролаза. При росте микроорганизмов на галогенированных субстратах помимо пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-пути обнаружен второй фермент, расщепляющий 3-хлорпирокатехин, - хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа (ХПК 1,2-ДО) [Dorn, Knackmuss, 1978a; Schmidt et al., 1980]. Было показано, что трансформацию 3-хлорпирокатехина в -кетоадипат у Pseudomonas sp. B13 осуществляют ХПК 1,2-ДО, хлормуконатциклоизомераза (ХМЦИ), диенлактонгидролаза (ДЛГ) и малеил-ацетатредуктаза (МАР). Этот путь назвали модифицированным орто-путем [Schlmann, 1994]. Данные работы можно считать началом разностороннего изучения ферментов разложения (хлор)пирокатехинов и это было одним из немногих результатов, полученных к началу наших экспериментов. Дальней-шие исследования, относящиеся с девяностым годам, также проводились в основном на грам-отрицательных бактериях [Pieper et al., 1985, 1988]. Установлено, что гены, кодирующие ферменты модифицированного орто-пути у грам-отрицательных бактерий, организованы в опероны сходной структуры и характеризуются высокой степенью идентичности. Показано, что ферменты, катализирующие аналогичные реакции разложения, характеризуются рядом общих свойств, тем не менее, субстратная специфичность ферментов находится в прямой зависимости от тех субстратов, которые являются ключевыми интермедиатами при разложении ксенобиотиков [van der Meer et al., 1991a,b]. Предпринятая позже попытка методом сайт-направленного мутагенеза изме-нить субстратную специфичность (хлор)муконатциклоизомераз у грам-отрица-тельных бактерий не дала  однозначных результатов. [Vollmer et al., 1998, Kaulmann et al., 2001]. Также ничего не было известно о пространственной структуре хлорпирокатехаз из грам-отрицательных бактерий; остался откры-тым вопрос об основах различий субстратной специфичности этих ферментов. На момент начала нашей работы практически ничего не было известно о ферментах разложения хлорпирокатехинов у родококков, но, учитывая их способность проявлять метаболическую активность, можно было предполо-жить, что эта группа микроорганизмов представляет несомненный интерес для исследователей с точки зрения изучения влияния токсикантов на живые системы.

Цель настоящей работы.

В связи с обозначенными предпосылками, целью работы явилось изучение организации биодеградативных путей бактерий рода Rhodococcus для выявления биохимических и молекулярных основ метаболической активности штаммов-деструкторов устойчивых поллютантов.

Для достижения поставленной цели было необходимо выполнение следующих задач:

  1. Оценка способности бактерий рода Rhodococcus разлагать или трансформировать незамещенные и замещенные ароматические соединения.
  2. Установление путей разложения ксенобиотиков наиболее активными штаммами родококков.
  3. Оценка активности, выделение и характеристика ферментов, участвующих в разложении бензоата, 4-метил-, 4-хлорбензоата, фенола, 2-хлор- и 4-хлорфенола у родококков.
  4. Сравнительный анализ структурных и каталитических особенностей ферментов, участвующих в разложении ксенобиотиков у родококков.
  5. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих ферменты разложения хлорфенолов у родококков.
  6. Кристаллизация хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ и расшифровка трехмерной структуры ферментов.
  7. Выявление факторов, определяющих различия субстратной специфичности интрадиольных диоксигеназ, раскрывающих кольцо орто-дигидроксибензолов.

Научная новизна работы. Проведен широкий поиск среди предста-вителей грам-положительных бактерий рода Rhodococcus на способность разлагать галогенированные ароматические соединения и отобраны наиболее активные штаммы-деструкторы.

Изучены процессы разложения 2- и 4-хлорфенолов, бензоата, фенола, 4-метилбензоата штаммами R. opacus 1cp, R. ruber P25, R. rhodnii 135, R. rhodochrous 89. Показано, что при использовании в качестве ростового субстрата каждого из эти соединений у родококков происходила индукция уникального набора ключевых ферментов, в первую очередь диоксигеназ, которые по субстратной специфичности можно разделить на три группы – пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-пути, хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы модифицированных орто-путей, метилпирокатехин 1,2-диокси-геназы. Впервые всесторонне охарактеризованы ферменты разложения 4-хлорпирокатехина: 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатцикло-изомераза, диенлактонгидролаза штамма R. opacus 1cp. Показано, что по физико-химическим и каталитическим свойствам они значительно отличаются от аналогичных ферментов из грам-отрицательных бактерий.

Исследовано разложение 3-хлорпирокатехина у R. opacus 1cp, что позволило обнаружить новый модифицированный орто-путь, который до сих пор в литературе не описан. Клонирован оперон, кодирующий ферменты 3-хлорпирокатехиновой ветви модифицированного орто-пути у штамма R. opacus 1cp. Сравнение нуклеотидных последовательностей, кодирующих ключевые ферменты, показало, что хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа и хлормуконатциклоизомераза из R. opacus 1cp ближе к аналогичным ферментам обычного орто-пути грам-положительных бактерий, чем к хлорпирокатехазам модифицированного орто-пути грам-отрицательных бактерий.

Изучены свойства муконатциклоизомеразы обычного орто-пути штамма R. rhodochrous 89 и установлено, что этот фермент отличается по субъединичному составу и свойствам от всех известных муконатциклоизомераз и занимает промежуточное положение между аналогичными ферментами грам-положительных и грам-отрицательных бактерий.

Впервые изучено превращение 2-галомуконата (фтор-, хлор-) (хлор)му-конатциклоизомеразами грам-положительных бактерий – реакция, которую можно считать определяющей при характеристике ферментов этого класса. Обнаружены их существенные отличия от ферментов из грам-отрицательных бактерий. Показано, что муконат- и хлормуконатциклоизомеразы из R. opacus 1cp способны выбирать направление циклоизомеризации 2-хлормуконата, что приводит к образованию 5-галомуконолактона. Реакцию превращения 5-гало-муконолактона в цис-диенлактон у R. opacus 1cp при росте на 2-хлорфеноле катализирует новый фермент, хлормуконолактондегалогеназа, аналог которого отсутствует в модифицированных орто-путях грам-отрицательных бактерий. Обнаружена необычная способность муконатциклоизомеразы из штамма R. rhodochrous 89 осуществлять превращение 2-хлормуконата, 2-хлор- и 5-хлормуконолактона в цис-диенлактон, а не в его транс-изомер, что характерно для грам-отрицательных бактерий.

Впервые методом рентгено-структурного анализа расшифрована пространственная структура хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 3-хлор- и 4-хлорпирокатехиновых ветвей модифицированного орто-пути штамма R. opacus 1cp на основании разработанного нами способа получения высокоочищенных препаратов этих ферментов и наличия их полной аминокислотной последова-тельности. Показано, что каждый фермент состоит из двух каталитических доменов и одного связующего центрального домена, содержащего две моле-кулы фосфолипидов. Установлено, что структура центральной части каталити-ческих доменов не отличается от таковой других интрадиольных диоксигеназ и содержит атом трехвалентного железа, пятикоординированный двумя остатка-ми гистидина, двумя остатками тирозина и гидроксилом воды. Тем не менее, в структуре активного центра обнаружены дополнительно по молекуле бензоата (у 4-ХПК 1,2-ДО) и бензогидроксамата (у 3-ХПК 1,2-ДО). Проведенное сравне-ние структур активных центров 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО позволило сде-лать предположение, что разница в субстратной специфичности этих фермен-тов опосредуется парами измененных аминокислотных остатков в той части, которая отвечает за связывание фермента с субстратом, прежде всего Val53/Ala53, Tyr78/Phe78 и Ala221/Cys224 (3-ХПК 1,2-ДО/4-ХПК 1,2-ДО).

Практическое значение работы. Проведенные нами исследования позволили создать коллекцию наиболее активных штаммов, способных разлагать устойчивые галогенированные поллютанты – хлор- и фторфенолы, хлорбензоаты, хлорбифенилы. При разложении 2- и 4-хлорфенолов получены штаммы, адаптированные к высоким концентрациям токсикантов и характе-ризующиеся высокой скоростью их разложения. Ряд результатов изучение особенностей процессов биодеструкции хлорфенолов штаммом R. opacus 1cp; разработка способов интенсификации процесса разложения токсикантов в биореакторе; возможность на основании полученных данных по простран-ственной структуре молекул методом сайт-направленного мутагенеза получать ферменты с заданной/измененной субстратной специфичностью – позволяет создать высокоэффективные бактериальные или ферментные препараты для очистка загрязненных территорий, а также оптимизировать процессы биореме-диации и очистки промышленных стоков, содержащих галогенированные ксенобиотики.

Материалы диссертационной работы используются в лекциях для профессорско-преподавательского состава ВУЗов РФ и  в лекциях для молодых ученых на Всероссийских конференциях, организуемых Пущинским Научным центром.

Связь работы с крупными научными программами. Результаты, представленные в данной работе, были получены в ходе выполнения исследований, проведенных в рамках тем: приоритетные направления АН СССР 0203 «Микробная деградация пестицидов», проектов программы ГНТП СССР/Министерства Науки РФ «Новейшие методы биоинженерии» (основное направление «Биотехнология защиты окружающей среды»); тем ИБФМ РАН «Новые микроорганизмы и ферментные пути для биоремедиации загрязненных сельскохозяйственных угодий» (№ гос. рег. 01.86.0 009.296), «Клеточные механизмы разложения неприродных и высокоустойчивых природных соединений базидиомицетами и коринеподобными бактериями» (№ гос. Рег. 0120.0403401), проектов РФФИ № 98-04-49393-а, № 05-04-49659, РФФИ-Наукоград 04-04-97266, РФФИ-Урал № 07-04-97625, международных грантов: NATO Linkage Grant HT 951032, NWO РФФИ-Нидерланды № 047.007.021; INCO Сopernikus (ERCIC15CT960103, ICA 1999-10046), DAAD (1992-1994, 2004), DFG N436 Rus 113/59/0, РФФИ-Германия ННИО_а № 99-04-04002.

Апробация результатов и публикации. Результаты данной работы были представлены для обсуждения на международном конгрессе по химии пести-цидов (Гамбург, Германия, 1990; Вашингтон, США, 1994), на втором всесоюз-ном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биоло-гии» (Самарканд, 1991), третьем международном симпозиуме по биологии и биотехнологии псевдоманад (Триест, Италия, 1991), на ежегодных конферен-циях немецкого микробиологического общества (1993, 1994, 2000гг), на 94-й конференции американского микробиологического общества (Лас Вегас, США, 1994), на конференции «Биотехнология защиты окружающей среды» (Пущино, 1994), на международном рабочем семинаре EERO «Энзиматические и генети-ческие аспекты биотехнологии окружающей среды» (Пущино, 1995), на между-народном симпозиуме «Современные проблемы микробной биохимии и био-технологии» (Пущино, 2000), на конференции «Биотехнология-2000» (Пущино, 2000), на конференции «Подготовка специалистов-биотехнологов для пред-приятий и организаций России» (Пущино, 2004), на второй европейской конфе-ренции «Оксиферменты» (Неаполь, Италия, 2004), на международных конфе-ренциях «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, Россия, 2005), INCOMID-2005 (Пермь, Россия, 2005) и «Сов-ременное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск-Раков, Беларусь, 2006). А также на ежегодных Отчетных сессиях ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН (1998-2006).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, об-зора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, содержит 54 таблицы и 67 рисунков. Список литературы включает 494 наименований, из них 474 – публикации в иностранных журналах.

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность и призна-тельность научному консультанту д.б.н., профессору, заслуженному деятелю науки РФ Л.А.Головлевой за многолетнюю помощь и поддержку; коллегам, участвовавшим в проведении исследований, чей вклад отражен в совместных публикациях: д.б.н. Е.Л.Головлеву, к.б.н.  О.В.Мальцевой , к.б.н. В.М.Травки-ну, к.б.н. О.В.Моисеевой, к.б.н. М.П.Коломыцевой, асп. О.В.Лисняк, студентке М.М.Суворовой, лаборантам Г.И.Захаровой, Н.Н.Земской; другим сотруд-никам института, помогавшим в проведении исследований, а также сотруд-никам ИГЭМО (г.Пермь): к.б.н. Е.Г.Плотниковой, к.б.н. Д.О.Рыбкиной, асп. Е.С.Шумковой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В обзоре описаны основные пути  разложения ключевых интермедиатов ((галогенированных)пирокатехинов, протокатехоата, гидроксигидрохинона), образующихся при бактериальной деструкции ароматических соединений с упором на (гало)фенолы, 2,4-Д, (хлор)бифенилы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. Реактивы, используемые для приготовления минеральных сред, были аналитической чистоты («Реахим», СССР). Биохимические реактивы были получены от фирм «Sigma» (США) и «Serva» (Германия). 3-Ме-тилпирокатехин – «Koch-Light» (Англия); 4-метилпирокатехин – «Fluka» (Швейцария). Монофторированные фенолы были получены от фирмы Janssen Chimica (Бельгия), ди-, три- и тетрафторфенолы, 2- и 4-хлорфенолы – от фирм Aldrich (Steinheim, Германия) и Fluorochem (Derbyshire, Великобритания). Реактивы для электрофореза в полиакриламидном геле – от «Bio-Rad» (США).

Микроорганизмы. В данной работе использованы следующие микро-организмы: штамм Rhodococcus opacus 1cp, способный использовать бензоат, 4-хлорфенол (4-ХФ) и 2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ), был выделен из на-копительной культуры, поддерживаемой в течение нескольких месяцев с 2,4-ДХФ [Горлатов с соав., 1989]. Вариант данного штамма, растущий на 2-хлорфеноле (2-ХФ) и 3-хлорбензоате (3-ХБК), получен после длительной адаптации к указанным субстратам [Моисеева с соавт., 1999]. Штамм R. rhodochrous 89 выделен из песчаной почвы соснового леса в пойме реки Волга; штамм Rhodococcus rhodnii 135 выделен методом накопительных культур из почвы, загрязненной нефтью, дизельным топливом и хлорфенолами, штамм Rhodococcus opacus 1G выделен методом накопительных культур из почв, загряз-ненных нефтью, в районе Самары; штамм Rhodococcus ruber Р25, выделен из почв, загрязненных галогенированными ароматическими соединениями [Плотникова с соавт., 2006].

Для культивирования родококков использована минеральная среда следующего состава (г/л): Na2HPO4 0.7; KH2PO4 0.5; NH4NO3 0.75; MgSO4 x 7H2O 0.2; MnSO4 0.001; FeSO4 0.02. Для получения биомассы проводили периодическое культивирование штаммов в 10-ти литровом биореакторе с объемом среды 7-7,5 литров. Субстраты вносили дробно по 50-250 мг/л. За ростом культур следили по снижению потребления кислорода, изменению значения рН и изменению оптической плотности клеточной суспензии. рН ростовой среды поддерживали на уровне 7.0-7.2 периодическими внесениями 0.1 М NaOH. Для выделения ДНК R. opacus 1cp выращивали при 30С в минеральной среде, рН 7.2 [Dorn et al., 1974] c двойной концентрацией фосфатного буфера, содержащей 20 г/л глицина и 2 г/л глюкозы. Штамм P. putida PRS2000 [Ornston, 1966] выращивали в той же среде без глицерина и глюкозы, но с 5 мМ бензоата натрия в качестве источника углерода и энергии. E. coli DH5 выращивали на LB среде [Sambrook et al., 1989] с 100 г/мл ампицилина при 37С. Для приготовления бесклеточных экстрактов штамм R. opacus 1cp выращивали на бензоате, пара-толуате, 2-хлорфеноле и 4-хлорфеноле; штаммы R. rhodochrous 89, R. opacus 1G и R. rhodnii 135 на феноле, R. ruber P25 – на 4-хлорбензоате (4-ХБК), пара-гидроксибензоате и пара-толуате. Биомассу размораживали, к клеточной суспензии добавляли дитиотреитол и MnSO4 до конечной концентрации 0.1 и 2 мМ, соответственно. Разрушение клеток проводили экструзионной дезинтеграцией на ИБФМ-прессе с рабочим давлением 3200 кГ/см2 или на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (США) мощностью 150 Вт при 20 кГц в течение 30 мин.

Активность ферментов определяли на спектрофотометрах Shimadzu UV-160 (Япония) или Kontron Uvikon 810 P (Германия) в кварцевых кюветах с дли-ной оптического пути 1 см при 25С. Единицу активности определяли как коли-чество фермента, катализирующее превращение одного µмоль субстрата или образование одного µмоль продукта в минуту. Относительную активность рас-считывали, принимая за 100 %-ную активность с незамещенным или с лучшим субстратом. Активность ферментов с фторированными субстратами определяли методом фтористого ядерно-магнитного резонанса на приборе Bruker DPX 400. Химические сдвиги соединений рассчитывали, принимая за ноль пик CFCl3. В качестве внутреннего стандарта использовали 4-фторбензоат. Анализ продуктов превращения хлорированных и фторированных соединений методом ВЭЖХ проводили на Waters M600-PDA хроматографе с Waters 996 фотодио-дным детектором, используя обращенно-фазовые колонки Alltima C18 размером 4.6 х 150 мм (Alltech, Нидерланды) и Grom SIL 100 C8 («Grom», Германия) размером 4.6 х 125 мм. Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц определяли электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS по модифицированному методу Лэммли [Laemmli, 1970] на пластинах с 10, 12 или 15%-ным акриламидом в разделяющем геле. Гель окрашивали по модифици-рованному методу Меррила [Merril et al., 1981]. Для калибровки использовали стандартные наборы низко- или высокомолекулярных белков фирмы «Sigma» (США). Молекулярную массу нативных белков определяли электрофорезом в ПААГ и гель-фильтрацией на колонке Superose 6 (HR 10/30). Для электро-фореза использовали готовые пластины Mini-Protean II («Bio Rad») с 4-20% полиакриламидным градиентом в 0.375 М Tris-HCl, рН 8.8. N-концевую аминокислотную последовательность белков определяли после нанесения белка на пластину с ПААГ-SDS, проведения электрофореза и электропереноса на мембрану Immobilon P («Millipore», США). Мембрану окрашивали Кумасси R-250, белковую линию вырезали. Определение аминокислотной последова-тельности проводили на приборе Applied Biosystems модель 473 А. Аминокислотный состав белков определяли после гидролиза 6 N HCl (110С, 24 ч) на аминокислотном анализаторе Waters PICO-TAG [Bidlingmeyer et al., 1984]. Очистку ферментов проводили с использованием носителей и колонок фирм Pharmacia (Швеция) и Toyo-Soda (Япония), используя установки “BioPilot” и “FPLC” фирмы Pharmacia: DEAE-Toyopearl 650M (180-240 мл), Sephacryl S-200 (250 мл), Q-Sepharose FF (20 мл), Q-Sepharose HP (60 мл), Superose 6, Superose 12 (25 мл), Superdex 75 (120 мл), Superdex 200 (120 мл), MonoQ 10/10 (6 мл), Mono Q 5/5 (1 мл), Resource Q (6 мл), Resource Iso (1 мл), Resource Phe (1 мл), Phenyl Superose HR 10/10 (8 мл), Butyl-Sepharose (20 мл), для концентрирования белков использовали ячейки для ультрафильтрации фирмы «Amiсon» объемом 10, 50 и 250 мл, размер пор мембран варьировал от 10000 до 30000. Для кристаллизации 4-ХПК 1,2-ДО использовали фермент, очищенный по обычной схеме из 100 г биомассы. Для первоначальных опытов использовали Hampton Research Crystal Screen и Crystal Screen 2, используя метод сидячей капли. 1 л белкового раствора (20 мг/мл) в 20 мМ Tris-SO4, pH 7,2, в смеси с 1 л резервного раствора уравновешивали против 500 л преципитирующего раствора. Для кристаллизации 3-ХПК 1,2-ДО использова-ли белок, очищенный согласно обычной схеме. Начальную кристаллизацию проводили в Hampton Research Crystal Screen I и II методом сидячей капли. Для этого 1 л белкового раствора (15 мг/мл) в 20 мМ Tris-SO4, pH 7,2, смешивали с равным объемом резервного раствора и уравновешивали против 50 л преци-питирующего раствора в плашках Chryschem на 96-ячеек. Результаты, позво-лившие получить кристаллы, в дальнейшем были оптимизированы. Рентгено-структурный анализ кристаллов 4-ХПК 1,2-ДО проводили на приборе Bruker, используя вращающийся анодный источник, сопряженный с 1К CCD детектором, используя дифракцию при 3.5 . Полный набор данных при 100К были получены в программе EMBL beamline BW7A в DORIS, DESY (Гамбург, Германия). Данные были получены с MAR CCD детектором и длиной волны 1,01 . Данные рассчитывали с использованием программы DENZO SCALEPACK [Otwinowski & Minor, 1997]. Рентгено-структурный анализ кристаллов 3-ХПК 1,2-ДО проводили при 100К на X-ray дифракционном Вeamline Elettra синхротроне (Триест, Италия), используя длину волны 1,01 . Данные получали с MAR CCD детектором с максимальным разрешением 2,0 .

Геномную ДНК выделяли по стандартной процедуре [Eulberg et al., 1997]. Плазмидную ДНК из E. coli DH5 выделяли с помощью набора Pharmacia Flexiprep. Векторную ДНК, разрезанную одной рестриктазой, дефос-форилировали перед лигированием. Для клонирования продукта ПЦР Т-вектор готовили как описано Марчуком с соавт. [Marchuk et al., 1991]. Фрагменты ДНК для лигирования или метки дигогсигенином выделяли из геля с использованием набора Easy Pure (Biozym). Компетентные клетки готовили из E. coli DH5, последующую трансформацию проводили по методу Иное с соавт. [Inoue et al., 1990]. Наличие вставки ДНК определяли на чашках с LB, содержащей 0,13 мМ IPTG и 32 г X-Gal, по цветовому признаку. Для проведения ПЦР использовали олигонуклеотиды, синтезированные на основе определенной N-концевой последовательности ферментов и одного из внут-ренних пептидов, полученного после обработки трипсином и разделения мето-дом ВЭЖХ. Реакционная смесь (50л) содержала 50 пмоль каждого праймера, 0,5 г геномной темплатной ДНК, 25 М каждого из дезоксинуклеозидтри-фосфата, 1х ПЦР буфер (MBI Fermentas), 2,0 Ед Таg  полимеразы (MBI Fermentas), 3 мМ MgCl2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка роста родококков на различных ароматических субстратах

Из почв по признаку роста на 3-ХБК, 2,4-Д и 4-хлорфеноле было выделено около 50 культур, в дальнейшей работе использовали два штамма, идентифицированные по данным 16Sрнк-ДНК анализа как Rhodococcus sp. 1 и Rhodococcus sp. 2.

Из коллекции д.б.н. Е.Л. Головлева (ИБФМ РАН), насчитывающей порядка 500 штаммов нокардиоподобных микроорганизмов, ауксанографи-чески было проверено около 20 наиболее перспективных культур из группы Rhodococcus, растущих на ароматических соединениях, при этом основное внимание уделялось хлорированным фенолам и бензоатам. Определено, что бактерии рода Rhodococcus разлагали широкий спектр ароматических соединений в качестве единственного источника углерода и энергии. Так, практически все штаммы росли на твердой минеральной среде с бензоатом, фенолом. Два штамма росли на агаризованной среде с толуолом. Поддерживали рост большинства из проверенных штаммов метилированные субстраты - пара-крезол и пара-толуат. В скобках – оценка роста по пятибальной шкале. Штамм Rhodococcus minimus 1а рос на бензоате (4), п-гидроксибензоате (5), п-толуате (4), анисовой (5), феруловой (5) кислотах, 2-хлорфеноле (2), 2,4-Д (3). Для штамма R. opacus 1G показана вариабельность роста на феноле, бензоате (2–4), п-оксибензоате (ПОБК) (2–3), п-крезоле (0–4). Штамм R. opacus 6a в качестве единстенного источника углерода использовал 3-хлорбензоат (3-ХБК) (3), 2,4,6-трихлорфенол (2), феруловую кислоту (5). Широкий спектр ароматических субстратов окисляли штаммы Rhodococcus rhodochrous 172 (фенол (5), бензоат (5), п-гидроксибензоат (4), фталат (5), терефталат (3), п-толуат (4), ацетофенон (5), анисовая к-та (5), нафталин (5), п-крезол (3), 2-хлорфенол (2), 4-хлорфенол (3), 2,4-Д (3), 3-ХБК (4)); Rhodococcus opacus 557 (фенол (5), бензоат (4), м-гидроксибензоат (3), ПОБК (4), анисовая (4), феруловая (4) к-ты, п-крезол (2), фталат (4), вцетофенон (3), 2,4-Д (3), 3-ХБК (4)), Rhodococcus ruber P25 (бифенил (5), 2-хлорбифенил (3), 4-хлорбифенил (4), 4-ХБК (3), п-толуат (5), п-гидроксибензоат (5), фенантрен (1), антрацен (1)). Штаммы родококков 172 и 412 росли на нафталине.

В жидкой минеральной среде с ароматическими субстратами в качестве единственного источника углерода и энергии не все культуры были способны давать значительное увеличение плотности без добавления легко усваиваемых источников питания. В первую очередь это относится к таким соединениям, как 2-ХФ, 2,4-Д и 3-ХБК.

На рисунке 1 показаны кривые роста некоторых из проверенных родококков на бензоате, пара-толуате, феноле. Рост на бензоате сопровождался самой короткой лаг-фазой. Практически у всех культур, растущих на п-толуате, была продолжительная лаг-фаза. Наиболее быстро росли на этом субстрате штаммы 172, 400, 6а – оптическая плотность достигала максимума менее, чем за 48 часов.

Штамм Rhodococcus opacus 1cp использовал в качестве единственного источника углерода и энергии широкий набор ароматических соединений, в том числе 2,4-дихлорфенол, фенол, бензоат, п-крезол, 4-хлорфенол (4ХФ). Изначально R. opacus 1cp не был способен к росту на 2-хлорфеноле (2ХФ), рост на 4ХФ рост сопровождался увеличением оптической плотности до 0,2–0,25 ед при 560 нм, если концентрация токсиканта не превышала 100 мг/л, увеличение концентрации вносимого 4ХФ приводило к ингибированию роста культуры. В результате проведенной адаптации к  4ХФ штамм R. opacus 1cp не проявлял признаков ингибирования роста при концентрации субстрата 200 мг/л, суммарная концентрация потребленного субстрата в условиях периодического культивирования в биореакторе составила порядка 4 г/л за 48-52 ч (Рис. 2).

Рисунок 2. Кривые роста неадаптированного (1) и адапти-рованного (2) штамма R. opacus 1cp при культивировании в колбах. Увеличение оптической плотности при периодическом культивировании штамма 1ср в биореакторе (3).

Адаптация R. opacus 1cp привела к появлению 2ХФ+ фенотипа. В процессе культивирования на хлорированных фенолах была обнаружена морфологи-ческая неоднородность состава популяции – выявлено две морфологически и физиологически отличающиеся формы с лабильным переходом между ними под действием токсических факторов.

Рисунок 1. Рост родококков: R. opacus 557 (1), Rhodococcus sp. 400 (2), R. rhodochrous 172 (3), R. opacus 6a (4), R. minimus 1a (5), R. opacus 1G (6) на ароматических субстратах.

Клетки R. opacus 1cp, поддерживаемые на 2-ХФ в качестве единственного источника углерода, при высеве на МПА образовывали  колонии одинаковой гладкой формы (S1), имеющие розовую окраску с ровной и слегка блестящей поверхностью. Через 10–15 пересевов при культивировании исходного штамма на МПА происходило появление шероховатых форм (R) такого же розового цвета. При культивировании S-форм на хлорфенолах дальнейшей диссоциации не происходило.

Шероховатая форма, выращиваемая на хлорфенолах, давала расщепление на шероховатую R и гладкую S1 формы на 8-10 сутки культивирования. S-формы оказались наиболее приспособленными к росту на хлорфенолах, более интенсивно осуществляя их разложение, а R-форма – к росту на среде, содер-жащей легко усваиваемые источники углерода. В литературе описана гетеро-генность популяции и R-S диссоциации у корине- и нокардиоподобных бакте-рий [Ames et al., 1968; Милько Е.С., Егоров, 1991]. Показана зависимость спо-собности родококков утилизировать ароматическую фракцию арабской сырой нефти от морфотипа колоний [Iwabuchi et al., 2000, 2002, Iwabuchi et al., 1997].

Мы показали, что длительный рост на хлорфенолах привел к адаптации штамма к токсичному субстрату, при этом изменялись как физиологические, так и морфологические характеристики клеток.

2. Конверсия фторфенолов родококками

Процессы разложения галогенированных соединений изучали, используя различные методы физико-химического анализа образующихся метаболитов. Одним из наглядных и удобных является метод спектроскопии фтористого ЯМР, который позволяет использовать целые клетки родококков для анализа метаболизма орто-фторированных ди- и трифторфенолов. Субстраты и ха-рактер их превращения родококками представлены в таблицах 1, 2.

Таблица 1. Разложение фенолов, выход фтор-иона и накопление фторированных интермедиатов при инкубации родококков с различными орто-фторированными фенолами. Время инкубации – 2 часа. Абиотическое окисление фторфенолов отсутствовало.

Субстрат и его производные

R. opacus 1G,

%

R. rhodnii 135,

%

R. rhodochrous 89, %

R. opacus 1cp, %

2,3-дифторфенол

Остаток фенола

Выделенный F-

F в интермедиатах

55

26

19

26

38

36

74

9

17

74

16

10

2,4-дифторфенол

Остаток фенола

Выделенный F-

F в интермедиатах

49

42

9

46

53

1

75

11

14

66

32

2

2,5-дифторфенол

Остаток фенола

Выделенный F-

F в интермедиатах

30

57

13

0

90

10

82

3

15

61

35

4

2,3,4-трифторфенол

Остаток фенола

Выделенный F-

F в интермедиатах

43

31

26

12

35

53

90

3

7

80

13

7

2,3,5-трифторфенол

Остаток фенола

Выделенный F-

F в интермедиатах

63

23

14

59

38

3

94

4

2

66

34

0

2,4,5-трифторфенол

Остаток фенола

Выделенный F-

F в интермедиатах

65

28

7

19

79

2

94

5

1

79

21

0

Таблица 2. Состав метаболитов при инкубации штаммов родококков с орто-фторированными ди- и трифторфенолами. За 100% принято общее коли-чество фторированных продуктов (за исключением фторфенола и фтор-иона). «-», фторированных метаболитов было менее 2% от их общего количества.

Фторированные метаболиты

R. opacus 1G, %

R. rhodnii 135, %

R. rhodochrous 89, %

R. opacus 1cp, %

2,3-дифторфенол

3-фторпирокатехин

3,4-дифторпирокатехин

2-фтормуконат

2,3-дифтормуконат

неизвестные

81±2

16±1

1±1

0

2±1

50±3

23±5

24±2

1±1

2±1

5±3

87±6

0

5±3

3±2

11±3

0

58±4

0

31±2*

2,4-дифторфенол

4-фторпирокатехин

3,5-дифторпирокатехин

3-фтормуконат

2,4-дифтормуконат

неизвестные

47±30

16±8

0

0

37±37*

-

-

-

-

-

5±3

94±3

0

1±1

0

-

-

-

-

-

2,5-дифторфенол

4-фторпирокатехин

3,6-дифторпирокатехин

3-фтормуконат

2,5-дифтормуконат

неизвестные

64±9

0

0

0

36±9*

9±9

12±12

0

74±17

5±5

0

47±5

0

53±5

0

1±1

2±1

0

17±6

80±7*

2,3,4-трифторфенол

3,4-дифторпирокатехин

3,4,5-трифторпирокатехин

2,3-дифтормуконат

2,3,4-трифтормуконат

неизвестные

81±1

19±1

0

0

0

79±1

21±2

1±1

0

0

0

100±0

0

0

0

7±4

3±2

0

39±8

51±2*

2,3,5-трифторфенол

3,5-дифторпирокатехин

3,4,6-трифторпирокатехин

2,4-дифтормуконат

2,3,5-трифтормуконат

неизвестные

98±1

0

0

0

2±1

78±5

2±2

1±1

5±5

14±9

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

2,4,5-трифторфенол

4,5-дифторпирокатехин

3,4,6-трифторпирокатехин

3,4-дифтормуконат

2,3,5-трифтормуконат

неизвестные

95±2

0

0

0

5±2

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Примечание. * Превращение 2,3-дифтор- и 2,3,4-трифторфенола приводило к образованию основного метаболита, дающего сигнал при сдвиге –189.9 ppm и минорного при –196.6 ppm, для 2,4- и 2,5-дифторфенолов – основной метаболит регистрировался при сдвиге –90.3 ppm и минорные при сдвигах –100.3 и –113.2 ppm (2,4-дифторфенол) и –126.1 и –113.2 ppm (2,5-дифторфенол).

Выявленные существенные различия в превращении фторфенолов родококками заключаются как в количестве образующихся интермедиатов, так и в их природе. Так, у штамма R. opacus 1G фенолгидроксилаза (ФГ) преиму-щественно осуществляла гидроксилирование фенолов во втором положении, что, сопровождаясь дефторированием, приводило к образованию соответствую-щих фторпирокатехинов, доля которых преобладала среди других интермеди-атов. Это указывало на лимитирующую роль ПК 1,2-ДО.

Для штамма R. rhodnii 135 закономерностей в природе и уровне накапливающихся интермедиатов выявлено не было. Разложение 2,3-дифтор-фенола приводило к накоплению пирокатехинов и муконатов (Рис. 3). Разложе- ние 2,3,4- и 2,3,5-трифторфенолов происходило с преимущественным накопле-нием фторпирокатехинов, утилизация 2,5-дифторфенола сопровождалась накоплением фтормуконатов. В то же время, при разложении 2,4-дифтор- и 2,4,5-трифторфенолов значительного накопления фторированных интерме-диатов не наблюдалось. Окислительное дефторированное в С2 преобладало над гидроксилированием в С6 положении. Отмечена закономерность – если на первом этапе разложения окислительное дефторирование преобладает над гидроксилированием в С6 положении (2,3,4- и 2,3,5-трифторфенолы), наблю-далось накопление пирокатехинов. В случае преимущественного гидроксили-рования в С6 положении (2,5-дифторфенол) происходила аккумуляция мукона-тов. Таким образом, разложение фторфенолов R. rhodnii 135 определялось активностью ФГ и ПК-ДО, а лимитирующий этап в их превращении был связан с активностью ферментов, превращающих муконаты.

Штамм R. rhodochrous 89 весь спектр фторфенолов разлагал с накоплением разнообразных метаболитов. Региоселективность ФГ обуславливала преиму-щественное гидроксилирование в С6 по сравнению с С2 положением.

Обнаруженные отличия штамма R. opacus 1cp по метаболитному профилю выражались в накоплении большого количества неидентифицированных фтори-рованных метаболитов. Отличие от других штаммов выражалось также в более высоком уровне накопления муконатов по сравнению с пирокатехинами. Лимитирование в данном случае происходило на более поздних этапах. Региоселективность ФГ зависела от заместителей в ароматическом кольце. Как и ФГ из R rhodnii 135 и R. opacus 1G, фермент из R. opacus 1cp был способен катализировать окислительное дефторирование, например, 2,3-дифторфенола (табл. 1, 2).

Анализ динамики разложения фторфенолов штаммами родококков показал, что только после полного исчезновения исходного субстрата количество накопленных интермедиатов начинало снижаться, сопровождаясь элиминацией фтор-иона (табл. 2, рис. 3).

Таким образом, полученные данные свидетельствовали о достаточно широкой специфичности ферментов начальной атаки у родококков.

3. Активность ферментов в бесклеточных экстрактах

Определена активность ключевых ферментов превращения (галогени-рованных) пирокатехинов. В таблице 3 приведена активность ПК 1,2-ДО в бесклеточных экстрактах, полученных при выращивании штамма R. opacus 1cp на различных ароматических субстратах. Нами показано, что скорость разложения 3-ХПК у R. rhodochrous 89, R. rhodnii 135, R. opacus 1cp, выращенного на 2-ХФ и 4-метилбензоате, а также, взятого для сравнения

Рисунок 3. 19F ЯМР спектры превращения 2,3-дифторфенола (a) R. opacus 1G, (b) R. rhodnii 135, (c) R. opacus 1cp.

Таблица 3. Удельная (относительная) активности ПК 1,2-ДО в бесклеточных экстрактах штамма R.opacus 1cp, выращенного на разных субстратах

Субстрат для ПК-ДО

Ростовой субстрат

Бензоат

2-ХФ

4-ХФ

4-МБК

ПК

3-ХПК

4-ХПК

3,5-ДХПК

0.079 (100%)

0.002 (2.5%)

0.0025 (3.15)

0.0015 (1.9%)

0.0227(100%)

0.0139(50.6%)

0.007 (26%)

0.066 (100%)

0.010 (15%)

0.060 (91%)

0.011 (17%)

0.53(100%)

0.15(29%)

штамма P. pitida 87, выращенного на 3-ХБК, примерно одинаковы, однако, было непонятно, является ли это результатом индукции нескольких диокси-геназ или определяется специфичностью одного фермента. Выделение и очис-тка ферментов позволили выяснить количество диоксигеназ в каждом случае.

4. Ферменты обычного орто-пути, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus 1cp на бензоате

Было проведено изучение ключевых ферментов обычного орто-пути разложения пирокатехина (рис. 4), индуцирующихся при росте штамма на нетоксичном субстрате, в данном случае – на бензоате. Эти исследования послужили отправной точкой и одновременно «контролем» для изучения свойств ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus 1cp на галогени-рованной ароматике. Была обнаружена активность ПК 1,2-ДО и муконатцикло-изомеразы (МЦИ). Определение относительной активности ПК 1,2-ДО с пирокатехином и замещенными пирокатехинами показало, что хлорированные субстраты расщепляются на уровне, не превышающем 3,2% от уровня превращения пирокатехина (табл. 3). Относительные скорости превращения 3- и 4-метилпирокатехинов по отношению к пирокатехину составили, соответственно, 99 и 88%.

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа в результате очистки разделялась на два пика, обозначенных как ПК ДОI-1 и ПК ДОI-2. Удельная активность ПК ДО I-1 составила 12 ед/мг белка, степень очистки – 151 раз. Удельная активность ПК ДО I-2 составила 11 ед/мг белка, степень очистки – 136 раз. Для всех даль-нейших экспериментов использовали препарат ПК ДОI-1 с более высокой удельной активностью. ПК ДОI была охарактеризована как гетеродимер, с мо-лекулярной массой 67 кДа и субъединичной молекулярной массой 35 и 33 кДа.

Определение субстратной специфичности ПК ДО показало, что актив-ность с ПК:3-МПК:4-МПК составляла, соответственно, 100:98,7:87,5%. Актив-ность с хлорированными пирокатехинами не превышала 2% по сравнению с активностью с пирокатехином. Км для пирокатехина была 3,3·10-6 М, для 4-ХПК – 17,6·10-6 М. рН оптимум ПК-ДО равнялся 7,8, температурный оптимум - 35°С.

Муконатциклоизомераза характеризовалась высокой термостабиль-ностью при 60С. Субъединичная молекулярная масса равнялась 40 кДа. Лучшим субстратом для нее был незамещенный цис,цис-муконат (Табл. 4). Скорость превращения других субстратов была минимум в три раза ниже. И хотя значения КМ для всех проверенных субстратов, за исключением 3-хлормуконата, были одного порядка, наивысшее значение константы специфичности было рассчитано для цис,цис-муконата.

МЦИ осуществляла превращение 2-хлормуконата с образованием единственного продукта – 5-хлормуконолактона (5-ХМЛ). Не было обнаружено транс-диенлактона ни спектрофотометрически, ни методом ВЭЖХ. (+)-5-ХМЛ, используемый в качестве субстрата для МЦИ, превращался в 2-хлормуконат. (+)-2-Хлормуконолактон (2-ХМЛ) не являлся субстратом для МЦИ.

Таким образом, изучение особенностей роста штамма R. opacus 1cp на бензоате показало, что утилизация данного субстрата сопровождается индук-цией ферментов, относящихся к обычному орто-пути – двух ПК 1,2-ДО и МЦИ.

Рисунок 4. Пути орто-расщепления (хлор)пирокатехинов. (A) – обычный орто-путь; (В) – 4-хлорпирокатехиновая ветвь модифицированного орто-пути.

У грам-отрицательных бактерий при росте на бензоате может индуцироваться несколько изоферментных ПК 1,2-ДО: три у Pseudomonas arvilla C-1 [Nakai et al., 1990], по две у Acinetobacter lwoffii K24 [Kim et al., 1997], Frateuria sp. ANA-18 [Aoki et al., 1984; Murakami et al., 1999], Acinetobacter radioresistens [Briganti et al., 2000] и две муконатциклоизомеразы у Frateuria sp. ANA-18 [Murakami et al., 1998], а при росте на 3-хлоранилине Pseudomonas acidovorans CA28 и на 3-хлорбензоате P. putida 87 и Pseudomonas sp. B13 были обнаружены ПК 1,2-ДО и ХПК 1,2-ДО [Hinterregger et al., 1992; Dorn & Knackmuss, 1978a].

Таблица 4. Субстратная специфичность МЦИ из R. opacus 1cp, выращенного на бензоате

Субстрат

Км (М)

Vmax

(Ед/мг белка)

Kcat

(мин-1)а

kcat /Км

(М-1мин-1)

цис,цис-муконат

2-хлор-муконат

3-хлормуконат

2-метилмуконат

3-метилмуконат

2,4-дифтормуконат

81,3±14

55,9±0,1

1240±694

66,7±23,6

48,7±10,7

36,9±3,9

5,4±0,1

13,2±6,8

3,0±0,5

4,8±0,5

<0,01б

1480

216

528

120

192

18,2

3,9

0,4

1,8

3,9

а Значение kcat рассчитывали на основании молекулярной массы равной 40 кДа;

б по данным ВЭЖХ 2-фтормуконат при концентрации 0,5 мМ не ингибирует активность ХМЦИ с 3-хлормуконатом в концентрации 0,2 мМ.

Охарактеризованные нами ферменты штамма R. opacus 1cp на первый взгляд по каталитическим свойствам были типичными представителями обычного орто-пути, однако их существенным отличием от аналогичных ферментов грам-отрицательных бактерий была способность МЦИ выбирать направление циклоизомеризации 2-хлормуконата.

5. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus 1cp на 4-ХФ

Определение активности ферментов в бесклеточном экстракте R. opacus 1cp, выращенного на 4-хлорфеноле, показало наличие всех ферментов модифицированного орто-пути, ранее описанного для грам-отрицательных бактерий, – диоксигеназы, проявляющей высокую активность не только с пирокатехином, но и с хлорированными субстратами, ХМЦИ, активной только с хлорированными муконатами (Табл. 5). Необычной была активность ДЛГ – транс-диенлактон почти не гидролизовался данным ферментом.

Таблица 5. Активность ферментов модифицированного орто-пути у штамма

R. opacus 1cp, выращенного на 4-хлорфеноле (4-ХФ) и 2-хлорфеноле (2-ХФ)

Фермент

Субстрат для определения

активности

Активность удельная (ед/мг белка) и относительная при росте штамма на

4-ХФ

2-ХФ

ПК-ДО

Пирокатехин

3-ХПК

4-ХПК

3,5-ДХПК

0,066 (100%)

0,010 (15%)

0,060 (91%)

0,011 (17%)

0,0227 (100%)

0,0139 (50.6%)

0,007 (26%)

0

МЦИ

Муконат

2-ХМ

3-ХМ

0,004 (4,3%)

0,068 (73,1%)

0,093 (100%)

0

0,046 (100%)

0

ДЛГ

транс-диенлактон

цис-диенлактон

0,016 (3,4%)

0,471 (100%)

0,0019 (1%)

0,194 (100%)

МАР

Малеилацетат (NADH)

Малеилацетат (NADPH)

0,643 (59,8%)

1,076 (100%)

Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, индуцирующаяся при росте R. opacus 1cp  на 4-хлорфеноле (4ХПК 1,2-ДО) была адаптирована к разложению субстратов, несущих заместители в пара-положении, что подтверждается значе-ниями константы специфичности, которые на порядок выше для пара-замещенных пирокатехинов по сравнению с мета-замещенными субстратами (Табл. 6). Данный факт указывает на высокую адаптацию ХПК 1,2-ДО к расщеплению именно 4-ХПК – интермедиата разложения 4-ХФ. 3-ХПК – интермедиат разложения 2-ХФ – расщеплялся данным ферментом не очень эффективно, хотя, скорее всего, этот этап не являлся бы “узким местом” деградации 2-ХФ вариантом штамма R. opacus 1cp, выращенным на 4-ХФ.

Таблица 6. Субстратная специфичность 4-ХПК-ДО из R. opacus 1ср. Значения kcat были рассчитаны, исходя из субъединичной массы 26,5 кДа.

Субстрат

Kм или Ki*, M

Vmax,

%

kcat,

min-1

kcat/Kм

min-1 M -1

пирокатехин

22,3

100

268

12

3-хлорпирокатехин

2

14

36

18

4-хлорпирокатехин

1,2

95

253

211

3-метилпирокатехин

27

208

557

21

4-метилпирокатехин

4,2

242

648

154

3-фторпирокатехин

5,7

12

33

6

4-фторпирокатехин

9,5

212

269

28,3

3-метоксипирокатехин

22,2

19

51

2,3

3,5-дихлорпирокатехин

1,2

18

49

41

3,6-дихлорпирокатехин

6,8

5

14

2

4,5-дихлорпирокатехин

1,9

5

14

7

3,4,5-ТХПК

0,7 *

-

-

-

3,4,5,6-ТетХПК

0,6 *

-

-

-

Ингибиторный анализ показал, что пирокатехины, содержащие в своем составе три или четыре атома хлора, являются конкурентными ингибиторами 4-ХПК 1,2-ДО, при этом их отличает высокое сродство к данному ферменту.

Хлор- и метилпроизводные фенола, аналоги пирокатехинов, также оказывали ингибирующее действие на изучаемый фермент (Табл. 7). Тип ингибирования был определен как конкурентный. Самыми сильными ингибиторами были трихлорфенолы. Замена галогена на метильную группу снижает сродство соединения к ферменту.

Хлормуконатциклоизомераза, выделенная из биомассы R. opacus 1cp, выращенного на 4-ХФ (ХМЦИ), не превращала 2-хлормуконата в транс-диен-лактон – реакцию, обычную в метаболизме 3-ХПК ферментами модифициро-ванного орто-пути грам-отрицательных бактерий, однако эффективно циклои-зомеризовала ряд муконатов, отдавая предпочтение 2,4-дихлор- и 3-хлор-муко-натам (Табл. 8). 3-Хлор-цис,цис-муконат, как показано, превращался ХМЦИ в цис-диенлактон.

Таблица 7. Константы ингибирования 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1ср. н.о. – не определено

Ингибитор

Ki, мкM

4-ХПК-1,2-ДО

3-ХПК-1,2-ДО

Пирокатехин

4-ХПК

Пирокатехин

фенол

1800

2000

91

2-хлорфенол

38

35

0.55

3-хлорфенол

70

80

1.02

4-хлорфенол

150

150

30.7

2,4-дихлорфенол

6

11

0.23

2,5-дихлорфенол

6

н.о.

0.127

2,6-дихлорфенол

11

н.о.

1.43

3,4-дихлорфенол

15

н.о.

0.44

3,5-дихлорфенол

41

н.о.

0.026

2,4,5-трихлорфенол

1.1

5

0.297

2,4,6-трихлорфенол

0.9

н.о.

34

2-метилфенол

1566

1750

535

3-метилфенол

943

720

4.6

4-метилфенол

878

600

65.4

Таблица 8. Субстратная специфичность ХМЦИ из R. opacus 1cp, выращенного на 4-хлорфеноле

Субстрат

Км (М)

Vmax

(Ед/мг белка)

kcat

(мин-1)а

kcat /Км

(М-1мин-1)

цис,цис-муконат

2-хлор-муконат

3-хлормуконат

2,4-дихлормуконат

2-метилмуконат

3-метилмуконат

3-фтормуконат

2-фтормуконат

6997±134

312±35

173±12

119±26

47±11

66±0,1

52±10

-б

6,5±0,1

3,3±0,3

90,9±3,3

33,5±5,6

0,084±0,007

1,2±0,01

9,1±0,7

<0,03

260

132

3640

1340

3,4

48

364

0,037

0,42

21,0

11,3

0,072

0,73

7,0

аЗначение kcat рассчитывали на основании молекулярной массы равной 40 кДа;

б по данным ВЭЖХ 2-фтормуконат при концентрации 0.5 мМ не ингибирует активность ХМЦИ с 3-хлормуконатом в концентрации 0.2 мМ.

Диенлактонгидролаза из R. opacus 1ср, выращенного на 4ХФ (ДЛГ), была очищена за 4 этапа в 93 раза. Конечный препарат имел удельную активность 30 ед/мг белка, выход по активности составил 19%. ДЛГ представляла собой мономер с массой 30кДа и была активна с цис-диенлактоном (Км = 28 М, kcat = 923 мин-1) и 2-хлор-цис-диенлактоном (Км = 2,2 М, kcat = 1190 мин-1). Константа специфичности ДЛГ для 2-хлордиенлактона, который является интермедиатом разложения 4ХФ,  была почти в 17 раз выше, чем для  неза-мещенного аналога и в 564 раза выше, чем для 2-метил-цис-диенлактона. Активность ДЛГ с транс-диенлактоном была меньше 0,5% от активности с цис-изомером. По предложенной классификации, эта ДЛГ относилась ко второй группе ферментов [Schlmann, 1994].

Превращение 2-хлормуконата ХМЦИ, выделенной из 4ХФ биомассы.

ХМЦИ превращала 3-хлор- и 2,4-дихлормуконаты в соответствующие диенлактоны без накопления интермедиатов. В случае с 2-хлормуконатом происходило образование и накопление в качестве интермедиата 5-хлормуко-нолактона (5-ХМЛ). Реакция была обратимой, и в ходе нее наступало равновесие между исходным  2-хлормуконатом и образующимся 5-ХМЛ. О прямом образовании 5-ХМЛ свидетельствовали две изосбестических точки на перекрывающихся УФ-спектрах и ВЭЖХ анализ. При этом не происходило ожидаемого (как в случае с 3-хлор- и 2,4-дихлормуконатами) образования диенлактона (рис. 5).

Рисунок 5. (А) Спектральные изменения при превращении 2-хлормуконата (максимум поглощения 270 нм) ХМЦИ из R. opacus 1cp, выращенного на 4-ХФ. Реакционная смесь (1 мл) содержала 30 мМ Tris/HCl (рН 7,0), 2 мМ MnCl2, 0,1 мМ 2-хлор-муконата и 1 г очищенного белка. УФ спектры снимали в диапазоне 190 и 360 нм каждые 2 мин. (В) Превращение (+)-5-хлормуконолактона (максимум поглощения 205 нм) (условия те же, концентрация не определена из-за недостатка субстрата).

Таким образом, характер превращения 2-хлор-цис,цис-муконата (2-ХМ) (хлор)муконатциклоизомеразами можно рассматривать как один из важных критериев при сравнительном изучении данных ферментов. Известно, что ХМЦИ из грам-отрицательных бактерий катализируют превращение 2-ХМ в транс-диенлактон, сопровождающееся выделением хлор-иона [Kuhm et al., 1990; Schmidt & Knackmuss, 1980; Vollmer & Schlmann, 1995] (Рис. 6). Это превращение осуществляется в два этапа, катализируемых одним и тем же ферментом: на первом этапе происходит образование 2-ХМЛ и 5-ХМЛ; на втором этапе дегалогенирование 5-ХМЛ приводит к образованию транс-диенлактона. Напротив, МЦИ обычного орто-пути из Pseudomonas sp B13, Pseudomonas putida PRS2000, Acinetobacter calcoaceticus ADP1 способны осуществлять превращение 2-ХМ в 2-ХМЛ и 5-ХМ, но не могут катализировать второй этап реакции – дехлорирование 5-ХМЛ [Vollmer et al., 1994]. МЦИ обычного орто-пути и ХМЦИ, индуцирующаяся при росте R. opacus 1cp на 4-ХФ, отличаются способностью выбирать между двумя возможными направле-ниями циклоизомеризации 2-ХМ, при этом образуется только один продукт – 5-ХМЛ, однако, ни один из этих ферментов не способен проводить его дальнейшего дегалогенирования. В случае с ХМЦИ 4-хлорпирокатехиновой ветви данное обстоятельство не играет никакой физиологически значимой роли, так как разложение 4-ХФ идет с образованием 4-ХПК и, соответственно, 3-хлормуконата. А способность этого фермента циклоизомеризовать 3-хлормуконат и осуществлять реакцию дегалогенирования с образованием цис-диенлактона оправдывает ее статус хлормуконатциклоизомеразы.

Рисунок 6. Превращение 2-хлормуконата МЦИ и ХМЦИ из различных штаммов. 1 – МЦИ грам-отрицательных бактерий; 2 – ХМЦИ штамма P. putida рАС27 и R. eutropha pJP4; 3 – МЦИ штамма R. opacus 1CP; 4 – ХМЦИ обеих ветвей модифицированного орто-пути штамма R. opacus 1CP; 5 – МЦИ штамма R. rhodochrous 89

В результате изучения ферментов, участвующих в разложении 4-ХФ, нами было выявлено несколько принципиальных моментов.

  1. Показано, что при росте R. opacus 1cp на 4-ХФ происходила индукция всех ферментов, описанного нами модифицированного орто-пути, что позволяет определить этот модифицированный орто-путь как “стандартный”, позволяющий сравнивать его с модифицированными орто-путями грам-отрицательных бактерий.
  2. Сравнительный анализ каталитических свойств выделенных ферментов выявил ряд существенных отличий от аналогичных  ферментов из грам-отрицательных бактерий:
  • хлорпирокатехаза отличалась необычной региоселекттивностью. Константы специфичности для субстратов с замесителями в пара-положении  были на порядок выше, чем константы специфичности для субстратов с заместителями в мета-положении.
  • ХМЦИ была способна выбирать направление циклоизомеризации 2-хлормуконата. Образуюшийся 5-хлормуконолактон не подвергался дехлорированию данным ферментом.
  • ДЛГ в отличие от ферментов из грам-отрицательных бактерий не активна с транс-диенлактоном.

Определение  структуры  метаболитов и изучение  каталитических свойств выделенных и очищенных ферментов позволило нам установить путь разложения 4-ХПК, образующегося при росте штамма R. opacus 1cp на 4-ХФ (Рис. 4). 

6. Новый модифицированный орто-путь у Rhodococcus opacus 1CР

Особенности субстратной специфичности ферментов 4-хлорпирокатехи-новой ветви не позволяли штамму R. opacus 1CP разлагать 2-хлорфенол (2-ХФ). Однако, после продолжительной адаптации был получен вариант штамма, использующий 2-ХФ в качестве единственного источника углерода и энергии [Моисеева с соавт., 1999]. Мы показали, что разложение 2-ХФ новым вариантом штамма опосредуется необычным набором ферментов и происходит с образованием 3-ХПК по новому модифицированному орто-пути.

В бесклеточном экстракте штамма R. opacus 1cp, выращенного на 2-ХФ, была определена активность ферментов: ПК 1,2-ДО, МЦИ, ДЛГ с различными субстратами (Табл. 5). ПК 1,2-ДО проявляла относительно невысокую актив-ность с хлорированными субстратами, что могло объясняться присутствием фермента обычного орто-пути. Активность с 3-ХПК была вдвое выше, чем с 4-ХПК. Не выявилось активности ХМЦИ с 3-хлормуконатом. Субстратная специ-фичность ДЛГ в экстрактах, полученных из 2-ХФ и 4-ХФ биомассы, была похожа, хотя известно, что разложение 2-ХФ проходит с образованием транс-диенлактона, а  4-ХФ – цис-изомера.

Наиболее интересным был вопрос, способна ли ХМЦИ из биомассы, выращенной на 2-ХФ, осуществлять циклоизомеризацию и дехлорирование 2-хлормуконата с образованием транс-диенлактона, как это происходит при превращении 2-хлормуконата ХМЦИ грам-отрицательных бактерий.

3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа (3-ХПК 1,2-ДО) была очищена в два этапа с выходом по активности 66%. Удельная активность фермента была 9,6 ед/мг белка. 3-ХПК 1,2-ДО была гомодимером с молекулярной массой 66 кДа, масса субъединицы равнялась 28 кДа.

Мы установили, что наибольшее сродство фермента наблюдалось к его непосредственному субстрату, 3-хлорпирокатехину, и 3-метилпирокатехину (табл. 9). В целом фермент не проявлял ярко выраженной избирательности к какому-либо субстрату. Субстратами являлись пирокатехин и его моноза-мещенные производные, в то время как дихлор- и тетрахлорпирокатехины оказывали конкурентное ингибирующее действие на фермент (Табл. 7).

Таблица 9. Субстратная специфичность 3-ХПК-ДО. Для расчета kcat использовали значение молекулярной массы субъединицы, равное 28,5 кДа, которая была рассчитана по сиквенсу гена, кодирующего 3-ХПК-ДО

Субстрат

Km или Ki*, мкM

Vmax,

Ед/мг

kcat,

мин-1

kcat/Km,

мин-1 мкM-1

Пирокатехин

2,1

16,1

458,8

218,5

3-хлорпирокатехин

1,4

11,5

327,7

234,1

4-хлорпирокатехин

3,5

10,0

285

81,4

3-метилпирокатехин

1,9

45,5

1295,3

681,7

4-метилпирокатехин

3,4

43,5

1239

364,4

3,5-дихлорпирокатехин

3,04 *

-

-

-

4,5-дихлорпирокатехин

0,0102 *

-

-

-

3,4,5,6-ТетХПК

0,059 *

-

-

-

Хлормуконатциклоизомераза, индуцирующаяся при росте на 2-ХФ, была очищена в 251 раз в три этапа, выход по активности составил 89%, удельная активность равнялась 11,6 ед/мг белка. ХМЦИ представляла собой гомооктамер с молекулярной массой нативного фермента, равной 340 кДа, и субъединичной массой 40 кДа. Фермент был активен в борат-фосфат-ацетатном буфере (рН оптимум 5,7). Температурный оптимум равнялся 65С. NH2-концевая аминокислотная последовательность определена до 18-го остатка: TXXITEMSATIVDLPSRR.

ХМЦИ характеризовалась высокой субстратной избирательностью: цис,цис-муконат, 3-хлор-, 3-метил- и 2,4-дихлормуконаты не являлись субстратами для данного фермента. ХМЦИ была активна с 2-хлор- и 2-фтормуконатами. Км для 2-хлормуконата равнялась 142,9 М, Vmax =71,43 ед/мг белка, kcat = 2850 мин-1, kcat/Kм = 19,95 min-1· M -1.

Хлормуконолактондегалогеназа (ХМЛДГ), новый фермент, обнару-женный в биомассе R. opacus 1cр,  была очищена в три этапа, удельная актив-ность составила 250 ед/мг белка. Масса субъединицы равнялась 12 кДа. Масса нативного фермента определена как 66 кДа. Таким образом, фермент состоял из 5-6 субъединиц. Определена NH2-концевая аминокислотная последователь-ность ХМЛДГ: MLYLVRMTVNLPRNLDPREEEE(?)LKASS(?).

ХМЛДГ осуществляла превращение 5-ХМЛ в цис-диенлактон, однако она не была способна к трансформации незамещенного муконолактона. Именно из-за особенностей субстратной специфичности она и получила такое название, в остальном же ХМЛДГ напоминала классические муконолактонизомеразы, ферменты обычного орто-пути разложения пирокатехина, не имеющие аналогов в 3- и 4-хлорпирокатехиновых ветвях модифицированного орто-пути [Katti et al., 1989; Prucha et al., 1996]. ХМЛДГ была термостабильна, в то время как МЛИ из штамма Pseudomonas putida быстро инактивировалась при 65. МЛИ штамма Alcaligenes eutrophus JMP134 осуществляла дехлорирование 5-хлор-3-метилмуконолактона в 3-метилдиенлактон и 5-хлормуконолактона в цис-диенлактон [Prucha et al., 1996].

Диенлактонгидролаза (ДЛГ) была очищена из 2-ХФ биомассы за 4 этапа, с выходом по активности 12%, удельная активность – 60 ед/мг белка. ДЛГ  представляла собой мономер с молекулярной массой 30 кДа, имела рН оптимум около 8,6, температурный оптимум - 40°С. Км для цис-диенлактона составила 200 М, Vmax =167 Ед/мг белка, kcat = 4633 мин-1,  kcat/Kм = 23 min-1· M -1.

Превращение 2-фтормуконатов

Субстратную специфичность ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus 1cp на 2-ХФ, изучали методом 19F ЯМР используя ряд фторпирокатехи-нов. Энзиматически  были получены 3-хлор-5-фторпирокатехин (с резонансом –126.7 ppm, рисунок 7а), 3-фторпирокатехин (-140.5 ppm, рисунок 7а), 3-хлор-6-фторпирокатехин (-142.6 ppm), 5-хлор-3-фторпирокатехин (-139.5 ppm).

Рисунок 7. 19F ЯМР анализ продуктов инкубации 2-хлор-4-фторфенола (слева) с: 1,6 мкМ 2-гидроксибифенил монооксигеназы (а); 1,4 мкМ 3-ХПК 1,2-ДО (СlcA2) (b); 0,5мкМ ХМЦИ (clcB2) (c) и 1,3 мкМ ХМЛДГ (ClcF) (d) и инкубации 3-фторпирокатехина (справа) (a) с: 1,4 мкМ ClcA2 (B); 0,5 мкМ ClcB2 (c) и 1,3 мкМ ClcF (d). В рамках приведены спектры, полученные в результате проведения сопряженного фтористо-протонного ЯМР.

После добавления 3-ХПК 1,2-ДО к полученным фторпирокатехинам происходило их превращение в соответствующие фтормуконаты. Лучшим субстратом для диоксигеназы (50% от активности с 3-ХПК) являлся 3-фторпи- рокатехин, 3-хлор-6-фтор-, 3-хлор-5-фтор- и 5-хлор-3-фторпирокатехины расщеплялись гораздо медленнее, с относительной скоростью, составляющей, соответственно, 25, 10 и 5% по сравнению с 3-ХПК.

На рисунке 7б представлены 19F ЯМР спектры превращения 3-хлор-5-фторпирокатехина. Образующийся муконат (-109.2 ppm) был идентифицирован на основе значений констант сопряжения 3J(4F,3H) и 3J(4F,5H), равных 30.7 и 21.5 Гц, соответственно, как 2-хлор-4-фтормуконат. В таблице 10 представле-ны 19F ЯМР характеристики вновь идентифицированных 2-галомуконатов.

Таблица 10. Величины 19F ЯМР химических сдвигов и идентификация фтор-муконатов и фтормуконолактонов

Соединение

Химический сдвиг (ppm)

Константы

сопряжения, Гц

Превращение

ХМЦИ

4-хлор-2-фтормуконат

-111.1

3J(2F,3H)(20.9)

Нет

2-хлор-4-фтормуконат

-109.2

3J(4F,3H)(30.7)

3J(4F,5H)(21.5) 

Да

2-хлор-5-фтормуконат

-112.0

3J(2F,3H)(20.1)

даа)

2-фтормуконатб)

-112.0

3J(2F,3H)(20.7)

Да

2-хлор-4-фтор- муконолактон

-111.7

3J(4F,5H)(19.9)

3J(4F,5H)(13.8)

продукт конверсии

2-хлор-4-фтормуконата

5-фтор-муконолактон

-201.0

2J(5F,5H)(47.4)

3J(5F,4H)(25.2)

продукт конверсии

2-фтормуконата

а) очень низкий уровень конверсии не позволил идентифицировать соответствующий муконолактон.

б) 19F ЯМР значения по Боэрсме с соавт. [Boersma et al., 1998].

Исследование превращения образующихся 2-фтормуконатов ХМЦИ показало, что в контрольной реакции без добавления ХМЦИ 2-галомуконаты теряли только около 10% сигнала за 10 часов инкубации, что свидетель-ствовало об их относительной устойчивости при рН 7,2. Известно, что муконаты, имеющие галозаместители во втором положении, особенно 2-фтор-муконат, наиболее устойчивы к действию циклоизомераз [Vollmer et al., 1998; Schmidt, Knackmuss, 1980]. Мы показали, что ХМЦИ нового модифици-рованного орто-пути R. opacus 1CP катализирует превращение этого субстрата в 5-фтормуконолактон. Инкубация ХМЦИ с 2-хлор-4-фтор- (Рис. 7в) и 4-хлор-2-фтормуконатами приводила к значительной убыли первого соединения.

Продукт реакции ХМЦИ с 2-хлор-4-фтормуконатом был идентифицирован как 2-хлор-4-фтормуконолактон на основании данных сопряженного протонно-фтористого ЯМР резонанса  (3J(4F,5H) константы, равные 19.9 и 13.8 Гц на –111.7 ppm) и фактов, что 1) из-за существенно удаленного положения атома фтора по отношению к лактоновому кольцу местное сопряжение C3-H, C4F у 4-фтормуконолактона в основном не определяется и 2) анизохрония в диастереотипичных метильных протонах приводит к неравным значениям 3JF-H констант сопряжения [Boersma et al., 2001; Schlmann et al., 1990a] (Табл. 10). По аналогии с более стабильным 4-фтормуконолактоном [Boersma et al., 2001; Schlmann et al., 1990], это соединение может подвергаться дефторированию с образованием, что наиболее вероятно, 2-хлормалеилацетата.

На рисунке 7в (справа) представлены результаты 19F ЯМР анализа инкубации 2-фтормуконата с ХМЦИ. 64%-ное снижение сигнала 2-фтормуконата при –112.0 ppm сопровождается появлением нового пика при –201.0 ppm, при этом интенсивность появляющегося пика соответствует убыли пика 2-фтормуконата. Проведенный сопряженный протонно-фтористый ЯМР (Рис. 7в, вставка) показал, что резонанс при –201.0 ppm характеризуется величиной 2J(5F,5H), равной 47.4, и 3J(5F,4H), равной 25.2 Гц, что можно отнести к 5-фтормуконолактону (Табл. 10) и находится в соответствии с литературными данными [Boersma et al., 2001; Wray, 1983].

Превращение фтормуконолактонов ХМЛДГ (ClcF).

В процессе работы были идентифицированы два новых муконолактона – 2-хлор-4-фтормуконолактон и 5-фтормуконолактон. 2-Хлор-4-фтор-муконолак-тон оказался крайне нестабильным, его дальнейшее превращение было неэнзи-матическим. 5-Фтормуконолактон был стабилен и превращался в цис-диенлак-тон с участием ClcF (Рис. 7с,d), что спектрально выражалось увеличением резонанса при –123.0 ppm, соответствующим фтор-иону. Добавление ДЛГ к препарату приводило к исчезновению цис-диенлактона (данные ВЭЖХ).

7. Клонирование генов, кодирующих превращение 3-ХПК у R. opacus 1cp

Проведенное нами секвенирование 9.5-кб вставки pROP1 выявило наличие 9-ти открытых рамок считывания (ORF) (Рис. 8): ORF1 (позиции 599–1) и ORF 2 (позиции 1229-648) имели высокую степень сходства (57 и 59%) с, соответственно, 3-гексулозо-6-фосфат синтазой и 6-фосфо-3-гексулоизомеразой из Mycobacterium gastri MB19 [Mitsui et al., 2000]. ORF3 имела сходство с несколькими регуляторами транскрипции LuxR семейства. ORF4 (позиции 4085-2802) имела 55-56% идентичности с глюкозо-6-фосфат 1-дегидрогеназами из Mycobacterium tuberculosis H37RV [Cole et al., 1998] и Streptomyces coelicolor. ORF5 (позиции 4818-5582, рассчитанная молекулярная масса 28.105 Да) показала значительное сходство с известными (хлор)пирокатехин 1,2-диоксигеназами. ORF6 (позиции 5608-6372, масса 27.400 Да) имела сходство с ДЛГ, особенно с ДЛГ из этого же штамма – 40% идентичных позиций [Eulberg et al., 1998], что позволило обозначить его как clcD2. ORF7 (позиции 6369-7484) кодирует белок (рассчитанная молекулярная масса 39.539 Да), сходный с (хлор)муконатциклоизомеразами: 46% идентичных позиций с МЦИ CatB P. putida PRS2000 [Houghton et al., 1995] и 35% с ClcB R. opacus 1cp [Eulberg et al., 1998]. NH2-концевая последовательность данного белка была идентична определенной ранее NH2-концевой последовательности ХМЦИ, выделенной из биомассы R. opacus 1cp, выращенного на 2-ХФ. Таким образом, ORF7 была определена как clcB2. ORF8 (позиции 7520-7804, рассчитанная молекулярная масса 11.193 Да), показал сходство с несколькими

Рисунок 8. (А) Рестрикционная карта вставки pROP1, несущей 9,510 бп фрагмент ДНК R. opacus 1cp (светлая полоса) в множественный сайт клонирования pBluescript II SK(+) (черная полоса). Указаны локализация и направление ORF на pROP1. Для сравнения приведены генные кластеры R. opacus 1cp для катаболизма 4-ХПК и 3,5-ДХПК (В) и незамещенного ПК (С). Гомологичные гены обозначены одинаковым цветом.

муконолактонизомеразами, особенно с метилмуконолактон изомеразой из R. eutropha JMP134 [Erb et al., 1998] – 55% идентичных позиций. Аминокислотная последовательность этого белка была идентична NH2-концевой последова-тельности ХМЛДГ, выделенной из биомассы штамма R. opacus 1cp, выращенной на 2-ХФ. На основании этого ген для нового в хлорпирокатехиновом пути белка был обозначен clcF.

Cравнение аминокислотных последовательностей 3-ХПК 1,2ДО и 4-ХПК 1,2-ДО штамма R opacus 1cp показало, что 3-ХПК 1,2-ДО была более близка к ферментам обычного орто-пути, чем к 4-ХПК 1,2-ДО (Рис. 9).

Рисунок 9. Дендрограмма, показывающая родство 3ХПК 1,2-ДО нового модифицированного орто-пути R. opacus 1cp с аналогичными ферментами.

Таким образом, изучение ферментов, участвующих в разложении 2-ХФ штаммом R. opacus 1cp, позволило выяснить следующие наиболее интересные моменты:

  1. Изначально выделенный из накопительной культуры штамм не был спосо-бен рости на ряде соединений (2-хлорфенол, 3-хлорфенол) из-за отсутствия специфических ферментов.
  2. Внесение в среду 2-ХФ привело к появлению способности штамма утилизи-ровать токсикант. Адаптация происходила благодаря появлению набора ферментов, имеющих аналоги в модифицированном орто-пути разложения (хлор)пирокатехинов и обычном пути разложения пирокатехина (Рис. 10).
  3. Факт, что выделенные ферменты характеризуются высокой специфич-ностью к интермедиатам превращения нового субстрата, указывает на неслучайность возникновения (или активизации) данного пути.

Рисунок 10. Модифицированные орто-пути разложения хлорпирокатехинов.  А – у грам-отрицательных бактерий; Б и В – у R. opacus 1cp: Б – новый модифицированный орто-путь, В – 4-хлорпирокатехиновый орто-путь.

8. Ферменты штаммов R. rhodochrous 89 и  R. rhodnii 135, R. opacus 1G, выращенных на феноле

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа штамма R. rhodochrous 89 (ПК 1,2-ДО_89) была очищена за 5 этапов с выходом по активности 15%. Фермент был гомодимером с молекулярной массой 69-70 кДа и субъединичной молекулярной массой 37 кДа. Наиболее высокой активность ПК 1,2-ДО_89 была с метилзамещенными пирокатехинами. Необычно высокой была активность с 3-ХПК (Табл. 11).

Таблица 11. Окисление замещенных пирокатехинов ПК 1,2-ДО из родококков

Субстрат для определения активности ПК-ДО

Относительная активность, %

R. rhodochrous 89

R. rhodnii 135

R. opacus 1G

Пирокатехин

3-Метилпирокатехин

4-Метилпирокатехин

3-Метоксипирокатехин

3-Хлорпирокатехин

4-Хлорпирокатехин

3,4-Дихлорпирокатехин

3,5-Дихлорпирокатехин

3,5-Дибромпирокатехин

100

161

130

2

22

5

0

0

0

100

157

134

3

20

9

0

0

0

100

16

34

н.о.

н.о.

6

0

0

0

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа штамма R.rhodnii 135 (ПК 1,2-ДО_135) была очищена за семь этапов в 103 раза, удельная активность составила 20,5 ед/мг белка, что соответствовало выходу по активности в 24%. Молекулярная масса ПК 1,2-ДО_135, как и ПК 1,2-ДО_89, составила 69-70 кДа. Субъединич-ная молекулярная масса равнялась 37 кДа. Таким образом, фермент являлся гомодимером. Оба фермента были похожи между собой и по способности окислять различные пирокатехины (Табл. 11).

Очистка пирокатехин 1,2-диоксигеназы штамма R. opacus 1G приводила к разделению пирокатехазной активности на два пика. Фермент из первого пика был крайне нестабилен и быстро инактивировался. Фермент из второго пика (ПК 1,2-ДО2_1G) был очищен за 4 этапа в 41 раз, с выходом по активности 14%. Удельная активность этой изоформы была выше, чем у других пирокатехин 1,2-диоксигеназ (29 ед/мг белка). Фермент был активен с пирокатехином, 3-МПК и 4-МПК (Табл. 11). Значения Kм для этих субстратов были 1,3 М (ПК), 1 М (3-МПК) и 1,3 М (4-МПК). Ингибиторами кон-курентного типа для ПК 1,2-ДО2_1G являлись следующие соединения: 3,5-ди-хлорпирокатехин (Ki = 0,25 M), 3,6-дихлорпирокатехин (Ki = 12,5 M), 4,5-дихлорпирокатехин (Ki = 0,5 M), 2-ХФ (Ki = 6,5 M) и 4-ХФ (Ki = 125 M).

Муконатциклоизомераза штамма R.rhodochrous 89 (МЦИ_89) была очищена за семь этапов в 186 раз, конечный препарат имел удельную активность 16 ед/мг белка. МЦИ_89 состояла из двух типов субъединиц с молекулярной массой 35,5 и 37 кДа. NH2-Концевая аминокислотная последовательность большей субъединицы определена до 27-го остатка MYKTI(K)ETLLMEIPQIRPxIIHMQQxS. NH2-Концевая аминокислотная последовательность меньшей субъединицы определена до 32-го остатка AVATMQTQTLVMVKI(K)STDDGFIGxxEATTIGG.

Превращение 2-хлормуконата МЦИ_89 сопровождалось образованием цис-диенлактона. Изучена динамика превращения метаболитов. Наиболее интенсивно конверсия 2-ХМ проходила в первые 30 мин после добавления МЦИ. Через 4 часа инкубации в смеси оставалось только 8% внесенного субстрата. В процессе трансформации образовывались 2-ХМЛ и 5-ХМЛ в качестве интермедиатов. цис-Диенлактон был единственным продуктом реакции (Рис. 11).

Рисунок 11. Динамика продуктов трансформации 2-хлормуконата МЦИ из R. rhodochrous 89, определенная ВЭЖХ. За 100% принято: 0.1 мМ для муконата, 0.09 мМ для цис-диенлактона и наибольшая площадь пиков для муконолактонов. 2-хлормуконат (1), 5-хлормуконолактон (2), 2-хлормуконо-лактон (3), цис-диенлактон (4).

Мы обнаружили, что у родококков присутствовали различные наборы ключевых ферментов при росте на различных субстратах. У R. opacus 1G при росте на феноле происходила индукция двух ПК 1,2-ДО, различающихся по стабильности. При росте штамма R. opacus 1сp на бензоате было обнаружено две ПК 1,2-ДО, различающихся по значениям Km для пирокатехина и константы ингибирования фенолом и 4-ХФ. При росте на 4-хлор- и 2-хлорфенолах у R. opacus 1сp обнаружено по одному ферменту модифицированного орто-пути.

Изоферменты ПК 1,2-ДО из P. arvilla [Nakai et al., 1988; 1990, 1995] и A. radioresistent [Briganti et al., 2000] не различались между собой по каталитическим свойствам, в то время как для изоферментов из Frateuria [Aoki et al., 1984b] и A. lwoffii [Kim et al., 1997] показаны различия в молекулярном весе и каталитических свойствах. Причины необычного набора ферментов обсуждаются в литературе. Орнстон и Парке [Ornston & Parke, 1976] подчер-кивали биологическую значимость изофункциональности белков: так как часто индукция является моментом узкоспецифичным, то возможность индукции одного из ферментов позволяет клеткам адаптироваться к условиям, существу-ющим в данный момент или к постоянному окружению, что увеличивает широ-ту ответа. Кроме того, гены разложения таких соединений, как бензоат, фенол, толуол, 2,4-Д, располагаются в различных оперонах плазмидного и хромосо-мального происхождения и имеют различные активаторы [Ehrt et al., 1995; Eulberg et al., 1997; Winstanley et al., 1987]. Таким образом, способность синте-зировать несколько ключевых изоферментов в ответ на воздействие ксенобио-тика может или повышать биодеградативный потенциал штамма и обеспечи-вать ему выживаемость в меняющихся условиях окружающей среды или отражает неспецифический ответ микроорганизмов на действие токсиканта.

9. Ферменты разложения ароматических субстратов штамма R. ruber P25

Ферменты разложения 4-ХБК

В плане сравнительного изучения хлорированных ароматических соединений родококками нами был использован штамм R. ruber P25, характе-ризующийся широким биодеградативным потенциалом и способный полностью разлагать ряд устойчивых токсикантов, в том числе хлорбифенилы. Поскольку промежуточным метаболитом при разложении полихлорированных бифенилов является 4-хлорбензоат (4-ХБК), были изучены ферменты, участвующие в деструкции этого соединения.

Путь разложения 4-ХБК схематично можно представить следующим образом (Рис. 12):

Рисунок 12. Путь разложения 4-ХБК и возможные сайты расщепления протокатеховой кислоты (ПКК). ПОБК – пара-гидроксибензоат, ПКК ДО – протокатехоат диоксигеназа.

В бесклеточном экстракте R. ruber P25 были определены активности пара-гидроксибензоат гидроксилазы (ПОБГ) и ПКК-ДО.

пара-Гидроксибензоат гидроксилаза (ПОБГ) была очищена в 71 раз, выход по активности составил 15.4%. ПОБГ содержала две субъединицы с молекулярной массой 43 кДа и 45кДа. Удельная активность ПOБГ равнялась 11,67 ед/мг белка, КмПОБК = 9,85 мкМ, КмNADH = 14,2 мкМ. Удельная активность ПОБГ при внесении NAD(P)H составила 14,25% от удельной активности ПОБГ при внесении NADH.

Протокатехоат диоксигеназа (ПКК ДО). Раскрытии ароматического кольца4-ХБК, как правило, катализирует протокатехоат 3,4-диоксигеназа – интрадиольная диоксигеназа, хорошо изученная у грам-отрицательных бактерий. В литературе также описаны две экстрадиольные ПКК диоксигеназы – ПКК 4,5-ДО и ПКК 2,3-ДО. ПКК ДО была очищена в 18,7 раз, выход по активности составил 47,2%. Удельная активность ПКК-ДО равнялась 15 ед/мг белка, Км = 5,26 мкМ, фермент был термолабилен, расщепление протокатехоата происходило по С4-С5 с образованием полуальдегида 2-окси-4-карбокси-цис, цис-муконовой кислоты.

Ферменты разложения пара-гидроксибензоата штаммом R. ruber P25

Рост R. ruber P25 на среде с ПОБК, одним из ключевых интермедиатов разложения ПХБ, сопровождался индукцией ПОБГ и ПКК ДО. ПКК расщеплялась между C3-C4 атомами, что свидетельствовало о различии свойств ПКК ДО, индуцирующейся при росте Р25 на 4-ХБК и ПОБК. Очистка ПКК 3,4-ДО сопровождалась разделением фермента на две активные фракции. Очищенные ПКК 3,4-ДО различались по каталитическим характеристикам. Так, значение Км ПКК 3,4-ДОI для ПКК равнялось 7.7 М, Км ПКК 3,4-ДОII для ПКК было 83 М. ПКК 3,4-ДО II окисляла ПКК со скоростью, вдвое превосхо-дящей скорость окисления этого субстрата ПКК 3,4-ДОI. Дальнейшая очистка приводила к значительной инактивации ПКК 3,4-ДОII, ПКК 3,4-ДО I была стабильна. Удельная активность конечных препаратов ПКК 3,4-ДОI и ПКК 3,4-ДОII составила, соответственно, 143 и 85 Ед/мг белка.

10. Ферменты разложения пара-толуата (4-метилбензоата) у родококков

Ферменты орто-пути у R.opacus 1cp

В бесклеточном экстракте R. opacus 1cp скорость окисления 4-ХПК и 4-МПК составляла, соответственно, 29% и 250% от скорости окисления пирокатехина. В результате очистки получены две ПК 1,2-ДО, различающихся по субстратной специфичности.

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа I была очищена в 14 раз с удельной активностью 7,48 ед/мг белка, выход соответствовал 1,53 %. SDS-электро-форез показал наличие в препарате двух полос с молекулярной массой 33 и 35 кДа. NH2-концевая последовательность субъединицы массой 33 кДа определена до 15 остатка (KAERATANTSPERLA). Фермент имел выраженный температур-ный оптимум при 40-50°С.

ПК 1,2-ДОI катализировала окисление с наиболее высокой скоростью  пирокатехина, 3МПК и 4-МПК (табл. 12) Активность с 4-ХПК составляла всего 2,09% от максимальной, а с 3,5- и 4,5-дихлорпирокатехинами активность отсутствовала.

Таблица 12. Кинетические характеристики пирокатехин 1,2-диоксигеназы I. При расчете kcat брали усредненную субъединичную массу 34 кДа.

Субстрат

Km, M

Vmax, ед/мг

kcat, мин-1

kcat/Km, мин-1·M-1

Пирокатехин

3-метилпирокатехин

4-метилпирокатехин

6,5

20,0

9,1

9,1

25

10

309,1

850,0

340,0

47,9

42,5

37,4

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа II была очищена в 18 раз за пять этапов, выход составил 37%, удельная активность составила 9,7 ед/мг белка. Субъединичная молекулярная масса ПК 1,2-ДО II равнялась 26-27 кДа. Определена NH2-концевая аминокислотная последовательность исследуемого фермента, АNTRVIELFDEFTDLIRDFIVRHEITTPEYETI, которая полностью соответствовало NH2-концевой последовательности ХПК 1,2-ДО, индуцирую-щейся при росте R.opacus 1cp на 4-ХФ [Eulberg et al., 1998].

Каталитические свойства ПК 1,2-ДОII. Фермент был способен катализировать окисление широкого круга замещённых пирокатехинов. Относительная активность ПК 1,2-ДО II с ПК : 4ХПК : 3МПК : 4МПК : 3,5-ДХПК составила, соответственно 100 : 113 : 191 : 253 : 22%, что было похоже на результаты, полученные для 4-ХПК 1,2-ДО.

Муконатциклоизомераза (МЦИ) была очищена в четыре этапа, удельная активность МЦИ с муконатом возросла с 0,02 ед/мг белка до 1,92 ед/мг белка, что соответствовало очистке в 96 раз. Выход по активности составил 37,3 %. Субъединичная молекулярная масса МЦИ была 40 кДа. МЦИ катализировала превращение ряда замещённых (3-хлор-, 2- и 3-метил-) муконатов с относительной активностью 14, 6 и 28% по отношению с муконату, соответственно, по этим свойствам была похожа на фермент того же штамма, индуцирующийся при росте на бензоате.

Набор ферментов, индуцирующихся у R. opacus 1cp при росте на пара-толуате, является необычным. Известно, что индукторами для пирокатехаз и муконатциклоизомераз могут служить бензоат и сам муконат, поэтому оправданной является индукция МЦИ и ПК 1,2-ДО обычного орто-пути. Присутствие еще одной диоксигеназы, а именно 4-ХПК 1,2-ДО, при отсутствии параллельной индукции ХМЦИ свидетельствуют о более сложном ответе на новый для штамма субстрат, что, с одной стороны, позволяет ему эффективно разлагать данное соединение, избегая непродуктивной индукции фермента (ХМЦИ), малоэффективного в отношении образующегося 3-метилмуконата, а, с другой, возможно, может служить примером возникновения нового метаболического пути.

Ферменты разложения пара-толуата у штамма R. ruber P25

В бесклеточном экстракте, полученном из биомассы, выращенной на пара-толуате, обнаружена активность ПК 1,2-ДО и МЦИ.

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа (ПК 1,2-ДО) была очищена в 3 этапа, удельная активность составила 5,4 ед/мг белка, температурный оптимум  30С, рН оптимум – 7.2-7.4; фермент был активен с пирокатехином, 3-метил-пирокатехином, 4-метилпирокатехином: удельная активность равнялась 5,7, 11,1 и 6,7 ед/мг белка, соответственно, активность с 3-ХПК и 4-ХПК была 2% от активности с пирокатехином. Ряд соединений конкурентно ингибировал  активность ПК 1,2-ДО с пирокатехином со значениями константы ингибирова-ния  0,3 М (3,5-ДХПК), 05 М (4,5-ДХПК), 0,4 М (3,6-ДХПК), 1 М (тетра-хлорпирокатехин), 27 М (2-ХФ). 4-МБК, 4-ХБК, взятые в концентрации до 200 мкМ, не ингибировали активность этой ПК 1,2-ДО.

Муконатциклоизомераза была очищена в 36 раз, удельная активность равнялась 2.2 ед/мг белка. МЦИ была стабильна при 60С; Км для муконата равнялась 6,67 мкМ; отсутствовала активность с 2-хлормуконатом.

Наши данные по субстратной специфичности пирокатехин 1,2-диокси-геназ родококков находятся в соответствии с данными, полученными другими авторами, и позволяют выделить в первую очередь два типа ферментов:

Первый – пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-пути, проявляю-щие узкую субстратную специфичность;

Второй – хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы модифицированных орто-путей (можно сказать, что их количество/специфичность зависит от того, сколь-ко различных хлопирокатехинов может образоваться в качестве ключевых интермедиатов разложения хлорированных ароматических соединений), характеризующиеся высоким сродством к хлорированным субстратам и широкой субстратной специфичностью.

Однако, нельзя обойти вниманием еще один тип интермедиатов, а именно метилпирокатехинов, образующихся при разложении ряда ароматических со-единений, например, метилбензоатов (толуатов) или метилфенолов (крезолов). Микробная деградация метилзамещённой ароматики обычно проходит через мета-путь расщепления метилпирокатехинов, так как их орто-расщепление приводит к образованию «dead-end» продуктов – метилзамещенных 4-карбок-симетилбут-2-ен-4-олидов (метилмуконолактонов) [Catelani et al., 1971; Knackmuss et al., 1976]. Особый интерес представляет разложение 4-метилмуко-нолактона, поскольку наличие алкильного заместителя при С-4 атоме препят-ствует дальнейшему разложению этого соединения по классическому 3-оксо-адипатному пути [Erb et al., 1998]. Тем не менее, обнаружено несколько исключений: у штаммов R. eutropha JMP134, Rhodococcus sp. и Rhodococcus rhodochrous N75 описаны модифицированные орто-пути для разложения ме-тилпирокатехинов, причем у наиболее изученных R. eutropha и R. rhodochrous N75 эти пути различались [Bruce, Cain, 1988; Pieper et al., 1985; Cha et al., 1998].

Проведенное нами изучение процессов разложения метилбензоата родо-кокками показало, что они используют орто-путь расщепления метилпирокате-хина. Мы обнаружили наличие фермента с широкой субстратной специфично-стью у штамма R. opacus 1cp. Хотя, согласно литературным данным, ПК 1,2-ДО-зы считались ферментами с узкой субстратной специфичностью, это не противоречит полученным нами результатам, так как в большинстве случаев о широте субстратной специфичности судили на основании сравнения скоростей окисления  пирокатехина и галогензамещенных субстратов, с которыми и в наших исследованиях была показана низкая активность фермента.

ПК 1,2-ДО из R. ruber P25, выращенного на 4МБК, отличается от известных диоксигеназ: ПК 1,2-ДО обычного орто-пути у описанных ранее штаммов окисляют 3-МПК и 4-МПК со скоростью, не превышающей скорость окисления пирокатехина (Таблица 13), скорость окисления хлорпиро-катехинов, как правило, незначительна.

ХПК 1,2-ДО модифицированного орто-пути окисляют 3-МПК и 4-МПК со скоростью, составляющей 200-300% от скорости окисления пирокатехина, вместе с тем, ферменты активны с хлорированными субстратами.

ПК 1,2-ДО из R. ruber P25 окисляет метилпирокатехины со скоростью, превышающей скорость окисления пирокатехина, но этот фермент харак-теризуется низкой активностью с хлорированными субстратами (Таблица 13).

Полученные нами данные, касающиеся особенности индукции ферментов, участвующих в разложении 4-МПК, и их субстратной специфичности у R. opacus и 1cp и R. ruber P25, указывают на особенности метаболизма пара-толуата исследованными бактериями и свидетельствуют о наличии еще одного типа пирокатехин 1,2-диоксигеназ – метилпирокатехаз (МПК 1,2-ДО).

Таблица 13. Скорости окисления пирокатехина (ПК), 3-метилпирокатехина (3МПК) и 4-метилпирокатехина (4МПК) пирокатехин диоксигеназами (ПК 1,2-ДО) и хлорпирокатехин диоксигеназами (ХПК 1,2-ДО) из различных бактерий

Бактерия

Ростовой субстрат

Фермент

Отн. активность, %

Субстрат ПК 1,2-ДО

ПК

3-МПК

4-МПК

P.arvilla C1

бензоат

ПК 1,2-ДО

100

5,4

94,6

Pseudomonas sp B13

бензоат

ПК 1,2-ДО

100

11

Но

Alcalig. eutrophus CH3

бензоат

ПК 1,2-ДО

100

20

Pseudomonas sp PS12

бензол

ПК 1,2-ДО

100

68

82

R. eutropha JMP 134

2,4-Д

ПК 1,2-ДО

100

41

Но

Acinetobacter lwoffii

анилин

ПК 1,2-ДОI

100

3

39

ПК 1,2-ДОII

100

22

51

Acinet. calcoaceticus

бензоат

ПК 1,2-ДО

100

12

18

Acinet. radioresistens

фенол

ПК 1,2-ДО

100

14,4

16,5

Rhod. rhodochrous В259

бензоат

ПК 1,2-ДО

100

79

68

Rhod.  Rhodochrous N75

п-толуат

ПК 1,2-ДО

100

64

83

R. opacus 1cp

бензоат

ПК 1,2-ДО

100

99

88

п-толуат

ПК 1,2-ДО

100

73

89

ХПК 1,2-ДО

100

208

242

Rhodococcus ruber P25

п-толуат

МПК 1,2-ДО

100

195

117

Pseudomonas sp B13

3-ХБК

ХПК 1,2-ДО

100

337

Но

Pseudomonas sp PAC 27

3-ХБК

ХПК 1,2-ДО

100

Но

300

R. eutropha JMP 134

2,4-Д

ХПК 1,2-ДО

100

167

Pseudomonas sp PS12

1,2,4-ТХБен-л

ХПК 1,2-ДО

100

319

230

Pseudomonas putida 87

3-ХБК

ХПК 1,2-ДО

100

235

187

Pseudomonas sp P51

хлорбензол

ХПК 1,2-ДО

100

202

189

Xantobacter phlavus

дихлорбен-л

ХПК 1,2-ДО

100

239

168

Pseudomonas acidovorans

2-хлоранилин

ХПК 1,2-ДО

100

307

205

Rhodococcus opacus 1cp

2-хлорфенол

ХПК 1,2-ДО

100

283

270

4-хлорфенол

ХПК 1,2-ДО

100

208

242

Но – не определяли, 1,2,4-ТХБен-л – 1,2,4-трихлорбензол.

11. Пространственная структура хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ

Сравнение гомологичных ферментов обычного и модифицированных орто-путей, участвующих в разложении ароматических соединений, из ряда бактерий, выращенных на разных субстратах, показало, что физико-химические и каталитические свойства таких ферментов различаются, хотя ферменты катализируют одинаковые реакции. Наиболее наглядно это наблюдение проявляется в случае раскрытия ароматического кольца пирокатехинов (хлор)пирокатехазами. Так, у штамма R. opacus 1ср при росте на 2-ХФ и 4-ХФ индуцируются два фермента, значительно различающихся по субстратной спе-цифичности. Вместе с тем, полученные нами данные, касающиеся структуры центральной части активного центра этих ферментов (железо (III), пятикоординированное остатками двух молекул гистидина, двух молекул тирозина и воды), указывают на то, что эта часть фермента не отличается по структуре от других интрадиольных диоксигеназ, таких как протокатехоат 3,4-диоксигеназы, пирокатехин 1,2-диоксигеназы и гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы. Таким образом, необходимо было сравнить пространственную структуру этих ферментов с тем, чтобы выявить факторы, опосредующие различия в субстратной специфичности изучаемых диоксигеназ.

Механизм реакции и пространственную структуру активного центра и молекул нативного белка диоксигеназ в основном изучали на примере протокатехоат 3,4-диоксигеназ, ПК 1,2-ДО были изучены незначительно [Funabiki et al., 1990; Ohlendorf et al., 1988; 1994]. Показано, что атом железа активного центра ферментов координирован двумя тирозиновыми, двумя гистидиновыми аминокислотными остатками и гидроксилом воды. На всех стадиях реакции железо не изменяет заряда. Долгое время все попытки получить ПК 1,2-ДО в кристаллическом виде были неудачны.

Нами были получены 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1cp в кристаллическом виде, пригодном для рентгено-структурного анализа и расшифрована пространственная структура этих ферментов.

Кристаллы 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы, полученные в растворе, содержащем 1,6 М (NH4)2SO4, 0,1 M NaCl, 100 мМ Tris/HCl, pH 9,0, 5-15% глицерин, имели размер 0.4 х 0.4 х 1.0 мм (Рис. 13), их хранили в жидком азоте в присутствии 30% глицерина как криопротектора. Кристаллы 4-ХПК 1,2-ДО принадлежат к первичной гексагональной пространственной группе Р6322, с размерами элементарной ячейки а = b = 90.4, с = 307.5 . Исходя из присутствия одной молекулы на одну ассиметрическую единицу, раствор составляет около 61% ячейки (Vм = 3.13 3 Да-1 [Mattews, 1968].

Рисунок 13. Кристаллы 4-ХПК 1,2-ДО (слева) и 3-ХПК 1,2-ДО (справа)

Кристаллы 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы,  полученные в буфере,  содержащем 0,3 М Mg(CH3CO2)2, 0,1 М HEPES, pH 7,5, 15% ПЭГ 8000, 5% глицерин, достигали максимальных размеров 0.2 х 0.5 х 0.5 мм (Рис. 13) и были заморожены в жидком азоте, 25% ПЭГ 400 добавляли к маточному раствору как криопротектор. Они принадлежат к первичной триклинной простран-ственной группе P1 Рассчитано, что на ассиметрическую единицу приходится четыре димера (FeIII)2 (молекулярная масса мономера 29 кДа).

До сих пор, помимо проводимых нами исследований, получены в кристаллическом виде еще две ПК 1,2-ДО - из штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13259 [Strachan et al., 1998] и из A. calcoaceticus ADP1 [Vetting & Ohlendorf, 2000]. Однако, структура ПК 1,2-ДО из R. rhodochrous расшифрована не была. В настоящее же время основное сравнение полученных нами структур проводится с ПК 1,2-ДО из A. calcoaceticus ADP1.

Трехмерная структура молекул хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ

4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

Изучение пространственной структуры 4-ХПК 1,2-ДО показало, что конечная модель содержала 2-257 аминокислот каждого мономера, два атома Fe(III), две молекулы бензоата, две молекулы фосфолипида, 284 молекулы воды и молекулу Tris буфера. На рисунке 14 схематически представлена вторичная структура фермента, полученная на основании его аминокислотной последова-тельности, на рисунке 15 – его третичная структура. Установлено, что молеку-ла фермента состоит из двух каталитических доменов, связанных линкерным доменом. Общая структура каталитических доменов образована рядом -слоев и несколькими редкими спиралями, соединенных неупорядоченной структурой. Линкерный домен образован -спиралями обоих мономеров и находится в центре молекулы. Линкерный домен образован двумя длинными (H1 и H2) и тремя короткими (H3-H5) -спиралями каждой субъединицы: четыре спирали с NH2-конца каждого мономера образуют петлю, которая взаимодействует с подобным мотивом другой субъединицы, и с пятой петлей, вытянутой из каталитического домена.

Рисунок 14. Вторичная структура 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1cp

Центральная часть каталитического домена образована рядом -слоев, собранных в -сэндвичи, и нескольких редких колец, расположенных между линкерным доменом и -сэндвичем. Металл активного центра расположен в участке редких колец, ограничен с одной стороны системой -сэндвича каждого мономера, с другой – -цепями линкерного домена. Гидрофобный вход в активный центр образован остатками Leu-49, Pro-77, Phe-78, Ile-171 (Pro-172) и скелетом лигандов железа Tyr-134 и Tyr169.

Рисунок 15. Модель третичной структуры 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1cp (вверху) и она же, повернутая на 90° вдоль горизонтальной оси (внизу).

Молекула 4-ХПК 1,2-ДО содержит два связанных фосфолипида, что, вероятно, характерно для ферментов этого класса [Vetting and Ohlendorf, 2000]. Точной идентификации этого соединения проведено не было из-за отсутствия электронной плотности головной части. В данном случае эти молекулы были смоделированы на основе молекулы фосфатидилхолина с двумя С14/С15 гидрофобными хвостами. Обе фосфолипидные структуры локализованы в пространстве между двумя субъединицами, каждая – в конце большого гидрофобного канала, образованного петлями Н1 и Н2 обоих мономеров, с головными группами, направленными наружу в раствор, и с хвостовыми частями, направленными внутрь друг к другу. Функциональной роли фосфолипидов в молекуле ферментов пока не дано какого-либо объяснения.

3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

Конечная модель включала 2-257 аминокислотный остаток каждой субъединицы, два атома Fe(III), два бензогидроксамата, два фосфолипида, 284 молекул воды и одну молекулу Tris буфера. Вторичная структура этого фермента представлена на рисунке 16.

Усредненная модель димера содержит два каталитических домена, образованных четырьмя β-слоями и несколькими редкими кольцами, и линкерным доменом, образованным несколькими α-спиралями обоих мономеров и расположенных в центре молекулы. Каждая субъединица содержит каталитический пакет с атомом железа(III), доступный для субстрата с наружной стороны молекулы. Таким образом, пространственная структура 3-ХПК 1,2-ДО в целом была сходна со структурой 4-ХПК 1,2-ДО.

Сравнение активных центров диоксигеназ

Идентифицируя аминокислотный состав активного центра фермента, мы установили, что в центре содержится мононуклеарный ион Fe(III), связанный с остатками Tyr-134, Tyr-169, His-194 и His-196. His2Tyr2 координация является

Рисунок 16. Вторичная структура 3-ХПК 1,2-ДО.

типичной для интрадиольных диоксигеназ расщепления кольца [Lange & Que, Jr. 1998; Briganti et al., 2000]. Данные рентгено-структурной абсорбционной спектроскопии показали, что нативный фермент является пятикоорди-нированным с двумя сферами атомов: или два 1.9 и три 2.1 или три 1.9 и два 2.1 [Benvenuti et al., 1999].

Каталитический карман 4-ХПК 1,2-ДО (Рисунок 17) образован несколькими аминокислотными остатками: Leu-49, Asp-52, Ala-53 H3 петли; Ile-74, Gln-75, Gly-76, Pro-77, Phe-78, Phe-79 участка отдельных петель; Trp-126 cлоя S3; лиганд железа Tyr-134 второй редкой петли; Tyr-169 S6 слоя; Ile-171 третьей редкой петли; Arg-191 слоя S7; His-194 и His-196 слоя S8; Gln-210 слоя S9; Cys-224 редкой петли.

Рисунок 17. Наложение структуры активного центра 4-ХПК 1,2-ДО и ПК 1,2-ДО из A. calcoaceticus (номера аминокислотных остатков указаны в скобках).

Каталитический карман 3-ХПК 1,2-ДО образован несколькими аминокислотными остатками: Leu49, Asp52, Val53 петли H3, Ile74, Gln75, Gly76, Pro77, Tyr78, Phe79 одиночной редкой петли, Trp125 из слоя S3, лигандов железа Tyr133 из второй редкой петли, Tyr167 слоя S6, Ile169 третьей редкой петли, Arg188 слоя S7, His191 и His193 из слоя S8, Gln207 из слоя S9 и Ala221 редкой петли. Остатки Leu49, Pro77, Tyr78, Ile169 и скелетные цепи лигандов железа Tyr133 и Tyr167 образуют гидрофобный вход в активный центр. Каталитический центр 3-ХПК 1,2-ДО содержит атом (III), связанный с остатками четырех аминокислот: Tyr 133, Tyr 167, His 191 и His193.

Дополнительные плотности, определенные как молекулы бензогидро-ксамата в координационной сфере железа 3-ХПК 1,2-ДО и бензоата  у 4-ХПК 1,2-ДО, были также обнаружены в структуре гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы из Nocardiodes simplex 3E (Ferraroni et al., 2006). Их присутствие можно объяснить, если допустить, что эта плотность является фрагментом сидерофора. Фактически, бактерии и грибы обладают сложной системой, основанной на сидерофорах, для приобретения, транспортировки и использования атомов железа. Грам-положительные бактерии, в том числе и родококки, обладающие толстой липоидной клеточной оболочкой, действующей как барьер для различных материалов, разработали более сложные системы переноса, чем у других бактерий [Ratledge & Dover, 2000]. Среди нескольких структурно-различных молекул, которые, как предполагается, участвуют у микобактерий в получении железа, есть сложные сидерофоры, чья способность хелатировать железо определяется орнитин-производными гидроксаматами [Carrano et al., 2001; De Voss et al., 1999], что позволяет объяснить присутствие их фрагментов в активном центре диоксигеназ.

Таким образом, пространственная структура одной субъединицы 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО модифицированных орто-путей штамма R. opacus 1cp в целом обладает рядом сходных черт. Но сравнение аминокислотных последовательностей 4-ХПК 1,2-ДО с 3-ХПК 1,2-ДО показывает (Рис. 18), что несколько участков, аминокислотные остатки которых составляют активный центр, имеют значительные замены. Особенно это заметно в выровненных последовательностях ХПК 1,2-ДО штаммов P. putida pAC27, R. eutropha pJP4, P. chlororaphis RW71 и 3-ХПК 1,2-ДО R. opacus 1cp, которые более специфичны к 3-ХПК [Pieper et al., 1988; Broderick & O’Halloran, 1991; Maltseva et al., 1994; Potrawfke et al., 1998]. Мы предполагаем, что возможной причиной наблюдаемых различий в субстратной специфичности диоксигеназ может быть замена остатка Val и Tyr (последний взаимодействует с заместителем субстрата в положении 3), у 3-ХПК 1,2-ДО(з) на Ala-53 и Phe-78, соответственно, у 4-ХПК 1,2-ДО. Кроме того, из Cys-223 и 224, которые являются консервативными у всех хлорпирокатехиндиоксигеназ и, как предполагается, важны для связывания хлорированных заместителей, у 4-ХПК 1,2-ДО присутствует только Cys-224, а 223 заменен на Ser [Vetting & Ohlendorf, 2000]. Более того, эти два остатка цистеина полностью отсутствуют у 3-ХПК 1,2-ДО, таким образом, сводя на “нет” приписываемую им функцию выбора субстрата.

Рисунок 18. Сравнение аминокислотных последовательностей 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1cp.

Arg188 и Gln207 консервативны во всех ПК 1,2-ДО и ПКК 3,4-ДО, и, как показано, определяют расположение субстрата, его депротонирование путем ван-дер-ваальсового взаимодействия с кольцом, что предотвращает его вращение в двух экваториальных плоскостях и/или обеспечивая электростатический противозаряд для создания электронной плотности на углеродных атомах кольца.

Наложение активных центров диоксигеназ по четырем лигандам железа (Tyr 133/134, Tyr 167/169, His 191/194 и His193/196 у 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО, соответственно) (Рис. 19) ясно показывает, что только несколько аминокислотных замен наблюдается в каталитической полости, из них наиболее видимые Val53/Ala53, Tyr78/Phe78 и Ala221/Cys224 (3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО, соответственно), в то время как другие остатки, за исключением некоторых незначительных сдвигов в скелетных и боковых цепях, остаются одинаковыми.

Таким образом, сравнение активных центров 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus cp позволило выявить аминокислотные остатки, участвующие в связывании субстратов, и на этой основе определить те аминокислоты, замена которых может определять различия в субстратной специфичности данных ферментов.

Заключение

Родококки, являясь представителями большой таксономической группы нокардиоподобных микроорганизмов, до недавнего времени оставались

Рисунок 19. Сравнение активных центров 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1cp.

довольно слабо изученными в отношении их биодеградативного потенциала, в частности, практически не были изучены ферменты, участвующие в разло-жении ароматических соединений и их галогенированных и метилзамещенных аналогов. Проведенный нами скрининг среди бактерий рода Rhodococcus  выя-вил активные штаммы-деструкторы ароматических соединений. Для изучения их метаболческого потенциала были использованы субстраты, различающиеся по степени влияния на клетку: токсичные галофенолы, менее токсичные фенол и бензоат, которые, тем не менее, служат консервантами, и метилбензоат.

Проведенные нами исследования показали, что ответ клетки на внесение ароматических соединений носит многосторонний характер, который мы отмечали на всех уровнях ее организации, начиная от аминокислотного состава ферментов и заканчивая ростовыми характеристиками. В таблице 14 суммиро-

Таблица 14. Ферменты и биодеградативные пути у родококков, описанные в данной работе

Ростовой субстрат

Тип пути

Ферменты

Особенности

Примечание

Rhodococcus rhodochrous 89

фенол

обычный орто-путь

ПК 1,2-ДО

высокая активность с 3-ХПК


МЦИ

активна с 2ХМ, два интермедиата (2ХМЛ, 5ХМЛ), образуется цис-диенлактон

отличается от всех известных (Х)МЦИ

Rhodococcus rhodnii 135

фенол

обычный орто-путь

ПК 1,2-ДО

высокая активность с 3-ХПК


Rhodococcus opacus 1G

фенол

обычный орто-путь

ПК 1,2-ДО

два изофермента, различающиеся по стабильности


Rhodococcus opacus 1cp

бензоат

обычный орто-путь

МЦИ

способность выбирать направление циклоизомеризации 2-ХМ

пара-толуат

обычный орто-путь

ПК 1,2-ДО

широкая субстратная специфичность

ХПК 1,2-ДО

присутствие дополнительного фермента из 4-ХПК ветви модифицированного орто-пути

4-ХФ

модифицирован-ный орто-путь

у родококков охарактеризован впервые

4-ХПК 1,2-ДО

специфичность к субстратам с заместителями в пара-положении

впервые расшифрована пространственная структура фермента, размещена в RCSB базе данных под номером 1S9A

ХМЦИ

способность выбирать направление циклоизомеризации 2-ХМ

ДЛГ

специфична к цис-диенлактонам

2-ХФ

новый модифицирован-ный орто-путь

описан впервые, аналогов нет

3-ХПК 1,2-ДО

активна с 3-хлорпирокатехином

впервые расшифрована пространственная структура фермента, размещена в RCSB базе данных под номером 2BOY;

нуклеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером O67987

ХМЦИ

Высокая специфичность; способность выбирать направление циклоизомеризации 2-ХМ

нуклеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером CAD 28144

ХМЛДГ

Активна с 5-хлормуконолактоном

нуклеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером CAD28145

ДЛГ

специфична к цис-диенлактонам

нуклеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером CAD28143

Rhodococcus ruber P25

4-ХБК

ПОБГ

специфичность к NADH

ПКК 4,5-ДО

экстрадиольное раскрытие ароматического кольца

ПОБК

ПКК 3,4-ДО

два изофермента, различающихся по скорости раскрытия кольца ПКК

пара-толуат

обычный орто-путь

ПК 1,2-ДО

активность с метилпирокатехинами выше, чем с пирокатехином, низкая активность с хлорпирокатехинами

новый тип пирокатехин 1,2-диоксигеназ

ваны данные, полученные в настоящей работе с акцентом на выявленные осо-бенности ферментов и путей разложения ароматических соединений родококками.

Изученная нами способность родококков разлагать ароматические соединения показала, что эти штаммы осуществляли трансформацию или полную утилизацию различных соединений. Этот факт является свидетельством разнообразия ферментных систем, участвующих в разложении ароматических соединений  родококками. Эксперименты по разложению фторфенолов клетками R. opacus 1cp, R. rhodnii 135 и R. rhodochrous 89 убедительно показали, что эти штаммы способны в условиях кометаболизма осуществлять трансформацию ди- и трифторированных фенолов с различной степенью глубины данного процесса, а широта субстратной специфичности ферментов, катализирующих первые этапы разложения субстратов, определяла степень этой “глубины”.

В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что у родококков присутствовали различные наборы ключевых ферментов при росте на ароматических субстратах. Так, у R. opacus 1G при росте на феноле происходила индукция двух ПК 1,2-ДО. При росте штамма R. opacus 1сp на бензоате было обнаружено две ПК 1,2-ДО, при росте на 4-хлор- и 2-хлорфенолах – по одному ферменту модифицированного орто-пути, на 4-метилбензоате - ПК 1,2-ДО и ХПК 1,2-ДО 4-хлорпирокатехиновой ветви. Изоферменты различались по стабильности и каталитическим характеристикам. Таким образом, способность индуцировать несколько ключевых изоферментов в ответ на воздействие ксенобиотика может или повышать биодеградативный потенциал штамма и обеспечивать ему выживаемость в меняющихся условиях окружающей среды или отражает в какой-то мере неспецифичный ответ микроорганизмов на действие токсиканта.

Особенно наглядным примером адаптации родококков к изменяющимся условиям культивирования является показанная нами на примере штамма R. opacus 1cp способность адаптироваться к росту на изначально неростовых субстратах, путем приобретения пути, ферменты которого характеризуются высокой специфичностью к новым субстратам.

Проведенные исследования существенно расширили представления о каталитических и структурных свойствах ферментов, участвующих в разложении токсичных соединений у родококков. Впервые были обнаружены, выделены в гомогенном виде и охарактеризованы ферменты 4-хлорпирокате-хиновой ветви модифицированного орто-пути, описан новый модифици-рованный орто-путь разложения 3-хлорпирокатехина и проведен сравнитель-ный анализ гомологичных ферментов родококков и грам-отрицательных бакте-рий. Такой подход позволил выявить наличие существенных различий в катали-тических свойствах сравниваемых ферментов, и в целом свидетельствовал о высокой адаптации ферментов родококков к превращению интермедиатов, образующихся в результате разложения разных токсикантов.

Одним из основных итогов данной работы явилось выявление факторов, определяющих различия в субстратной специфичности ключевых ферментов разложения ароматических соединений на примере хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. Эти работы явились новым шагом на пути понимания механизмов разложения чужеродных соединений бактериями и открывают в дальнейшем широкие перспективы для получения ферментов с заранее заданными свойствами.

Выводы

  1. Создана коллекция активных штаммов–деструкторов фенолов, 2-, 3- и 4-монохлор-фенолов, 2,4-Д, 3-хлорбензоата, 4-метилбензоата (пара-толуат). В результате проведенного анализа были отобраны штаммы Rhodococcus rhodochrous 89, Rhodococcus opacus 1G, Rhodococcus rhodnii 135, разлагающие фенол; Rhodococcus opacus 1cp, полностью минерализующий фенол, 2-хлор-, 4-хлор- и 2,4-дихлорфенол, п-толуат; Rhodococcus opacus P25, утилизирующий п-толуат и хлорбифенилы.
  2. Впервые изучены ферменты модифицированного орто-пути разложения 4-хлорпирокатехина у грам-положительной бактерии – Rhodococcus opacus 1cp. Обнаружены, выделены в гомогенном виде и охарактеризованы хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатциклоизомераза, диенлак-тонгидролаза. Константа специфичности 4-хлорпирокатехин 1,2-диокси-геназы была на порядок выше для субстратов с заместителями в пара-положении, чем для мета-замещенных. Хлормуконатциклоизомераза была специфична к 3-хлор-цис,цис-муконату, а диенлактон гидролаза проявляла активность только с цис-диенлактоном.
  3. Впервые описан новый модифицированный орто-путь разложения 3-хлорпирокатехина у штамма R. opacus 1cp, выращенного на 2-хлорфеноле. Выделены, охарактеризованы ферменты этого пути: хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатциклоизомераза, хлормуконолактондегалоге-наза, диенлактонгидролаза. Показано, что новый путь содержит в своем составе как ферменты модифицированного орто-пути разложения хлорпирокатехинов, так и один из ферментов обычного орто-пути.
  4. Детально изучены реакции циклоизомеризации (хлор-)фтормуконовых кислот и последующего дегалогенирования образующихся муконо-лактонов ферментами родококков. Показано, что реакция циклоизоме-ризации 2-галомуконата является определяющей для характеристики катализирующих ее (хлор)муконатциклоизомераз и позволяет выявить принципиальные различия между муконатциклоизомеразами родококков и грам-отрицательных бактерий.
  5. Впервые получены в кристаллическом виде хлорпирокатехазы 3-хлор- и 4-хлорпирокатехиновых ветвей модифицированного орто-пути штамма R. opacus 1cp. Рентгено-структурный анализ полученных кристаллов позволил установить пространственную структуру хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, выявил наличие молекулы бензоата в активном центре 4-ХПК 1,2-ДО и бензогидроксамата у 3-ХПК 1,2-ДО. Показано, что факторами, определяющими различия субстратной специфичности диоксигеназ, являются аминокислоты, формирующие как активный центр в местах связывания и позиционирования субстратов, так и вход в него.
  6. Проведенное широкое исследование ферментов, участвующих в разложении незамещенных и замещенных ароматических соединений у бактерий рода Rhodococcus, заполнило значительный пробел в изучении процессов биодеградации устойчивых поллютантов микроорганизмами.
  7. Изучение биодеградативных путей разложения метил- и галоароматических соединений у родококков с биохимических, генетических и структурных позиций показало, что их высокий биодеградативный потенциал объясняется своеобразной организацией этих метаболических путей, включающей способность бактерий реагировать на новые для них субстраты индукцией изофункциональных ферментов с различной субстратной специфичностью, образованием новых стабильных и высоко специфичных метаболических путей, а также привлечением нескольких специфичных ферментов из уже существующих метаболических путей.

Список публикаций по теме диссертации

Экспериментальные статьи

  1. М.В.Суворова, И.П.Соляникова, Л.А. Головлева (2006) Особенности орто-расщепления пирокатехина при разложении пара-толуата бактерией Rhodococcus opacus 1cp. Биохимия, 71, вып. 12., 1616-1624.
  2. M.Ferraroni, I.P. Solyanikova, M.P. Kolomytseva, A. Scozzafava, L.Golovleva, F.Briganti (2006) Crystal structure of 3-chlorocatechol 1,2-dioxygenase key enzyme of a new modified ortho-pathway from the gram-positive Rhodococcus opacus 1CP grown on 2-chlorophenol. J. Mol. Biol., 360, 788-799.
  3. M.Ferraroni, I.P. Solyanikova, M.P. Kolomytseva, A. Scozzafava, L.Golovleva, F.Briganti (2006) Crystal structure of 3-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Rhodococcus opacus 1CP. Protein Data Bank, accession number 2boy.
  4. Коломыцева М.П., Соляникова И.П., Головлев Е.Л., Головлева Л.А.(2005) Гетерогенность Rhodococcus opacus 1CP как ответ на стрессовое воздей-ствие хлорфенолов. Прикл. биохим. микробиол., 41, 5, стр. 541-546.
  5. M.Ferraroni, I.P.Solyanikova, M.P.Kolomytseva, L.A.Golovleva, A. Scozzafava, F.Briganti (2004) Crystal structure of 4-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from the chlorophenol-utilizing gram-positive Rhodococcus opacus 1cp. J. Biol. Chem., 279 (26), 27646-27655.
  6. M.Ferraroni, I.P.Solyanikova, M.P.Kolomytseva, L.A.Golovleva, A. Scozzafava, F.Briganti (2004) Crystal structure of 4-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Rhodococcus opacus 1cp. Protein Data Bank, accession number 1s9a.
  7. I.P.Solyanikova, O.V.Moiseeva, S.Boeren, M.G.Boersma, M. P. Kolomytseva, J.Vervoort, I.M.C.M.Rietjens, L.A.Golovleva, W.J.H.van Berkel (2003) Conversion of 2-fluoromuconate to cis-dienelactone by purified enzymes of Rhodococcus opacus 1cp. Appl. Environm. Microbiol., 69, 5636-5642.
  8. V.M.Travkin, I.P.Solyanikova, J.Vervoort, I.M.C.M.Rietjens, W.J.H.van Berkel, L.A.Golovleva (2003) Degradation of 3,4-dichloro- and 3,4-difluoroaniline by Pseudomonas fluorescers 26-K. J. Environm. Sci. Health., B38, p.121-132.
  9. M.Ferraroni, M.V.R.Tariffa, A. Scozzafava, I.P.Solyanikova, M.P.Kolomytseva, L.A.Golovleva, F.Briganti (2003) Preliminary crystallographic analysis of 3-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from a new modified ortho-pathway from the gram-positive Rhodococcus opacus 1CP grown on 2-chlorophenol. Acta Crystallographica, D 59, 188-190.
  10. O.V.Moiseeva, I.P.Solyanikova, S.Kaschabek, M.Thiel, L.A.Golovleva, M.Schloemann (2002) A new modified ortho-cleavage pathway of 2-chlorophenol degradation by Rhodococcus opacus 1CP: genetic and biochemical evidences. J.Bacteriol., 184, 5282-5292.
  11. M.Ferraroni, M.V.R.Tariffa, F.Briganti, A. Scozzafava, S.Mangano, I.P.Solyanikova, M.P.Kolomytseva, L.A.Golovleva (2002) 4-Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from the chlorophenol-utilizing gram-positive Rhodococcus opacus 1CP: Crystallization and preliminary crystallographic analysis. Acta Crystallographica, D58, 1074-1076.
  12. Соляникова И.П., Шлеманн М., Головлева Л.А.(2001) Новый тип муконатциклоизомеразы из Rhodococcus rhodochrous 89. Биохимия, 66, 7, стр. 922-928.
  13. Моисеева О.В., Белова О.В., Соляникова И.П., Шлеманн М., Головлева Л.А.(2001) Ферменты нового модифицированного орто-пути из Rhodococcus opacus 1CP, утилизтрующего 2-хлорфенол. Биохимия, 66, 5, стр. 678-687.
  14. M.G.Boersma, I.P.Solyanikova, W.J.H.Van Berkel, J.Vervoort, L.A.Golovleva, I.M.C.M.Rietjens (2001) 19F NMR metabolomics for the elucidation of microbial degradation pathways of fluorophenols. J. of Ind.Microbiol and Biotechnol., 26, 22-34.
  15. Соляникова И.П., Головлев Е.Л., Лисняк О.В., Головлева Л.А.(1999) Выделение и характеристика пирокатехаз из штаммов Rhodococcus rhodnii 135 и Rhodococcus rhodochrous 89: сравнение с аналогичными ферментами обычного и модифицированного орто-пути. Биохимия, 64, 7, стр. 982-989.
  16. F.Briganti, S.Mangani, L.Pedocchi, A.Scozzafava, L.A.Golovleva, A.P.Jadan, I.P.Solyanikova (1998) XAS characterization of the active sites of novel intradiol ring-cleaving dioxygenases: hydroxyquinol and chlorocatechol dioxygenases. FEBS Lett. 433, 58-62.
  17. V.S.Bondar, M.G.Boersma, E.L.Golovlev, J.Vervoort, W.J.H.Van Berkel, Z.I.Finkelstein, I.P.Solyanikova, L.A.Golovleva, I.M.C.M.Rietjens (1998) 19F NMR study on the biodegradation of fluorophenols by various Rhodococcus species. Biodegradation 9, 475-486.
  18. I.P.Solyanikova, Ya.Yu.Protopopova, V.M.Travkin, L.A.Golovleva (1996) Key enzymes of 2,4-D and 2,4,5-T degradation from Nocardioides simplex strain 3E. Biochemistry (Moscow) 61, 461-466. Translated from Biokhimiya 61, 635-642.
  19. I.P.Solyanikova, O.V.Maltseva, M.D.Vollmer, L.A.Golovleva, M.Schlmann (1995) Characterization of muconate and chloromuconate cycloisomerase from Rhodococcus erythropolis 1CP: indications for functionally convergent evolution among bacterial cycloisomerases. J.Bacteriol. 177, 2821-2826.
  20. Соляникова И.П., Мальцева О.В., Головлева Л.А. (1995) Модифицированный орто-путь у штамма Pseudomonas putida 87: очистка и свойства диенлактонгидролазы. Биохимия, 60, 8, стр. 1251-1260.
  21. O.V.Maltseva, I.P.Solyanikova, L.A.Golovleva (1994) Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Rhodococcus erythropolis 1CP. Kinetic and immunochemical comparison with analogous enzymes from gram-negative strains. Eur.J.Biochem. 226, 1053-1061.
  22. O.V.Maltseva, I.P.Solyanikova, L.A.Golovleva, M.Schlmann, H.-J.Knackmuss (1994) Dienelactone hydrolase from Rhodococcus erythropolis 1CP: purification and properties. Arch.Microbiol. 162, 368-374.
  23. Соляникова И.П., Мальцева О.В., Головлева Л.А. (1992) Очистка и свойства пирокатехин 1,2-диоксигеназы II из Pseudomonas putida 87. Биохимия, 57, 12, стр. 1883-1891.
  24. L.A.Golovleva, O.V.Maltseva, I.P.Solyanikova (1992) Metabolism of foreign compounds in Pseudomonas spp. in: Pseudomonas: Molecular Biology and Biotechnology (Galli, E., Silver, S., Witholt, B., eds.), pp 231-238, ASM, Washington, D.C.
  25. Мальцева О.В., Соляникова И.П., Головлева Л.А. (1991) Пирокатехазы штамма Rhodococcus erythropolis – деструктора хлорфенолов: очистка и свойства. Биохимия, 56, 12, стр. 2188-2197.

Обзоры

  1. V.M.Travkin, I.P.Solyanikova, L.A.Golovleva (2006) Hydroxyquinol Pathway for Microbial Degradation of Halogenated Aromatic Compounds. J. Environm. Sci. Health., 41, 1361-1382.
  2. I.P.Solyanikova, L.A.Golovleva (2004) Bacterial Degradation of Chlorophenols: Pathways, Biochemical, and Genetic Aspects. J. Environm. Sci. Health., B39, p. 333-351.
  3. Соляникова И.П., Головлева Л.А. (1999) Фенол гидроксилазы: современное состояние вопроса. Биохимия, 64, 437-446.

Тезисы докладов и стендовых сообщений

  1. O.V.Maltseva, I.P.Solyanikova, L.A.Golovleva (1990) The metabolism of chlorophenols by Rhodococcus erythropolis. 06C-02 Book of abstracts of 7th International congress of pesticide chemistry. Hamburg August 5-10, 1990.
  2. I.P.Solyanikova, O.V.Maltseva, L.A.Golovleva (1991) Purification and comparison study on key enzymes of ortho-pathway from strains-degraders of chlorinated aromatic compounds. P.181.Book of abstracts 2nd All-union simposium "Teoretical and applied aspects of molecular biology". Samarkand, September 22-28, 1991.
  3. I.P.Solyanikova, O.V.Maltseva, L.A.Golovleva (1991) Purification and characterization of catechol 1,2-dioxygenase II from Pseudomonas putida 87. p.57. Book of abstracts of 3rd International symposium on Pseudomonads Biology and biotechnology. Trieste, Italy, June 16-20, 1991.
  4. I.P.Solyanikova, O.V. Maltseva, M.D. Vollmer, L.A.Golovleva, M.Schlmann (1993) Chloromuconate cycloisomerase from Rhodococcus erythropolis 1CP, an intermediate stage in the adaptation for chlorosubstituted substrates. Bioengineering, 1993, V.9(1), P210.
  5. M.Schlmann, M.D.Vollmer, I.P.Solyanikova, H.Hoier (1993) Muconate versus chloromuconate cycloisomerases: Implications for the evolution of chlorocatechol degradative pathways. Bioengineering, 1993, 9(1), V201.
  6. I.P.Solyanikova, M.D.Vollmer, O.V.Maltseva, L.A.Golovleva, M.Schlmann  (1994) Muconate cycloisomerase of Rhodococcus erythropolis 1CP and  its contributions to an evolutionary puzzle. Bioengineering, 1994, 10(3), P410.
  7. M.D.Vollmer, I.P.Solyanikova, O.V.Maltseva, L.A.Golovleva, M.Schlmann (1994) Diversity in 2-chloromuconate cycloisomerization: Indications for convergent evolution of chlorocatechol degradative pathways. Abstr.of the 94th  General Meeting of the American Society for Microbiol. Las Vegas, Nevada. May 23-27 1994. Q-367.
  8. O.V.Maltseva, I.P.Solyanikova, L.A Golovleva, M.Schlmann, H.-J. Knackmuss (1994) Purification and properties of dienelactone hydrolase from the chlorophenols degrading strain Rhodococcus erythropolis 1CP. Abstr.of the 94th General Meeting of the American Society for Microbiol. Las Vegas, Nevada. May 23-27 1994. Q-368.
  9. O.V.Maltseva, I.P.Solyanikova, L.A.Golovleva (1994) Chlorophenols are  competitive inhibitors of catechol- and chlorocatechol 1,2- dioxygenases of the strain Rhodococcus erythropolis 1CP. Abstr. of the 8th IUPAC Intern. Congress of Pesticide Chemistry.Washington. July 4- 9 1994. Book of Abstr.V.2,693.
  10. Соляникова И.П., Мальцева О.В., Головлева Л.А. (1994) Особенности разложения хлорфенолов штаммом Rhodococcus erythropolis1ХФ. Тезисы докладов конференции Биотехнология защиты окружающей среды. Пущино. 18-19 октября 1994.
  11. Соляникова И.П., Мальцева О.В., Фольмер М.Д., Шлеманн М., Головлева Л.А. (1994) Особенности циклоизомеризации хлормуконовых кислот штаммом Rhodococcus erythropolis 1ХФ. Тезисы докладов конференции Биотехнология защиты окружающей среды. Пущино 18-19 октября 1994.
  12. M.Schlmann, Eulberg D., I.P.Solyanikova, V.Seibert, L.A.Golovleva (1995) Convergent evolution of chlorocatechol catabolic pathways? Characterization of degradative genes from Rhodococcus erythropolis 1CP and comparison to those of Gram-negative bacteria. EERO Workshop. Enzymatic and genetic aspects of environmental biotechnology. Pushchino, 1995.
  13. I.P.Solyanikova, O.V.Maltseva, L.A.Golovleva (1995) Competitive inhibition of catechol and chlorocatechol 1,2-dioxygenases of Rhodococcus erythropolis 1CP by different phenolic compounds. EERO Workshop. Enzymatic and genetic aspects of environmen tal biotechnology. Pushchino, 1995.
  14. S.R.Kaschabek, I.P.Solyanikova, O.V.Moisseeva, L.A.Golovleva, and M.Schlmann (2000) Degradation of 2-chlorophenol by Rhodococcus opacus 1CP via dehalogenation of 5-chloromuconolactone to cis-dienlactone. BIOspectrum, Sonderausgabe zum 1. Gemeinsamen Kongress der DGHM, OGHMP und VAAM "Microbiology 2000", 12.-16. Marz 2000, Munchen. 13.P.1.39, p.47.
  15. O.Moisseeva, I.P.Solyanikova, O. Belova, L.A Golovleva (2000) Novel modified ortho-pathway of Rhodococcus opacus 1CP utilizing of 2-chlorophenol: enzyme characterization. International symposium: Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology Pushchino, June 25-30, 2000. р.117.
  16. L.A.Golovleva, Z.I.Finkelstein, E.L.Golovlev, O.Moisseeva, B.P.Baskunov, I.P. Solyanikova (2000) Bacterial degradation of chloroaromatic compounds. Abstracts of the conference “Biotechnology-2000”. Pushchino, September 2000. P. 39.
  17. Коломыцева М.П., Соляникова И.П., Головлева Л.А. (2003) Изофункциональные диоксигеназы Rhodococcus opacus 1cp: структурно-функциональные свойства. Биология – наука XXI века. Сб. тез. VII-й Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 14-18 апреля, 2003, стр. 343.
  18. Solyanikova I., Kolomytseva M., Ferraroni M., Scozzafava A., Briganti F., Golovleva L.A. (2004) Chlorocatechol 1,2-dioxygenases from Rhodococcus opacus 1cp: kinetic and structural aspects. Abstracts of the conference Oxizymes in Naples. 2nd European meeting. Universita di Napoli Federico II, 3-5 June 2004, p.23.
  19. Рыбкина Д.О., Соляникова И.П., Головлева Л.А., Плотникова Е.Г. (2005) Штамм Microbacterium sp. B51 – природный деструктор ароматических ксенобиотиков. Тезисы международной конференции ICOMID-2005. Пермь, Россия, стр. 85-86.
  20. Головлева Л.А., Травкин В.М., Соляникова И.П., Коломыцева М.П., Феррарони М., Бриганти Ф. (2005) Биодеградация хлорфенолов и хлорфеноксиалкановых гербицидов: биохимические, генетические и структурные аспекты. Тезисы международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». 14-16 сентября 2005, Саратов, Россия, стр. 4-5.
  21. Головлева Л.А., Коломыцева М.П., Феррарони М., Бриганти Ф., Соляникова И.П., Травкин В.М. (2006) Структурно-функциональные свойства диоксигеназ. Материалы международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» 1-2 июня 2006, Минск-Раков, Беларусь, стр. 20-23.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.