WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Хомутов Алексей Радиевич

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ХИМИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ МЕТАБОЛИЗМА БИОГЕННЫХ АМИНОВ СПЕРМИНА И СПЕРМИДИНА

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

Москва 2011

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ действия физиологически

активных соединений Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Официальные оппоненты:                         д.х.н., проф., чл.-корр. РАН  Е.С.Северин

д.х.н., проф., чл.-корр. РАН  В.И.Цетлин

д.х.н., проф. С.Н.Михайлов

                               

Ведущая организация:                        Учреждения Российской академии наук

Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН

                       

Защита диссертации состоится « 24 » ноября 2011 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного Совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан « ____ » _____________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат химических наук                                                       А.М. Крицын

Актуальность проблемы. Биогенные полиамины спермин (Spm), спермидин (Spd) и их предшественник путресцин (Put) присутствуют в клетках всех типов в μM-mM концентра-циях и жизненно необходимы для их нормального роста. Высокое внутриклеточное содержа-ние Spm и Spd определяет разнообразие их клеточных функций, многие из которых остаются все еще малоизученными, что обеспечивает поступательное развитие этой области биохимии (см.обзор: Casero R.A. & Pegg A.E. In: Polyamines: Methods and Protocols, Methods in Molecu-lar Biology, 720, 3-35. Springer Science+Business Media, LLC. 2011). При физиологическом значении рН полиамины существуют в форме поликатионов. Spd и Spm взаимодействуют с ДНК, РНК и нуклеопротеидами, служат регуляторами активности топоизомераз, рестриктаз, а также ферментов биосинтеза ДНК и РНК. Полиамины участвуют в регуляции транспорта Са2+ митохондриями, являются модуляторами NMDA рецептора и эффекторами транспорта K+, а также регулируют процесс полимеризации тубулина. Spd служит единственным доно-ром аминобутильного остатка, необходимого для посттрансляционной модификации (прев-ращение остатка лизина в гипузин – Nε-(4-амино-2-оксибутил)-L-лизин) фактора инициации трансляции eIF-5A, жизненно необходимого для всех эукариот. Наконец, Spd входит в состав трипанотиона – важнейшего метаболита протозойных паразитов.

Аналоги Spm и Spd являются одним из основных инструментов исследования фермен-тов метаболизма и клеточных функций полиаминов. Соответственно, направленное создание новых биологически активных производных полиаминов, расширение семейства весьма не-многочисленных функционально-активных миметиков частично взаимозаменяемых Spm и Spd, изучение взаимодействия этих аналогов с ферментами метаболизма полиаминов, а так-же их активности на уровне культуры клеток и in vivo представляется вполне актуальным.

Целью работы являлись: (i)- разработка удобных способов получения системы неиз-вестных ранее С-метилированных аналогов Spd, N1-ацетил-Spd и Spm; (ii)- синтез неописан-ных ранее оптических изомеров α-метилполиаминов; (iii)- создание нового типа зарядодефи-цитного аналога Spm (SpmTrien) на основе триэтилентетрамина, а также ацетильных и бис-этильных производных SpmTrien; (iv)- получение оригинальных биологически активных гид-роксиламин содержащих аналогов Spm и агматина (последнее потребовало создания нового метода гуанидилирования аминооксигруппы); (v)- исследование взаимодействия С-метили-рованных аналогов полиаминов и SpmTrien с ДНК; (vi)- изучение взаимодействия синтезиро-ванных веществ с ферментами метаболизма полиаминов и их эффектов в культуре клеток и in vivo.

Научная новизна. Разработаны удобные схемы синтеза системы неизвестных ранее С-метилированных аналогов Spd, Spm и N1-ацетил-Spd, позволяющие получать эти соедине-ния с высокими выходами из доступных исходных веществ и в количествах, необходимых для проведения экспериментов in vivo. Получены неизвестные ранее оптические изомеры α-метилполиаминов и N-ацетил-α-MeSpd. Синтезирован оригинальный зарядодефицитный аналог Spm – SpmTrien и его биохимически-значимые производные. Разработаны удобные схемы синтеза аминоокси- и окса-аналогов Spm, а также бисубстратных ингибиторов спермин/спермидин-N1-ацетилтрансферазы (SSAT) на основе аминоокси аналогов Spd и Spm. Впервые показано, что трифлат ди-Вос-гуанидина количественно гуанидилирует аминооксигруппу, что позволило получить ряд функционально-замещенных алкоксигуани-динов, включая и неизвестные ранее гидроксиламин-содержащие аналоги агматина.

Исследовано взаимодействие синтезированных С-метилированных производных Spd и Spm с ферментами метаболизма полиаминов, их влияние на антизим-зависимые пути регу-ляции гомеостаза полиаминов, а также способность аналогов восстанавливать рост клеток с истощенным пулом полиаминов. Оказалось, что биохимические свойства аналогов определя-ются положением метильной группы. Введение метильной группы в α-положение обеспечи-вает катаболическую устойчивость α-метилспермидина (α-MeSpd), но не α-метилспермина (α-MeSpm). Показано, что среди аналогов этого типа лишь γ-метилспермидин (γ-MeSpd) является функционально-активным метаболически устойчивым миметиком спермидина (γ-MeSpd не является субстратом ни SSAT, ни сперминсинтазы, но способен восстанавливать рост клеток с истощенным пулом полиаминов), что открывает новые возможности для иссле-дования клеточных функций катаболически неустойчивых и легко взаимопревращающихся Spm и Spd. Найдено, что β-метилспермидин (β-MeSpd), в отличие от подавляющего боль-шинства аналогов Spd и остальных С-метилированных производных Spd, практически не ин-дуцирует биосинтез антизима – небольшого белка блокирующего проникновение полиами-нов в клетку, а также вызывающего диссоциацию орнитиндекарбоксилазы на субъединицы и осуществляющего их доставку в 26S протеосомы. Использование хиральных аналогов α-ме-тилированных полиаминов позволило впервые показать, что сперминоксидаза, дезоксигипу-зинсинтаза и ацетилполиаминооксидаза (АРАО), природные субстраты которых ахиральны, обладают стереоспецифичностью и найти изящный способ регулирования стереоспецифич-ности АРАО. Установлено, что α-метилполиамины способны выполнять жизненно важные функции их природных прототипов в культуре нормальных и опухолевых клеток, а также и in vivo, предотвращая развитие острого панкреатита у SSAT-трансгенных крыс и стимулируя регенерацию печени после частичной гепатэктомии в условиях дефицита Spm и Spd. Таким образом, впервые показано, что введение метильной группы в заданное положение поли-аминного скелета и изменение конфигурации хирального центра позволяет тонко регулиро-вать биохимические свойства аналогов полиаминов, а соответствующие производные и ана-логи представляют собой ценные инструменты исследования клеточных функций и метабо-лизма Spm и Spd in vitro и in vivo.

Практическая ценность работы. Повышенное содержание Spm и Spd в опухолевых клетках, жизненная необходимость полиаминов для развития возбудителей малярии, сонной болезни и лейшманиоза, а также наблюдаемые нарушения метаболизма полиаминов у боль-ных панкреатитом и диабетом формируют прикладную составляющую исследований клеточ-ных функций Spm и Spd и поиска новых регуляторов их метаболизма. Правомерность подоб-ного подхода подтверждается успешным использованием α,α-дифторметилорнитина (DFMO) для лечения поздних стадий сонной болезни (Burri C.C. & Brun R. 2003. Parasitol.Res. 90, S49-S52) и противоопухолевой активностью терминально N,N’-бис-алкилированных производных полиаминов, являющихся супериндукторами SSAT (см.обзор: Casero R.A. & Marton L.J. 2007. Nat.Rev.Drug Discov. 6, 373-390). В настоящей работе впервые показано, что α-MeSpd спосо-бен предотвращать развитие острого панкреатита у SSAT-трансгенных крыс, возникающего в ответ на активацию фермента. Найдено, что активно транспортируемый в L.donovani 1-гуани-диноокси-3-аминопропан (GAPA), в отличие от других ингибиторов орнитиндекарбоксилазы, эффективно препятствует размножению резистентных к сурьма-содержащим препаратам форм паразита, что открывает новые возможности для практической полиаминотерапии лейшманиоза.

Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на: Polyamine Gordon Research Conference (Connecticut College, New London, CT, USA, June 2001); International Con-ference devoted to 100-year anniversary of Acad. A.E.Braunstein (Moscow, Russia, May 2002); International Conference on Biogenic Amines (Trento, Italy, June 2002); Biogenic Amines COST 922: Health implications of dietary amines (Trento, Italy, May 2004); The IX spring meeting of synthetic chemistry (Kuopio, Finland, June 2006); 1st International Conference on the Role of Poly-amines and their Analogs in Cancer and Other Diseases (Tivoli, Italy, September 2006); Biochemi-cal Society COST Action 922: Health Implications of Dietary Amines (Aberdeen, Scotland, UK, October 2006); COST B22 expert meeting "Polyamines and parasites" (Stockholm, Sweden, Sep-tember 2007); International Conference “Polyamine: Forty Years of Mammalian Ornithine Decar-boxylase” (Kuopio, Finland, June 2008); XI International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins (Vienna, Austria, August 2009); 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases (Tivoli, Italy, December 2010); Polyamine Gordon Research Conference (Waterville Valley, New Hampshire, USA, June 2011); International Conference “Biogenic Amines 2011. Biochemical, Physiological and Clinical Perspectives” (Trento, Italy, September 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 37 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ___ стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экс-периментальной части и выводов. Материал иллюстрирован ___ таблицами, ___ рисунками и ___ схемами. Список цитированной литературы включает ___ наименований.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантами РФФИ: 03-04-49080, 06-04-49638, 08-04-91317-ИНД, 08-04-91777-АФ, 09-04-01272, 10-04-92661-Инд; а также Федераль-ной целевой программой “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” (Госконтракт № 02.740.11.5134 от 09 марта 2010 г.) и Программой президиума РАН "Моле-кулярная и клеточная биология"

Система метаболизма полиаминов включает в себя несколько ферментов (Рис. 1), ско-рость определяющими из которых на путях биосинтеза являются декарбоксилазы орнитина (ODC) и S-аденозилметионина (AdoMetDC), а на путях катаболизма – спермидин/спермин-N1-ацетилтрансфераза (SSAT). Биосинтез и деградация этих трех короткоживущих фермен-тов тонко регулируется на многих уровнях, в том числе и в ответ на изменения внутрикле-точной концентрации полиаминов. Повышение содержания спермина (Spm) и спермидина (Spd) вызывает +1 сдвиг рамки считывания мРНК антизима (AZ), что приводит к образова-нию функционального активного белка, который блокирует проникновение полиаминов в клетку, а также, связываясь с ODC, вызывает диссоциацию фермента на субъединицы и осу-ществляет их доставку в 26S протеосомы. Повышение концентрации Spm и Spd вызывает продуктивный сплайсинг мРНК SSAT, что, вместе с AZ-зависимыми механизмами регуля-ции, является одним из основных способов поддержания гомеостаза полиаминов в клетке.

Рис.1. Метаболизм полиаминов. ODC – орнитиндекарбоксилаза; AdoMetDC – S-аденозилметиониндекарбок- силаза; SSAT – спермидин/спермин-N1-ацетилтрансфераза; АPAО – ацетилполиаминоксидаза; SMO – спермин-оксидаза; SpdSy – спермидинсинтаза; SpmSy – сперминсинтаза; AZ – антизим; AZI – ингибитор антизима.

Учитывая, что опухолевые клетки имеют повышенный уровень полиаминов по срав-нению с нормальными, а также необходимость полиаминов для размножения болезнетвор-ных трипаносоматидов (Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei gambiense, Leishmania donovani и т.п.) и то, что Spm и Spd входят в состав оболочки многих вирусов, в биохимии полиаминов большое внимание традиционно уделяется разработке подходов к истощению внутриклеточного пула Spd и Spm, приводящего к ингибированию роста клеток. Соответст-венно были созданы разнообразные специфические ингибиторы ферментов биосинтеза по-лиаминов (см. обзоры: Wallace H.M. & Fraser A.V. 2004. Amino Acids, 26, 353–365; Seiler N. 2003. Curr.Drug Targets, 4, 537-564). В культуре клеток экзогенные Spm и Spd полностью об-ращают эффекты ингибиторов ферментов биосинтеза полиаминов, что подтверждает избира-тельность исходного воздействия на систему. Однако наиболее эффективным способом сни-жения уровня полиаминов in vitro и in vivo оказалась супериндукция SSAT – скорость опре-деляющего фермента катаболизма полиаминов (см. обзоры: Casero R.A. & Woster P.M. 2009. J.Med.Chem., 52, 4551-4573; Casero R.A. & Marton L.J. 2007. Nat.Rev.Drug Discov. 6, 373-390). Так как в условиях супериндукции SSAT экзогенные Spm и Spd быстро катаболизируют и поэтому неэффективны, то оставалось неясным, обусловлены ли наблюдаемые эффекты только снижением уровней Spm/Spd в результате супериндукции SSAT или же они прямо не связаны с изменением содержания полиаминов в соответствующих органах и тканях. Для от-вета на этот важнейший для биохимии полиаминов вопрос необходимо было создать систему катаболически устойчивых аналогов Spm и Spd, способных выполнять основные клеточные функции полиаминов. В общем смысле, значение подобных веществ велико и потому, что регуляция биохимических процессов подразумевает не только возможности вызывать необ-ходимый ответ клетки или организма, но и наличие в распоряжении исследователя способов обращения эффекта. Это позволяет оценить избирательность исходного воздействия и свиде-тельствует об адекватности наших представлений о том или ином биохимическом процессе.

Изучение клеточных функций полиаминов на молекулярном уровне осложнено час-тичной взаимозаменяемостью и легкостью взаимопревращений Spm и Spd. Поэтому в этих исследованиях широко используются мутантные микроорганизмы и клетки (Cohen S.S. A guide to the polyamines. New York: Oxford University Press. 1998), а также трансгенные живот-ные (см. обзор: Janne J., et al. 2004. Eur.J.Biochem., 271, 877-894), что позволяет активировать или «выключать» заданные ферменты метаболизма полиаминов и регуляторные механизмы, ответственные за поддержание гомеостаза полиаминов. Относительно простым решением, хорошо дополняющим существующие подходы и позволяющим дискриминировать клеточ-ные эффекты Spm и Spd, может быть истощение внутриклеточного пула полиаминов и ис-пользование для обращения эффекта функционально активных миметиков Spm и Spd не спо-собных к взаимопревращениям. Однако соединения с подобным комплексом свойств, равно как и функционально-активные аналоги Spm и Spd не индуцирующие биосинтез AZ, до настоящего времени не были известны.

Совокупность этих обстоятельств привела к синтезу системы неизвестных ранее С-ме-тилированных аналогов Spm и Spd, включая оптические изомеры α-метилированных произ-водных, и исследованию их взаимодействия с ферментами метаболизма полиаминов, а также эффектов в культуре клеток и in vivo, предполагая, что конкретные биохимические свойства аналогов будут определяться не только протонированным при физиологическом рН скелетом молекулы полиамина, но и положением метильной группы, а также и конфигурацией возни-кающего хирального центра. Результаты этих исследований представлены в первой части диссертационной работы.

       Биохимические свойства Spm и Spd в значительной степени определяются правильным расположением аминогрупп, протонированных при физиологическом значении рН. Однако вклад зарядовой составляющей, по сравнению со структурным фактором, в активность полиаминов малоисследован. Рациональным подходом для изучения вклада протонирования аминогрупп в функционирование полиаминов является констуирование изостерных “зарядодефицитных” аналогов – рКа одной или двух аминогрупп в таких производных понижена на несколько порядков по сравнению с аминогруппами Spm и Spd. Соответственно, во второй части настоящей работы предложен и реализован оригинальный принцип конструирования “зарядодефицитных”аналогов Spm, заключающийся в замене Spd-фрагмента молекулы на изостерный ему триэтилентетраминовый, поскольку существенное снижение основности вторичных аминогрупп достигается, в том числе, и сокращением расстояния между ними до двух метиленовых звеньев. Аминооксианалоги Spm и Spd (Khomutov A.R., et al. 1996. Tetrahedron, 52, 13751-13766) принадлежат к другому типу “зарядодефицитных” аналогов полиаминов. Используя эти аналоги, которые, как и все О-замещенные гидроксиламины, являются карбонильными реагентами, были получены оригинальные «бисубстратные» ингибиторы SSAT, хорошо моделирующие промежуточный комплекс Ас-СоА–полиамин. Результаты этих исследований также представлены во второй части данной работы.

       Успешное применение химических регуляторов метаболизма во многом определяется возможностью создания форм, активно транспортируемых в клетки. Попытка решения этой проблемы на примере 1-аминоокси-3-аминопропана (АРА), одного из наиболее эффективных ингибиторов орнитиндекарбоксилазы (ODC), действующего на изолированный фермент в nM концентрация, привела к 1-гуанидиноокси-3-аминопропану (GAPA), что стало возможным после того как нами был найден удобный метод гуанидинилирования аминооксигруппы. GAPA активно проникал в амастиготы L.donovani и был эффективен, в отличие от других ингибиторов ODC, и по отношению к солюсурмин-устойчивых формам паразита. Результаты этих исследований представлены в третьей части диссертационной работы.

Синтез рацемических α-метилированных производных спермидина,

N1-ацетилспермидина и спермина.

Ингибирование ODC, ключевого фермента биосинтеза полиаминов, приводит к исто-щению пула Spd/Put и торможению роста клеток. Известно, что внесение в культуральную среду как Spd и Spm, так и их α-метилированных производных полностью восстанавливает рост таких клеток (Lakanen J.R., et al. 1992. J.Med.Chem., 35, 724-734). Однако активация катаболизма полиаминов в результате индукции SSAT приводит к истощению внутри-клеточного пула не Put/Spd, а Spm/Spd, поэтому a priori

Рис. 2. α-Метилированные аналоги полиаминов.

неочевидно, будут ли α-метилполиамины устойчивые к действию SSAT, поддерживать рост клеток с супериндуцированной SSAT, а также устранять в этих условиях патологические последствия дефицита полиаминов in vivo.

Описанные в литературе методы синтеза α-MeSpd, α-MeSpm и α,α’-Me2Spm позволя-ют получать эти соединения в количестве нескольких десятков миллиграммов с низким сум-марным выходом (Lakanen J.R., et al. 1992. J.Med.Chem., 35, 724-734). Проблемы с раствори-мостью ключевых промежуточных соединений, а также трудоемкие процедуры выделения и очистки на последних стадиях синтеза делают нецелесообразным воспроизведение и, тем бо-лее, масштабирование этих методик получения α-метилполиаминов. Соответственно, необ-ходимо было разработать альтернативные схемы синтеза, позволяющие получать α-MeSpd, α-MeSpm и α,α’-Me2Spm с высокими суммарными выходами в количествах, необходимых для проведения экспериментов с лабораторными животными.

Среди разнообразных методов создания C-N-связи, используемых для получения поли-лиаминов (см. обзор: Kuksa V., et al. 2000. Synthesis, 9, 1189-1207), в настоящей работе для по-строения скелета аналогов полиаминов было использовано алкилирование избытка амина ме-тансульфонатами соответствующих N-защищённых аминоспиртов (Схема 1). Основным ин-термедиатом в синтезе α-MeSpd является N-Cbz-3-аминобутанол (3), который был получен восстановлением LiAlH4 коммерчески доступного этилового эфира 3-аминомасляной кислоты (1) и последующим N-карбобензоксилированием аминоспирта (2). Ключевой стадией синтеза

Схема 1

(i)- LiAlH4/THF/; (ii)- CbzCl/THF/H2O/NaHCO3; (iii)- MsCl/Et3N/CH2Cl2; (iv)- H2N(CH2)4NH2/THF;

(v)- (1) H2/Pd/AcOH/MeOH; (2) HCl/MeOH; (vi)- (1) Boc2O; (2) H2/Pd; (3) AcCl/Et3N/THF; (4) HCl/MeOH.

являлось алкилирование 1,4-диаминобутана метансульфонатом (4), которое проводили при 0С, что позволило уменьшить количество минорных побочных продуктов, трудно отделяе-мых от N-Cbz-α-MeSpd (5) хроматографией на силикагеле. Защитную группу удаляли ката-литическим гидрированием над Pd-чернью и целевой легко кристаллизующийся из водного спирта трихлоргидрат α-MeSpd был получен с суммарным выходом 43%, считая на (1).

Для построения скелета α-MeSpm полиаминную цепь последовательно наращивали алкилируя соответствующие амины мезилатами N-защищенных аминоспиртов (Схема 2), в целом, аналогично описанному выше для α-MeSpd, что позволило получить целевой α-MeSpm в виде хорошо кристаллизующегося тетрахлоргидрата с выходом 41%, считая на (4).

Схема 2

(i)- H2N(CH2)4OH/THF; (ii)- CbzCl/THF/H2O/NaHCO3; (iii)- MsCl/Et3N/CH2Cl2; (iv)- H2N(CH2)3NH2/THF;

(v)- (1) H2/Pd/AcOH/MeOH; (2) HCl/MeOH. 

Описанная выше линейная стратегия малоэффективна для получения α,α’-Me2Spm. Симметрия молекулы целевого соединения позволила осуществить конвергентный синтез (Схема 3), ключевой стадией которого являлось алкилирование бис-о-нитрофенилсульфо-нильного (Ns) производного 1,4-диаминобутана (11) N-Cbz-3-аминобутилбромидом (10) и целевой α,ω-Me2Spm был получен в виде тетрахлоргидрата с суммарным выходом 57%, считая на (4).

Схема 3

(i)- LiBr/THF; (ii)- (1) NsNH(CH2)4NHNs/DMF/K2CO3; (2) PhSH/DMF/K2CO3; (iii)- (1) H2/Pd/AcOH/MeOH;

(2) HCl/MeOH.

Синтезированные такими способами α-MeSpd, α-MeSpm и α,α’-Me2Spm по данным ВЭЖХ в стандартных условиях анализа полиаминов (Hyvonen T., et al. 1992. J.Chromatogr., 574, 17-21) имели чистоту более 99.5%.

Активность рацемических α-метилированных аналогов Spd и Spm in vivo. 1

Активация катаболизма полиаминов в результате супериндукции SSAT нетоксичны-ми дозами солей Zn2+ и диэтил-нор-Spm (индуктор SSAT) у SSAT-трансгенных крыс приво-дит к истощению пула Spd и Spm, наиболее выраженному в поджелудочной железе и печени, и развитию острого некротизирующего панкреатита, который вызывает 100% гибель живот-ных в течение 72 ч (Alhonen L., et al. 2000. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 8290-8295). К моменту начала настоящего исследования не было известно способов обеспечения функциональной целостности поджелудочной железы на фоне активации SSAT.

       Оказалось, что даже однократное введение α-MeSpd (50 мг/кг) SSAT-трансгенным крысам до индукции фермента полностью предотвращало развитие острого панкреатита. Более того, введение крысам α-MeSpd или α,α’-Me2Spm через 6 ч после индукции фермента существенно снижает тяжесть заболевания и исключает смертность животных как минимум в течение 14 сут (выживаемость составляет 100% в случае α-MeSpd и 90% в случае α,α’-Me2Spm). Соответственно, именно дефицит полиаминов, по-видимому, является причиной развития панкреатита у SSAT-трансгенных крыс. Следует отметить, что в поджелудочной железе α,α’-Me2Spm эффективно (~ на 35% за 48 ч) расщеплялся до α-MeSpd, что свидетель-ствует о его катаболической неустойчивости in vivo.

       Известно, что одним из факторов инициации острого панкреатита является активация трипсиногена, однако молекулярные механизмы этого процесса окончательно не установле-ны (Halangk W., et al. 2002. Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol., 282, 367–374). При обра-ботке солями Zn2+ изолированных ацинарных клеток поджелудочной железы SSAT-транс-генных крыс наблюдается быстрое снижение внутриклеточной концентрации полиаминов в результате индукции SSAT и существенное повышение активности трипсиногена. Предвари-тельное введение животным α,α’-Me2Spm блокирует активацию трипсиногена в ацинарных клетках, что свидетельствует о возможном участии полиаминов в процессах регуляции ак-тивности клеточных протеаз.

       Следует отметить, что и на других лабораторных моделях развитие панкреатита со-провождается активацией катаболизма полиаминов в поджелудочной железе, приводящей к истощению пула Spm и Spd. Подобные изменения были отмечены у немногочисленных об-следованных пациентов, страдающих острым или хроническим панкреатитом. Поскольку на-бор веществ, используемых для терапии острого панкреатита, весьма ограничен, можно предположить, что катаболически устойчивые аналоги Spm и Spd представят определенный интерес и для практической медицины.

       Регенерация печени крыс после частичной гепатектомии была одним из первых при-меров, на котором in vivo удалось показать необходимость полиаминов для нормального рос-та животных клеток (Janne J. 1967. Acta Physiol.Scand Suppl., 300, 1–71). На ранних стадиях регенерации наблюдается увеличение концентрации Put и некоторое снижение уровня Spd, а количество Spm практически не изменяется. У SSAT-трансгенных крыс частичная гепатэкто-мия сопровождается резким снижением уровня Spd (Alhonen L., et al. 2002. Biochem.J., 362, 149–153), по-видимому, из-за самопроизвольной индукции SSAT в результате операционно-го вмешательства. У таких крыс способность печени к регенерации восстанавливается лишь через 3 сут, когда за счет высокой активности ODC уровень Spd в печени вновь достигает предоперационного значения. Введение SSAT-трансгенным крысам α-MeSpd перед операци-ей снимает блок регенерации печени, что указывает на важность полиаминов для нормально-го протекания регенерационных процессов. Таким образом, казалось, что именно Spd а не Spm необходим для обеспечения процессов регенерации печени крыс. Однако, введение α,α’-Me2Spm SSAT-трансгенным крысам перед частичной гепатэктомией показало, что этот аналог Spm столь же эффективен, как и α-MeSpd. Превращение α,α’-Me2Spm в α-MeSpd в печени, в отличие от поджелудочной железы, происходит лишь в незначительной степени и концентрация α-MeSpd, образовавшегося из α,α’-Me2Spm, оказывается намного ниже необ-ходимой для инициации регенерации. Таким образом, в данном случае Spm и Spd взаимо-заменяемы. Исследование влияния (R,R)- и (S,S)-диастереомеров α,α’-Me2Spm (синтез и био-химические свойства диастереомеров описаны в следующих разделах) на способность пече-ни SSAT-трансгенных крыс к регенерации после частичной гепатэктомии показало, что оба диастереомера одинаково эффективны, т.е. стереоконфигурация аналога несущественна.

Tаким образом впервые был найден способ обращения последствий супериндукции SSAT in vivo, позволяющий предотвращать развитие острого панкреатита у SSAT-трансген-ных крыс и показано, что α-MeSpd и α,α’-Me2Spm представляют собой функционально-ак-тивные миметики Spd и Spm, соответственно. Полученные данные о метаболизме рацемичес-ких форм этих аналогов свидетельствовали о необходимости получения индивидуальных изомеров и диастереоизомеров и детального изучения их взаимодействия с ферментами метаболима полиаминов.

Синтез оптических изомеров α-метилированных полиаминов

Молекулы α-метилполиаминов хиральны, а оптические изомеры известных хираль-ных аналогов полиаминов обладают разной биологической активностью. Так, среди изоме-ров 2,10-дигидрокси-N1,N11-диэтилнорспермина и 2,10-дигидрокси-N1-циклопропилметил-N11-этилнорспермина лишь один диастереомер каждого из веществ оказался супериндукто-ром SSAT (Bergeron R.J., et al. 2001. J.Med.Chem., 44, 2451-2459). Можно ожидать, что и сте-реоизомеры α-метилполиаминов будут по-разному узнаваться клеточными полиамин-связы-вающими сайтами и проявлять различную биологическую активность.

Учитывая, что структура целевых α-метилполиаминов не слишком сложна, рациональ-нальным подходом представлялось использование коммерчески доступных энантиомерно чистых исходных соединений. Поэтому для построения 3-аминобутанового фрагмента требу-емой конфигурации использовали энантиомеры 2-аминопропанола (12), углеродный скелет которых удлиняли на 1 атом алкилированием цианид-иона мезилатом N-Вос аланинола (14), что приводило к нитрилу (15). Нитрилы (15) восстанавливали LiAlH4 в эфире при -5C, что без рацемизации приводило к аминам, которые превращали в о-нитрофенилсульфонильные (Ns) производные (16), служившие универсальными хиральными блоками для синтеза всех оптических изомеров α-метилполиаминов (Схема 4). Для получения энантиомеров α-MeSpd соединения (16) алкилировали N-(4-йодбутил)-фталимидом, что приводило к полностью за-щищенному триамину (17). Удаление Ns-групп приводило к диза-щищенным α-MeSpd, кото-рые очищали хроматографией на силикагеле. После удаления Boc- и фталильной защитных групп целевые (R)- и (S)- изомеры α-MeSpd были выделены в виде трихлоргидратов с сум-марными выходами 43% и 45%, считая на (12а) и (12b), соответственно.

Схема 4

(i)- Boc2O/Et3N/CHCl3; (ii)- MsCl/Et3N/CH2Cl2; (iii)- NaCN/DMSO, 40C; (iv)- (1) LiAlH4/Et2O, -5C; (2) NsCl/Et3N/CH2Cl2, 0C; (v)- PhtN(CH2)4I/K2CO3/DMF; (vi)- (1) PhSH/K2CO3/DMF; (2) N2H4/EtOH/; (3) HCl/MeOH; (vii)- (1) HCl/MeOH; (2) AcCl/Et3N/THF; (3) PhSH/K2CO3/DMF; (4) N2H4/EtOH/; (5) HCl/MeOH.

Для получения (R)- и (S)-α-MeSpm cульфамиды (16) обрабатывали избытком 1-бром-4-хлорбутана в DMF в присутствие поташа (Схема 5). Полученные хлориды превращали в иодиды (18), вводили в реакцию с избытком 1,3-диаминопропана и соединения (19) очи-щали колоночной хроматографией на силикагеле. Следует отметить, что диамины (19) оказа-лись неустойчивы при хранении, вероятно из-за внутри- или межмолекулярного замещения сульфамидной группы. Эти наблюдения вполне согласуются с тем, что Ns-группа легко уда-ляется под действием алкил- и арилсульфид-анионов, нуклеофильность которых значительно выше чем у аминогруппы. Защитные группы в соединениях (19) удаляли последовательной обработкой тиофенолом в DMF и затем раствором HCl в абс.этаноле. Последующая пере-кристаллизация из Н2О-МеОН-EtOH приводила к целевым тетрахлоргидратам (R)- и (S)-α-MeSpm с суммарными выходами 32% и 33%, считая на (12а) и (12b), соответственно.

Схема 5

(i)- (1) Cl(CH2)4Br/DMF/K2CO3; (2) NaI/(CH3)2CO; (ii)- H2N(CH2)3NH2/THF; (iii)- (1) PhSH/K2CO3/DMF;

(2) HCl/EtOH.

Молекула α,α’-Me2Spm симметрична и поэтому существуют лишь три диастереомера – (R,R), (S,S) и (R,S). Для получения (R,R)- и (S,S)- изомеров α,α’-Me2Spm сульфамиды (16) вводили в реакцию со стехиометрическим количеством дииодбутана и затем “one-pot” удаля-ли Ns-группы (Схема 6). При этом следы не вошедших в реакцию соединений (16) после де-нозилирования превращались в соответствующие (R)- и (S)-изомеры N3-(трет-бутилоксикар-бонил)-1,3-диаминобутана, которые плохо отделялись хроматографией от ди-Вос-производ-ных (20). Поэтому перед удалением Ns-групп к реакционной смеси прибавляли бензилбромид (10 мольн. %) для алкилирования не вошедших в реакцию с дийодбутаном нозилатов (16). Та-кая последовательность операций позволяла легко выделять в чистом виде ди-Вос-производ-ные (20). После удаления Вос-групп целевые (R,R)- и (S,S)-α,α’-Me2Spm получали в виде тет-рахлоргидратов с суммарными выходами 42% и 46 %, считая на (12а) и (12b), соответственно

Схема 6

(i)- (1) I(CH2)4I/K2CO3/DMF; (2) PhSH/K2CO3/DMF; (ii)- 17b/K2CO3/DMF; (2) PhSH/K2CO3/DMF; (iii)- HCl/EtOH.

Мезо-форму α,α’-Me2Spm получали из иодида (18b), который обрабатывали стехио-метрическим количеством сульфамида (16a) (Схема 6) аналогично описанному выше для (R,R)- и (S,S)-диастереолмеров и (R,S)-ди-Вос-α,α’-Me2Spm (20c) выделяли хроматографией на силикагеле. Вос-группы удаляли действием HCl в абс.этаноле и целевой (R,S)-α,α’-Me2Spm получали в виде тетрахлоргидрата с суммарным выходом 40 %, считая на (12b).

Синтезированные такими способами неописанные ранее изомеры α-MeSpd и α-MeSpm, а также диастереомеры α,α’-Me2Spm по данным ВЭЖХ в стандартных условиях анализа по-лиаминов (Hyvonen T., et al. 1992. J.Chromatogr., 574, 17-21) имели чистоту более 99.5%.

Взаимодействие оптических изомеров α-метилированных

аналогов Spm и Spd с ферментами метаболизма полиаминов и клетками 2

       Spm, Spd и их N1-ацетильные производные представляют собой ахиральные молекулы и до начала наших исследований в литературе отсутствовали какие-либо данные о стереоспе-цифичности ферментов их метаболизма. Вместе с тем, исходя из общих соображений, а так-же основываясь на различиях в активности хиральных аналогов дезоксиспергуалина (Lebre-ton L., et al. 1999. J.Med.Chem., 42, 4749–4763) и гидроксилированных производных диэтил-нор-спермина (Bergeron R.J., et al. 2001. J.Med.Chem., 44, 2451-2459), можно было предполо-жить существование скрытой стереоспецифичности соответствующих ферментов. Если это предположение справедливо, то использование оптических изомеров α-метилированных ана-логов Spm и Spd открывает неизвестные ранее подходы к тонкому регулированию активнос-ти ферментов метаболизма полиаминов и, что не менее важно, новые возможности преци-зионного воздействия на гомеостаз полиаминов в клетке.

Уже первые эксперименты показали, что флавин-зависимая ацетилполиаминооксида-за (АРАО) предпочтительно окисляет (R)-изомер N-Ac-α-MeSpd (Табл. 1).Таким образом, впервые было показано, что АРАО, природными субстратами которой служат ахиральные N1-Ac-Spd и N1-Ac-Spm, обладает скрытой сте-реоспецифичностью.

Табл. 1. Окисление расщепление N1-Ac-Spd и изоме-ров N-Ac-α-MeSpd под действием (AРАО).

Известно, что АРАО способна в присутствии ароматических альдегидов эффективно окис-лять и неацетилированный Spd (Holtta E. 1977. Biochemistry, 16, 91–100). Механизм этой реак-ции не исследован, а первоначальное предположение о промежуточном образовании в раство-ре оснований Шиффа (Holtta E. 1977. Biochemistry, 16, 91–100) представляется маловероятным при проведении реакции в 0.1 М глициновом буфере, а также, учитывая что взаимодействие ароматических альдегидов с 1,3-диаминопропанами приводит к достаточно сложной смеси продуктов, включая и циклические структуры (Metzler C.М., et al. 1980. J.Am.Chem.Soc., 102, 6075-6082). Оказалось, что бензальдегид (ВА) катализирует расщепление преимущественно (R)-α-MeSpd, а в присутствии пиридоксаля (PL) субстратом оказывается уже (S)-изомер (Табл. 2). Напротив, 4-пиридинальдегид (4-Py-Ald) неспособен осуществлять стереоконтроль реак-ции и одинаково эффективен как в случае (R)-, так и (S)-изомеров α-MeSpd

Табл. 2. Окислительное расщепление Spd и изомеров α-MeSpd AРАО. в присутствии бенз-альдегида (ВА), пиридоксаля (PL) и 4-пири-динальдегида (4-Py-Ald).

Таким образом, при помощи ахиральных ароматических альдегидов нам впервые удалось найти изящный способ регуля-ции стереоспецифичности АРАО, позво-ляющий избирательно окислять аналоги субстрата только (R)- или только (S)-конфигурации, что весьма необычно не только для флавин-зависимых оксидаз, но и для энзимологии в целом.

       Недавно в животных клетках была обнаружена сперминоксидаза (SMO) – новый фла-вин-зависимый фермент, окисляющий Spm в Spd без предварительного N1-ацетилирования (Wang Y., et al. 2001. Cancer Res., 61, 5370-5373). Так как родственная флавин-зависимая AРАО обладает скрытой стереоспецифичностью (см.выше), то мы исследовали взаимодейст-вие (R,R)- и (S,S)-диастереомеров α,α’-Me2Spm с рекомбинантной SMO. Оказалось, что суб-стратными свойствами обладал лишь (S,S)- α,α’-Me2Spm, а эффективность его расщепления была даже несколько выше, чем у Spm (Табл. 3). Таким образом, нам впервые удалось пока- казать, что SMO, как и АРАО, обладает

скрытой стереоспецифичностью. При этом, АРАО предпочтительно расщепляет (R)-N-Ac-α-MeSpd, а субстратом SMO, напротив, служит лишь (S,S)-α,α’-Me2Spm.

Табл. 3. Окислительное расщепление диастерео-меров α,α-Me2Spm сперминоксидазой.

       Аминокислота гипузин (Nε-(4-амино-2-оксибутил)-L-лизин), входящая в состав высо-коконсервативного участка фактора инициации трансляции eIF5A, присутствующего у всех эукариот, представляет собой одно из наиболее известных и метаболически-значимых кова-лентных производных Put (см. обзор: Park M.H. 2006. J.Biochem.(Tokyo), 139, 161–169). Так как немодифицированный eIF5A неактивен, то не всегда возможно однозначно определить, связано ли замедление роста клеток, вызванное снижением внутриклеточной концентрации Spd (единственный донор аминобутильного фрагмента), только с нарушением биосинтеза ги-пузина или имеет другие полиамин-зависимые причины. Располагая системой изомеров α-MeSpd и диастереомеров α,α’-Me2Spm, мы попытались дискриминировать гипузин-опосре-дованное ингибирование роста клеток и последствия, прямо не связанные с нарушением био-синтеза гипузина. Оказалось, что (R)- и (S)-изомеры α-MeSpd, а также и все три диастереоме-ра α,α’-Me2Spm, в равной степени способны поддерживать рост клеток DU145 в течение первых 6 сут инкубации с DFMO (Рис. 3). Однако при более продолжительном времени ин-гибирования ODC снижение внутриклеточной концентрации Spd становится критическим.

Рис. 3. Изомеры α-MeSpd и диастереомеры α,α-Me2Spd по-разному поддерживают рост клеток DU145 с истощенным пулом Spd и Put. Клетки DU145 выращивали в присутствии 5 mM DFMO в течение 3, 6, 9, или 12 дней без добавления α-MeSpd/ α,α’-Me2Spm (контроль), или в присутствии аналогов (100 μM). D, DFMO; R, (R)-α-MeSpd; S, (S)-α-MeSpd; RR, (R,R)-α,α’-Me2Spm; SS, (S,S)-α,α’-Me2Spm; RS, (R,S)- α,α’-Me2Spm

Из исследованных аналогов лишь (S)-α-MeSpd и, в меньшей степени, (S,S)-α,α’-Me2Spm, который частично превращался в (S)-α-MeSpd, эффективно поддерживали рост клеток. Эти результаты прямо указывают на существование двух независимых причин замедления роста клеток, вызываемых истощением пула Spd.

       Неспособность (R)-α-MeSpd поддерживать рост клеток DU145 при инкубации с DFMO более 6 сут привела к необходимости исследования субстратных свойств (R)- и (S)-изомеров α-MeSpd в дезоксигипузинсинтазной реакции, которая является скорость-опреде-ляющей стадией биосинтеза гипузинилированного eIF5A (Рис. 4). Субстратные свойства изо-

меров оценивали по образованию гомоспермидина, который в отсутствии eIF5A возникает при инкубации дезоксигипузинсинтазы (DHS) cо Spd или его аналогами в присутствии аль-тернативного акцептора аминобутильного фрагмента – [14С]-Put.

Рис. 4. Образования дезоксигипузинил-eIF5A и гомоспермидина в дезоксигипузинсинтазной реакции (по данным работы: Park J-H., et al. 2003. J.Biol.Chem., 278, 32683-32691)

Донором аминобутильного фрагмента в де-зоксигипузинсинтазной реакции оказался лишь (S)-α-MeSpd, т.е. впервые было обна-ружено, что дезоксигипузинсинтаза облада-ет скрытой стереоспецифичностью (Рис. 5). Это свойство фермента позволило при помощи

(R)- и (S)-изомеров α-MeSpd показать, что сначала замедление роста клеток определяется де-фицитом собственно полиаминов, а гипузин-опосредованные эффекты начинают проявлять-ся существенно позднее.

Рис. 5. Субстратные свойства стереоизомров

α-MeSpd в дезоксигипузинсинтазной реакции. Реакционная смесь (50 μl) содержала 0.2 M Gly-NaOH буфер (pH, 9.5), 50 μg BSA, 1 mM DTT, 1 mCi [14C]-Put (100 mCi/mmol), 1 mM NAD, 10 μM и 25 μM Spd или 10 μM и 25 μM изомеров MeSpd и 1.0 μg рекомбинантной DHS человека.

Системе активного транспорта Spm и Spd отводится важное место в поддержании го-меостаза полиаминов. Поэтому были исследованы особенности транспорта хиральных аналогов Spm и Spd в клетки DU145. Оказалось, что со-держание изомеров α-MeSpd и диастереомеров α,α’-Me2Spm в клетках было сопоставимо с содержанием Spm и Spd, что указывало на активный транспорт аналогов (данные не приведе-ны). Однако изомеры α-MeSpd и диастереомеров α,α’-Me2Spm по-разному конкурировали за транспорт со Spd и Spm, а наименее эффективными оказались (S)-α-MeSpd и (S,S)-α,α’-Me2Spm (Рис. 6).

Рис. 6. Транспорт стререо-изомеров MeSpd (a) и Me2Spm (b) в клетки DU145. Клетки инкубиро-вали в течение 10 мин с 10 μM [14C]-Spd (a) или 10 μM [14C]-Spm (b) в присутствии 1, 10 или 100 μM исследуе-мого стереоизомера. R, (R)-α-MeSpd; S, (S)-α-MeSpd; RR, (R,R)-α,α’-Me2Spm; SS, (S,S)-α,α’-Me2Spm; RS, (R,S) -α,α’-Me2Spm.

Таким образом, система транспорта полиаминов обладает стереоспецифичностью, что позво-

ляет регулировать доступность их аналогов, изменяя конфигурацию хирального центра.

       Одним из важнейших регуляторов внутриклеточного содержания полиаминов являет-ся небольшой белок антизим (AZ), биосинтез которого индуцируется в ответ на повышение концентрации полиаминов в клетке (Spm и Spd вызывают +1 сдвиг рамки считывания мРНК AZ, приводящий к образованию активного белка). AZ связывается с ODC, вызывая диссоциа-цию фермента на субъединицы, которые не обладают декарбоксилазной активностью, что приводит к снижению активности ODC в клетке. Однако эффекты диастереомеров α,α’-Me2Spm значительно отличались, а (S,S)-α,α’-Me2Spm по своей активности превосходил даже DFMO (Табл. 4).

Табл. 4. Влияние диастереомеров α,α-Me2Spm (100 μM) на активности ODC и SSAT через 72 ч инкубации клеток DU145 с с аналогами Spm.

Таким образом, изменяя конфигура-цию хирального центра α-MeSpd (дан-ные не приведены) и α,α’-Me2Spm, удается регулировать активность ODC в клетке, по-види-мому, через AZ-опосредованные механизмы.

       Известно, что помимо диссоциации ODC на субъединицы AZ ингибирует и транспорт полиаминов в клетки. Поэтому был исследован транспорт изомеров α-MeSpd и α,α’-Me2Spm в присутствии и отсутствии СНХ (ингибитор биосинтеза белка в клетке). Оказалось, что ин-гибирование биосинтеза AZ сильнее всего сказывается на накоплении (S,S)-α,α’-Me2Spm и (S)-α-MeSpd (Рис. 7), т.е. именно тех изомеров, которые наиболее эффективно сни-жают активность ODC в клетке (Табл. 4).

Рис. 7. Влияние биосинтеза AZ на транспорт стереоизомеров MeSpd и Me2Spm в клетки DU145. Клетки инкубировали с или без CHX (10 μg/ml) в течение 1 ч, а затем в присутствии аналогов (100 μM) еще в течение 2 ч. R, (R)-α-MeSpd; S, (S)-α-MeSpd; RR, (R,R)-α,α’-Me2Spm; SS, (S,S)-α,α’-Me2Spm; RS, (R,S)- α,α’-Me2Spm.

Таким образом, гипотеза о возможности стереоконтроля +1 сдвига рамки считывания мРНК AZ получила дополнительные подтверждения. В заклю-чение было исследовано влияние стереоизомеров α-MeSpd и α,α’-Me2Spm на собственно +1 сдвиг рамки считывания мРНК (Рис. 8). Оказалось,

Рис. 8. Индукция +1 сдвига рамки считывания мРНК сте-реоизомерами MeSpd (1.25 μM) и Me2Spm (2.5 μM). Клетки HEK-293 преинкубировали 48 ч с 2.5 mM DFMO и затем трансфицировали плазмидой, несущей ген люциферазы под контролем промотора, содержащего участок, обеспечивающий +1 сдвиг рамки считывания. Стереоизомеры прибавляли через 12 ч после трансфекции и клетки выращивали еще 24 ч. R, (R)-

α-MeSpd; S, (S)-α-MeSpd; RR, (R,R)-α,α’-Me2Spm; SS, (S,S)- α,α’-Me2Spm; RS, (R,S)- α,α’-Me2Spm.

что наибольшим эффектом среди аналогов Spm обладает (S,S)-α,α’-Me2Spm, а среди анало-гов Spd – (S)-α-MeSpd. Эти данные хорошо объясняют влияние AZ на транспорт аналогов в клетки, а также их эффекты на активность ODC в клетке.

Таким образом, используя оптические изомеры Spm и Spd удалось оригинальным об-разом воздействовать на процессы биосинтеза AZ. Вместе с тем, следует отметить, что моле-кулярные механизмы стереоконтроля +1 сдвига рамки считывания мРНК AZ изомерами Spd и Spm остаются неясными, как и эффекты собственно Spm и Spd, также не имеющие одно-значной интерпретации.

Синтез рацемических β-, γ- и ω-метилированных аналогов cпермидина,

N1-ацетилспермидина и спермина.

Неизвестные ранее изомеры α-метилированных полиаминов, впервые синтезирован-ные в ходе выполнения настоящего исследования, оказались ценным инструментом исследо-вания клеточных функций Spm и Spd, ферментов их метаболизма и регуляторных механиз-мов, ответственных за поддержание гомеостаза полиаминов в клетке. Оказалось, что конфи-гурация α-углеродного атома “is a hot point of polyamine molecule”. Вместе с тем, вопрос о существовании других критических точек в молекулах Spm и Spd, существенных для кор-ректного узнавания и функционирования полиаминов в клетке, оставался открытым. Более того, учитывая раз-нообразие внутри-клеточных превра-щений Spd и Spm,

Рис. 9. Новые С-мети-лированные аналоги Spd, N1-Ac-Spd и Spm.

равно как и множе-ственность их кле-точных функций, представляется вполне обоснованным использовать не только α-метилиро-ванные аналоги, а систему С-метилированных производных (Рис. 9), предполагая, что биохи-миические свойства таких аналогов будут определяться не только трипротонированным при физиологическом рН скелетом Spd, но и положением метильной группы. Эти соображения, несмотря на кажущуюся механистичность перемещения метильной группы по полиаминово-му скелету, позволили получить ряд неожиданных и значимых для биохимии Spm и Spd ре-зультатов (см. следующий раздел).

       Для получения β-MeSpd и γ-MeSpd удобным представлялось использование восста-новление нитрилов (22а) и (22b), которые были получены присоединением Put к метакрило-нитрилу (21а) и кротононитрилу (21b) (Схема 7). Однако, восстановление нитрилов водоро-дом над Ni-Ренея или PtO2 проходило неоднозначно и сопровождалось образованием набора минорных побочных продуктов, трудно отделяемых от целевых MeSpd’s хроматографией на силикагеле. Тем не менее, этим способом β-MeSpd и γ-MeSpd были синтезированы в виде хо-рошо кристаллизующихся трихлоргидратов с суммарными выходами 16% и 32%, считая на метакрилонитрил и кротононитрил, соответственно.

Схема 7

i- NH2(CH2)4NH2/EtOH/20°C90°C; ii- H2/Ni-Raney/EtOH; iii- Boc2O/THF; iv- LiAlH4/Et2O/-5°C; v- HCl/EtOH.

Для упрощения этих синтезов нитрилы (22а) и (22b) были превращены в соответствующие ди-Вос-производные, которые гладко и с хорошим выходом восстанавливались LiAlH4 в эфире при -5°С до ди-Вос-аминов (23а) и (23b). Последующее удаление защитных групп привело к искомым трихлоргидратам β-MeSpd и γ-MeSpd с суммарными выходами 27% и 45%, считая на (21а) и (21b), соответственно.

Промежуточные ди-Вос-амины (23а) и (23b) были использованы в качестве исходных соединений в синтезах N1-ацетильных производных β- и γ-MeSpd (Схема 7). Последователь-ное ацетилирование свободной аминогруппы и удаление Вос-защитных групп привели к кристаллическому дихлоргидрату N1-Ас-β-MeSpd с выходом 23.4% и быстро смокающему на воздухе дихлоргидрату N1-Ас-γ-MeSpd с выходом 39%, считая на (21а) и (21b).

       Учитывая трудности, возникшие при выделении продуктов восстановления нитрилов (22а) и (22b) водородом над Ni-Ренея или PtO2, для получения β,β’-Me2Spm был приготовлен ди-Вос-динитрил (26). Однако этот динитрил не растворялся в эфире, а проведение восста-новления LiAlH4 в THF при -5°С сопровождалось побочным элиминированием. Соответст-венно, после удаления Вос-защитных групп и кристаллизации были получены в примерно равных количествах хорошо кристаллизующийся тетрахлоргидрат β,β’-Me2Spm с суммар-ным выходом 3.5%, считая на метакрилонитрил, и трихлоргидрат β-MeSpd (Схема 8). Для получения γ,γ’-Me2Spm было использовано восстановление динитрила (24b) водородом над PtO2 (Схема 8), т.к. восстановление ди-Вос-производного динитрила (24b) LiAlH4 в THF при -5°С привело лишь к следовым количествам искомого ди-Вос-диамина. Как и в случае синте-за γ-MeSpd (см.выше) наблюдалось образованием спектра побочных продуктов, трудно отде-ляемых от γ,γ’-Me2Spm хроматографией на силикагеле. Тем не менее, медленно смокающий на воздухе тетрахлоргидрат γ,γ’-Me2Spm удалось получить с выходом 11.7%, считая на (21а).

Схема 8

i- NH2(CH2)4NH2/20°C90°C; ii- H2/PtO2/EtOH; iii- Boc2O/THF; iv- LiAlH4/Et2O/-5°C; v- HCl/EtOH.

       ω-MeSpd и α,ω-Me2Spd сначала были синтезированы исходя из 3-аминобутанола-1 (2) (Схема 9). Ключевым интермедиатом этих 12-ти стадийных синтезов был Вос-нозилат (28), который алкилировали 3-(N-бензилоксикарбонил)амино-1-бромпропаном для получе-ния (29а), являющегося предшественником ω-MeSpd, или 3-(N-бензилоксикарбонил)амино-1-бромбутаном для получения (29b) – предшественника α,ω-Me2Spd (Схема 9). Последую-

Схема 9

i- Boc2O/THF; ii- MsCl/Et3N/CH2Cl2; iii- NaCN/DMSO; iv- LiAlH4/Et2O/-5°C; v- NsCl/CH2Cl2/Et3N;

vi- 1. CbzNH(CH2)3Br/DMF/K2CO3/45°C для 28а; 2. CbzNHCH(CH3)(CH2)2Br/DMF/K2CO3/45°C для 28b;

vii- PhSH/DMF/K2CO3; viii- 1. HCl/EtOH; 2. H2/Pd/AcOH/MeOH; 3. 1. HCl/EtOH.

щее удаление защитных групп гладко приводило к целевым хорошо кристаллизующимся трихлоргидратам ω-MeSpd и α,ω-Me2Spd с суммарными выходами 31%, считая на метан-сульфонат (27) и 12.2%, считая на аминоспирт (2), соответственно.

       Впоследствии (Схема 10), для упрощения синтеза ω-MeSpd мы использовали алкили-

Схема 10

i- CbzCl/H2O/NaHCO3; ii- MsCl/Et3N/ CH2Cl2; iii- 1. NH2CH2CH(CH3)CH2NH2 для β-MeSpd;

2. NH2CH2C(CH3)2CH2NH2 для β,β-Me2Spd; 3. NH2(CH2)3NH2/THF для ω-MeSpd; 4. NH2(CH2)4NH2/THF

для γ-MeSpd; iv- H2/Pd/MeOH/AcOH; i- HCl/EtOH.

рование диаминов мезилатами N-защищенных спиртов. Этим методом в 4 стадии были по-лучены также β-MeSpd, β,β’-MeSpd и γ-MeSpd с суммарными выходами 41%, 38% и 23%, считая на (30а) и (30с), соответственно. Выход ω-MeSpd составил 34.5%, считая на (30b).

       Промежуточный Cbz-диамин (35) был использован в качестве исходного соединения при получении N1-Ас-ω-MeSpd (Схема 11). Для дискриминации первичной и вторичной ами-ногрупп было использовано превращение первичной в салицилиденовое производное, кото-рое после введения Вос-защиты по вторичной аминогруппе, было превращено в первичный амин (36) обработкой CH3ONH2-основанием. Ацетилирование первичной аминогруппы и последовательное удаление Boc- и Cbz-защитных групп привели к целевому N1-Ac-ω-MeSpd с выходом 46%, считая на (35).

Схема 11

i- o-C6H4(OH)CHO/THF; ii- Boc2O/THF; iii- MeONH2/THF; iv- AcCl/Et3N/THF; v- H2/Pd/AcOH/MeOH; vi- HCl/EtOH

       Таким образом, семейство α-метилированных аналогов Spm и Spd было дополнено неизвестными ранее β-, γ-, ω- и α,ω-Me2Spd, N1-ацетильными производными β-, γ- и ω-MeSpd, а также β,β’-Me2Spm и γ,γ’-Me2Spm.

Взаимодействие С-метилированных аналогов Spd с ферментами

метаболизма полиаминов и клетками 3

На первом этапе мы исследовали взаимодействие β-MeSpd, γ-MeSpd, ω-MeSpd и α,ω-Me2Spd со SSAT в сравнении с α-MeSpd и Spd. Как и следовало ожидать, ω-MeSpd, подобно описанному ранее ω,ω-Me2Spd (Nagarajan S., et al. 1988. Biochem.J., 254, 373-378), оказался хорошим субстратом фермента, а α,ω-Me2Spd не ацетилировался как и α-MeSpd (Табл. 5). Удивительно, но β-MeSpd, в отличие от описанного ранее β,β-Me2Spd, имеющего две метиль-ные группы при β-углеродном атоме и α-MeSpd, оказался хорошим субстратом SSAT с близким Spd значением Km, но заметно снижен-ным, по сравнению со Spd значением Vmax.

Табл. 5. Взаимодействие C-метилированных анало-гов Spd с SSAT.

Таким образом, уменьшение количества замес-тителей кардинально влияет на субстратные свойства аналога. Оказалось, что перемещение метильной группы еще на одно положение, приводящее к γ-MeSpd, вновь лишает аналог суб-стратных свойств в SSAT-реакции (Табл. 5). Такие, на первый взгляд, парадоксальные зави-симости субстратных свойств от положения и количества метильных групп хорошо согласу-ются с данными рентгено-структурных исследований комплекса фермента с коньюгатом Spm и СоА, моделирующим бисубстратный комплекс (Hegde S.S., et al. 2007. Biochemistry, 46, 7187-7195), а также бинарным комплексом SH-CoA – Spm (Montemayor E.J. & Hoffman D.W. 2008. Biochemistry, 47, 9145–9153) и отражают особенности узнавания полиаминов SSAT.

       В предыдущем разделе было показано, что N-Ac-α-MeSpd является хорошим субстра-том АРАО, а в присутствии ароматических альдегидов АРАО эффективно расщепляла и соб-ственно α-MeSpd. Поэтому мы исследовали возможность окислительного расщепления С-метилированных MeSpd’s под действием АРАО в присутствии бензальдегида, который по данным (Holtta E. 1977. Biochemistry, 16, 91–100) является самым активным из исследован-ных альдегидов. Оказалось, что бензальдегид эффективно стимулирует катализируемое АРАО расщепление всех синтезированных аналогов за исключением γ-MeSpd, в котором метильная группа находится при атоме углерода, образующего расщепляемую в ходе поли-аминооксидазной реакции связь со вторичной аминогруппой (Рис. 10). Соответственно, этот участок субстрата должен быть высококомплементарен активному центру фермента и нали-чие метильной группы в γ-положении Spd может привести к непродуктивному связыванию этого аналога или затруднить отрыв протона, являющийся движущей силой окислительного расщепления, приводящего к образованию промежуточного основания Шиффа. Таким образом, γ-MeSpd не является субстратом ни АРАО, ни SSAT и представляет собой новый катаболически устойчивый аналог Spd.

Рис. 10. Взаимодействие C-метилированных аналогов Spd с APAO в присутствии или без 5 mM бензальдегида (BА).

Следует особо отметить, что β-MeSpd достаточно эффектив-но расщеплялся АРАО и в отсутствии бензальдегида (Рис. 10), что совершенно не характерно для этого фермента, учитывая известные данные о его субстратной специфичности (см.обзор: Casero R.A. & Pegg A.E. 2009. Biochem.J., 421, 323–338). В присутствии же бензальдегида, субстратные свойства β-MeSpd намного превосходили таковые для Spd в аналогичных усло-виях (Рис. 10). Таким образом, перемещая метильную группу по скелету спермидина, удается получать как катаболически устойчивые производные (γ-MeSpd), так и усиливать способ-ность аналога к окислительному расщеплению (β-MeSpd), то есть появляются неизвестные ранее возможности для регуляции метаболизма полиаминов.

На следующем этапе был исследован транспорт синтезированных аналогов Spd в клетки DU145. Все производные узнавались системой транспорта в качестве Spd (Рис. 11) и конкурировали за транспорт с [14C]-Spd, однако лишь β-MeSpd был столь же эффективен как

и “холодный“ Spd, тогда как остальные С-метилированные производные оказались несколь-ко менее активными.

Рис. 11. Транспорт C-метилированных аналогов Spd в клетки DU145. Клетки инкубировали в течение 10 мин с 10 μM [14C]-Spd в присутствии 1, 10 или 100 μM исследуемых аналогов.

       Проникнув в клетку С-метилирован-ные производные Spd могут превращаться в соответствующие аналоги Spm. Из литера-туры известно, что гем-Me2Spd’s, несущие две метильные группы при одном атоме углерода (Nagarajan S., et al. 1988. Biochem.J., 254, 373-378), не являются субстратами Spm-синтазы. Уменьшение количества метильных групп, как и в случае SSAT (см.выше), кардинально сказывается на субстратных свойствах аналогов В клетках DU145 α-MeSpd, β-MeSpd и ω-MeSpd метаболизировали до соответствующих про-изводных Spm (Табл. 6), но этого не наблюдалось в клетках дефицитных по Spm-синтазе (данные не приведены). Следует отметить, что α-MeSpm и β-MeSpm образовывались уже после 24 ч инкубации клеток с соответ-ствующими аналогами Spd, тогда как δ-MeSpm, возникающий из ω-MeSpd де-тектировался лишь после 48 ч инкуба-ции аналога с клетками.

Табл. 6. Биосинтез C-метилированных анало-гов Spm в клетках DU145. Клетки выращивали в присутствии C-метилированных аналогов Spd (100 μM) и 1 mM аминогуанидина (AG), ингиби-тора сывороточных аминооксидаз, предотвраща-ющего неспецифическую токсичность аналогов.

Удивительно, что γ-MeSpd не метаболизировал в клетках DU145 до γ-MeSpm даже после 72 ч инкубации клеток с аналогом (Табл.6), что прямо указывает на существование высокой комплементарности между соответствующим участком активного центра Spm-синтазы и центральным фрагментом молекулы Spd, обеспечивающим продуктивное связывание суб-страта и его аналогов в активном центре фермента. Таким образом, γ-MeSpd представляет собой новый метаболически устойчивый аналог Spd, а перемещение метильной группы по скелету Spd позволяет регулировать субстратные свойства С-метилированных производных Spd в Spm-синтазной реакции, что не описано ни для одного из известных аналогов Spd.

       Сбалансированная работа ферментов синтеза и деградации полиаминов наряду с сис-темой активного транспорта Spm и Spd, являются основными факторами, позволяющими поддерживать необходимую концентрацию полиаминов в клетке. Активность, биосинтез и деградация ферментов метаболизма полиаминов зависят от многих факторов, в том числе и

от внутриклеточного содержания Spm и Spd. Поэтому было изучено влияние С-метилирован-ных аналогов Spd на активность ключевых ферментов метаболизма полиаминов. Наиболее выраженные эффекты наблюдались в случае ODC – скорость-лимитирующего фермента на путях биосинтеза полиаминов (Табл. 7). Оказа-лось, что β-MeSpd, в противоположность всем остальным производным, практически не сни-жал активность ODC ни после 24 ч, ни после 72 ч инкубации клеток с аналогом.

Табл.7. Влияние C-метилированных аналогов Spd (100 µM) на активность ODC в клетках DU145. Клетки выра-щивали в присутствии 1 mM AG.

Такие необычные свойства β-MeSpd привели к необходимости оценить концентрационную и временную зависимости эффекта. Оказалось, что в случае 4-х ч инкубации клеток DU145 с 10 M β-MeSpd активность ODC практически не изменялась, тогда как для α-MeSpd она сос-тавляла ~30%, для ω-MeSpd ~40%, а для γ-MeSpd – около 50% от активности ODC в конт-рольных клетках (Рис. 12). Подобная зависимость активности аналога от положения метиль-ной группы является уникальной и связана, скорее все-го, с низкой эффективностью индукции биосинтеза AZ β-MeSpd, что совершенно не характерно для функцио-нально-активных миметиков полиаминов, и открывает спектр новых возможностей для регулирования мета-болизма полиаминов.

Рис. 12. Влияние C-метилированных аналогов Spd на актив-ность ODC в клетках DU145. Клетки инкубировали с 10, 25, 50 или 100 μM аналогов и 1 mM AG в течение 4 ч.

       На следующем этапе был исследован транспорт С-метилированных аналогов Spd в об-работанные и необработанные СНХ (ингибитор биосинтеза белка) клетки DU145. Оказалось, что в отсутствии AZ все аналоги за исключением β-MeSpd накапливались значительно эф-фективнее, чем в клетках (Рис. 13), способных синтезировать дополнительные количества AZ в ответ на повышение внутриклеточной концентрации аналогов полиаминов, что пре-пятствует проникновению экзогенных полиаминов в клетки и способствует поддержанию гомеостаза Spm и Spd. В случае β-MeSpd различий между обработанными и необработанными

Рис. 13. Влияние AZ на транспорт C-метилированных аналогов Spd в клетки DU145. Клетки инкубировали 2 ч с CHX (10 μg/mL), или без CHX, а затем еще 4 ч с аналогами Spd (100 μM).

СНХ клетками не наблюдалось (Рис. 13), что косвенно указы-зывает на то, что этот аналог, в отличие от других С-метилированных производных Spd не

способен, или весьма слабо индуцирует биосинтез AZ в клетках DU145.

Способность С-метилированных производных Spd индуцировать биосинтез AZ по-добно природным полиаминам и большинству их синтетических аналогов, была оценена ис-пользуя антитела к AZ. Оказалось, что количество AZ зави-сит от положения метильной группы в структуре аналога. β-MeSpd слабо индуцировал биосинтез AZ, γ-MeSpd был нес-колько активнее, но действовал слабее чем остальные С-ме-тилированные производные Spd и контрольные DENSpm и DESpm (Рис. 14A). Пониженная способность β-MeSpd инду-

Рис. 14. Влияние C-метилированных аналогов Spd на биосинтез AZ. Клетки инкубировали 4 ч с исследуемыми аналогами (100 μM) без MG132 (A) или в присутствии 25 μM ингибитора (B). Аликвоту суммар-ной белковой фракции (50 μg) анализировали электрофорезом в 12 % SDS-полиакриламидном геле и визуализировали иммуноблотингом с антителами к AZ.

цировать биосинтез AZ была подтверждена и в экспериментах с MG132, ингибитором про-теосом-опосредованной деградации белков. В присутствии MG132 количество AZ сущест-венно увеличивалось после добавления в среду любого из С-метилированных производных MeSpd, за исключением β-MeSpd (Рис 14В). Возможность регулировать экспрессию AZ простым перемещением метильной группы вдоль скелета Spd является совершенно неожи-данной, уникальной и не имеющей аналогий в литературе, так как все исследованные функ-ционально-активные аналоги Spm и Spd вызывают +1 сдвиг рамки считывания мРНК AZ и индуцируют его биосинтез (см.обзор: Kahana С. 2009. Cell.Mol.Life Sci., 66, 2479-2488).

       На заключительном этапе была исследована способность С-метилированных аналогов Spd восстанавливать рост клеток DU145 с истощенным пулом полиаминов (18 сут инкубации с 5 mM DFMO) (Рис. 15). Из литературы известно, что даже гем-Me2Spd’s способны поддер-живать рост клеток с острым дефицитом полиаминов, возникающим в результате инкубации с DFMO в течение 3 сут, т.е. в условиях когда еще не затра-гиваются процессы гипузини-лирования eIF5А

Рис. 15. Способность C-метилиро-ванных аналогов Spd (100 µM) поддерживать рост клеток DU145 с истощенным в результате инку-бации с DFMO (5 mM) пулом по-лиаминов. (А) – в присутствии 1 mM AG; (В) – без 1 mM AG.

(Nagarajan S., et al. 1988. Biochem.J., 254, 373-378). Соответственно и С-метилированные аналоги Spd, представляю-щие собой более тонкий инструмент исследования, в 100 M концентрации в примерно рав-ной степени восстанавливали рост клеток подобно 100 M Spd (Рис. 15). Таким образом, γ-MeSpd представляет собой не только новый метаболически устойчивый, но и функциональ-но-активный миметик Spd, что делает его ценным инструментом исследования, позволяю-щим, в том числе, раздельно изучать клеточные функции Spm и Spd в условиях острого де-фицита полиаминов.

Вместе с тем, в условиях хронического дефицита полиаминов, приводящего к “недоги-пузинилированию” eIF5А (инкубация клеток с DFMO от 12 сут и более), активности аналогов сильно отличались и лишь α- и β-MeSpd были способны восстанавливать рост клеток (Рис.15) Поэтому были исследованы субстратные свойства аналогов в DHS-реакции (Рис. 16). Оказа-лось, что ω-MeSpd не является субстратом DHS, тогда как три другиx аналога были донорами аминобутильного остат-ка, хотя их субстратные свойства и ухудшались при переме-щении метильной группы от α- к γ-углеродному атому Spd.

Рис. 16. Субстратные свойства C-метилированных аналогов Spd в дезоксигипузинсинтазной реакции. Условия реакции см. в подписи к Рис. 5.

В случае (R)- и (S)-изомеров α-MeSpd (см. пред.раздел) и ω-MeSpd (см.выше) наблюдалась прямая корреляция между субстратными свойствами ана-логов в DHS-реакции и способностью преодолевать хро-нический дефицит поли-аминов в клетке, вызванный ин-кубацией с клеток с DFMO от 12 сут и более (Рис. 17). Однако в случае γ-MeSpd зависимости оказались более сложными и поэтому возникла необходимость прямо оце-нить количество гипузинилированного eIF5А, возникаю-щего в клетках дефицитных по Spd и обработанных раце-матами C-метилированных ана-логов Spd. Оказалось, что в клетках DU145 из γ-MeSpd не образуется гипузинили-рованный eIF5А, что может быть обусловлено тем, что субстратом DHS является непроникающий в клетки изо-мер γ-MeSpd.

Рис. 17. Влияние C-метилированных аналогов Spd на гипузини-лирование eIF5A в клетках с истощенным пулом Spd. Клетки DU145 выращивали в присутствии DFMO (5 mM) и аналогов Spd (100 µM) в течение 9 сут с 1 mM AG, или без AG. Гипузинилирован-ный eIF5A (pI, 5.37) негипузинилированный eIF5A (pI 5.25) и ацети-лированную форму негипузинилированного eIF5A (pI, 5.1) разделяли двумерным электрофорезом и белки визуализировали, используя антитела к eIF5A.

       Таким образом, использование системы неизвест-ных ранее C-метилированных аналогов полиаминов открывает неожиданные возможности для прецизионного воздействия на метаболизм полиаминов, а различия в биохимических свойствах аналогов Spm и Spd определяются как положением метильной группы, так и конфигурацией α-углеродного атома. Таким образом, ферменты метаболизма Spm и Spd, AZ-зависимая система регуляции гомеостаза полиаминов и система транспорта полиаминов имеют не только «электростатические», но и дополнительные, различающиеся между собой, структурные критерии узнавания Spm и Spd, используя которые оказывается возможным создавать новые избирательно действующие структуры и исследовать клеточные функции легко взаимопревращающихся и частично взаимозаменяемых Spm и Spd.

Синтез SpmTrien нового изостерного зарядодефицитного аналога Spm

и его биохимически значимых производных.

Биологические эффекты полиаминов определяются геометрией молекулы, обеспечи-вающей необходимое пространственное расположение аминогрупп и степенью их протони-рования. Большая часть работ по изучению зависимости биологической активности поли-аминов от их строения посвящена изучению структурных аналогов Spm и Spd, включая про-изводные с различными заместителями при концевых атомах азота (см.обзоры: Casero R.A. & Woster P.M. 2009. J.Med.Chem., 52, 4551-4573; Casero R.A. & Marton L.J. 2007. Nat.Rev. Drug Discov. 6, 373-390). Исследования вклада заряда аминогрупп Spm/Spd в биологические эффекты полиаминов не столь многочисленны. В подобных работах полезным инструментом являются зарядодефицитные аналоги полиаминов, а рациональным подходом к созданию та-ких веществ является понижение основности аминогрупп при минимальном искажении гео-метрии молекулы, что, однако, существенно ограничивает число возможных аналогов.

В настоящей работе предложен и реализован оригинальный подход к созданию ново-го зарядодефицитного аналога Spm, состоящий в сокращении расстоя-ния между вторичными аминогруп-пами до 2-х метиленовых звеньев, что существенно понижает основ-ность вторичных аминогрупп ана- лога по сравнению со Spm (Табл. 8).

Табл. 8. Основность аминогрупп Spd, Trien, Spm и SpmTrien.

Использование 15N-ЯМР спектроскопии для определения микроскопических констант диссоциации показало существование равновесия между трипротонированными формами SpmTrien в интервале рН 6.6-8.5 с протоном, делокализованным между тремя вторичными аминогруппами (Рис. 18). Это свойство может оказаться весьма полезным для обеспечения продуктивного взаимодействия SpmTrien с полиамин-связывающими сайтами, т.к. аналог

способен трансформироваться в ионную форму, комплементарную участку связывания.

Рис. 18. Зависимость хим. сдвига атомов азота от значения рН в 15N-ЯМР спектрах SpmTrien

Замена Spd фрагмента молекулы Spm изостерным ему триэтилентетрами-новым приводит к появлению в мо-лекуле SpmTrien сразу трех этилен-диаминовых фрагментов, что дает начало уникальной для биохимии полиаминов способности к комплек-сообразованию с ионами переход-ных металлов (Рис. 19). Известно, что триэтилентетрамин (Trien) обра-зует очень прочный комплекс с ионами Cu2+ [pKuns 20.4 при pH 14 и pKuns 14.2 при pH 7 (Schwarzenbach G. 1950. Helv.Chem.Acta 33, 974-985)], а для комплекса SpmTrien с ионами Cu2+ можно ожидать близких значений констант диссо-циации.

Рис. 19. Cтруктуры комплексов Trien и SpmTrien с ионами Cu2+

Следует отметить, что ни Spm, ни его известные анало-ги не обладают подобным комплексом свойств. Соответственно, SpmTrien может быть ис-пользован в качестве регулятора активности ферментов метаболизма полиаминов, для изуче-ния особенностей активного транспорта Spm в клетки и исследования взаимодействий поли-аминов с нуклеиновыми кислотами. При этом биологические эффекты SpmTrien могут быть как рН-, так и Cu2+-зависимыми.

Выбранная нами стратегия синтеза SpmTrien состояла в последовательном наращива-нии полиаминной цепи путем алкилирования соответствующих аминов мезилатами N-защи-щенных аминоспиртов. Первый способ синтеза предусматривает построение полиаминной цепи, начиная с С-3 фрагмента (Схема 12). Исходным соединением служил 3-аминопропа-

Схема 12

i- CbzCl/NaHCO3/THF/H2O; ii- MsCl/Et3N/CH2Cl2; iii- H2NCH2CH2NHCH2CH2OH/THF; iv- H2NCH2CH2NH2/THF; v- 1. o-C6H4(OH)CHO/THF; 2. i-; 3. MeONH2/THF/H2O; vi- AcCl/Et3N/THF; vii-H2/Pd/AcOH/MeOH; viii- HCl/MeOH

нол-1 (37), который N-карбобензоксилировали, превращали в соответствующий мезилат и затем без выделения вводили в реакцию с избытком N-(2-аминоэтил)-аминоэтанола в THF. Соединение (40) выделяли колоночной хроматографией на силикагеле, но оно содержало в качестве трудно отделяемой примеси небольшое количество продукта алкилирования N-(2-аминоэтил)аминоэтанола по вторичной аминогруппе. Вторичные аминогруппы в соединении (40) защищали и после хроматографии на силикагеле получали чистый трис-Cbz-аминоспирт (41). Его превращали в мезилат, который без выделения обрабатывали избытком этиленди-амина, что приводило к трис-Cbz-диамину (43) из которого получали пентахлоргидрат SpmTrien с выходом 20%, считая на N-Cbz-аминоспирт (38) и тетрахлоргидрат N1-AcSpmTrien с выходом 51%, считая на соединение (43).

Второй путь синтеза SpmTrien предусматривает построение полиаминной цепи, начи-ная с С-2 фрагмента (Схема 13), что позволяет избежать неоднозначно протекающей стадии алкилирования первичной аминогруппы в присутствии незащищенной вторичной.

Схема 13

i- CbzCl/NaHCO3/THF/H2O; ii- MsCl/Et3N/CH2Cl2; iii- H2NCH2CH2OH/THF; iv- H2NCH2CH2CH2NH2/THF; v- H2/Pd/AcOH/MeOH; vi- HCl/MeOH; vii- H2N(CH2)3NHAc/THF.

Методически этот путь аналогичен первому и представляет собой семистадийный процесс. Однако выделение и очистка промежуточных соединений менее трудоемки. Суммарный вы-ход SpmTrien составил 20%, считая на N-(аминоэтил)аминоэтанол, а N12-AcSpmTrien был по-лучен в виде тетрахлоргидрата с выходом 58%, считая на трис-Cbz-аминоспирт (50).

Таким образом были синтезированы SpmTrien и два неизвестных ранее моно-ацетиль-ных производных, представляющих интерес для исследования SSAT и АPAO.

Терминально бис-алкилированные аналоги полиаминов являются одним из основных инструментов исследования системы метаболизма полиаминов и, кроме того, имеют опреде-ленные перспективы клинического применения. Тем не менее, механизмы их действия на молекулярном уровне в большинстве случаев до сих пор неизвестны. Влияние геометрии молекулы на биологические эффекты бис-алкилполиаминов подробно исследовалось на протяжении последних 15 лет (см.обзоры: Casero R.A. & Woster P.M. 2009. J.Med.Chem., 52, 4551-4573; Casero R.A. & Marton L.J. 2007. Nat. Rev.Drug Discov. 6, 373-390; Casero R.A. & Woster P.M. 2001. J.Med.Chem., 44, 1-26), но вклад зарядовой составляющей в биологическую активность практически не изучен.

Для получения неизвестного ранее зарядодефицитного N1,N12-Et2SpmTrien нами был

использован N-этиламиноэтанол, который карбобензоксилировали, спирт (53) превращали в мезилат и без очистки вводили в реакцию с избытком N-(2-аминоэтил)аминоэтанола (Схема 14). Диаминоспирт (55), содержащий небольшое количество изомерного продукта алкилиро-вания N-(2-аминоэтил)аминоэтанола по вторичной аминогруппе, вновь карбобензоксилиро-вали. При этом целевое трис-Cbz производное (56) легко отделялось хроматографией на си-ликагеле от побочного продукта реакции алкилирования, содержащего две Cbz-группы. Защи-щённый аминоспирт (56) превращали в мезилат (57), который обрабатывали избытком N-этил-1,3-диаминопропана. Наряду с целевым соединением линейного строения (58) образовывалось некоторое количество продукта алкилирования N-этил-1,3-диаминопропана по вторичной ами-ногруппе, который плохо отделялся хроматографией. Для удаления примеси сырой диамин (58) обрабатывали ~20 мольн. % салицилового альдегида, что приводило к образованию устой-чивого основания Шиффа по первичной аминогруппе примеси, которое легко отделялось хро-матографией от основного продукта (58). После удаления Cbz-защитных групп N1,N12-Et2-SpmTrien был получен в виде пентахлоргидрата с суммарным выходом 8%, считая на (52).

Схема 14

i- CbzCl/THF/H2O/NaHCO3; ii- MsCl/Et3N/CH2Cl2; iii- H2NCH2CH2NHCH2CH2OH/THF; iv- C2H5NH(CH2)3NH2/THF; v- H2/Pd/MeOH/AcOH; vi- HCl/MeOH.

Таким образом, на основе скелета SpmTrien был получен первый зарядодефицитный по центральному фрагменту аналог бис-этилспермина – N1,N12-Et2-SpmTrien.

Взаимодействие SpmTrien и его производных с ферментами метаболизма

полиаминов и клетками.

Триэтилентетрамин (Trien), является эффективным хелатором ионов Cu2+ (Рис. 19) и используется в практической медицине для лечения болезни Вильсона (Dixon H.B.F., et al. 1972. Lancet, pp. 853–854), обусловленной нарушением обмена меди в организме. В послед-ние годы показана перспективность Trien для снижения гипертрофии левого желудочка, характерной для поздних стадий диабета II типа (Cooper G.J., et al. 2004. Diabetes, 53, 2501-2508; Cooper G.J., et al. 2009. Diabetologia, 52, 715–722). В настоящее время Trien находится на II стадии клинических испытаний и его метаболизм детально исследуется (Lu J., et al. 2010 J.Clin.Pharmacol., 50, 647–658). Однако, участие системы транспорта полиаминов в доставке Trien в клетки, равно как и участие ферментов метаболизма полиаминов во внутриклеточных трансформациях Trien не рассматривается, несмотря на то, что Trien является изостерным, хотя и зарядодефицитным, аналогом Spd (Табл. 8). Поэтому в этой части работы мы исследо-вали взаимодействие Trien и SpmTrien с ферментами метаболизма полиаминов и клеточные эффекты этих аналогов.

Оказалось, что Trien и SpmTrien, несмотря на структурное соответствие Spd и Spm, не конкурируют с полиаминами за про-никновение в клетки DU145 и, скорее все-го, попадают в клетки не исполь-зуя систему транспорта полиаминов (Рис. 20).

Рис. 20. Конкуренция Trien, SpmTrien и N1,N12-Et2-SpmTrien с полиаминами в процессе транспорта в клетки DU145.

Таким образом, “правильное прото-нирование” аналога оказывается критическим для его узнавания системой активного транс-порта полиаминов.

       Известными метаболитами Trien являются N1-Ac-Trien и N1,N8-Ac2-Trien, которые вместе с Trien были обнаружены в моче людей принимавших это лекарство (Lu J., et al. 2007. Drug Metab.Dispos., 35, 221–227). Учитывая структурное сходство Trien и SpmTrien с Spd и Spm, соответственно, мы исследовали взаимодействие этих аналогов с SSAT (Табл. 10). Ока-залось, что Trien и SpmTrien являются субстратами этого фермента, но худшими чем Spd, а каждый из продуктов моно-ацетилирования SpmTrien, подобно N1-Ac-Trien, в свою очередь оказался плохим субстратом SSAT. Таким образом, SSAT может рассматриваться в ка-честве одного из ферментов ответственных за ацетилирование Trien in vivo.

Табл.10. Взаимодействие Trien, SpmTrien и его моно-ацетильных производных с SSAT.

Инкубация клеток DU145 с SpmTrien и Trien и анализ пула полиаминов показали, что моно-ацетильное производное (N1-Ac-SpmTrien) воз-никает лишь из первого аналога, а Trien в клетках DU145 заметно не метаболизирует (Табл. 11) Возможно это связано с тем, что уровень SpmTrien и его метаболитов в клетках почти в 10 раз выше чем содержание Trien и количество N1-Ac-Trien оказывается ниже детектируемо-го уровня. Следует особо отметить, что SpmTrien метаболизирует в клетке и до Trien, причем коли-

Табл.11. Метаболизм Trien и SpmTrien в клетках DU145. Влияние аналогов на содер-жание полиаминов в клетках

чество последнего, возникающего из SpmTrien (концентрация в среде 50 μM), сравнимо с ко-личеством Trien, проникающего в клетку в результате инкубации с 50 μM аналога (Табл. 11). Образование Trien в клетке происходит, по-видимому, через N12-Ac-SpmTrien, который под действием АРАО превращается в Trien. Поэтому из двух моно-ацетильных производных SpmTrien (SSAT, оказывается, не способна дискриминировать аминопропильный и амино-этильный концы молекулы SpmTrien) в клетке детектируется лишь N1-Ac-SpmTrien, не явля-ющийся субстратом АРАО. Таким образом, SpmTrien, накапливается в клетках почти в 10 раз эффективнее Trien, что, учитывая высокую прочность комплексов SpmTrien–Cu2+, может представлять интерес и для практической терапии.

       SpmTrien, Trien и N1,N12-Et2-SpmTrien по-разному влияют на внутриклеточное содер-жание полиаминов в клетках DU145 (Табл. 11). Если Trien и N1,N12-Et2-SpmTrien, в особен-ности первый, малоактивны, то SpmTrien эффективно снижал внутриклеточный уровень по-лиаминов, активируя ферменты их катаболизма (образование значительных количеств N1-AcSpd) и подавляя систему их биосинтеза (сильное снижение уровня Put). Наблюдаемые из-менения в активностях ODC, AdoMetDC и SSAT в клетке подтверждали эти предположение (Табл. 12). Следует отметить, что зарядодефицитный N1,N12-Et2-SpmTrien, в отличие от изо-стерного ему DENSpm, не был индуктором SSAT, по-видимому из-за невозможности пра-вильного связывания с С-концевой последовательностью фермента, что и стабилизирует бе-лок, снижая скорость его протеолиза. При этом, N1,N12-Et2-SpmTrien и DENSpm при-мерно одинаково индуцируют продуктив-ный сплайсинг пре-мРНК SSAT (данные не приведены).

Табл.12. Влияние полиаминов, DENSpm и заря-додефицитных аналогов Spm на активность фер-ментов метаболизма Spm и Spd клетках DU145. Концентрация полиаминов и их аналогов - 50 μM. Клетки выращивали в присутствии 1 mM AG.

       Вызываемое SpmTrien снижение активности ODC оказалось AZ-опосредованным. Из всех аналогов транспорт SpmTrien в большей степени контролировался уровнем AZ – обра-ботка клеток СНХ (ингибитор биосинтеза белка) приводила к резкому увеличению содержа-ния SpmTrien в клетке, тогда как эффекты СНХ на транспорт N1,N12-Et2-SpmTrien и Trien от-сутствовали вовсе, а в случае DENSpm были менее выраженными (Рис. 21). Оказалось, что SpmTrien способен подобно природным полиаминам и многим их аналогам индуцировать +1 сдвиг рамки считывания мРНК AZ, что необходимо для биосинтеза активного белка. Соот-ветственно, количество синтезирующегося в клетке AZ, в ответ на инкубацию с аналогами сильно отличалось, а среди зарядодефицитных производных SpmTrien оказался наиболее ак-тивным (Рис. 21).

Рис. 21. Влияние Trien, SpmTrien и N1,N12-Et2-SpmTrien на биосинтез AZ (a). Зависимость транспорта аналогов от уровня AZ в клетках DU145 (b).  (a) Клетки инкубировали 4 ч с исследуемыми аналогами (50 μM); аликвоту суммарной белковой фракции (50 μg) анализировали электрофорезом в 12% SDS-полиакриламидном геле и визуализировали при помощи антител к AZ. (b) Клетки инкубировали 1 ч с CHX (10 μg/mL), или без CHX, а затем еще 4 ч с Trien, SpmTrien, N1,N12-Et2-SpmTrien и DENSpm (50 μM).

Таким образом, сокращение расстояния между ами-ногруппами до двух метиленовых звеньев в случае Trien (изостер Spd) приводит к тому, что аналог, все еще являясь субстратом SSAT, перестает узнаваться клеткой как Spd: (i) Trien не использует систему транспорта полиаминов для проникновения в клетку, (ii) не влияет на пул полиаминов в клетке и на активности соответствующих ферментов мета-болизма, (iii) не индуцирует ни биосинтез AZ, (iv) ни продуктивный сплайсинг пре-мРНК SSAT. Превращение Trien в SpmTrien приводит к зарядодефицитному изостеру Spm, кото-рый по большинству биохимических параметров, за исключением механизма проникновения в клетку, может считаться полиамином. Учитывая, что внутриклеточное содержание SpmTrien почти в 10 раз выше чем содержание Trien, а также возможность биосинтеза Trien из SpmTrien и низкую токсичность аналога для клеток, можно предположить, что SpmTrien представляет собой не только интересный инструмент исследования метаболизма и клеточ-ных функций полиаминов, но и не лишен некоторой практической значимости.

Конденсация ДНК под действием SpmTrien.4

Взаимодействие с ДНК является одной из основных клеточных функций Spm и Spd. Конденсация ДНК, сопровождающаяся появлением оптической плотности при > 320 нм из-за рассеяния падающего УФ-излучения на формирующихся компактных частицах, пред-ставляет собой одну из простейших моделей для оценки эффективности взаимодействия по-лиаминов с ДНК. Способность полиаминов конденсировать ДНК зависит от количества по-ложительных зарядов в молекуле и уменьшается в ряду пентамин > тетрамин > триамин (Saminathan M., et al., 1999. Biochemistry, 38, 3821-3830).

Основность внутренних аминогрупп SpmTrien понижена, что приводит к недостаточному, по сравнению со Spm, протонированию центрального фрагмента молекулы при физиологичес-ком рН (см. Табл. 8). В то же время в области слабокислых рН степень протонирования SpmTrien соответствует ионному состоянию Spm. Поэтому мы провели исследование ДНК-конденсирующих свойств Spd, Spm и SpmTrien при нейтральных и слабокислых рН, исполь-зуя в качестве критерия концентрацию полиамина (скр), начиная с которой А340 быстро рас-тет с увеличением концентрации полиамина (Рис. 22). При рН 6.8 скр Spm и SpmTrien отлича-ются более, чем в 2,5 раза (25 и 67 μM, соответственно), а скр Spd, который подобно SpmTrien является трикатио-ном при данном рН, составляет уже 420 μM (Рис. 22). Однако при рН 5.5 скр Spm и SpmTrien практически совпадают (22 и 24 μM, соответственно), а скр Spd оказыва-ется равной 300 μM.

Рис. 22. Зависимость конденса-ции ДНК (A340) от концентрации Spd, Spm и SpmTrien при разных pH. (1) - Spm, pH 6.8; (2) - SpmTrien, pH 6.8; (3) - Spd, pH 6.8; (4) - Spm, pH 5.5; (5) - SpmTrien, pH 5.5; (6) - Spd, pH 5.5.

Таким образом, при рН 5.5 в процесс конденсации включа-ется четвертая протонирован-ная аминогруппа SpmTrien, что подтверждает правомерность рассмотрения его в качестве за-рядо-дефицитного аналога Spm при нейтральном рН. Следует особо отметить, что при рН 6.8 конденсирующая способность трижды протонированного SpmTrien намного превосходит та-ковую для трикатиона Spd. Наблюдаемые отличия обусловлены или геометрией молекулы (расстоянием между положительными зарядами), или же участием непротонированных вто-ричных аминогрупп SpmTrien во взаимодействии с ДНК, возможно, и в результате образова-ния системы водородных связей.

Известно, что ДНК, сконденсированная под действием Spm или SpmTrien, вновь рас-творяется при добавлении гепарина – полианиона, который эффективно извлекает полиами-ны из комплекса с ДНК (С.Г. Скуридин, неопубликованные данные). Поскольку SpmTrien является хорошим хелатором Cu2+, то введение в систему солей меди должно вызывать гепа-риноподобные эффекты благодаря образованию прочного комплекса Cu2+-SpmTrien.

Сравнение УФ-спектров исходной ДНК и ДНК, сконденсированной под действием 19.4 μМ SpmTrien при рН 5.2 (Рис. 23а, кривые 1 и 7) с УФ-спектром конденсированной ДНК после прибавления 19.5 μМ CuCl2 показывает, что в присутствии ионов

Рис. 23. Конденсация ДНК под действием SpmTrien (а) и деконденсация в присутст-вии ионов Cu2+ (б). (а): (1) ДНК - 20 μg/ml в 5 mМ Na-Ac буфере, рН 5.2; (2) - (1) + 3.24 μМ SpmTrien; (3) - (1) + 6.48·μМ SpmTrien; (4) - (1)  + 9.71·μМ SpmTrien; (5) - (1) + 12.9 μМ SpmTrien; (6) - (1) + 16.2·μМ SpmTrien; (7) - (1) + 19.4·μМ SpmTrien. (б): (1) ДНК - 20 μg/ml в 5 mМ Na-Ac буфере, рН 5.2 + 19.4 μМ SpmTrien; (2) - (1) + 4.96·μМ CuCl2; (3) - (1) + 9.88·μМ CuCl2; (4) - (1) + 14.7·μМ CuCl2; (5) - (1) + 19.5·μМ CuCl2; (6) - (1) + 24.3·μМ CuCl2; (7) 19.4·μМ SpmTrien + 19.5· μМ CuCl2.

Cu2+ происходит растворение компактной формы ДНК (Рис. 23б, кривые 2-6), тогда как в случае ДНК сконденсированной под действием Spm, ионы Cu2+ не вызывают подобного эф-фекта (данные не приведены). В отличие от гепарин-зависимой деконденсации ДНК (УФ-спектры исходной ДНК и комплексов ДНК-Spm и ДНК-SpmTrien после обработки гепари-ном идентичны), в случае ионов Cu2+ величина А260 уменьшается лишь незначительно, что обусловлено заметным поглощением комплекса (Cu*SpmTrien)2+ при 260 нм (Рис. 23б, кри-вая 7). Сами по себе ионы Cu2+ в концентрациях до 2.0 μМ не вызывают изменений УФ-спектра растворов ДНК. Таким образом, наличие у SpmTrien хороших комплексообразую-щих свойств позволяет регулировать его конденсирующую активность не только при помо-щи рН, но и вводя в систему ионы Cu2+, что неизвестно ни для одного из аналогов Spm.

Новые ингибиторы спермин/спермидин N1-ацетилтрансферазы на основе стабильных аналогов бисубстратного комплекса,

возникающего в ходе ферментативной реакции.

Одной из традиционных задач химической энзимологии полиаминов является разра-ботка методов истощения внутриклеточного пула Spm и Spd, что вполне естественно, учиты-вая повышенное содержание полиаминов в опухолевых клетках. Соответственно, были най-дены эффективные индукторы SSAT, ключевого фермента катаболизма полиаминов, однако набор ингибиторов SSAT, в отличие от ODC и AdoMetDC, весьма ограничен. Развитие моле-кулярной биологии полиаминов показало, что полиамин-зависимый сплайсинг пре-мРНК SSAT играет важную роль в регуляции активности фермента, а следовательно и уровня Spm и Spd в клетке (Hyvonen M.T., et al. 2006. RNA, 12, 1569-1582). Поскольку избирательные ин-гибиторы SSAT являются удобным инструментом исследования активных и неактивных форм фермента, в том числе и методами рентгеноструктурного анализа, представлялось целесообразным расширить существующий набор ингибиторов.

Механизм SSAT-реакции не предусматривает промежуточного образования ацетили-рованного фермента – происходит прямой перенос ацетильной группы Ас-СоА на полиамин. Поэтому для ингибирования фермента были использованы конъюгаты HS-СоА со Spm или Spd, в которых HS-СоА и полиамин были соединены при помощи ацетатного линкера (Рис. 24). Синтезированные производные симметричных полиаминов ингибировали изолирован-ный фермент с IC50 0.5-5.0 μМ в зависимости от строения полиаминного фрагмента (Ervin B.G., et al. 1984. Biochemistry, 23, 4250-4255), а для получения конъюгатов SH-CoA, а также

Рис.24. Моделирование переходного состояния бисубстратного комплекса, возникающего в ходе SSAT-реакции, с помощью конъюгатов CoA-полиамин с ацетатным и ацетоновым линкерами.

D-пантотеина, избирательно по N1- или N8-положениям Spd позднее был разработан доста-точно сложный многостадийный синтез (Roblot G. et al. 1993. Tetrahedron, 29, 6381-6398).

Располагая набором аминооксианалогов Spm и Spd (Khomutov A.R. et al. 1996. Tetra-hedron, 52, 13751-13766), которые представляют собой не только зарядодефицитные изостер-ные аналоги полиаминов (рКа H2NO-группы ~ 3.5), но являются еще и классическими карбо-нильными реагентами, естественным представлялось использовать различия в реакционной способности H2NO- и H2N-групп для получения конъюгатов CoA-полиамин. На первой ста-дии разработанного нами простого двухстадийного синтеза HS-CoA или D-пантотеин алки-лировали хлорацетоном в слабощелочной среде (Схема 15). Полученный кетон без выделе-ния вводили в реакцию с соответствующим аминооксианалогом Spm или Spd, что приводило к целевым соединениям с выходами, близкими к количественным.

Схема 15.

i - ClCH2COCH3/CH3CN/H2O/NaHCO3/Na2CO3; ii - RONH2; iii - DTT/EtOH/H2O

Как следует из данных Табл. 13, наиболее активным оказалось соединение (61), моде-лирующее аддукт по N8-положению Spd, тогда как соединение (60), моделирующее N1-заме-щенный Spd, было не столь эффективно (значения IC50 получены при 4.5 μМ концентрации Ас-СоА в субстратной смеси). Соединение (61) было в 22 раза активнее кетона (59), действо-вавшего хуже любого из CoA-содержащих конъюгатов. Подобная зависимость действия от строения подтверждает вклад полиаминного фрагмента в эффективность торможения. Вклад аденозинового фрагмента СоА в эффективность торможения SSAT был определяющим, что прямо следует из низкой активности пантотеиновых производных имевших IC50 > 100 М (данные не приведены). Однако известно, что в случае сукцинил-СоА-ацетоацетат трансферазы пантотеновая часть субстрата вносит значитель-ный вклад в эффективность связывания субстра-та (Fierke C.A. & Jencks W.P. 1986. J.Biol.Chem., 261, 7603-7606)].

Табл. 13. Ингибирование (IC50) SSAT конъюгатами CoA-SH и D-пантотеина с аминооксианалогами поли-аминов.

Таким образом, был получен набор новых аналогов бисубстратного комплекса SSAT-реакции на основе CoA-SH и D-пантотеина и показано, что активность соединений (61), (63) и (60) была сравнима с таковой для лучших из известных ингибиторов SSAT.

Синтез и биологическая активность

функционально-замещенных алкоксигуанидинов.

Среди природных производных гидроксиламина наиболее известны аминокислота ка-наванин (-амино--гуанидинооксимасляная кислота), широко распространенная в растени-ях, и антибиотик циклосерин (4-аминоизоксазолидон-3), применяемый для лечения туберку-леза. Если синтез и химия циклосерина были разработаны еще в конце 50-х – начале 60-х гг., то удобных способов получения алкоксигуанидинов, в том числе и канаванина, практически не существует. Известно лишь, что обработка защищенного производного каналина S-метил-изотиомочевиной при 20°С в течение 72 ч приводит к канаванину с выходом 10% (Rosenthal G.A. et al. 1983. Anal.Biochem., 133, 277-282), а 5 ч кипячение с цианамидом в спирте позво-ляет получить канаванин с выходом 70% (Frankel M., et al. 1963. J.Chem.Soc., 3127-3130). Предполагая использовать функционально-замещенные алкоксигуанидины в качестве инструмента исследования метаболизма полиаминов, мы были вынуждены сначала найти удобный метод синтеза этих малодоступных соединений.

В настоящей работе для получения гуанидинооксиалканов впервые был использован трифлат ди-Boc-гуанидина, который быстро и практически количественно превращает али-фатические амины в соответствующие гуанидины (Feichtinger K., et al. 1998. J.Org.Chem., 1998, 63, 3804-3805). Однако О-замещенные гидроксиламины существенно менее нуклео-фильны по сравнению с соответствующими алифатическими аминами и поэтому мы сначала исследовали взаимодействие трифлата ди-Boc-гуанидина с модельным О-бензилгидроксил-амином. Оказалось, что ди-Вос-производное бензилоксигуанидина образуется с практически количественным выходом, но реакция протекает существенно медленнее (Рис. 25), чем в слу-чае бензиламина. Величина константы скорости реакции второго порядка (мольные соотно-шения О-бензилгидроксиламина и трифлата ди-Вос-гуанидина), определенная с использова-

зованием 1Н-ЯМР составила 2.66·10-2 л/моль/мин (τ1/2 75 мин при 37С).

Рис.25. Кинетика гуанидинилирования О-бензилгидрок-силамина (0.3 М) трифлатом ди-Boc-гуанидина (0.3 М) в присутствии Et3N (0.3 М) в CDCl3 при 37С.

На следующем этапе работы в реакцию с трифла-том ди-Boc-гуанидина были введены некоторые функционально-замещенные эфиры гидрок-силамина (Схема 16), гуанидилирование которых удается осуществить с высоким выходом несмотря на наличие в радикале меркапто- и гидроксильных групп, а также экзоциклической аминогруппы аденозина.

Схема 16

Таким образом, был найден эффективный способ гуанидилирования аминооксигруппы, позволяющий получать целевые гидроксиламин-содержащие аналоги Agm.

Рис.26. Агматин и его гидроксиламин-содержащие аналоги.

Исходным соединением в синтезах AO-Agm, GAPA и NGPG (Рис. 26) служил 1-эток-сиэтилиденаминоокси-3-аминопропан (69) (Схема 17). Гуанидинилирование его свободной аминогруппы трифлатом ди-Boc-гуанидина позволило получить ди-Boc-производное (69) с выходом близким к количественному. Последующее удаление защитных групп действием HCl/EtOH привело к медленно смокающему на воздухе дихлоргидрату AO-Agm, который был переведен в хорошо кристаллизующийся дитозилат (выход 75.5%, считая на (69)).

Схема 17

i- (BocNH)2C=NTf/Et3N/CH2Cl2/20C;  ii- HCl/i-PrOH/H2O; iii- CbzCl/Et3N/THF; iv- HCl/EtOH/H2O; v- (BocNH)2C=NTf/Et3N/CHCl3/37C; vi- HBr/AcOH.

Следует отметить, что AO-Agm является изостерным зарядодефицитным аналогом Agm и образует, подобно другим О-замещенным гидроксиламинам, стабильные оксимы с альдегидами и кетонами, включая PLP, который служит коферментом ArgDC. Так как ами-нооксианалоги субстратов пируват- и PLP-зависимых ферментов метаболизма аминокислот являются их эффективными ингибиторами, то следует ожидать высокой активности AO-Agm по отношению к ArgDC.

При получении GAPA свободную аминогруппу соединения (69) сначала карбобензок-силировали, а затем удаляли этоксиэтилиденовую защиту, что приводило к соответствующе-му гидрохлориду (71) (Схема 17). Гуанидинилирование аминооксигруппы трифлатом ди-Boc-гуанидина позволило получить с высоким выходом соединение (72), что после одновремен-ного удаления Boc- и Cbz-защитных групп привело к кристаллическому дибромгидрату GAPA (выход 48.7%, на (69)). Мы реализовали несколько схем получения NGPG, наиболее удачной из которых является синтез, исходящий из 1-аминоокси-3-аминопропана, свободные амино- и аминоокси-группы которого гуанидилировали 1.9 экв. трифлата ди Boc-гуанидина при 37°С (Схема 17). Соединение (73) очищали колоночной хроматографией на силикагеле, и после удаления Boc-защитных групп получали дибромгидрат NGPG (выход 54%, на (69)).

Основность гуанидиноокси-фрагмента GAPA и NGPG имеет значение для правильно-го использования этих аналогов в биохимии полиаминов. Значения pKa аминооксигруппы

Рис.27. Основность гидроксиламин-содержащих аналогов Agm.

AO-Agm (pKa 4.05) и гуанидинооксигрупп GAPA (pKa 6.7) и NGPG (pKa 6.9) были опреде-лены с использованием 1H-ЯМР спектроскопии (Рис. 27). Таким образом, GAPA, являясь изостером Agm (pKa 9.6 и 12.5), по основности ближе к Put и, скорее всего, будет активно переноситься в клетки, используя, подобно Agm, систему транспорта Put.

Влияние GAPA на размножение Leishmania donovani5.

       Полиамины играют важную роль и в жизненном цикле протозойных паразитов, на-

пример Plasmodium falciparum, Leishmania donovani, Trypanosoma brucei gambiense, вызыва-ющих весьма распространенные в тропиках и субтропиках заболевания – малярию, лейшма-ниоз и сонную болезнь, соответственно (см.обзор: Heby O., et al. 2007. Amino Acids, 33, 359-366). В последние годы возникли формы L.donovani, устойчивые к противолейшманиозным препаратам, в том числе и к широко используемому Cолюсурьмину®, что делает весьма ак-туальным поиск метаболических мишеней, перспективных для создания новых средств борь-бы с лейшманиозом (см.обзор: Croft S.L., et al. 2006. Clin.Microbiol.Rev., 19, 111-126). Одной из таких мишеней являются ферменты биосинтеза полиаминов, что обусловлено необходи-мостью Put и Spd как таковых для размножения паразитов, а также и тем, что Spd входит в состав трипанотиона (Try, N1,N8-бис(глутатионил)спермидин), выполняющего многочислен-ные функции по защите паразита от неблагоприятных внешних воздействий. Одна из слож-ностей практического применения ингибиторов биосинтеза Spd для лечения протозойных инфекций состоит в том, что Spd жизненно необходим и для клеток хозяина. Тем не менее, α-дифторметилорнитин (DFMO), ингибитор ODC, используется для лечения поздних стадий сонной болезни, вызываемой Tripanosoma brucei gambiense (Burri C.C. & Brun R. 2003. Para-sitol.Res., 90, S49–S52).

       Среди многочисленных ингибиторов ODC одним из наиболее эффективных является 1-аминоокси-3-аминопрпан (АРА), действующий на изолированный фермент в nM концент-рациях и специфически подавляющий рост нормальных и опухолевых клеток (Hyvoven T., et al. 1988. J.Biol.Chem., 263, 11138-11144; Persson L., et al. 1989. Biochem.J., 257, 929-931; Sta-nek J., et al. 1992. J.Med.Chem., 35, 1339-1344; Milovic V., et al. 2001. Biochem.Pharmacol., 61, 199-206).

       Оказалось, что АРА высокоактивен и по отношению L.donovani и P.falciparum, подав-ляя их размножение в μM концентрациях, снижая уровни Put, Spd и Try у парази-тов и был намного активнее DFMO, клас-сического ингибитора ODC (Табл. 14).

Табл. 14. APA эффективно ингибирует раз-множение P.falciparum и амастигот L.donovani и изолированную ODC этих паразитов.

Размножение и L.donovani и P.falciparum, полностью восстанавливается после добавления в среду Put/Spd, что указывает на специфичность действия ингибитора (данные не приведены).

Высокая активность АРА по отношению ODC L.donovani и P.falciparum стимулирова-ла рентгеноструктурные структурные исследования E-I комплекса. АРА правильно связыва-ется в активном центре фермента (протонированная при фи-зииологическом рН аминогруппа ингибитора выполняет якорные функции), что как и при связывании субстрата приводит к разрыву С=N-двойная связь внутреннего альдимина, образованного карбонильной группой

кофермента и аминогруп-пой Lys69. Пиридиновый цикл поворачивается и карбонильная группа PLP оказывается сближенной с аминоокси группой инги-битора (Рис. 28). Однако, в этом случае, в отличие от

Рис.28. Структура комплекса ODC и APA (разрешение 1.9)

комплексов пиридоксаль-5’-фосфат зависимых аспартатамино-трансферазы с аминооксиук-сусной кислотой (Markovic-Housley Z., et al. 1996. Eur.J.Biochem., 236, 1025-1032), трансами-назы γ-аминомасляной кислоты с аминооксиуксусной кислотой (Liu W., et al. 2004. Bioche-mistry, 43, 10896-10905) и 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат синтазы с аминооксианалогом декарбоксилированного S-аденозилметионина (Capitani G., et al. 2003. Biochim.Biophys.Acta, 1647, 55-60), образование оксима фермента не наблюдалось, а карбонильная- и аминоокси-группы оказывались «замороженными» на расстоянии ~ 3, что соответствует длине водо-родной связи. Таким образом, показано, что в данном случае комплекс ODC–АРА кристал-лизуется в конформации, которая не реализуется в растворе, где происходит образование ок-сима фермента. Из литературы известно, что кристаллическая структура не всех комплексов ODC–DFMO соответствует строению, образующегося в растворе, ковалентного аддукта ин-гибитора с ферментом.

       Успех применения специфических ингибиторов для практической терапии во многом определяется возможностью создания их активно-транспортируемых форм. Однако, такие ингибиторы ODC как DFMO и APA, весьма активные in vitro по отношению к L.donovani и P.falciparum, пассивно проникают в паразиты. Поэтому в заключительной части настоящего исследования мы попытались создать активно-транспортируемую форму APA, превратив его в GAPA, который представляет собой зарядодефицитный (рКа 6.71, см. Рис. 27) изостерный аналог агматина. Так как агматин активно проникает в животные клетки используя Put транспортер, то можно было предположить, что и GAPA сможет проникать в клетки, исполь-зуя систему транспорта Put.

Сопоставление активностей APA и GAPA по отношению к изолированной ODC (10-9 М и 6·10-6 M, соответственно) и амастиготам L.donovani (5 μM и 9 μM, соответственно) свиде-тельствует, что GAPA, скорее всего, активно проникает в паразит и, следовательно, может считаться первым активно-транспортируемым ингибитором ODC. Возможность внутрикле-точной трансформа-ции GAPA в APA (Рис. 29) определяется наличием в клетке низкоспеци-

фичных уреидогидролаз.

Рис. 29. Возможные механизмы действия GAPA.

Известно, что многие аргиназы спо-собны превращать канаванин в кана-лин, а некоторые из них способны даже расщеплять Agm до Put (Dabir S., et al. 2005. Int.J.Biol.Sci., 1, 114-122). Кроме того, мак-рофаги, в которых локализована L.donovani, обладают агматиназной активностью (Sastre M., et al. 1998. Biochem.J., 330, 1405-1409). Проникнув в L.donovani, GAPA подобно APA вызыва-ет снижение уровня Put и Spd (Табл.15) а экзогенные Put и/или Spd полностью нейтрализуют эффекты ингибитора (данные не приведены), что свидетельствует о связи биохимической мишени GAPA с метаболизмом полиаминов.

Однако GAPA, в отличие от APA, мало влияет на уровень трипанотиона в L.donovani (Табл.15). Таким образом, наблю-даемая картина, по-видимому, не

Табл. 15. Влияние GAPA и APA на уро-вень полиаминов и трипанотиона (Try) у промастигот L.donovani.

может быть описана только в терминах ингибирования ODC под действием GAPA или в ре-зультате ее расщепления до APA (Рис. 29), а взаимосвязь уровень Spd – уровень трипаноти-она у L.donovani может иметь достаточно сложный характер.

Другим принципиальным отличием GAPA от APA и DFMO является его высокая эф-фективность по отношению к формам L.donovani, резистентным к сурьмасодержащим (SAG) препаратам (Табл. 16). Следует отметить, что устойчивость к этим препаратам сопровожда-ется повышенной активность ферментов биосинтеза Spd, в первую очередь ODC, что, по-видимому, и снижает эффектив-ность АРА и DFMO.

Табл. 16. Влияние SAG, APA и GAPA на SAG-резистентные (R-1 и GE-1) клинические изоляты L.donovani.

Таким образом, нельзя исклю-чить, что GAPA имеет еще одну метаболическую мишень, отличную от ODC. Нечто подоб-ное наблюдалось ранее при сравнении эффектов DFMO и APA на рост мицелия фитопато-генного гриба Pyr.oryzae. Оба ингибитора ODC снижали содержание Put и замедляли рост мицелия, который восстанавливался при внесении в среду Put. Однако, APA, действуя, в от-личие от DFMO, еще и на ранние этапы биосинтеза меланина, вызывал обесцвечивание ми-целия, окраска которого восстанавливалась после добавления Put (Хомутов А.Р., и др. 1989. Биоорган.Химия, 15, 706-709).

Превращение АРА в GAPA привело к активно проникающему в L.donovani ингибитору ODC, который, в отличие от АРА, оказался эффективен по отношению к SAG-усойчивым формам паразита. Эти приципиальные отличия в действии АРА и GAPA должны стимулировать детальное изучение механизма действия последнего, поскольку возможность существования у GAPA биологической мишени отличной от ODC, может быть уникальной для этого паразита и представлять интерес для избирательного воздействия на L.donovani.

Выводы.

1.        Разработан новый подход к превращениям спермина (Spm) и спермидина (Spd) в их биологически-активные производные, заключающийся в создании системы новых С-моно-метилированных аналогов Spd, Spm и N1-Ac-Spd, для получения которых были разработаны оригинальные схемы синтезов. Ключевые соединения получены в количествах, достаточных для проведения испытаний на лабораторных животных.

2.        Впервые показано, что биохимические свойства С-моно-метилированных аналогов Spm и Spd зависят от положения метильной группы. Перемещение последней карди-нально сказывается на взаимодействии аналогов с ферментами метаболизма полиами-нов, что позволило получить метаболически устойчивое производное Spd – γ-MeSpd или, наоборот – индуцировать катаболическую нестабильность (β-MeSpd). Это откры-вает спектр новых возможностей для исследования клеточных функций Spm и Spd, которые легко взаимопревращаются и частично взаимозаменяемы. Найдено, что β-MeSpd, в отличие от подавляющего большинства аналогов Spd и остальных С-метилированных производных Spd, слабо индуцирует биосинтез регуляторного белка антизима, что делает β-MeSpd уникальным инструментом исследования важнейших для клетки антизим-зависимых путей поддержания гомеостаза полиаминов.

3.        При помощи катаболически устойчивого α-МеSpd впервые удалось обратить последствия супериндукции спермин/спермидин-N1-ацетилтрансферазы in vitro и in vivo и предотвратить развитие острого панкреатита, вызываемого активацией катаболизма полиаминов, у крыс с регулируемой экспрессией гена SSAT.

4.        Введение метильной группы в молекулы Spm и Spd приводит к возникновению хиральных центров, что открывает возможность осуществлять регуляцию биохими-ческих свойств таких аналогов полиаминов не только посредством перемещения ме-тильной группы, но и на более тонком уровне, изменяя конфигурацию хирального центра. С этой целью, были разработаны удобные методы синтеза и получены неопи-санные ранее (R)- и (S)-изомеры α-MeSpd и α-MeSpm, (R,R)-, (S,S)- и (R,S)-диастерео-меры α,α’-Me2Spm, а также (R)- и (S)-изомеры N8-Ac-α-MeSpd.

5.        Впервые показано, что ферменты метаболизма полиаминов – сперминоксидаза, дезоксигипузинсинтаза и ацетилполиаминооксидаза, природные субстраты которых ахиральны, обладают скрытой стереоспецифичностью. Найден оригинальный способ регулирования стереоспецифичности ацетилполиаминооксидазы. Установлено, что система активного транспорта полиаминов по-разному узнает стереоизомеры α-мети-лированных полиаминов в качестве Spm и Spd. Способность изомеров α-МеSpd и диастереомеров α,α’-Me2Spm по-разному индуцировать +1 сдвиг рамки считывания мРНК антизима, приводящий к биосинтезу активного белка, а также продуктивный сплайсинг мРНК SSAT открывают новые возможности воздействия на ключевые регуляторные механизмы, ответственные за поддержание гомеостаза полиаминов в клетке.

6.        Предложен новый подход к созданию зарядодефицитных аналогов Spm, состоящий в сокращении расстояния между аминогруппами до двух метиленовых звеньев, и син-тезированы неизвестные ранее 1,12-диамино-3,6,9-триазадодекан (SpmTrien) и его биохимически-значимые производные. Наличие триэтилентетраминового фрагмента в молекуле SpmTrien сообщает аналогу комплексообразующие свойства в отношении ионов Cu2+. Впервые показано, что введение в систему ионов меди приводит к измене-нию конденсированного состояния ДНК, вызываемого SpmTrien, что не известно для аналогов Spm.

7.        На основании анализа взаимодействия SpmTrien и триэтилентераамина (Trien) с ферментами катаболизма полиаминов и эффектов, вызываемых этими аналогами в культуре клеток, показано, что SpmTrien способен выполнять многие клеточные функции Spm, тогда как Trien, изостерный Spd, не является функционально активным миметиком Spd. Установлено, что концентрация эффективно хелатирующего ионы Cu2+ SpmTrien в клетках оказывается почти в 10 раз выше, чем Trien, и что SpmTrien частично метаболизирует в клетке до Trien. Последний, благодаря образованию прочных комплексов с ионам Cu2+, в настоящее время используется в терапии нарушений миокарда, возникающих на поздних стадиях диабета II типа, а также для лечения болезни Вильсона.

8.        Предложен общий способ превращения О-замещенных гидроксиламинов в ранее малодоступные алкоксигуанидины. Использовании трифлата ди-Вос-гуанидина позволяет получать разнообразные функционально-замещенные алкоксигуанидины, включая и биологически-активный 1-гуанидиноокси-3-аминопропан (GAPA) с выходами близкими к количественным.

9.        Предложен способ превращения 1-аминоокси-3-аминопропана, специфического ингибитора орнитиндекарбоксилазы (скорость-определяющий фермент биосинтеза полиаминов), в GAPA – активно-транспортируемый ингибитор/проингибитор этого фермента. Показано, что GAPA эффективно ингибирует размножение Leishmania donovani, в том числе и формы резистентные к широко используемым в практической терапии лейшманиоза сурьмасодержащим препаратам.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

  1. Khomutov A.R., Svetsov A.S., Vepsalainen J.J., Kritzyn A.M. "Novel acid-free cleavage of N-(2-hydroxyarylidene) protected amines". Tetrahedron Lett., 42(15), 2887-2889 (2001).
  2. Ruiz-Chica A.J., Khomutov A.R., Medina M.A., Sanchez-Jimenez F., Ramirez F.J. "Interaction of DNA with an aminooxy analogue of spermidine - an FT-IR and FT-Raman approach". J.Mol.Structure, 565-566, 253-258 (2001).
  3. Turchanowa L, Shvetsov A.S., Demin A.V., Khomutov A.R., Wallace H.M., Stein J., Milovic V. "Insufficiently charged isosteric analogue of spermine: interaction with polyamine uptake, and effect on Caco-2 cell growth". Biochem.Pharmacology, v. 64, No 4, p. 649-655 (2002).
  4. Rasanen T.L., Alhonen L., Sinervirta R., Keinanen T., Herzig K-H., Suppola S., Khomutov A.R., Vepsalainen J., Janne J. "A polyamine analogue prevents acute pancreatitis and restores early liver regeneration in transgenic rats with activated polyamine catabolism". J.Biol.Chem., 277(42), 39867-39872 (2002).
  5. Хомутов А.Р., “Ингибирование ферментов биосинтеза полиаминов субстратоподобными О-замещенными гидроксиламинами”. Биохимия, 67(10), 1403-1412 (2002).
  6. Григоренко Н.А., Вепсалайнен Й., Ярвинен А., Кейнанен Т.А., Алхонен Л., Янне Ю., Крицын А.М., Хомутов А.Р. "Новый синтез -мелилспермидина". Биоорган.химия, 30(4), 441-445 (2004).
  7. Jarvinen A., Grigorenko N., Khomutov A.R., Hyvonen M.T., Uimari A., Vepsalainen J., Sinervirta R., Keinanen T.A., Vujcic S., Alhonen L., Porter C.W., Janne J. "Metabolic stability of alpha-methylated polyamine derivatives and their use as substitutes for the natural polyamines". J.Biol.Chem., 280(8), 6595-601 (2005).
  8. Григоренко Н.А., Вепсалайнен Й., Ярвинен А., Кейнанен Т.А., Алхонен Л., Янне Ю., Хомутов А.Р. "Новый синтез -мелил- и ,'-диметилспермина". Биоорган.химия, 31(2), 200-205 (2005).
  9. Хомутов А.Р., Симонян А.Р., Вепсалайнен Й., Кейнанен Т.А., Алхонен Л., Янне Ю. "Новые оксааналоги спермина". Биоорган.химия, 31(2), 206-212 (2005).
  10. Хомутов А.Р., Григоренко Н.А., Демин А.В., Вепсалайнен Й., Касеро Р.А., Уостер П.М. "Зарядодефицитный аналог спермина с комплексообразующими свойствами" Биоорган.химия, 31,(3), 303-311 (2005).
  11. Grigorenko N.A., Vepsalainen J., Jarvinen A., Keinanen T.A., Alhonen L., Janne J., Khomutov A.R. "Synthesis of (R)- and (S)-isomers of 1-methylspermidine" Mendeleev Commun., 15,(4), 142-143 (2005).
  12. DasGupta R., Krause-Ihle T., Bergmann B., Muller I.B., Khomutov A.R., Muller S., Walter R.D., Luersen K. "3-Aminooxy-1-aminopropane and derivatives have an antiproliferative effect on cultured Plasmodium falciparum by decreasing intracellular polyamine concentrations". Antimicrob.Agents Chemother., 49(7), 2857-2864 (2005).
  13. Симонян А.Р., Григоренко Н.А., Вепсалайнен Й., Хомутов А.Р. "Новые зарядодефицитные аналоги агматина". Биоорган.химия, 31(6), 645-650 (2005).
  14. Jarvinen A.J., Cerrada-Gimenez M., Grigorenko N.A., Khomutov A.R., Vepsalainen J.J., Sinervirta R.M., Keinanen T.A., Alhonen L.I., Janne J.E. "α-Methyl polyamines: efficient synthesis and tolerance studies in vivo and in vitro. First evidence for dormant stereospecificity of polyamine oxidase". J.Med.Chem., 49(2), 399-406 (2006).
  15. Jarvinen A., Keinanen T.A., Grigorenko N., Khomutov A.R., Uimari A., Vepsalainen J., Narvanen A., Alhonen L., Janne J. "Guide molecule-driven stereospecific degradation of α-methylpolyamines by polyamine oxidase". J.Biol.Chem., 281(8), 4589-4595 (2006).
  16. Hyvonen M.T., Herzig K-H., Sinervirta R., Albrecht E., Nordback I., Sand J., Keinanen T.A., Vepsalainen J., Grigorenko N., Khomutov A.R., Kluger B., Janne J., Alhonen L. “Activated polyamine catabolism in acute pancreatitis - methylated polyamine analogues prevent trypsinogen activation and pancreatitis-associated mortality”. Am.J.Pathol., 168(1), 115-122 (2006).
  17. Симонян А.Р., Вепсалайнен Й., Хомутов А.Р. "Аминооксианалоги спермина и их моноацетильные производные." Биоорган.химия, 32(6), 643-650 (2006).
  18. Singh S., Mukherjee A., Khomutov A.R., Persson L., Heby O., Chatterjee M., Madhubala R. “Antileishmanial effect of 3-aminooxy-1-aminopropane is due to polyamine depletion”. Antimicrob Agents Chemother. 51(2), 528-534 (2007).
  19. Khomutov A.R., Grigorenko N.A., Skuridin S.G. “Novel approach to design isosteric charge-deficient analogue of spermine and its biochemical important derivatives”. Biochem.Soc.Trans., 35(2), 369-373 (2007).
  20. Grillo M.A., Battaglia V., Colombatto S., Rossi C.A., Simonian A.R., Salvi M., Khomutov A., Toninello A. “Inhibition of agmatine transport in liver mitochondria by new charge-deficient agmatine analogues”. Biochem.Soc.Trans., 35(2), 401-404 (2007).
  21. Grigorenko N.A., Khomutov A.R., Keinnen T.A., Jrvinen A., Alhonen L., Jnne J., Vepslinen J. “Synthesis of novel optical isomers of α-methylpolyamines”. Tetrahedron, 63(10), 2257-2262 (2007).
  22. Keinnen T.A., Jrvinen A., Uimari A., Vepslinen J., Khomutov A.R., Grigorenko N.A., Hyvonen M.T., Cerrada-Gimenez M., Alhonen L., Jnne J. “α-Methylated polyamines as potential drugs and experimental tools in enzymology” Mini Rev.Med.Chem., 7(8), 813-820 (2007).
  23. Dufe V.T., Ingner D., Heby O., Khomutov A.R., Persson L., Al-Karadaghi S. “A structural insight into the inhibition of human and Leishmania donovani ornithine decarboxylase by 3-aminooxy-1-aminopropane” Biochem.J., 405(2), 261-268 (2007).
  24. Hyvonen M.T., Keinanen T.A., Cerrada-Gimenez M., Sinervirta R., Grigorenko N., Khomutov A.R., Vepsalainen J., Alhonen L., Janne J. “Role of hypusinated eukaryotic translation initiation factor 5A in polyamine depletion-induced cytostasis”. J.Biol.Chem., 282(48), 34700-34706 (2007).
  25. Simonian A., Khomutov A., Hyvonen T., Grigorenko N., Keinanen T., Vepsalainen J., Alhonen L., Janne J. " Novel CoA-polyamine conjugates for effective inhibition of spermine/spermidine-N1-acetyltransferase." Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 26(10), 1245-1248 (2007).
  26. Merentie M., Uimari A., Pietila M., Sinervirta R., Keinnen T.A., Vepslinen J., Khomutov A., Grigorenko N., Herzig K-H., Jnne J., Alhonen L. “Oxidative stress and inflammation in the pathogenesis of activated polyamine catabolism-induced acute pancreatitis”. Amino Acids, 33(2), 323-330 (2007).
  27. Singh S., Jhingran A., Sharma A., Simonian A.R., Soininen P., Vepsalainen J., Khomutov A.R., Madhubala R. “Novel agmatine analogue, gamma-guanidinooxypropylamine (GAPA) efficiently inhibits prolifereation of Leishmania donovani by depletion of intracellular polyamine levels”. Biochem.Biophys.Res.Commun., 375(1), 168-172 (2008).
  28. Хомутов А.Р., Кейнанен Т.А., Григоренко Н.А., Хивонен М.Т., Умари A., Пиетила M., Серрада-Хименес M., Симонян А.Р., Хомутов М.А., Вепсалайнен Й., Алхонен Л., Янне Ю. “Метилированные аналоги биогенных полиаминов спермина и спремидина как инструмент исследования клеточных функций полиаминов и ферментов их метаболизма“. Молекулярная биология, 43(2), 274-285 (2009).
  29. Hyvonen M.T., Howard M.T., Anderson C.B., Grigorenko N., Khomutov A.R., Vepsalainen J., Alhonen L., Janne J., Keinanen T.A. “Divergent regulation of the key enzymes of polyamine metabolism by chiral alpha-methylated polyamine analogs”. Biochem.J., 422(2), 321-328 (2009).
  30. Nayvelt I., Hyvnen M.T., Alhonen L., Pandya I., Thomas T., Khomutov A.R., Vepslinen J., Patel R., Keinnen T.A., Thomas T.J. “DNA condensation by chiral α-methylated polyamine analogues and protection of cellular DNA from oxidative damage” Biomacromolecules, 11(1), 97-105 (2010).
  31. Weisell J., Hyvnen M.T., Vepslinen J., Alhonen L., Keinnen T.A., Khomutov A.R., Soininen P. ”Novel isosteric charge-deficient spermine analogue – 1,12-diamino-3,6,9-triazadodecane: Synthesis, pKa measurement and biological activity”. Amino Acids, 38(2), 501-507 (2010).
  32. Hyvnen M.T., Sinervirta R., Keinnen T.A., Fashe T., Grigorenko N., Khomutov A.R., Vepslinen J., Alhonen L. “Acute pancreatitis induced by activated polyamine catabolism is associated with coagulopathy of α-methylated polyamine analogs on haemostasis” Pancreathology 10(2-3), 208-221 (2010).
  33. Vuohelainen S., Pirinen E., Сerrada-Gimenez M., Keinanen T.A., Uimari A., Pietila M., Khomutov A.R., Janne J., Alhonen L. “Spermidine is indispensable in differentiation of 3T3-L1 fibroblasts to adipocytes” J.Cell Mol.Med., 14(6B), 1683-1692 (2010).
  34. Weisell J., Hyvnen M.T., Hkkinen M.R., Grigorenko N.A., Pietil M., Lampinen A., Kochetkov S.N., Alhonen L., Vepslinen J., Keinnen T.A., Khomutov A.R. “Synthesis and biological characterization of novel charge-deficient spermine analogs”. J.Med.Chem., 53(15), 5738-5748 (2010).
  35. Khomutov A.R., Weisell J, Khomutov M.A., Grigorenko N.A., Simonian A.R., Hkkinen M.R., Keinnen T.A., Hyvnen M.T., Alhonen L., Kochetkov S.N., Vepslinen J. ”Methylated polyamines as research tools”. In: Polyamines: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. (A.E.Pegg & R.A.Casero, Eds.) vol. 720, Ch.29, pp. 449-461. Springer Science+Business Media, LLC (2011).
  36. Hyvnen M.T., KeinnenT.A., Khomutov M., Simonian A., Weisell J., Kochetkov S.N., Vepslinen J., Alhonen L., Khomutov A.R. “The use of novel C-methylated spermidine derivatives to investigate the regulation of polyamine metabolism”. J.Med.Chem., 54(13), 4611-4618 (2011).
  37. Hyvnen M.T., Keinnen T.A., Khomutov M., Simonian A., Vepslinen J., Park J.H., Khomutov A.R., Alhonen L., Park M.H. “Effects of novel C-methylated spermidine analogs on cell growth via hypusination of eukaryotic translation initiation factor 5A”. Amino Acids  -  в печати

1 Совместно с Prof. J.Janne, Prof. L.Alhonen, и Dr. T.Keinanen (A.I.Virtanen Institute for Molecular Sciences, University of Eeastern Finland, Kuopio, Finland).

2 Совместно с Prof. J.Janne, Prof. L.Alhonen, Prof. J.Vepsalainen, Dr. T.Keinanen и Dr. M.Hyvonen (A.I.Virtanen Institute for Molecular Sciences, University of Eeastern Finland, Kuopio, Finland).

3 Совместно с Prof. J.Janne, Prof. L.Alhonen, Prof. J.Vepsalainen, Dr. T.Keinanen и Dr. M.Hyvonen (A.I.Virtanen Institute for Molecular Sciences, University of Eeastern Finland, Kuopio, Finland), а также Dr. H.M.Park (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA).

4 Совместно с д.б.н. С.Г. Скуридиным, ИМБ им.В.А. Энгельгардта РАН.

5 Совместно с Prof. R.Madhubala (J.Nehru University, New Delhi, India), Prof. L.Persson (University of Lund, Sweden), Prof. S.Al-Karadaghi (University of Lund, Sweden) и Prof.R.Walter (Institute of Tropical Medicine, Hamburg, Germany).







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.