WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

БУГОРКОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ

ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ХОЛЕРЫ, ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ

НА АДАПТАЦИОННО-КОМПЕНСАТОРНЫЕ

РЕАКЦИИ  БИОМОДЕЛЕЙ

03.00.07 – микробиология

14.00.15 – патологическая анатомия

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Саратов – 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт “Микроб” (ФГУЗ РосНИПЧИ “Микроб”)

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ 

член-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор 

Кутырев Владимир Викторович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Ананьева Юлия Васильевна

доктор медицинских наук, профессор 

Богомолова Нина Викторовна

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

Малецкая Ольга Викторовна

Ведущая организация – ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации», г. Киров.

Защита состоится « » ___________ 2009 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» по адресу: 410005 г. Саратов, ул. Университетская, д.46.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан « » _____________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник                                                А.А. Слудский

Актуальность проблемы. Ежегодно в мире инфекционные болезни, и в их числе особо опасные инфекции, регистрируются более чем у двух миллиардов человек [WER, 2007; ЕИКЗР, 2007]. В результате роста и развития экономической деятельности, открытия границ, миграции населения, увеличения объемов  международных сообщений и торговли тенденция к глобализации инфекционных болезней будет сохраняться. Реальная потребность создания современных, надежных средств профилактики и лечения особо опасных инфекционных болезней обусловливает интерес исследователей к всестороннему рассмотрению проблемы взаимодействия микро- и макроорганизма [Smith H., 2000; Бухарин О.В. и др., 2002; Туйгунов М.М. и др., 2003;  Железникова Г.Ф., 2006].

Молекулярно-биологический анализ  возбудителей холеры, чумы и туляремии, являющийся основой для получения новых знаний о ключевых факторах их патогенности и вирулентности, значительно опережает исследования в области изучения  различных сторон взаимодействия патогенных бактерий с макроорганизмом [Farugue S.M. et al., 2004; Zhou D. et al., 2006; Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2006]. Но для адекватного решения вопросов, связанных с  разработкой новых и совершенствованием уже имеющихся средств и методов эффективной борьбы с особо опасными инфекционными болезнями, этого недостаточно.

Инфекционный процесс, рассматриваемый как результат взаимодействия микро- и макроорганизма, отражает состояние нарушенного баланса между уровнями экспрессии детерминант вирулентности первого и адекватностью функционирования защитных барьеров второго [Бондаренко  В.М., 1999; Атауллаханов Р.И., Гинцбург А.Л., 2005; Portnoy D., 2005; Bradley C. et al., 2005]. В этом аспекте представляют интерес  исследования особенностей взаимодействия  организма биомоделей с возбудителем  инфекции, основанные на выяснении роли молекулярных механизмов патогенности микроорганизма, приводящих к разбалансировке функционирования систем реагирования и контроля макроорганизма.  

Для решения этой задачи необходимо расширение методической базы традиционного экспериментального исследования инфекционного и вакцинного процессов при работе с возбудителями особо опасных инфекционных болезней за счет внедрения морфофункционального и морфометрического анализа адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма на патоген. Так, для объективного суждения о состоянии функциональных систем макроорганизма при моделировании экспериментального инфекционного процесса в количественной оценке нуждаются:  выраженность воспалительных и иммунных реакций, интенсивность регенеративных и некротических процессов, особенности и интенсивность гистохимических и иммуногистохимических характеристик клеток нейроэндокринной системы (НЭК), элементов мукозального гомеостаза и ряд других параметров.

Эксперименты на лабораторных животных являются важным этапом при доклиническом испытании вакцин. При этом научные основы оценки качества вакцин, несмотря на большой фактический материал, накопленный в этой области, только начинают формироваться. В то же время имеющиеся  вакцины  против особо опасных инфекционных болезней не лишены недостатков [Медуницын Н.В., 2004; Kabir S., 2005], а поиск диагностических и прогностических критериев их безопасности является актуальной научной проблемой, требующей  всестороннего изучения.

Важное место в перечне методов доклинической оценки вакцин занимает морфологический анализ [РД 42-28-8-89; РД 42-28-10-90;  СП 3.3.2.561-96; МУ 3.3.1.1113–02; МУ 3.3.1.2075-06; МУ 3.3.1.2161-07]. Оценка  степени выраженности изменений в органах и тканях биомоделей при экспериментальном вакцинном процессе, базирующаяся на применении тезиса “оптимального морфофункционального соотношения” элементов системы для ее эффективной работы [Бородин Ю.И. и др., 1992; Труфакин В.А., Шурлыгина А.В., 2002], подразумевает  широкое использование методов морфометрического анализа. Но многие структурные и функциональные взаимосвязи в работе  системы реагирования, контроля и защиты  макроорганизма (нейроэндокринной, иммунной)  при вакцинном процессе, обусловленном  препаратами для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии, остаются мало изученными

В связи с этим комплексное  исследование влияния возбудителей Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Francisella tularensis с определенным набором детерминант вирулентности и иммуногенности  на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма особенно актуально для  расширения представлений о патогенезе этих заболеваний. Разработка алгоритма  проведения патоморфологического исследования экспериментального инфекционного и вакцинного процессов направлена на формирование научно-методической основы  для решения важной проблемы, связанной с информативной и объективной  оценкой качества вакцинных препаратов против холеры, чумы и туляремии на этапах их разработки и доклинического  испытания.

Цель исследования. Совершенствование научно-методической  основы  оценки качества вакцинирующих препаратов против особо опасных инфекций, базирующейся на комплексном исследовании влияния  возбудителей холеры, чумы и туляремии с различным набором детерминант вирулентности и иммуногенности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма.

Задачи исследования:

1. Осуществить подбор штаммов возбудителей  V.cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой для  воспроизведения экспериментального инфекционного процесса и изучить  их влияние на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма, определяемые  по ряду морфометрических параметров.

2. Разработать алгоритм патоморфологической оценки тяжести течения экспериментального инфекционного процесса при холере, чуме и туляремии. Определить возможность его применения при использовании аппаратно-программных компьютерных  комплексов.

3. Предложить морфометрические критерии для отбора штаммов V.cholerae, используемых в качестве  контрольных в морфологических и иммунологических исследованиях.

4. Выявить особенности влияния холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп на клетки APUD-системы кишечника и  другие элементы  кишечного «барьера» биомоделей.

5. Охарактеризовать течение инфекционного процесса  в организме биомоделей, используя  штаммы чумного и туляремийного микробов с различной вирулентностью. Сопоставить данные морфологического и морфометрического анализа изменений во внутренних органах подопытных животных  с генетическими особенностями этих штаммов.

6. Провести морфофункциональный и морфометрический анализ адаптационно-компенсаторных  реакций макроорганизма при моделировании вакцинного процесса с использованием коммерческих вакцин и экспериментальных препаратов.

7. Оценить реакцию  «барьерных»  структур (желудочно-кишечного тракта, лимфоидных органов, дыхательной системы) макроорганизма при введении живых коммерческих вакцин, аттенуированных и рекомбинантных штаммов возбудителей холеры, чумы и туляремии.

8. Изучить реакцию апудоцитов функционально значимых систем организма, клеток мукозального эпителия, образований  эффекторной  зоны иммунной системы  желудочно-кишечного тракта и легких, лимфоидной системы при  моделировании инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации биомоделей коммерческими и экспериментальными препаратами для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии.

Научная новизна. Впервые при  изучении влияния на макроорганизм штаммов возбудителей V. cholerae, Y. рestis и F. tularensis  c различной генетической характеристикой  разработан алгоритм проведения патоморфологических исследований экспериментального инфекционного и вакцинного процессов и  определены морфометрические параметры, объективно  характеризующие тяжесть течения патологического процесса у биомоделей. Впервые оценена реакция нейроэндокринных клеток (НЭК) лимфоидных органов, лимфатических структур в легких и кишечнике при особо опасных инфекциях и вакцинации против них. Подобраны морфометрические параметры для характеристики адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма при моделировании  инфекционного процесса  на фоне предварительной иммунизации против холеры, чумы и туляремии. Обоснована необходимость проведения комплексных исследований при оценке безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности вакцин против холеры, чумы и туляремии и показаны возможности применения для этого аппаратно-программных компьютерных  комплексов с целью  получения стандартизированных объективных результатов. Усовершенствована научно-методическая основа  оценки экспериментальных препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии.

Впервые показана возможность применения морфометрических характеристик состояния апудоцитов кишечника,  клеток эффекторной зоны иммунной системы и слизеобразующих элементов мукозального эпителия желудочно-кишечного тракта для оценки качества противохолерных вакцин и степени выраженности холерного инфекционного процесса (патент на изобретение № 2301075 «Способ оценки качества вакцинных препаратов против холеры»). Впервые  предложены  морфометрические критерии для  отбора штаммов холерного вибриона, используемых в качестве контрольных  в морфологических и иммунологических исследованиях (патент на изобретение  № 2254371 «Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio Cholerae биовара  eltor серовара Ogawa (ctxA-, tcpA-, toxR-, zot-), используемый в иммунологических, генетических исследованиях и учебном процессе»).

Практическая значимость и внедрение. Предложенный алгоритм патоморфологического исследования  был применен при проведении Государственных доклинических испытаний  рекомбинантного штамма V. cholerae eltor КМ 184 – кандидата в живые противохолерные вакцины  (Протокол  № 5  от  15.01.2001 г.)

Результаты  исследований  использованы  в следующих документах:

- Методические указания МУ 3.3.1.2075-06 «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации  Г.Г. Онищенко и введенные в действие с 11.07.06 г. взамен методических указаний «Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона», утвержденных Госкомсанэпиднадзором России от 17.10.1994 г. № 01-19/48-11;

- Методические указания МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба», утвержденные  Главным  государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко  и введенные в действие впервые  с  01.04.07 г.;

- Методическое пособие «Моделирование холерной инфекции методом RITARD», одобренное Ученым советом  (протокол № 1 от 01.02.02 г.) и утвержденное директором РосНИПЧИ «Микроб»  (05.02.02 г.);

- Методические рекомендации «Оценка эффективности противохолерных вакцин по ряду морфофункциональных показателей адаптационно-приспособительной реакции биомодели к холерной инфекции», одобренные Ученым советом (протокол № 5 от 11.05.06 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб»  (12.05.06 г.);

- Методические рекомендации «Техника  и прядок забора гистологического материала для морфометрических исследований от биомоделей, зараженных возбудителями I-II групп патогенности», одобренные Ученым советом  (протокол № 3 от 17.06.08 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб»  (18.06.08 г.).

Научные и практически значимые результаты работы используются в лекционном курсе первичной специализации и усовершенствования врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».

Опубликованные материалы исследования явились основой для написания монографий:

- «APUD-система кишечника животных при холерной инфекции, интоксикации и вакцинальном процессе».- Деп. ВИНИТИ, 2000;

- «Патоморфологические подходы  к доклинической оценке холерных вакцин».- Деп. ВИНИТИ, 2002.

- «Патоморфологические аспекты доклинических испытаний вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры».- Саратов: ЗАОПЦ «ИППОЛиТ-99», 2004.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Введение штаммов возбудителей  V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой  вызывает в организме биомоделей  изменение  морфометрических показателей, степень выраженности которых находится в зависимости от полноты набора  детерминант вирулентности микроорганизма. 
  2. Разработанные алгоритмы проведения комплексных исследований  влияния возбудителей  V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis на адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей при моделировании инфекционного и вакцинного процессов повышают  информативность  экспериментального патоморфологического исследования.
  3. Предложенные морфометрические параметры позволяют отбирать штаммы V. cholerae для использования в качестве контрольных при проведении морфологических и иммунологических  исследований.
  4. Применение разработанных коэффициентов и индексов для  учета состояния  трех групп клеточных элементов  в слизистой оболочке кишечника  объективизирует и стандартизирует оценку качества противохолерных вакцинных препаратов на доклиническом этапе исследований
  5. Морфометрические и морфофункциональные эквиваленты адаптационно-компенсаторных и иммунопатологических реакций у биомоделей характеризуют направленность процессов иммуногенеза при первичном и вторичном  иммунных ответах.
  6. Реакция апудоцитов  функционально значимых органов биомоделей при инфекционном и вакцинном процессах  отражает уровень вовлечения APUD-системы макроорганизма  в процесс поддержания его гомеостаза.
  7. В основе повышения объективности оценки безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности  препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии на этапах их доклинического изучения лежит  широкое применение возможностей базовых аппаратно-программных компьютерных комплексов для денситоморфометрической характеристики состояния клеток и тканей макроорганизма.

Апробация диссертационной работы. Исследования проведены в рамках плановых НИР РосНИПЧИ «Микроб» в период  1999 - 2008 г.г.:  025-99 «Изучение иммунобиологических свойств потенциально вакцинных рекомбинантных штаммов холерного вибриона, несущих гетерологические антигены» № госрегистрации 01.99.0008392; 006-3-01 «Разработка и усовершенствование унифицированных методов оценки безопасности вакцинирующих иммунобиологических препаратов против особо опасных инфекций» № госрегистрации 01.200.111501; 21-4-04 «Патоморфологические аспекты изучения нейроэндокринных механизмов в становлении противохолерного иммунитета» № госрегистрации 0120.0504666; 32-3-08 «Изучение взаимодействия возбудителей чумы, туляремии с организмом хозяина при инфекционном и вакцинальном процессе». Исследование иммуногенных и  протективных свойств препаратов «теней» клеток холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп (VCG/O1 c TCP и VCG/O1 без TCP; VCG/O139 c TCP  и VCG/O139 без  TCP) выполняли  в  рамках договора РосНИПЧИ «Микроб» с Институтом микробиологии и генетики Университета г. Вены, Австрия (1999-2000); ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы, Блок I  «Ориентированные фундаментальные исследования», раздел «Технологии живых систем», подраздел «Защита от патогенов».

Материалы диссертационной работы были  представлены на: Всероссийской научно-практической конференции “Новые технологии в медицине”, 13-14 апреля 2001 г., Саратов;  Общероссийской конференции с международным участием  “Проблемы морфологии”, 14-16 мая 2002 г., г. Сочи; VIII Российской научно-практической конференции по проблеме “Холера”, 4-5 июня 2003 г.,  г. Ростов-на-Дону;  ХIХ съезде физиологического общества им. И. П. Павлова, 19-24 сентября 2004 г., г. Екатеринбург;  Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов “Окружающая Среда и здоровье”, 19-22 мая 2005 г., г. Суздаль;  XXI Российской конференции по электронной микроскопии, 5-10 июня 2006 г., г.Черноголовка; VII Российском съезде врачей-инфекционистов “Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней”, 25-27 октября 2006 г.,  г. Нижний Новгород; VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в рамках Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств», 3-5 октября 2006 г., г. Оболенск;  проблемной комиссии 50.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (50.00) 2000-2006 г.г.;  IX съезде Всероссийского научно-практического  общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-27 апреля 2007 г., г. Москва; VIII конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии”, 27-29 июня 2007 г., г. Москва ;  VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ», 25-26 сентября 2007 г., г. Саратов; на научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований» в институте «Микроб», 2000-2008 г.г.

Публикации результатов исследований. Основные положения диссертации изложены в 46 печатных работах, из них 15 статей в рекомендованных ВАК изданиях.

  Структура и объем диссертации.  Диссертация изложена на  337 листах машинописного текста, состоит из введения,  7-ми глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 201 отечественный и 182  зарубежных источника. Работа иллюстрирована  89  таблицами  и  47  рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Штаммы. В работе использовали 38 штаммов микроорганизмов, из них 26 штаммов V. cholerae О1 серогруппы (эльтор и классического биоваров), 4 штамма V.cholerae О139 серогруппы, 6 штаммов Y. pestis, в том числе вакцинный штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ,  2 штамма F. tularensis, в том числе вакцинный штамм F. tularensis 15 линии  НИИЭГ.

Препараты. Применяли следующие препараты: коммерческую холерную  химическую бивалентную таблетированную вакцину производства РосНИПЧИ «Микроб» (серия 13);  коммерческую вакцину Cholera-Impstoff (Lot: 015044.02, Exp.: 05.2000, Swiss Serum Institute);  экспериментальные препараты “теней клеток” V. cholerae O1 eltor – VCG/O1 с пилями адгезии (ТСР) и без них;  препараты “теней клеток” V. cholerae О139 (VCG/O139) c TCP и без них, приготовленные из штаммов V. cholerae О1  eltor cH1  и V. cholerae O139 AI-1838 (препараты любезно предоставлены доктором В. Любицем, Институт Микробиологии и генетики, Университета г. Вены, Австрия); холерную химическую вакцину, обогащенную ферментами (экспериментально-производственной серии) (РосНИПЧИ «Микроб»; живую чумную вакцину (ЖЧВ) производства ФГУЗ Ставропольского НИПЧИ; вакцину химическую чумную (ХЧВ) (экспериментально-производственной серии № 2) - препарат любезно предоставлен  д.м.н. С.М. Дальвадянцем; вакцину  туляремийную живую (ЖТВ) производства ФГУП «НПО «Микроген» «Омское предприятие по производству бакпрепаратов», г. Омск (серии 1, 16). 

Экспериментальные животные. Работа выполнена на 123 взрослых кроликах породы шиншилла, 110  крольчатах-сосунках, 148 беспородных  белых мышах,  255 морских свинках. Объектами морфологического исследования у биомоделей были внутренние органы (сердце, легкие, печень, почки, надпочечники), различные отделы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), лимфоидные органы - селезенка,  различные группы лимфатических узлов (регионарные, контрлатеральные и отдаленные), аппендикс,  пейеровы бляшки, лимфоидная ткань, ассоциированная с ЖКТ.

Методы. Для изучения культур микроорганизмов использовали общепринятые микробиологические методы. Штаммы холерных вибрионов вводили внутрикишечно крольчатам-сосункам  по методу  N.K. Dutta  и  M.K. Habbu [1955],  per os белым мышам по методу S.N. Richardson [1984], а также внутрикишечно  взрослым кроликам по методу W.M Spira с соавторами [1981].  Штаммы чумного и туляремийного микробов вводили подкожно морским свинкам  и беспородным белым мышам.

Противохолерные вакцины вводили взрослым кроликам перорально с помощью зонда. Вакцинные штаммы Y. pestis EV линии НИИЭГ и F.tularensis  15 НИИЭГ  вводили морским свинкам подкожно в правую паховую область. Аэрозольную вакцинацию проводили  Y. pestis EV линии НИИЭГ морским свинкам  в  аспирационной дозе 5х105 ж.м.к.

При изучении чистых культур с помощью ПЦР использовали: для Y. pestis - тест-систему «ГенПест» (ТУ- 8895-005-01898109-2007, производства РосНИПЧИ «Микроб») и  экспериментальную тест-систему «Мульти-Yp» (РосНИПЧИ «Микроб»); для V. cholerae -  тест-систему «ГенХол - Тест-системы  для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом ПЦР»  (ТУ 8895-006-01898109-2007, производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб»). Работу выполняли в соответствии с инструкциями к препаратам.  Для выявления zot и ace генов V.cholerae использовали праймеры, предложенные A. Basu  et al.(1998), параметры и условия реакции амплификации - Н.А. Давыдовой  с соавторами (1999).

Иммунологические показатели  после введения противохолерных вакцин определяли в сыворотках крови иммунизированных животных в различные сроки. Агглютинины выявляли по общепринятой методике, титры вибриоцидных антител устанавливали микрометодом [Benenson A.S. et al., 1968], антитела к холерному токсину, О-антигену и ферментам  - в  иммуноферментном анализе  (ИФА) с  использованием моноспецифических адсорбированных кроличьих сывороток. После введения противочумных вакцин сывороточные антитела  к F1 чумного микроба  определяли в трехкомпонентной реакции нейтрализации антигена (РНАГ) с диагностикумом эритроцитарным чумным  иммуноглобулиновым  сухим и в тесте активной защиты животных [МУ 3.3.1.1113-02].

После введения штамма – кандидата в холерные вакцины определяли количество апоптотических и пролиферирующих эукариотических клеток на импульсном  проточном  цитофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия).

Для гистологического исследования биоматериал фиксировали в 10 %-ом водном нейтральном растворе формалина и далее  проводили по общепринятой в гистологии схеме обезвоживание и заливку его в парафин [Меркулов Г.А., 1969].  Из полученных парафиновых блоков на санном микротоме готовили полутонкие срезы (толщиной 4-5 мкм), которые окрашивали: гематоксилином и эозином [Лилли Р., 1969], альциановым синим  и Шифф-реактивом [Пирс Э., 1962], суданом IV и осмиевой кислотой [Лилли Р., 1969],  ОКГ (оранжевым-красным-голубым) [Зербино Д.Д., Лукасевич Л.Л., 1984], по методу  Севки  [Пирс Э., 1962],  импрегнировали срезы серебром по Массону  в модификации Гамперля  [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996], по Гримелиусу (1968), по Мозеру (1995), микробные клетки окрашивали по Николя [Меркулов Г.А., 1969]. Готовые гистологические препараты просматривали в световом микроскопе МБИ-15 с фотоприставкой или биологическом микроскопе Olimpus CX 31 с видеокамерой JVC.

Количество отдельных клеточных элементов (лимфоциты, нейтрофилы, эозинофилы, плазматические клетки, макрофаги, фибробласты) определяли на 100 клеток  клеточного инфильтрата в 10 полях зрения правильно ориентированных срезов кишечника при увеличении Х 400.  Конечный результат (среднеарифметическое значение) выражали в процентах. Количество межэпителиальных  лимфоцитов (МЭЛ) тонкого кишечника  и лимфоцитов покровного эпителия толстого кишечника определяли на 1000 ядер энтероцитов при увеличении  Х 200. Общее количество бокаловидных  клеток подсчитывали на 100 ядер эпителиоцитов  в 10 повторах  при увеличении Х 200, определяя их секреторный профиль по количеству клеток, дающих голубую (кислые мукополисахариды - КМПС), красную (нейтральные мукополисахариды - НМПС) или фиолетовую (смешанные формы) окраску, в  100 секреторных клетках. Количество апудоцитов определяли  в 10 полях зрения правильно ориентированных срезов кишечника, лимфоидных органов (селезенка, мезентериальные лимфатические узлы, пейеровы бляшки), легочной ткани, мозгового вещества надпочечников  при увеличении Х 200 - Х 400. Морфофункциональное состояние клеток оценивали по изменению интенсивности окрашивания и зоне распределения продукта секреции в клетке, выявляемых в гистохимических реакциях и подтверждаемых изменениями  на электронограммах. Количество апудоцитов в состоянии различной функциональной активности  определяли  по формуле: Ру = Ух100/n, где Ру - процент клеток в том или ином морфофункциональном состоянии, У - количество клеток в данном морфофункциональном состоянии, n - общее число апудоцитов.

Подсчет апоптозных ядер проводили  при увеличении Х 900, в 5-ти повторах, так чтобы анализу был подвергнут материал, включающий не менее 1000 клеток.

Степень активности отдельных структур лимфоидных органов  и селезенки (Т- и В-зон) оценивали полуколичественным методом по 3-х балльной шкале (от 0 до 3): 0 баллов - отсутствие активности; 1 балл - слабо выраженная активность; 2 балла - умеренно выраженная активность; 3 балла- резко выраженная активность. 

Состояние паренхиматозных клеток оценивали: по изменению ядерно-цитоплазматического индекса (ЯЦИ),  деструктивного индекса (ДИ), определяемого по удельному весу в клеточной  популяции элементов с проявлениями цитопатологии. Функциональное состояние дыхательной системы характеризовали по изменению перфузионно - вентиляционного отношения (ПВО).

Для  выявления взаимосвязанной оценки отдельных звеньев гомеостаза,  конкретные морфометрические параметры представляли в виде разработанных нами ассоциаций показателей в форме различных индексов.

  Стрессорный индекс (Истресс.) вычисляли по формуле:

  Истресс. = Шкоры / .Шмозг. ,

где Шкоры - ширина коркового, .Шмозг - ширина мозгового вещества надпочечников у исследуемой биомодели.

  Коэффициент адаптации (Кадап.) вычисляли по формуле:

  Кадап. = Истресс.оп . / Истресс.контр.  ,

где Истресс.оп. - величина  стрессорного индекса у животных опытной группы, Истресс.контр - аналогичный показатель в  группе интактных контрольных животных.

Индекс регенеративной активности (ИР) вычисляли по формуле:        

=

Коэффициент активности апудоцитов  (КА) вычисляли по формуле:

=

где Иап – индекс активности апудоцитов определяемый по формуле:        

=

Коэффициент секреторной активности (КС) вычисляли по формуле:

где Иса – индекс секреторной активности, определяемый по  отношению клеток, содержащих КМПС к сумме клеток содержащих НМПС и смешанный продукт реакции, выраженная в процентах.

При выполнении морфометрического исследования строго следовали принципу соблюдения стандартных условий: забора и фиксации  материала, приготовления и окраски срезов,  определения учитываемых параметров.

Для морфометрической оценки интересующих характеристик использовали окулярные сетки Автандилова [Автандилов Г.Г., 1990] и (или) возможности денситоморфометрической программы аппаратно-программного комплекса МЕКОС-Ц.
Препараты, приготовленные по общепринятой схеме обработки тканей для электронной микроскопии (Уикли Б., 1975), просматривали в электронном микроскопе JEM 7

Полученные результаты были статистически обработаны общепринятыми методами с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m),  коэффициента достоверности (р) и корреляционной зависимости(r). Графическая обработка результатов проводилась с использованием  Microsoft Office Excel 2003. Морфометрические характеристики, полученные  с помощью программы «Денситоморфометрия» (версия 2.1.0.0), статистически обрабатывались в рамках  возможностей, предусмотренных программой.

Результаты исследований и их обсуждение

Основным показателем  проявления функционирования тех или иных генов микроорганизма в макроорганизме являются изменения, возникающие в ответ на инокуляцию патогена, морфологическими эквивалентами которых  можно считать развитие различных патологических или адаптационно-компенсаторных реакций.

Для исследований  были отобраны типичные по родовым и видовым свойствам штаммы V.cholerae О1 серогруппы, культуры которых при внутрикишечном введении крольчатам-сосункам приводили к развитию холерогенной (вирулентные), энтеропатогенной (слабо вирулентные) реакции или вообще не вызывали видимых изменений со стороны ЖКТ биомодели (авирулентные). Методом ПЦР, в геноме, отобранных штаммов определяли наличие основных генов, связанных с вирулентностью (ctxА и  tcpА) и дополнительных (zot  и ace) и проводили морфометрический анализ гистологических изменений, выявляемых у зараженных ими  крольчат-сосунков. Полученные  количественные параметры сопоставили с особенностями генетической характеристики штаммов V.cholerae О1 серогруппы (таблица 1).

Согласно полученным данным реакция клеток APUD-системы у подопытных животных находилась в за­висимости,  с одной стороны, от отдела кишечника,  а с другой - от  особенностей фено- и генотипической  характеристики штаммов холерных вибрионов,  используемых для заражения, и  коррелировала  со степенью выраженности морфологических изменений в ЖКТ и внутренних органах биомоделей (таблица 2). Для удобства оценки степени функциональной активности апудоцитов использовали разработанный нами индекс функциональной активности (Иап). Так, Иап в тонком кишечнике крольчат, зараженных холерными вибрионами, содержащими полный набор  генов патогенности, в 24 раза превышал аналогичный показатель  у интактных контрольных животных. При этом наибольшее изменение Иап было характерно для введения холерных вибрионов  классического биовара вирулентного штамма V. cholerae 569В. Введение холерных вибрионов штаммов, лишенных ctxА гена, также влияло на  изменение Иап  у крольчат, но в  этом случае показатель не более чем в 3 раза  превышал Иап у интактных контрольных животных (таблица 2). Штаммы с полным набором основных генов, обусловливающих их  вирулентность,  вызывали у подопытных животных почти 3-х кратное превышение учитываемых морфометрических параметров в почках по сравнению с интактными крольчатами, изменение в большей степени, чем в других группах, показателей функционального состояния печени (таблицы 3, 4). Причем внутри группы  у животных, зараженных культурами этих штаммов, имел место определенный разброс величин определяемых показателей, позволяющий выделить среди отобранных культур штаммы, вызывающие максимально выраженные изменения у биомодели. Что касалось штаммов, лишенных ctxА гена, то среди  них наибольшие изменения  во внутренних органах подопытных животных вызывали V.cholerae, в геноме которых определялись гены  zot и  ace, кодирующие продукцию Zot и Ace токсинов.

Таким образом, на основании выявленных по результатам морфометрического анализа особенностей в реакции крольчат-сосунков на внутрикишечное введение различных по набору детерминант вирулентности холерных вибрионов были отобраны морфометрические параметры, позволяющие с большей долей достоверности характеризовать  морфофункциональное состояние  систем организма биомодели.

Несмотря на схожесть экспрессируемых факторов патогенности (подвижность, колонизирующая способность, токсические субстанции) у холерных  вибрионов О1 и О139  серогрупп, последние имеют целый ряд особенностей. Аналогичным образом, отобрав штаммы холерных вибрионов О139 серогруппы, провели анализ морфофункциональных изменений апудоцитов и клеток эффекторной зоны иммунной системы у подопытных животных, зараженных  ими.

Общая направленность ответной реакции APUD-системы кишечника биомоделей на инокуляцию холерных вибрио­нов  заключалась в дегрануляции клеток, то есть в высвобождении того или иного количества биологически активных веществ (БАВ), принимающих непосредственное участие в патогенезе холерной инфекции. Для APUD-системы кишечника подопытных животных, зараженных холерными вибрионами О139 серогруппы, харак­терным было снижение количества апудоцитов и увеличение их функциональ­ного напряжения (таблица 5).

Таблица 1. Результаты внутрикишечного  заражения крольчат-сосунков V. cholerae  O1  в дозе 1х107 м.к.

Штаммы  V.cholerae  О1

Генетическая характеристика штаммов

Павшие с холерогенной реакцией  (в  %)

Павшие  с энтеропатогенной реакцией  (в %)

Оценка штаммов по холерогенной реакции

V.cholerae М1259, М1273, М1268, М674, 358, 569В, 410, 968

ctxA+, ace+,zot+, tcpA+

100

0

вирулентные

V.cholerae М1191

сtxA-,  ace+, zot+, tcpA+

0

50

слабовирулентные

V.cholerae М661, М1183

сtxA-, ace+, zot+, tcpA-

0

0

авирулентные

V.cholerae 203, М1336, КМ27

сtxA-, ace-, zot-, tcpA+

0

0

авирулентные

V.cholerae М1397, М1398, М1257,  М1280, М1242, КМ26

сtxA-, ace-, zot-, tcpA-

0

0

авирулентные

V.cholerae  М1258, М1262, М1256, М1265

сtxA-, ace-, zot-, tcpA-

40

слабовирулентные

Таблица 2. Реакция апудоцитов кишечника крольчат-сосунков на внутрикишечное заражение V. cholerae  О1 в дозе 1х107 м.к.

Группа штаммов

V. cholerae О1 с генетической характеристикой

Количество штаммов

Количество  апудоцитов в одном поле зрения среза кишечника (М+m)

Морфофункциональное состояние апудоцитов кишечника

Индекс активности апудоцитов (Иап)

Тонкий кишечник

 

Толстый кишечник

Тонкий кишечник

Толстый кишечник

Тонкий кишечник

Толстый

кишечник

Опустошенные клетки

(в %)

Гистохимически активные клетки

(в % )

Опустошенные клетки

(в %)

Гистохимически активные клетки

(в % )

ctxA+, tcpA+

8

4,69+0,53*

2,34+0,57*

78,65+11,83

6,07+3,86

36,51+5,64

22,25+5,45

6,41

1,45

ctxA-, tcpA-

12

6,02+0,87

3,77+0,73

32,99+3,42

7,46+4,25

41,39+2,45

7,22+3,07

0,76

0,98

ctxA-, tcpA+

4

6,56+0,99

3,83+0,84

31,36+3,44

8,92+4,07

40,13+6,75

7,04+2,14

0,73

0,96

Интактный контроль

-

7,92+0,98

5,13+0,64

18,92

2,13

24,95

23,78

0,27

0,95

Примечание -* достоверность р<0,05

Таблица 3. Морфометрические параметры, характеризующие состояние почек, у крольчат-сосунков при внутрикишечном заражении V. cholerae  О1 в дозе 1х107 м.к.

Группа штаммов

V. cholerae О1 с генетической характеристикой

Площадь почечного тельца (М+m)

Площадь сосудистого клубочка (М+m)

Суммарная площадь капилляров коры (М+m)

Суммарная площадь капилляров мозгового вещества (М+m)

Количество почечных телец  на S = 317706мкм2 (М+m)

Отношение площади почечного тельца к площади сосудистого клубочка

ctxA+, tcpA+

2789,42+1096,08

1802,48+731,70*

9373,320+2684,13*

25426,01+5770,65

8,70+1,84*

1,56

ctxA-, tcpA-

1995,55+649,06

884,390+381,49

3635,900+579,500

12530,52+3029,04

11,88+3,34

2,42

ctxA-, tcpA+

2095,74+813,64

928,900+368,46

8961,29+3184,45

31867,12+8096,22*

12,79+2,55

2,32

Интактный контроль

1810,68+673,87

836,13+327,05

2978,64+975,60

19788,92+1098,24

19,8+1,24

2,17

Примечание - * достоверность  р<0,05

Таблица 4. Морфометрические параметры, характеризующие состояние печени, у крольчат-сосунков при внутрикишечном заражении V. cholerae  О1 в дозе 1х107 м.к.

Группа штаммов V. cholerae О1 с генетической характеристикой

Средняя площадь центральных вен печени (М+m)

Суммарная площадь печеночных  капилляров (М+m)

Ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ) гепатоцитов

Количество клеток РЭС  в  одном поле  зрения среза (М+m)

ctxA+, tcpA+

49127,53+2774,28

43682,65+17092,83

0,2

9,5+2,82*

ctxA-, tcpA-

23800,41+3110,34

61297,42+21777,73

0,3

11,43+3,12*

ctxA-, tcpA+

47814,69+27466,31

47391,91+9536,68

0,24

10,2+3,02*

Интактный контроль

27356,84+6112,05

50759,18+4043,91

0,28

29,7+3,02

Примечание -* достоверность  р<0,05

Таблица 5. Реакция апудоцитов кишечника крольчат-сосунков на внутрикишечное введение холерных вибрионов О139 серогруппы

Группа штаммов

V. cholerae  О139 с генетической характеристикой

Количество  апудоцитов в одном поле зрения среза кишечника (М+m)

Индекс активности апудоцитов (Иап)

Тонкий кишечник

 

Толстый кишечник

Тонкий кишечник

Толстый кишечник

Двенадцатиперстная кишка

Тощая кишка

Подвздошная кишка

Двенадцатиперстная кишка

Тощая кишка

Подвздошная кишка

V.cholerae МО45, РО7, 16064 (ctxA+, ace+, zot+ tcpA+)

4,43+0,8*

5,53+0,59

3,23+0,89*

2,5+0,62*

4,03

2,08

3,41

0,63

V.cholerae М62, 170 (сtxA-, ace-, zot-, tcpA-)

6,2+0,69

6,6+1,2

4,7+0,91

3,75+0,55

0,95

0,68

0,94

0,43

Интактный контроль

8,0+1,45

7,8+0,39

6,3+0,89

5,4+0,56

0,29

0,46

0,32

0,35

Примечание -* достоверность  р<0,05

Так, Иап на введение ctxА+ штаммов холерных вибрионов  в 14 раз превышал  аналогичный показатель у  контрольных  животных и был выше, чем у крольчат, зараженных культурами ctxА- штаммов. У последних  реакция клеток APUD-системы  сводилась к умеренному функциональному напряжению элементов системы пропорциональному развивающимся адаптационно-компенсаторным процессам в органах.

Холерные вибрионы О139 серогруппы штаммов с генотипом ctxА+ zot+ace+ tcpА+ приводили к быстрой  гибели подопытных животных и  развитию выраженных изменений во внутрен­них органах  близким к патологическим процессам, вызываемым вирулентными холерными вибрионами O1 серогруппы. Но в отличие от холерных вибрионов О1 серогруппы,  в кишечнике подопытных крольчат наблюдали проявления воспалительного характера с прева­лированием пролиферативно-инфильтративных процессов над явлениями отека и дистрофического поражения энтероцитов. Эти из­менения в ЖКТ протекали на фоне выраженных токсических поврежде­ний паренхиматозных органов (почки, печень), возможно обусловленных строением патогена - наличием полисахаридной капсулы, соматическо­го антигена О139, некоторыми отличиями в строении ЛПС микроба.

Таким образом, возможность сравнения  определяемых количественных параметров позволила выявить среди отобранных штаммов холерных вибрионов как культуры, вызывающие у биомоделей наиболее выраженные типичные для холерной инфекции патоморфологические изменения, так и штаммы, не приводящие к развитию таковых.

На основании этого был предложен принцип выбора контрольных штаммов для экспериментальных исследований инфекционного и вакцинного процессов. Морфометрический анализ с применением компьютерных технологий в исследованиях применяли для повышения качества и информативности экспериментального морфологического  заключения.

Использование  метода  RITARD для воспроизведения холеры у взрослых кроликов позволило провести мониторинг инфекционного процесса (таблица 6). Степень выраженности клинической  картины болезни у  животных  коррелировала  с интенсивностью гистологических изменений в  ряде функциональных систем макроорганизма и подтверждалась  результатами морфометрического анализа, причем изменения  учитываемых морфометрических параметров, находились в зависимости от серогруппы холерных вибрионов, используемых для воспроизведения инфекции и носили дозозависимый характер.  Так,  была отмечена  прямая корреляционная связь между количеством  апудоцитов  тонкого  кишечника и величиной отека подслизистой оболочки (r=0,8) у животных, зараженных холерными вибрионами О1 серогруппы.

Содержание клеток в собственной пластинке слизистой (СПС) оболочки во всех отделах кишечника у животных, зараженных холерными вибрионами О1 серогруппы, было ниже, чем в контроле, что отражало величину выраженности отека слизистой и подслизистой оболочек у них, в то время как на введение холерных вибрионов О139 серогруппы регистрировали увеличение плотности клеточного инфильтрата в тонком  кишечнике и снижение числа  клеток  в толстом кишечнике.

Таблица 6. Клинико-морфологическая характеристика холерного инфекционного процесса

Штамм

Число животных

СПЖ павших животных,  в (ч)

Клинико-морфологическая характеристика изменений у павших/выживших животных

всего

павшие

выжившие

Диарея

Тонкий кишечник

Толстый кишечник

Объем содержимого

Характер содержимого

Состояние сосудов

Характер содержимого

Состояние сосудов

Выраженность

Длительность (ч)

V. chole- rae  Р3122

О1 серогруппы

12

11

1

29,4+3,2

+++

до 30

185,5+12,9

35,6+9,18

серозное

Полнокровие сосудов брыжейки

«кашица»

«орешки»

Умеренное полнокровие сосудов брыжейки

V. chole- rae Р16064 О139 се- рогруп- пы

7

7

0

27,4+2,9

+++

до 30

128,3+14,6

20,5+3,75

Серозно-слизистое

Выраженная инъекция сосудов серозной оболочки

«кашица»

Умеренное полнокровие сосудов брыжейки

Интактный контроль

3

0

3

>124

*

-

4,5+0,85

слизистое

бви

«орешки»

бви

Примечание – +++- выраженная диарея; *- отсутствие диареи;  бви – без видимых изменений

То есть, ответная реакция макроорганизма на введение холерных вибрионов О139 серогруппы  характеризовалась преимущественно экссудативным характером изменений в толстом кишечнике на фоне воспалительной  реакции в тонком  кишечнике, что  подтверждалось присутствием  в слизистой оболочке ПМЯЛ.

Холерные вибрионы О139 серогруппы  вызывали  более выраженную активацию МЭЛ  в  тонком  кишечнике  подопытных  животных по сравнению с  V.cholerae O1 серогруппы и оказывали  значительное  влияние на  изменение функционального  состояния бокаловидных клеток (таблица 7). Так, у всех животных этой группы  имела место тенденция к увеличению числа клеток, содержащих КМПС, в то время как  число клеток с секретом, представленным  НМПС, резко снижалось, что указывало на снижение защитной функции слизи. Общие закономерности в реакции апудоцитов кишечника (таблица 8) как на введение холерных вибрионов  как О1 серогруппы, так и О139 серогруппы сохранялись и заключались в уменьшении их количества во всех отделах кишечника на фоне их  резкого опустошения и некоторого снижения синтетической активности. В целом реакция  апудоцитов  зависела от интенсивности развития диареи и тяжести течения заболевания  у подопытных животных.

Таким образом, принцип поиска морфологических эквивалентов - маркеров заболевания и состояний реактивности макроорганизма, основанный на оценке клеточных систем защиты организма биомоделей -  иммунной, нейроэндокринной и других, является перспективным направлением  экспериментально-морфологического исследования патогенеза холеры.

Расширение арсенала методов морфологического исследования, применяемых для учета влияния рекомбинантных штаммов холерных вибрионов на организм  биомоделей за счет  введения информативных и  доступных к определению параметров адаптационно-компенсаторных  реакций макроорганизма, позволило провести  комплексное исследование холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп: штамма  V.cholerae eltor КМ184, не имеющего гена, кодирующего синтез холерного токсина (СТ), и несущего гены, детерминирующие экспрессию иммуногенной В-субъединицы СТ и фактора колонизации CFAI  E.coli;  штамма  V. cholerae  КМ182, содержащего рекомбинантные плазмиды с протективными антигенами - B-субъединицей холерного токсина и адгезином CFA/I.

В результате проведенных исследований были получены новые знания о механизмах нейроэндокринной регуляции процессов иммуногенеза - определены количественные  показатели состояния нейроэндокринной системы кишечника и лимфоидных органов, в том числе лимфоидной ткани, ассоциированной с ЖКТ.

Динамика изменений морфофункционального состояния  апудоцитов  в кишечнике  взрослых кроликов, иммунизированных  V.cholerae КМ184, заключались в последовательной смене фаз функциональной активности  и  покоя  клеток (таблица 9). Прослеживалась средней силы корреляционная связь (как прямая, так и обратная) между количеством апудоцитов в кишечнике и иммунологическими показателями в крови биомодели. Наблюдали обратную средней силы корреляционную связь (ρ = -0,5) между количеством НЭК в лимфоидных органах и уровнем агглютининов к V. cholerae cholerae  и прямую средней силы связь (ρ = 0,5)  между количеством НЭК и уровнем агглютининов к V. cholerae eltor.

Таблица 7. Характеристика состояния секреторных клеток ЖКТ и межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) кроликов, зараженных вирулентными холерными вибрионами по методу RITARD

Штаммы

Количество секреторных клеток в поле зрения среза (М+m)

Индекс секреторной активности (Иса)

Количество межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) на 100 ядер эпителиальных клеток

Двенадцатиперстная кишка

Подвздошная кишка

Толстый кишечник

Двенадца-

типерстная 

кишка

Подвздошная кишка

Толстый кишечник

Двенадцатиперстная кишка

Подвздошная кишка

Толстый кишечник

V. cholerae

Р3122

О1 серогруппы

52,7+3,6

43,5+6,3

35,5+4,1*

1,3

1,6

3,4

43,3+11,24

68,3+7,11

38,9+5,44

V. cholerae  Р16064 О139 серогруппы

68,8+4,3

47,5+6,2

60,5+5,7

6,8

12,4

9,4

51,3+4,92

94,8+14,14

60,5+5,7

Интактный контроль

59,9+7,8

47,6+3,4

84,9+5,1

0,12

0,47

0,5

32,1+6,59

76,4+15,8

46,7+14,4

Примечание - * достоверность  р<0,05

Таблица 8. Морфофункциональная характеристика апудоцитов ЖКТ кроликов, зараженных вирулентными холерными вибрионами по методу RITARD

Штаммы

Количество апудоцитов в одном поле зрения среза кишечника (М+m)

Индекс активности апудоцитов (Иап)

Двенадцатиперстная кишка

Подвздошная кишка

Толстый кишечник

Двенадцатиперстная кишка

Подвздошная кишка

Толстый кишечник

V. cholerae  Р3122

О1 серогруппы

1,98+0,2*

2,4+0,61

1,4+0,64*

1,46

1,35

2,32

V. cholerae Р16064

О139 серогруппы

2,9+0,89

1,8+0,32*

2,7+0,54

2,7

1,22

1,62

Интактный

контроль

3,6+0,64

3,0+0,19

3,6+1,12

0,78

0,47

0,82

Примечание - * достоверность р<0,05

  Таблица 9. Реакция апудоцитов желудочно-кишечного тракта взрослых кроликов, иммунизированных V.cholerae КМ184

Показатель

Контроль I

Контроль II

Срок наблюдения после иммунизации (сутки)

1

3

7

14

21

28

Двенадцатиперстная кишка

Количество апудоцитов в поле зрения (М+m)

5,40+0,45

7,60+0,69

*

7,20+0,4*

5,50+1,5

3,30+0,75*

5,50+0,8

2,10+0,2*

3,80+0,84

Количество опустошенных клеток (%)

27,8

40,8

59,7

60

36,4

40,5

42,4

41,6

Количество гистохимически активных клеток (%)

15,9

3,9

2,8

0

21,2

2,4

0

2,6

Индекс активности апудоцитов (Иап)

0,78

0,81

1,67

1,5

1,36

0,75

0,74

0,79

Начальные отделы толстого кишечника

Количество апудоцитов в поле зрения (М+m)

2,8+0,62

3,2+1,17

3,1+1,17

3,1+0,89

2,5+0,32

4,4+1,15

*

2,0+0,61

1,8+0,41

*

Количество опустошенных клеток (%)

38

53

61,3

74,2

52

49

45

38,9

Количество гистохимически активных клеток (%)

7

3

0

0

8

2

5

0

Индекс активности апудоцитов (Иап)

0,82

1,27

1,58

2,88

1,5

1,04

1

0,64

Примечание -  * достоверность различий по отношению к контролю I  р < 0,05

Прямая высокой силы корреляционная связь (ρ = 1) была отмечена между количеством НЭК и титрами антитоксинов. Реакцию НЭК в мезентериальных лимфатических узлах и нарастание титров вибриоцидных антител характеризовала обратная высокой силы корреляционная связь (ρ = -1). Четкая средней силы прямая корреляционная связь (ρ = 0,5) прослеживалась между количеством  НЭК в надпочечниках и уровнем агглютининов к V. cholerae cholerae и вибриоцидных антител к V. cholerae eltor. Наблюдали активацию пролиферирующих лимфоцитов в пейеровых бляшках тонкого кишечника в период с  3-х по 14-е сутки, с  возвратом  к контрольным  показателям на 21-е сутки, что подтверждало направленность иммунологических процессов, происходящих в организме иммунизированных биомоделей. 

Таким образом, динамика  морфофункциональных изменений апудоцитов кишечника  кроликов в ответ на введение  холерных вибрионов рекомбинантного штамма V. cholerae КМ184 – кандидата в холерную вакцину, находилась  в  четкой зависимости  от степени  выраженности  иммунологических реакций  в эффекторном  звене  иммунной системы  ЖКТ. Это позволило нам  обосновать возможность учета  морфофункционального  состояния апудоцитов  кишечника  и  клеток эффекторной зоны иммунной системы ЖКТ - МЭЛ в качестве косвенных  показателей, характеризующих  направленность иммунологических реакций у иммунизированных биомоделей.

В организме крольчат-сосунков холерные вибрионы штамма V.cholerae КМ184 при 10-кратном пассировании не вызывали гибели подопытных животных и развития у них холерогенного синдрома, не приводили к формированию недопустимой морфологической патологии. Но по результатам морфометрического анализа  были выявлены  признаки  некоторого функционального напряжения апудоцитов кишечника у подопытных животных. Так, на фоне относительного уменьшения числа апудоцитов регистрировали  более чем трехкратное превышение Иап у иммунизированных крольчат по отношению к контрольным животным.

  Эффективность защиты животных, иммунизированных V.cholerae КМ184, оценивали по результатам заражения их вирулентными холерными вибрионами по разработанной схеме: выживаемость подопытных животных к учетному сроку (5-е сутки)  и (или) средняя продолжительность жизни (в часах); клинико-патологоанатомическая характеристика проявлений инфекционного процесса; гистологический анализ изменений во внутренних органах;  количество  и функциональное состояние клеток ЖКТ и иммунокомпетентных органов биомодели (апудоцитов, МЭЛ, бокаловидных клеток,  НЭК лимфоидных органов) и уровень процессов пролиферации и апоптоза  клеток  в  крови и селезенке. 

Регистрировали активацию МЭЛ и апудоцитов у животных, зараженных  вирулентными  холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации  испытуемым штаммом, отсутствие резкого изменения профиля секрета, образующегося в бокаловидных клетках кишечника. В то же время у интактных зараженных кроликов наблюдали  уменьшение количества МЭЛ  и резкое опустошение апудоцитов кишечника, происходящие  на фоне снижения  количества  бокаловидных клеток и  изменения их  секреторного профиля за счет повышения числа  клеток, содержащих КМПС (таблица 10). В ответ на введение вирулентных холерных вибрионов предварительно иммунизированным кроликам регистрировали сохранение пролиферативной  активности  лимфоцитов крови и селезенки и  не  более чем двукратное увеличение числа клеток в состоянии апоптоза. 

Таблица 10. Характеристика клеточных элементов слизистой оболочки ЖКТ взрослых кроликов,  зараженных вирулентными холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации  V. cholerae КМ184

Показатель

У животных, зараженных на фоне предварительной иммунизации

Контроль заражения

Интактный контроль (ИК)

Двенадцатиперстная кишка

МЭЛ*

47,5+6,41**

33,3+11,25

32,1+6,59

Бокаловидных клеток

53,8+9,44

42,7+3,59**

59,9+7,80

Апудоцитов

9,8+2,43**

1,98+0,17**

3,39+0,32

Подвздошная кишка

МЭЛ*

78,7+14,96

58,3+7,12**

76,4+15,86

Бокаловидных клеток

44,2+7,45

23,5+6,31**

47,6+3,44

Апудоцитов

7,8+1,95**

2,4+0,61

3,1+0,32

Начальные отделы толстого кишечника

МЭЛ*

52,1+13,21

38,9+5,45

46,7+14,45

Бокаловидных клеток

60,5+9,12

35,7+4,11**

74,9+5,67

Апудоцитов

4,1+0,89

1,4+0,61

3,2+0,64

Примечание - *МЭЛ – межэпителиальные лимфоциты

  ** Достоверность различий  по отношению к ИК р<0,05

Таким образом, по результатам морфометрического анализа  испытуемый штамм,  введенный однократно в дозе  5х109 м.к., обладал  достаточной протективной активностью  и защищал биомоделей от контрольного заражения 1х109 м.к. вирулентного штамма V. cholerae eltor Ogawa Р3122.

Исследование  рекомбинантного штамма V. cholerae КМ182, проведенное по разработанной схеме, позволило дать  более точную характеристику результата взаимодействия вирулентных холерных вибрионов О139 серогруппы с кишечником предварительно иммунизированных животных (таблица 11).

При ультрамикроскопическом анализе, несмотря на общую схожесть и относительную доброкачественность изменений, наблюдаемых после введения биомоделям рекомбинантных штаммов холерных вибрионов как 01, так и 0139 серогрупп, был выявлен ряд особенностей в развитии у них  компенсаторных реакций. Так,  после введения V.cholerae КМ182 имело место длительное  обнаружение  единичных  микробных  клеток  как на  поверхности слизистой оболочки  тонкого кишечника  животных, так  и  в  составе  фагоцитированных включений в гистиоцитах. Факт длительного (14-е сутки после инокуляции) пребывания холерных вибрионов 0139 серовара в слое кишечной слизи у подопытных животных объяснял  наличие  инфильтрации  слизистой  и  СПС оболочки  кишечника  биомоделей

Таблица 11. Характеристика клеточных элементов слизистой оболочки ЖКТ взрослых кроликов, зараженных вирулентными холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации V. cholerae КМ 182

Показатель

Опытная группа

Контроль заражения

Интактный контроль (ИК)

Двенадцатиперстная кишка

МЭЛ*

36,5+4,74

51,3+4,92

32,1+6,59

Бокаловидные клетки

37+8,41

68,8+4,26

59,9+7,79

Апудоциты

3,8+1,03

2,9+0,89

3,6+0,64

Подвздошная кишка

МЭЛ*

79,7+9,87

94,8+14,14

76,4+15,8

Бокаловидные клетки

62,0+7,32

47,5+6,22

47,6+3,44

Апудоциты

4,4+1,34

1,8+0,32**

3,0+0,19

Начальные отделы толстого кишечника

МЭЛ*

56,6+7,06

60,5+5,7

46,7+14,4

Бокаловидные клетки

71,1+6,47

60,5+5,7

84,9+5,67

Апудоциты

5,1+1,72**

2,7+0,54

3,6+1,12

Примечание - * МЭЛ – межэпителиальные лимфоциты

  ** достоверность различий по отношению к ИК р<0,05

значительным количеством эозинофильных гранулоцитов в стадии активного синтеза и  умеренное мембраноповреждающее действие рекомбинантного штамма.

Но, несмотря  на усиление активности функциональных систем макроорганизма в ответ на введение холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп рекомбинантных штаммов,  в клетках сохранялось равновесие между процессами синтеза и распада, что свидетельствовало о доброкачественности происходящих в них изменений и, следовательно, об определенной  клеточной адаптации к воздействию этими агентами.

Таким образом,  применение ультрамикроскопического анализа изменений в клетках подопытных животных на этапах авторского изучения рекомбинантных штаммов холерных вибрионов, направленного на  уточнение значимости тех или иных адаптационно-компенсаторных процессов, выявляемых при световой микроскопии, способствовало повышению информативности проводимых  исследований.

По представленной  ранее схеме было проведено исследование особенностей  течения инфекционного  процесса у биомоделей, предварительно иммунизированных коммерческими (холерной химической бивалентной таблетированной вакциной производства РосНИПЧИ «Микроб», коммерческой вакциной Cholera-Impstoff) и экспериментальными препаратами (препараты «теней» V.cholerae О1 и О139 с токсинкорегулируемыми пилями адгезии -VCG-TCP- и без них, полученные путем контролируемой экспрессии гена E фага PiX174, кодирующего синтез мембранного протеина Е).

Оценку протективных свойств коммерческой холерной вакцины производства РосНИПЧИ  «Микроб» проводили  с использованием 2-х биомоделей: половозрелых беспородных мышей (модель - «запечатанные мыши») [Richardson S.H., et al., 1984] и взрослых кроликов (RITARD) [Spira W.M. et al., 1981].

Инфекционный процесс у предварительно иммунизированных мышей  протекал доброкачественно, сопровождался явлениями иммунологической перестройки в иммунокомпетентных органах, чему соответствовали компенсаторные защитные реакции  со  стороны апудоцитов кишечника  в виде некоторого повышения  их функциональной активности. Независимо от используемой биомодели (беспородные мыши или взрослые кролики) общие  тенденции в реакции  этих клеток отличались от той, что развивается при инфекционном процессе  в интактном организме.

У предварительно иммунизированных животных  вирулентные холерные вибрионы  вызывали  умеренное функциональное напряжение  апудоцитов кишечника в виде незначительного увеличения их количества и относительного опустошения  клеток.

Анализ морфометрических показателей, характеризующих изменения у зараженных на фоне предварительной иммунизации кроликов (рис.1), выявил определенную зависимость между количеством НЭК в лимфоидных органах биомоделей и степенью их иммунологической перестройки. В частности, имела место средней силы прямая корреляционная связь (r = 0,4) между количеством аргирофильных  клеток и величиной гиперплазии фолликулов в мезентериальных лимфатических узлах животных. Описанные изменения количества и морфофункционального состояния апудоцитов в этих органах отчасти отражали регуляторные свойства синтезируемых ими гормонов (серотонин, гистамин). Мобилизация нейроэндокринного окружения иммунокомпетентных органов привитых животных, заключающаяся в достоверном (р < 0,05) увеличении числа  апудоцитов по отношению к контролю, свидетельствовала об усилении синтеза ими БАВ и характеризовала стадию ограничения  интенсивности  иммунопатологических  реакций  при  введении  вирулентных  холерных вибрионов, что укладывалось  в общую закономерность изменений апудоцитов при вторичном иммунном  ответе.

Таким образом, вирулентные холерные вибрионы в организме предварительно иммунизированных  коммерческими препаратами биомоделей, вызывая развитие минимальных  изменений со стороны внутренних органов, в ЖКТ сталкивались с  функционирующим вследствие иммунизации «защитным барьером»  из  плазматических клеток, МЭЛ, активных зон в лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником, и клеток APUD-системы.

При испытании эффективности экспериментальных препаратов были выявлены определенные закономерности  в изменении числа, морфофункционального состояния апудоцитов кишечника и НЭК в лимфоидных органах в зависимости от используемого препарата, способа и кратности его введения, степени выраженности иммунологической перестройки в органах иммунной системы на момент заражения, характера последующей обработки биомоделей. Впервые было показано, что оценка состояния апудоцитов кишечника в совокупности с другими морфометрическими показателями изменений ЖКТ является достаточно информативным критерием для характеристики инфекционного процесса  у предварительно иммунизированных животных. 

На основании этого была разработана система оценки показателей морфофункционального состояния  клеток APUD-системы организма подопытных животных при первичном и вторичном иммунном ответе. Проведено сравнение двух групп экспериментальных препаратов, полученных  на основе холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп и показаны преимущества первых перед вторыми.

По результатам проведенных исследований был предложен способ оценки качества противохолерных вакцин, заключающийся в использовании минимального набора хорошо воспроизводимых гистологических и гистохимических методик в сочетании с  морфометрическим анализом для характеристики морфофункционального состояния систем макроорганизма,  реагирующих  на патоген. Эффективность местной защитной реакции  макроорганизма при противохолерной вакцинации оценивали по изменению состояния клеток:  МЭЛ, апудоцитов, бокаловидных клеток. Полученные количественные характеристики, отражающие характер и направленность  адаптационно-компенсаторных реакций у биомоделей, представляли в виде ассоциаций показателей (коэффициентов, индексов), что значительно  упрощало дальнейшую  трактовку результатов  по  выявлению  преимуществ тех или иных вакцинирующих препаратов, повышало информативность и объективность доклинических исследований новых противохолерных препаратов (таблица 12).  Согласно полученным данным, наибольшей протективной активностью среди коммерческих препаратов  обладала вакцина бивалентная таблетированная производства РосНИПЧИ «Микроб», среди экспериментальных препаратов  - препараты «VCG+TCP».

Во второй части работы  были  проведены исследования по количественной оценке изменений в  организме биомоделей, обусловленных влиянием чумного и туляремийного микробов штаммов с различной генетической характеристикой, охарактеризованы реакции функциональных систем экспериментальных животных, зараженных вирулентными культурами указанных возбудителей на фоне приобретенной резистентности к чуме и туляремии, проведено комплексное исследование противочумного и противотуляремийного вакцинного процессов.

Для сравнительного морфометрического исследования были взяты культуры  вирулентного штамма Y.pestis 231 (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm+); штаммов, выделенных  в 2006 г. на территории Прикаспийского природного очага чумы - Y.pestis 770, 6205, 6215 (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm-) и вакцинного штамма Y.pestis EV (pFra+, pPst+, pCad+,Pgm-) линии НИИЭГ.

Алгоритм исследования включал анализ изменений в месте входных ворот инфекции, морфометрическую характеристику адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма с учетом реакции клеток нейроэндокринной системы.

Наиболее показательными были изменения со стороны НЭК в лимфоидных органах. На введение культур вирулентного штамма Y.pestis 231 отмечали резкое угнетение НЭК. Инокуляция мышам  Pgm- природных штаммов чумного микроба приводила к относительной  активации НЭК в лимфоидных органах, но  менее выраженной, чем при  введении вакцинного штамма Y.pestis EV.

Резкое  угнетение ПВО у животных, зараженных Y.pestis 231 сопровождалось относительной активацией НЭК в легких. Аналогичная зависимость прослеживалась и на введение Pgm-  штаммов, но диапазон изменения учитываемого показателя был близок к значению у контрольных животных.

А

Б

Рис.1. Морфометрическая характеристика состояния:  А.- селезенки; Б.- мезентариальных лимфатических узлов взрослых кроликов, зараженных холерными вибрионами по методу RITARD на фоне предварительной  иммунизации: 1.- холерной химической бивалентной таблетированной вакциной производства РосНИПЧИ «Микроб»; 2.-  коммерческой вакциной Cholera-Impstoff ; ГС - группа сравнения

Таблица 12. Результаты оценки качества различных вакцинных препаратов по разработанным показателям

Название препарата

Схема иммунизации

Доза препарата

Заражение на 14-е сутки после окончания иммунизации

Показатели

Двенадцатиперстная кишка

Подвздошный отдел тонкого кишечника

Восходящий отдел ободочной кишки

КА

КС

ИР

КА

КС

ИР

КА

КС

ИР

Коммерческая холерная бивалентная  таблетированная вакцина (РосНИПЧИ «Микроб»)

Per os

однократно

3 таблетки (1 ч/д)

V.cholerae О1

серогруппы

5,36

13,88

0,84

3,59

5,10

0,73

5,80

12,7

0,75

Коммерческая холерная вакцина (Швейцария)

« - «

109 у.м.к.

V.cholerae  О1

серогруппы

4,69

8,67

0,94

2,98

4,79

0,83

4,50

6,56

0,71

Препарат “VCG+TCP”

V. cholerae O1

Per os 2-х кратно с интервалом 14 дней

20 мг

V.cholerae  О1

серогруппы

4,69

19,69

1,21

3,11

4,96

0,83

3,0

7,64

0,52

Препарат “VCG-TCP”

V. cholerae O1

« - «

20 мг

V.cholerae  О1

серогруппы

3,07

8,56

1,16

3,37

3,69

1,25

3,78

3,12

0,81

Препарат “VCG+TCP”

V. cholerae O139

« - «

20 мг

V.cholerae О139

серогруппы

4,22

74,3

1,27

3,05

56,81

1,68

3,45

62,8

0,90

Препарат “VCG-TCP”

V. cholerae O139

« - «

20 мг

V.cholerae О139

серогруппы

2,53

9,29

1,27

1,82

22,32

1,62

2,19

16,2

0,89

Авирулентный штамм  V. cholerae КМ 184

Per os

однократно

5х109 ж.м.к.

V.cholerae  О1

серогруппы

1,78

46

0,70

3,24

16,63

0,73

7,04

44,3

0,75

Авирулентный штамм V. cholerae КМ 184

« - «

5х109 ж.м.к.

-

0,96

0,92

1,37

0,85

1,12

1,04

1,27

0,63

0,57

Авирулентный штамм V. cholerae КМ 182

Per os 2-х кратно с интервалом 14 дней

5х109 ж.м.к.

V.cholerae О139

серогруппы

3,69

133,8

1,41

2,59

27,8

1,19

1,35

42,8

1,07

Авирулентный штамм  V. cholerae КМ 182

« - «

5х109 ж.м.к.

-

0,92

0,42

0,95

1,57

0,97

0,99

1,49

0,42

0,92

Примечание – КА – коэффициент активности апудоцитов; КС – коэффициент секреторной активности; ИР – индекс регенеративной активности

Выявлены отличия и  по  другим морфометрическим параметрам, отражающим функциональное состояние систем жизнеобеспечения организма биомодели, на введение природных Pgm-  штаммов,  отличающие их по характеру вызываемых ими изменений как от Y.pestis 231, так и Y.pestis EV. Несмотря  на отсутствие  гибели  мышей при подкожном введении им  культур штаммов Y.pestis 770, 6205, 6215, регистрируемые умеренные изменения морфометрических параметров свидетельствовали о формировании  адаптационно-компенсаторных реакций в организме биомоделей.

После сравнения  ряда морфометрических характеристик для оценки интенсивности выраженности  адаптационно-компенсаторных процессов  в организме  лабораторных мышей  при изучении  влияния различных культур чумного микроба, среди определяемых параметров были  выбраны наиболее информативные, которые были апробированы  в последующих исследованиях на морских свинках.

Чумные микробы вирулентного штамма Y.pestis 231 при подкожном введении морским свинкам вызывали в печени двукратное увеличение ядерно-цитоплазматического индекса (ЯЦИ) гепатоцитов, повышение деструктивного индекса (ДИ) в 4,5 раза, резкие  инволютивные процессы со стороны клеток ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) на фоне формирования крупных инфильтратов из ПМЯЛ. 

В ответ на введение Y.pestis вакцинного  штамма EV у  животных поддерживался  определенный адаптационный потенциал. Вакцинный штамм достоверно не изменял перфузионно-вентиляционное отношение  (ПВО),  а введение вирулентных культур чумного микроба приводило к изменению ПВО в легких,  понижая этот показатель в 10 раз  из-за развития  гемадинамических нарушений и воспалительных изменений в органе.

На срыв адаптации у биомоделей, инфицированных Y.pestis 231 указывали: инверсия зон  коркового вещества надпочечников и  изменение стрессорного индекса (Истресс.)  более чем на 0,5 по отношению к показателю у интактных животных.

У биомоделей, зараженных  Y. pestis 231 на фоне предварительной  иммунизации регистрировали взаимосвязь между  выраженностью  количественных параметров, определяющих степень токсического повреждения функциональных структур макроорганизма, и уровнем иммунологических процессов в лимфоидных органах.  Так, ключевые морфометрические параметры, отражающие функциональное состояние систем макроорганизма, у предварительно иммунизированных животных  в ответ на введение вирулентных Y. pestis 231 не выходили за допустимые  пределы  и были близки к показателям у интактных контрольных животных.

Вирулентные  культуры F.tularensis 503/840  уже через 24 ч локализовались в печени и селезенке, а к моменту гистологического исследования  (12-е сутки) обнаруживались в крови подопытных морских свинок. Возбудитель вызывал  гнойно-некротические изменения в коже места введения культур патогена, в регионарных и отдаленных лимфатических узлах,  в селезенке, формирование в этих органах, особенно в селезенке, эпителиоидноклеточных гранулем. Во внутренних органах имели место: изменение ЯЦИ гепатоцитов и семикратное увеличение ДИ в печени, формирование  преимущественно эпителиоидноклеточных гранулем; почти в 9 раз превышение ДИ для эпителия  извитых канальцев почек;  в 13 раз снижение ПВО.  О срыве адаптации у биомоделей, инфицированных F.tularensis 503/840,  свидетельствовал Истресс.= 1,97 (интактный контроль Истресс.= 1,25).  Характерный гранулематозный характер воспаления в органах, присутствие в очагах воспаления лимфоидных элементов и макрофагов указывали на формирование  иммунного воспаления (ГЗТ), играющего важную роль в патогенезе туляремии.

Таким образом, вирулентный штамм F.tularensis у чувствительной биомодели  вызывал общую интоксикацию и генерализацию инфекции,  образование во внутренних органах и лимфатических узлах специфических эпителиоидноклеточных  туляремийных гранулем. Морфометрические параметры, характеризующие глубину повреждающего действия патогена, свидетельствовали о срыве  адаптационного потенциала у биомодели.

Был  проведен морфометрический анализ изменений у морских свинок, зараженных 5х103 м.к.  вирулентного штамма F. tularensis 503/840  на фоне их предварительной иммунизации  вакцинным штаммом  F. tularensis 15  в дозе 2х108 м.к..

При практически полном отсутствии  на 30-е сутки после заражения  видимых патоморфологических изменений, морфометрический анализ выявил напряжение в работе функциональных систем макроорганизма в виде умеренной активации РЭС и элементов APUD-системы. Так, в легких ПВО в 4 раза было ниже, чем у  животных  из группы интактного контроля, а  количество аргентаффинных клеток увеличивалось.  Это вызвало интерес потому, что эндокринный аппарат органов дыхания представлен как одиночными НЭК – апудоцитами, диффузно расположенными  среди клеток бронхиального эпителия, так и групповыми скоплениями (нейроэпителиальные тельца - НЭТ). Продуцируемые ими серотонин, бомбезин, дофамин, способны воздействовать на гладкомышечные элементы бронхиальной стенки, регулируя воздухораспределение. В то же время  известна особая роль клеток альвеолярного эпителия не только в поддержании легочного гомеостаза, но и в запуске механизмов  врожденного  иммунитета при контакте с патогеном [Johnson M.D. et al., 2002].  F. tularensis, взаимодействуя с клетками альвеолярного эпителия, индуцирует каскад реакций, связанных с продукцией секретируемых цитокинов, результатом которых  является миграция в очаг иммунокомпетентных клеток [Gentry M., Taormina J. et al., 2007].  При этом  изменение  морфофункционального состояния НЭК в легких влечет  за собой  локальное нарушение  газообмена и может осложнять  течение патологического или адаптивного процессов.

В надпочечниках  регистрировали  умеренную активацию НЭК. На фоне гиперпластических процессов в лимфатических узлах имела место активация аргентаффинных  элементов  при относительном покое  аргирофильных клеток. В селезенке же напротив реагировали аргирофильные,  а аргентаффинные  элементы оставались в покое.

Исследования реакции клеток APUD-системы ряда функционально значимых органов биомоделей на вакцинные штаммы Y.pestis EV линии НИИЭГ и F. tularensis  15 линии  НИИЭГ, расширяющие представления о механизмах нейроиммуноэндокринных  взаимоотношений в макроорганизме,  были направлены  на  совершенствование методов оценки безопасности и эффективности вакцин против чумы и туляремии.

В ответ на введение вакцинного штамма Y. pestis ЕV выявлены изменения  реакции апудоцитов в лимфоидных органах, происходящие в соответствие  с ролью регуляторных свойств синтезируемых этими клетками БАВ и пептидов (таблица 13).  Активность НЭК тимуса в период с 3-х по 7-е сутки, коррелирующая  с процессами  активации лимфоидных элементов в нем, согласуется с данными о роли этого органа как  координатора молекулярных и клеточных нейроэндокринных взаимодействий  [Мanley N.R., 2000; Maroder M. et al., 2000].  Способность  тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) секретировать такие БАВ, как серотонин, мелатонин, гистамин и другие [Акмаев И.Г., 1997], и продуцировать сигнальные молекулы – цитокины, играющие важную роль в дифференцировке и пролиферации тимоцитов [Кветной И.М. и др., 2005], позволяет предположить участие  НЭК не только в иммуномодулирующих процессах при противочумной вакцинации, но и в ограничении  аллергических  и общетоксических реакций макроорганизма. В периферических органах иммунной системы первоначально регистрируемое снижение количества апудоцитов, направленное на стимуляцию иммунной реакции, в последующем сменяется увеличением их числа, способствуя ограничению интенсивности процесса. С увеличением дозы Y. pestis ЕV развивающиеся явления острого лимфаденита в регионарных лимфатических узлах, по-видимому, сопровождаются более ранней (до 3-их суток) активацией апудоцитов, в первую очередь - аргентаффинных  клеток,  а к 7-м суткам  активность этих элементов  резко уменьшается. К 14-м суткам, когда явления острого воспаления стихают, число НЭК начинает нарастать, что является отражением регуляторного влияния продуктов секреции этих клеток на различные компоненты или фазы воспалительного процесса. Таким образом, активация аргирофильных клеток оказывает  влияние на  регуляторные механизмы ранней фазы иммуногенеза, запускающей значительный клон антигеннеспецифических супрессоров тимуса, что в конечном итоге и определяет  количественную основу иммунного ответа. Это согласуется с данными о максимальном изменении пула иммунокомпетентных клеток с рецепторами для серотонина и гистамина, происходящим в ранние сроки после противочумной вакцинации. Этот процесс предшествует развитию невосприимчивости лабораторных животных к заражению вирулентными чумными микробами, а отмечаемая разнонаправленность колебаний  показателей,  как по амплитуде, так и по вектору, носит дозозависимый и фазный характер [Щуковская Т.Н. и др., 1992].

Данные о разнообразии продуктов секреции, расположения клеток и функциональной значимости  апудоцитов  в лимфоидных органах и в органах дыхания [Белжеларская С.Н., Саттон Ф., 2003] обусловили интерес к выяснению роли и участия элементов APUD-системы  при аэрогенном способе  введения ЖЧВ (таблица 14).

На  фоне изменения  ПВО  у морских  свинок при  аэрогенной  иммунизации  Y. pestis ЕV регистрировали  снижение  числа  апудоцитов в легких за  счет их опустошения. В регионарных и отдаленных  лимфатических узлах  реакция НЭК  находилась в прямой зависимости от выраженности воспалительного компонента, отмечали снижение  числа  аргентаффинных клеток  вплоть  до 21-х суток, а  количество  аргирофильных  элементов  несколько превышало контрольные показатели в первые сутки и на 14-е сутки, когда  активизировались гиперпластические процессы.  К 45-м суткам количество НЭК в отдаленных лимфатических узлах практически возвращалась к контрольным значениям. Морфометрические показатели  активации гиперпластических процессов  в селезенке подопытных животных  коррелировали  с умеренной  активацией НЭК, начинающейся с 3-х суток, максимум которой  со стороны аргентаффинных клеток  приходился на 14-е сутки, а аргирофильных - на 21-е сутки. Выявленные изменения морфофункционального состояния апудоцитов в легких и иммунокомпетентных органах  свидетельствовали о заинтересованности элементов APUD-системы при ингаляционном способе поступления антигенного материала, а динамика их носила фазный характер.

Таблица 13. Динамика изменения количества клеток APUDсистемы у морских свинок, иммунизированных  подкожно вакцинным штаммом Y.pestis ЕV 

Окраска по

Иммунизирующие дозы

Интактный контроль

1х107 м.к

2х109 м.к

1,5х1010 м.к

3 сутки

7 сутки

14 сутки

3 сутки

7 сутки

14 сутки

3 сутки

7 сутки

14 сутки

Легкие

Масону

2,6+0,23

2,0+0,89

2,8+0,69

4,1+0,90

3,1+0,05

3,8+0,75

3,4+0,23

5,5+1,04*

2,6+0,72

3,6+0,50

Гримелиусу

1,7+0,65

0,9+0,07*

1,3+1,01

2,6+0,89

1,8+0,64*

1,9+0,55*

2,4+0,32

3,2+0,64

1,6+0,23*

3,9+1,52

Регионарные лимфатические узлы

Массону

3,1+0,35

4,2+1,56

3,1+0,65

2,4+0,61*

2,5+0,28

4,8+2,11

3,8+1,11

0,9+0,61*

4,1+0,07

3,3+0,68

Гримелиусу

1,5+0,89*

2,9+0,61

1,2+0,46*

3,3+0,89

2,5+0,29*

4,6+1,58

2,3+0,32

2,7+0,51

2,3+0,51

3,7+0,50

Контрлатеральные лимфатические узлы

Массону

2,7+0,75

2,5+1,04

4,1+1,12*

2,2+0,90

4,5+0,76*

3,6+0,65

5,0+2,31*

2,7+1,82

4,0+1,15

2,7+0,51

Гримелиусу

1,1+0,47

0,9+0,02*

1,5+0,5

2,7+1,17

4,8+0,64*

3,7+0,89

2,4+0,30

2,4+1,50

3,7+0,51

2,2+0,53

Отдаленные лимфатические узлы

Массону

4,9+1,09

3,2+1,06

4,4+1,28

3,3+0,90

5,2+0,69*

2,9+1,05

1,5+0,54*

3,4+1,05

5,0+1,02*

3,8+1,51

Гримелиусу

3,1+1,07

2,9+0,69

2,4+0,5

2,9+0,61

4,9+0,61*

6,6+2,57*

1,7+0,61

2,0+1,10

2,8+0,52

2,8+0,64

Тимус

Массону

3,6+1,59

18,1+1,18*

2,1+1,12

6,5+1,2*

2,7+1,01

2,4+0,84

2,9+0,89

2,1+0,06

3,1+0,06

2,1+0,95

Гримелиусу

2,7+1,17

15,3+2,47*

1,8+0,53

3,8+0,9

3,2+0,64

1,9+0,06

1,6+0,31

3,5+2,02

2,8+0,12

2,8+1,01

Селезенка

Массону

3,8+0,53

3,7+0,17

2,7+0,51*

2,2+0,65*

5,5+0,29

4,1+0,87

3,9+0,06

2,2+0,53*

3,8+0,11

5,6+0,35

Гримелиусу

2,4+0,89*

2,6+1,09

2,7+0,52

2,1+0,36

2,4+1,05

3,6+0,92

3,8+1,50

3,1+2,06

2,8+0,12

3,7+0,64

Надпочечники

Массону

5,4+2,44

2,5+0,51*

2,4+0,42*

3,5+0,89*

2,5+1,04*

2,3+1,07*

2,8+0,52*

4,7+2,14*

2,8+0,64*

7,1+1,05

Гримелиусу

3,1+1,45

1,9+0,75*

1,9+0,51*

3,6+1,44

2,7+1,02

3,2+1,01

1,8+0,61

1,4+0,52*

2,9+1,53

3,7+0,64

Примечание: * - р<0,05

Таблица 14. Количество клеток APUD-системы морских свинок при  аэрогенной иммунизации вакцинным штаммом Y. pestis ЕV 

Окраска по

Сутки наблюдения

Интактный контроль (ИК)

1

3

7

14

21

45

Легкие

Массону

2,7+0,51

2,1+0,06

2,4+0,50

2,5+0,50

2,6+0,72

2,7+0,68

3,4+0,69

Гримелиусу

2,2+0,52

2,3+0,68

1,6+0,23*

3,1+1,01

2,3+0,51

2,2+0,90

3,7+1,56

Регионарные лимфатические узлы

Массону

3,3+0,85

1,7+0,17*

2,9+0,45

2,5+0,29

0,6+0,05*

2,1+0,06

3,6+1,17

Гримелиусу

4,8+1,21

2,8+0,52

2,6+0,55

4,1+1,53

2,5+0,51

2,6+2,01

3,3+0,92

Отдаленные лимфатические узлы

Массону

6,1+1,70*

4,3+1,50

5,1+1,05*

2,5+0,29

1,8+0,46*

2,5+0,29

3,1+0,56

Гримелиусу

4,1+1,01

3,4+1,92

6,1+1,54*

3,3+0,17

2,7+0,40

3,1+0,98

3,3+0,75

Селезенка

Массону

3,8+1,10

4,8+1,01

5,9+1,51

6,1+3,50*

4,3+0,17

2,8+1,01*

3,9+0,97

Гримелиусу

5,5+1,75

5,1+1,12

2,6+0,50

4,5+1,04

7,0+1,15*

5,3+0,85

4,5+1,25

Примечание: *-достоверность р<0,05 по отношению к ИК

После выяснения  реакции макроорганизма на различные способы введения  ЖЧВ, была предпринята попытка сравнения  ревакцинирующего эффекта ЖЧВ и препарата ХЧВ. В результате  проведенного морфометрического исследования были  выявлены более выраженные проявления вторичного иммунного ответа к 14-м суткам наблюдения со стороны иммунокомпетентных органов морских свинок, ревакцинированных препаратом ХЧВ, по сравнению с ЖЧВ. В регионарных лимфатических узлах  при ревакцинации ХЧВ  гиперплазия  лимфатических фолликулов выражалась в увеличении их площади в 2 раза  по сравнению с интактным контролем. Отмечали в 1,3 раза чаще, чем у свинок ревакцинированных ЖЧВ, увеличение числа лимфатических фолликулов  со светлыми центрами, характеризующими процессы активации этих структур. Чуть слабее была реакция со стороны отдаленных лимфатических узлах, где гиперпластические процессы в виде увеличения паракортикальных зон (ПКЗ) и размеров фолликулов наблюдались с 14-х суток  у животных ревакцинированных  как ЖЧВ, так и ХЧВ. Увеличение средней площади лимфатических фолликулов  в селезенке  животных,  иммунизированных ХЧВ,  было в 1,7 раза больше, чем на введение ЖЧВ, и  в 1,3 раза чаще  среди них встречались фолликулы с активными светлыми центрами, а  ширина Т-зон в органе была  в 1,2 раза больше.

Выраженности иммунологической перестройки в лимфоидных органах подопытных животных, регистрируемой по результатам морфометрического исследования  к 14-м суткам после ревакцинации указанными препаратами, соответствовало максимальное накопление антител к FI у морских свинок иммунизированных ЖЧВ и ревакцинированных ХЧВ или  ЖЧВ. Следует отметить, что на ревакцинацию ХЧВ этот показатель почти в 2 раза превышал аналогичный у свинок, ревакцинированных ЖЧВ.

Далее разрабатываемый принцип и схему оценки изменений в макроорганизме, обусловленных введением вакцинного штамма чумного микроба, апробировали  для характеристики аттенуированного штамма  Y.pestis 1217М (архив комиссионных испытаний 1986-1987 г.), проведя  его сравнительное изучение с эталонным вакцинным штаммом Y.pestis ЕV линии НИИЭГ [МУ 3.3.1.1113-02]. Штамм Y.pestis 1217М, отклоненный по результатам комиссионных испытаний от внедрения в качестве вакцинного, был взят для проверки правильности выбора наиболее значимых параметров.

Отмечая общее сходство в направленности  иммунологических процессов в  лимфатических узлах и селезенке подопытных животных, иммунизированных  чумными  микробами  испытуемого  штамма,  в  сравнении с эталонным, регистрировали  ряд  отличий в количественной характеристике описываемых изменений.  Так, в отличие от Y.pestis EV,  введение  Y.pestis 1217М  дозе  1х107 м.к.  вызывало  на фоне  наблюдаемых  явлений умеренного серозного, иногда серозно-гнойного процесса в лимфоидных органах  гиперплазию фолликулов в регионарных и отдаленных лимфатических узлах, регистрируемую  морфометрическими методами,  без  активации бластической реакции в них вплоть до 14-х суток. С увеличением иммунизирующей дозы до 2х109 м.к. нарастал воспалительный компонент  при введении культур, как эталонного штамма, так и испытуемого, а  разница между определяемыми морфометрическими параметрами в группах нивелировалась. Адаптационно-компенсаторные реакции во внутренних органах характеризовали состояние функционального напряжения в работе систем жизнеобеспечения биомодели. Введение испытуемого штамма в дозе 100 м.к. или 1х107 м.к. вызывало умеренную активацию клеток РЭС в печени в ранние сроки. С увеличением иммунизирующей дозы до 2х109 м.к.  наблюдали  относительное истощение  клеток РЭС. Эти изменения проходили на фоне  усиления деструктивных процессов в гепатоцитах с  изменением ДИ, значение которого вплоть до 45-х суток наблюдения  отличалось от такового у интактного контроля и превышало показатели, определяемые в группе животных, иммунизированных культурами эталонного штамма. Аналогичная  закономерность была установлена и для морфометрических параметров, характеризующих функциональное состояние почек.  В легких инфильтративные процессы при введении культур испытуемого штамма в дозах 1х107 м.к. и 2х109 м.к. приводили к изменению ПВО, понижая этот показатель более чем в 8 раз по отношению к интактному контролю, без достижения контрольного значения к 45-м суткам. На введение же культур эталонного штамма  достоверное изменение ПВО  регистрировали лишь при  иммунизации в дозе 2х109 м.к. и только в ранние сроки. Если стресс-реакцию организма на введение культур эталонного штамма Y.pestis EV в дозах 1х107 м.к. и 2х109 м.к.  характеризовали  незначительные отклонения Истресс. до 7-х суток, что согласуется с литературными данными о стрессорном действии ЖЧВ, характеризуемом по изменению концентрации 11-оксикортикостероидов в плазме крови подопытных животных [Анисимова Т.И. и др., 2005], то введение культур  испытуемого  штамма  в аналогичных дозах  приводило к изменению Истресс., вызывало  гиперплазию коркового вещества органа на фоне резкой  инверсии его слоев,  а учитываемые морфометрические параметры  лишь по отдельным позициям к 45-м суткам возвращались к контрольным значениям.

Таким образом,  по полученным данным испытуемый штамм  чаще  вызывал патологические изменения в органах и тканях подопытных животных, эти изменения по продолжительности были более длительными, а процесс формирования адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма не всегда укладывался во временной промежуток до 45-х суток наблюдения. 

Границы традиционного патоморфологического исследования  биомоделей при введении F.tularensis 15  были расширены за счет введения характеристики реакций клеток нейроэндокринной (APUD) системы функционально значимых органов и  морфометрического анализа изменений, отражающих характер адаптационно-компенсаторных  процессов в макроорганизме, обусловленных иммуногенезом (таблица 15).

Таблица 15. Количество клеток APUD-системы морских свинок, иммунизированных культурой вакцинного штамма F.tularensis 15

Окраска по

Опыт 1

Опыт 2

Интактный контроль

Легкие

Массону

2,3+0,4

4,2+0,14

3,6+0,50

Гримелиусу

2,9+1,17

3,5+1,06

3,9+1,52

Регионарные лимфатические узлы

Массону

6,7+1,08*

4,4+0,28

3,3+0,68

Гримелиусу

4,1+0,89

3,6+0,17

3,7+0,50

Отдаленные лимфатические узлы

Массону

2,6+1,06

7,1+1,48*

3,8+1,51

Гримелиусу

4,2+0,72*

7,4+0,99*

2,8+0,64

Тимус

Массону

5,4+1,22

6,7+0,92*

2,1+0,95

Гримелиусу

3,9+0,64

6,9+1,34*

2,8+1,01

Селезенка

Массону

11,5+2,14*

5,7+1,91

5,6+0,35

Гримелиусу

9,8+1,45*

5,8+3,68

3,7+0,64

Надпочечники

Массону

6,5+1,24

3,9+0,07*

7,1+1,05

Гримелиусу

4,2+0,98

5,5+0,35

3,8+1,22

Примечание * достоверность р<0,05 по отношению к интактному контролю

Реакция НЭК  в регионарных лимфатических узлах заключалась в некоторой активации аргентаффинных клеток, особенно на введение  вакцинного штамма в дозе 5х107 м.к (опыт 1), а  аргирофильных элементов - практически не отличалась от аналогичных показателей у интактного контроля. В отдаленных лимфатических узлах НЭК  реагировали резкой активацией как аргентаффинных, так и аргирофильных клеток на введение культуры вакцинного штамма в дозе 5х109 м.к. (опыт 2) и умеренной активацией аргирофильных элементов на иммунизацию  5х107 м.к. Количество НЭК  в селезенке  достоверно увеличивалось при введении культур вакцинного штамма в дозе 5х107 м.к.

По результатам морфометрического анализа  были отмечены умеренные деструктивные изменения на введение  вакцинного штамма, но без резких инволютивных процессов со стороны РЭС. Если на введение вирулентных культур регистрировали снижение ПВО в 13 раз по отношению к  интактному контролю, то у  иммунизированных  животных этот показатель  отличался лишь в 1,5-1,6 раза.  Относительная активация синтетических процессов в апудоцитах легких на 5-е сутки после иммунизации  имела место только при введении 5х109 м.к. культур вакцинного штамма. Меньшая доза  вакцинного штамма  способствовала умеренному опустошению  клеток. Аргентаффинные клетки APUD-системы  в надпочечниках  претерпевали дегрануляцию, а  в  аргирофильных элементах усиливались синтетические процессы.

Реакция апудоцитов кишечника на подкожное  введение вакцинного штамма F.tularensis 15  заключалась в  снижении их числа  в 1,3 - 4 раза. На вирулентные туляремийные микробы кишечник биомодели реагировал  увеличением количества  клеток APUD-системы в 1,5-2 раза по отношению к  показателю  у интактных животных, причем преимущественно реагировали аргентаффинные  - EC-клетки, продуцирующие  серотонин и  мелатонин. Но, несмотря на различную направленность процессов активации апудоцитов кишечника  у вакцинированных и зараженных биомоделей,  Иап  в обеих группах изменялся однотипно.

В результате реализации возможности комплексного морфометрического анализа полученных данных для  характеристики чумного, туляремийного инфекционных процессов и оценки реакций макроорганизма на введение культур  вакцинных штаммов этих микроорганизмов намечены перспективы создания экспертных систем (ЭС), направленных на  решение проблем, связанных с отбором  штаммов – кандидатов в живые вакцины  и  задач экспериментальной морфологии.

Алгоритм оценки влияния испытуемых экспериментальных и коммерческих препаратов для специфической профилактики чумы и туляремии  разрабатывали таким  образом, чтобы: количественно оценить  повреждающее действие вакцины (остаточную вирулентность) и возможные побочные реакции макроорганизма на нее; охарактеризовать стресс-реакцию  макроорганизма;  проанализировать  роль  клеток  APUD-системы как системы реагирования и контроля  в реализации  защитного потенциала макроорганизма при вакцинном процессе; выявить морфометрические параметры, определяющие специфическую  активность вакцины на основании оценки устойчивости функционально значимых систем организма биомодели к повреждающему действию конкретного возбудителя.

Для оценки  был отобран  ряд формализованных признаков: определение функционального состояния паренхиматозных элементов и характера инфильтративных процессов в печени, отражающих  степень нарушения  дезинтоксикационной, синтетической и защитной функций органа; учет количества НЭК в легких, обеспечивающих  местную регуляцию функций дыхательной системы – приспособление  кровотока  к вентиляции  легких  и изменение ПВО; оценка микроциркуляторных нарушений в ренальном звене – функциональное состояние почечных телец и эпителия канальцев, обеспечивающих  адекватную работу выделительной системы; анализ морфофункционального состояния НЭК лимфоидных органов, выступающих в роли  неспецифических регуляторов иммунологических процессов; количественная характеристика изменений в надпочечниках – органе, ответственном за  формирование адаптационных реакций.

Таким образом, применение аппаратно-программных компьютерных комплексов и стандартных схем морфологического анализа по представленным алгоритмам в экспериментальной морфологии особо опасных инфекций, упрощая доклиническую характеристику создаваемых препаратов против холеры, чумы и туляремии, позволит нивелировать зависимость качества конечного результата исследования от субъективизма оценки исследователя. 

ВЫВОДЫ

1.  В ответ на введение штаммов V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой,  рекомбинантных штаммов V. cholerae, экспериментальных и коммерческих препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии выявлены особенности изменения ряда морфометрических параметров, характеризующих адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей, дополняющие имеющиеся представления о пато- и иммуногенезе указанных инфекций.

2.  Введение штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп с генотипом  ctxA+ zot+ ace+ tcpA+приводит к  развитию выраженных морфологических  изменений в желудочно-кишечном тракте и внутренних органах биомоделей, вызывая функциональное напряжение клеток APUD-системы кишечника с увеличением индекса активности апудоцитов по отношению к интактному контролю в 24-14 раз соответственно. Изменения в тонком  кишечнике биомоделей на введение культур холерных вибрионов штаммов с генотипом  ctxA- tcpA+ и  ctxA-tcpA-  носят однонаправленный характер, не имеют достоверных отличий между собой и свидетельствуют об умеренном напряжении морфофункционального состояния апудоцитов с увеличением их индекса активности  в 3 раза. По предложенным морфометрическим параметрам отобран штамм V. cholerae биовара eltor, серовара Ogawa (ctxA-, zot-, tcpA-, toxR-), предлагаемый  в качестве  контрольного для морфологических и иммунологических исследований.

3.  Установлены различия  в течении экспериментальной холерной инфекции у биомоделей, зараженных  холерными вибрионами О1 и О139 серогрупп, касающиеся особенностей  морфофункционального состояния клеток кишечника, выполняющих барьерные функции: межэпителиальных лимфоцитов, апудоцитов, бокаловидных клеток, клеток собственной пластинки слизистой оболочки кишечника. Изменение соотношения между различными клеточными популяциями, нарушение интенсивности обменных процессов в них  отражают уровень повреждающего действия  холерных вибрионов на функциональные системы макроорганизма.

4.  При испытании эффективности экспериментальных и коммерческих противохолерных  вакцин  и рекомбинантных  штаммов  V. cholerae  О1 и  О139 серо-групп обнаружены изменения числа и морфофункционального состояния апудоцитов кишечника, клеток эффекторной зоны иммунной системы желудочно-кишечного тракта и нейроэндокринных клеток в лимфоидных  органах, в том числе в лимфоидной ткани, ассоциированной с  кишечником биомоделей, в зависимости от используемого препарата, способа и кратности его введения, степени выраженности иммунологической перестройки в органах иммунной системы на момент заражения.

5.  Разработан способ оценки  качества  вакцинных препаратов против холеры, включающий морфологическое исследование гистологического материала от биопроб с использованием морфометрической характеристики трех групп клеточных элементов  в слизистой оболочке кишечника и  математическую обработку количественных показателей. Применение предложенных коэффициентов и индексов учета результатов способствует объективизации и унификации оценки качества  противохолерных вакцин.

6. При  заражении беспородных белых мышей культурами штаммов Y. pestis  pFra+, pPst+, pCad+, Pgm+ и Y. pestis  pFra+, pPst+, pCad+, Pgm- выявлены отличия в состоянии функционально значимых систем макроорганизма по изменению  морфометрических параметров, характеризующих размер органа, число и площадь его функционально активных структур (фолликулов лимфоидных органов, почечных телец и сосудистых клубочков, легочных альвеол и капилляров), количество клеток разных видов, отвечающих на антигены возбудителя, в том числе апудоцитов, клеток ретикулоэндотелиальной системы, гепатоцитов. 

7. Об эффективности  защиты  морских свинок, предварительно иммунизированных вакцинными штаммами Y. pestis EV линии НИИЭГ и F. tularensis 15 линии НИИЭГ, при введении  вирулентных культур этих микроорганизмов свидетельствует отсутствие  выраженных изменений морфометрических параметров, отражающих  функциональное состояние печени, почек, аэрогематического барьера легких, клеток нейроэндокринной системы макроорганизма.

8.  Выявлен фазный характер изменений количества и морфофункционального состояния нейроэндокринных клеток в лимфоидных органах и легких при подкожном и аэрогенном  способах иммунизации биомоделей вакциной Y. pestis EV, отражающий  направленность процессов иммуногенеза  и выраженность стресс-реакции макроорганизма.

9.  Для повышения объективности характеристики безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности живых вакцин против чумы и туляремии с помощью  экспертной системы  предложен алгоритм оценки степени тяжести экспериментальной инфекции и адаптационно-компенсаторных реакций  у биомоделей при моделировании вакцинного процесса, основанный на применении морфометрических показателей: ядерно-цитоплазматического индекса светлых гепатоцитов, деструктивного индекса, перфузионно-вентиляционного отношения, количества и морфофункционального состояния нейроэндокринных клеток (в лимфоидных органах, легких, надпочечниках) и клеток ретикулоэндотелиальной системы, определяемых с использованием  аппаратно-программных компьютерных  комплексов. 

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Бугоркова С.А., Грачева И.В., Исупов И.В.,  Валова Т.В., Плотников О.П. Сравнительная характеристика патогенного действия холерных вибрионов не 01 группы  0139 серовара и 01 группы на APUD-систему кишечника крольчат-сосунков //  Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. –1999.- № 3.- С. 10-13.
  2. Бугоркова С.А. Экспериментальное изучение состояния апудоцитов кишечника и иммунокомпетентных органов при противохолерной вакцинации // Избранные проблемы педиатрии.- Саратов: Из-во СГМУ,  2000.- С. 13-15.
  3. Бугоркова С.А., Исупов И.В.,  Бугоркова Т.В.,  Майоров Н.В.,  Кутырев В.В. Состояние APUD-системы кишечника и морфологические изменения во внутренних органах взрослых кроликов, зараженных токсигенными холерными вибрионами // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2000.- № 3.- С. 11-14.
  4. Бугоркова С.А., Исупов И.В.  APUD- система кишечника животных при холерной инфекции, интоксикации и вакцинальном процессе // Рук. Деп. В ВИНИТИ 09.11.2000 № 2825-В-2000.
  5. Бугоркова С.А., Исупов И.В. Экспериментальные данные сравнительной патоморфологической оценки действия холерных вибрионов 01- и 0139 серогрупп / С.А. Бугоркова, И.В. Исупов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2001.- № 2.- С. 6-9.
  6. Бугоркова С.А.,  Чеховская Г.В., Ливанова Л.Ф., Смирнова Н.И. Морфологический анализ инфекционного процесса, обусловленного капсульными и бескапсульными вариантами холерных вибрионов 0139 серовара // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии межведомственного научного совета по  санитарно-эпид.  охране террит. РФ.- Ростов-н/Д, 2001.- Вып. № 14. - С. 70-72.
  7. Бугоркова С.А., Исупов И.В. Анализ компенсаторных возможностей организма при противохолерной иммунизации // Пробл. особо опасных инфекций .- 2001.- Вып. 81.- С. 141-147.
  8. Бугоркова С.А., Исупов И.В., Назарова Л.С., Елисеев Ю.Ю. Состояние апудоцитов при противохолерной вакцинации в эксперименте // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2001.- № 4.- С. 27-31.
  9. Бугоркова С.А., Назарова Л.С., Задумина С.Ю. Использование морфометрического анализа для оценки качества вакцин // Новые технологии в медицине: Матер. Всерос. науч.-практ. конф.- Саратов.- С. 48-49.
  10. Исупов И.В., Назарова Л.С., Бугоркова С.А., Кутырев В.В. Патоморфологические подходы к доклинической оценке холерных вакцин // Рук. деп. в ВИНИТИ 14.01.02 № 56-В-2002.
  11. Бугоркова С.А., Исупов И.В., Задумина С.Ю. Значение патоморфологической оценки при моделировании холерной инфекции методом RITARD // Проблемы морфологии: Общерос. конф. с междунар. участием.- Сочи.- 2002.- С.12.
  12. Бугоркова С.А., Исупов И.В., Задумина С.Ю. Использование некоторых морфометрических показателей для характеристики инфекционного процесса // Проблемы морфологии: Общерос. конф. с междунар. участием.- Сочи.- 2002.- С.15.
  13. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Назарова Л.С. Экспериментальное исследование эмбриотропного действия холерных вакцин // Проблемы морфологии: Общерос. конф. с междунар. участием.- Сочи.- 2002.- С.16.
  14. Анисимова Т.И., Дроздов И.Г.,  Щуковская Т.Н.,  Ерошенко Г.А.,  Саяпина Л.В., Назарова Л.С.,  Адамова Г.В., . Малыхина З.В., . Монахова Е.В.,. Куличенко А.Н.,  Задумина С.Ю.,  Бардахчьян Э.А., . Резников Ю.Б.,  Лоцманова Е.Ю.,  Миронова Н.П.,  Пуденкова О.С., . Емельянова Н.В.,. Фирстова В.В.,  Клюева С.Н.,  Малахаева А.Н.,  Касина И.В.,  Бугоркова С.А. Государственные доклинические испытания V. cholerae Eltor КМ-184, предлагаемого в качестве вакцинного // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии межведомственного научного совета по  санитарно-эпид.  охране террит. РФ.- Ростов-н/Д, 2002.- Вып. № 15. - С. 108-109.
  15. Лоцманова Е.Ю., Щуковская Т.Н., Исупов И.В.,  Емельянова Н.В.,  Фирстова В.В., Клюева С.Н., Бугоркова С.А., Кривенко Д.В. Моделирование холерной инфекции при помощи метода  RITARD // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии межведомственного научного совета по  санитарно-эпид. охране террит. РФ.-Ростов-н/Д, 2002.-Вып. № 15.-С.111-112.
  16. Лоцманова Е.Ю., Щуковская Т.Н., Фирстова В.В.,  Емельянова Н.В., Кравцов А.Л., Клюева С.Н.,  Бугоркова С.А.,  Дроздов И.Г., Кутырев В.В.  Оценка иммунологической эффективности оральных холерных вакцин при помощи метода RITARD // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии межведомственного научного совета по  санитарно-эпид.  охране террит. РФ.- Ростов-н/Д, 2002.- Вып. № 15. - С. 100.
  17. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Лоцманова Е.Ю., Щуковская Т.Н. Экспериментально-морфологическая характеристика эффективности противохолерных вакцинирующих препаратов // Холера:  Матер. VIII Рос. Науч.-практ. Конф.- Ростов-н/Д.- 2003.- С. 224-227.
  18. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Исупов И.В., Лоцманова Е.Ю.,  Щуковская Т.Н., Кутырев В.В. Морфологические подходы к оценке эффективности противохолерных  вакцин в эксперименте // Пробл. особо опасных инфекций.- 2003.- Вып. 86.- С. 108-116.
  19. Исупов И.В., Бугоркова С.А., Кутырев В.В.  Патоморфологические аспекты доклинических испытаний различных вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры - Саратов.- 2004.- 179 с.
  20. Бугоркова С.А., Щуковская Т.Н., Кутырев В.В. Реакция апудоцитов кишечника у иммунизированных животных при моделировании холерной инфекции // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии межведомственного научного совета по  санитарно-эпид.  охране террит. РФ.- Ростов-н/Д, 2004.- Вып. № 17. - С. 98-100.
  21. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Щуковская Т.Н.  Нейроэндокринные механизмы регуляции вторичного иммунного ответа при холерной инфекции // Матер. ХIХ съезда физиологического общества им. И. П. Павлова.- Екатеринбург, 2004. - С. 46-47.
  22. Кобкова И.М., Ливанова Л.Ф., Бугоркова С.А., Смирнова Н.И. Конструирование и изучение иммунобиологических свойств рекомбинантных штаммов Escherichia coli и  Vibrio cholerae, продуцирующих протективные  антигены  //  Окружающая Среда и здоровье: Матер. Всерос. Науч.-практ. Конф. молодых ученых и специалистов.- Суздаль.- 2005. - С. 350-353.
  23. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Щуковская Т.Н. Морфофункциональная характеристика кишечного барьера взрослых кроликов при экспериментальной холерной инфекции, обусловленной вибрионами 01- и 0139-серогрупп // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии межведомственного научного совета по  санитарно-эпид.  охране террит. РФ.- Ростов-н/Д, 2005.- Вып. № 18. - С. 120-122.
  24. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Щуковская Т.Н., Кутырев В.В. Исследование адаптационно-компенсаторных возможностей иммунного организма при  экспериментальной холере // Пробл. особо опасных инфекций.- 2005.- Вып. 1(89).- С. 59-62.
  25. Бугоркова С.А.  Состояние эффекторной зоны иммунной системы желудочно-кишечного тракта кроликов при экспериментальной холерной инфекции, обусловленной вибрионами 01- и 0139- серогрупп // Успехи современного естествознания. - 2005.- № 11.- С. 92-93.
  26. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Щуковская Т.Н., Кутырев В.В.  Участие апудоцитов в адаптивном процессе при экспериментальной холере в иммунном организме // Рук. Деп. в ВИНИТИ  18.07.05. № 1045-В-2005.
  27. Бугоркова Т.В.,  Осина Н.А., Бугоркова С.А., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio Cholerae биовара eltor серовара Ogawa (ctxA-, tcpA-, toxR-, zot-), используемый в иммунологических, генетических исследованиях и учебном процессе // Патент на изобретение № 2254371.- Опуб. 20.06.05.- Бюл. № 17.
  28. Бугоркова С.А., Ливанова Л.Ф.,  Кобкова И.М., Бугоркова Т.В.,  Коннов Н.П.,  Кузнецов О.С., Смирнова Н.И.  Ультраструктурные аспекты изучения влияния рекомбинантных штаммов холерного вибриона на организм биомодели  // Пробл. особо опасных инфекций.- 2006.- Вып. 1 (91).- С. 53-56.
  29. Бугоркова С.А., Коннов Н.П. Ультраструктурная характеристика слизистой оболочки кишечника  биомодели при введении рекомбинантных штаммов холерного вибриона // Рос. Конф. по электронной микроскопии.- Черноголовка, 2006.- С. 213.
  30. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю. Методические аспекты морфологической характеристики инфекционного и вакцинального процесса при чуме // Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней: VII Российский съезд врачей -инфекционистов.-  Журнал Ремедиум приволжье (Специальный выпуск для врачей).- 2006.- С. 74-75.
  31. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Щуковская Т.Н., Кутырев В.В. Методические аспекты проведения комплексного морфологического исследования на этапе разработки противохолерных вакцинных препаратов // Холера и патогенные для человека вибрионы:  Матер. пробл. комиссии межведомственного научного совета по  санитарно-эпид.  охране террит. РФ.- Ростов-н/Д, 2006.- Вып. № 19. - С. 105-107.
  32. Бугоркова С.А., Щуковская Т.Н., Задумина С.Ю. Патоморфологические аспекты изучения нейроэндокринных механизмов в становлении противохолерного иммунитета // Холера и патогенные для человека вибрионы:  Матер. пробл. комиссии межведомственного научного совета по  санитарно-эпид.  охране террит. РФ.- Ростов-н/Д, 2006.- Вып. № 19. - С. 137-138.
  33. Бугоркова С.А. Сравнительный морфометрический анализ инфекционного и вакцинального процессов при чуме // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в рамках Санкт-Петербургского саммита «Групп восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: Матер. VII межгосударственной науч.-практ. конф.- Оболенск, 2006.- С. 140-141.
  34. Бугоркова С.А., Белобородов Р.А., Дальвадянц С.М., Кутырев В.В. Морфологическая характеристика иммунокомпетентных органов морских свинок при ревакцинации живой и химической чумными вакцинами // Пробл. особо опасных инфекций.- 2007.- Вып. 1 (93).- С. 69-73.
  35. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Задумина С.Ю., Бугоркова С.А.,  Клюева С.Н., Щуковская Т.Н. Азурофильная дегрануляция нейтрофтлов крови in vitro у лиц, привитых живой чумной  вакциной  // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ.  об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол..- Москва. 2007.- Т.1.- С. 71.
  36. Бугоркова С.А. Совершенствование методического подхода к проведению патоморфологического исследования штаммов холерного вибриона с различной эпидемической значимостью // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ.  об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол..- Москва. 2007.- Т.1.- С. 133.
  37. Бугоркова С.А., Кутырев В.В., Бугоркова Т.В., Куличенко А.Н.  Способ оценки качества вакцинных препаратов против холеры // Патент на изобретение № 2301075.- Опуб.  20.06.07.- Бюл. № 17
  38. Бугоркова С.А., Щуковская Т.Н.,  Бугоркова Т.В.,  Задумина С.Ю. Реакция нейроэндокринных клеток лимфоидных органов взрослых кроликов в динамике формирования противохолерного иммунитета // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии: VIII конгресс общества иммунологов аллергологов.- М., 2007.- РАЖ.- № 3, приложение 1.- С. 15-16.
  39. Бугоркова С.А. Методические аспекты морфологического исследования приобретенной резистентности к чуме // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгосударственной науч.-практ. конф. государств-участников СНГ.- Саратов, 2007.- С. 179-181.
  40. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Щуковская Т.Н. Оценка эффективности противохолерных вакцин по ряду  морфофункциональных показателей  адаптационно-приспособительной реакции биомодели к холерной инфекции // Холера и патогенные для человека вибрионы:  Матер. пробл. комиссии межведомственного научного совета по  санитарно-эпид.  охране террит. РФ.- Ростов-н/Д, 2007.- Вып. № 20. - С. 134.
  41. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю.,  Бугоркова Т.В.,  Лоцманова Е.Ю.,  Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н., Кутырев В.В. Комплексный морфологический подход к оценке протективных свойств препаратов для специфической профилактики холеры // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2008.- № 1.- С. 31-34.
  42. Бугоркова С.А. Морфометрическая характеристика экспериментального противочумного вакцинного процесса // Современные технологии в  реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств: Матер. IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. – Волгоград.- 2008.- С.36-38.
  43. Киреев М.Н., Гусева Н.П., Полунина Т.А., Кравцов А.Л., Бугоркова С.А., Подборонова Н.А., Тараненко Т.М. Влияние наночастиц коллоидного серебра на иммунобиологические свойства капсульного антигена чумного микроба // Вестник Российской военно-медицинской академии.- 2008.- Приложение 2 (часть II).-  с. 486.
  44. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Кутырев В.В. Реакция клеток APUD-системы экспериментальных биомоделей на подкожную  иммунизацию вакцинным штаммом Yersinia pestis  ЕВ // Пробл. особо опасных инфекций.- 2008.- №. 3 (97) - С.  46-49.
  45. Крепостнова И.М., Ливанова Л.Ф., Бугоркова С.А., Смирнова Н.И.  Изучение протективных свойств сконструированного диплазмидного  штамма V. cholerae  серогруппы О139, продуцирующего В-субъединицу холерного токсина и фактор колонизации кишечной палочки CFA/I // Пробл. особо опасных  инфекций.- 2008.- №. 3 (97) - С. 35-38.
  46. Бугоркова С.А., Куклев В.Е., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В. Сравнительный  морфометрический анализ экспериментальной чумной инфекции,  обусловленной Yersinia pestis штаммами с различной генетической характеристикой // Пробл. особо опасных инфекций.- 2008.- №. 4 (98) - С. 48-52.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.