WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ВИНОХОДОВ Дмитрий Олегович

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ

БИОТЕСТИРОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНФУЗОРИЙ

03.00.23 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург – 2007

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургском Государственном технологическом институте (техническом университете)

Научный консультант:  доктор химических наук, профессор

  Гинак Анатолий Иосифович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Михайлова Наталья Павловна

доктор биологических наук

Сухинин Александр Александрович

доктор химических наук

Орлов Антон Иосифович

Ведущая организация: Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия.

Защита диссертации состоится 19 октября 2007 г. в 13-00 в аудитории №61 на заседании Диссертационного Совета Д 212.230.04 при Санкт-Пе­тербургском Государственном технологическом институте (техни­чес­ком университете).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петер­бург­ского Государственного технологического института (технического уни­верситета).

Замечания и отзывы по данной работе в 1 экземпляре, заверенном печатью, просим направлять по адресу:

190013, С.-Петербург, Московский пр., 26, Санкт-Петербургский Го­сударственный технологический институт (технический университет), Ученый Совет.

Автореферат разослан 3 сентября 2007 г.

  Ученый секретарь

  Диссертационного Совета

Д 212.230.04, к. т. н., доцент  Т. Б. Лисицкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Одним из важных направлений прикладной биотехнологии является разработка эффективных биологических методов оценки состояния разнообразных объектов внешней среды, загрязнение которых токсичными веществами в настоящее время приобрело комплексный характер. Даже если бы было возможно определить содержание всех ксенобиотиков в объекте ис­следования, такая информация была бы недостаточна для каких-либо прогнозов, так как токсикометрические параметры установле­ны лишь для незначительной части этих веществ. Кроме того, результат комби­нированного действия двух и более токсич­ных веществ, имеющихся в исследуемом образце в небольших количествах, предсказать достаточно сложно. Соединения нетоксичные при изолированном действии могут вызывать значительный патологи­ческий эффект при комбинированном влиянии. Поэтому для оценки токсичности природных вод, промышленных сбросов, почвы, кормов и прочих объектов окружающей среды, а также новых химических веществ и внутренних сред организма человека и животных используют тесты на различных живых организмах. Предоставляя мало информации о природе поллютанта, биотестирование дает возмож­ность с большой степенью достоверности определить степень интегральной токсичности объекта исследования.

В числе организмов, на которых проводят биотестирование, присутствуют представители подцарства простейших. История применения Protozoa в качестве тест-организмов насчитывает не одно десятилетие. В то же время, развитие иных методов токсикологического анализа, таких как химические, физико-химические, иммунологические, а также использование биологической оценки на организмах из других систематических групп не снижают актуальности биотестов на простейших. Об этом говорит значительное число методических разработок, рекомендаций и публикаций, постоянно появляющихся в специализированных изданиях, а также их широкое использование на практике. Эти методы обладают высокой чувствительностью, экспрессностью, надежностью, универсальностью и малой себестоимостью. Они просты в проведении, поддаются инструментализации и автоматизации, а их результаты легко интерпретируемы. В отличие от химических и физико-химических методов анализа, биотестирование на инфузориях позволяет прогнозировать интегральное воздействие изучаемого объекта на живые организмы, поскольку реакция биологической тест-системы зависит не только от отдельных токсичных соединений, содержащихся в объекте исследования, но и от их взаимодействия между собой, а также от присутствия веществ, обладающих ярко выраженным влиянием на токсичность указанных соединений. А по сравнению с биотестами на высших животных оно обладает значительными преимуществами в экономической, методической и этической сферах.

Хотя в рассматриваемой области накоплен богатый фактический материал, в биологической науке до сих пор отсутствует единая концепция, описывающая биотестирование на инфузориях. Определения основных используемых терминов не получили точных и исчерпывающих формулировок, недостаточно изучена культура инфузорий, как система, по реакции которой производится оценка объекта внешней cреды, не выявлены закономерности ее реакции на неблагоприятные воздействия, не сформулированы принципы выбора тест-организмов. Как следствие, отсутствуют единые методы подготовки проб и культуры инфузорий как тест-системы к проведению анализа.

Недостаточность теоретического описания биотестирования на инфузориях влечет за собой разнообразные проблемы в практическом воплощении конкретных методик. Тест-организмы зачастую подбираются без учета их биологических особенностей, инфузории культивируют на нестандартных средах и в произвольных условиях, во многих методиках процесс подготовки тест-системы к анализу отсутствует как таковой, уровень чувствительности наблюдаемых тест-реакций далеко не всегда соответствует поставленным задачам, используемые для оценки степени проявления тест-реакции критерии в ряде случаев имеют малую информативность по сравнению с альтернативными. Все это приводит к огрублению результатов, неверной их интерпретации, снижению объективности выводов, а зачастую и к дискредитации биотестирования, как метода научного исследования.

По этим причинам в настоящее время особую важность приобретает вопрос о комплексном подходе к биотестированию. В первую очередь необходим глубокий теоретический анализ этой группы методов. Создание единой концепции оценки свойств объектов окружающей среды по реакции культуры инфузорий должно способствовать развитию, стандартизации и унификации уже разработанных методов, а также созданию новых, более совершенных.

Таким образом, можно заключить, что исследования в указанной области являются актуальными и имеют важное теоретическое и прикладное значение.

Цель и задачи исследования. C учетом вышеизложенного в работе ставилась цель: на основе теоретического осмысления и критического анализа литературных данных и результатов собственных исследований сформировать научные основы биотестирования на инфузориях как метода научного исследования.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1 Обобщить и систематизировать накопленный опыт в области оценки свойств различных объектов по реакции организмов группы Protozoa;

2 Сформулировать определения основных терминов, используемых в биотестировании;

3 Сформировать научное представление о культуре инфузорий как диагностической тест-системе и выявить основные закономерности процесса ее взаимодействия с объектами исследования;

4 Разработать принципы выбора тест-организмов и методы подготовки культуры инфузорий к проведению биотеста применительно к конкретным задачам биотестирования различных объектов окружающей среды;

5 Сформировать комплекс мер для стандартизации процесса биотестирования и управления основными параметрами тест-систем;

6 Разработать эффективный, экспрессный, недорогой биотест с использованием инфузорий, отвечающий сформулированным требованиям, опробировать его в производственных условиях и внедрить в практику.

Научная новизна. Обобщены и систематизированы исследования в области изучения реакций инфузорий на экстремальные химические воздействия, а также по их использованию в биотестировании.

Разработана система терминов, используемых в области биотестирования. На основе комплексного представления о процессе биотестирования составлена его схема и рассмотрены основные факторы, влияющие на него.

Проведено систематическое исследование процесса взаимодействия токсичных веществ и их смесей с культурой инфузорий на модели тест-реакций гибели и хемотаксиса. Выведены универсальные зависимости, описывающие этот процесс, получены параметры, численно характеризующие токсические свойства химических веществ и их смесей, а также состояние тест-системы.

Показаны пути для оптимизации биотестирования и сформирован комплекс мер для его стандартизации и для управления основными характеристиками культуры инфузорий, как тест-системы.

Предложены принципы выбора тест-организмов. В соответствии с ними выделен и предложен для научно-исследовательских работ и для практического использования штамм инфузории Colpoda steinii. Разработан и внедрен препарат для исcледования кормов в сельском хозяйстве на основе данного штамма. Разработана технология приготовления и налажено производство препарата.

Все это позволило создать целостную концепцию биотестирования как метода научного исследования.

Практическая ценность. Выделен, всесторонне охарактеризован и депонирован в коллекции микроорганизмов НИИ Особо чистых биопре­паратов производственный штамм инфузории Colpoda steinii П-1.

Разработана и утверждена на уровне Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ, а также на уровне Министерства аграрной политики Украины научно-техническая документация на препарат "Культура Colpoda steinii сухая для эколого-токсикологических исследований": технические условия и наставление по применению.

Разработанный метод оценки токсичности зернопродуктов включен в Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.7-97 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма: Методы определения токсичности", Государственный стандарт Украины ДСТУ 3570-97 "Зерно фуражне, продукти його переробки, комбiкорми: Методи визначення токсичностi" и в Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52337-2005 "Корма, комбикорма, комбикормовое сырье: Методы определения общей токсичности" в качестве экспресс-метода.

Совместно с редакцией журнала “Архив ветеринарных наук”, Всероссийским обществом протозоологов при РАН, Санкт-Петербургским государственным университетом и Международной академией информатизации организована и проведена Международная заочная научно-практическая конференция "Инфузории в биотестировании", Санкт-Петербург, 1998 г. В конференции приняли участие свыше ста специалистов из семи стран мира.

Результаты исследований и теоретические обобщения, приведенные в диссертации, могут быть использованы в учебном процессе по учебным курсам, связанным с биотехнологией, экологией, зоологией беспозвоночных, протозоологией, производством сельскохозяйственных кормопродуктов и санитарией кормов.

Апробация работы. Материалы работы доложены на следующих съездах, конференциях и заседаниях:

- заседания Ветеринарного фармакологического совета при Главном управлении ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации, Москва, в 1992 и 1999 гг.;

- Всероссийская конференция по совершенствованию мер про­филактики и борьбы с микотоксикозами птиц, Ломоносов, Все­российский научно-исследовательский ветеринарный институт пти­цеводства, 1992 г.;

- Международная конференция "Биотехнология-94", Санкт-Петер­бург, 1994 г.;

- заседание Всероссийского общества протозоологов, Санкт-Петербург, 1998 г.;

- Международная заочная научно-практическая конференция "Инфузории в биотестировании", Санкт-Петербург, 1998 г.;

- заседание Международной молодежной научной школы "Биоиндикация-98", Петрозаводск, 1998 г.;

- I съезд токсикологов России, Москва, 1998 г.;

- Заочная научно-практическая конференция "Биотехнология в Федеральной целевой программе «Интеграция»", Санкт-Петербург, 1999 г.;

- семинар "Контроль качества кормов" в Ленинградской областной ветеринарной лаборатории, Санкт-Петербург, 2000 г.;

- III научно-техническая конференция аспирантов СПбГТИ(ТУ), Санкт-Петербург, 2000 г.;

- Всероссийская научная конференция, посвященная 45-летию науч-но-исследовательской лаборатории питания и водоснабжения Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург, 2001 г.;

- Международная конференция молодых ученых "Химия и биотехно-логия биологически активных веществ, пищеваых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии", Тверь, 2002 г.;

- Межвузовская конференция "Микотоксины в экосистемах Санкт-Петербурга и Ленинградской области", Санкт-Петербург, 2002 г.;

- Всероссийская научно-практическая конференция "Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск", Санкт-Петербург, 2003 г.;

- VII Вишняковские чтения. Стратегия и тактика вузовской науки в регионе, Бокситогорск, 2004 г.;

- Всероссийская научно-техническая конференция "Успехи в специ-альной химии и химической технологии", Москва, 2005 г.;

- IV съезд Общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова, Пущино, 2006 г.

По пезультатам работы подготовлена и утверждена следующая научно-техническая документация:

- Временное наставление к экспресс-методу определения токсичности кормов, кормовых добавок, воды и органов павших и убитых животных с использованием культуры Colpoda steinii. Утверждено Государственным департаментом ветеринарии МСХиП РФ.

- Настанова по застосуванню культури Colpoda steinii (колпода) сухоi для еколого-токсикологiчних дослiджень об`ектiв зовнiшнього середовища тварин та птицi. Утверждена Гос. департаментом ветеринарной медицины МАП Украины.

- Культура Colpoda steinii сухая для эколого-токсикологических исследований: Технические условия. ТУ 9388-001-885-95. Утверждены Государственным департаментом ветеринарии МСХиП РФ.

- Культура Colpoda steinii суха для еколого-токсикологiчних дослiджень об`ектiв зовнiшнього середовища тварин та птицi: Технiчнi умови. ТУ У 46.15.243.-97. Утверждены Гос. департаментом ветеринарной медицины МСХиП Украины.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в тридцати девяти работах, в том числе, монографии и четырнадцати статьях. По материалам работы получено четыре патента РФ.

На основе оригинального метода биотестирования разработано три государственных стандарта: ГОСТ 13496.7-97, ДСТУ 3570-97 и ГОСТ Р 52337-2005.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 262 страницах машино­писного текста и включают в себя введение, обзор литературы, ма­териалы и методы исследований, результаты исследований, обсуж­дение, выводы и практические предложения. Материал иллюстри­рован 20 таблицами и 41 рисунком. Список основной исполь­зованной литературы содержит 319 наименование работ отечест­венных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Понятия и определения

Существенная часть нашей работы состоит в обсуждении вопросов терминологии, используемой в области биотестирования. Мы придаем этой проблеме особое значение, поскольку любая область науки, завершающая стадию формирования, должна получить связную и внутренне непротиворечивую систему понятий и определений.

Биотестирование как метод исследования используют специалисты различных областей науки: в экологической токсикологии для анализа вод и почв, в гуманитарной и ветеринарной медицине для исследования свойств внутренних сред высших организмов, в сельском хозяйстве для экспресс-тестирования кормов на общую токсичность, в химии для первичной оценки свойств новых веществ и так далее. При этом само понятие "биотестирование" зачастую истолковывают по-разному, приспосабливая этот термин к тому или иному узкому кругу задач и объектов, тем самым, обедняя его содержание и даже вкладывая в него различный смысл. Еще сложнее обстоит дело с производными терминами в этой области знания - они не только не имеют устоявшихся определений, но зачастую даже не являются общепринятыми. Комплексное рассмотрение биологических тестов позволило нам вычленить их общие черты и составить универсальную формулировку определения, в котором преодолены проблемы узости сферы использования биотестирования и адекватности описания биологической основы, на которой проводится тест. Итак, биотестирование - это оценка свойств изучаемого объекта по его воздействию на биоло­гическую тест-систему (далее - тест-систему) в стандартных условиях. Данная формулировка включает в сферу рассмотрения любые методы, в которых для изучения какого-либо явления используются биологические объекты. Это позволяет анализировать и сопоставлять биологические тесты, применяемые в разных областях, с единой точки зрения.

Введение в данное определение понятия “тест-система” не является случайным. Как правило, для обозначения живого элемента, на котором производится постановка биологического теста используют иные понятия, такие как “тест-организм” и “тест-объект”. Между тем в общем случае мы имеем дело не просто с отдельными организмами, а с биологической системой, имеющей внутреннюю структуру, определяемую связями между ее биологическими элементами и средой, в которой они находятся. Эта система может состоять из группы организмов одного вида, сооб­щества нескольких видов, целой экосистемы, или же может включать отдельные органы и ткани орга­низма, культуру клеток,  изолированные органеллы, фермен­ты и т. д. Эти биологические элементы распределены в среде и за­ключены в определенном объеме. Именно тест-система, а не просто отдельные живые организмы, является центральным элементом процесса биотестирования, и уяснение сути этого термина дает ключ к научному пониманию процесса биотестирования, как такового, а следовательно, и к целенаправленному управлению им. Тест-система - это пространственно ограниченная совокупность чувствительных биологических элементов и среды, в которой они находятся.

Из этой формулировки следует, что понятие “тест-объект” является составной частью понятия “тест-система” и органично включается в нее. Мы определяем этот термин следующим образом. Тест-объекты - это чувствительные  элементы, входящие в тест-систему. Они могут находиться в одном или различных физио­ло­гических состояниях, их пространственное распределение может быть равномерным, или же они могут концентрироваться в каких-либо областях (на дне сосуда, на его стенках, на твердом носителе, у скопле­ний пищи и т. д.).

Под термином же "тест-организм", который также достаточно часто используют специалисты, мы подразумеваем систематичес­кое наимено­вание тест-объекта вплоть до вида, штамма или клона.

Принцип, лежащий в основе биотестирования как процесса преобразования материального потока в информационный, мы представляем в виде схемы, показанной на рис. 1.

Рисунок 1 – Принципиальная схема биотестирования

Процесс постановки биологического теста начинается с того, что исследуемый образец переводят в состояние, удобное для проведения эксперимента, т. е. получают действующую форму, после чего осуществляют ее контакт с тест-системой. На тест-систему действует три группы факторов. Первая группа объединяет факторы исследуемого образца. К ним, например, относятся токсичные вещества, которые содержатся в исследуемом объекте. Воздействие факторов этой группы и подлежит оценке в процессе биотестирования, то есть является целевым. Вторая группа факторов объединяет различные посторонние воздействия и “шумовые” помехи. Это могут быть измене­ния темпера­туры, освещения и прочих условий, которые сказываются на состоянии тест-системы. Эти факторы не всегда удается учитывать и устранять, тем не менее необходимо стремиться к минимизации их воздействия. К третьей группе факторов относятся разнообразные воздействия, которые наносят на тест-систему намеренно с целью регулирования ее чувствительности. Эти воздействия играют роль физиологической нагрузки и их применение может повысить чувствительность тест-систем на один-два порядка.

В результате действия всех этих факторов тест-объекты и вся тест-система в целом претерпевают некоторую дефор­мацию, что проявляется в изменении состояния тест-системы и появлении ряда реакций на различных уровнях ее функцио­нирования. Эти реакции различают­ся по чувстви­тельности, скорости проявления, легкости наблюде­ния и другим параметрам. Одну или несколько из этих реакций вы­бирают в качестве тест-реакции. Этот термин мы определяем следующим образом. Тест-реакция - это одна из закономерно возникающих ответных реакций тест-системы на воздействие комплекса внешних факторов, выбранная для анализа состояния этой тест-системы.





По степени проявления тест-реакции судят о свойствах исследу­емого образ­ца. Определение степени проявления тест-реакции производится по некоторому крите­рию. При этом одной реакции может соответство­вать несколько различных критериев. Например, исследуя тест-реакцию гибели организмов, можно регистрировать либо количество погибших особей за оп­ределенный проме­жуток времени, либо время, за ко­торое погибает определенная часть задействованных в опыте животных. Тест-критерий - это показатель, на основании которого прово­дят оценку изменения состояния тест-системы, находящейся под воздействием комплекса внешних факторов.

Таким образом, основной результат биотестирования, оценка свойств исследуемого объекта, зависит от ряда факторов: способа донесения действующего начала до тест-системы, характе­ристик самой тест-системы (вида тест-организмов, из которых со­стоит тест-система, их коли­чества, состояния в момент тестирова­ния и состава среды, в которой они находятся), комплекса посто­ронних воздействий, выбранной тест-реакции и способа ее наблюде­ния, тест-критерия и, наконец, от квалификации исследователя. Проведенные исследования позволили проанализировать эти факторы, а также составить рекомендации по стандартизации биологических тестов и целенаправленному управлению ими. Рассмотрим эти вопросы подробнее.

Тест-система

Для корректной постановки и адекватной интерпретации результатов биологического теста необходимо создавать тест-системы определенного состава и перед использованием приводить их в строго нормированное начальное состояние.

Говоря о составе тест-системы, в первую очередь необходимо упомянуть ее небиологическую составляющую - среду, в которой распределены тест-объекты. Ее химический состав оказывает заметное влияние на чувствительность организмов к внешним воздействиям. Одни вещества, такие как белки, антиоксиданты, гумины и некоторые микроэлементы могут оказывать протекторное действие на клетки в процессе интоксикации. Другие, например, поверхностно-активные вещества и некоторые органические растворители даже в незначительных концентрациях, напротив, способны многократно усиливать воздействие токсичных веществ на живые объекты. По этой причине мы считаем, что тест-системы должны включать лишь те среды, которые готовят на основе растворов с известным и постоянным химическим составом. В наших экспериментах хорошо зарекомендовал себя минеральный раствор Лозина-Лозинского, он пригоден для работы со всеми инфузориями, которые были использованы в наших опытах.

Правильный подбор тест-организма является не менее важным, чем использование стандартной питательной среды. В наших экспериментах мы использовали инфузорий четырех видов: Colpoda steinii, Paramecium caudatum, Tetrahymena pyriformis и Stylonychia mytilus. Существенные морфологические и физиологические различия этих организмов обуславливают разнообразие сфер их использования в биологической практике. И хотя до настоящего времени не сделано обоснованного выбора универсального тест-объекта, идеально пригодного для любых методик биотестирования, более того, существует мнение, что таковой не может быть найден в принципе, анализ индивидуальных особенностей перечисленных инфузорий, а также сравнение их чувствительности к ряду токсичных веществ позволили нам сформулировать общие требования, которым должны отвечать инфузории, рассматриваемые в качестве кандидатов на роль тест-организмов. Они таковы: идентификация вплоть до вида и штамма (клона); возможность обеспечения постоянства генетических и физиологических характеристик штамма (клона); простота культивирования; высокая чувствительность к основным поллютантам; наличие легко наблюдаемых тест-реакций.

При подборе вида инфузории для каких-либо специфических биологических тестов могут быть составлены и другие дополнительные требования, но указанные выше сохраняют свое значение.

Помимо вопроса о составе тест-системы, существенное значение имеет проблема нормирования ее начального состояния, которое зависит от физиологического состояния тест-объектов, входящих в нее, то есть от фазы роста культуры и стадии жизненного цикла каждой отдельной инфузории. Эти два параметра должны подвергаться стандартизации. В наших экспериментах было показано, что чувствительность культуры Colpoda steinii, находящейся на постцистной стадии развития, к мертиолату почти вдвое выше, чем в фазе экспоненциального роста. В то же время, по данным ряда авторов, чувствительность инфузорий Tetrahymena pyriformis, не имеющих в жизненном цикле стадии цисты покоя, в экспоненциальной фазе роста выше, чем в стационарной. Таким образом, можно заключить, что оптимальным для постановки биологического теста состоянием культуры инфузорий, с точки зрения чувствительности ответной реакции, является постцистная стадия жизненного цикла у цистобразующих видов и фаза экспоненциального роста у инфузорий, которые не имеют стадии цисты покоя.

Нормирование тест-системы по стадии жизненного цикла, входящих в ее состав инфузорий, может быть осуществлено с использованием разнообразных методов синхронизации. Как правило, применяют синхронизацию с помощью серии температурных шоков. Этот метод имеет высокую эффективность, но его практическое использование затруднено вследствие трудоемкости и значительных временных затрат на его проведение. Поэтому, хотя в ряде специальных биологических тестов шоковую синхронизацию продолжают применять, при проведении масштабного биотестирования от нее рекомендуют воздерживаться. В своих исследованиях мы использовали иной метод синхронизации. Он относится к группе механических или селективных методов и заключается в том, что заранее подготовленные цисты покоя инфузории Colpoda steinii подвергают индуцированному эксцистированию. Данный способ достаточно эффективен и весьма прост в использовании, его пригодность в практическом применении служит весомым аргументом при выборе тест-организма для постановки биологического теста.

В результате мы получали синхронизированную культуру инфузорий, но оценку степени ее синхронизированности проводили не по общепринятому методу, который заключается в наблюдении за процессом единовременного деления клеток культуры, а исходя из той физиологической характеристики, которая интересует нас в первую очередь - чувствительности клеток к токсичным веществам. Полученный нами индекс синхронизированности показывает, во сколько раз время гибели 100% клеток инфузорий превышает время гибели 50% клеток, и может служить характеристикой генетической и физиологической однородности тест-системы. Его вид будет обсуждаться ниже, сейчас лишь укажем, что на постцистной стадии жизненного цикла культуры Colpoda steinii его величина составляла 1,07. Это означает, что время, в течение которого погибают все клетки в культуре, превышает время гибели половины из них на 7%. Столь низкую величину индекса синхронизированности можно объяснить тем, что мы использовали специально выделенный штамм данного вида инфузории, а также тем, что макронуклеус Colpoda stei­nii на постцистной стадии жизненного цикла тетраплоиден, как и у только что разделившейся клетки. Индекс синхронизированности культуры инфузорий в экспоненциальной фазе роста составлял 1,24. То есть однородность такой культуры была значительно ниже, чем в синхронизированной культуре на постцистной стадии жизненного цикла. Соответственно, и ответная реакция тест-системы, в состав которой входят инфузории, взятые из культуры, находящейся в экспоненциальной фазе роста, на воздействие токсичного вещества оказывается растянутой во времени, менее однозначной и труднее интерпретируемой.

Таким образом, проблема нормирования первоначального состояния тест-систем, используемых в биотестировании, может быть решена с помощью регулирования двух параметров - фазы роста культуры и стадии жизненного цикла клеток, входящих в ее состав.

Тест-реакция и тест-критерий

В зависимости от природы и интенсивности возмущающего воздействия реакции тест-системы могут проявиться на различных уровнях ее функционирования. Например, катионы кадмия в концентрации порядка 10-3% вызывают гибель клеток инфузорий. В концентрации на порядок ниже этот агент уже не приводит клетки к гибели, но вызывает хемотаксическую реакцию. По данным многочисленных исследователей, наблюдение более тонких реакций, таких как угнетение роста, ингибирование ферментных систем, изменение частоты конъюгации и других, позволяет регистрировать еще меньшие концентрации токсичных веществ.

Кроме чувствительности, ответные реакции тест-систем характеризуются различной скоростью проявления и легкостью наблюде­ния. Существенное значение имеет и проблема адекватности тест-реакции моделируемому процессу воздействия внешнего фактора на биологические объекты, тесно связанная с уровнем организации тест-системы и интегральностью тест-реакции.

Таким образом, одним из важных вопросов биотестирования является выбор одной из ответных реакций тест-системы в качестве тест-реакции. Он может быть решен лишь с учетом специфических особенностей задач, стоящих перед исследователем в каждом отдельном случае. Но можно сформулировать общие требования, которым должна отвечать тест-реакция. По нашему мнению, они таковы: достаточная чувствительность к изучаемому фактору; высокая экспрессность; соответствие уровня организации тест-системы уровню моделируемого процесса; интегральность; нетребовательность к специальному оборудованию; нетребовательность к квалификации персонала.

Выбор тест-критерия ряд авторов также предлагают осуществлять согласно определенным требованиям. По нашему мнению, наиболее целесообразно использовать следующие: эффек­тивность; универсальность; количественность и возможность выражения одним числом; наличие биологического смысла; простота и легкость интерпретации и вычисления; сопоставимость при получении в разные сроки наблюдения.

В наших исследованиях мы изучали две тест-реакции. Первая из них, тест-реакция гибели, была подробно исследована на модели инфузории Colpoda steinii. В качестве тест-критерия для оценки степени проявления этой тест-реакции можно регистрировать либо количество погибших особей за оп­ределенный проме­жуток времени, либо время, за ко­торое погибает определенная часть задействованных в опыте животных. Поскольку при работе с инфузориями Colpoda steinii используют весьма значительное количество клеток, а также вследствие высокой степени синхронизированности культуры этой инфузории на постцистной стадии жизненного цикла, мы применяли второй из этих тест-критериев.

1 - кривая для ЛЭ50; 2 - кривая для ЛЭ100

Рисунок 2 – Обобщенные кривые "концентрация - время"

Была исследована реакция инфузорий на мертиолат, бутанол, глутаровый альдегид, фенол, о-толуидин, фенилгидразин сульфат, 2,4-Д, гексахлоран, хлорофос, метафос, этафос, а также на неорганические соли, содержащие катионы Cd2+, Cu2+, Hg2+, Pb2+ и Zn2+. Во всех изученных случаях зависимость времени гибели клеток инфузории от концентрации вызывающего эту гибель токсичного вещества ("концентрация - время") имела характерный вид. Обобщенные кривые, описывающие этот процесс, показаны на рис. 2. Уравнение регрессии для этих кривых представляет собою степенную функцию:

где: τ - время гибели некоторой доли организмов в популяции, C - концентрация токсичного вещества в растворе, A - норми­рующий коэффициент, зависящий от регистрируемой доли гибнущих организмов, b - коэффициент в показателе степени, биологический смысл которого указан ниже.

Так как тест-система в общем случае представляет собой неоднородную совокупность клеток, их гибель про­исходит не одномоментно, а с некоторым временным разбросом. Поэтому графическое описание процесса взаимодействия ток­сичного вещества с популяцией живых организмов в координатах "концентрация - время" представляет собой семейство изоэффективных кривых, описы­ваемых приведенной выше формулой, которые отличаются между собой только коэф­фициентом A. Вид полученных кривых "концентрация - время" для Colpoda steinii соот­ветствует описанному в литературе для ракообразных Daphnia mag­na, что позволяет говорить об универсальности данной зависимости для живих систем. Использование изоэффективных уровней воздействия предполагает использование такой величины, как летальная экспозиция для 50% и 100% клеток (LE50 и LE100) вместо летальной концентрации (летальной дозы) этого вещества, вызывающей гибель 50% или 100% тест-объектов в течение фиксированного промежутка времени. Анализ зависимости "концентрация - время" позволяет получить единую систему парамет­ров, характеризующих тест-систему, процесс ее взаимодействия с токсичным веществом и само исследуемое токсичное вещество. Использование этих кривых дает в ру­ки токсикологов важный инструмент для сравнения различных тест-систем по их чувствительности и однородности. Величина вре­менного разброса гибели клеток  (а следовательно, и разница меж­ду нормирующими коэффициентами A1 и A2 и графиками на рис. 2) будет тем мень­ше, чем клетки ближе друг к другу генетически и по физиологи­ческому состоянию, то есть, чем однороднее тест-система. Поэтому генетическая и физиологическая однородность тест-системы, как было сказано ранее, может быть охарактеризована при помощи индекса синхронизиро­ванности - отношения нормирующих коэффициентов A2 и A1:

Токсичное вещество характеризуется уже двумя параметрами: пределом обнаружения, который показывает, в какой концентрации вещество вызывает гибель 50% клеток инфузорий в течение 3 часов:

и коэффициентом b, который определяет вероятность возникновения неблагоприятного эф­фекта при повышении концентрации токсичного вещества, иными словами, токсикологическую широту действия вещества.

Необходимо отметить, что уравнение "концентрация - время" удачно описы­вает экспериментальные данные в области больших и средних кон­цен­траций токсичных веществ. В области же малых концентраций могут наблюдаться отклонения экспериментальных данных от тео­ретической кривой. Мы склонны объяснять этот факт проявлением различных адаптационных механизмов клеток инфузорий, частично компенсирующих воздействие повреждающего фактора. Кроме того, при большом времени экспозиции (несколько часов и более) может воз­никать эффект десинхронизации культуры. Вследствие этого кри­вые, которые должны ассимптотически приближаться к оси ординат, на самом деле не пересекают некоторую вертикальную линию, за которой концентрация токсичного вещества настолько мала, что не вызывает гибели клеток.

Сравнение чувствительности к токсичным веществам тест-реакции гибели Colpoda steinii и высших животных показывает, что инфузории реагируют на концентрации на один-два порядка ниже, чем теплокровные. Об этом наглядно свидетельствуют материалы таблицы 1. В последней графе указана концен­трация токсичного вещества в экстракте исследуемого корма при соотношении экстрагента и навески пробы корма 5 : 1, полноте экс­тракции 100% и содержании токсина в пробе в количестве, приво­дящем к гибели 50% подопытных теплокровных животных, считая условно, что животное съедает в сутки количество корма, эквивалентное 10% своего веса.

Из материалов таблицы видно, что чувствительность данного тест-объекта к изученным токсичным веществам выше, чем у теплокровных животных. Таким образом, тест-реакция гибели инфузории Colpoda steinii может быть использована для анализа объектов внешней среды в области острой токсичности.

Таблица 1 – Оценка чувствительности тест-реакции гибели инфузории Colpoda steinii к токсичным веществам в сравнении с теплокровными животными

Вещество

Предел обнаружения, %

ЛД50, мг/кг ве­са тела

Содержание в экстракте, %

Cu2+

1,56.10-3

248,5

49,7.10-3

Cd2+

1,39.10-3

53,9

10,77.10-3

Hg2+

1,52.10-4

12,9

25,86.10-4

Мертиолат

4,93.10-4

75,0

150,0.10-4

2,4-Д

8,96.10-3

100,0

20,0.10-3

Этафос

1,81.10-3

250,0

50,0.10-3

Вторая тест-реакция, которую мы использовали в экспериментах, это тест-реакция хемотаксиса. В качестве тест-критерия нами было выбрано отношение показания прибора "Биотестер" в опыте к его показанию в контроле, выраженное в процентах. Данный тест-критерий характеризует относительное количество клеток инфузорий, перешедших в верхнюю фазу оптической кюветы, содержащую анализируемый образец, по сравнению с контролем.

Показано, что количество клеток инфузорий, перешедших в верхнюю фазу кюветы, содержащую токсичное вещество, за определенный промежуток времени находится в зависимости от концентрации этого вещества (зависи­мость "концентрация - эффект"). В области, в которой тест-критерий находится в пределах 10-70%, данная зависимость может быть описана уравнением прямой линии. За пределами этой области наблюдаются отклонения экспериментальных данных от линии регрессии. В качестве характеристики токсичности вещества мы выбрали концентрацию этого вещества, при которой величина тест-критерия составляет 50%.

Сопоставление чувствительности тест-реакции хемотаксиса инфузории Paramecium caudatum со стандартными характеристиками токсичных веществ (таблица 2) показывает, что данная тест-реакция может быть использована для оценки объектов окружающей среды при работе с концентрациями некоторых токсичных веществ, приближающихся к области предельно допустимых концентраций.

Таблица 2 – Оценка чувствительности тест-реакции хемотаксиса инфузории Paramecium caudatum к токсичным веществам в сравнении с гигиеническими параметрами

Токсичное

вещество

Cd2+

Cu2+

Zn2+

Фенол

ПДК, %

6,0.10-7

2,6.10-6

4,8.10-5

1,0.10-7

C50, %

8,0.10-5

6,6.10-5

8,3.10-5

7,1.10-3

В процессе экспериментов обе тест-реакции показали постоянные уровни чувствительности к изученным токсичным веществам, высокую экспрессность, информативность и удобство в использовании, что дает основания к рекомендации их для практического применения.

Воздействия на тест-систему

В общем случае ответные реакции формируются в тест-системе, как результат целого комплекса внешних воздействий. Основным из них, интересующим исследователя в первую очередь, является фактор исследуемого образца. Как правило, практические работники имеют дело с комплексным загрязнением исследуемых объектов окружающей среды.  И ценность биотестирования во многом обусловлена возможностью проводить оценку интегральной токсичности объекта исследования. Однако проблема действия смесей токсичных веществ на живые организмы и, в частности, на инфузорий все еще остается недостаточно изученной. Поэтому важной частью нашей работы явилось исследование комбинированного воздействия различных токсичных веществ на используемые тест-системы. Были изучены бинарные смеси веществ с единым предполагаемым механизмом действия (катионы кадмия - катионы цинка, катионы кадмия - катионы меди) и смеси соединений, относящихся к различным группам токсичных веществ (катионы кадмия в сочетании с 2,4-Д, метафосом, фенолом, а также глутаровым альдегидом). В каждой серии опытов одно из двух веществ пребывало в постоянной концентрации и служило фоном, а концентрацию второго вещества мы меняли в некоторых пределах. Кривые “концентрация - время”, построенные по материалам исследований, позволили провести оценку характера комбинированного воздействия изученных бинарных смесей.

При этом удалось выявить два различных характера взаимовлияния токсичных веществ при их взаимодействии с тест-системой. Аддитивный тип взаимовлияния веществ наиболее ярко может быть продемонстрирован на примере раствора, содержащего катионы цинка и кадмия (рис. 3), а также катионы меди и кадмия. Токсический эффект, вызываемый смесью, складывается из токсических эффектов, вызываемых каждым компонентом такой смеси при их изолированном воздействии.

Фоновая концентрация катионов цинка: 1 - 0%; 2 - 0,8.10-3%; 3 - 1,25.10-3%;

4 - 1,7.10-3%.

Рисунок 3 – Комбинированное влияние катионов кадмия и цинка

на клетки Colpoda steinii

Происходит это, вероятно, по причине того, что механизм действия этих веществ на тест-систему един. При изменении концентрации фонового компонента кривая “концентрация - время” смещается вдоль оси абсцисс на величину, пропорциональную данному изменению (рисунок 4). При низких концентрациях фонового компонента данный процесс может быть описан формулой:

где: А - нормирующий коэффициент, b - коэффициент, определяющий токсикологическую широту действия основного компонента смеси, С1 - молярная концентрация основного компонента смеси, С2 - молярная концентрация фонового компонента смеси, Спр1 - предел обнаружения основного компонента смеси [моль/л], Спр2 - предел обнаружения фонового компонента смеси [моль/л].

1 - кривая “концентрация - время” при отсутствии Zn2+;

2 – кривая “концентрация - время” при фоновой концентрации Zn2+ 0,8.10-3%;

1` - отображение профиля кривой 1, иллюстрирующее аддитивный характер

взаимодействия катионов двух металлов

Рисунок 4 – Характер комбинированного воздействия катионов Cd2+ и Zn2+

При повышении концентрации фонового компонента до величин, близких к пределу обнаружения, эффект действия смеси был несколько ниже суммы эффектов влияния компонентов при их изолированном применении, что говорит об отклонении характера действия смеси катионов тяжелых металлов от аддитивности в сторону антагонизма. При этом изменялась токсикологическая широта действия смеси, что сопровождалось изменением абсолютного значения коэффициента “b” в показателе степени уравнения. По нашему мнению, это обусловлено повышением вклада фонового компонента в суммарный эффект действия смеси, а также конкуренцией катионов тяжелых металлов, возникающей в процессе их взаимодействия с молекулами-мишенями.

Характер взаимовлияния токсичных компонентов близкий к аддитивному был выявлен также при исследовании смесей метафоса с катионами кадмия, а также фенола с катионами кадмия. Токсикологическая широта действия смеси метафоса и катионов кадмия при введении метафоса, как фонового компонента, расширялась. О смеси фенола и катионов кадмия подобного заключения сделать не удалось ввиду того, что кривые “концентрация - эффект” при комбинированном действии этих двух веществ не соответствуют виду степенной функции.

Антагонистический тип взаимовлияния токсичных компонентов смеси был выявлен при исследовании смесей 2,4-Д с катионами кадмия, а также глутарового альдегида с катионами кадмия. Хотя результат действия смесей этих веществ и превышал эффекты от их изолированного влияния, он был меньше суммы этих эффектов. При этом токсикологическая широта действия смеси при изменении соотношения ее компонентов либо не изменялась, как в случае с 2,4-Д и катионами кадмия, либо уменьшалась (смесь глутарового альдегида и катионов кадмия).

Помимо токсичных соединений, присутствующих в исследуемом образце изначально, в процессе постановки биологического теста могут участвовать и иные вещества, так как хотя одни объекты окружающей среды, такие как природные и сточные воды, удается исследовать непосредственно, другие предварительно приходится переводить в действующую форму, которая может представлять собой экстракт, эмульсию либо суспензию. В связи с использованием в этих целях органических растворителей и ПАВ встает вопрос об их воздействии на тест-систему. Нами была изучена чувствительность инфузорий к органическим растворителям - этанолу, ацетону, ДМСО и поверхностно-активным веществам - твину-80, тритону Х-305, додецилсульфату натрия, неонолу П-6 и неонолу П-9-12. Полученные данные позволяют говорить о том, что для суспензирования не растворимых в воде токсичных веществ целесообразно применять этанол, ДМСО, ацетон, тритон X-305 и твин-80, так как эти вещества не обладают высокой токсичностью по отношению к инфузориям. Токсическое действие ДСН и поверхностно-активных веществ группы неонолов, напротив, ярко выражено. Но при использовании указанных растворителей и ПАВ для подготовки действующих форм необходимо учитывать их влияние на чувствительность тест-систем к токсичным веществам.

Таблица 3 – Комбинированное действие органических растворителей и токсичных веществ (Colpoda steinii, тест-реакция гибели)

Растворитель

Токсичное вещество

Наимен.

Конц-ия, %

Cd2+

Спр, %;

b

Cu2+

Спр, %;

b

Zn2+

Спр, %;

b

фенол

Спр, %;

b

-

-

1,39.10-3;

-3,24

1,56.10-3;

-2,79

2,05.10-3;

-1,79

38,5.10-3;

-1,90

ДМСО

2,5.10-3

0,65.10-3;

-2,26

1,28.10-3;

-2,49

1,09.10-3;

-1,64

30,3.10-3;

-1,89

50.10-3

0,49.10-3;

-2,15

1,19.10-3;

-2,47

0,95.10-3;

-1,59

28,0.10-3;

-1,88

ацетон

0,5

0,45.10-3;

-1,85

1,07.10-3;

-2,37

0,65.10-3;

-1,53

36,7.10-3;

-1,90

2,5

0,32.10-3;

-1,67

1,05.10-3;

-2,36

0,48.10-3;

-1,45

35,1.10-3;

-1,90

0,96

-

1,34.10-3;

-2,79

-

-

этанол

1,90

0,58.10-3;

-1,78

-

0,93.10-3;

-1,61

26,9.10-3;

-1,92

3,20

0,51.10-3;

-1,73

-

-

24,2.10-3;

-1,91

Нами изучены комбинации растворов, содержащих фенол и катионы тяжелых металлов (кадмия, меди и цинка) в сочетании с ДМСО, ацетоном, этанолом, твином-80, ДСН и тритоном Х-305, использованными в качестве фонового компонента в концентрациях, которые при изолированном действии не вызывали заметного эффекта. Для каждой пары веществ были построены серии кривых “концентрация - время”, по этим кривым была проведена оценка характера комбинированного воздействия веществ. Во всех изученных сочетаниях токсичных веществ с органическими растворителями наблюдался эффект потенцирования, то есть эффект действия смеси значительно превышал сумму эффектов ее компонентов при их изолированном воздействии. При этом предел обнаружения токсичного вещества снижался в 1,5 - 4 раза. Токсикологическая широта действия при добавлении органического растворителя повышалась лишь у катионов тяжелых металлов, а у фенола статистически достоверных изменений не претерпевала (таблица 3).

Таблица 4 – Комбинированное действие ПАВ и токсичных веществ (Colpoda steinii, тест-реакция гибели)

ПАВ

Токсичное вещество

Наимен.

Конц-ия, %

Cd2+

Спр, %;

b

Zn2+

Спр, %;

b

фенол

Спр, %;

b

-

-

1,39.10-3;

-3,24

2,05.10-3;

-1,79

38,5.10-3;

-1,90

Твин-80

2.10-3

0,45.10-3;

-1,57

0,57.10-3;

-1,43

18,3.10-3;

-1,91

20.10-3

0,28.10-3;

-1,54

-

-

0,2.10-3

1,06.10-3;

-3,23

-

-

ДСН

2.10-3

0,56.10-3;

-3,19

0,55.10-3;

-1,45

25,8.10-3;

-1,88

20.10-3

-

-

18,0.10-3;

-1,89

Тритон X-305

2.10-3

1,11.10-3;

-3,23

0,59.10-3;

-1,45

19,7.10-3;

-1,65

20.10-3

0,99.10-3;

-3,24

0,41.10-3;

-1,41

17,7.10-3;

-1,63

Влияние поверхностно-активных веществ было во многом подобно действию органических растворителей. Во всех изученных смесях наблюдали эффект потенцирования. При этом предел обраружения изученных токсичных веществ снижался в 2-5 раз. Однако токсикологическая широта действия изменялась не во всех случаях. Так, тритон X-305 и додецилсульфат натрия не снижали коэффициент “b” для катионов кадмия, а твин-80 и додецилсульфат натрия не снижали этот коэффициент для фенола (таблица 4).

Влияние органических растворителей и поверхностно-активных веществ на чувствительность хемотаксической реакции инфузорий к изученным токсичным веществам также оказалось ярко выраженным.

Таблица 5 – Комбинированное действие органических растворителей, ПАВ и токсичных веществ (Paramecium caudatum, тест-реакция хемотаксиса)

Растворитель

Токсичное вещество

Наимен.

Конц-ия, %

Cd2+

C50, %

Cu2+

C50, %

Zn2+

C50, %

фенол

C50, %

-

-

8,0.10-5

6,6.10-5

8,3.10-5

7,1.10-3

Твин-80

0,1

-

-

-

1,8.10-3

1,0

1,8.10-5

2,8.10-5

6,8.10-5

-

ДСН

0,001

5,5.10-5

5,5.10-5

5,8.10-5

6,2.10-3

0,002

2,2.10-5

1,0.10-5

3,8.10-5

2,7.10-3

ДМСО

0,01

3,4.10-5

6,1.10-5

5,1.10-5

6,9.10-3

0,1

-

4,3.10-5

3,0.10-5

4,3.10-3

Так, в присутствии твина-80, додецилсульфата натрия или ДМСО концентрация изученных токсичных веществ, которая создавала уровень относительной токсичности равный 50% (C50), снижалась в 2-6 раз (таблица 5), при этом чувствительность тест-реакции возрастала настолько, что вплотную приближалась к показателям ПДК катионов цинка и меди.

Исходя из вышеизложенного можно заключить, что токсичность при комбинированном воздействии нескольких различных веществ в общем случае не является аддитивной величиной. Некоторые токсичные вещества способны снижать эффект воздействия в сочетании с другими веществами, а иные, не являясь сами по себе токсичными, могут увеличивать токсический эффект действия токсикантов. По этой причине мы полагаем, что термин "суммарная токсичность", часто используемый в литературе, не адекватно отражает описываемое явление. Более правильно применять термин "интегральная токсичность". Кроме того, результаты экспериментов говорят о том, что только методы биотестирования могут дать адекватное представление о воздействии смесей различных химических веществ на живые системы.

Изучение влияния органических растворителей и ПАВ на чувствительность тест-систем к токсичным веществам имеет и другой важный аспект. Практическое использование биологических тестов часто ставит перед исследователями задачу целенаправленного искусственного изменения порога реагирования тест-системы на внешние воздействия. Для этого могут быть использованы так называемые физиологические (функциональные) нагрузки. Их роль заключается в искусственном изменении состояния тест-системы путем того или иного стрессового воздействия. Механизмы подобных воздействий на живую клетку могут быть достаточно разнообразными. В одних случаях клетка вынуждена компенсировать влияние нагрузки путем перестройки метаболизма и расходовать на это часть своих внутренних ресурсов. При этом снижаются возможности клетки для противодействия влиянию исследуемого токсичного вещества и, соответственно, увеличивается чувствительность к нему. Другие факторы, изменяя транспортные возможности поверхностных структур клетки, облегчают проникновение токсичных веществ в цитоплазму, тем самым усиливая их влияние на клетку. В числе последних факторов особый интерес вызывают органические растворители и ПАВ.

В качестве характеристики влияния вещества, выбранного в качестве функциональной нагрузки, мы использовали коэффициенты потенцирования, которые представляют собой отношения пределов обнаружения токсичного вещества при изолированном действии и в присутствии фонового компонента:

 

где: Kd и Kt - коэффициенты потенцирования для тест-реакций гибели и хемотаксиса соответственно, Cпр и Cпр.к - пределы обнаружения вещества по тест-реакции гибели при изолированном действии и в присутствии фонового компонента, C50 и C50к - пределы обнаружения вещества по тест-реакции хемотаксиса при изолированном действии и в присутствии фонового компонента.

Таблица 6 – Коэффициенты потенцирования при комбинированном действии ПАВ и органических растворителей с токсичными веществами на тест-системы

ПАВ или

Конц-ия,

Токсичное вещество

растворитель

%

Cd2+

Cu2+

Zn2+

фенол

Kd (вне скобок) и Kt (в скобках)

2,5.10-3

2,1

1,2

1,9

1,3

ДМСО

10.10-3

(2,4)

(1,1)

(1,6)

(1,0)

50.10-3

2,8

1,3

2,2

1,4

100.10-3

-

(1,5)

(2,8)

(1,7)

Ацетон

0,5

3,1

1,5

3,2

1,1

2,5

4,3

1,5

4,3

1,1

0,96

-

1,2

-

-

Этанол

1,90

2,4

-

2,2

1,4

3,20

2,7

-

-

1,6

2.10-3

3,1

-

3,6

2,1

Твин-80

20.10-3

5,0

-

-

-

100.10-3

-

-

-

(3,9)

1,0

(4,4)

(2,4)

(1,2)

-

0,2.10-3

1,3

-

-

-

ДСН

1.10-3

(1,5)

(1,2)

(1,4)

(1,2)

2.10-3

2,5 (3,6)

(6,6)

3,7 (2,2)

1,5 (2,6)

20.10-3

-

-

-

2,1

Тритон X-305

2.10-3

1,3

-

3,5

2,0

20.10-3

1,4

-

5,0

2,2

Из представленных в таблице 6 данных можно заключить, что тест-система поддается внешнему целенаправленному регулированию. Порог ее чувствительности ко внешним воздействиям может быть искусственно изменен путем применения функциональной нагрузки. Для повышения чувствительности тест-реакции гибели клеток наиболее целесообразно использовать диметилсульфоксид в концентрации 50.10-3%, а из поверхностно-активных веществ - твин-80 в концентрациях от 2.10-3% до 20.10-3%. Для повышения чувствительности тест-реакции хемотаксиса более эффективным оказался додецилсульфат натрия в концентрации от 1.10-3% до 2.10-3%.

Третью группу внешних воздействий на тест-систему составляют "шумовые" факторы. Как правило, их воздействие обусловлено теми манипуляциями, которые производят с тест-системой в процессе осуществления ее контакта с исследуемым образцом. К ним относятся колебания температуры, изменения кислотности среды, осмотические воздействия и так называемый "ударный" эффект. Воздействие этих факторов на тест-систему обычно не приводит к значительному искажению результатов, однако определенный вклад в погрешность при определении тест-критерия они вносят. Поэтому, хотя эти факторы не всегда удается учитывать и устранять в процессе постановки биологического теста, следует принимать меры для их минимизации.

Разработка теоретической концепции биотестирования как метода научного исследования дала нам возможность перейти к ее практическому воплощению.

Практическая реализация научных основ биотестирования

Одной из задач, стоявших перед нами, явилась разработка нового, эффективного, экспрессного и недорогого биологического теста, с помощью которого можно было бы исследовать объекты внешней среды сельскохозяйственных птиц, такие как корма, вода и другие, а также внутренние среды организма птиц в условиях промышленного птицеводства. Поскольку новый биологический тест планировали использовать в условиях лабораторий птицефабрик и иных сельскохозяйственных предприятий, не приспособленных для осуществления ряда мероприятий по систематическому поддержанию культур инфузорий и не имеющих возможности использовать специальное дорогостоящее оборудование для наблюдения за некоторыми специфическими тест-реакциями, то такой биологический тест должен был иметь вид стандартного набора, содержащего готовую к применению тест-систему, а используемая тест-реакция доступна для наблюдения с помощью стандартных технических средств, имеющихся в любой лаборатории.

Эти условия дали нам ориентиры в поиске тест-организма. В первую очередь наше внимание привлекли те виды свободноживущих инфузорий, которые имеют в своем жизненном цикле стадию покоя и способны образовывать цисты покоя. Особый интерес в этом отношении представляют почвенные виды инфузорий. Один из них, Colpoda steinii, был выбран нами в качестве тест-организма. Среди признаков, присущих прочим инфузориям, данный вид обладает рядом уникальных свойств. Способность образовывать цисты покоя, устойчивые к высушиванию, и быстрый переход от стадии покоя к активной жизнедеятельности позволяют получать на основе культуры Colpoda steinii удобный в использовании сухой препарат-диагностикум с длительным сроком годности. А отсутствие стадии конъюгации в жизненном цикле и фа­зы старения в клональном цикле, специфика процесса деления макронуклеуса, в результате которого генетический материал, в отличие от большинства инфузорий, точно распределяется между дочерними вегетативными ядрами, а также тетраплоидность макронуклеуса на постцистной стадии жизненного цикла определяют относительное генетическое постоянство лабораторных штаммов данной инфузории и однородность ее культуры, полученной путем индуцированного проращивания цист покоя.

В ходе работ с данным видом выделен и депонирован в коллекции культур микроорганизмов Государственного НИИ ОЧБ штамм инфузории Colpoda steinii П-1. Изучены его морфологические и физиологические характеристики, жизненный цикл, охарактеризована чувствительность к токсичным веществам. Результаты этих исследований дали основания для разработки на основе культуры инфузории Colpoda steinii П-1 токсикологического диа­гностикума. Форма приготовления этого препарата предложена в виде так называемого токскита, сухого стандартного набора, содержащего живую тест-систему, предназначенную для токсикологических исследований.

Необ­ходимым этапом разработки технологии приготовления препарата явилось изучение кинетики роста смешанной культуры инфузории Colpoda steinii и бактерии Bacillus subtilis, представляющей собой систему типа "субстрат - жертва - хищник". Для математического описания этого процесса была выбрана система трех дифференциальных уравнений:

где: S - концентрация лимитирующего субстрата; X1 - концентрация жертвы; X2 - концентрация хищника; τ - время; μ1m - максимальная удельная скорость роста жертвы; μ2m  - максимальная удельная скорость роста хищника; KS - константа полунасыщения по лимитирующему субстрату; KX1 - константа полунасыщения по жертве; ε0=1/αS - усвояемость лимитирующего субстрата жертвой; ε1=1/αX1 - коэффициент хищничества (усвояемость жертвы хищ­ником).

Константы модели были определены в острых опытах, что позволило, задавая начальные условия и интегрируя систему в численном виде явным методом Рунге-Кутта четвертого порядка, предсказывать поведение смешанной культуры и управлять ее раз­витием. Эксперименты показали, что математическая модель достаточно точно описывает процесс культивирования смешанной культуры Colpoda steinii и Bacillus subtilis при температуре 22°C. Значительные отклонения экспериментальных данных от теоретических наблюдали лишь в последние часы эксперимента. Так, реальные концен­трации глюкозы и клеток Bacillus subtilis не достигали нуля, а кон­центрация трофонтов Colpoda steinii по достижении максимума начинала быстро убывать за счет формирования цист покоя. Но следует отме­тить, что максимальные концентрации организмов смешанной куль­туры полученной системой уравнений предсказываются верно, как и время достижения этих концентраций, что является ключевым моментом в практическом использовании модели. Отклонения эксперименталь­ных данных от теорети­ческих кривых мы склонны объяснять погрешностями при опреде­лении констант математической модели, измерении параметров процесса и некоторыми допущениями, принятыми при составлении модели. К последним относятся: предположение о постоянстве эко­номических коэффициентов (коэффициентов хищничества и усвояе­мости субстрата) и пренебрежение влиянием первого трофического звена на третье. Кроме того, модель не учитывает нелинейный ха­рактер зависимости скорости фагоцитоза инфузорий-седиментато­ров от концентрации бактерий, особенности процесса палинто­мического деления Colpoda steinii и ее способность образовывать цисты покоя. Приняв во внимание все эти моменты, можно сделать вывод, что полученная математическая модель позволяет предсказать поведе­ние системы и целенаправленно управлять ею и, следовательно, вполне применима на практике.

Проведенные исследования позволили отработать производственные режимы выращивания больших количеств культуры Colpoda steinii для приготовления препарата. Результаты экспериментов нашли отражение в технической документации на препарат и в патентной документации.

Еще одним важным звеном в разработке диагностического препарата явилось исследование процесса его хранения и создание комплекса мер по увеличению срока его годности. Полученные кривые выживания цист покоя Colpoda steinii в сухом состоянии показывают, что значительная доля инцистиро­вавшихся инфузорий в изученных условиях погибала в течение первых 20 суток хранения. Причем доля погибших цист зависела от вида носителя (33% на ацетилцеллюлозной пленке и 71% на стекле). В дальнейшем кинетика гибели цист менялась. Скорость гибели цист была невелика и зависела от материала носителя. Из изученных вариантов условий хранения наилучшим является хранение цист покоя, сорбированных на аце­тилцеллюлозной пленке, в герметично закрытых флаконах в темном месте. В таком виде срок годности препарата составляет 24 месяца, что делает возможным его промышленное производство и коммерческое использование.

Разработанный препарат призван решить проблему экспрессной оценки интегральной токсичности кормопродуктов и воды, поступающих на птицефабрики, непосредственно в лаборатории предприятия-потребителя. Препарат прошел широкую проверку и внедрен в практику работы лабораторий ряда сельскохозяйственных предприятий России, Украины и Грузии. Ре­зультаты производственных испытаний подтвердили данные каме­ральных опытов и позволили сделать вывод о его пригодности для оценки кормов сельскохозяйственных животных на общую токсичность. Такой же вывод был сделан при независимой проверке препарата в Институте ветеринарной медицины УААН (г. Киев) и в НПЦ "Корм" (г. Санкт-Петербург).

Другой перспективной сферой применения биотестирования с использованием инфузорий является диагностика и мониторинг состояния организмов высших животных, а также их популяций путем исследования токсических свойств их внутренних сред. Применение разработанного нами препарата в этой специфической области позволило провести изучение динамики токсичности сыворотки крови кур в зависимости от их возраста в нормальных условиях, а также при различных заболеваниях и специальных технологических мероприятиях. Результаты исследования показали, что токсические свойства сыворотки крови кур находятся в зависимости от возраста, причем, возрастные изменения носят закономерный характер. Экстремальные внешние воздействия изменяют свойства сыворотки крови кур. Так, при профилактической вакцинации цыплят против болезни Гамборо и инфекционного ларинготрахеита токсичность сыворотки крови птиц увеличивалась в 3-4 раза уже на следующие сутки. Подобное явление наблюдали и при инфекционном процессе, вызванном мезогенным вирусом ньюкаслской болезни. Среднее значение регистрируемого параметра изменялось в 1,7 раза по сравнению с нормой. Таким образом, уровень токсичности крови птиц, а также статистический разброс этого параметра могут служить критерием для экспрессной диагностики общего состояния поголовья птиц в условиях промышленного птицеводства.

ВЫВОДЫ

1 Сформированы научные основы биотестирования, как метода анализа объектов окружающей среды. Они включают в себя:

- связную систему оригинальных определений основных терминов, используемых в биотестировании;

- схему постановки биологического теста, как процесса превращения материального потока, представленного исследуемым образцом и его действующей формой, в информационный, результатом которого является оценка исследуемого образца;

- описание внутренней структуры тест-системы, как центрального звена процесса биотестирования, и трех групп факторов внешних воздействий на тест-систему;

- пути оптимизации, стандартизации и управления тест-системой и процессом биотестирования в целом.

2 Даны обоснования к использованию инфузорий в качестве тест-объектов в биологических тестах, разработаны системы требований для отбора тест-организмов, тест-реакций и тест-критериев, наиболее пригодных для практического применения.

3 Выведена универсальная зависимость, описывающая процесс взаимодействия культуры клеток инфузорий с токсичным веществом на модели тест-реакции гибели, и на ее основе получены характеристики токсичных веществ - предел обнаружения, определяемый как концентрация данного ве­щества в растворе, вызывающая гибель 50% клеток Colpoda steinii в течение 3 часов, и токсикологическая широта действия, характеризуемая коэффициентом в показателе степени уравнения "концентрация - время", а также самой тест-системы - индекс синхронизированности, представляющий собой отношение нормирующих коэффициентов в уравнениях "концентрация - время" для 100% и 50% гибели инфузорий. Чувствительность тест-реакции гибели Colpoda steinii к изученным токсичным веществам на 1-2 по­рядка выше таковой для теплокровных животных. Кривые "концентрация - время", характеризующие процесс взаимодействия тест-системы с токсичным веществом, описываются уравнением степенной функции, а морфологические изменения, происходящие в клетках во время интоксикации, носят специфический характер.

4 Выведена зависимость, описывающая процесс взаимодействия культуры клеток инфузорий с токсичным веществом на модели тест-реакции хемотаксиса. Показано, что применение этой тест-реакции дает возможность исследовать интегральную токсичность объектов внешней среды с содержанием поллютантов на уровне, сравнимом с ПДК.

5 В результате изучения процесса комбинированного воздействия смеси токсичных веществ на культуру клеток инфузорий выявлены аддитивный и антагонистический типы взаимовлияния различных ксенобиотиков, выведены формулы, описывающие процесс взаимодействия смеси токсичных веществ с тест-системой при аддитивном типе взаимовлияния.

6 В результате исследования процесса комбинированного воздействия смеси токсичного вещества с органическими растворителями, а также с поверхностно-активными веществами на культуру клеток инфузорий выявлен эффект потенцирования. Показана принципиальная возможность использования органических растворителей и ПАВ в качестве функциональной нагрузки с целью управления тест-системой и процессом биотестирования в целом.

7 Сформирован комплекс мер для стандартизации процесса биотестирования и управления основными параметрами тест-систем. Он включает использование депонированных штаммов инфузорий, обладающих стабильными генетическими и физиологическими характеристиками, синхронизацию тест-систем перед применением, регулирование чувствительности тест-системы с помощью функциональных нагрузок.

8 В результате практической реализации теоретических основ использования инфузорий в биотестировании выбран вид инфузории, обладающий рядом специфических свойств, обуславливающих его преимущества перед иными тест-организмами, выделен, всесторонне охарактеризован и депонирован штамм Colpoda steinii П-1.

9 На основе культуры инфузории Colpoda steinii П-1 создана тест-система, обладающая по сравнению с существующими важными преимуществами - высокой чувствительностью к токсичным веществам, высокой степенью синхронизированности и постоянством генетических и физиологических характеристик.

10 Для управления процессом культивирования моноксеничной культуры инфузории Colpoda steinii использована математическая модель типа "субстрат - жертва - хищник", получены значения коэффици­ентов этой модели.

11 В результате изучения процесса хранения цист покоя Colpoda steinii в высушенном состоянии определены оптимальные условия их хранения и срок годности.

12 Разработан первый отечественный токскит на основе культуры инфузории Colpoda steinii, штамм П-1, со сроком годности более 2 лет. Препарат прошел широкие испытания и внедрен в практику работы лабораторий сельскохозяйственных предприятий России, Украины и Грузии. Метод оценки интегральной токсичности фуражного зерна и комбикормов с использованием препарата включен в Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.7-97, в Государственный стандарт Украины ДСТУ 3570-97 и в Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52337-2005. Применение препарата в исследованиях внутренних сред организмов в промышленном птицеводстве является перспективным и может быть использовано при решении вопросов, связанных с регулированием условий содержания животных, проведением профилактических мероприятий, а также при создании различных систем прогнозирования экономических показателей сельскохозяйственных предприятий.

СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Препарат токсикологичес­кой диагностики кормов // Ростовский ЦНТИ. - 1993. - № 97-93. - 2 с.

2 Па­тент № 2001951 Российской Федерации, МКИ5 C 12 N 5/00. Штамм инфузории Colpoda steinii для приготовления токсикологического диагностикума/ Виноходов Д. О., Виноходов В. О. - М.: НПО "Поиск" Роспатента, 1993. - 8 с.

3 Патент № 2002263 Российской Федерации, МКИ5 G 01 N 33/18. Способ получения препара­та для токсикологических исследований объектов внешней среды/ Виноходов Д. О., Виноходов В. О. - М.: НПО "Поиск" Роспатента, 1993. - 10 с.

4 Vinochodov D., Vinochodov V. Preparation for toxicological estimation of poultry fodder // International conference "Biotechno­logy St.Petersburg94". St.Petersburg, Russia, September 21-23, 1994: Program and abstracts. - SPb, 1994. - P. 97-98.

5 Виноходов Д. О. Токсикологические исследования кормов с использованием инфузорий. – СПб: АВН, 1995. - 80 с.

6 Патент № 2039825 Российской Федерации, МКИ6 C 12 O 1/02, G 01 N 33/18. Способ определения токсич­ности объектов внешней среды/ Виноходов Д. О., Виноходов В. О. - М.: НПО "Поиск" Роспатента, 1995. - 6 с.

7 Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И. Биотестирование как метод научного исследования // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 40-43.

8 Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И., Ананченко И. В. Зависимость "концентрация - время" в острых опытах // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 73-78.

9 Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Colpoda steinii как тест-организм // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 85-87.

10 Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И. Исследование токсичности зернопродуктов: новая редакция ГОСТ // Биоиндикация-98: Материалы Международной молодежной научной школы 21-28 сентября 1998. - Петрозаводск, 1998. - Т. 1. - C. 164-167.

11 Виноходов Д. О. Математическое моделирование кинетики роста культуры инфузории  Colpoda steinii в периодических условиях // Архив ветеринарных наук. - 1998. - Т. 1(48). - C. 121-134.

12 Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И. Определение общей токсичности зернопродуктов // 1-ый съезд токсикологов России 17-20 ноября 1998: Тезисы докладов. - М.: 1998. - C. 271.

13 Земляникина Т. А., Олемской В. В., Виноходов Д. О. Исследование свойств сыворотки крови кур с использованием культуры простейших // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 275-278.

14 Казаченок Е. Н., Виноходов Д. О. Влияние органических растворителей на чувствительность инфузорий к тяжелым металлам // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 229-232.

15 Кривицкая О. Г., Виноходов Д. О. Влияние поверхностно-активных веществ на чувствительность инфузорий к тяжелым металлам // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 225-228.

16 Соболева Л. С., Виноходов Д. О. Выявление токсигенных грибов, контаминирующих корма, при помощи инфузорий // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 266-269.

17 Виноходов Д. О. Временное наставление к экспресс-методу определения токсичности кормов, кормовых добавок, воды и органов павших и убитых животных с использованием культуры Colpoda steinii // Ветеринарная газета. - 1999 - № 2 (153). - C. 5.

18 Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И., Земляникина Т. А. Использование инфузорий в исследованиях внутренних сред высших организмов // Архив ветеринарных наук. - 1999. - Т. 1(48), ч. 3. - C. 551-577.

19 Зерно фуражне, продукти його переробки, комбiкорми: Методи визначення токсичностi. ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97). Державний стандарт Украiни. Киiв: Держстандарт Украiни. - 1999. - 15 с.

20 Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма: Методы определения токсичности. ГОСТ 13496.7-97. Межгосударственный стандарт. - МГС по стандартизации, метрологии и сертификации. - 1999. - 15 с.

21 Зубанов П. А., Кривицкая О. Г., Пожаров А. В., Виноходов Д. О., Ивакина А. В. Влияние поверхностно-активных веществ на тест-реакции инфузорий // Биотехнология в ФЦП "Интеграция": Тезисы докладов заочной научно-практической конференции. - СПб: Изд-во СПбГТИ(ТУ), 1999. - C. 107-109.

22 Патент № 2136152 Российской Федерации, МКИ6 A 01 K 67/02, A 61 B 10/00, C 12 Q 1/02. Способ определения естественной резистентности организма птиц/ Олемской В. В., Виноходов О. В., Виноходов Д. О. - М.: ФИПС, 1999. - 6 с.

23 Зубанов П. А., Виноходов Д. О. Влияние поверхностно-активных веществ на тест-реакцию хемотаксиса Paramecium caudatum // Концептуальные вопросы питания населения и военнослужащих: Сборник трудов по материалам Всероссийской научной конференции, посвященной 45-летию научно-исследовательской лаборатории питания и водоснабжения (25 мая 2001 год). - Санкт-Петербург, 2001, с. 46-49.

24 Зубанов П. А., Виноходов Д. О. Перспективы применения поверхностно-активных веществ в биотестах // Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии: Материалы международной конференции молодых ученых (15 ноября 2002 г.), выпуск второй. - Тверь, 2002. - с. 20.

25 Виноходов Д. О., Гинак А. И. Исследование токсичности зернопродуктов: новая редакция ГОСТ // Ветеринария в птицеводстве. - 2002 - №1. - С. 9.

26 Ковбасенко В. М., Горобей А. М., Ляшкевич А. А., Полежаев Ф. И., Григорашева И. Н., Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Экспресс-метод определения токсичности пищевых продуктов с использованием инфузории Colpoda steinii // Ветеринария в птицеводстве. - 2002 - №3. - С. 26-29.

27 Виноходов Д. О., Поляков Н. Л. Биотестирование в птицеводстве и ветеринарии: Введение в биотестирование // Ветеринария в птицеводстве. - 2003 - №5-6. - С. 41-46.

28 Виноходов Д. О. Методические рекомендации по определению токсичности продуктов животноводства и кормов (микробиологический экс-пресс-метод) // Ветеринария в птицеводстве. - 2003 - №5-6. - С. 49-54.

29 Виноходов Д. О., Поляков Н. Л. Определение микотоксинов методами биотестирования // Ветеринария в птицеводстве. - 2003 - №5-6. - С. 47-48.

30 Храпунова Н. М., Рачеева Ю. А., Илюшин М. А., Зубанов П. А., Виноходов Д. О. Оценка биологической активности новых веществ экспрессными методами (на примере перхлоратных аммиакатов кобальта (III)) // Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (20-21 ноября 2003 года). - СПб: ВМедА, 2003. - С. 184-185.

31 Конюшенко Е. Н., Никитина Ю. А., Виноходов Д. О., Дубяго Н. П., Илюшин М. А., Шугалей И. В., Целинский И. В., Жилин А. Ю., Козлов А. С., Илюшина Т. М. Генерация, реакционная способность активных форм кислорода и их деструктивная роль в процессах жизнедеятельности // VII Вишняковские чтения: Стратегия и тактика вузовской науки в регионе: Материалы международной научной конференции (Бокситогорск, 2 апреля 2004 г.). - СПб. – 2004. - С. 100-110.

32 Конюшенко Е. Н., Никитина Ю. А., Дубяго Н. П., Илюшин М. А., Виноходов Д. О., Шугалей И. В., Целинский И. В., Жилин А. Ю., Козлов А. С., Илюшина Т. М. Влияние комплексообразования на свойства коразола // Химия и технология синтетических биологически активных веществ: Сборник трудов Всероссийской научно-технической конференции «Успехи в специальной химии и химической технологии». - М., 2005. - С. 58-62.

33 Виноходов Д. О., Поляков Н. Л. Профилактика ассоциированных токсикозов методами биотестирования // Международный вестник ветеринарии. - 2005 - №1/ - C. 91-95.

34 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье: Методы определения общей токсичности. Национальный стандарт Российской Федерации. ГОСТ Р 52337-2005. - М.: Стандартинформ, 2005. - 16 с.

35 Виноходов Д. О. Биотестирование на культурах инфузорий в диагностической профилактике пищевых отравлений животных (обзор) // Ветеринарная патология. - 2006. - №1. - С. 90-96.

36 Зубанов П. А., Виноходов Д. О., Филимон Е. В. Зависимость чувствительности Paramecium caudatum к токсичным веществам от условий обитания // IV съезд Общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова (17–19 октября 2006 г.), Пущино, 2006.

37 Виноходов В. О., Виноходов Д. О., Поляков Н. Л. Новый экспресс-метод определения токсичности мясопродуктов // Практик. - 2006. - №2. - С. 26-31.

38 Виноходов Д. О., Пожаров А. В. Методологические особенности токсикологических тестов с инфузориями // Известия СПбГЭ-ТУ «ЛЭТИ». Серия «Биотехнические системы в медицине и экологии». - 2006. - Вып. 3. - С. 60-67.

39 Поляков Н. Л., Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Новый экспресс-метод определения токсичности мясопродуктов // Ученые записки Казанской академии ветеринарной медицины. - 2006. - Т. 180. - С. 210-219.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.