WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

  Гореликов Петр Леонидович

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА

МЕХАНИЗМОВ  НИКОТИНОВОЙ  ХОЛИНЕРГИЧЕСКОЙ

РЕГУЛЯЦИИ  НЕЙРОН-ГЛИАЛЬНЫХ  ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ И  МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ  АКТИВНОСТИ

В  СИМПАТИЧЕСКОМ  ГАНГЛИИ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2008

Работа  выполнена  в  ГУ  Научно-исследовательском  институте  морфологии человека РАМН

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Савельев Сергей Вячеславович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Яцковский Александр Никодимович

доктор медицинских наук Худоерков Рудольф Михайлович

доктор медицинских наук, профессор  Ягубов Аркадий Сергеевич

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Российский  государственный  медицинский  университет»

Защита диссертации состоится « » ___________ 2008 года  в ____ часов на заседании  диссертационного совета (Д  001.004.01) ГУ НИИ  морфологии человека  РАМН  по  адресу:  117418 Москва,  ул. Цюрупы,  д.3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ  морфологии

человека  РАМН

Автореферат разослан  «  » ______________ 2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Л.П.Михайлова

доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Фундаментальной проблемой нейробиологии является выяснение механизмов, обеспечивающих функционирование тканевых элементов нервной системы. Во многом ее решение зависит от знания синаптических процессов – важнейшего звена, обеспечивающего интегративную деятель-ность нервной системы. В ряду нейротрансмиттерных систем особую роль играют никотиновые холинергические синапсы паравертебральных симпа-тических ганглиев, образованные преганглионарными волокнами. Никоти-новые холинорецепторы в указанных синапсах представляют ключевое функциональное звено, через которое осуществляется передача информации в ганглиях и происходит активизация автономной нервной системы (Ноздрачев А.Д., Фатеев М.М., 2002; De Biassi M. et al., 2000; De Biassi M., 2002).

Важным интегративно-координационным центром автономной регуля-ции является краниальный шейный ганглий, через никотиновые холино-рецепторы которого осуществляется контроль общего сосудистого тонуса и гемодинамических показателей, обеспечивается деятельность эпифиза и регуляция многих других жизненно важных висцеральных функций (Ноздрачев А.Д., Пушкарев Ю.П., 1980; Skok V., 2002; Wang N. et al., 2004; Asamoto K., 2005).

Правомерно в связи с этим предполагать, что столь значимая функциональная роль никотиновых холинорецепторов в информационном обеспечении краниального шейного, равно как и других экстрамуральных симпатических ганглиев, должна определенным образом проявиться и в участии этих рецепторов в молекулярно-клеточных механизмах непосред-ственно организующих  деятельность самих симпатических ганглиев. Такая постановка вопроса представляет вполне понятный теоретический и прак-тический интерес, как с точки зрения выяснения общих принципов орга-низации работы периферических ганглиев, так и в плане изучения последствий модуляции активности периферических никотиновых холино-рецепторов, как объекта воздействия наркотических субстанций и лекарст-венных препаратов.

Объективной основой для проведения исследования в обозначенном направлении служит значительное число экспериментальных данных пос-ледних лет, полученных в отношении других отделов нервной системы, которые показывают, что роль синаптических процессов не ограничивается обеспечением только лишь информационной связи между нейронами.  Напро-тив, эти данные позволяют рассматривать соответствующие синапсы в ка-честве биохимически самоорганизующихся систем, которые располагают собственными механизмами контроля за всеми этапами белкового синтеза в постсинаптических нейронах (Tiedge H., 2005; Hirokawa N., 2006; Pfeiffer B., Huber K., 2006) и непосредственно участвуют в таком специфическом клеточном механизме, как нейрон-глиальное взаимодействие (Fellin T., Carmignoto G., 2004; Hertz L., 2004; Magistretti P., 2006). Вместе с тем нейротрофическая роль синаптического сигнала через никотиновые холинорецепторы в регуляторных механизмах симпатических ганглиев не изучена.

Цель исследования – установить морфофункциональные закономер-ности метаболического ответа краниального шейного симпатического ганглия и входящих в его состав нейронов и сателлитных глиоцитов на экспериментально вызванные изменения в численности свободно функцио-нирующих никотиновых холинергических рецепторов.

Задачи:

  1. Установить закономерности в изменениях содержания рРНК в симпа-тических нейронах и окружающих нейроны сателлитных глиоцитах при применении разных доз ганглиоблокатора, вызывающих блокирование относительно небольшого, значительного числа никотиновых холино-рецепторов и полное блокирование никотиновых холинорецепторов, а также в ходе последующего восстановления численности функциони-рующих никотиновых холинорецепторов после применения разных моделей блокады.
  2. Провести сравнительный анализ модуляций в содержании рРНК в симпа-тических нейронах и окружающих сателлитных глиоцитах при разной чис-ленности блокированных никотиновых холинорецепторов.
  3. Определить изоферментный состав и спектр ферментативной системы лактатдегидрогеназы (ЛДГ) на уровне интактного симпатического ганглия и на клеточном уровне - в симпатических нейронах и сателлитных глио-цитах.
  4. Выявить закономерности в изменениях активности ферментативной сис-темы ЛДГ при частичном и полном блокировании никотиновых холино-рецепторов в симпатическом ганглии, а также в симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах.
  5. Определить основные закономерности в изменениях содержания аденилат-ных макроэргов (АТФ, АДФ, АМФ) в симпатическом ганглии, связанные с частичным и полным блокированием никотиновых  холинорецепторов, а также динамику этих показателей в процессе последующего восстановле-ния после прекращения действия блокады.
  6. Провести комплексный анализ полученных динамических изменений метаболических показателей при экспериментально вызванных флук-туациях численности свободно функционирующих никотиновых холинер-гических рецепторов. Определить роль никотиновых холинергических ре-цепторов в регуляции метаболического статуса симпатического ганглия и межклеточном взаимодействии между симпатическими нейронами и са-теллитными глиоцитами и вероятный механизм, лежащий в основе этой регуляции.

Научная новизна

Установлены раннее неизвестные принципы морфофункциональной организации  симпатического  ганглия,  которые  базируются  на  том,  что синаптические сигналы, поступающие через никотиновые холинорецепторы симпатических нейронов, управляют метаболическими процессами и моби-лизуют специфические клеточные механизмы в симпатическом ганглии, выс-тупая в качестве системообразующего фактора, обеспечивающего его актив-ную деятельность.

Впервые показано, что в симпатическом ганглии нейроны и окружа-ющие  нейроны сателлитные глиоциты при определенных условиях образуют единую функционально - метаболическую систему. Выявлены ранее неиз-вестные условия и характер взаимодействия между этими типами клеток, которые заключаются в том, что нейроны и сателлитные глиоциты в симпа-тическом ганглии вступают в метаболическое взаимодействие только при наличии синаптического сигнала, поступающего через никотиновые холино-рецепторы симпатических нейронов. При этом метаболическая активность и энергетические механизмы сателлитных глиоцитов регулируются функцио-нальным состоянием нейронов, которые через ионотропные никотиновые хо-линорецепторы осуществляют интеграцию своего собственного метаболизма с метаболизмом окружающих сателлитных глиоцитов.

В эксперименте впервые показано, что в симпатическом ганглии соз-даются условия для энергетического взаимодействия между симпатическими нейронами и сателлитными глиоцитами и существует высокая вероятность реализации в краниальном шейном ганглии механизма энергетического гомеостаза на основе клеточной интеграции, описываемого гипотезой ANLSH (astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis) для головного мозга, которая пред-полагает существование между глиоцитами (астроцитами) и нейронами лак-татного челночного механизма.

Впервые определен изоферментный спектр ЛДГ для краниального шей-ного ганглия и изоферментный профиль ЛДГ для симпатических нейронов и сателлитных глиоцитов.

Научно-практическая значимость

Разработанная в работе функционально-информационная модель регу-ляции краниального шейного симпатического ганглия представляет теорети-ческий и практический интерес с позиций понимания специфических меха-низмов и общих принципов, лежащих в основе морфофункциональной орга-низации периферических ганглиев и в целом симпатического отдела нервной системы.

Показанное в работе нейротрофическое значение холинергического сигнала через никотиновые холинорецепторы указывает на необходимость учета и оценки последствий модуляций активности периферических никоти-новых холинорецепторов в краниальном шейном симпатическом ганглии, как объекта воздействия наркотических субстанций и лекарственных препаратов. Вместе с этим ключевая роль синаптических процессов с участием никоти-новых холинорецепторов в организации контроля  метаболизма и клеточного взаимодействия в краниальном шейном симпатическом ганглии указывает на возможность адресного, направленного на периферические никотиновые холинорецепторы, фармакологического контроля и коррекции симпатических функций.

Описанные в работе динамика энергетических и метаболических пока-зателей и происходящие изменения в нейрон-глиальном взаимодействии рас-ширяют фактологическую базу для расшифровки молекулярно-клеточных ме-ханизмов патогенеза заболеваний, связанных с нарушением синаптической функции холинергической передачи через никотиновые рецепторы.

Выявленный эффект применяемого в работе ганглиолитика, относя-щегося к группе бис-катионных аммониевых соединений, на динамику мета-болических сдвигов в симпатическом ганглии и входящих в его состав ней-ронов и сателлитных глиоцитов восполняет существующий пробел в пред-ставлениях о молекулярно-клеточных механизмах действия этой группы неконкурентных холинолитиков в самом объекте блокады – краниальном шейном симпатическом ганглии.

Основные положения, выносимые на защиту

На основании анализа динамики метаболических процессов при модуляциях синаптического холинергического сигнала разработана функционально-информационная модель регуляции краниального шейного симпатического ганглия. Синаптический сигнал, поступающий через никоти-новые холинорецепторы в синапсах симпатических нейронов, является для симпатического ганглия системообразующим фактором, который трансформирует и направляет метаболизм и создает специфическую клеточную интеграцию в ганглии для выполнения этим органом адекватной функции.

В рамках представленной модели установлено следующее.

  • Синаптический сигнал, через никотиновые холинорецепторы симпатических нейронов:

- управляет метаболическим статусом симпатического ганглия, осуществляя регуляцию базового уровня энергетического гомеостаза и изменяя активность белок-синтезирующей системы нейронов и саттелитных глиоцитов.

- потенцирует формирование специфической межклеточной интег-ративной единицы, связывая симпатические нейроны и соседние сателлитные глиоциты в единую функционально - метаболическую систему.

  • В отсутствие холинергического синаптического  сигнала в симпатическом ганглии оказываются задействованными механизмы, поддерживающие только его системы жизне-обеспечения, а симпатические нейроны и сателлитные глиоциты представляют собой метаболически обособленные друг от друга клеточные системы.
  • На клеточном уровне показано, что синаптический сигнал через никотиновые холинергические рецепторы:

-  индуктивно  воздействует  на  метаболическую активность сим-патических  нейронов,  вызывая  в  них повышение уровня активности белок–синтезирующей системы;

- модулирует в нейронах активность белок-синтезирующей системы;

-  обеспечивает энергетический гомеостаз в нейронах, по крайней мере, на уровне регуляции активности ферментативной системы ЛДГ;

-  обеспечивает синхронизацию процессов синтеза белка в нейронах и соседних сателлитных глиоцитах на уровне трансляции, и детерминирует анаэробную направленность изоферментного профиля ЛДГ в сателлитных глиоцитах.

Внедрение

Результаты исследования нейротрофического значения синаптической передачи через никотиновые холинорецепторы и ее роли в нейрон-глиальном взаимодействии в симпатическом ганглии используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах гистологии  и эмбриологии Российского государственного медицинского университета и анатомии и гистологии животных Московской академии ветеринарной медицины и биотехнологии.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на IX и X Всесоюзных  съездах  анатомов, гистологов и эмбриологов  (г. Минск,  1981 и

г. Полтава, 1986); VII и VIII конгрессах международной ассоциации морфо-логов (г. Казань, 2004 и г. Орел, 2006); VII Всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 2005); 5-й Всероссийской конференции  «Бабу-хинские чтения в Орле» (г. Орел, 2006); Конференциях ГУ НИИ морфологии человека  РАМН  «Актуальные  вопросы  морфогенеза  в норме и  патологии»

(г. Москва, 2005, 2006, 2008), межлабораторной конференции в ГУ НИИ морфологии человека РАМН (декабрь, 2007г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы, из них 8 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 276 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 42 рисунками и микрофотографиями, содержит 36 таблиц и одну схему. Список литературы включает 418 источников, из которых 110 отечественных и 308 зарубежных.

Материал и методы исследования

Работа выполнена на материале краниальных шейных симпатических ганглиев (КШСГ) половозрелых кроликов породы шиншилла (питомник “Столбовая“). В эксперименте использовано 103 животных, 124 ганглия, проанализировано 3568 симпатических нейронов и 5647 сателлитных глиоцитов.

При работе с экспериментальными животными руководствовались  приказами Минздрава  СССР № 755  от 12.08.1977 г. и Минздрава РФ №  267  от  19.06.2003г. На  проведение экспериментов получено разрешение

Комиссии по биоэтике ГУ НИИ морфологии человека РАМН

(Протокол № 3 от.21.04.2005г.)

Экспериментальная модель. Для оценки роли никотиновых холино-рецепторов (нХР) применялось экспериментально индуцированное и управляемое  изменение  эффективности  синаптического  влияния через нХР.

С этой целью использовали холинолитик димеколин. Холинолитический эффект препарата заключается в блокировании нХР в синапсах сим-патических нейронов, число которых последовательно возрастает с увеличением дозы ганглиоблокатора (Скок В.И. и соавт.,1987; Бровцына Н.Б. и соавт., 1996). Димеколин характеризуется высокой холинолитической активностью, максимальный блокирующего эффект препарата наступает через 1час, с продолжительностью действия около 3-х часов, и  слабой выраженностью побочного действия (Шарапов И.М., 1962; Вышинская Т.Е., 1965; Першин Б.Н., 1966).

Эксперимент планировали в соответствии с установленной для кро-ликов фармакодинамикой препарата (Шарапов И.М.1961, 1962; Першин Б.Н., 1966). Применяли однократное подкожное введение ганглиоблокатора в дозах 10, 30 и 50 мг/кг живого веса, первая из которых превышает пороговую дозу и вызывает частичное блокирование, а последняя приводит к практически полному блокированию нХР. После введения препарата в каждой из ука-занных доз в разные сериях опыта материал брали через 1,  3,  5,  7,  9  и  11 часов.

Исследовали:

  • рРНК – ключевой параметр белкового синтеза (Grannemann S., Baserga S., 2004; Dresios J. et al., 2006).
  • Ферментативную систему ЛДГ, которая осуществляет регуляцию субстратного обеспечения энергетических процессов (Зимин Ю.В. и др., 2001; Gladden L., 2004) и принимает участие в ряде других механизмах внутриклеточной  регуляции  (Popanda O. et al., 1998;  Beeckman S., Kanasek E., 1996).
  • Аденилатные макроэрги (АТФ, АДФ, АМФ), уровень содержания, которых характеризует энергетический статус и общую интеграцию биохимических процессов (Хочачка П., Сомеро Дж., 1977, 1988; Dzeja P., Terzic A. , 2003).

Содержание нуклеиновых кислот определяли в цитоплазме нейронов и в сателлитных глиоцитах методом сканирующей фотографической цито-фотометрии (Агроскин Л.С., Папаян Г.В.,1977) на микрофотометре ИФО-451 (фирма ЛОМО).

Для этого материал заключали в парафин в режиме, не приводящем к потерям нуклеиновых кислот (Гореликов П.Л, 1977, 1979), изготовляли  срезы толщиной 5-7 мкм. Толщину парафиновых срезов измеряли пред-ложенным нами методом (Гореликов П.Л, 1975) с помощью микроскопа ОРИМ – 1 (фирма ЛОМО). Срезы окрашивали по методу Эйнарсона и фото-графировали в максимуме поглощения красителя (575 ммк) на специально для этой цели подобранную фотопленку КН-3 (Гореликов П.Л., Лебедев Э.А., 1977). Результаты, пересчитывали на 1 мкм толщины срезов.

Полученные в нейронах и сателлитных глиоцитах цитохимические сдвиги относили за счет изменений рРНК, так как в цитоплазме нейронов нуклеиновые кислоты в основном представлены рРНК (Гайцхоки В.С., 1980), а в глиоцитах, в которых по существу определяется суммарное количество РНК+ДНК, изменениями глиальной ДНК можно пренебречь, поскольку в зре-лой нервной ткани она характеризуется стабильностью (Peters A., Sethares C., 2004). Объем выборки в контроле и во всех сериях опыта составлял в среднем 100 – 200 клеток каждого типа взятых от отдельного животного.

Активность ЛДГ, Н и М ее изоформ в нейронах и окружающих их сателлитных глиоцитах определяли методом интегральной цитофотометрии (Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977) на цитофотометре МИФ-1 (фирма ЛОМО) на криостатных срезах после гистохимического окрашивания тетранитро-синим тетразолием по методу Брумберга В.А. и Певзнера Л.З. (1975), позво-ляющему проводить количественную оценку активности фермента. Объем выборки составлял в контроле и в опыте по 150 нейронов и 210 – 300 сателлитных глиоцитов от каждого животного.

Содержание АТФ, АДФ, АМФ в ганглии определяли методом рас-пределительной тонкослойной хроматографии на силуфоловых пластинках, с последующим количественным спектрофотометрическим определением раз-деленных нуклеотидов на спектрофотометре СФ-16 (фирма ЛОМО) в УФ диапазоне (260 ммк).

Активность изоферментов ЛДГ определяли в относительных единицах методом фотографической фотометрии (Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977). Разделение изоферментов осуществляли с помощью диск-элекрофореза в полиакриламидном геле (ПАГ) в микромодификации Панавене Д.П. (1974) после окрашивания нитросиним тетразолием. После фотографирования в максимуме поглощения формазана (569 ммк) на специально подобранную для этой цели Аэрофотопленку, электрофореграммы денситометрировали на микрофотометре ИФО-451 (фирма ЛОМО).

При исследовании всех показателей в контроле и в каждой из серий опыта использовано по 3-5 животных.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием общепринятых методов параметрической (t-критерий, корреляционный ана-лиз) и непараметрической (U-критерий) статистик с помощью компьютерных программ “Microsoft Excel  97”, σ, “STATISTICA”. При оценке статистичес-кой  значимости коэффициентов корреляции (r) применяли преобразование Фишера.

Результаты исследований и их обсуждение

  1. Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на метаболическую активность симпатических нейронов и сателлитных глиоцитов

Влияние функционирующих никотиновых холинорецепторов на проявления метаболической активности в нейронах и глиоцитах

Примененная в работе экспериментальная модель дозированной синап-тической блокады дает возможность создавать динамически изменяющийся численный баланс между нХР, которые вследствие блокирования находятся, в инактивированном состоянии, и нХР, которые, напротив, остаются неза-нятыми ганглиоблокатором и, следовательно, сохраняют способность активно функционировать, и сопоставить эти изменения с цитохимическими сдви-гами, происходящими в это время в исследуемых клетках.

Такой анализ позволил установить, что при синаптической блокаде нХР динамика формирования метаболических сдвигов в нейронах и соседних с ними сателлитных глиоцитах существенно различается.

В нейронах блокада, независимо от уровня блокирования холинорецеп-торов, вызывает стереотипный цитохимический ответ – выраженные колеба-ния содержания рРНК, которые вместе с ослаблением и окончанием блокиру-ющего воздействия постепенно затухают (рис.1а,б,в). Важной особенностью наблюдаемых колебаний является то, что они происходят на уровне заметно превышающем контрольный.

Отмеченные в цитоплазме нейронов изменения рРНК представляют со-бой в достаточной мере адекватную характеристику функционального потен-циала белок-синтезирующей системы, по крайней мере на уровне трансля-ционных процессов синтеза белка (Grannemann S., Baserga S., 2004; Dresios J. et al., 2006) и свидетельствуют о том, что в ответ на блокаду синаптической передачи через нХР эти процессы в симпатических нейронах заметно активи-зируются.

Именно изменения режима функционирования синаптической передачи являются основной причиной активизации белок-синтезирующего аппарата в нейронах (Gueorguiev V. et al., 2000; Dunckley T., Lukas R., 2003) и продикто-ваны они необходимостью обеспечить материальными ресурсами функцио-нальные и структурные перестройки синаптических образований (Wang H., Tiedge H., 2004).

Таким образом, полученные сдвиги рРНК сами по себе являются прояв-лением метаболического ответа нейронов на изменения внешних условий, связанных с нарушением нормального хода синаптических процессов в ре-зультате блокады синаптической передачи.

Рис.1 Динамика содержания рРНК в симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах при разных уровнях блокады никотиновых холинорецепторов

Обозначения: нХР – никотиновые холинорецепторы;

а – незначительное (10 мг/кг) и б – значительное количество (30 мг/кг) первоначально блокированных нХР; в – практически полная блокада (50 мг/кг) нХР. В скобках указаны дозы ганглиоблокатора.

По вертикали – отклонение в % к контролю. По горизонтали – время после введения ганглиоблокатора (в час.).

Примечание:  * анализировали нейроны ядра, которых в плоскости данного среза имели, как минимум, одно ядрышко и глиоциты, удаленные от перикариона нейронов не более чем на больший диаметр ядра глиальной клетки;

** статистическую достоверность различий в полученных результатах и стандартную ошибку средних значений оценивали по t - критерию с р < 005.

Вместе с тем модуляции содержания рРНК в нейронах КШСГ оказы-ваются закономерно связанными с активностью нХР.

Так вызванные эффектом блокады изменения содержания рРНК в ней-ронах происходят, только в том случае, когда в ганглии есть нормально функционирующие нХР. В самом деле, когда практически все нХР в синапсах нейронов заблокированы (через 1 и 3 часа после введения ганглиоблокатора), уровень содержание рРНК в цитоплазме статистически значимо не изме-няется (р > 0,05), то есть остается на уровне этого показателя в интактных нейронах (рис.1в). Это означает, что при полной блокаде нейроны оказывают-ся полностью депривированы и, несмотря на изменения внешней ситуации, связанной со сдвигами в режиме функционирования синаптической передачи, тем не менее, не могут изменить свой метаболизм.

В то же время при наличии в ганглии некоторого количества незабло-кированных, и, следовательно, сохраняющих функциональную активность, нХР (через 1 часа после введения ганглиоблокатора в дозах создающих частичную блокаду рецепторов), наблюдается резкий подъем содержания рРНК (рис.1а,б). С позиций предполагаемой роли нХР важно отметить, что величина наблюдаемого при этом сдвига в содержании рРНК оказывается тем больше, чем выше количественный уровень способных к активному функцио-нированию нХР (рис.1).

Характер последующих цитохимических изменений в ходе разблоки-рования нХР (через 5, 7, 9 и 11 часов после введения ганглиоблокатора) под-тверждает, что установленная в период блокады связь между активностью холинорецепторов и метаболической активностью нейрона закономерна и случайным совпадением не является. Так в случае применения полной бло-кады холинорецепторов содержание рРНК в нейронах начинает повышаться только при постепенном разблокировании нХР (через 5 часов) и продолжает возрастать (через 7 часов) параллельно увеличению количества способных к функционированию нХР, которые последовательно освобождаются в про-цессе разблокирования (рис.1в).

Кроме того, из сопоставления модуляций при разных условиях блоки-рования следует, что уровень первоначально заблокированных нХР детерми-нирует также и относительную быстроту цитохимического ответа, и размах происходящих при  этом колебаний. В самом деле, наблюдаемое максималь-ное увеличение содержания рРНК наступает тем раньше и по величине амплитуды оно тем больше, чем большим является количество сохра-няющихся при данной модели блокады активных нХР (рис.1). Так при минимальном блокировании нХР максимальное отклонение наблюдается через 1 час и его величина относительно контроля составляет 72% (рис.1а). При увеличении численности блокированных нХР максимальное отклонение наблюдается позже, только через 5 часов, и уже со значительно меньшей амплитудой - на 49% выше контрольного уровня, (рис.1б), при полном блокировании максимально возможное отклонение наступают еще позже – через 7 часов и является при этом наименьшим – увеличение только на 35% (рис.1в).

Таким образом, полученные экспериментальные данные дают основа-ния заключить, что нХР в симпатическом ганглии весьма специфично прояв-ляют себя в формировании метаболизма рРНК в нейронах. Не оказывая заметного влияния на базовый уровень этого показателя, характеризующий интактные нейроны, данные рецепторы принимают участие в индуктивных механизмах, которые в ответ на изменения внешних условий запускают дина-мические изменения рРНК в нейрональной цитоплазме и при этом, по всей вероятности, одновременно модулируют необходимый уровень и интенсив-ность цитохимического ответа.

Эффект блокирования нХР проявляется и на морфологическом уровне, что находит свое выражение в структурных перестройках хроматофильной субстанции в цитоплазме нейронов.

При полной блокаде холинорецепторов (через 1 час после введения ганглиоблокатора) в нейронах наблюдается тотальный хроматолиз. В это время основную массу нейронов представляют клетки, в которых имеет место выраженное “измельчение” хроматофильной зернистости и значительное просветление участков цитоплазмы, в которых нисслевская субстанция не просматривается. В известной мере такая структурная реорганизация хрома-тофильной субстанции свидетельствует о существенной дезинтеграции эргастоплазмы (Pullen A., 1990; Heus R., Diegenbach P., 1992).

В то же время при частичном блокировании нХР изменения хромато-фильной субстанции носят в эти же сроки разнонаправленный характер. При блокировании незначительного числа рецепторов наблюдается гипер-хроматоз. В этом случае большая часть нейронов представлена клетками с крупнозернистой формой хроматофильной субстанции в цитоплазме, которая местами переходит в крупноглыбчатую форму. При этом глыбки укрупняют-ся настолько, что теряют свою обособленность и формируют в цитоплазме однородную плотную массу, которая в норме не встречается. При возраста-нии численности заблокированных нХР морфологическая картина представ-лена, напротив, умеренным хроматолизом. В подавляющем большинстве ней-ронов хроматофильная субстанция в значительной степени диспергирована, в отдельных участках цитоплазмы наблюдается разрежение базофильного ма-териала с заметным уменьшением размера зернистости.

Все отмеченные изменения обратимы и, независимо от числа первона-чально заблокированных холинорецепторов, ослабление и окончание блока-ды в последующие сроки (3 – 11 часов) сопровождаются постепенной норма-лизацией хроматофильной субстанции.

Наблюдаемая морфологическая картина позволяет говорить о том, что степень трансформационных изменений хроматофильной субстанции харак-теризует, прежде всего, масштабность количественных модуляций рРНК: зна-чительное увеличение содержания рРНК проявляются в гиперхроматозе, ме-нее выраженные по величине изменения этого показателя, напротив, сопро-вождает умеренный хроматолиз.

Представленные данные, с учетом результатов количественного анали-за цитохимических изменений рРНК и то, что на светооптическом уровне хроматофильная субстанция по существу представляет эргастоплазму ней-рона и ее базофильные гранулы располагаются в местах интенсивного бел-кового синтеза (Pannese E., 1994; Крстич Р.В., 2001), подтверждают конкрет-ный вклад никотиновых холинорецепторов в регуляцию белково-синтезиру-ющего аппарата симпатических нейронов, по крайней мере, на уровне транс-ляции.

В сателлитных глиоцитах блокада также, как и в нейронах вызывает стереотипный для этих клеток цитохимический ответ - существенные ко-лебания содержания рРНК (рис.1а,б,в). Вместе с тем динамика этого пока-зателя имеет свои особенности. В отличие от нейронов, в глиоцитах измене-ния при всех уровнях блокирования нХР характеризуются четко выра-женным фазным характером, и в них можно выделить три различных фазы (рис.1 а,б,в).

Фаза подъема, во время которой в глиоцитах происходит увеличение содержания рРНК. Указанный сдвиг отмечается в первые часы после введения ганглиоблокатора при всех уровнях блокирования нХР и его величина прямо не связана с количеством блокированных нХР. Так ампли-туда изменений рРНК в глиоцитах при блокаде большого количества нХР (рис.1б) и при полной блокаде нХР (рис.1в) оказывается практически одина-ковой (р > 0,05).

Фаза нормализации, во время которой содержание рРНК в глиоцитах временно нормализуется.

Фаза снижения, во время которой содержание рРНК в глиоцитах снижается.

Фазный характер количественных сдвигов рРНК в сателлитных глио-цитах скорее всего является частным проявлением общих закономерностей в динамике синтетической активности глиоцитов разных отделов нервной сис-темы, которые при различных воздействиях отвечают, как правило, разно-направленными относительно контрольного уровня модуляциями содержания рРНК (Гейнисман Ю.Я., 1974; Мац В.Н., 1994).

Таким образом, симпатические нейроны и окружающие их глиоциты характеризуются различной метаболической реакцией в ответ на нарушение синаптических процессов, вызванных блокадой.

Нейрон-глиальная метаболическая корреляция при разных уровнях блокирования никотиновых холинорецепторов

В модуляциях содержания рРНК в нейронах и окружающих нейроны сателлитных глиоцитах в условиях частичной блокады, сохраняющей в синапсах некоторое количество незаблокированных и, следовательно, функционально активных нХР, обнаруживается высокая, статистически достоверная положительная корреляционная зависимость (рис.1а,б).

Напротив, при полном блокировании нХР такая корреляционная зависимость между указанными клеточными системами отсутствует (рис.1в).

Высокая согласованность в динамике количественных изменений рРНК между симпатическими нейронами и соседними с ними сателлитными глио-цитами при наличии активных нХР и отсутствие таковой при полном блоки-ровании нХР позволяет полагать, что в симпатическом ганглии существует механизм, координирующий метаболические изменения рРНК в нейронах и глиоцитах. Необходимым компонентом этого механизма координации явля-ется медиаторное взаимодействие с нХР, расположенных в синапсах симпа-тических нейронов.

Таким образом, из анализа полученных данных, следует, что в механиз-мах управления работой симпатического ганглия существует важное функци-ональное звено, представленное никотиновыми холинергическими синапсами (нХР).

На основании полученных экспериментальных данных можно заклю-чить, что, во-первых, синаптический сигнал через нХР оказывает индук-тивное и модулирующее воздействие на активность белок-синтезирующей системы в симпатических нейронах КШСГ вызывая, в ответ на вызванные блокадой изменения синаптической активности, повышение функциональ-ного потенциала этой системы.

Во-вторых, через медиаторное взаимодействие с нХР симпатические нейроны сопрягают свою метаболическую активность с метаболической активностью соседних с ними сателлитных глиоцитов, по крайней мере, на уровне количественных изменений рРНК в этих клетках.

2. Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на энергетические процессы в симпатическом ганглии

Особенности изоферментного спектра ЛДГ интактного ганглия и входящих в его состав симпатических нейронов и сателлитных глиоцитов

В связи с тем, что спектр изоферментов ЛДГ характеризует высокая органная и тканевая специфичность (Райдер К., Тейлор К., 1983) для решения поставленных в работе задач необходимо было определить в КШСГ кроликов не исследованный до настоящего времени изоферментный состав ЛДГ. На основании полученных электрофореграмм установлено, что в интактном ганглии ферментативная система ЛДГ представлена всеми пятью основными изоферментами (рис.2). Наиболее активны из них анодные фракции ЛДГ-1 и ЛДГ-2, суммарный вклад которых в общую активность ЛДГ составляет более 50% от активности остальных изоформ (ЛДГ-3, ЛДГ-4 и ЛДГ-5).

В связи с этим КШСГ кролика можно отнести к категории органов, в которых превалирует активность, так называемых, изоформ ЛДГ сердечного типа  (Райдер К., Тейлор К., 1983;  Зимин Ю.В. с соавт., 2001).

Цитохимический анализ изоферментного состава ЛДГ подтверждает основные результаты, полученные при изучении ферментативной системы ЛДГ на уровне симпатического ганглия. Также как и в ганглии, в

Рис.2  Изоферментный состав ЛДГ и относительный вклад (в%) каждого изофермента в общую ферментативную активность ЛДГ в интактном симпатическом ганглии.

Обозначения: 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно изоферменты ЛДГ-1, ЛДГ-2, ЛДГ-3, ЛДГ-4 и ЛДГ-5. Стрелки Н и М указывают на изоферменты с преобладанием Н и М субъединиц.

симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах выявляется высокая актив-ность Н и М-изоформ ЛДГ (рис.4). Вместе с тем в указанных клетках обнару-живаются важные принципиальные различия в соотношении активности меж-ду Н и М изоформами ЛДГ (рис.4).

В нейронах, как и в симпатическом ганглии, в спектре ЛДГ преобладает активность  Н-изоформ (Н/М > 1). Такая особенность изоферментного про-филя ЛДГ нейронов и ганглия в целом выглядит закономерной, так как вы-сокий уровень активности Н-изоформ необходим для реализации высоко-эффективной аэробной фазы энергопродукции (Хочачка П., Сомеро Дж., 1977; Gladden L., 2004).

Вместе с тем изоферментный профиль ЛДГ расположенных вокруг ней-ронов сателлитных глиоцитов характеризуется противоположной направ-ленностью (рис.4). В этих клетках наиболее активны М-изоформы (Н/М < 1), что свидетельствует, с учетом субстратной специфичности М-изоформ (Pellerin L., 2003; Bouzier-Sore A., et al., 2003), о том, что сателлитные глио-циты продуцируют лактат в значительно большем количестве, чем нейроны.

Выявленные на клеточном уровне различия ферментативных систем ЛДГ указывают, таким образом, на существование в симпатическом ганглии градиента в распределении лактата между симпатическими нейронами и окружающими их сателлитными глиоцитами. Наличие такого градиента между клетками, в соответствии с современными представлениями био-энергетики (Gladden L., 2004; Philp A. et al., 2005; Schurr A., 2006), создает принципиальные возможности для осуществления межклеточного транспорта лактата, который может использоваться в качестве дополнительного энер-гетического ресурса для интенсивно работающих клеток. Именно существо-вание такого механизма на основе трансферта  лактата через глио-синап-тические контакты в активно работающие нейроны из астроцитов, которые имеют точно такую же, как и сателлитные глиоциты, анаэробную направ-ленность энергетического обмена, предусматривается в головном мозге в соответствии с концепцией лактатного челночного механизма ANLSH (astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis) (Pellerin L., 2003; Pellerin L., Magistretty P., 2004;  Pierre K., Pellerin L., 2005).

Можно полагать в связи с вышеизложенным, что установленные разли-чия в ферментативных системах ЛДГ  симпатических нейронов и сателлит-ных глиоцитов характеризуют те же клеточные механизмы энергетического взаимодействия, которые предусматриваются концепцией ANLSH, и сател-литные глиоциты симпатического ганглия наделены  подобно астроцитам функциями энергообеспечения нейронов.

Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на ферментативную активность и изоферментный профиль ЛДГ в симпатическом ганглии

Синаптическая блокада нХР, как частичная, так и полная, ингибирует в значительной мере активность всей ферментативной системы ЛДГ (рис.3).

Рис. 3. Редукция изоферментного состава и активности ЛДГ в ганглии при уменьшении числа свободных никотиновых холинорецепторов.

Обозначения: К – контроль, Ч и П – частичная и полная блокада рецепторов, при введении ганглиоблокатора в дозах соответственно 10 и 50 мг/кг. Черным – показана относительная  доля (цифры в рамке) Н-субъединиц фермента, стрелками - уменьшение активности общей ЛДГ и ее  остаточная активность (подчеркнутые цифры). 1, 2, 3, 4 и 5 - обозначения изо-ферментов ЛДГ те же, что и на рис.2. Все различия достоверны (U критерий, p < 0,05).

Наибольшие по величине сдвиги наблюдаются уже при частичном блокиро-вании нХР. В этих условиях синаптической блокады происходит полное ис-чезновение катодных фракций (ЛДГ-4 и ЛДГ-5). Активность остающихся в спектре анодных фракций (ЛДГ-1 и ЛДГ-2) и гибридной формы ЛДГ-3, при этом, резко снижается, составляя значительно меньше половины (29%, 30% и 13% соответственно) от активности этих изоформ в контроле (рис.3). След-ствием этих изменений является значительное снижение (более чем в 5 раз) активности общей ЛДГ.

В редуцированном таким образом спектре ЛДГ, состоящем только из трех изоферментов, заметно выражена поляризация между активностью анод-ных фракций ЛДГ-1 и ЛДГ-2, на долю которых приходится 86% всей ак-тивности ферментативной системы ЛДГ, и активностью гибридной изо-формы ЛДГ-3 (рис.3). На долю последней приходится только 14% всей ак-тивности ЛДГ, в связи, с чем она не вносит заметный вклад в общую актив-ность ЛДГ.

В результате таких изменений, в спектре ЛДГ при частичной блокаде нХР вклад (83%) Н-субъединиц в общую активность ЛДГ, по сравнению с нормой заметно возрастает (рис.3). Это означает, с учетом функциональной значимости  Н и  М изоформ (Pellerin L., 2003; Gladden L., 2004), что метабо-лическая направленность  ферментативной  системы ЛДГ и характер ее воз-действия на энергопродуцирующие механизмы в ганглии при блокировании рецепторов меняются: основной процесс наработки пирувата из лактата сох-раняется, тогда как катализация обратного процесса - превращения пирувата в лактат в значительной степени снижается.

Следует при этом подчеркнуть, что в силу резкого, почти пятикратного падения активности ЛДГ, в результате которого активность фермента состав-ляет только 19% от уровня контроля (рис.3), сама по себе степень участия ферментативной системы ЛДГ в реализации аэробной фазы энергопро-дукции при частичном блокировании нХР в целом оказывается существенно сниженной.

При полном блокировании нХР процесс сжатия спектра ЛДГ продол-жается (рис.3). Из спектра окончательно исчезает гибридная форма изофер-мента ЛДГ-3 и в составе ферментативной системы ЛДГ остаются только две изоформы: ЛДГ-1 и ЛДГ-2. Активность этих изоформ, по сравнению с условиями частичного блокирования рецепторов, при этом еще более снижается. 

Следует подчеркнуть, что, и при частичном блокировании и при полном блокировании нХР, сохраняется полная синхронность в изменениях ЛДГ-1 и ЛДГ-2. В результате этого уровень остаточной активности одинаков для ЛДГ-1 и ЛДГ-2. Этот показатель (16%), равно как остаточная активность ЛДГ в целом (9%), существенно ниже (р < 0,01), чем величина этих показа-телей при частичном блокировании никотиновых рецепторов.

В редуцированном таким образом спектре, полностью представленным только двумя изоферментами, суммарный вклад в ферментативную актив-ность Н-субъединиц составляет 89%, а М-субъединиц - всего 11%. Это гово-рит о том, что метаболическая направленность ферментативной системы ЛДГ и ее воздействие на энергопродуцирующие механизмы в ганглии при полной блокаде нХР приобретают практически односторонний характер, ориентиро-ванный на превращение лактата в пируват, на фоне практически полного прекращения обратной реакции с участием ЛДГ – превращения пирувата в лактат.

Редукция изоферментного состава и крайне низкий уровень активности ЛДГ при полном блокировании никотиновых холинорецепторов значительно ограничивает потенциальные возможности ферментативной системы ЛДГ для участия в энергопродуцирующих механизмах ганглия.

Таким образом, частичная блокада нХР в симпатическом ганглии вы-зывает редукцию спектра ЛДГ и значительное снижение активности всей ферментативной системы ЛДГ. Полная блокада нХР практически исключает участие этого фермента, как в энергообеспечении, так и в других процессах метаболизма. Вместе с этим блокирование холинорецепторов трансфор-мирует функциональную направленность ферментативной системы ЛДГ, существенно сдвигая катализируемую этой системой реакцию взаимо-превращения пирувата и лактата в сторону преимущественного образования пирувата.

Полученные результаты позволяют заключить, что органноспеци-фичный для КШСГ изоферментный состав и активность ЛДГ поддерживают-ся только при нормально функционирующих нейрональных никотиновых холинорецепторах и указывают на важную роль этих рецепторов в меха-низмах гомеостаза ферментативной системы ЛДГ.

Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на ферментативную систему ЛДГ в симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах

В нейронах блокирование нХР вызывает значительное снижение актив-ности изоферментов ЛДГ (рис.4).

Рис.4. Ферментативная система ЛДГ в клетках симпатического ганглия в разных условиях блокады никотиновых холинорецепторов.

Обозначения: По горизонтали: К – контроль; Ч и П – частичная и полная блокада рецепторов (через 1 час после введения ганглиоблокатора в дозах 10 и 50 мг/кг соответственно). По вертикали: активность ферментов в отн. ед.

Примечание: нХР – никотиновые холинорецепторы; Н/М отношение между активностью Н и М-формами ЛДГ. Стрелка на диаграмме указывает направление инверсии изофермент-ного профиля ЛДГ глиоцитов при нарастающей блокаде нХР.

Также как и в целом ганглии, в нейронах, по мере сокращения числа свободно функционирующих нХР, наблюдается синхронное, весьма зна-чительное и последовательное падение активности ЛДГ и входящих в ее сос-тав изоформ (рис.4). При блокировании части рецепторов активность общей  ЛДГ  в нейронах  уменьшается  на 41,5%, при полном блокировании – умень-шение активности фермента составляет уже 71% относительно уровня его ферментативной активности в контроле. Такая же последовательность в ин-гибировании ферментативной активности при усилении блокирующего воз-действия регистрируется и в отношении отдельных изоферментов ЛДГ. Для Н-изоформ полученное снижение активности составляет соответственно 25% при частичной, и 58% при полной блокаде. Для М-изоформ уровень снижения активности относительно контрольных показателей составляет соответ-ственно 36% и 62%.

В динамике изменения активности всех трех составляющих фермента-тивной системы ЛДГ (общей ЛДГ, Н- и М-изоформ), которые определяются в рамках одного и того же гистохимического метода, но с помощью независя-щих друг от друга цитохимических реакций, прослеживается совпадающая тенденция, которая выражается в том, что вместе с уменьшением свободно функционирующих никотиновых холинорецепторов, линейно, с довольно высоким коэффициентом детерминированности (R2 = 0,99) синхронно умень-шается и их активность (рис.4).

Важным следствием блокады является то, что в нейронах вместе с ингибированием активности ферментативной системы ЛДГ, происходит сдвиг в сторону большей активности Н-субъединиц, осуществляющих прев-ращение лактата в пируват. Связано это с тем, что активность М-изоформы при блокаде нХР снижается в большей степени, чем  активность Н-изоформы, в результате чего величина отношения Н/М в нейронах при блокаде, хотя и незначительно, но повышается (рис.4) и при частичной блокаде отношение Н/М устанавливается на уровне более высоком, чем  контрольный (p < 0,05).

Вышеизложенные результаты показывают, что уменьшение уровня сво-бодных нХР вызывает сдвиги в функциональной направленности фермента-тивной системы ЛДГ в нейронах в сторону интенсификации участия фермен-та в процессах аэробной фазы энергопродукции.

Полученная при блокаде однотипность в изменениях ЛДГ, Н и М ее изоформ, совокупный вклад которых по существу определяет общий уровень активности ЛДГ, каждая из которых выявлялась с помощью разных цито-химических методик, объективно указывает на закономерное участие нХР в регуляции активности всей ферментативной системы ЛДГ нейронов. При этом характер цитохимических изменений ЛДГ в нейронах достаточно хорошо согласуется с аналогичными изменениями ЛДГ, полученными в тех же условиях с помощью биохимического анализа этого фермента на уровне целого симпатического ганглия.

Таким образом, нейрональным никотиновым холинорецепторам при-надлежит ключевая роль в регулировании ферментативной системы ЛДГ как на уровне симпатического ганглия, так и входящих в его состав нейронов.

Совокупность представленных результатов позволяет заключить, что синаптический сигнал через нХР представляется важной составной частью механизмов, которые, во-первых, формируют изоферментный спектр ЛДГ, во-вторых, обеспечивают необходимый уровень активности входящих в состав ЛДГ ферментов и, в-третьих, поддерживают ее функциональную специ-фичность, направленную на  обеспечение необходимой для нормальной деятельности ганглия сбалансированности лактат-пируватной реакции.

В сателлитных глиоцитах расположенных вокруг нейронов наблю-дается при блокаде нХР другие изменения активности ЛДГ (рис.4).

В этих клетках наибольшие изменения происходят только с М изофор-мами ЛДГ, активность которых по мере усиления блокирующего воздействия значительно снижается - на 43% относительно контрольных показателей при частичной блокаде нХР и на 55,5% - при полной блокаде. Активность Н-форм ЛДГ в  глиоцитах, в отличие от нейронов, при этом не меняется (р >  0,05). Достоверное снижение активности общей ЛДГ (p < 0,05) регистрируется только при полной блокаде нХР (рис.4) и очевидно связано с отмеченными выше изменениями в активности М изоформ.

Важным следствием особенной реакции ЛДГ сателлитных глиоцитов на блокаду нХР является резкое изменение в этих клетках отношения между уровнями активности изоформ ЛДГ (Н/М), которое претерпевает, по срав-нению с интактными клетками полную инверсию (рис.4). Так, при частичной блокаде отношение Н/М в указанных клетках уже выше единицы (1,15).  При полной блокаде изоферментный профиль ЛДГ глиоцитов статистически значимо (р>0,05) не отличается от величины отношения Н/М, характеризу-ющего нейроны интактного ганглия. (рис.4).

Таким образом, при блокаде нХР в сателлитных глиоцитах происходит трансформация энергетических механизмов, по крайней мере, в отношении ферментативной системы ЛДГ, которая начинает функционировать также как в интактных симпатических нейронах.

Полученные экспериментальные результаты позволяет закономерно полагать, что в сателлитных глиоцитах механизмы энергетического обмена, по крайней мере, в части функционирования ферментативной системы ЛДГ, контролируются через никотиновые рецепторы холинергической синапти-ческой активностью симпатических нейронов, которые тем самым могут прямо влиять на процессы выработки лактата в окружающих симпатические нейроны сателлитных глиоцитах.

Установленная в работе интеграция энергетических процессов между нейронами и окружающих их сателлитными глиоцитами, которая детермини-руется нейронами через синаптическое взаимодействие с нХР, может рас-сматриваться как один из ключевых механизмов энергетической организации КШСГ, подобно аналогичному клеточному механизму энергетической орга-низации головного мозга в соответствии концепцией лактатного челночного механизма ANLSH (Pellerin L., 2003; Pellerin L., Magistretty P., 2004;  Pierre K., Pellerin L., 2005).

Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на содержание макроэргов в симпатическом ганглии

Блокирование нейрональных нХР приводит к весьма значительному, больше чем на половину, синхронному снижению содержания всех аденилат-ных макроэргов (рис.5).

Рис.5. Дефицит в содержании аденилатных макроэргов в симпатическом ганглии при блокировании никотиновых холинорецепторов (нХР)

Обозначения.  По горизонтали:  К - контроль; Ч - частичное и П - полное блокирование рецепторов, при применении доз ганглиоблокатора соответственно 10 и 50 мг/кг (через 1 час после введения). По вертикали: содержание макроэргов в мг%.

Все различия достоверны (U критерий, p < 0,05).

Поскольку количественные изменения макроэргов отражают не только интенсивность энергопродуцирующих процессов, но и уровень клеточного метаболизма в целом (Хватова Е.М., с соавт., 1987; Dzeja P.,Terzic A., 1998), такая динамика свидетельствует о значительном энергетическом дефиците и о снижении общего метаболического потенциала при блокаде нХР.

При этом степень отмеченных изменений выражена тем сильнее, чем меньше в ганглии остается функционирующих нХР, численность которых, как известно (Першин Б.Н., 1966; Скок В.И. и соавт.,1987; Бровцына Н.Б. и соавт., 1996), уменьшается с увеличением дозы ганглиоблокатора

Создаваемый блокадой дефицит макроэргов вместе с тем носит обра-тимый характер и в последующем, независимо от степени первоначально примененного блокирующего воздействия, содержание макроэргов начинает столь же последовательно увеличиваться (рис.6).

Рис.6. Последовательное увеличение содержания аденилатных макроэргов в симпатическом ганглии при разблокировании никотиновых холинорецеп-торов (нХР)

Обозначения.  По горизонтали:  Время после введения ганглиоблокатора (в час.). По вертикали: содержание макроэргов в мг%.

(К) - контроль; (Ч) - частичное и (П) - полное блокирование рецепторов, при применении доз ганглиоблокатора соответственно 10 и 50 мг/кг. При оценке достоверности различий средних применяли U критерий при p < 0,05. На графиках показаны линии тренда линейной апроксимации.

При этом содержание аденилатов закономерно повышается вместе с постепенным восстановлением нормальной численности свободно функцио-нирующих нХР, что является естественным следствием ослабления и окон-чания синаптической блокады (Першин Б.Н., 1966; Скок В.И. и соавт., 1987; Бровцына Н.Б. и соавт., 1996).

Таким образом, характер динамики полученных сдвигов аденилатного пула макроэргов позволяют заключить, что синаптические нХР  принимают закономерное участие в механизмах формирующих такой уровень содер-жания макроэргов, который обеспечивает необходимый энергетический баланс, отвечающий запросам нормально функционирующего симпати-ческого ганглия.

Заключение

На основании полученных результатов впервые установлены законо-мерности, управляющие функциональной деятельностью краниального шей-ного симпатического ганглия. Суть этих закономерностей заключается в том, что, поступающий в ганглий через нейрональные никотиновые холинорецеп-торы афферентный информационный поток осуществляет включение и пос-ледующую модуляцию в ганглии определенных молекулярных и специфичес-ких клеточных механизмов (схема 1).

Синаптический сигнал через никотиновые холинорецепторы принимает участие в механизмах энергетического гомеостаза симпатического ганглия, обеспечивая управление базовым уровнем ключевых энергетических пара-метров - аденилатного пула макроэргов и ферментативной системы ЛДГ, активизирует и модулирует процессы синтеза белка в нейронах и окружа-ющих нейроны сателлитных глиоцитах.

Вместе с этим синаптический сигнал через никотиновые холино-рецепторы потенцирует в симпатическом ганглии специфическое клеточное взаимодействие  – метаболическую интеграцию  между симпатическим ней-

Схема 1. Включение через нейрональные никотиновые холинорецепторы (нХР) специфических, связанных с поступающим синаптическим сигналом молекулярных и клеточных механизмов в симпатическом ганглии.

I  –  поток катионов, индуцируемый синаптическим сигналом,  II  -  обеспечение базовых уровней содержания макроэргов в ганглии и

III  - активности ферментативной системы ЛДГ в ганглии, нейронах (Н) и сателлитных глиоцитах (С), IV- индукция и модуляция синтетической активности в нейронах (Н) и сателлитных глиоцитах (С); Н-Г – нейрон-глиальная  метаболическая интеграция: сопряжение синтетических (1) и энергетических(2) процессов в симпатических нейронах (Н) и сателлитных глиоцитах (С).

роном и сателлитными глиоцитами, тем самым, связывая эти клетки в единую функционально - метаболическую единицу.

В этой системе метаболизм сателлитных глиоцитов контролируется нейронами. Симпатические нейроны через никотиновые холинорецепторы сопрягают активность своей белок-синтезирующей системы, по крайне мере на уровне трансляции, с активностью белок-синтезирующего системы сосед-них с ними сателлитных глиоцитов и детерминируют анаэробную направ-ленность энергетических процессов в сателлитных глиоцитах, ориентируя эти клетки на избыточное продуцирование лактата.

Использованная в работе экспериментальная модель, приводящая к блокированию ионных каналов в никотиновых холинорецепторах, делает возможным понимание природы сигнальных механизмов, трансформиру-ющих регуляторное воздействие через никотиновые холинорецепторы. К таковым относятся ионотропные эффекты селективного потока катионов Na+, K+ и Ca 2+, лежащие в основе быстрой холинергической синаптической передачи.

ВЫВОДЫ

1. Основополагающий принцип морфофункциональной организации симпати-ческого ганглия заключается в сопряжении синаптических сигналов поступа-ющих через никотиновые холинорецепторы симпатических нейронов с мета-болическими процессами в симпатическом ганглии.

2. Синаптический сигнал через никотиновые холинергические рецепторы формирует в симпатическом ганглии временную межклеточную интегра-тивную систему, состоящую из метаболически взаимодействующих между собой симпатических нейронов и окружающих нейроны сателлитных глио-цитов. В отсутствие такого сигнала симпатические нейроны и сателлитные глиоциты представляют собой метаболически самостоятельные, независящие друг от друга клеточные системы.

3. Индуцируемое холинергическим синаптическим сигналом нейрон – глиаль-ное взаимодействие проявляется в синхронизации процессов синтеза белка в  симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах в ответ на изменения синаптической активности. 

4. В обусловленном синаптическим сигналом межклеточном взаимодействии ведущая роль принадлежит симпатическим нейронам, которые через нико-тиновые холинергические рецепторы осуществляют контроль за процессами синтеза белка на уровне трансляции в соседних с ними сателлитных глио-цитах и детерминируют в сателлитных глиоцитах специфический изофер-ментный профиль ЛДГ, определяющий в этих клетках анаэробную направ-ленность энергетических процессов.

5. Энергетические процессы в симпатических нейронах и сателлитных глио-цитах существенно различаются. В симпатических нейронах ферментативная система ЛДГ ориентирована на обеспечение доминирования аэробной фазы энергопродукции. В сателлитных глиоцитах изоферментный профиль ЛДГ, напротив, функционально обеспечивает доминирование анаэробной фазы и связанной с ней интенсивной продукцией лактата.

6. Синаптические никотиновые холинорецепторы являются необходимым функциональным звеном, через которое в ответ на изменения синаптической активности холинергических синапсов осуществляется активизация про-цессов трансляции белка в симпатических нейронах. При этом синаптический сигнал, поступающий через никотиновые холинорецепторы, оказывает моду-лирующее влияние на процессы трансляции белка в нейронах, детерминируя относительную быстроту и интенсивность наступающего цитохимического ответа.

7. Сателлитные глиоциты краниального шейного симпатического ганглия в ответ на изменение синаптической активности проявляют высокую мета-болическую лабильность, которая выражается в модуляциях содержания рРНК и изменениях изоферментного профиля ферментативной системы ЛДГ в этих клетках. В то же время метаболическая реакция сателлитных глио-цитов существенно отличается от реакции симпатических нейронов.

8. Ферментативная система ЛДГ в краниальном шейном симпатическом ганглии кроликов представлена в норме пятью основными изоформами: ЛДГ-1, -2, -3, -4 и -5. Наиболее активны анодные фракции ЛДГ-1 и ЛДГ-2. Относи-тельная активность изоферментов в спектре ЛДГ последовательно убывает от ЛДГ-1 к ЛДГ-5.

9. Через синаптическое взаимодействие с никотиновыми холинорецепторами обеспечивается необходимый для нормальной функциональной деятельности симпатического ганглия изоферментный состав и уровень активности каж-дого из изоферментов ЛДГ, устанавливаются базовые параметры аденилат-ного пула макроэргов.

10. Полученные результаты по изучению динамических изменений энерге-тических и метаболических параметров дают основания заключить, что синаптический сигнал через никотиновые холинорецепторы управляет энергетическим и метаболическим статусом симпатического ганглия в усло-виях его нормальной функциональной деятельности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гореликов П.Л. Динамика содержания цитоплазматической РНК симпа-тических нейронов при синаптической блокаде. //Бюлл. экспер. биол. и мед.-  1980.-  т. 89.-  № 2.-  C. 232 – 234.

2. Гореликов П.Л. Светооптическая характеристика базофильного вещества симпатических нейронов в условиях синаптической блокады. //«Проблемы молекулярной биологии и патологии сельскохозяйственных животных». Сб. научн. тр. М.: Моск.вет.акад.-1980.- Т. 113.- С. 91 – 94.

3. Гореликов П.Л. Функциональные изменения хроматофильного вещества и содержание РНК в цитоплазме симпатических нейронов при нарушении синаптической передачи. //Арх.  анат.  гист.  эмбр.-  1981.-  т. 81.-  № 7.- С. 58 – 64.

4. Александровская О.В., Козлов Н.А., Гореликов П.Л. Морфологические изменения ганглиев периферической нервной системы при постнатальном развитии и компенсаторном ответе. //«Проблемы вирусологии, молекулярной биологии и гистологии сельскохозяйственных животных». Сб.научн.тр. М.: Моск.вет.акад.-1983.- С. 56 – 58.

5. Гореликов П.Л.  Содержание  РНК  в нейронах и перинейрональной нейро-глии краниального шейного симпатического ганглия при синаптической бло-каде. //В кн.: «Морфологические исследования в практике здравоохранения и животноводства». М.: Наука. - 1984.- С. 34 – 37.

6. Гореликов П.Л., Козлов Н.А., Плахотина Л.М. Морфо-функциональные проявления компенсаторного ответа симпатической системы сельскохозяй-ственных животных в условиях гипер- и гиподинамии. //«Возрастная и эколо-гическая морфология животных в условиях интенсивного живодноводства». Сб. научн. тр. Ульяновск.: Ульяновский с.-х. ин-т.- 1987.- С. 85 – 87.

7. Гореликов П.Л. Метаболизм РНК в условиях дозированной гипофункции нейронов. //«Актуальные проблемы ветеринарной и зоотехнической науки в интенсификации живодноводства». Мат.конф.посв.70-летию МВА. М.: Моск. вет. акад.-1990.- С. 157 – 158.

8. Гореликов П.Л. Некоторые особенности метаболизма РНК в нейронах периферической нервной системы в условиях дозирования гипофункции. //В кн.: «Морфофункциональные основы формирования в онтогенезе адаптивных возможностей организма человека и животных». М.: ИЭМЭЖ АН СССР.- 1991.- С. 11 – 12.

9. Гореликов П.Л.  Морфофункциональный статус периферической нервной системы кроликов при дозированной гипофункции. //«Морфофункциональ-ный статус млекопитающих и птиц». Сб. научн тр. Симферополь: Крымский с.-х. ин.-т. и Крымский мед. ин.-т.- 1995.- С. 54 – 55.

10. Гореликов П.Л. Особенности энергообеспечения клеток нервной ткани в краниальном шейном ганглии в норме и при синаптической блокаде. //«Материалы методической и научной конференции» Сб. научн тр. М.: МГАВМБ. - 2001.- С. 170 – 171.

11. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Влияние блокады Н-холинергических синапсов в верхнем шейном ганглии на ферментативную систему ЛДГ. Тез. докл.  VII  конгресса  Межд. Ассоциации  морфологов.  //Морфология.- 2004.-

т. 126.- № 4.- С. 38.

12. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Эффект частичного и полного нарушения транссинаптической  передачи  в  холинергических  синапсах  на  содержание

р-РНК в симпатических нейронах. //«VII Всероссийская конференция по патологии клетки».  Сб. научн. тр. М.: ГУ НИИ МЧ РАМН. - 2005.- С. 37 – 38.

13. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Количественные изменения РНК в цито-плазме симпатических нейронов в условиях ганглионарной блокады. //«Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии. Клиническая мор-фология новообразований эндокринных желез». Мат. научн. конф. М.: ГУ НИИ МЧ РАМН.- 2005.- C. 92 – 95.

14. Гореликов  П.Л., Савельев  С.В. Изоферментный спектр лактатдегидро-геназы  в  краниальном  шейном  симпатическом ганглии в норме и при синап-тической  блокаде. //Бюлл.  экспер.  биол.  и  мед.- 2005.-  т.140.-  № 12.- C. 642 – 644.

15. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Глиальные нуклеиновые кислоты в симпа-тическом ганглии при синаптической блокаде.//«Актуальные вопросы морфо-генеза в норме и патологии». Сб. научн. тр. М.: ГУ НИИ МЧ РАМН.- 2006.- С. 70 – 73.

16. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Метаболический ответ глиальных клеток на блокирование синаптической передачи в симпатическом ганглии.  Мат. докл.  VIII  конгресса  Межд. Ассоциации  морфологов. //Морфология.- 2006.-

т. 129.- № 4.- С. 39.

17. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Вероятный механизм энергообеспечения симпатических нейронов с помощью глиальных клеток. //«Бабухинские чтения в Орле». Мат. 5-й Всеросийской конф. ЗАО «Ретиноиды». М.:-2006.- С. 43 – 44.

18. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Возможное участие лактата в нейрон-глиальном взаимодействии через Н-холинергические синапсы в краниальном шейном  симпатическом  ганглии. //Бюлл.экспер. биол. и мед.-  2006.-  т.142.-

№ 11.- С. 573 – 575. (Gorelikov P.L., Saveliev S.V. Possible involvement of lactate in neuroglial interaction through nicotinic cholinergic synapses in the cranial cervical sympathetic ganglion. //Bull.  Exp.  Biol.  Med.-  2006.-  V.142.- N.5.-

p. 625 – 627.

19. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Участие Н-холинергических синапсов в ре-гуляции метаболизма РНК симпатических нейронов и сателлитных глиоци-тов. // Морфология.- 2007.- т.131.-№ 1.-С. 40 – 43.

20. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Влияние Н-холинергической синаптической блокады на содержание аденилатных макроэргов и на ферментативную систему  ЛДГ  в  симпатическом  ганглии.  //Биомед. хим.- 2007.-т.53.-Вып.3.-

С. 290 – 296.

21. Гореликов П.Л., Савельев С.В. Изоферменты лактатдегидрогеназы в симпатических нейронах  и сателлитных глиоцитах в норме и в условиях блокады никотиновых холинорецепторов. //Морфология.- 2007.- т.132.-№ 4.- С. 36 – 39.

22. Гореликов  П.Л.,  Савельев  С.В. Участие  Н-холинергических пери-ферических синапсов в энергетическом обмене симпатического ганглия. //Нейрохимия. – 2007. – т.24.-№ 2.- С. 132 – 137. (Gorelikov P.L., Saveliev S.V. Involvement of N-cholinergic peripheral synapses in energy exchange within a sympathetic ganglion. // Neurochem. J.-2007.-V.1.-N.3.- p. 208 – 213).

23.Гореликов П.Л. Характеристика ферментативной системы ЛДГ в краниальном шейном ганглии. //Научн. конф.«Актуальные вопросы мор-фогенеза в норме и патологии».Сб. научн. тр. М.: ГУ НИИ МЧ РАМН.- 2008.- C. 35 – 38.

24.Гореликов П.Л. Влияние никотиновых холинергических рецепторов на энергетический обмен краниального шейного симпатического ганглия. //Научн. конф.«Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии».Сб. научн. тр. М.: ГУ НИИ МЧ РАМН..- 2008.- C. 32 – 34.

* Курсивом выделены работы, опубликованные в журналах, входящих в список ВАК РФ

Соискатель:                                П.Л. Гореликов






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.