WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

БЕЗПРОЗВАННЫЙ Илья Борисович

НЕЙРОНАЛЬНАЯ КАЛЬЦИЕВАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ И НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН и в Юго-западном медицинском центре Техасского университета в Далласе

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Маргулис Борис Александрович Институт цитологии РАН доктор химических наук, член-корреспондент РАН Габибов Александр Габибович Институт биоорганической химии им.

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Никольский Евгений Евгеньевич Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Защита состоится « 23 » апреля 2010 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс института (812)297-03-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан «_____» марта 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Кальциевая (Ca2+) передача сигналов объединяет мембранную возбудимость и биологическую функцию нейронов [10]. Действуя на границе между «электрическим» и «сигнальным» мирами клетки, Ca2+ каналы играют ведущую роль во многих ключевых аспектах нейронной функции. Вследствие огромной важности кальция как вторичного посредника, нейроны используют многочисленные способы управления внутриклеточным содержанием Ca2+, чаще всего в пределах местных сигнальных путей. В нейрональную Ca2+ сигнализацию вовлекается большое количество Ca2+ каналов:

потенциал-зависимые Ca2+ каналы плазматической мембраны, NMDA рецепторы, AMPA рецепторы, TRP каналы и депо-управляемые каналы.

Высвобождение Ca2+ из внутриклеточных депо эндоплазматического ретикулума (ЭР) осуществляется рецепторами инозитол-1,4,5трисфосфата (InsP R) и рианодиновыми рецепторами (RyanR). Помпа SERCA в ЭР, Ca2+ помпа плазматической мембраны и Na+/Ca2+ обменник плазматической мембраны тонко контролируют концентрацию Ca2+ в цитозоле в узком диапазоне значений. В формировании цитозольных Са2+ сигналов важную роль играют митохондрии. Из-за чрезвычайной чувствительности нейронов к изменению внутриклеточной концентрации Ca2+ даже относительно небольшие отклонения в Ca2+ сигнализации могут привести к разрушительным последствиям. Сравнительные исследования с нейронами из молодых и старых грызунов показали, что нейрональная Ca2+ сигнализация подвергается существенным изменениям с возрастом.

Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Хантингтона (БХ) и спиномозжечковые атаксии (СМА), представляют собой огромную медицинскую и научную проблему [11]. Несмотря на интенсивный поиск причин этих заболеваний, они до сих пор остаются неизлечимыми. Лекарственные препараты, используемые для коррекции указанных нарушений, имеют ограниченный эффект, принося только временное облегчение в проявлении симптомов болезни или несколько задерживая процесс развития заболевания [11]. Основной прогресс в понимании этих _____________________________________________________________ Список основных сокращений. ЭР – эндоплазматический ретикулум, БА – болезнь Альцгеймера, БХ – болезнь Хантингтона, СМА – спиномозжечковая атаксия, СШН – срединные шипиковые нейроны, PS – белок пресенилин, Хтт – белок Хантингтин, ХАП – хантингтин-ассоциированный протеин, Atx – белок атаксин, InsP – инозитол-1,4,5–трисфосфат, InsP R1 – рецептор инозитол-1,4,5-трисфосфата первого типа, БЛМ – бислойные липидные мембраны, ДТ – дикий тип, ФДТ – фибробласты дикого типа, ФДН – фибробласты с двойным нокаутом.

нарушений был связан с установлением мутаций, вызывающих болезнь.

БХ и СМА являются в чистом виде генетическими нарушениями, а гены, ответственные за развитие этих заболеваний, были клонированы 15 лет назад [11]. Большинство случаев БА, БП и БАС являются спорадическими, но примерно у 5% пациентов болезнь обусловлена наследственными причинами. Большая часть генов, ответственных за развитие наследственных форм этих заболеваний, также клонирована [11], что позволило создать генетические модели для исследования этих патологий на основе мышей.

На настоящий момент львиная доля попыток изучения этих патологий сфокусирована на определении основных причин указанных заболеваний. Например, основной причиной развития БА считается накопление амилоида. Поэтому основные усилия исследователей были направлены на предотвращение аккумуляции амилоида путем блокирования его продукции или путем облегчения его вывода из головного мозга. В случае с БХ главной причиной заболевания является экспрессия мутантной формы белка Хантингтина. Соответственно, основные усилия экспериментаторов в данном случае были направлены на попытки снижения экспрессии мутантного Хантингтина в головном мозге (например, применяя интерференцию антисмысловой РНК).

Несмотря на блестящие научные результаты, эти подходы очень трудно перенести в клинику. Так, в случае с БА клинические испытания амилоид-связывающего соединения трамипросата (Альцгемед) и ингибитора -секретазы таренфлурбила (Флуризан) потерпели неудачу.

А клинические испытания амилоид-связывающих моноклональных антител (Бапинеузумаб) имели очень ограниченный эффект, если вообще имели. Для клинических испытаний подходов в лечении БХ узким местом является создание адекватной системы доставки иРНК или антисмысловой последовательности РНК в головной мозг человека.

Пока нет решения этой проблемы, данные клинические испытания не могут быть начаты.

В то время как фокусирование внимания на амилоиде и мутантном Хантингтине имеет смысл для развития подходов в лечении БА и БХ, следует отметить, что разработка успешной терапии, основанной на этих подходах, займет значительное время и потребует больших усилий. Вдобавок к развитию «лечения» мы можем предложить терапию, которая позволит отложить возраст проявления симптомов и(или) снизит степень проявления заболевания. Отправной точкой наших исследований послужила гипотеза о важной роли нейрональной кальциевой сигнализации в развитии патологии нейродегенеративных заболеваний. На основании выдвинутой «кальциевой гипотезы» выносится предложение о том, что нейрональные кальциевые каналы и сигнальные белки, вовлеченные в кальциевую сигнализацию в нейронах, представляют собой притягательную цель для развития терапии для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Цель и задачи исследования. Несмотря на интенсивный поиск причин нейродегенеративных заболеваний, они до сих пор остаются неизлечимыми. Было обнаружено, что атрофические и дегенеративные процессы в нейронах сопровождаются изменениями кальциевого гомеостаза. Эти результаты привели к формулировке «Кальциевой гипотезы» нейродегенеративных заболеваний. Основная цель диссертационной работы – выяснение роли цитоплазматического кальция в развитии нейрональных патологий и экспериментальная проверка «кальциевой гипотезы» на клеточных и животных моделях БА, БХ и СМA. В связи с этим поставлены следующие задачи:

1. Анализ изменений в нейрональной Ca2+ сигнализации в присутствии мутаций, приводящих к развитию болезни Хантингтона. Выявление потенциальных связей между нарушениями в нейрональной Ca2+ сигнализации и смертью срединных шипиковых нейронов (СШН) стриатума, наблюдаемой при БХ.

2. Анализ изменений в нейрональной Ca2+ сигнализации в присутствии мутаций, приводящих к развитию спиномозжечковой атаксии 3 типа (СМА3). Выявление потенциальных связей между нарушениями в нейрональной Ca2+ сигнализации и смертью нейронов в собственных ядрах моста и черном веществе, наблюдаемой при СМА3.

3. Анализ изменений в нейрональной Ca2+ сигнализации в присутствии мутаций, приводящих к развитию спиномозжечковой атаксии 2 типа (СМА2). Выявление потенциальных связей между нарушениями в нейрональной Ca2+ сигнализации и смертью клеток Пуркинье, наблюдаемой при СМА2.

4. Анализ изменений в нейрональной Ca2+ сигнализации, вызванных мутациями в белках пресенилинах, приводящих к развитию болезни Альцгеймера. Проверка гипотезы о новой функции пресенилинов как каналов утечки Ca2+ из внутриклеточных депо. Выявление потенциальных связей между нарушениями в нейрональной Ca2+ сигнализации и патологией нейронов наблюдаемой при БА.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Нейрональная кальциевая сигнализация и патогенез болезни Хантингтона (БХ). Мутантный белок Хантингтин (Хтт) специфически связывается с InsP R и активирует эти рецепторы в липидных бислоях.

В срединных шипиковых нейронах стриатума (СШН) при БХ нарушена кальциевая сигнализация и увеличена глутаматная токсичность.

Кальциевые блокаторы защищают СШН при БХ от глутаматной токсичности в экспериментах с культурами нейронов и у мышей, являющихся моделью БХ. Активация допаминовых рецепторов приводит к дополнительному увеличению кальциевого ответа в СШН стриатума.

Допаминовая сигнализация принимает участие в патогенезе БХ, и блокатор допаминовой сигнализации тетрабеназин может использоваться для лечения больных, страдающих БХ.

2. Нейрональная кальциевая сигнализация и патогенез спиномозжечковой атаксии 3-го типа (СМА3). Мутантный белок атаксин-специфически связывается с InsP R и активирует эти рецепторы в липидных бислоях. В результате, в нейронах, поражаемых при СМА3, нарушена нейрональная кальциевая сигнализация. Блокатор кальциевого выброса дантролен замедляет развитие патологии у мышей, являющихся моделью СМА3. Дантролен и другие кальциевые блокаторы могут использоваться для лечения больных, страдающих СМА3.

3. Нейрональная кальциевая сигнализация и патогенез спиномозжечковой атаксии 2-го типа (СМА2). Мутантный белок атаксин-специфически связывается с InsP R и активирует эти рецепторы в липидных бислоях. В клетках Пуркинье при СМА2 нарушена кальциевая сигнализация и увеличена глутаматная токсичность. Кальциевые блокаторы защищают клетки Пуркинье при СМА2 от глутаматной токсичности. Так, блокатор кальциевого выброса дантролен замедляет развитие патологии в модели СМА2 на основе мышей. Дантролен и другие кальциевые блокаторы могут использоваться для лечения больных, страдающих СМА2.

4. Нейрональная кальциевая сигнализация и патогенез болезни Альцгеймера (БА). В дополнение к известной -секретазной функции белки пресенилины работают как пассивные каналы утечки кальция из эндоплазматического ретикулума (ЭР). Большинство мутаций в пресенилинах, которые вызывают БА, приводят к нарушению функции каналов утечки и вызывают переполнение кальциевых депо. В нейронах потеря кальциевой утечки через белки пресенилины частично компенсируется за счет увеличения экспрессии рианодиновых рецепторов. Блокада рианодиновых рецепторов в модели БА на основе мышей приводит к дополнительному увеличению концентрации кальция в ЭР и вызывает увеличение количества бета-амилоидных бляшек, потерю синаптических маркеров и нейрональную атрофию. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли нейрональной кальциевой сигнализации в патогенезе БА.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование нарушений нейрональной кальциевой сигнализации при БХ, СМА3, СМА2 и БА. Получены приоритетные результаты, раскрывающие связь между мутациями, вызывающими БХ, СМА3 и СМА2, активностью InsP R и нарушенной нейрональной кальциевой сигнализацией. Впервые показана потенциальная роль кальциевых блокаторов для лечения БХ, СМА3, СМА2. Впервые продемонстрирован благоприятный эффект тетрабеназина в модели БХ на основе мышей.

Также впервые показана роль пресенилинов как каналов утечки кальция из ЭР. Установлена связь между нейрональной кальциевой сигнализацией и формированием амилоидных бляшек при БА.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в представленной работе данные имеют принципиальное значение для понимания фундаментальных основ нейрональной Ca2+ сигнализации.

Результаты работы демонстрируют связь между мутациями, вызывающими нейродегенеративные заболевания, и нейрональной Ca2+ сигнализацией. Проведенные исследования представляют теоретическую базу и адекватную экспериментальную модель для исследования роли нейрональной Ca2+ сигнализации в проявлении и развитии нейродегенеративных заболеваний. Полученные результаты расширяют представления о роли Ca2+ сигнализации при нейродегенеративных заболеваниях. Общебиологическая значимость результатов определяется также тем, что новая функция пресенилинов как каналов пассивной утечки кальция из ЭР имеет принципиальное значение для понимания фундаментальных механизмов кальциевого гомеостаза.

Итоги работы представляют несомненный интерес для современной фармакологии и практической медицины. Результаты проведенных исследований указывают на тот факт, что кальциевые антагонисты могут применяться для лечения нейродегенеративных заболеваний. Показано, что используемый в клинике препарат дантролен приводил к замедлению развития симптомов и уменьшению нейрональной смерти в моделях СМА3 и СМА2 на основе мышей.

Предложено провести клинические испытания дантролена для лечения больных СМА3 и СМА2. Установлено, что используемый в клинике блокатор допаминовой сигнализации тетрабеназин приводит к замедлению развития симптомов и уменьшению нейрональной смерти в модели БХ на основе мышей. Было выдвинуто предположение о том, что тетрабеназин может использоваться для лечения больных БХ.

Полученные результаты и сформированные на их основе теоретические представления используются в курсах лекций для студентов Юго-западного медицинского центрa Техасского университета Далласа и при руководстве аспирантами в Институте цитологии РАН Санкт-Петербурга и в Юго-западном медицинском центре Техасского университета Далласа.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на приглашенных семинарах в University of California (Irvine, 1997, 2006), University Medical Branch (Galveston, 1997), Университете Монреаля (1998), Texas Tech Health Science Center (Lubbock, 1999), New York University (1999), Georgetown University (Washington, 2000), New Jersey Medical and Dental School (2000), University Health Science Center (San Antonio, 2000), University de Lausanne (Switzerland, 2000), University Paris Sud Orsay (2000), K.U.Leuven (Leuven, Belgium, 2000, 2008), Case Western Reserve University (Cleveland, 2000, 2008), Max Planck Institute (Dresden, Germany, 2000), NIH Gerontology Research Center (2002), University of Okazaki (Japan, 2003), University of Tokyo (Japan, 2003, 2004, 2007), Korean Institute of Science and Technology (Daejeon, Korea, 2003), KIST (Seoul, Korea, 2003, 2006), University of Chicago (2003), University of Colorado Health Science Center (Denver, 2004), New York Upstate Medical University (Syracuse, 2004), University of Arkansas (Little Rock, 2004), University of California (Davis, 2005, 2008), Yale University (New Haven, 2006), Seoul National University (Korea, 2006), Rosalind Franklin University (Chicago, 2008), University of Pennsylvania (Philadelphia, 2008), Институте цитологии РАН (Санкт Петербург, 2008), University of Ann Arbor (2008), Gladstone Institute of Neurological Disease (San Francisco, 2008), University of Iowa (Iowa City, 2009), а также в приглашенных докладах на Гордоновских конференциях (1999, 2005, 2008, 2009), на съездах международного Физиологического общества (1999, 2008), на съездах международного Биофизического общества (2003, 2008, 2009), на съездах международного общества Нейробиологов (2004), HDF foundation workshops (2003, 2004, 2008), EMBO workshop on “Calcium Signaling and Disease” (Capri, Italy, 2004), RIKEN BSI Frontiers in Molecular Neuropathology workshop (Tokyo, Japan, 2004), HighQ Foundation workshop “Calcium Targets in HD” (Los Angeles, 2005), FAOPS Congress (Seoul, Korea, 2006), Winter Conference on Brain Research (2007, 2008), Conference on Molecular Mechanisms of Neurodegeneration (Milan, Italy, 2007), FASEB Summer Research Conference (2007, 2008), University of Tokyo Neuroscience Symposium (Sapporo, Japan, 2007), KMA foundation workshop (Las Vegas, 2008), European Calcium Society meeting (Leuven, Belgium, 2008), Ion Channels meeting (Giens, France, 2008), конференции Российского общества клеточных биологов в Санкт Петербурге (2009), на 16-ой международной конференции по кальциевой сигнализации (Пуко, Чили, 2009).

Публикации. Список основных публикаций по теме диссертации включает 62 оригинальные статьи в ведущих отечественных (3) и зарубежных (59) рецензируемых изданиях и 16 заказных обзоров (в зарубежных рецензируемых журналах и книгах), а также более 1тезисов отечественных и зарубежных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 2страниц включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, 88 рисунков, таблиц, заключение, выводы и список литературы. Личный вклад автора являлся определяющим на всех этапах работы и заключался в постановке задач исследования, участии в проведении экспериментов и обработке данных, анализе, обобщении и изложении результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке, полученной автором от National Institutes of Health, CHDI foundation, Hereditary Disease Foundation, Welch Foundation, Alzheimer's Drug Discovery Foundation, Alzheimer's Association, US Department of Defence и многих других организаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Трансгенные линии мышей. Для изучения патогенеза БХ использовали трансгенную линию мышей YAC128 [12], для изучения патогенеза СМА3 – трансгенную линию СМА3-YAC-84Q [13], а для изучения патогенеза СМА2 – трансгенную линию СМА2-58Q [14]. При изучении патогенеза БА использовали мышей PScDKO (PS1dTAG/dTAG, PS2-/-), которые были созданы скрещиванием мышей PS1dTAG/dTAG с мышами PS2-/- [15]. Мыши PS1dTAG/dTAG были созданы при помощи нокаутной стратегии. Первый экзон гена PSEN1 был окружен сайтами loxP. Вдобавок к этому, двойная метка, кодирующая белок, связывающий кальмодулин, а затем метка эпитопа 3xFlag были вставлены сразу за стартовым кодоном ATG гена PSEN1. PScDKO мыши любезно предоставлены Bart De Strooper (KU Leuven). Для изучения патогенеза БА также использовали мышей 3xTg (KI-PS1, M146V Thy1-APP, Thy1-tau ) [16] и мышей APPPS1 (Thy1KM670/671NL P301L APP, Thy1-PS1 ) [17]. Мыши 3xTg любезно предоставлены KM670/671NL L166P Frank La Ferla (UC Irvine), а мыши APPPS1 – Mathias Jucker (University of Tbingen). Все животные находились на стандартной лабораторной диете и получали бидистиллированную воду ad libitum.

Плазмиды. Плазмида, кодирующая InsP R1 крысы [18], была любезно предоставлена Thomas Sdhof (Stanford University); плазмиды с полными формами Хтт-23Q и Хтт-82Q человека [19] – Dr Christopher A Ross (John Hopkins University); плазмиды с полными формами Хтт-15Q и Хтт-138Q человека [20] – Dr Michael Hayden (University of British Columbia); плазмиды с полными формами Atx3-19Q, Atx3-77Q и Atx3-127Q человека [21] – Dr Nobiku Nukina (Riken); плазмиды с полными формами Atx-22Q и Atx2-58Q человека [22] – Dr Stefan Pulst (University of Utah); плазмиды с полными формами пресенилинoв человека (дикого типа и мутантых) – Dr GangYu (Southwestern University at Dallas) и Bart De Strooper (K.U.Leuven). Для генерации мутаций и конструкций для экспрессии использовали стандартные методы молекулярной биологии.

Антитела. Моноклональные антитела: против ХA (HA.11) – Covance, против Хтт (mAB2166) – Chemicon International, против ХАП1 1Bпредоставлены Dr. Claire-Anne Gutekunst, антитела против GAD65 – BD PharMingen, антитела против CTF-PS1 (MAB5232) и против актина (MAB1501) – Chemicon, против FLAG (F3165) – Sigma, против RyanR (MA3-925) – ABR, антитела NeuN (MAB377) – Millipore, антитела DARPP-32 (#2306) – Cell Signaling, антитела против A 6E10 (SIG-39300) – Covance. Поликлональные антитела: T443 против InsP R1 были описаны ранее [23], против SERCA2b были предоставлены Dr. Frank Wuytack (KU Leuven), против PSD95 — Thomas Sdhof (Stanford University). Вторичные антитела: Alexa Fluor-488 или Fluor-594 (A21121, A11012 и A11008) – Invitrogen, конъюгированные с HRP антикроличьи и антимышиные антитела (115-035-146 и 111-035-144) – Jackson ImmmunoResearch, биотинилированный реагент против IgG мыши – Vector Labs (BMK-2202).

Вирусные векторы. Для функциональных и биохимических экспериментов рекомбинантные белки были экспрессированы в клетках Sf9, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами.

Рекомбинантные бакуловирусы, кодирующие InsP R1, пресенилины (PS1, PS2 и мутанты), хантингтин, атаксин-2 и атаксин-3, были созданы с использованием системы Bac-to-Bac (Invitrogen). Для экспрессии рекомбинантных белков в первичных культурах нейронов использовались лентивирусы. Шаттл-плазмиды, кодирующие NLS-GFPCre и NLS-GFP, любезно предоставлены Thomas Sdhof (Stanford University). Вирусы Lenti-GFP и Lenti-Cre созданы посредством котрансфекции шаттл-векторов с упакованным HIV-1 вектором 8.9 и VSVG плазмид покровных гликопротеинов в пакующую клеточную линию HEK293T. Полученные маточные растворы вирусов были немедленно заморожены в жидком азоте и хранились при -80°C. Рекомбинантные лентивирусы, кодирующие GFP, GFP-IC10 и PS1, созданы по той же технологии. Для экспрессии рекомбинантных белков in vivo использовали адено-ассоциированные вирусы (AAV). Вирусы AAV1-GFP и AAV1-GFP-IC10 cозданы в клетках Sf9 [24] при использовании протоколов University of Iowa Vector Core. Экспрессионные кассеты CMVGFP-BGH или CMV-GFP-IC10-BGH субклонированы в аденоассоциированный шаттл-вектор pFBGR [25,26]. Были созданы рекомбинантные бакуловирусы bac-GFP и bac-GFP-IC10 с использованием системы Bac-to-Bac (Invitrogen). Вирусы bac-GFP и bacGFP-IC10 использовали для инфицирования клеток Sf9 вместе с вирусами Rep2 и Cap1. Вирусы AAV1-GFP и AAV1-GFP-IC10 выделены из лизатов клеток Sf9 и очищены центрифугированием в градиенте йодиксанола [27] в сопровождении Mustang-Q ионо-мембранного обмена (диализа) (Pall Corporation). Очищенные вирусы AAV1 сконцентрированы на мембране Amicon Ultra-4 и заморожены при -80°C.

Биохимические и молекулярные методы. Использовали стандартные методы для анализа с помощью двугибридной дрожжевой системы, направленного мутагенеза, GST pull-down анализа, иммунопреципитации.

Бислойные липидные мембраны. Регистрация активности одиночного канала рекомбинантного InsP R1 была осуществлена по описанной ранее методике [28,29] при трансмембранном потенциале в мВ и с использованием 50 мM Ba2+ (trans) в качестве носителя тока.

Цитозольная (cis) камера содержала 110 мM Tris, растворенного в HEPES (pH 7.35), 0.5 мM Na ATP, pCa 6.7 (0.2 мM EGTA + 0.14 мM CaCl ) 2 [30]. InsP R1 был активирован добавлением 100 нM InsP или 2 мкM InsP 3 3 (Alexis) в cis камеру. Активность каналов пресенилинов регистрировали по тому же методу без добавления InsP и ATФ. Токи в бислоях усиливались (Warner OC-725), фильтровались на частоте 1 кГц при помощи низкочастотного 8-полюсного фильтра Бесселя, оцифровывались на частоте 5 кГц (Digidata 1200, Axon Instruments) и записывались на жесткий диск компьютера и на оптический диск. Для последующего компьютерного анализа (pClamp 6, Axon Instruments) токи подвергали цифровой фильтрации на частоте 500 Гц. Для графического представления записи токов данные фильтровали при 200 Гц.

Первичные культуры нейронов. Первичные культуры срединных шипиковых нейронов (СШН) получены из гетерозиготных мышат YAC1и мышат дикого типа на 1-2-й день после появления на свет. Первичные культуры клеток Пуркинье получены из гетерозиготных новорожденных мышат СМA2-58Q и новорожденных мышат дикого типа. Первичные культуры постнатальных нейронов гиппокампа получены из гомозиготных мышат 3xTg, PScDKO и мышат дикого типа на 1-2-й день после появления на свет. Полученные первичные культуры поддерживали 11-14 дней перед проведением экспериментов.

Флуориметрическая регистрация внутриклеточной концентрации Ca2+. Внутриклеточная концентрация Ca2+ в первичных нейрональных культурах и в культурах фибробластов измеряли при помощи флуоресцентного зонда Fura 2-AM (Molecular Probes). Для флуориметрических экспериментов покровные стекла с клетками переносились в регистрирующую/перфузионную камеру (RC-26G, Warner Instrument Corp), которая помещалась на подвижный предметный столик инвертирующего микроскопа Olympus IX-70. Клетки периодически возбуждали ультрафиолетом с длиной волны 340 и 380 нм (DeltaRAM illuminator, PTI) с использованием Fura-2 дихроического фильтра (Chroma Technologies) и 60-кратного пропускающего ультрафиолет иммерсионного объектива (Olympus). Излучаемый свет фиксировался камерой IC-300 (PTI), полученные изображения оцифровывали при помощи программного обеспечения ImageMaster Pro (PTI). Свечение зонда при длинах волн возбуждения 340 и 380 нм фиксировали каждые 5 с и представляли как соотношение свечения при 340/380 в отмеченные временные интервалы. Фоновую флуоресценцию определяли согласно рекомендациям производителя (PTI) и вычитали из регистрируемого сигнала. Внутриклеточная концентрация цитозольного Ca2+ ([Ca2+ ]i (нM)) в этих экспериментах определяли из уравнения [31]:

[Ca2+ ]i (нM) = Kd x [(R - Rmin)/(Rmax - R)] x Sf,380/Sb,380, где Kd = 285 нM – это константа диссоциации Fura-2 по Ca2+ при 37°C, R – это экспериментально установленное соотношение 340/380, Rmax – это соотношение 340/380 для Fura-2, связанной с Ca2+, Rmin – это соотношение 340/380 для Fura-2, не связанной с кальцием.

Sf,380/Sb,380 – это отношение интенсивности флуоресценции бескальциевой и связанной с Ca2+ формами Fura-2 при 380 нм.

Sf,380/Sb,380 в наших экспериментах определялась как 2.0.

TUNEL окрашивание для оценки апоптоза. Первичные культуры СШН на 14-й день инкубации в течение 8 ч подвергали воздействию глутамата, добавленному в инкубационную среду в различных концентрациях. В ходе воздействия глутамата клетки находились в CO 2 инкубаторе для клеточных культур (увлаженный 5% CO, 37°C). Сразу после воздействия глутаматом нейроны фиксировали в течение 30 мин в 4%-м параформальдегиде с 4% сахарозы в PBS (pH 7.4), пермеабилизировали в течение 5 мин в 0.25%-м Triton X-100 и окрашивали при помощи DeadEnd Fluorometric TUNEL System согласно инструкции производителя (Promega). Ядра были противоокрашены мкM йодида пропидиума (PI) (Molecular Probes). Покровные стекла были интенсивно отмыты PBS и помещены в Moweol-488 (Polysciences). FITC- и PI-флуоресцирующие изображения фиксировали с помощью микроскопа Olympus IX70 с 40-кратным объективом камерой Cascade-650 (Rhoper Scientific) и программным обеспечением Metafluor (Universal Imaging). Для каждой позиции эксперимента было проанализировано 4-6 случайно выбранных полей зрения, содержащих по 200-300 СШН каждое. Количество TUNEL-позитивных ядер нейронов рассчитывалось как фракция PI-позитивных ядер нейронов в каждом поле зрения безотносительно природы исследуемого образца. Ядра глиальных клеток, идентифицированных благодаря своим большим размерам и слабому PI-окрашиванию, не рассматривались при анализе.

Фракция TUNEL-позитивных ядер, определенных для каждого поля зрения, была усреднена, а результаты представлены как среднее ± S.D (n = количество проанализированных полей зрения).

Введение лекарственных препаратов мышам Трансгенным мышам и мышам дикого типа препараты давались при помощи адаптированной методики, использовавшейся в предыдущих исследованиях на мышах R6/2 [32]. Все препараты были ресуспензированы в PBS и в 2% кукурузной муке и принимались мышами дважды в неделю начиная с возраста 2 мес до 10-месячного возраста. Контрольным группам скармливался PBS.

Стереотаксические инъекции вирусов AAV1. Стереотаксические инъекции вирусов AAV1 в стриатум мышей осуществляли по описанной ранее методике [26]. Для билатеральных инъекций шприцы позиционировали под углом 10 градусов с обеих сторон мозга.

Оптимальные инъекционные координаты (относительно темени) для стриатальных инъекций составили: A/P = 0.5 мм, латерально = 2.5 мм, D/ V = -2.8 мм. Вирусы AAV1 были диализированы против лактатного раствора Рингера непосредственно перед стереотаксическими инъекциями. Конечные виральные титры, используемые для инъекций, содержали 2.2 1011 TU/мл для AAV1-GFP и 2.0 1011 TU/мл для AAV1GFP-IC10 в лактатном растворе Рингера. Объем инъекции составил мкл на участок, при скорости введения 0.2 мкл/мин. Инъекции AAVделали мышам в возрасте 7-8 нед.

Анализ координации движений у мышей. Эксперименты по оценке координации движений осуществлялись по ранее описанной методике для мышей R6/2 и YAC128 [12,33]. Для проведения «теста на вращение» использовался аппарат ускоряющийся ротарод Economex (The Columbus Instruments, Columbus, Ohio). Тестирование проводилось в течение 1 дня с полуторачасовыми периодами отдыха между испытаниями. Регистрировали время, в течение которого животное удерживается на вращающемся валике до падения, в ходе двух тестовых попыток. «Тест на балансировку» проводили с использованием самодельной оригинальной экспериментальной установки. В тесте использовали круглый (17 мм и 11 мм в диаметре) и квадратный (5 мм толщиной) бруски. Для каждого испытания регистрировали время прохождения бруска (80 см длиной) и количество соскальзываний с бруска задних лап животного. Для каждого измерения брали результаты двух последовательных испытаний на каждом типе бруска.

Исследование дорожки следов осуществляли в возрасте 11.5 мес по ранее описанной методике [33]. В этих экспериментах задние и передние лапы мыши покрывали соответственно синей и красной нетоксичной краской. Затем мышей обучали проходить вдоль экспериментальной камеры длиной 50 см, шириной 10 см с открытым верхом и боковыми стенками высотой 10 см. Все мыши осуществляли по три побежки в день в течение трех последовательных дней. После каждой побежки на дно камеры укладывался новый чистый лист бумаги. Дорожку следов количественно анализировали по четырем измерениям: длина самого большого шага, размер шага задними лапами, размер шага передними лапами и размер наложения следа передними и задними лапами, как было описано ранее [33].

Нейропатологическое обследование мышей. По окончании анализа координации движений (в возрасте 11-14 мес) мыши были терминально анестезированы и транскардиально перфузированы 10 мл 0.9%-ного соляного раствора со 100 мл фиксатива (4%-ного параформальдегида в 0.1M PBS, pH 7.4). Мозг всех животных извлекали из черепа и взвешивали. Мозги стойко фиксировали в течение ночи при 4°C в 4%-м параформальдегиде и уравновешивали в 20-30% (w/v) сахарозе в PBS. Мозги нарезали на коронарные срезы толщиной 30 мкм при помощи скользящего микротома Leica SM2000R. Коронарные срезы окрашивали моноклональными антителами NeuN (Chemicon, разведение 1:1000) и биотинилироваными вторичными антимышиными антителами (Vector, Burlington, ON, Canada, разведение 1:200) (MOM набор). Для визуализации клеток Пуркинье срезы мозжечка окрашивали моноклональными антителами против кальбандина D 28K (CBD28) и биотинилироваными вторичными антимышиными антителами. Сигнал усиливался при помощи набора ABC Elite (Vector) и определялся с диаминбензидином (Pierce). Все количественные стереологические подсчеты осуществляли вслепую относительно природы срезов (генотип и принимавшиеся препараты) с использованием установки Stereoinvestigator и программного обеспечения (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

Для окрашивания бета-амилоидных бляшек коронарные срезы мозга мышей APPPS1, проходящие через области переднего мозга, окрашивали антителами против A 6E10 (разведение 1:1000), а затем вторичными антителами против IgG мыши Alexa Flour-488 (1:20dilution). Количественный анализ амилоидной нагрузки осуществляли вслепую с использованием сканирующей лазерной системы Isocyte (Molecular Devices). При помощи специального программного обеспечения (Molecular Devices) для каждого среза автоматически рассчитывали: среднюю площадь амилоидных бляшек (AREA), среднюю интенсивность флуоресцентного сигнала от бляшек (IINT-1) и количество бляшек. Проанализированы по 20 срезов мозга от каждой из 12 мышей. Данные для контрольной и получавшей дантролен групп усредняли.

Для анализа плотности синапсов срезы гиппокампа из APPPSмышей окрашивали поликлональными антителами против PSD95 и Alexa Fluor-488 вторичными антителами. Ядра нейронов гиппокампа окрашивали йодидом пропидиума. Изображения срезов гиппокампа были получены при помощи конфокального микроскопа Zeiss Axoivert 100M. На четырех срезах от каждой мыши APPPS1 осуществляли окрашивание серебром по Бильшовскому согласно ранее опубликованным процедурам.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Нейрональная кальциевая сигнализация и патогенез болезни Хантингтона (БХ).

1.1 InsP R1 связывается с ХАП1A в дрожжевой двугибридной системе (Д2Г).

Мы идентифицировали новые белки, которые связываются с Сконцевой областью InsP R1. Для этого использовали С-концевую область InsP R1 крысы в векторе pLexN (IC участок, аминокислоты D2590-A2749) для Д2Г скрининга библиотеки кДНК мозга крысы и изолированных 16 позитивных клонов. Один из изолированных клонов (клон 11) соответствовал частичному фрагменту белка ХАП1A (хантингтин-ассоциированного протеина 1). Провели систематическое картирование взаимодействующих доменов, используя жидкостный Д2Г анализ (Рис. 1A, Б). Связывание InsP R1 и ХАП1 было подтверждено в GST pull-down экспериментах и при использовании метода иммунопреципитации (Рис. 1В, Г). Поскольку ХАП1 взаимодействует с Хтт, мы исследовали, можно ли сформировать троичный комплекс InsP R1-ХАП1A-Хтт. В ходе этого исследования обнаружено, что мутантный Хтт-82Q, но не Хтт-23Q (дикого типа), демонстрировал сильное и прямое связывание с С-концом InsP R1 даже в отсутствие ХАП1A (Рис. 1Д).

Рисунок. 1. InsP R1 связывает ХАП1A и Хтт в двугибридной дрожжевой системе in vitro. А-Б. Результаты жидкостного двугибридного анализа. В-Г. Результаты pull-down экспериментов. Д. Результаты экспериментов по иммунопреципитации. [6] 1.2 Мутантный Хантингтин активирует InsP R1 в БЛМ.

Для изучения функциональных последствий связывания InsP R1 с мутантным Хтт использован метод реконституции в бислойные липидные мембраны (БЛМ). Рекомбинантный InsP R1 был экспрессирован в клетках Sf9 при помощи бакуловирусной системы и встроен в БЛМ. Добавление 100 нM InsP в cis (цитозольную) камеру вызывало низкие уровни активности InsP R1 (Рис. 2Б, вторая линия, 2В).

Дальнейшее добавление белка GST или повторное добавление белка Хтт-N-15Q прямо к бислою не оказывало влияния на активность InsP R(Рис. 2Б, линии 3-5, 2В). В противоположность этому, добавление белка Хтт-N-138Q к тому же бислою приводило к усилению активности InsP R(Рис. 2Б, линия 6, 2В). В среднем вероятность открытого состояния InsP R1 составила 0.020±0.008 (n=16) в присутствии 100 нM InsP, 3 0.02±0.01 (n=6) после добавления белка Хтт-N-15Q и 0.19±0.05 (n=4) после добавления белка Хтт-N-138Q. Усиление активности InsP R1 под действием Хтт-N-138Q было более выраженным при низких концентрациях InsP. Когда InsP R1 был активирован 2 мкМ InsP, 3 3 добавление белков GST, Хтт-N-15Q и Хтт-N-138Q не оказывало достоверного действия на вероятность открытого состояния InsP R(Рис. 2Г). Исходя из этих данных, мы сделали заключение о том, что ХттN-138Q, но не Хтт-N-15Q, сенсибилизирует InsP R1 к активации субмаксимальными дозами InsP.

Рисунок 2. Мутантный Хантингтин сенситизирует InsP R1 к InsP в БЛМ 3 А-В. Эффекты GST, Хтт-N-15Q и Хтт-N-138Q на активность рекомбинантного InsP R1 в бислойной липидной мембране при 100 нM InsP. Г. Результаты, полученные 3 при 2 мкM InsP. [6] 1.2 Мутантный Хантингтин активирует выброс Ca2+ в СШН.

Для исследования функциональных воздействий Хттexp на InsP R1 была создана первичная культура СШН из эмбрионов крыс E18. После культивирования в течение 20 сут СШН были трансфицированы плазмидами с полными формами Хтт-23Q, Хтт-82Q или Хтт-138Q. Для идентификации трансфицированных клеток была котрансфицирована плазмида с улучшенным зеленым флуоресцирующим белком (EGFP).

Клетки были загружены Ca2+ флуоресцентным зондом Fura-2 и простимулированы 3,5-дигидроксифенилглицином (ДГФГ), специфическим агонистом рецептора mGluR1/5, в концентрации 10 мкМ.

Данные с СШН, трансфицированными EGFP, EGFP+Хтт-23Q, EGFP+Хтт-82Q и EGFP+Хтт-138Q, показаны на рисунке 3.

Трансфицированные клетки определялись по наличию свечения GFP (Рис. 3, первая колонка, стрелки) до начала флуориметрических экспериментов. 10 мкМ ДГФГ соответствует пороговой концентрации для активации рецептора mGluR1/5 в СШН. На аппликацию ДГФГ в этой концентрации к контрольным СШН, трансфицированным одной плазмидой с EGFP (Рис. 3, первый ряд), и к СШН, трансфицированным плазмидой с Хтт-23Q (Рис. 3, второй ряд), наблюдался незначительный ответ. В противоположность этим данным, аппликация 10 мкМ ДГФГ вызывала значительный ответ в СШН, трансфицированных плазмидой с Хтт-82Q (Рис. 3, третий ряд). Еще более сильная реакция на агонист наблюдалась в СШН, трансфицированных плазмидой с Хтт-138Q (Рис.

3, четвертый ряд).

Рисунок 3. Мутантный Хантингтин стимулирует высвобождение Ca2+ в СШН.

Сигнал Fura-2 показан для ДГФГ-индуцированных (в концентрации 10 мкM) Ca2+ выбросов в СШН, трансфицированных EGFP (первый ряд), EGFP+Хтт-23Q (второй ряд), EGFP+Хтт82Q (третий ряд) и EGFP+Хтт-138Q (четвертый ряд). [6] 1.4 Нарушение Ca2+ сигнализации и апоптоз СШН при БХ.

В трансгенных мышах YAC128, являющихся моделью БХ, полная форма Хтт человека с увеличенным полиглутаминовым повтором (128Q) экспрессируется под контролем эндогенного промотора и регуляторных элементов [12]. С использованием мышей YAC128 мы разработали «in vitro модель БХ» на основе первичных культур СШН. В качестве контроля использовали первичные культуры СШН дикого типа (ДТ) и мышей линии YAC18. На 14-й день инкубации все 3 группы СШН были подвергнуты 8-часовому воздействию глутамата (в концентрациях от до 250 мкM) для имитации физиологической стимуляции. После воздействия глутамата СШН фиксировали, пермеабилизировали и оценивали количество апоптировавших клеток с помощью TUNEL окрашивания. Установлено, что в базальных условиях (без добавления глутамата) приблизительно 10% СШН во всех трех экспериментальных группах были апоптическими (TUNEL-позитивными) (Рис. 4A, 4Б).

Добавление 25 или 50 мкM глутамата увеличивало количество апоптирующих клеток до 15-20% во всех трех экспериментальных группах (Рис. 4A, 4Б). Добавление 100 или 250 мкM глутамата увеличивало апоптическую смерть клеток до 60-70% для YAC128 СШН и только до 25-30% для СШН ДТ и YAC18 (Рис. 4A, 4Б). Таким образом, воздействие глутаматом в концентрациях от 100 до 250 мкM приводит к селективному апоптозу YAC128 СШН. Полученная клеточная модель БХ была использована для проверки «кальциевой гипотезы БХ».

Нейропротективный эффект был продемонстрирован в экспериментах с ингибиторами mGluR1/5 рецепторов, NMDA рецепторов, InsP R рецепторов, блокаторами каспазы-3 и каспазы-9 и ингибиторами пор митохондриальной проницаемости [3]. Нейропротективные эффекты в клеточной модели БХ были также показаны для клинических кальциевых и глутаматных блокаторов мемантина и рилузола [34], биоактивных фракций из экстракта женьшеня [35] и для препарата Димебон [36]. Было сделано заключение о том, что каналы кальциевой сигнализации представляют собой новые потенциальные мишени для терапевтического воздействия при БХ.

Рисунок 4. Глутаматиндуцированный апоптоз YAC128 БХ СШН. [3] 1.5 Нейропротективные эффекты фрагмента С-конца InsP R1 у мышей-моделей БХ.

Раннее нами было показано, что С-концевой фрагмент IC10 InsP R(F2627-A2749, длиной 122 аминокислот) напрямую и специфично связывается с мутантным Хттexp (раздел 1.1). Мы предположили, что включение пептида IC10 в СШН БХ в trans позиции должно нарушать патогенную связь между InsP R1 и Хттexp, что позволит нам оценить значение комплекса InsP R1-Хттexp для патогенеза БХ. Для введения пептида IC10 в полностью дифференцированные нейроны стриатума мы создали лентивирусные векторы, кодирующие интегрирующий белок GFP-IC10, и контрольные лентивирусы, кодирующие только белок GFP.

Первичные культуры СШН дикого типа и YAC128 были инфицированы Lenti-GFP или Lenti-GFP-IC10 на 7-й и 11-й день культивирования. При измерении Ca2+ сигналов в инфицированных культурах СШН мы определили, что фрагмент IC10 специфично стабилизирует глутаматопосредованное нарушение Ca2+ сигнализации в YAC128 СШН [1].

Для изучения нейропротективного эффекта Lenti-GFP-IC10 мы использовали разработанную нами ранее «in vitro модель БХ» (раздел 1.4). На 14-й день все инфицированные культуры СШН в течение 7-8 ч подвергались воздействию глутамата в концентрациях 0, 100, 250 мкМ, а затем при помощи TUNEL-TMR окрашивания (красный) и DAPI противоокрашивания ядер (синий) был проанализирован уровень клеточной смерти. Инфицирование вирусом Lenti-GFP не оказывало достоверного влияния на апоптоз СШН дикого типа или YAC128 (Рис.

5A, 5Б), а инфицирование вирусом Lenti-GFP-IC10 не оказывало Рисунок 5. Экспрессия GFP-IC10 защищает YAC128 СШН от апоптоза. [1] достоверного воздействия на клеточную смерть СШН дикого типа, однако значительно снижало глутамат-индуцированный апоптоз YAC1СШН (Рис. 5А, 5В). Таким образом, экспрессия GFP-IC10 оказывает специфичное нейропротективное действие в клеточной модели БХ.

Для исследования долговременных эффектов экспрессии GFP-ICв модели БХ на основе мышей YAC128, мы создали рекомбинантные вирусные векторы аденоассоциированных вирусов первого серотипа (AAV1), экспрессирующие интегрирующий белок GFP-IC10 и контрольный белок GFP. Полученные вирусы были билатерально стереотаксически инъецированы в область стриатума самок мышей дикого типа и мышей YAC128 в возрасте 7-8 нед. Для сравнения тонкой координации движений и способностей к поддержанию равновесия среди разных групп мышей использовался тест на балансировку на круглом (11 мм в диаметре) и квадратном (5 мм толщиной) брусках. Тест на балансировку повторялся каждые 2 мес до достижения мышами возраста 11.5 мес. Было установлено, что мыши YAC128, которым инъецировался вирус AAV1-GFP, с возрастом демонстрировали прогрессирующее нарушение способности ходить по бруску (более продолжительный период прохождения бруса и увеличенное число соскальзывания лап) в сравнении с мышами дикого типа, которым инъецировался тот же вирус AAВ1-GFP. Достоверные отличия в основных показателях этого теста (p<0.05) между группами YAC128/GFP и ДТ/GFP наблюдались в возрасте 7, 9 и 11.5 мес для круглого бруска и в возрасте 5, 7, 9 и 11.5 мес для квадратного бруска. В противоположность этому, мыши YAC128/IC10, так же, как и мыши ДТ/GFP или ДТ/IC10, успешно справлялись с тестом при любом уровне сложности вплоть до 9-месячного возраста, а в возрасте 9 мес мыши этих экспериментальных групп проходили тест достоверно (p<0.01) Таблица 1. Нейропатологический анализ мозга мышей, после инъекции AAV1. В наших экспериментах тестировались 4 группы мышей. Данные представлены как среднее ± S.E.M. (n = количество мышей). [1] Количество Количес №груп Наименование Площадь поперечного тво Вес мозга (г) нейронов (1пы группы сечения СШН (мкм2) мышей клеток) 1 ДТ-GFP 13 0.506 ± 0.014 1.331 ± 0.030 87.00 ± 2.2 YAC-GFP 15 0.445 ± 0.006 A 0.992 ± 0.032 A 72.88 ± 1.87 A 3 ДТ-GFP-IC10 11 0.511 ± 0.021 1.347 ± 0.027 90.11 ± 1.4 YAC-GFP-IC10 14 0.460 ± 0.007 A 1.196 ± 0.031 A,B 82.56 ± 1.90 A,B A: Достоверные отличия (p < 0.01) при сравнении с контрольными группами (ДТ).

B: Достоверные отличия (p < 0.01) при сравнении с группами YAC-GFP.

лучше, чем мыши группы YAC128/GFP в возрасте 9 и 11.5 мес для круглого бруска и в возрасте 5, 7, 9 и 11.5 мес для квадратного бруска.

Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия белка GFP-IC10 в стриатуме достоверно улучшает показатели теста на балансировку у стареющих мышей YAC128.

Селективная потеря СШН стриатума является главным нейропатологическим маркером БХ и характерной особенностью стареющих мышей YAC128 [12]. Для оценки эффектов экспрессии GFPIC10 на нейропатологию по завершении поведенческого анализа у мышей всех четырех групп после транскардиальной перфузии был извлечен мозг и определено количество СШН, используя стереологические методы. В этих экспериментах NeuN-позитивные нейроны стриатума подсчитывались безотносительно природы срезов (генотипа и воздействия вирусным вектором). В соответствии с опубликованными результатами [12], мыши YAC128, которым инъецировали AAV1-GFP, демонстрировали значительную потерю нейронов стриатума в сравнении с мышами ДТ/GFP или ДТ/IC(Таблица 1). У мышей YAC128, которым инъецировали вирус AAV1-GFPIC10, наблюдалось достоверное большее количество нейронов стриатума по сравнению с мышами YAC128/GFP (Таблица 1), что свидетельствует о нейропротективном действии экспрессии GFP-ICна СШН у мышей YAC128.

Дополнительный стереологический анализ выявил значительное снижение средней площади поперечного сечения нейронов у мышей YAC128/GFP по сравнению с мышами ДТ/GFP (Таблица 1). Интересно, что площадь поперечного сечения СШН у мышей YAC128/IC10 была достоверно больше, чем этот показатель у мышей YAC128/GFP (Таблица 1). Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия GFP-IC10 не только защищает YAC128 СШН от клеточной смерти, но и препятствует клеточному сжатию СШН у стареющих животных YAC128.

В целом установлено, что оверэкспрессия интегрирующего белка GFP-IC10 может стабилизировать Ca2+ сигнализацию и защищать YAC128 СШН от клеточной смерти in vitro и in vivo. Результаты наших исследований позволяют рассматривать InsP R1 как потенциальную терапевтическую мишень при лечении БХ, а также подтверждают роль пептида IC10 как нового терапевтического агента при этом заболевании.

1.6 Роль допаминовой сигнализации при БХ.

Помимо глутаматергической стимуляции из коры больших полушарий, стриатум является основной мишенью воздействия допаминергических нейронов черного вещества мозга [37]. Для оценки потенциальной роли допаминергической сигнализации в дегенерации СШН при БХ мы использовали «in vitro модель БХ», описанную ранее (раздел 1.4). Результаты экспериментов in vitro показали, что допамин и глутамат работают синергично, вызывая апоптоз СШН при БХ [7]. В дальнейшем мы оценили вклад допаминовых путей сигнализации в нейродегенерацию стриатума in vivo, используя мышей YAC128 как модель БХ. Для увеличения уровня допамина в мозге мышей был использован L-Dopa (100 мг/кг, дважды в неделю перорально), а для противодействия L-Dopa и ингибирования допаминовой сигнализации использовался ингибитор VMAT2 тетрабеназин (TBZ) (5 мг/кг, дважды в неделю перорально). В наших экспериментах координация движения животных оценивалась в тесте на вращение и в тесте на балансировку.

В возрасте 2 мес до начала приема препаратов у всех групп мышей регистрировались базальные показатели координации движений в этих двух тестах. Начиная с 2-месячного возраста и до возраста 10 мес всем мышам дважды в неделю скармливались препараты по описанной выше схеме. В возрасте 10 мес прием препаратов был прекращен и в течение последующих 30 сут животные не принимали никаких веществ.

Показатели теста на вращение и теста на балансировку регистрировались в возрасте 2, 5, 7, 9, 10 и 11 мес. После анализа результатов исследования поведения установлено, что у мышей дикого типа и мышей YAC128 в возрасте 2 мес показатели теста на вращение были сходными (Рис. 6). Контрольная группа животных дикого типа (которые получали PBS) проходила тест на вращение достоверно лучше (p<0.05), чем контрольная группа мышей YAC128 в возрасте 5, 7, 9, 10 и 11 мес (Рис. 6). Скармливание мышам дикого типа L-Dopa или LDopa/TBZ не оказывало очевидного эффекта на прохождение ими теста на вращение в каждом из исследованных возрастов (Рис. 6).

Прием L-Dopa мышами YAC1ухудшало их показатели теста на вращение (Рис. 6) с достоверным (p<0.05) уменьшением времени до падения, измеренного в возрасте и 11 мес. В противоположность этому, скармливание мышам YAC128 смеси L-Dора/TBZ достоверно (p<0.05) улучшало прохождение теста этими Рисунок 6. Результаты теста на животными в возрасте 9, 10 и вращение мышей YAC128. [7] мес в сравнении с контрольными мышами YAC128 (Рис. 6). Качественно похожие результаты были получены при использовании теста на балансировку и при анализе дорожки следов [7].

Для определения вклада путей допаминовой сигнализации в потерю нейронов у мышей YAC128, по завершении анализа поведения (в возрасте 11 месяцев), мозг животных всех 6 экспериментальных групп после транскардиальной перфузии извлекался из черепа и анализировался методами стереологии (раздел 1.5). Установлено, что прием мышами дикого типа L-Dopa и смеси L-Dopa/TBZ не вызывал достоверного изменения количества нейронов стриатума у этих животных (Таблица 2). Напротив, у мышей YAC128, принимавших LDopa, отмечалась достоверная потеря нейронов (p<0.05) по сравнению с контрольными мышами YAC128 (Таблица 2). Скармливание мышам YAC128 L-Dopa/TBZ достоверно (p<0.05) уменьшало потерю нейронов стриатума по сравнению с контрольными мышами YAC128 (Таблица 2).

Результаты нейропатологического анализа показали, что устойчивое увеличение уровня допамина посредством скармливания мышам L-Dopa способствуют потере нейронов стриатума у мышей YAC128 в возрасте 11 мес. Мы пришли к заключению о том, что TBZ защищает нейроны стриатума от клеточной смерти у стареющих мышей YAC128, но не защищает эти нейроны от усыхания (Таблица 2). Было выдвинуто предположение, что TBZ и другие допаминовые антагонисты могут быть использованы для лечения больных БХ.

Таблица 2. Нейропатологический анализ мозга мышей после воздействия L-DOPA/TBZ.

Тестировали 6 групп мышей. Данные представлены как среднее ± S.E.M. (n = количество мышей).

[7] Площадь Количество Группа Наименование Количество поперечного нейронов Масса мозга (г) # группы мышей сечения СШН (106 клеток) (мкм2) 1 ДТ-контроль 9 (5, 4) 0.508 ± 0.025 1.264 ± 0.035 85.75 ± 2.2 ДТ-Dopa 7 (5, 2) 0.501 ± 0.020 1.225 ± 0.016 87.51 ± 1.3 ДТ- Dopa /TBZ 8 (5, 3) 0.501 ± 0.019 1.258 ± 0.020 91.34 ± 2.4 YAC-контроль 9 (4, 5) 0.432 ± 0.007 1.090 ± 0.020 71.99 ± 1.5 YAC-Dopa 8 (4, 4) 0.423 ± 0.008 1.014 ± 0.028 75.53 ± 1.6 YAC- Dopa/TBZ 7 (4, 3) 0.464 ± 0.010 1.182 ± 0.026 77.21 ± 1.Достоверные отличия (p < 0.01) при сравнении с контрольными группами (ДТ).

B: Достоверные отличия (p < 0.01) при сравнении с группами YAC-GFP.

2. Нейрональная кальциевая сигнализация и патогенез спиномозжечковой атаксии 3-го типа (СМА3).

2.1 Мутантный атаксин-3 специфически связывается с InsP R1 и увеличивает его активность в БЛМ.

Спиномозжечковая атаксия 3 типа (СМА 3), также известная как болезнь Мачадо-Джозефа, - аутосомно-доминантное нейродегенеративное нарушение, которое, как и рассмотренная ранее БХ, принадлежит к группе заболеваний, вызываемых увеличением полиглутаминовой последовательности (polyQ) в белках [38]. На молекулярном уровне причина СМА3 состоит в увеличении polyQ последовательности в С-конце белка атаксина-3 (ATX3) [38]. По аналогии с Хттexp мы предположили, что мутантный ATX3exp может также связываться с С-концевой областью InsP R1. Для проверки этой гипотезы мы экспрессировали белки EGFP-ATX3-19Q, EGFP-ATX3-77Q и EGFP-ATX3-127Q в клетках HEK293 и осуществили серию GST pull-down экспериментов с бактериально экспрессированным С-концевым фрагментом InsP R1 GST-IC10. Установлено, что GST-IC10 специфично связывается с мутантными белками GFP-ATX3-77Q и GFP-ATX3-127Q, но не с белком дикого типа EGFP-ATX3-19Q (Рис. 7A). Аналогичные результаты были получены в экспериментах по иммунопреципитации полной формы InsP R1 (RT1) с белками EGFP-ATX3-19Q, EGFPATX3-77Q и EGFP-ATX3-127Q (Рис. 7Б).

Для оценки функционального влияния Atx3exp на InsP R1 в бактерии были экспрессированы полные формы белков ATX3-19Q и ATX3-77Q с добавлением амино-терминального тага MBP. Белки MBPATX3-19Q/77Q были очищены аффинной хроматографией и отфильтрованы в геле. При помощи бакуловирусной инфекции в клетках Sf9 была экспрессирована полная форма InsP R1 (RT1), Рисунок 7. Мутантный атаксин-Рисунок 8. Мутантный атаксин-связывается с InsP R1. [2].

активирует InsP R1 в БЛМ. [2].

которая затем встраивалась в БЛМ. Активность рекомбинантного InsP R1 индуцировалась добавлением 100 нМ InsP в cis камеру 3 (Рис. 8А, В, вторая запись тока). Добавление очищенного белка MBP или MBP-ATX3-19Q не оказывало влияния на активность InsP R1 в БЛМ (Рис. 8А, третья и четвертая запись тока, 8В). Напротив, добавление белка MBP-ATX3-77Q вызывало выраженную активацию InsP R1 (Рис. 8В, четвертая запись тока, 8Г). На основании полученных результатов мы сделали заключение о том, что связывание Atx3exp с InsP R1 увеличивает аффинность InsP R1 к 3 InsP, аналогично эффекту белка Хттexp (Глава 1).

2.2 Высвобождение Ca2+ из внутриклеточных Ca2+ депо в первичных фибробластах пациентов со СМА3.

Для дальнейшего исследования функциональных воздействий Atx3exp на Ca2+ сигнализацию в клетках и для определения адекватности наших результатов в отношении заболеваний человека мы осуществили серию экспериментов по измерению внутриклеточной концентрации Ca2+ (при помощи зонда Fura-2) на первичных фибробластах человека, взятых от здоровых людей и от пациентов с симптомами СМА3 с удлинением polyQ до 74Q в гене атаксина-3 (Рис. 9A). Обнаружено, что аппликации 300 нМ брадикинина (BK), агониста InsP -связанного рецептора, вызывали более значительное увеличение концентрации Ca2+ в фибробластах пациентов со СМА3, по сравнению с клетками здоровых людей (Рис.

9Б, 9В). В среднем амплитуда BKиндуцированного изменения концентрации Ca2+ составила 318±71 нМ Ca2+ (n=43) в контрольных клетках здоровых людей и 573±108 нМ Ca2+ (n=37) в клетках со СМА3, что было достоверно (p<0.05) выше контрольных значений. Таким образом, экспрессия мутантного белка атаксина-3 у человека оказывает усиливающее действие на InsP Rопосредованное высвобождение Ca2+ в фибробластах пациентов со СМА3, что Рисунок 9. Выброс Ca2+ из депо в согласуется с результатами, полученными в первичных фибробластах экспериментах с БЛМ (раздел 2.1).

пациентов со СМА3 [2].

2.3 Дантролен уменьшает выраженность симптомов СМА3 у трансгенных мышей.

Для проверки роли нейрональной Ca2+ сигнализации в патогенезе СМА3 мы провели исследования эффектов дантролена на трансгенных мышах СМA3-YAC-84Q. Дантролен — это релаксант скелетной мускулатуры, широко применяемый в клинике при лечении злокачественной гипертермии и мышечных спазмов [39]. Одной из молекулярных мишеней дантролена в мышечных и нервных клетках является рианодиновый рецептор (RyanR) — канал выброса Ca2+ из внутриклеточных депо. В наших исследованиях 100 мкг дантролена ресуспензировали в PBS и скармливали мышам дикого типа и мышам СМA3-YAC-84Q (СМА3) дважды в неделю начиная с двухмесячного возраста до достижения животными возраста 12 мес (Таблица 3). Прием дантролена мышами со СМА3 достоверно улучшал прохождение этими животными теста на балансировку (раздел 1.4) и улучшил «походку» животных, что установлено в результате анализа дорожки следов [2].

По завершении исследования поведения (в возрасте 13.5 мес) мозг животных из всех экспериментальных групп был извлечен из черепа и проанализирован методами стереологии. Наше внимание было сфокусировано на области ядер моста и черного вещества, которые наиболее сильно поражаются у пациентов со СМА3 [40]. Установлено, что пероральный прием дантролена уменьшил потерю нейронов в этих участках мозга у мышей-моделей СМА3 (Таблица 3). Полученные результаты свидетельствуют о том, что дантролен оказывает нейропротективное действие на нейроны ядер моста и черного вещества мозга, и подтверждают гипотезу об участии нарушений кальциевой сигнализации в патогенезе СМА3.

Таблица 3. Исследования эффектов дантролена на мышах СМА3-YAC-84Q. [2] В наших экспериментах использовались 4 группы мышей. Средняя масса мозга, количество нейронов в ядрах моста и черном веществе представлены как среднее ± SEM для каждой группы.

Количес Черное Дозировка Ядра моста № Наименова- тво Генотип Масса мозга вещество лекарства количество группы ние самок мышей (г) количество (мг/кг/3 дня) нейронов мышей нейронов ДТ1 10 ДТ PBS 0.500±0.008 43368±1811 11026±2контроль ДТ- 5 мг 2 7 ДТ 0.501±0.004 43659±2203 11202±2дантролен дантролена СМА3- СМА33 8 PBS 0.451±0.007 37021±1000 9384±2контроль YAC-84Q СМА3- СМА3- 5 мг 4 10 0.470±0.007 43642±1725 10699±2дантролен YAC-84Q дантролена 3. Нейрональная кальциевая сигнализация и патогенез спиномозжечковой атаксии 2-го типа (СМА2).

3.1 Мутантный атаксин-2 связывается с InsP R1 и увеличивает его активность в БЛМ.

Спиномозжечковая атаксия 2 типа (СМА2) – это аутосомное доминантное генетическое нейродегенеративное заболевание [41]. При СМА2 прежде всего поражаются клетки Пуркинье мозжечка [41,42]. На молекулярном уровне причина СМА2 состоит в удлинении нестабильного тринуклеотидного CAG повтора в гене ATXN2, который кодирует полиглутаминовый (polyQ) участок белка атаксина-2 (Atx2). По аналогии с Хттexp и Atx3exp мы предположили, что мутантный Atx2exp может также связываться с С-концевой областью InsP R1. Для проверки этой гипотезы мы экспрессировали белки Atx-22Q и Atx2-58Q человека в клетках COS7 и осуществили серию GST pull-down экспериментов с бактериально экспрессированным С-концевым фрагментом InsP RGST-IC10. Установлено, что GST-IC10 специфично связывается с мутантными белком Atx2-58Q, но не с белком дикого типа Atx-22Q (Рис.

10A). Аналогичные результаты были получены в экспериментах по иммунопреципитации полной формы InsP R1 (RT1) с белками Atx-22Q и Atx2-58Q (Рис. 10Б). Таким образом, мутантный Atx2exp специфично связывается с С-концевой областью InsP R1 так же, как и Хттexp и Atx3exp (Главы 1 и 2).

Для оценки функционального влияния Atx2exp на InsP R1, мы создали бакуловирусы, экспрессирующие полные формы белков Atx2-22Q и Atx2-58Q. Клетки Sf9 были коинфицированы бакуловирусами Atx2-22Q или Atx2-58Q вместе с бакуловирусом, кодирующим InsP R(RT1). Из коинфицированных Sf9 были выделены микросомы ЭР, Рисунок 11. Мутантный атаксин-Рисунок 10. Мутантный атаксин-активирует InsP R1 в БЛМ. [9] связывается с InsP R1. [9].

которые затем встраивались в БЛМ. До аппликации InsP в наших экспериментах не наблюдалось активности каналов (Рис. 11A, В).

Аппликация 100 нМ InsP приводила к низким уровням активации InsP R1, коэкспрессированного с Atx2-22Q (Рис. 11A, верхние записи тока, 11Б), но вызывала мощную активацию InsP R1, коэкспрессированного с Atx2-58Q (Рис. 11В, верхние записи тока, 11Г).

Увеличение концентрации InsP до 2 мкM еще сильнее активировало InsP R1 коэкспрессированного с Atx2-22Q (Рис. 11A, нижние записи тока, 11Б), но не оказывало дополнительного влияния на активность InsP R1, коэкспрессированного с Atx2-58Q (Рис. 11В, нижние записи тока, 11Г).

На основании этих результатов мы пришли к заключению о том, что ассоциация с Atx2exp увеличивает аффинность InsP R1 к InsP, что 3 аналогично эффектам белков Хттexp и Atx3exp (Главы 1 и 2).

3.2. Мутантный атаксин-2 сенситизирует клетки Пуркинье к глутамат-индуцированному апоптозу.

Клетки Пуркинье мозжечка серьезно поражаются уже на ранних стадиях СМА2 [41]. Эти клетки обильно экспрессируют InsP R1 [43].

Приводит ли описанное выше взаимодействие InsP R1 с Atx2exp (раздел 3.1) к нарушению Ca2+ сигнализации в клетках Пуркинье при СМА2? Для ответа на этот вопрос мы получили первичные культуры клеток Пуркинье из новорожденных мышат дикого типа и трансгенных мышат СМA2-58Q. В экспериментах с флуоресцентным кальциевым зондом Fura-2 мы показали, что клетки Пуркинье из животных СМA2-58Q выбрасывают значительно больше Ca2+ в ответ на стимуляцию 10 мкM ДГФГ, чем нейроны из контрольных мышей дикого типа [9]. В следующей Рисунок 12. Глутамат-индуцированная клеточная смерть в первичной культуре клеток Пуркинье из мышей дикого типа и СМА2-58Q [9].

серии экспериментов 14-суточные культуры клеток Пуркинье дикого типа и СМА2-58Q были подвергнуты 7-часовому воздействию 200 мкM глутамата, как ранее описывалось для культур СШН стриатума (Глава 1). Вслед за аппликацией глутамата клетки Пуркинье были окрашены антителами T443 на InsP R1 для визуализации формы клеток (Рис. 12, первая и вторая колонки, зеленый). Для идентификации клеточных ядер в стадии апоптоза использовался метод TUNEL-окрашивания (Рис. 12, третья колонка, красный), а для маркировки всех ядер в поле зрения применялось DAPI-окрашивание (Рис. 12, третья колонка, синий). В ходе данных экспериментов показано, что клетки Пуркинье СМА2-58Q имеют повышенную чувствительность к глутамат-индуцированному апоптозу (Рис. 12). Также установлено, что блокада RyanR дантроленом защищает СМА2-58Q клетки Пуркинье от глутамат-индуцированного апоптоза (Рис. 12).

2.3 Дантролен уменьшает выраженность симптомов СМА2 у трансгенных мышей.

Для проверки гипотезы о том, что нейрональная Ca2+ сигнализация вносит свой вклад в патогенез СМА2, мы провели исследования эффектов дантролена на трансгенных мышах СМA2-58Q. Эти эксперименты были организованы по той же схеме, что и эксперименты с мышами-моделями СМА(Глава 2). Установлено, что прием дантролена мышами со СМА2 достоверно улучшал прохождение этими животными теста на балансировку и на вращение [9].

По завершении исследования поведения (в возрасте 12 мес) мозг всех подопытных животных был извлечен из черепа. Для визуализации клеток Пуркинье сагиттальные срезы мозжечка были окрашены моноклональными антителами против кальбандина D 28K.

Рисунок 13. Нейроанатомический анализ головного мозга мышей дикого типа и мышей СМА2-58Q после курса дантролена [9].

В соответствии с предыдущим описанием мышей СМA2-58Q [14], наблюдалась потеря иммунореактивности к кальбандину в телах и дендритах клеток Пуркинье из мозжечков 12-месячных контрольных мышей СМА2-58Q в отличие от сильного окрашивания кальбандина в клетках Пуркинье мышей дикого типа того же возраста (Рис. 13Б).

Окрашивание кальбандина в клетках Пуркинье заметно восстанавливалось у животных СМА2-58Q, принимавших дантролен (Рис. 13Б). Для количественного определения морфологических изменений в мозжечке старых мышей СМА2-58Q мы измерили толщину молекулярного слоя (МС). Обнаружено, что у 12-месячных контрольных мышей 58Q МС был на 10 мкм тоньше (166±3 мкм), чем у контрольных мышей дикого типа (176±5 мкм), но эти отличия не достигали статистически достоверного уровня (p=0.078) (Рис. 13В, Таблица 4).

Толщина МС у животных СМА2-58Q, получавших дантролен, была почти такой же, как у животных дикого типа, получавших этот препарат (Рис.

13С, Таблица 4).

Для дальнейшей оценки степени потери клеток Пуркинье у мышей СМА2-58Q мы провели стреологический анализ этих клеток во всех исследованных группах животных. В результате этого анализа мы установили, что количество клеток Пуркинье у 12-месячных контрольных мышей СМА2-58Q было на 14% меньше, чем у контрольных животных дикого типа (Рис. 13Г, Таблица 4). Скармливание дантролена мышам СМА2-58Q достоверно снижало гибель клеток Пуркинье (Рис. 13Г, Таблица 4). Из приведенных данных следует, что прием дантролена защищает клетки Пуркинье старых мышей СМА2-58Q от дегенерации.

Полученные результаты подтверждают гипотезу об участии нарушений кальциевой сигнализации в патогенезе СМА2.

Таблица 4. Исследования эффектов дантролена на мышах СМА2-58Q [9] Использовались 4 группы мышей. Масса мозга, толщина молекулярного слоя и количество клеток Пуркинье представлены как среднее ± SEM для каждой группы.

Кол-во Разовая доза Дозировка Толщина № Наименова Генотип Кол-во клеток самок (2 в нед) препарата (мг/кг/ молекулярного группы ние группы мышей Пуркинье мышей (50мкл) 3 дня) слоя (мкм) ДТ 1 9 ДТ 50 мкл PBS PBS 176 ± 5 221240 ± 67контроль ДТ 100 мкг 5 мг/кг 2 12 ДТ 173 ± 3 224239 ± 51дантролен дантролена дантролена СМА2-58Q 3 10 СМА2-58Q 50 мкл PBS PBS 166 ± 3 191305 ± 44контроль СМА2-58Q 100 мкг 5 мг/кг 4 9 СМА2-58Q 175 ± 5 217629 ± 89дантролен дантролена дантролена 4. Нейрональная кальциевая сигнализация и патогенез болезни Альцгеймера (БА).

4.1 Рекомбинантные пресенилины формируют катионпроницаемые каналы низкой проводимости в БЛМ.

Болезнь Альцгеймера (БА) – это нейродегенеративное нарушение, приводящее к потере памяти. В большинстве случаев БА является идиопатической и характеризуется поздним проявлением симптомов (старше 60 лет). Небольшая часть от всех случаев этого заболевания (наследственная БА, НБА) характеризуется ранним проявлением симптомов и генетическим наследованием. В 40% всех известных случаев НБА наблюдались мутации в белках пресенилине-1 (PS1) и пресенилине-2 (PS2) [44]. Пресенилины – это белки массой 50 кДа, содержащие 9 трансмембранных доменов и расположенные в мембране эндоплазматического ретикулума (ЭР). Комплекс пресенилинов с никастрином, субъединицами aph-1 и pen-2 функционирует как секретаза, которая расщепляет белок предшественник амилоида (APP), что приводит к образованию амилоидного -пептида (A) — основного элемента амилоидных бляшек в мозге пациентов с БА. Поскольку пресенилины являются каталитическими субъединицами -секретазы [45,46], мутации этих белков, наблюдаемые при НБА, затрагивают процессинг APP.

Помимо изменений процессинга APP, имеющих место при НБА, мутации пресенилинов приводят к нарушению Ca2+ сигнализации [47].

Каково механистическое объяснение этих процессов? Какую роль играют пресенилины в Ca2+ сигнализации? Предсказанная структура пресенилинов содержит 9 трансмембранных доменов, что согласуется с возможностью выполнения этими белками функции ионного канала или транспортера. Нами было выдвинуто предположение, что пресенилины могут опосредовать транспорт Ca2+ в клетке. Для проверки этой гипотезы мы экспрессировали белок PS1 человека, белки PS1-M146V и PS1-E9 (мутантные белки, характерные для НБА) в клетки Sf9 при помощи бакуловирусной инфекции. Также мы исследовали белок PS1-D257A — мутант, который устраняет секретазную активность пресенилинов. Гетерологически оверэкспрессированные пресенилины не объединялись в -секретазный комплекс и в основном находились в виде холопротеинов [4].

Рисунок 14. PS1 формируют низкопроводящие катионные каналы в БЛМ [4].

Микросомы ЭР из инфицированных PS1 клеток Sf9 изолировались и встраивались в БЛМ. В качестве носителя тока в этих экспериментах использовались ионы Ba2+ (50 мM на trans стороне). Мы не отмечали ионных токов через БЛM до встраивания микросом ЭР (Рис. 14, первая колонка) или после встраивания микросом из неинфицированных клеток Sf9 (Рис. 14, вторая колонка). Напротив, когда микросомы из инфицированных PS1 клеток Sf9 встраивались в БЛM, в 7 из экспериментов наблюдались токи (Рис. 14, третья колонка). При сравнении с током на поддерживаемом потенциале 0 мВ, PS1опосредованные токи возрастали при потенциале –10 мВ и снижались при потенциале +10 мВ (Рис. 14, третья колонка), что согласуется с электрохимическим градиентом для ионов Ba2+. Эти данные свидетельствуют о том, что PS1 способен усиливать транспорт ионов Ba2+ через БЛМ, что может служить подтверждением выполнения им функции Ca2+ канала in vivo. В противоположность экспериментам с микросомами PS1, в экспериментах с микросомами PS1-M146V наблюдались намного меньшие токи (Рис. 14, четвертая колонка).

Мутант PS1-D257A поддерживал токи Ba2+ через БЛМ, сходные по амплитуде с PS1 дикого типа (Рис. 14, пятая колонка), а мутант PS1-Eдемонстрировал усиление канальной функции (Рис. 14, шестая колонка).

По аналогии с другими известными ионными каналами, функциональные каналы PS1, вероятно, являются мультимерами нескольких субъединиц PS1. Может ли мультимер PS1:PS1-M146V работать как ионный канал? Для ответа на этот вопрос мы коинфицировали клетки Sfбакуловирусами с PS1 и PS1-M146V (в соотношении 1:1).

Изолированные из этих клеток микросомы ЭР встраивались в бислойные липидные мембраны. Мы не обнаружили активности каналов в этих экспериментах (Рис. 14, седьмая колонка), что может свидетельствовать о наличии доминантно негативного действия мутанта PS1-M146V на функцию PS1 как ионного канала.

PS1 и PS2 – это две изоформы пресенилинов млекопитающих высокой степени гомологии. Разделяет ли PS2 функцию ионного канала с PS1? Для ответа на этот вопрос мы создали бакуловирус, кодирующий PS2 человека и мутантный PS2-N141I, и провели серию экспериментов с БЛМ. Мы установили, что рекомбинантный PS2, но не рекомбинантный PS2-N141I, поддерживает Ba2+ токи в БЛМ [4].

В наших экспериментах мы были не в состоянии зарегистрировать работу отдельного одиночного канала, и PS-опосредованные токи имели вид шумов (Рис. 14) Такой тип тока характерен для каналов с низкой проводимостью. Для оценки амплитуды одиночного тока через PSподдерживаемые каналы мы использовали модификацию методики анализа постоянного шума. Применив этот метод, мы определили, что при потенциале 0 мВ амплитуда единичного тока Ba2+, поддерживаемого PS1, составила 0.04±0.01 пА (n=4), что в 50 раз меньше амплитуды единичного тока через InsP R1 (2 пА).

4.2. Пресенилины функционируют как каналы Сa2+ утечки в эмбриональных фибробластах мышей.

Для определения физиологической роли Ca2+ каналов, формируемых пресенилинами, мы провели серию экспериментов по флуориметрическому определению внутриклеточной концентрации Ca2+ в фибробластах, полученных из мышей с двойным нокаутом (ФДН) по пресенилинам [48]. Контрольные эксперименты проводились на фибробластах мышей дикого типа (ФДТ). Обнаружено, что аппликация 300 нM брадикинина (BK) вызывала более выраженный Ca2+ ответ в клетках ФДН по сравнению с ФДТ (Рис. 15A, Б). В среднем амплитуда BK-индуцируемых Ca2+ ответов была в 3.5 раза выше в ФДН фибробластах по сравнению с ФДТ дикого типа (Рис. 15В). Для объяснения этих результатов мы предположили, что клетки ФДН и ФДТ отличаются по уровню заполнения Ca2+ депо ЭР в неактивированном состоянии. Для сравнения уровней Ca2+ в ЭР в следующей серии экспериментов мы оценили Ca2+ сигналы в ФДТ и ФДН, индуцируемые аппликацией 5 мкM ионофора иономицина. Аппликации иономицина приводили к появлению более массивных и длительных Ca2+ сигналов в клетках ФДН по сравнению с ФДТ (Рис. 15Г). В среднем размер иономицин-чувствительного пула Ca2+ в ФДН был в 1.8 раз больше, чем в ФДТ (Рис. 15Д), что согласуется с гипотезой о переполнении Ca2+ депо в ФДН. Данные результаты позволили нам предположить, что пресенилины работают как каналы утечки Ca2+ из ЭР, что усиливает пассивный ток Ca2+ через мембрану ЭР. Для проверки этой гипотезы мы оценили Ca2+ сигналы, индуцируемые в ФДН и ФДТ ингибитором Ca2+ помпы ЭР тапсигаргином.

Аппликация 1 мкM тапсигаргина вызывала резкое и значительное увеличение уровня цитозольного Ca2+ в клетках ФДТ и более скромное и отложенное во времени увеличение цитозольного Ca2+ в клетках ФДН (Рис. 15Е). Генетическое удаление пресенилинов приводит к уменьшению в 5.6 раз скорости пассивной утечки Ca2+ (Рис. 15Ж), свидетельствуя о том, что в ФДТ пресенилины ответственны примерно за 80% общей эндогенной активности пассивной утечки Ca2+ из ЭР.

Рисунок 15. Ca2+ сигнализация в фибробластах дикого типа (ФДТ) и с двойным нокаутом по пресенилину (ФДН) [4].

4.3 Эксперименты по восстановлению Ca2+ утечки из ЭР фибробластов с двойным нокаутом по PS.

Для оценки функции PS1 дикого типа и отдельных мутантов PS1, характерных для НБА, как каналов утечки Ca2+ из ЭР мы осуществили серию экспериментов по «восстановлению». В этих экспериментах ФДН были трансфицированы плазмидой с EGFP (EGFP контроль) или плазмидами EGFP вместе с конструкцией экспрессии PS1. Через 48 ч после трансфекции в клетках при помощи флуоресцентного кальциевого зонда Fura-2 анализировалось изменение внутриклеточной концентрации Ca2+. Трансфицированные клетки в этих экспериментах идентифицировались по флуоресценции ЕGFP. Для оценки функции каналов утечки в трансфицированных ФДН клетках были проведены измерения Ca2+ ответов на добавление 300 нM BK или 5 мкM иономицина (IO). Были также проведены прямые измерения концентрации Ca2+ в ЭР ([Ca2+] ) при помощи низкоаффинного Ca2+ ЭР флуоресцентного зонда Mag-Fura-2. Обнаружено, что экспрессия белков PS1 и PS2 дикого типа в ФДН привела к нормализации ответов на BK и IO и восстановлению уровня [Ca2+] [4]. Сходные результаты были ЭР получены при экспрессии конструкций PS1-D257A и PS1-E9 [4]. В противоположность этим результатам экспрессия мутантов PS1-M146V и PS2-N141I в ФДН не оказала влияния на ВК- и IO-индуцируемые Ca2+ сигналы или на уровень [Ca2+] [4]. Таким образом, PS1 и PS2 дикого ER типа или мутанты PS1-D257A и PS1E9, но не мутанты PS1-M146V и PS2-N141I, работают как каналы утечки Са2+ из ЭР фибробластов.

Используя аналогичный подход, мы протестировали дополнительную серию НБА мутантов в PS1. Исходя из этих результатов мы заключили, что экспрессия PS1 дикого типа или мутанта A79V, но не мутантов L166P, A246E, E273A, G384A и P436Q, восстанавливает ответ на ВК (Рис.

16А), размер IO-чувствительного пула Ca2+ (Рис. 16Б) и уровни [Ca2+] ЭР (Рис. 16В) в ФДН до уровней этих показателей, наблюдаемых в ФДТ дикого типа. Таким образом, можно заключить, что большинство НБА мутаций в пресенилинах приводят к нарушению функции каналов Рисунок 16. Сводные данные результатов экспериментов по пассивной Ca2+ утечки из ЭР.

«восстановлению» PS1 [8].

4.4 Роль пресенилинов в нейрональном гомеостазе кальция.

Для того, чтобы ответить на вопрос, работают ли пресенилины в качестве каналов утечки Ca2+ из ЭР и в нейронах, мы провели серию экспериментов по флуориметрическому измерению концентрации Ca2+ в первичных культурах нейронов гиппокампа мышей с условным двойным нокаутом по пресенилину (мыши PScDKO; PS1dTAG/dTAG, PS2-/-) и тройных трансгенных мышей, являющихся моделью БА (мыши 3xTg; KI-PS1, M146V Thy1-APP, Thy1-tau ) [16]. При создании нейронов с двойным KM670/671NL P301L нокаутом (DKO) по PS нейроны PScDKO были инфицированы лентивирусами, кодирующими нуклеарный поровый белок GFP-Cre (NLS-Cre). В параллельных контрольных экспериментах культуры PScDKO были инфицированы лентивирусами, кодирующими нуклеарный белок GFP (NLS-GFP). В наших экспериментах первичные культуры нейронов гиппокампа были загружены Ca2+ флуоресцентным зондом Fura-2, перенесены из инкубационной среды, содержащей 2 мM Ca2+, в бескальциевую среду на 30 с и затем подвергнуты действию иономицина в концентрации 5 мкM. Увеличение соотношения свечений цитозольной Fura-2, наблюдаемое сразу после добавления иономицина, интегрировалось и обозначалось как IO. Обнаружено, что аппликации иономицина приводили к значительно более выраженным Са2+ ответам в культурах гиппокампальных нейронов 3xTg, по сравнению с культурами нейронов дикого типа (Рис. 17). Индуцируемое иономицином повышение цитозольного уровня Са2+ также было выше в нейронах PScDKO, инфицированных вирусами Lenti-Cre, по сравнению с нейронами, инфицированными вирусами LentiGFP (Рис. 17Б,В). Коинфицирование вирусом PS1 дикого типа или вирусом, экспрессирующим «секретазного мутанта» PS1-D257A, восстанавливало IO-индуцированные ответы до уровней ответов, наблюдаемых в культурах, инфицированных только GFP (Рис.

17Б, В). Напротив, коинфицирование мутантом «потери функции утечки Ca2+ из ЭР» PS1-L166P не восстанавливало IO-индуцированное увеличение концентрации Са2+, а вместо этого приводило к ее увеличению: в среднем размер IO пула Ca2+ в нейронах PScDKO, коинфицированных вирусами с Cre и Рисунок 17. Иономицин-чувствительный пул Ca2+ в гиппокампальных нейронах 3xTg PS1-L166P, был в 3 раза больше, и PS DKO. [5].

чем в нейронах PScDKO, инфицированных вирусом с GFP (Рис. 17В). Похожие результаты были получены в экспериментах с мутантами PS1-D385A, которые утратили и -секретазную функцию, и функцию утечки Ca2+ из ЭР (Рис. 17В).

Коинфицирование вирусом Lenti-Cre с мутантом «усиления функции канала утечки Ca2+ из ЭР» PS1-E9 снижает амплитуду ответов на IO до уровней ответов, даже более низких, чем наблюдаемые в нейронах PScDKO, инфицированных GFP, что согласуется с тем фактом, что мембрана ЭР в этих нейронах более проницаема для утечки Са2+ (Рис.

17Б,В). Основываясь на этих (Рис. 17) и дополнительных [5] результатах, мы пришли к заключению о том, что пресенилины работают как каналы утечки Ca2+ в нейронах гиппокампа.

4.5 Рецептор рианодина и утечка Ca2+ из ЭР в нейронах гиппокампа.

Анализ с помощью Вестерн блота выявил существенное увеличение уровней экспрессии RyanR в гиппокампальных нейронах 3xTg [5]. Мы выдвинули гипотезу о том, что экспрессия RyanR может быть компенсаторным ответом на нарушение функции утечки Ca2+ из ЭР в этих нейронах. Для проверки этой гипотезы мы культивировали нейроны гиппокампа дикого типа и 3xTg в течение 6 сут (7 – 13-е сутки инкубации) в присутствии 50 нM дантролена, мембрано-проницаемого ингибитора RyanR [39]. Мы обнаружили, что инкубация с дантроленом существенно усиливала IO-индуцированные Ca2+ ответы в клетках 3xTg (Рис. 18A, Б).

Для специального исследования роли RyanR мы инфицировали культуры нейронов дикого типа и 3xTg лентивирусами, кодирующими короткие шпильки интерферирующей РНК (кРНК) против RyanR (RyRкРНК) или контрольные кРНК (Контр-кРНК). Показано, что IOиндуцированные Ca2+ ответы в гиппокампальных нейронах дикого типа, инфицированных RyR-кРНК, были выше, чем в нейронах, инфицированных контрольными кРНК (Рис.

18В, Г). Нейроны 3xTg, инфицированные RyRкРНК, отвечали на иономицин гораздо сильнее, чем нейроны 3xTg, инфицированные контрольными кРНК (Рис.

18В, Г). Исходя из этих данных мы заключили, что RyanR компенсирует нарушение функции каналов утечки в Рисунок 18. RyanR компенсирует нарушение функции гиппокампальных утечки Ca2+ из ЭР в гиппокампальных нейронах 3xTg [5].

нейронах 3xTg.

4.6. Оценка действия дантролена в мышах APPPS1.

Данные, полученные на гиппокампальных нейронах 3xTg, указывают на тесную взаимосвязь между пресенилин- и RyanR-опосредованными путями утечки Ca2+ из ЭР (раздел 4.5). Для понимания значения этой взаимосвязи in vivo мы осуществили исследование эффектов дантролена на дважды трансгенных мышах APPPS1 (Thy1-APP, KM670/671NL Thy1-PS1 ) [17]. Дантролен давался мышам APPPS1 по той же схеме, L166P которую мы использовали ранее при испытании дантролена на мышах со СМА (главы 2 и 3) начиная с возраста 2 мес и заканчивая 8-месячным возрастом, после чего мыши забивались, у них извлекался мозг, который подвергался гистологическому анализу. Для определения количества амилоидной нагрузки у этих животных коронарные срезы головного мозга мышей APPPS1 были окрашены моноклональными антителами против A. Обнаружено, что количество и интенсивность флуоресценции амилоидных бляшек у мышей APPPS1, принимавших дантролен, были значительно выше по сравнению с контрольными животными (Рис. 19A, Б). Поскольку утрата синаптических связей является одним из наиболее ранних событий в БА человека [49], мы окрасили срезы гиппокампа обеих групп мышей антителами против маркера синаптического возбуждения PSD95. Было отмечено значительное снижение интенсивности окрашивания PSD95 в поле CA1 гиппокампа у получавших дантролен мышей APPPS1 (Рис. 19В). Используя нейрональный ядерный маркер NeuN и цитозольный маркер СШН DARPP-32, мы не обнаружили достоверных отличий между контрольной и получавшей дантролен группами мышей APPPS1 (Рис. 19Г), что свидетельствует о том, что нейроны стриатума у этих мышей не были затронуты патологическим процессом. Используя метод окрашивания по Бильшовскому, мы наблюдали значительное снижение плотности нервных волокон и обилие дистрофичных аксонов в гиппокампе и кортикальной области мышей APPPS1, которые принимали дантролен (Рис.

19Д). Все эти изменения согласуются с продолжающейся нейрональной атрофией и потерей нейронов в гиппокампальных и кортикальных областях мозга мышей APPPS1, Рисунок 19. Нейропатологические принимавших дантролен.

эффекты длительного приема дантролена у мышей APPPS1. [5].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В наших исследованиях проведен систематический анализ изменений в нейрональной кальциевой (Ca2+) сигнализации в условиях нейродегенеративных заболеваний - болезни Хантингтона (БХ), спиномозжечковой атаксии 3-го типа (СМА3), спиномозжечковой атаксии 2-го типа (СМА2) и болезни Альцгеймера (БА). Эти заболевания представляют собой огромную медицинскую, социальную, финансовую и научную проблему. Несмотря на интенсивный поиск причин этих заболеваний, они до сих пор остаются неизлечимыми. Несколько предыдущих исследований указывали на то, что нарушение в нейрональной Ca2+ сигнализации может играть роль в патогенезе этих заболеваний. Наиболее известный и яркий пример – это "Кальциевая гипотеза БА", выдвинутая Завеном Хачутряном в конце 80-х годов.

Однако подавляющее большинство предыдущих исследований были описательными и не смогли объяснить причину нарушения в Ca2+ сигнализации при нейродегенеративных заболеваниях или показать роль кальциевой сигнализации в их патогенезе.

В нашей работе было достигнуто несколько приоритетных результатов, которые впервые помогли установить причинноследственную связь между наследственными мутациями, вызывающими нейродегенеративные заболевания, и нарушениями в нейрональной Ca2+ сигнализации. Мы впервые показали, что увеличение полиглутаминового повтора в белках Хантингтин, атаксин-2 и атаксин-оказывает прямое действие на активность рецепторов инозитол-1,4,5трисфосфата. Это открытие позволило нам объяснить причину нарушенной нейрональной Ca2+ сигнализации при БХ, СМA2 и СМА3.

На следующем этапе работы были проведены исследования значения Ca2+ сигнализации для нейрональной патологии при БХ, СМAи СМА3. Для этих экспериментов использовались трансгенные мыши, являющиеся моделями БХ, СМA2 и СМА3. В экспериментах с первичными культурами срединных шипиковых нейронов стриатума (СШН) из мышей-моделей БХ было показано, что эти нейроны имеют повышенную чувствительность к глутаматной токсичности. Блокаторы Ca2+ сигнализации уменьшили глутаматную токсичность в культурах БХ СШН. В наших экспериментах был эффективен и клинический блокатор NMDAR мемантин. Клинические испытания мемантина с пациентами, страдающими БХ, сейчас проводятся в США.

Повышенная чувствительность к глутаматной токсичности была также показана в экспериментах с первичными культурами клеток Пуркинье из мышей-моделей СМА2. Было установлено, что клинический блокатор выброса Ca2+ из внутриклеточных депо дантролен защищает клетки Пуркинье при СМА2 от глутаматной токсичности. Более того, было показано, что кормление мышей-моделей СМА дантроленом замедляет развитие патологии в моделях СМА2 и СМА3. На основании этих результатов было внесено предложение о проведении клинических испытаний дантролена с пациентами СМА2 и СМА3. Возможность организации таких испытаний в рамках Европейской организации EUROSCA обсуждается с профессором Thomas Klockgether (University Hospital Bonn, Germany). Организация EUROSCA, возглавляемая профессором Klockgether, разработала Шкалу оценки степени атаксии, которая теперь является стандартом для клинических исследований с пациентами. При поддержке Евросоюза организация EUROSCA собрала информацию и произвела клиническое описание 4000 больных.

Созданная инфраструктура позволит провести клинические испытания дантролена или других клинических кальциевых блокаторов (мемантина, дигидропиридинов) с больными СМА2 и СМА3.

В дополнение к БХ, СМА2 и СМА3 было также проведено изучение связи между нейрональной кальциевой сигнализацией и патогенезом болезни Альцгеймера (БА). Наследственная форма БА вызвана точечными мутациями в белках пресенилинах. Пресенилины функционируют как каталитические субъединицы -секретазы, протеазного комплекса, расщепляющего амилоидный белокпредшественник (APP). Большинство исследователей считают, что клинические мутации в пресенилинах изменяют специфичность расщепления APP и приводят к БА в результате увеличения концентрации амилоидного пептида 42. В наших исследованиях было показано, что в дополнение к роли в расщеплении APP пресенилины также работают как пассивные каналы утечки кальция из эндоплазматического ретикулума (ЭР). Более того, оказалось, что большинство клинических мутаций в пресенилинах приводят к нарушению функции каналов утечки и вызывают переполнение кальциевых депо. С использованием моделей БА на основе мышей нам удалось показать, что в нейронах гиппокампа потеря кальциевой утечки через белки пресенилины частично компенсируется за счет увеличения экспрессии рианодиновых рецепторов. Также было обнаружено, что блокада рианодиновых рецепторов в модели БА на основе мышей приводит к дополнительному увеличению концентрации кальция в ЭР и вызывает увеличение количества бета-амилоидных бляшек, потерю синаптических маркеров и нейрональную атрофию.

Полученные в результате проведенного цикла работ результаты подтвердили важную роль нейрональной кальциевой сигнализации в патогенезе БХ, СМA2, СМА3 и БА. Для развития и проверки "Кальциевой гипотезы нейродегенеративных заболеваний" будут необходимы дальнейшие исследования. Клинические испытания кальциевых блокаторов с больными этими заболеваниями покажут практическую важность "Кальциевой гипотезы нейродегенеративных заболеваний".

ВЫВОДЫ Проведены исследования молекулярных механизмов патогенеза нейродегенеративных заболеваний - болезни Хантингтона (БХ), спиномозжечковых атаксий 3-го и 2-го типа (СМА3 и СМА2) и болезни Альцгеймера (БА). Основной задачей исследований служила проверка гипотезы о важной роли нейрональной кальциевой (Ca2+) сигнализации в патогенезе этих заболеваний. Исследования проводились на моделях БХ, СМA3, СМА2 и БА на основе клеток и трансгенных мышей.

1. При изучении БХ показано, что мутантный белок Хантингтин специфически связывается с рецепторами инозитол-1,4,5-трисфосфата первого типа (InsP R1) и активирует эти рецепторы в липидных бислоях. В первичных культурах срединных шипиковых нейронов (СШН) стриатума из трансгенных мышей, являющихся моделью БХ, увеличивается выброс Ca2+ из внутриклеточных депо и глутаматная токсичность. Было также показано, что кальциевые блокаторы защищают СШН при БХ от глутаматной токсичности.

2. Изучена роль допамин-зависимой сигнализации в патогенезе БХ. Показано что активация допаминовых рецепторов приводит к дополнительному увеличению Ca2+ ответа в БХ СШН и к усилению глутаматной токсичности. В экспериментах с моделью БХ на основе трансгенных мышей блокатор допаминовой сигнализации тетрабеназин замедлял развитие моторных симптомов и уменьшал потерю нейронов стриатума. Полученные данные указывают на возможность терапевтического использования тетрабеназина.

3. При изучении СМА3 показано, что мутантный атаксин-3 специфически связывается с InsP R1 и активирует эти рецепторы в липидных бислоях.

Блокатор выброса Ca2+ дантролен замедляет развитие патологии у трансгенных мышей, являющихся моделью СМА3.

4. При изучении СМА2 показано, что мутантный атаксин-2 специфически связывается с InsP R1 и активирует эти рецепторы в липидных бислоях.

В первичных культурах клеток Пуркинье из мышей, являющихся моделью СМА2, усиливается выброс Ca2+ и дегенеративные изменения в ответ на глутамат. Блокатор выброса Ca2+ дантролен защищает клетки Пуркинье при СМА2 от глутаматной токсичности и замедляет развитие патологии у мышей, являющихся моделью СМА2.

5. Полученные результаты позволяют считать, что кальциевые блокаторы различной природы (мемантин, дантролен, дигидропиридины) представляют потенциальный интерес для клинических испытаний с пациентами, страдающими БХ, СМА3, СМА2.

6. При изучении наследственной формы БА открыта новая функция белков пресенилинов как каналов пассивного выхода (утечки) Ca2+ из эндоплазматического ретикулума (ЭР). Показано, что мутации в пресенилинах, вызывающие наследственную БА, приводят к нарушению функции каналов утечки и вызывают переполнение Ca2+ депо. В мутантных нейронах потеря этой функции — транспорта Ca2+ через белки пресенилины — частично компенсируется за счет увеличения экспрессии и функции рианодиновых рецепторов. Блокада рианодиновых рецепторов в модели БА на основе трансгенных мышей приводит к дополнительному увеличению концентрации Ca2+ в ЭР и вызывает увеличение количества бета-амилоидных бляшек, потерю синаптических маркеров и нейрональную атрофию. Полученные результаты подтверждают важную роль нейрональной кальциевой сигнализации в патогенезе БА.

7. Результаты, полученные в проведенном цикле исследований на моделях БХ, СМA3, СМА2 и БА на основе клеток и мышей, свидетельствуют в пользу "Кальциевой гипотезы нейродегенеративных заболеваний" и дают экспериментальную и теоретическую основу для ее дальнейшего развития и медицинского приложения.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. I. Bezprozvanny, J. Watras, B. Ehrlich (1991) Bell-shaped calcium response curves of Ins(1,4,5)P and calcium-gated channels from 3- endoplasmic reticulum of cerebellum. Nature, V. 351, pp. 751-754.

2. И.Б. Безпрозванный (1992) Изучение ионных каналов внутриклеточных мембран с использованием метода бислойной реконституции. Институт цитологии РАН. Санкт-Петербург.

Кандидатская диссертация.

3. I. Bezprozvanny, R.H. Scheller, R.W. Tsien (1995) Functional impact of syntaxin on gating of N-type and Q-type calcium channels. Nature, V. 378, pp. 623-626.

4. T.-S. Tang, H. Tu, E.Y.W. Chan, A. Maximov, Z. Wang, C.L. Wellington, M.R. Hayden and I. Bezprozvanny (2003) Huntingtin and huntingtinassociated protein 1 influence neuronal calcium signaling mediated by inositol-(1,4,5) triphosphate receptor type 1. Neuron, V. 39, pp. 227-25. T.-S. Tang, H. Tu, P.C. Orban, E.Y.W. Chan, M.R. Hayden, I.

Bezprozvanny (2004) HAP1 facilitates effects of mutant huntingtin on inositol 1,4,5-trisphosphate-induced Ca2+ release in primary culture of striatal medium spiny neurons. European Journal of Neuroscience, V. 20, pp. 1779-1787.

6. T.-S. Tang, E. Slow, V. Lupu, I. G. Stavrovskaya, M. Sugimori, R. Llins, B. S. Kristal, M. R. Hayden, I. Bezprozvanny (2005) Disturbed Ca2+ signaling and apoptosis of medium spiny neurons in Huntington’s disease.

Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), V. 102, pp.

2602-2607.

7. H. Tu, O. Nelson, A. Bezprozvanny, Z. Wang, S.-F. Lee, Y.-H. Hao, L.

Serneels, B. De Strooper, G. Yu, I. Bezprozvanny (2006) Presenilins form ER calcium leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer’s disease-linked mutations. Cell, V. 126, pp. 981-993.

8. J. Wu, T.-S. Tang, I. Bezprozvanny (2006) Evaluation of clinically-relevant glutamate pathway inhibitors in in vitro model of Huntington’s disease.

Neuroscience Letters, V. 407, pp. 219-223.

9. O. Nelson, H. Tu, T. Lei, M. Bentahir, B. De Strooper, I. Bezprozvanny (2007) Familial Alzheimer’s disease-linked mutations specifically disrupt calcium leak function of presenilin 1. Journal of Clinical Investigation, V. 117, pp. 1230-1239.

10. T.-S. Tang, X. Chen, J. Liu, I. Bezprozvanny (2007) Dopaminergic signaling and striatal neurodegeneration in Huntington’s disease. Journal of Neuroscience, V. 27, pp. 7899-7910.

11. Е.В. Казначеева, Л.Н. Глушанкова, В.В. Бугай, В.А. Алексеенко, К.О.

Гусев, И.Б. Безпрозванный, Г.Н. Можаева (2007) Роль белка TRPCв формировании рецептор- и депо-управлямых каналов в клетках А431. Биологические мембраны. Т. 24, С. 90-99.

12. H. Zhang, S. Das, Q.-Z. Li, I. Dragatsis, J. J. Repa, S. Zeitlin, G.

Hajnczky, I. Bezprozvanny (2008) Elucidating a normal function of huntingtin by functional and microarray analysis of huntingtin-null mouse embryonic fibroblasts. BMC Neuroscience, V. 9: pp. 38.

13. H. Zhang, Q. Li, R. K. Graham, E. Slow, M. R. Hayden, I. Bezprozvanny (2008) Full length mutant huntingtin is required for altered Ca2+ signaling and apoptosis of striatal neurons in the YAC mouse model of Huntington’s disease. Neurobiology of Disease, V. 31, pp. 80-88.

14. J. Wu, Q. Li, I. Bezprozvanny (2008) Evaluation of Dimebon in cellular model of Huntington's disease. Molecular Neurodegeneration, V. 3, pp.15.

15. X. Chen, T.-S. Tang, H. Tu, O. Nelson, M. Pook, R. Hammer, N. Nukina, I.

Bezprozvanny (2008) Deranged calcium signaling and neurodegeneration in spinocerebellar ataxia type 3. Journal of Neuroscience, V. 28, pp.

12713-12724.

16. J. Wu, H. K. Jeong, S. Bulin, S. W. Kwon, J. Hill Park, I. Bezprozvanny (2009) Ginsenosides protect striatal neurons in a cellular model of Huntington’s disease. J. Neuroscience Research, V. 87, pp. 1904-1912.

17. T.-S. Tang, C. Guo, H. Wang, X. Chen, I. Bezprozvanny (2009) Neuroprotective effects of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor carboxyterminal fragment in Huntington's disease mouse model. Journal of Neuroscience, V. 29, pp. 1257-1266.

18. J. Liu, T.-S. Tang, H. Tu, O. Nelson, E. Herndon, D. P. Huynh, S.-M. Pulst, I.

Bezprozvanny (2009) Deranged calcium signaling and neurodegeneration in spinocerebellar ataxia type 2. J Neuroscience, V. 29, pp. 9148-9162.

19. M. W. Kim, Y. Chelliah, S. W. Kim, Z. Otwinowski, I. Bezprozvanny (2009) Secondary structure of Huntingtin amino-terminal region. Structure, V. 17, pp. 1205-1212.

Избранные обзоры:

1. B. Ehrlich, E. Kaftan, S. Bezprozvannaya, I. Bezprozvanny (1994) The pharmacology of intracellular Ca2+-release channels. Trends in Pharmacological Sciences, V. 15, pp. 145-149.

2. I. Bezprozvanny, B. Ehrlich (1995) The inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP ) receptor. Journal of Membrane Biology, V. 145, pp. 205-216.

3. I. Bezprozvanny, M.R. Hayden (2004) Deranged neuronal calcium signaling and Huntington’s disease. Biochemical and Biophysical Research Communications, V. 322, pp. 1310-1317.

4. I. Bezprozvanny (2005) The inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. Cell Calcium, V. 38, pp. 261-272.

5. I. Bezprozvanny, M. P. Mattson (2008) Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Trends in Neuroscience, V. 31, pp. 454-463.

6. I. Bezprozvanny (2009) Calcium signaling and neurodegeneration. Trends in Molecular Medicine, V. 15, pp. 89-100.

7. I. Bezprozvanny (2009) Amyloid goes global. Science Signaling. V. 2, pp.

16-20.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ [1] Tang T.S. et al. (2009). J. Neurosci., V. 29, pp.1257-66.

[2] Chen X. et al. (2008). J. Neurosci., V. 28, pp.12713-12724.

[3] Tang T.-S. et al. (2005). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, V. 102, pp.2602-2607.

[4] Tu H. et al. (2006). Cell, V. 126, pp.981-993.

[5] Zhang H. et al. (2009). submitted [6] Tang T.-S. et al. (2003). Neuron, V. 39, pp.227-239.

[7] Tang T.S. et al. (2007). J. Neurosci., V. 27, pp.7899-910.

[8] Nelson O. et al. (2007). J. Clin. Invest., V. 117, pp.1230-9.

[9] Liu J. et al. (2009). J. Neurosci., V. 29, pp.9148-62.

[10] Berridge M.J. (1998). Neuron, V. 21, pp.13-26.

[11] Bezprozvanny I. (2009). Trends Mol. Med., V. 15, pp.89-100.

[12] Slow E.J. et al. (2003). Hum. Mol. Genet., V. 12, pp.1555-67.

[13] Cemal C.K. et al. (2002). Hum. Mol. Genet., V. 11, pp.1075-94.

[14] Huynh D.P. et al. (2000). Nat. Genet., V. 26, pp.44-50.

[15] Herreman A. et al. (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, V. 96, pp.11872-7.

[16] Oddo S. et al. (2003). Neuron, V. 39, pp.409-21.

[17] Radde R. et al. (2006). EMBO Rep., V. 7, pp.940-6.

[18] Mignery G.A. et al. (1990). J. Biol. Chem., V. 265, pp.12679-12685.

[19] Cooper J.K. et al. (1998). Hum. Mol. Genet., V. 7, pp.783-90.

[20] Wellington C.L. et al. (2000). J. Biol. Chem., V. 275, pp.19831-8.

[21] Wang G. et al. (2000). Hum. Mol. Genet., V. 9, pp.1795-803.

[22] Huynh D.P. et al. (2007). Exp. Neurol., V. 203, pp.531-41.

[23] Kaznacheyeva E. et al. (1998). J. Gen. Physiol., V. 111, pp.847-856.

[24] Urabe M. et al. (2002). Hum. Gene Ther., V. 13, pp.1935-43.

[25] Xia H. et al. (2004). Nat. Med., V. 10, pp.816-20.

[26] Harper S.Q. et al. (2005). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, V. 102, pp.5820-5.

[27] Zolotukhin S. et al. (1999). Gene Ther., V. 6, pp.973-85.

[28] Tu H. et al. (2002). Biophys., V. J 82, pp.1995-2004.

[29] Tang T.S. et al. (2003). J. Neurosci., V. 23, pp.403-15.

[30] Bezprozvanny I. et al. (1991). Nature, V. 351, pp.751-754.

[31] Grynkiewicz G. et al. (1985). J. Biol. Chem., V. 260, pp.3440-3450.

[32] Hickey M.A. et al. (2002). J. Neurochem., V. 81, pp.46-59.

[33] Carter R.J. et al. (1999). J. Neurosci., V. 19, pp.3248-57.

[34] Wu J. et al. (2006). Neurosci. Lett., V. 407, pp.219-223.

[35] Wu J. et al. (2009). J. Neurosci. Res., V. 87, pp.1904-12.

[36] Wu J. et al. (2008). Mol. Neurodegener., V. 3, pp.15.

[37] Gerfen C.R. (1992). Trends Neurosci., V. 15, pp.133-9.

[38] Gusella J.F. et al. (2000). Nat. Rev. Neurosci., V. 1, pp.109-15.

[39] Krause T. et al. (2004). Anaesthesia, V. 59, pp.364-73.

[40] Stevanin G. et al. (2000). Eur. J. Hum. Genet., V. 8, pp.4-18.

[41] Lastres-Becker I. et al. (2008). Cerebellum, V. 7, pp.115-24.

[42] Geschwind D.H. et al. (1997). Am. J. Hum. Genet., V. 60, pp.842-50.

[43] Mignery G. et al. (1989). Nature, V. 342, pp.192-195.

[44] Tandon A. et al. (2002). Genome Biol., V. 3, reviews3014.

[45] De Strooper B. et al. (1998). Nature, V. 391, pp.387-90.

[46] Wolfe M.S. et al. (1999). Nature, V. 398, pp.513-7.

[47] Smith I.F. et al. (2005). Cell Calcium, V. 38, pp.427-37.

[48] Herreman A. et al. (2000). Nat. Cell. Biol., V. 2, pp.461-2.

[49] Gomez-Isla T. et al. (2008). Handb. Clin. Neurol., V. 89, pp.233-43.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.