WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

  На правах рукописи

Плескова Светлана Николаевна

МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

ГУМОРАЛЬНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ

НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА

03.00.13 – физиология

14.00.36 – аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Нижний Новгород

2009

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология, физическая и аналитическая химия» Нижегородского государственного технического университета им. Р.Е. Алексеева

Научные консультанты:        доктор биологических наук, профессор

Хомутов Александр Евгеньевич;

доктор биологических наук, профессор

Новиков Виктор Владимирович

Официальные оппоненты:        доктор медицинских наук, профессор

Дурново Евгения Александровна;

доктор медицинских наук, профессор

Колюжин Олег Витальевич;

доктор биологических наук, доцент

Романова Елена Борисовна

Ведущая организация:

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. И. Н. Блохиной

Защита состоится «__»_________2009 г. в __ часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, д. 23, корп. 1, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан «__» ______________2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук, доцент С.В. Копылова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Неспецифическая резистентность является одним из центральных механизмов, поддерживающих физиологическую целостность организма (Ярилин, 1999). Это система «экстренного реагирования», подключающаяся к элиминации дестабилизирующих факторов до активации специфических компонентов защиты. Тем самым достигается выигрыш во времени, предоставляющий организму дополнительную возможность к настройке и реализации мощных адаптивных факторов. Этим, по-видимому, и обусловлена разноплановость и разнонаправленность реакций в системе неспецифической резистентности. Интерес к тонким молекулярным механизмам распознавания и взаимодействия между патогенами и системами защиты заставляет рассматривать эти механизмы на клеточном и гуморальном уровне. Традиционно принято делить совокупность реакций защиты на местный и системный иммунитет. В реализации защитных функций местного иммунитета полости рта большая роль принадлежит лизоциму слюны – фактору, способному к прямому бактериолизу грамположительных микроорганизмов (Дорофейчук, 1968).  Общепризнанность этой роли приводит к поиску практического приложения тестов по определению активности фермента. Среди клеточных факторов местного иммунитета можно выделить транзиторные и стационарные. В качестве стационарного клеточного фактора местного иммунитета полости рта необходимо особо отметить буккальные эпителиоциты – клетки на арене которых реализуются комплексные взаимодействия между представителями нормо- и патофлоры и осуществляются процессы реализации всего спектра защитных механизмов в системе неспецифической резистентности (Маянский и др., 1987). С переходом на системный уровень число гомеостатических факторов значительно возрастает. Многие из них находятся в тесной кооперации и образуют целостные системы и сети, например, система альтернативного каскада комплемента, система лектинового пути комплемента, цитокиновая сеть. Последние годы ознаменовались всплеском интереса к функционированию системы альтернативного каскада комплемента, поскольку она способна не только регулировать реакции гуморально-клеточной кооперации, но и принимать непосредственное участие в поддержании гомеостатического баланса. Однако некоторые вопросы остаются практически не освещенными, в частности, в литературе мало сведений о степени активации системы альтернативного каскада в зависимости от вида и штамма микроорганизма.

Не меньшее значение принадлежит и факторам местного иммунитета, которые не только выполняют гомеостатическую и элиминационную роль, но и могут служить высокоинформативными индикаторами нарушений местного гомеостаза.  Среди клеточных факторов системы неспецифической резистентности особую роль играют нейтрофильные гранулоциты (Маянский, 1989). Во-первых, эта фракция является превалирующей среди всех лейкоцитов крови, во-вторых, клетки находится в крови в преформированном состоянии, т.е. состоянии полной «боеготовности». В-третьих, нейтрофил является в определенном смысле убиквитарным для организма: он обнаруживается практически во всех тканях и органах в процессе острого воспаления. Экстренный и экстремальный характер деятельности нейтрофила нашел отражение и в особенностях клеточной морфологии.

Появившиеся в последние годы новые методы исследований позволяют не ограничиваться только визуализацией клеточных и тканевых объектов, или только регистрацией биохимических сдвигов в живых системах, но сочетают в себе морфологические и функциональные тесты (Dufrne Y.F., 2001). Появление новой методологии особенно важно в настоящее время, поскольку возрастающая абиогенная и биогенная нагрузка на организм человека делает чрезвычайно актуальной оценку границ резистентности и адаптационных возможностей различных систем органов, в особенности тех, центральной задачей которых является обеспечение гомеостатического баланса всего организма.  Указанные положения и явились основанием для наших исследований.

Цель исследования: изучить функциональную и морфологическую многовариантность реактивности местных и системных факторов врожденного иммунитета в ответ на биогенные и абиогенные воздействия.

Задачи исследования:

1. выявить вариабельность реактивности местного клеточного иммунитета в системе «буккальные эпителиоциты – микрофлора» и рассмотреть преимущества разных микроскопических методов в определении параметров колонизационной резистентности;

2. исследовать различия в функционировании лизоцима как гуморального неспецифического фактора местного иммунитета у здоровых детей и детей, страдающих кариесом и оценить возможности определения активности лизоцима слюны для использования в качестве прогностического критерия тяжести кариозного процесса;

3. изучить степень активации системы альтернативного каскада комплемента в реакциях с разными штаммами грамположительных и грамотрицательных бактерий и рассмотреть возможные причины вариабельности АПАК-реактивности;

4. разработать методику витального исследования нейтрофилов методом сканирующей зондовой микроскопии, выявить морфо-функциональные особенности клеток в зависимости от используемого буфера, сравнить морфологические параметры клеток, при использовании разных методов фиксации и изучить ригидность мембран нативных нейтрофильных гранулоцитов  и нейтрофилов, находящихся под воздействием биотических и абиотических факторов;

5. определить структурные и физиологические особенности работы фагоцитов в системе «яд-гепарин»;

6. исследовать морфо-физиологические особенности нейтрофильных гранулоцитов под воздействием различных физико-химических факторов и охарактеризовать разновариантность реактивности нейтрофилов.

Научная новизна работы.

Впервые продемонстрировано, что поверхность буккальных эпителиоцитов не однородна по механическим свойствам, и на ее поверхности могут выявляться «мягкие» участки.

Впервые выявлено, что межштаммовая вариабельность бактерий в системе альтернативного пути активации комплемента выражена в большей степени, чем межвидовая. Возможность функциональной активности в качестве только опсонического или опсонического и мембранолитического фактора показана для АПАК на разных штаммах Proteus.

Впервые в России разработана оригинальная методика витального наблюдения за клетками в режиме реального времени методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) без использования фиксации. Показано, что механическое воздействие зонда не оказывает повреждающего действия на живую клетку. Впервые в мире определена ригидность мембраны нейтрофильного гранулоцита.

Впервые продемонстрирована проапоптотическая активность липополисахарида в отношении нейтрофильных гранулоцитов при совместном механо-биохимическом воздействии и продемонстрировано поэтапное отделение «апоптозо-подобных» телец от клеток в режиме реального времени.  При воздействии пероксида водорода зарегистрирован новый механизм клеточной гибели – «мумификация» нейтрофила, связанная с повышением механической прочности клетки. Токсичность квантовых точек (CdSe/ZnS-МУК) впервые продемонстрирована на нейтрофилах и показан феномен разделения нейтрофилов по функциональной активности на три субпопуляции. Впервые продемонстрировано, что фагоциты в функционально активном состоянии более чувствительны к токсическому действию яда.

Теоретическая и практическая значимость работы. В представленной работе суммируются данные о многовариантности и разнонаправленности проявлений неспецифической защиты, которые отражаются в своеобразии морфологии и неоднозначности физиологического поведения различных факторов на клеточном и гуморальном уровне. Формулируется концепция о том, что хотя в ответ на альтерацию под давлением естественного отбора в системе неспецифической резистентности эволюция отобрала наиболее быстрые, эффективные и наименее энергоемкие реакции, тем не менее, спектр реализации этих реакций может быть достаточно широким.  Для реакций неспецифической резистентности узкое нацеливание является не приемлемым, поскольку элиминирующая функция первой линии защиты должна срабатывать и в случае атаки на организм ранее не известных альтерирующих факторов. В таких условиях только наличие выбора варианта и силы ответа на повреждение поможет удержать организм на грани гомеостатического баланса.

В представленной работе показана межштаммовая вариабельность для альтернативного пути активации комплемента, продемонстрированы различия морфо-функциональных характеристик нейтрофильных гранулоцитов в реакциях как с традиционными альтерирующими факторами (липополисахарид, пчелиный яд, пероксид водорода), так и с недавно появившимися продуктами нанотехнологии – квантовыми точками. В случае превышения компенсаторного порога происходит гибель клеток системы неспецифической резистентности. В зависимости от характера и дозы биогенных и абиогенных дестабилизаторов отмечена вариабельность клеточной гибели, в частности, нами зафиксированы три варианта гибели нейтрофильных гранулоцитов: некроз, апоптоз, «мумификация».

Методы атомно-силовой микроскопии и сканирующей лазерной микроскопии были адаптированы для биологических исследований. Применение новой методологии позволило решить ряд практических задач: создать модель для оценки упруго-механических свойств клеток и на ее основе определить значения ригидности нейтрофилов и буккальных эпителиоцитов, выявить токсическую активность квантовых точек (наноматериала, перспективного для биофотоники) и определить степень повреждения клеток при действии традиционного биологического токсиканта – пчелиного яда. Важными практическими приложениями работы являются выводы о протективной активности гепарина в отношении малых доз пчелиного яда и доказательство перспективности использования теста на активность лизоцима слюны в качестве прогностического критерия для оценки степени тяжести кариозного процесса у детей. Полученные теоретические знания дополнили курсы «Физиология человека», «Биомедицинские нанотехнологии», «Общая биотехнология», читаемые автором.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Использование режима микротвердости в методе сканирующей зондовой микроскопии выявляет наличие мягких областей на поверхности буккальных эпителиоцитов некоторых доноров. Но эти области не являются результатом контаминации микоплазмами и хламидиями.
  2. Функциональная активность системы альтернативного каскада комплемента в реакциях с бактериями проявляется неодинаково. Межштаммовая вариабельность более выражена, чем межвидовая.  Возможна реализация только опсонической или опсонической и литической функций альтернативного каскада комплемента в отношении бактерий рода Proteus.
  3. Исследование активности лизоцима слюны выявило различие в активности фермента у здоровых детей и детей, страдающих кариесом.
  4. Метод СЗМ позволяет исследовать изменения морфологии нейтрофильных гранулоцитов in vitro в режиме реального времени, а исследование фиксированных препаратов методом СЗМ не требует длительной предварительной подготовки образцов, но искажает морфологические параметры (объем и высоту) клеток.
  5. В процессе фагоцитоза нейтрофильными гранулоцитами образование псевдоподий и активация респираторного взрыва являются дискретными, разобщенными во времени процессами.
  6. Ригидность мембран нейтрофильных гранулоцитов составляет 2,1 ± 0,7 кПа при измерении методом СЗМ и расчете модуля Юнга.
  7. Нейтрофильные гранулоциты реагируют однотипной реакцией набухания на значительное механическое давление, на изменения рН среды и на внесение некоторых биохимических агентов (липополисахарида). Наблюдается периодическое колебание параметров клетки (изменения высоты и объема) и механических свойств (ригидности клеточной мембраны). Гибель клеток под влиянием разных токсических агентов (липополисахарид, квантовые точки, пчелиный яд, экзогенный пероксид водорода в токсической концентрации) реализуется по разным механизмам, но всегда сопровождается резким падением респираторной активности нейтрофильных гранулоцитов.
  8. Функциональные тесты (реакция люминолзависимой хемилюминесценции) в отношении исследования токсической активности пчелиного яда являются более чувствительными, чем морфологические. Угнетение респираторного взрыва происходит быстрее в том случае, если клетка активирована. И морфологические и функциональные тесты свидетельствуют о наличии у гепарина протективной активности в отношении малых доз пчелиного яда (1 – 10 мкг/мл).

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены: на 4 сессии молодых ученых (г. Дзержинск, 1999), на 5 сессии молодых ученых (г. Дзержинск, 2000), на 5 Международной конференции по фундаментальным наукам «Ломоносов-2000» (г. Москва, 2000), на II Всероссийском симпозиуме «Хроническое воспаление» (г. Новосибирск, 2000), на Международном «Workshop Scanning Probe Microscopy» (г. Нижний Новгород, 2001), на Международном «Workshop Scanning Probe Microscopy» (г. Нижний Новгород - Казань, 2004), на Международном EMBO/FEBS Workshop AFM applications in Biology (г. Оейраш, Португалия, 2004), на научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2004), на IV сессии научной молодежной школы-семинара «Промышленная безопасность и экология» (г. Саров, 2004), на международном форуме NSTI-Nanotech 2005 (г. Анахейм, США, 2005), на Международном FEBS-конгрессе «Molecules in Health and Diseases» (г. Стамбул, Турция, 2006), на международном симпозиуме «Topical problems of biophotonics» (г. Нижний Новгород – Москва, 2007),  на II Международном съезде общества цитологов (г. Санкт-Петербург, 2007), на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2008), на 12-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2008), на Международной конференции «Нанотехнологии в онкологии» (г. Москва, 2008), X Международном форуме «Высокие технологии XXI века» (г. Москва, 2009).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ___ страницах и состоит из введения, 2 глав обзора литературы, материалов и методов исследования, 8 глав собственных исследований, выводов, библиографического указателя. Список цитируемой литературы содержит ­___ источников, из которых ___ на русском и ___ на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 88 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе было использовано 5 штаммов бактерий  Staphylococcus aureus, 4 штамма S. epidermidis, 3 штамма Proteus vulgaris и 3 штамма P. mirabilis и штамм гриба Candida albicans 601 из коллекции кафедры микробиологии и иммунологии Нижегородской государственной медицинской академии, штаммы протея выделены на базе клинической инфекционной больницы №2. Для исследования активности лизоцима использовали тест-культуру Micrococcus lisodeicticus, предоставленную Нижегородским НИИ детской гастроэнтерологии.

Исследования проведены на нейтрофилах, выделенных из венозной крови здоровых доноров (500 человек). Для изучения системы комплемента использовался пул сывороток здоровых доноров (в общей сложности 1250 человек). Для исследования активности лизоцима слюны использована ротовая жидкость 9 здоровых детей и 57 детей, с разной интенсивностью кариозного процесса. В исследовании колонизационной резистентности буккальных эпителиоцитов использованы клетки 25 доноров (из них клетки 15 доноров изучались методом сканирующей зондовой микроскопии). Для исследования перитонеальных макрофагов было взято 15 нелинейных мышей массой 20-22 г. 

Определение АПАК – реактивности штаммов

Термин АПАК – реактивность отражает способность альтернативного пути активации комплемента подключаться к элиминации бактерий. Определение этого критерия проводили, используя оригинальную методику инактивирования сыворотки бактериями с использованием в качестве индикатора активности штаммов реакцию C3b – зависимой адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса. Принцип метода заключается в способности декстранов (сефадекса) активировать комплемент по альтернативному пути. Сефадекс G50, Fine взвешивали в ЗФР и инкубировали на водяной бане (100С, 60 мин). После трехкратного отмывания  ЗФР гранулы  ресуспендировали в растворе Хенкса (Маянский и др., 1991). Взвесь бактерий смешивали в равных объемах с пулом сывороток здоровых доноров. В контроле вместо взвеси микроорганизмов использовали ЗФР. Для исключения активации комплемента по классическому пути в систему добавляли ЭГТА – MgCl2. Пробы инкубировали (37С, 60 мин), после чего бактерии осаждали центрифугированием (800g, 10 мин), а сыворотку использовали для изучения остаточной активности АПАК. Показатели АПАК – реактивности выражали в процентах по формуле:

(1- ------ )  х 100%  ,

  N контроль

где  N опыт  и  N контроль - число позитивных гранул в опытной и контрольной пробах.

Получение липополисахарида из бактерий рода Proteus

Использовали метод  экстракции ЛПС из бактерий ЭДТА (Григорьева и др., 1998; Live, Morrison, 1972). 

Люминолзависимая хемилюминесценция

Взвесь нейтрофилов в среде Хенкса (0,5 • 106 кл/мл) смешивали с 0,1 мл раствора люминола  (Невмятуллин и др., 1987) и выдерживали 15 мин в жидкостно-стинциляционном счетчике «Бета-1» (КПО, «Медаппаратура», Киев). После регистрации спонтанной хемилюминесценции в каждый флакон вносили по 0,05 – 0,2 мл стимулятора.

Выделение нейтрофильных гранулоцитов

Кровь здоровых доноров стабилизировали гепарином (50 ед/мл) и разводили ЗФР в соотношении 1:1, наслаивали на двойной градиент фиколла-верографина и центрифугировали (200g, 45 мин). Нейтрофильное кольцо выделяли и дважды отмывали ЗФР (Подосинников и др., 1981). Остаточные эритроциты лизировали холодным изотоническим раствором NH4Cl (12 мин, 0°С). Взвесь нейтрофилов отмывали от гемолизата ЗФР.

Получение буккальных эпителиоцитов

Забор буккального эпителия проводили с внутренней поверхности щеки от здоровых доноров в возрасте 20 – 35 лет. Клетки отмывали ЗФР дважды (40g, 5 мин), к осадку добавляли ЗФР, доводя концентрацию клеток до 106 кл/мл.  Полученную взвесь помещали на предметное стекло, готовили мазок и фиксировали метанолом (10 мин), затем красили азуром А (1%, 30 сек). Подсчитывали колонизацию 100 эпителиоцитов, рассчитывали число микробных клеток на один эпителиоцит (Маянский и др., 1987).

Приготовление мазков-отпечатков

Предметные стекла прикладывали к внутренней поверхности щеки, мазки высушивали на воздухе, фиксировали метанолом 10 мин и отмывали дистиллированной водой (Быкова и др., 1987).

Определение активности лизоцима слюны нефелометрически

Учитывали изменение коэффициента светопропускания микробной взвеси тест-культуры Micrococcus lisodeicticus под влиянием лизоцима по сравнению с показателем исходной микробной взвеси (Дорофейчук, 1968). Активность фермента определяли в процентах.

Прямая флюоресценция для выявления ДНК

Мазки окрашивали раствором метиленового зеленого (18-20°С, 30 мин), отмывали, высушивали и окрашивали Hoechst 33258 («Hoechst», USA),  смешивали с красителем Гимзе в конечной концентрации (1 мг/мл, рН 7,2). Мазки микроскопировали под масляной иммерсией на люминесцентном микроскопе «Leica» («Microsystems Wetzlar GmbH», Германия) при = 360 – 390 нм  (Староверова, 2003).

Реакция иммунофлюоресценции с применением антител, меченных флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ)

На фиксированный мазок наносили 30 мкл раствора антитела-ФИТЦ, инкубировали во влажной камере (37°С, 20 мин). Не связавшиеся антитела для устранения неспецифического свечения смывали, препараты высушивали (18-20°С, 30 мин). Микроскопировали под масляной иммерсией с увеличением х 560 (ОАО «ЛОМО», Санкт-Петербург).

Исследования методом сканирующей зондовой микроскопии

Использовали сканирующий зондовый микроскоп Solver BIO NT-MDT (Зеленоград), зонды с жесткостью 0,3 N/m, радиус закругления кончика зонда составлял 50 nm. Фиксированные препараты (способ сканирования в воздушной фазе) и живые клетки, находящиеся в растворе Хенкса (сканирование в водной фазе) исследовались как в контактном, так и в полуконтактном режимах.

Использование спектроскопии для определения ригидности клеточных мембран

Для оценки ригидности мембран использовали режим спектроскопии. Ригидность мембран оценивалась по модулю Юнга, который рассчитывали согласно теории Герца (Hassan et al., 1998; Henderson, H. Oberleithner, 2000).

Исследование методом санирующей лазерной микроскопии

Клетки в витальном состоянии (жизнеспособность по трипановому тесту 99 %) в растворе Хенкса вносились в жидкостную ячейку и поддерживались в ней при 37° С. После проведения контроля, в систему добавляли квантовые точки.

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ проводили в пакетах Origin 5,0 Server и Bopstatistics 4.03 по общепринятой методике (Гланц, 1998). Рассчитывали выборочную среднюю и стандартное отклонение. Статистически значимыми различия между группами признавались, если р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для оценки морфо-функциональных изменений неспецифической резистентности исследовали факторы местного и системного иммунитета. Определялась их реактивность в ответ на внешнее раздражение и степень толерантности к нему. Первой линией обороны на пути антигена выступают факторы местного иммунитета. Гомеостатические процессы полости рта реализуются благодаря барьерной функции буккального эпителия, колонизационной резистентности, защитными свойствами ротовой жидкости (Боровский, Леонтьев, 1991).  Лишь в случае несостоятельности этих факторов или в случае наличия у антигена мощного патогенного потенциала происходит инвазия альтерирующего агента в глубокие ткани организма. В этом случае подключается более мощный механизм стабилизации гомеостаза – системный врожденный иммунитет, важнейшим гуморальным фактором которого является система комплемента, а клеточным – нейтрофильные гранулоциты.

ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ И КОЛОНИЗАЦИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ БУККАЛЬНЫХ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ У РАЗНЫХ ГРУПП ДОНОРОВ

Производилась оценка возможности визуализации микробного пейзажа буккальных эпителицитов (БЭ) методом СЗМ. Результаты сканирования продемонстрировали выявление на поверхности БЭ представителей нормальной микрофлоры (преимущественно стрептококков). Однако помимо объективности, СЗМ не имеет существенных преимуществ перед световой микроскопией в оценке естественной колонизации. Это объясняется тем, что поверхность клеток имеет собственную ворсинчатую структуру, которая не видна при использовании световой микроскопии, но четко выявляется при исследовании топографии зондом. При этом ворсинки клеток частично маскируют цепочки стрептококка на поверхности БЭ. Характер, величина и расположение ворсинок у доноров демонстрировали выраженную вариабельность.

Интересные результаты получены при использовании режима микротвердости (режим распределения твердо-упругих участков по поверхности клеток, где «мягкие» структуры выглядят более темными). У троих доноров (из 15) на апикальной поверхности выявлены более мягкие по сравнению с остальной поверхностью участки мембраны клетки, при этом колонизационная резистентность соответствовала нормальному состоянию полости рта (20 – 50 бакт/эпителиоцит). Размеры мягких участков варьировали от 0,1 мкм  до 1,5 мкм. Выделенные области не имели соответствия структурам на топографическом изображении БЭ (рис. 1). Согласно исследованиям Борхсениус С.Н. и др. (2002) может наблюдаться контаминация клеток микоплазмами. Размеры микоплазм (около 0,3 мкм) попадают в диапазон выявленных «мягких» областей. Для того чтобы определить возможность микоплазменной, хламидиальной или вирусной контаминации проводилось окрашивание БЭ Hoechst 33258. Однако у всех исследуемых доноров была выявлена экстрануклеарная ДНК на поверхности клеток, поскольку Hoechst 33258 окрашивает любую ДНК, в том числе и ДНК микрофлоры. Поэтому для окончательного решения вопроса о контаминации микоплазмами и/или хламидиями клетки обрабатывали специфическими антителами, меченными ФИТЦ к микоплазмам и хламидиям, колонизирующим БЭ. Во всех препаратах не наблюдалось специфического свечения, характерного для ФИТЦ, что доказывает  отсутствие микоплазменной и хламидийной контаминации. Одному из доноров была проведена ПЦР-диагностика, которая также исключила наличие микоплазм и хламидий. 

Таким образом, применение сканирующей зондовой микроскопии позволяет проводить исследование морфологии БЭ с исключительно высоким разрешением, а использование режима микротвердости позволяет выявить мягкие области. Их образование не является результатом контаминации микоплазмами и/или хламидиями.

Рис. 1 Мягкие области на поверхности БЭ (темные фрагменты), полученные в режиме микротвердости: 1 (а), 2 (а)  – поверхностная топография БЭ двух доноров, 1 (б), 2 (б) – сканы БЭ, полученные в режиме микротвердости

В работе Домарадского И.В. и др. (2002) постулируется наличие феномена транслокации бактериальных клеток через клетки эпителия: когда БЭ принуждаются к фагоцитозу, поскольку не являются профессиональными фагоцитами. Домарадский И.В. и др. (2002) приводят данные о том, что для БЭ характерен незавершенный фагоцитоз, приводящий к повреждению клеток и облегчающий транслокацию бактерий. Вероятнее всего зоны такого повреждения и были выявлены в режиме распределения микротвердости.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИЗОЦИМА СЛЮНЫ

Для исследования лизоцима общепризнанным является нефелометрический метод, разработанный В.Г. Дорофейчук (1968). Была исследована слюна 68 детей в возрасте 6 – 7 лет. Клиницистами-стоматологами (Лукиных Л.М., Рацюк М.М.) было проведено разделение детей на 4 группы:

  • 1 группа: здоровые дети (n=9), 
  • 2 группа компенсированная форма (n=7), у детей обнаруживался один зуб с начальным кариесом,
  • 3 группа субкомпенсированная форма (n=39), у детей обнаруживался один зуб с глубоким кариесом или более одного с начальным;
  • 4 группа декомпенсированная форма (n=13) в полости рта детей было более одного зуба с глубоким кариесом.

Показатели активности лизоцима слюны у детей колебались от 21% до 65%: наибольшие колебания наблюдались в субкомпенсированной и декомпенсированной группах, тогда как показатели в группах контроля и компенсированной были относительно равномерны. Показатели активности лизоцима равномерно разделились на два нормальных распределения внутри четвертой (декомпенсированной) группы. В одной подгруппе отмечены очень низкие, в другой – очень высокие показатели активности лизоцима, поэтому в дальнейшем проводили анализ этих подгрупп раздельно: соответственно обозначая их 4а и 4b.

Для оценки статистических различий между пятью независимыми группами (1, 2, 3, 4а и 4b) использовали однофакторный дисперсионный анализ. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1

Активность лизоцима слюны детей

с разной интенсивностью кариозного процесса

Группа детей

Детей в группе

(N)

Активность лизоцима слюны, %

(M ± m)

1 контрольная

9

42, 78 ± 2, 65*

2 компенсированная

7

47, 29 ± 4, 21*

3 субкомпенсированная

38

48, 11 ±1, 68*

4а декомпенсированная с низкими показателями активности лизоцима

4

34, 0 ± 3, 29*

4b декомпенсированная с высокими показателями активности лизоцима

8

60, 62 ± 0, 99*

F  =  6.507 (νвну= 61; νмеж=4)  * р<0,01

Представленные в таблице показатели активности лизоцима слюны в разных группах различимы, различия статистически значимы. Следовательно, функциональный тест по  определению активности лизоцима слюны может быть использован в качестве скринингового метода, сигнализирующего о неблагоприятных изменениях в системе неспецифической резистентности, возникающих в результате развития кариозного процесса. Дети в подгруппе 4а  имели очень низкие показатели активности лизоцима, что, по-видимому, свидетельствует об истощении резерва энзима при нарушении целостности тканей зуба. В подгруппе 4b напротив отмечается увеличение активности лизоцима слюны, сопряженное с увеличением тяжести кариозного процесса. Это может объясняться активным вовлечением механизмов резистентности в противостояние с разрушающими факторами, способствующими развитию кариеса, т.е. увеличивая концентрацию фермента, организм пытается компенсировать нарушения гомеостатического баланса полости рта.

Была поставлена задача визуального контроля разрушения клеток М. lysodeicticus под влиянием лизоцима слюны с использованием СЗМ. До взаимодействия с лизоцимом клетки имеют правильную форму, довольно часто образуют агрегаты. Их размеры составляют 1,3 – 1,5 мкм в диаметре, 0,5 – 0,6 мкм в высоту, что является стандартным для микрококка. После инкубации со слюной здорового ребенка при сканировании отмечается практически полное разрушение бактериальных клеток. Каждая из них «обволакивается» слюной и разрушается лизоцимом, что выявляется по уменьшению размеров: диаметр становится равным 0,6 – 0,8 мкм, а высота 0,1– 0,15 мкм. В случае инкубации со слюной ребенка с декомпенсированной формой кариозного процесса (функциональная активность по нефелометрическому тесту около 30 %) отмечается отсутствие лизированных бактерий. Размеры клеток составляют: диаметр 2,6 – 4,6 мкм; высота 0,3 – 0,4 мкм. Таким образом, клетки не разрушаются, а только набухают под влиянием лизоцима, что проявилось увеличением диаметра М. lysodeicticus. Метод СЗМ показывает, что слюна вначале обволакивает каждую клетку, затем под действием лизоцима происходит вначале набухание, а затем лизис М. lysodeicticus.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ АЛЬТЕРНАТИВНОГО КАСКАДА КОМПЛЕМЕНТА В РЕАКЦИЯХ С БАКТЕРИЯМИ

В системе АПАК тестировали 5 штаммов Staphylococcus aureus и 4 штамма Staphylococcus epidermidis. Результаты изучения АПАК-реактивности различных штаммов стафилококка суммированы в таблице 2.

Таблица 2

АПАК-реактивность золотистого и эпидермального стафилококка

Штаммы S.aureus

Штаммы S.epidermidis

7M

86M

66M

CCM

885

1971

51-1

CCM

2124

31O2

178

M

АПАК-реактивность

(%)

86,2

±

2,3 1

82,1

±

5,3 1

76,3

±

7,5

61,5

±

1,5

39,5

±

4,7

86,2

±

5,4 2

76,2

±

6,42

64,5

±

9,5

21,4

±

3,1

Среднее для вида (М)

69,2±15,6 %

63,2±20,4 %

1 достоверность различий относительно штамма S.aureus 1971 (р<0,05);

2 достоверность различий относительно штамма S.epidermidis 178М (р<0,05).

Усредненные данные  для штаммов золотистого и эпидермального стафилококка были практически одинаковы. В то же время среди изученных культур обнаружено два штамма, активность которых в системе АПАК была существенно ниже, чем у остальных стафилококков (р<0,05). Причиной низкой реактивности могло быть экранирование АПАК-активирующих центров белками. Однако термическая (100С, 10 мин) и протеолитическая (трипсин) обработка не усиливала эффекта штаммов S. epidermidis 178M и S. aureus 1971 в системе альтернативного каскада. Можно предположить также негативное влияние сиаловых кислот, создающих условия для инактивации С3b. В опытах обработка малоактивных штаммов стафилококка нейраминидазой привела к увеличению АПАК-реактивности S.epidermidis 178M в среднем на 20% (с 20,5 ± 1,5% до обработки до 40,0 ± 1,0% после обработки (р<0,05), тогда как активность S. aureus 1971 не менялась (41,5 ± 2,5% и 47,5 ± 0,5% соответственно до и после обработки (р>0,05). Это означает, что сиаловые кислоты действительно могут сглаживать АПАК – реактивность некоторых штаммов стафилококка, но это не единственный фактор, ограничивающий активацию альтернативного каскада. 

Параллельно проводилось исследование трех штаммов Proteus mirabilis и трех – Proteus vulgaris. Инкубацию штаммов в системе АПАК проводили в течение 60 мин. Результаты по исследованию АПАК-реактивности двух видов протея были идентичными показателям АПАК-реактивности стафилококка (таблица 3).

Таблица 3

Реактивность штаммов протея в системе АПАК

Штаммы P.vulgaris

Штаммы P.mirabilis 

1418-1

298

856

1395

210

120

АПАК-реактивность

штамма (%)

14,3±

0,05

72,2±

1,21

69,3±

3,21

81,4±

7,21

72,6±

10,41

70,5±

0,51

АПАК-реактивность вида (%)

51,7±25,1

74,5±4,3

1  достоверность различий относительно штамма P.vulgaris 1418-1.

Одной из причин «ускользания» штамма P.vulgaris 1418-1 от АПАК могло быть конкурентное экранирование активирующих центров компонентами, препятствующими сборке и стабилизации С3-конвертазы. Наиболее действенным в плане активации альтернативного каскада является липополисахарид грамотрицательных бактерий, поэтому его структурные особенности или экранирование какими либо элементами могло привести к снижению АПАК-реактивности штамма. Поскольку наиболее выраженной антикомплементарной активностью обладают сиаловые кислоты (Edwards et al., 1982; Taylor, 1995), была исследована возможность их участия в снижении АПАК-реактивности P.vulgaris 1418-1. Показатели АПАК-реактивности до обработки нейраминидазой составили 12,0 ± 2,0%, после – увеличились до 32,0 ± 4,0% (р<0,05), т.е. достоверно возрастали.

Другая возможность межштаммовой вариабельности может быть обусловлена различиями в строении ЛПС. На устойчивость бактерий  к лизису в системе комплемента оказывает влияние длина полисахаридных боковых цепей О-антигена ЛПС: длинноцепочечные ЛПС препятствуют взаимодействию МАК с гидрофобными участками наружной мембраны, предупреждая бактериолиз. Бактерии с ЛПС, слабо связывающим С3 компонент комплемента, практически не фагоцитируются и являются наиболее вирулентными (Кудрина и др., 1997; Klink et. al., 1998).

Пять штаммов протея обладали сходной АПАК-реактивностью (табл. 3), т.е. в течение 60 мин связывали одинаковое количество С3 компонента комплемента. Представлялось интересным выяснение динамики АПАК-реактивности штаммов в зависимости от времени инкубации с сывороткой. Для исследования было отобрано 4 штамма протея, обладающих идентичной АПАК-реактивностью. Динамика расходования компонентов АПАК в течение разного времени инкубации с хелатированной сывороткой (от 10 до 60 мин) у разных штаммов протея происходит не одинаково (рис. 2).

Рис 2. Динамика АПАК-реактивности штаммов протея

Полученные данные могут свидетельствовать о различиях в эффекторных функциях АПАК. Есть свидетельства того, что лишь небольшое число грамотрицательных бактерий лизируются в результате сборки МАК. Поэтому возможность разрушения протея в системе альтернативного каскада оценивали по целому ряду реакций.

Вначале косвенную оценку проводили в реакции стимуляции нейтрофильных гранулоцитов штаммами бактерий, обработанными в системе АПАК. Стимуляцию (подавление) респираторной активности нейтрофилов под действием бактерий оценивали в системе ЛЗХЛ.

Использовали интактные бактерии (в качестве контроля) и бактерии, обработанные в режиме АПАК. Определяли значение пика хемилюминесценции (Iхл) и общей светосуммы (Sхл). Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Люминолзависимая хемилюминесценция нейтрофилов, стимулированных штаммами P. vulgaris и P.mirabilis

Штамм

 

  Контроль

Активация нейтрофилов штаммами, проинкубированными в системе АПАК

15 минут

30 минут

60 минут

I хл

S хл

I хл

S хл

 

I хл

S хл

 

I хл

 

S хл

P. mirabilis 120

1,2± 0,7

5,5± 3,7

19,1± 0,2*

87,4± 0,8*

17,6±

0,8*

70,6±4,9*

1,5±

0,2

5,6±

0,6

P. mirabilis 210

0,4±

0,2

2,0±

1,0

9,6 ±

1,7*

34,3±

12,0*

13,4± 2,7

46,5±17,9

10,7± 9,1

60,5±

22,5*

P. vulgaris 296

0,8± 0,1

3,3±

0,2

6,6±

1,1*

26,3± 9,1*

4,1± 0,3*

16,4±4,7*

2,7±

1,0*

10,9±

7,0

P. vulgaris 856

0,7± 0,2

3,7±

1,5

25,2± 1,1*

110,4± 0,8*

26,0± 1,9*

110,4±0,8*

44,7±16,2

182,4±

84,5

* - различия с контролем статистически значимы (p < 0,05).

Отмечается неоднозначность реакций протея в системе АПАК. Два штамма демонстрировали нарастание активирующей способности в отношении нейтрофильных гранулоцитов при увеличении времени инкубации в системе АПАК. Это связано с тем, что штаммы  P. mirabilis 210 и  P. vulgaris 856 не разрушаются МАК, а подключение системы альтернативного каскада комплемента к элиминации этих штаммов обусловлено реализацией опсонической функции. Т.е. С3b компонент откладывается на поверхности бактериальных клеток, способствуя усилению фагоцитоза, что и регистрировалось по увеличению респираторной активности нейтрофильных гранулоцитов.

Однако при инкубации нейтрофилов со штаммами P. mirabilis 120 и P. vulgaris 296 обработанными в системе АПАК отмечалась абсолютно другая динамика хемилюминесценции: в результате увеличения времени инкубации с сывороткой штаммы теряют способность активировать респираторную активность нейтрофилов. После 60 мин пребывания в системе АПАК штаммы не способны вызывать респираторный взрыв нейтрофилов, что регистрируется по практически идентичным показателям опытной и контрольной пробы. Мембранолитическая активность АПАК отмечается в работах разных авторов, в основном для бактерий, имеющих особую структуру ЛПС с короткими олигомерными О-специфическими боковыми цепями. В противном случае сорбированный на наружной части внешней мембраны МАК не достигает липидного бислоя и слущивается с поверхности клеточной стенки, сохраняя нативность клетки. Даже в случае фиксации МАК на цитоплазматической мембране образовавшийся канал может быть эндотирован клеткой, что позволяет сохранить ее жизнеспособность (Muller-Eberhard, 1988).

Для доказательства реализации литической стратегий АПАК в отношении двух штаммов бактерий рода Proteus проводилось изучение жизнеспособности после пребывания в системе АПАК. Для этого на среде Плоскирева определялось количество колониеобразующих единиц (КОЕ) до и после инкубации с хелатированной сывороткой. В таблице 5 представлены результаты  подсчета КОЕ штаммов Proteus до инкубации с сывороткой (контроль), и после инкубации с ней (опыт).

Таблица 5

Число КОЕ бактерий рода Proteus до и после обработки в системе АПАК

P. vulgaris 296

P. vulgaris 856

P. mirabilis 120

P. mirabilis 210

контр

опыт

контр

опыт

контр

опыт

контр

опыт

344,75

±

16,65*

81,21

±

8,63*

198,88

±

4,83

203,88

±

4,98

314,33

±

10,71*

114,51

±

11,47*

219,86

±

28,38

225,75

±

18,95

* различия между контролем и опытом статистически значимы  (р<0,001).

Представленные результаты доказывают, что в отношении P. vulgaris 296 и P. mirabilis 120 реализуется литическая функция АПАК (число КОЕ снижается в 3 раза), тогда как изменения жизнеспособности  P. vulgaris 856 и P. mirabilis 210 не происходит, следовательно, эти штаммы только опсонизируются в системе АПАК, и в отсутствии других эффекторов не могут быть уничтожены. 

Представленный результат был подтвержден исследованием морфологии бактериальных клеток методом СЗМ: клетки штаммов P. vulgaris 296 и P. mirabilis 120 набухали и лизировались, а бактерии штаммов P. vulgaris 856 и P. mirabilis 210 сохраняли целостность, но при этом окружались компонентами сыворотки – предположительно белками-опсонинами. 

Таким образом, независимые эксперименты по подсчету КОЕ, изучению стимуляции нейтрофилов в ЛЗХЛ и исследованию морфологии бактериальных клеток доказывают реализацию двух стратегий АПАК в отношении грамотрицательных бактерий рода Proteus: лизиса или опсонизации. При этом суммарное расходование С3b компонента комплемента при реализации любого из механизмов в течение 60 мин одинаково.

Различия в активации АПАК у протея обусловлены, прежде всего,  особенностями строения клеточной стенки, поэтому исследовали АПАК-реактивность ЛПС, выделенного из 4 изучаемых штаммов. ЛПС тестировался в реакции С3b-зависимой адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса. Способность активировать комплемент  при инкубации в сыворотке практически не отличается у ЛПС трех из четырех изучаемых штаммов и является достаточно низкой: P. vulgaris 296 – 28,7±7,2%; P. vulgaris 856 – 26,2±3,4%; P. mirabilis 120 – 41,5±1,5%, в то время как у ЛПС P. mirabilis 210 способность активировать АПАК была высокой и достигала уровня цельной бактериальной клетки: 80,0±0,9%.

В реакции ЛЗХЛ нейтрофилов стимуляцию клеток проводили ЛПС четырех видов бактерий рода Proteus. Вначале изучалась респираторная активность нейтрофильных гранулоцитов в реакциях с экстрагированным ЛПС, а затем с ЛПС предварительно проинкубированным в системе АПАК. В качестве позитивного контроля жизнеспособности клеток выступал зимозан. Данные экспериментов суммированы в таблице 6.

Таблица 6

Хемилюминесцентная активность нейтрофилов, стимулированная липополисахаридом (ЛПС) штаммов протея

Стимулятор люминесценции

Индекс стимуляции

Максимум люминесценции (I мах)

Суммарная светосумма

(S)

Зимозан

166,31 ± 26,5

79,21 ± 1,94

ЛПС P. mirabilis 120

3,22 ± 0,62*

2,67 ± 0,51*

ЛПС P. mirabilis 210

1,05 ± 0,08*

1,06 ± 0,03*

ЛПС P. vulgaris 296

10,06 ± 0,83*

5,88 ± 0,05*

ЛПС P. vulgaris 856

3,99 ± 0,24*

2,92 ± 0,32*

ЛПС P. mirabilis 120 + АПАК

1,05 ± 0,06*

0,82 ± 0,13*

ЛПС P. mirabilis 210 + АПАК

1,31 ± 0,01*

0,65 ± 0,04*

ЛПС P. vulgaris 296 + АПАК

5,62 ± 0,59*

5,18 ± 0,21*

ЛПС P. vulgaris 856 + АПАК

1,84 ± 0,57*

1,22 ± 0,26*

* достоверность различий активности хемилюминесценции нейтрофилов после стимуляции их ЛПС штаммов до и после инкубации в сыворотке (р<0,05).

Представленные результаты показывают, что ЛПС разных штаммов обладает разной активностью в отношении респираторного взрыва нейтрофилов. Наибольшей она была у  P. vulgaris 296. Однако в остальных случаях ЛПС протея слабо активировал респираторный взрыв, а ЛПС P. mirabilis 210 вообще не вызывал стимуляции нейтрофилов (образование АФК соответствовало уровню спонтанной хемилюминесценции). Наиболее интересным результатом исследования явились показатели активирующей способности ЛПС штаммов протея, после 60 мин инкубации в системе с избирательной активацией АПАК. После такой инкубации только ЛПС одного штамма P. vulgaris 296 сохранял высокий активирующий потенциал (хотя и в этом случае он снижался по сравнению с интактным ЛПС), тогда как у всех остальных штаммов достоверно снижалась активирующая способность.

Полученные данные интересно сравнить с работой А.Е. Платонова и др. (1999), где изучалось повреждение гранулоцитов человека под действием менингококкового липополисахарида. В этой работе показано, что повреждение и гибель гранулоцитов под влиянием ЛПС происходит только при условии наличия в системе интактного комплемента и не зависит от концентрации ЛПС и наличия антител к нему. Полученные нами результаты подтверждают данные исследования, поскольку после инкубации ЛПС с белками альтернативного каскада комплемента нейтрофилы теряли способность активироваться.

Особое внимание обратили на ЛПС штамма P. vulgaris 296, который не подавлял, а стимулировал кислородный взрыв нейтрофилов. В остальных трех случаях клетки поддерживали слабую респираторную активность на фоновом уровне. Имеются работы, подтверждающие возможность апоптоза нейтрофилов под влиянием связывания рецептора их мембран (CD14) с ЛПС (Van Oostveldt et al., 2002). Однако такое связывание не опосредовано белками комплемента, и, по-видимому, реализуется напрямую. В настоящее время вопрос о том, как координируется действие сывороточных белков, влияющих на связывание ЛПС с клеточными мембранами и сывороточных белков, опосредующих сигнальные функции ЛПС, остается не изученным.

Пока с уверенностью можно сказать только, что межштаммовые различия протея в системе АПАК обусловлены не только различиями в строении клеточной стенки бактерий, поскольку активаторная способность главного компонента клеточных стенок – ЛПС не соответствует реакциям с цельными бактериальными клетками.

       МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Изменение морфологических параметров клеток проецируют на их физиологические свойства, что наряду с функциональной характеристикой дает полноценную информацию об участии в поддержании гомеостаза. На следующем этапе исследований проводили анализ сканированных образцов фиксированных и витальных нейтрофильных гранулоцитов методом СЗМ. Результаты сканирования отражают полиморфизм нейтрофилов. На препаратах, где происходит не только адгезия, но и распластывание нейтрофилов определяются границы клеток, полиморфное ядро, видны гранулы цитоплазмы. Особенно хорошо эти структуры выявляются на боковом сечении профиля клетки. Однако при исследовании живых препаратов наблюдали также нейтрофилы, плохо распластывающиеся на субстрате, где  границы клетки выражены достаточно четко, но ядро определялось плохо и могло быть выявлено только по боковому сечению профиля клетки. Поскольку практически вся цитоплазма оказывается сконцентрированной возле ядра, гранулы цитоплазмы практически не идентифицируются. В случае фиксации метанолом границы клеток выражены отчетливо, всегда определяется сегментированное ядро и гранулы. Однако фиксированная клетка практически лишается воды, полностью распластывается по поверхности подложки (от чего становится четко выраженной топография ее внутренней структуры) и это резко изменяет морфологические параметры клетки (табл. 7).

Таблица 7

Морфологические параметры нейтрофильных гранулоцитов, измеренные методом СЗМ при использовании фиксации и без нее

Нативные клетки (живые НГ)

Клетки, фиксированные метанолом

Клетки, фиксированные глутаровым альдегидом

Диаметр клеток (мкм)

14,55 ± 0,55*

16,72 ± 0,41*

18,25 ± 0,48*

Высота клеток (мкм)

2,13 ± 0,11**

0,66 ± 0,03**

1,03 ± 0,05**

* F = 15,11 (νвну = 138,1; νмеж = 9,136)  * р<0,001 – различия между группами статистически значимы; **F = 99,26 (νвну = 214,1; νмеж = 2,15)  * р<0,001 - различия между группами статистически значимы.

Большим преимуществом в исследовании фиксированных препаратов является то, что разрешение сканирующего зондового микроскопа в воздушной среде оказывается выше. При получении изображения методом СЗМ общепризнанным методом фиксации является обработка глютаровым альдегидом (Dufrne, 2001). Однако мы не обнаружили преимуществ данного метода фиксации: поскольку при такой обработке клетка сохраняет воду и не распластывается по подложке ее изображение идентично изображению нативных нейтрофильных гранулоцитов, где четко определены границы клеток, однако ядро и гранулы не выявляются. Заметна только шероховатость мембраны, которая практически не выявляется при фиксации метанолом. Однако размеры нейтрофильных гранулоцитов при фиксации глютаровым альдегидом отличаются от нативных препаратов.

Любой метод фиксации искажает размеры клеток: при фиксации метанолом это по большей части отражается на высоте клетки, при фиксации глютаровым альдегидом на поперечных размерах клетки (табл. 7). В целом можно отметить, что хотя использование фиксированных препаратов имеет целый ряд преимуществ перед нативными пробами, морфологические параметры при исследовании фиксированных препаратов оказываются искаженными. Поэтому для изучения процессов, протекающих в клетке и морфологических изменений, сопровождающих эти процессы удобнее использовать исследования нефиксированных препаратов в жидкой фазе, а для визуализации детальных подробностей этих изменений лучше использовать методы фиксации, среди которых предпочтение нужно отдавать фиксации метанолом.

Метод АСМ не ограничивается наблюдением морфологии интактной клетки. Например, реализация такой эффекторной функции как фагоцитоз сопровождается у нейтрофила образованием псевдоподий, а их можно четко визуализировать. На рис. 3 представлено, как меняется морфология нейтрофильного гранулоцита при внесении  в среду инкубации бактерий, опсонизированных в системе АПАК.

а                                                        б

Рис. 3 Изменение морфологии нейтрофилов при инкубации с бактериальными клетками (фиксация метанолом):

(а) морфология интактной клетки,

(б) морфология нейтрофила через 5 минут, после инкубации с опсонизированным в системе АПАК S. аureus 7 М

Параллельно этому эксперименту проводились опыты по исследованию ЛЗХЛ, где к суспендированным нейтрофилам добавляли опсонизированные S.aureus 7M, показатели хемилюминесценции снимали каждые 5 мин (рис. 4).

Морфологические наблюдения показывают, что наиболее интенсивно псевдоподии формируются у нейтрофильных гранулоцитов на 5 – 10 мин наблюдения, тогда как пик респираторной активности достигается только на 25 – 40 мин. Оба процесса: и формирование активных форм кислорода и образование псевдоподий зависят от АТФ. Скорее всего, в течение респираторного взрыва энергетические ресурсы нейтрофила интенсивно перераспределяются в сторону гексозомонофосфатного шунта (для продукции свободных радикалов кислорода), а не в сторону гликолиза (для продукции АТФ, необходимой для активной сборки цитоскелета).

Рис. 4 Кинетика респираторного взрыва нейтрофильных гранулоцитов после стимуляции опсонизированным S.aureus 7М

Поэтому вероятно, что увеличение продукции активных форм кислорода это фактор, который может ограничивать способность ПМЯЛ формировать псевдоподии in vitro, поскольку на этом этапе внутриклеточного метаболизма энергетические ресурсы клетки перераспределены на более эффективное внутриклеточное разрушение микроорганизма. В результате исследований показано, что две стадии фагоцитоза: формирование псевдоподий, захват чужеродных тел, втягивание внутрь мембраны и формирование активных форм кислорода – процессы не связанные между собой. Можно сказать, что приведенное исследование  доказывает описанный ранее (Маянский, 1989) феномен функциональной дискретности нейтрофилов.

Особенности морфологии нейтрофильных гранулоцитов при исследованиях методом атомно-силовой микроскопии в различных буферных системах

Нейтрофилы в ходе реализации фагоцитоза вынуждены находиться не только в разном клеточном окружении, но и в средах с изменяющимися значениями рН, поэтому на следующем этапе наблюдения за нейтрофильными гранулоцитами исследовали живые клетки в физиологическом растворе (рН 7,2); в растворе Хенкса (рН варьировала от 7,2 до 8,2), в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4), а также были предприняты попытки наблюдения за нейтрофилами в чрезвычайно неблагоприятных для них условиях: цитратном буфере (рН 5,0) и карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5). В физиологическом растворе в течение всего времени наблюдения клетка не меняла параметров ни в ответ на сканирование, ни в ответ на проведение спектроскопии, была «морфологически инертна». Замеры объема клетки также продемонстрировали незначительные колебания, не выходящие за пределы статистически значимых различий.

Принципиально иные результаты получены при сканировании клеток в фосфатно-солевом буфере, поскольку в нем нередко отмечалась атипичная морфология клеток. ПМЯЛ, инкубируемый в ФСБ, является морфологически нестабильным: клетка плохо распластывается по поверхности подложки, по краям выявлено образование утолщений (похожие атипично крупные гранулы мы отмечали в последующих сериях экспериментов, посвященных стрессовым воздействиям на нейтрофилы). Отсутствие распластывания по поверхности подложки нельзя объяснить отсутствием ионов Са2+, так как в предыдущей серии экспериментов сканирование в бедном физиологическом растворе не препятствовало хорошей адгезии нейтрофилов. Характерными являются еще два признака, свидетельствующие о том, что пребывание ПМЯЛ в ФСБ является неблагоприятным для клеток. Во-первых, нейтрофил формирует псевдоподии без внесения в среду каких-либо стимулирующих агентов и даже до проведения сканирования; во-вторых, на подложке отчетливо визуализируются гранулы различного диаметра (их количество увеличивалось на протяжении сканирования). Мы считаем, что появление этих гранул связано с разрушением части клеток, инкубируемых в ФСБ. Особенно серьезные изменения наблюдаются у ПМЯЛ после механического надавливания на нейтрофильный гранулоцит с силой 0,4 nN: клетка вначале несколько уменьшается в объеме, так, что даже визуализируются ядра, а затем постепенно «набухает», в конечном итоге увеличивая объем более чем в 2 раза. Таким образом, пребывание нейтрофильных гранулоцитов в ФСБ в процессе сканирования является неблагоприятным для клеток, несмотря на то, что значение рН на всем протяжении экспериментов поддерживалось на строго постоянном уровне.

При сканировании в забуференном растворе Хенкса, в том случае, когда значение рН поддерживалось на постоянном уровне (7,2) морфология клеток была стабильна на протяжении длительного времени наблюдения: объем и высота клеток не изменяются. Хотя нужно отметить, что буферность среды при обогащении ионного состава не предохраняет нейтрофил от значительного набухания при проведении спектроскопии. В том случае если не регулировать искусственно буферность системы  значения рН в растворе Хенкса изменяются с 7,2 до 8,2. При таких условиях даже атравматичное сканирование клеток в неконтактном режиме может привести к значительному увеличению их объема.

Таким образом, изменение рН, равно как ионный состав среды оказывают значительное влияние на механические свойства клеток. В бедной ионами среде с постоянным значением рН (физиологический раствор)  клетки не чувствительны ни к слабому (сканирование), ни к сильному (FS-спектроскопия) механическому воздействию. Обогащение ионного состава среды при постоянном рН делает клетку чувствительной к сильному механическому воздействию (FS-спектроскопия), что проявляется патологической реакцией набухания клетки. Изменения рН среды при обогащении ионного состава делают клетку максимально чувствительной к любому, даже слабому механическому воздействию.

Исследование клеток в неблагоприятных для жизнедеятельности буферах (в цитратном (рН 5,0) или карбонатно-бикарбонатном (рН 9,6)) показало, что в таких условиях ПМЯЛ утрачивает способность к адгезии, поэтому СЗМ-исследования не возможны. Кроме того, в карбонатно-бикарбонатном буфере клетки через 1 час оказывались полностью разрушенными.

ИЗУЧЕНИЕ РИГИДНОСТИ МЕМБРАН НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Метод СЗМ позволяет измерять локальные упругие свойства поверхности клеток. Теоретическое обоснование использования модуля Юнга, рассчитываемого по модели Герца для исследования эластичности «мягких» биологических объектов приводится в работах E. Hassan et al., 1998; R. Henderson, H. Oberleithner, 2000. Для нейтрофильных гранулоцитов исследование механических свойств имеет первостепенное значение, поскольку процессы диапедеза и миграции в тканях и процесс фагоцитоза сопровождаются комплексными упруго-механическими реакциями. Помимо рецепторных взаимодействий, которые к настоящему времени достаточно полноценно исследованы и охарактеризованы, в рекогносцировочных реакциях нейтрофилов большое значение принадлежит перестройкам цитоскелета, активации хемо- и механорецепторов. В приведенном исследовании, используя модель Герца, определяли ригидность мембран нейтрофильных гранулоцитов, а также оценивали, насколько спектроскопические измерения способны изменить морфологию нейтрофильного гранулоцита. Зонд подводили к поверхности клетки и надавливали на мембрану с силой от 0,4 до 4 nN. Кантилевер начинает испытывать силу упругого сопротивления со стороны мембраны клетки. В результате получали кривую FS-спекроскопии, отображающую взаимосвязь между приложенной силой и величиной прогиба мембраны под зондом, по которой вычисляли модуль Юнга. Первоначально проводили измерение модуля Юнга на нативных клетках в 25 независимых экспериментах (клетки брали от разных доноров, FS-спектроскопию каждой клетки проводили не менее 3-х раз, значение модуля Юнга оценивали как среднее из этих измерений). Результаты исследования показали, что ригидность мембран нейтрофилов составляла в среднем 2,1 ± 0,7 кПа. Поскольку при проведении спектроскопии воздействие зонда на клетку оказывается более значительным, чем в процессе сканирования было сделано предположение, что оно может изменять морфологию клеток. Проведенная  серия экспериментов по исследованию морфологии клеток после спектроскопических измерений (в забуференном растворе Хенкса, как наиболее физиологичном для нейтрофилов) продемонстрировала реакцию набухания клетки в ответ на механическое воздействие силой от 0,4 до 2 nN. При этом отмечается зависимость степени набухания от величины приложенной силы. Резкое увеличение объема отмечено вследствие применения сил, превышающие те, что воздействуют на ПМЯЛ в физиологических условиях. В частности, в работе K. E. Edmondson et al. (2005) продемонстрировано, что сила сопротивления нейтрофилам со стороны эндотелиоцитов составляет 100 pN, что в 4 раза меньше силы, используемой нами при FS-спектроскопии. Однако, при проведении экспериментов in vitro использование сил меньше, чем 0,4 не целесообразно, поскольку при таком воздействии вязкие свойства мембраны преобладают над упругими, в результате чего не удается получить удовлетворительной FS-кривой. Нужно отметить также высокую степень резистентности клеток к набуханию: увеличение объема более чем в 3 раза от первоначального не вызывает некроза клеток и позволяет проводить наблюдения за нейтрофилами в течение 2,5 часов.

Вероятнее всего набухание клеток можно объяснить кратковременным раздражением механорецепторов, вследствие чего открываются механочувствительные ионные каналы, вызывающих трансмембранный инфлюкс ионов внутрь клетки с последующим ее набуханием. Первоначальное набухание клетки вызывает открывание новой порции каналов. На эту роль могут претендовать, в частности TRPV4 (transient receptor potential) катионные каналы, поскольку они являются чувствительными к нагреванию, химическому воздействию и осмотическому увеличению объема клеток (Gller et al., 2002; Vriens et al., 2004).  Такая петля позитивной обратной связи вызывает еще большее нарастание клеточного объема, что и продемонстрировано в нашей серии экспериментов. Факт, что в реакции задействованы именно кальциевые каналы подтверждается отсутствием набухания клетки при проведении спектроскопии в физиологическом растворе (среде без Ca 2+). По данным J. Vriens et al. (2004) гипоосмотического увеличения объема клеток в отсутствие экстрацеллюлярного кальция не происходит.

Было сделано предположение, что увеличение объема клетки оказывает непосредственное влияние на ригидность мембран нейтрофилов. Для подтверждения или опровержения этого предположения  проводили спектроскопические исследования в течение всего процесса набухания. Результаты наблюдения представлены в таблице 8.

Приведенные результаты попадают в диапазон доверительного интервала, а различия между ними не являются статистически значимыми.  Таким образом, спектроскопия существенно изменяет морфологию нейтрофилов у доноров, но не влияет на ригидность мембран нейтрофильных гранулоцитов. В случае необходимости исследования воздействия различных веществ на клетки, необходимо проводить морфологические и спектроскопические исследования в независимых экспериментах. Сам по себе результат, показывающий независимость ригидности мембран от объема клетки доказывает, что объемно-морфологические характеристики клетки не влияют на упругие свойства мембран.

Таблица 8

Ригидность мембран нейтрофильных гранулоцитов в процессе проведения спектроскопических исследований

Время после проведения первой спектроскопии

(мин)

Контроль

30

50

90

150

Значения модуля Юнга (кПа)

2,1±0,7

1,4±0,5

1,8±0,3

2,2±0,7

2,2±0,8

р > 0, 05 – разница между значениями не является статистически значимой.

МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ НА ФОНЕ ДЕЙСТВИЯ БИОТИЧЕСКИХ И АБИОТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ

Нейтрофильные гранулоциты могут находиться в кровяном русле в стадиях праймирования, «преактивации» и покоя (Сапрыкин, Кузнецов, 2001). Любое физико-химическое воздействие вызывает активацию клетки. Однако для проявления реактивности необходимо, чтобы этот стимул обладал адекватной силой воздействия, поскольку слабое воздействие вызовет лишь кондиционирование клетки, сопровождающееся биохимическими перестройками, но не идентифицирующееся морфологически и функционально. Такой стимул может спровоцировать развитие толерантности. Тогда как чрезмерная сила воздействующего фактора может привести к срыву адаптации и гибели клеток. Границы устойчивости нейтрофильных гранулоцитов к экзогенному воздействию были определены в реакциях с биогенными факторами (пчелиный яд, гепарин, ЛПС) и абиогенными раздражителями (Н2О2 и квантовыми точками).

МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ ФАГОЦИТОВ В СИСТЕМЕ «ЯД-ГЕПАРИН»

Для оценки влияния гепарина на респираторную активность нейтрофилов производили исследование люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов до и после внесения гепарина (в спонтанном тесте и после стимуляции опсонизированным зимозаном). Дыхательная активность нейтрофилов показала незначительную стимуляцию спонтанной и стимулированной хемилюминесценции при использовании самых малых доз гепарина (0,05 МЕ/мл). Интересным фактом является то, что при увеличении концентрации гепарина его стимулирующий эффект полностью элиминируется, сменяясь некоторым подавлением дыхательной активности, которое выявлялось как в спонтанном, так и в стимулированном тесте. Затем в систему с нейтрофильными гранулоцитами вносили пчелиный яд. Результаты экспериментов представлены на рис. 5.

Рис.5. Влияние пчелиного яда на стимулированную зимозаном (а)

и спонтанную (б) хемилюминесценцию нейтрофилов. По оси ординат – относительные значения хемилюминесценции, опыт/контроль.

Концентрации яда: 1 – 1 мкг/мл, 2 – 10 мкг/мл, 3 – 100 мкг/мл

Лишь малые дозы яда (1 мгк/мл) на начальном этапе обладают стимулирующей активностью, которая быстро сменяется подавлением клеточного дыхания. Увеличение дозы ведет к резкой супрессии дыхательной активности уже на 5 мин, а к 20 мин она падает до критического уровня. Эта тенденция характерна как для спонтанной, так и для стимулированной хемилюминесценции. Интересной особенностью, отмеченной в ходе экспериментов, является то, что на активированные клетки пчелиный яд оказывает более выраженное воздействие: клетки в состоянии активации быстро и эффективно уничтожаются пчелиным ядом. В качестве объяснения повышенной чувствительности клетки к яду в стадии активации можно сделать предположение о суммации повреждающего действия экзогенного (яд) и эндогенного (активные формы кислорода) воздействия. Клетка, находящаяся в состоянии физиологического покоя гораздо более резистентна к токсическому воздействию, и при наиболее низкой концентрации (1 мкг/мл) даже проявляется незначительный стимулирующий эффект.

Исследование возможного протекторного действия гепарина показало, что функциональные характеристики клетки могут быть защищены гепарином только в случае малых концентраций яда (1, 10 мгк/мл) и только когда клетка не находятся в физиологически активной фазе. Протективная активность гепарина отмечалась только при спонтанной хемилюминесценции: в течение сорокаминутного наблюдения за клетками, предварительно проинкубированными с комплексом «яд – гепарин» (концентрация яда не превышала 10 мгк/мл) не отмечено достоверного снижения дыхательной активности клеток по сравнению с уровнем контроля.

В случае увеличения концентрации яда в комплексе до 100 мгк/мл гепарин уже не мог компенсировать разрушающего и/или ингибирующего действия яда.

В работе М.Б. Звонковой (2002), при рассмотрении взаимодействия пчелиного яда с гепарином, отмечается, что гепарин in vitro вступает в прямое химическое взаимодействие с основным компонентом пчелиного яда – мелиттином, тогда как другой компонент пчелиного яда – фосфолипаза А комплекса с гепарином не образует. Именно это наблюдение может объяснить ингибирование дыхательной активности стимулированных клеток. Известно, что основной мишенью фосфолипазы А являются глицерофосфолипиды клеточных мембран, но респираторный взрыв нейтрофилов сопровождается резким изменением метаболического профиля клеток, переориентированного на синтез активных форм кислорода с участием НАДФ. Т.е. это мембранозависимый процесс, но мембраны повреждаются не связанной гепарином фосфолипазой А, что сопровождается снижением синтеза энергетически активных молекул, а следовательно, и снижением величины респираторного взрыва. Это уменьшение дыхательной активности при стимуляции клеток, предварительно проинкубированных в системе «яд – гепарин» и наблюдалось в наших экспериментах.

Помимо функциональных тестов была сделана морфологическая оценка клеток (перитонеальных макрофагов мыши) под действием пчелиного яда. Исследования производили методом сканирующей зондовой микроскопии. Были получены результаты о неизменности морфологии перетонеальных макрофагов после инкубации с гепарином. Тестирование пчелиного яда проводили на тех же клетках. Концентрация пчелиного яда, взятого в эксперимент составила 1; 10 и 100 мкг/мл (рис.6).

 

Рис. 6. Морфология перитонеальных макрофагов мыши, фиксированных метанолом: (а) интактные клетки; (б) клетки, фиксированные после инкубации с пчелиным ядом (10 мкг/мл) в течение 10 мин; (в) клетки, зафиксированных после 20 мин инкубации с комплексом «яд-гепарин» (100 мкг/мл – 5 МЕ/ мл соответственно)

Только на мазках, приготовленных после инкубации перитонеальных макрофагов с минимальной из испытуемых доз пчелиного яда (1 мкг/мл) отмечалась неизменность клеточной морфологии. В остальных случаях влияние на макрофаги пчелиного яда выражалось в резком изменении морфологии клеток: макрофаги имели «рваные» края и расплывчатые очертания, внутренняя область клетки, где должно располагаться ядро оказывалась вогнутой. В дальнейшем было проведено исследование протективной активности гепарина. Конечная концентрация компонентов в комплексах «яд-гепарин» составляла соответственно: 1 мкг/мл – 0,05 МЕ/мл, 10 мкг/мл – 0,5 МЕ/мл; 100 мкг/мл – 5 МЕ/мл. Нужно отметить, что в случае определения только морфологических параметров гепарин оказывает гораздо более выраженный протективный эффект: даже максимальная концентрация яда – 100 мкг/мл при инкубации с 5 МЕ/мл гепарина, по всей видимости, формировала настолько прочное комплексное соединения, что морфологические параметры клеток практически не изменялись.  Границы клеток не нарушались и имели четкие очертания, хотя в некоторых случаях, (например, при увеличении концентрации яда до максимального) отмечалось появление псевдоподий. Таким образом, и использование функционального теста (респираторная активность нейтрофилов в реакциях ЛЗХЛ) и оценка морфологических параметров клеток (методом АСМ) показывают однозначный результат по цитотоксическому действию пчелиного яда и протективному эффекту гепарина. При этом нужно признать, что функциональный тест является более чувствительным и реагирует на незначительные изменения в биохимическом окружении клеток, тогда как морфологическая структура достаточно долго поддерживается в стабильном состоянии, проявляя изменения только при достаточно «грубом» (высокие концентрации пчелиного яда) патологическом воздействии.

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В СИСТЕМЕ С ЛИПОПОЛИСАХАРИДОМ

ЛПС – один из наиболее мощных активаторов нейтрофилов. Но в отсутствии сывороточных белков ЛПС не способен индуцировать респираторный взрыв в нейтрофилах, что обусловлено физиологической функцией полиморфноядерных лейкоцитов: акцептировать на своей поверхности ЛПС. Связывание ЛПС на нейтрофильном гранулоците обуславливается рецептором СD14, что может приводить к апоптозу ПМЯЛ. K. Van Oostveldt et al. (2002) показали, что ЛПС (от 1 до 10 мкг/мл) способен связываться с CD14 и инициировать процесс апоптоза, сопровождающийся утратой фагоцитарной и респираторной активности клеток. Однако реализовать программу апоптоза удается не всегда, поскольку высокие концентрации ЛПС индуцируют шеддинг рецептора с поверхности нейтрофильных гранулоцитов (Sohn et al., 2007). Поэтому ряд исследователей регистрируют антиапоптотический эффект бактериальных эндотоксинов (Yamamoto et al., 1993; Lee et al., 1993; Hiroi et al., 1998; Sweeney et al., 1998; Винокуров и др., 2006).

В нашем исследовании была поставлена цель: исследовать изменения морфологии нейтрофильных гранулоцитов под действием ЛПС методом СЗМ. В эксперимент были взяты два вида ЛПС: выделенный из штамма P. mirabilis 210, поскольку он вызывал подавление респираторной активности нейтрофилов и стандартизованный ЛПС штамма E.coli O127:B8 (Sigma, USA). Контрольные измерения (в отсутствии ЛПС) показали, что клетки не изменяют своей морфологии в течение длительного времени инкубации (измерения проводили до 180 мин). После добавления к нейтрофилам (5 • 106 кл/мл) ЛПС P. mirabilis 210  (10 мкг/мл) уже спустя 15 мин наблюдаются значительные изменения морфологии клеток, выражающиеся в увеличении размеров клеток, т.е. значительном «набухании» рис. 7. Такие изменения могут приводить к критическому увеличению объема, заканчивающемуся некротической гибелью части клеток. Однако некроз регистрировался лишь у незначительной части клеток, большинство из них сохраняли жизнеспособность в течение длительного времени. Наблюдения за единичными клетками в течение длительного времени показали, что ПМЯЛ претерпевает изменения, сходные с описываемыми для апоптоза: в частности набухание клеток сменяется уменьшением объема, а впоследствии такие периодические изменения объема будут сопровождаться фрагментацией и отделением ядерного материала от клетк

и, что демонстрируется рис. 8.

Рис. 7. Изменение морфологии нейтрофильных гранулоцитов на первых минутах после внесения ЛПС P. mirabilis 210  (10 мкг/мл): (а) контрольный скан интактных клеток; (б) клетки через 15 мин после инкубации с ЛПС

Поскольку дополнительные доказательства апоптоза не проводились такие формирования, мы обозначали как «апоптозоподобные» тельца. Изменения объема, площади и высоты отдельных клеток также демонстрировали постоянное колебание параметров.

Рис. 8. Изменение морфологии нейтрофильных гранулоцитов на поздних стадиях наблюдения за клетками после внесения ЛПС P. mirabilis 210 (10 мкг/мл):

(а) через 70 мин после инкубации с ЛПС;  (б) через 80 мин после инкубации с ЛПС; (в) через 90 мин после инкубации с ЛПС

Изменениями морфологии не ограничивались реакции клеток на введение ЛПС P. mirabilis 210. Измерение ригидности мембран нейтрофильных гранулоцитов (в серии независимых экспериментов) показало значительные колебания модуля Юнга, т.е. отмечались моменты, когда жесткость мембраны повышалась в 11 раз по сравнению с контролем. Результаты замеров ригидности мембран нейтрофилов, рассчитанной по модели Герца представлены в таблице 9.

Таблица 9

Значения модуля Юнга, изменяющиеся в ходе инкубации нейтрофилов

с ЛПС P. mirabilis 210  (10 мкг/мл)

Время

инкубации

Конт

роль

15 мин

30 мин

40 мин

60 мин

70 мин

90 мин

110 мин

120 мин

150 мин

Модуль Юнга, кПа

2,1±0,7

8,2

±

2,9*

18,0

±

4,5*

5,7

±

1,7*

4,4

±

1,9

17,5

±

7,9*

8,9

±

1,1*

2,9

±

0,5

23,7

±

1,2*

4,5

±

0,6

* - различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

На всем протяжении эксперимента значения ригидности ни разу не опускались ниже уровня контроля, а, напротив, поддерживались на достаточно высоком уровне, что является косвенным доказательством реализации клеткой апоптотической программы (Elmore, 2007). Для сравнения аналогичная серия экспериментов была проделана с ЛПС E.coli O127:B8. Морфология нейтрофильного гранулоцита постоянно изменялась, но общая направленность изменений соответствовала тем, что отмечались при внесении ЛПС P. mirabilis 210, хотя первоначальное набухание клеток было не столь выраженным. Фрагментация ядра клетки отмечалась через 90 мин после внесения ЛПС. Аналогичные с действием ЛПС штамма P. mirabilis 210  колебания упругости мембраны нейтрофильного гранулоцита отмечены и как результат реакции на ЛПС E.coli O127:B8. Показатели ригидности не разу не снижались ниже контрольного уровня.

Таким образом, несмотря на разнонаправленность влияния на респираторную активность нейтрофильных гранулоцитов (ЛПС P. mirabilis 210  ингибировал, а ЛПС E.coli O127:B8 не изменял этого параметра) ЛПС разных штаммов вызывают сходные изменения морфологии клеток и свойств мембран. Отделение от клеток «апоптозоподобных» телец и значительное увеличение ригидности клеточных мембран заставляют предположить, что в данном случае наблюдается апоптоз нейтрофильных гранулоцитов. Против этого предположения выступает только факт первоначального (на первых минутах наблюдения) увеличения объема клеток после внесения ЛПС. Однако анализ литературных данных показывает, что дегидратационное сокращение объема клеток отнюдь не является облигатным признаком апоптоза. В частности, в работе А.А. Веренинова и др. (2004) показано, что сочетание определенных индукторов и типов клеток приводит к апоптозу без дегидратационного уменьшения объема клеток, тогда как остальные признаки апоптоза (конденсация и фрагментация хроматина, образование апоптозных телец, выпадение из популяции S-фазных клеток) сохраняются. По литературным данным ЛПС является антиапоптотическим агентом. Однако видимого противоречия удается избежать, если, во-первых, учитывать, что в случае проведения СЗМ экспериментов нейтрофильные гранулоциты адгезируются на поверхности подложки, а такая реакция сама по себе обладает кондиционирующим эффектом. В литературных источниках приводятся данные об инкубации нейтрофилов с ЛПС в пробирках, что исключает адгезию клеток. Можно предположить, что первоначальная активация клетки приводит к изменению реакции на ЛПС. Во-вторых, нельзя сбрасывать со счетов и воздействие зонда на механорецепторы нейтрофилов, которое хотя и не вызывает изменения морфологии клеток, но может  трансформировать реакцию клеток на тот или иной (в том числе биохимический) стимул.

ДИНАМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В СИСТЕМАХ С ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА

При исследовании воздействия  пероксида водорода на нейтрофилы было показано, что метод СЗМ имеет ограничения, поскольку при добавлении пероксида в концентрации более 25 мкМ с высокой интенсивностью идет реакция по разложению перекиси до Н2О и О2. При этом активно выделяющиеся пузыри кислорода укрупняются и оседают  на зонде. Это препятствует сканированию, так как изменяется амплитуда колебаний зонда.

Наблюдение за нейтрофильными гранулоцитами в течение 120 минут при внесении Н2О2 в концентрациях от 3 мкМ до 25 мкМ, показало, что возможно два варианта изменения клеточной морфологии. В первом случае клетка размягчается и сдирается зондом с поверхности подложки. В данном случае речь идет о некротической гибели клеток (рис. 9).

Во втором случае клетки «мумифицировались» и практически не изменяли своих параметров в ответ на сканирование, что вероятнее всего также обусловлено гибелью клеток (рис. 10).

Этот вариант гибели клеток не встречался еще не в одной серии экспериментов. Его уникальность заключается в чрезвычайной жесткости мембраны клетки. О том, что мембрана видоизменяется настолько, что морфология клетки становиться неизменной свидетельствует и тот факт, что усиление механического давления на клетку со стороны зонда никак не влияет на изменение её параметров. Постоянное увеличение силы давления проводилось с 2,2 nN до 16,2 nN и в конечном итоге составило значительную силу, в 6,5 раз превышающую оптимальную силу надавливания на интактные клетки в процессе сканирования.

Рис. 9. Некротическая гибель клеток после внесения пероксида водорода в концентрации 3,1 мкМ (изображения получены в физиологическом растворе в режиме реального времени методом АСМ)

Рис. 10. «Мумификация» клеток после внесения пероксида водорода в концентрации 3,1 мкМ (изображения получены в физиологическом растворе в режиме реального времени методом АСМ).

Поскольку исследование взаимодействия нейтрофилов с Н2О2 методом СЗМ имеет ограничения, то для изучения её влияния в больших концентрациях клетки инкубировали с Н2О2 разной концентрации и делали фиксированные мазки по Романовскому-Гимзе. В данном случае обнаруживалась гибель ПМЯЛ по двум классическим путям: некрозу и апоптозу. Некроз-апоптотическое соотношение было подсчитано в серии независимых экспериментов с окрашиванием клеток. Суммарные значения приведены в таблице 10. В результате зафиксировали значительное увеличение некротической гибели клеток, в то время как апоптоз нейтрофилов сохранялся приблизительно на одном уровне при разных концентрациях Н2О2 и не превышал уровня 15,9±5,0 %.

Таким образом, главным результатом в ходе исследования влияния на нейтрофилы пероксида водорода методом СЗМ является выявление нетипичной для нативных, а также некротически и апоптотически гибнущих клеток структурной перестройки мембран, характеризующейся крайне высокой жесткостью.

Таблица 10

Некроз-апоптотические соотношения гибели нейтрофильных гранулоцитов при внесении разной концентрации Н2О2

Концентрация

Н2О2

контроль

50 мкМ

100 мкМ

150 мкМ

200 мкМ

250 мкМ

Интактные клетки (%)

94,7±

0,6

79,3±

0,6

69,3±

3,8

68,7±

2,1

35,0±

11,3

23,0±

1,0

Апоптоз (%)

2,3±0,6

11,7±1,5

22,0±1

17,3±5,5

18,5±3,5

10,0±8,5

Некроз (%)

3,0±1,0

9,0±1,0

8,7±3,1

18,3±1,5

46,5±14,9

67,0±9,9

ДИНАМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В СИСТЕМАХ С КВАНТОВЫМИ ТОЧКАМИ

Поскольку при всех вариантах поступления наночастиц в организм человека они неизбежно оказываются в крови, то изучение реакции клеток крови на наноматериалы является первоочередной задачей. Для исследования влияния квантовых точек на жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов первоначально оценивалась жизнеспособность интактных клеток. Для этого в течение 10 часов нейтрофилы, изолированные из кровяного русла и находящиеся в ЗФР в концентрации 500 тыс. кл/мл в термостатируемой ячейке конфокального микроскопа, наблюдали в режиме реального времени. За все время наблюдения клетки демонстрировали высокую степень активности: быстрое передвижение гранул в цитоплазме, миграционная активность, образование псевдоподий. Тест с трипановым синим показал значение  жизнеспособности нейтрофилов – 99% как в начале наблюдения за клетками, так и по окончании процесса.

В дальнейшем к нейтрофильным гранулоцитам добавляли квантовые точки (CdSe/ZnS, покрытые меркапто-уксусной кислотой с эмиссией 620 нм). Моделировалось две ситуации. Во-первых, клетки инкубировали с квантовыми точками (0,1 мг/мл) в течение разных временных интервалов в пробирках, после чего высаживали на стекло, где происходила спонтанная адгезия к подложке и клетки фиксировали метанолом. Во-вторых, клетки вносили в термостатируемую жидкостную ячейку (37С), после чего происходила спонтанная адгезия и в течение 2 часов наблюдали за интактными клетками. После этого в систему вносили квантовые точки.

В первой серии экспериментов зафиксировали ярко выраженный  цитотоксический эффект квантовых точек, даже в том случае, когда клетки не праймированы адгезией к субстрату, а фототоксическое воздействие исключено условиями проведения эксперимента. Инкубация нейтрофилов с квантовыми точками в течение 5 мин не являлась опасной, поскольку границы клеток четко контурируются, определяется ядро, видна только голубая автофлюоресценция, но уже через 10 мин клетки начинают постепенно поглощать квантовые точки, при этом четко отмечается зависимость между заполненностью клеток квантовыми точками и структурой мембраны, т.е. эмиссия в красной области спектра (=620нм), характерная для квантовых точек, кореллирует с отсутствием у клеток ядра и разрушением мембраны. Через 30 и 60 мин после инкубации с CdSe/ZnS-МУК (0,1 мг/мл) количество поврежденных клеток постепенно нарастает, однако самые серьезные изменения происходят при инкубации нейтрофилов с квантовыми точками в течение 90 мин и более: отмечается образование клетками множественных сетевых контактов, при этом размеры формируемых структур размеры типичных псевдоподий. Клетки коадгезируют, образуя крупные конгломераты некротизированных образований, идентифицируемых в виде ярко-красного свечения. Четко идентифицируется отсутствие ядер клеток в агрегатах и деструкция мембраны.  Дополнительную информацию дает использование метода АСМ: клетка сохраняет целостность мембраны и ядро, однако образует псевдоподии, не характерные для нейтрофильных гранулоцитов, т.к. фрагменты псевдоподий на некоторых участках выглядят как «расплавленные», в отличие от всегда четко структурированных псевдоподий, формируемых клетками при фагоцитозе микроорганизмов. Таким образом, происходит поглощение квантовых точек несмотря на их абиотическую природу. Процесс поглощения реализуется в короткие промежутки времени (к 10-й мин эксперимента более 30% клеток оказываются заполненными квантовыми точками).

Такая же концентрация квантовых точек была использована при инкубации с клетками, адгезированными и распластанными на субстрате. Обнаружено, что квантовые точки в концентрации 0,1 мг/мл образуют крупные конъюгаты, а для клеток отмечались следующие феномены. Во-первых, наблюдается активное поглощение квантовых точек нейтрофильными гранулоцитами, хотя активное образование псевдоподий трудно напрямую ассоциировать с поглощением конъюгатов. Во-вторых, клетки, поглотившие квантовые точки, сохраняют способность к хемотаксису, быстро двигаются по направлению друг к другу и активно обмениваются квантовыми точками. По всей видимости, полученные нами после фиксации мазков агрегаты, и являются следствием такого направленного движения клеток по направлению друг к другу. В-третьих, нейтрофилы еще больше укрупняют конъюгаты квантовых точек,  и пытаются экскретировать их на одном из полюсов. Достаточно продолжительное время клетки еще сохраняют высокую подвижность, но через 60 мин она сменяется характерным истончением мембраны по периферии, свидетельствующем о гибели клеток. В-четвертых, у части нейтрофилов наблюдается эффект «избегания» квантовых точек, когда они не просто активно выводят конъюгаты квантовых точек либо в среду, либо передавая их другим клеткам, но формируют выпячивание мембраны в месте концентрации  CdSe/ZnS-МУК (рис. 11).

Рис. 11. Углубление участка мембраны нейтрофильного гранулоцита в месте концентрации квантовых точек CdSe/ZnS-МУК (0,1 мг/мл). Изображение получено на конфокальном микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200M LSM 510 META (Германия), увеличение объектива х100

В данном случае, вероятнее всего наблюдается сочетанное токсическое воздействие квантовых точек и света, поскольку наблюдение в конфокальном микроскопе ведется при постоянном освещении низкой интенсивности. Через  100 мин после внесения квантовых точек неизбежно наступает «вскипание» клетки. Морфологические признаки такого «вскипания» не однородны. В основном можно выделить две группы клеток. Первая группа характеризуется быстрым некрозом, в результате которого при микроскопии визуализируется только «тень» клетки.  Вторая группа начинает образовывать не характерные для нативного нейтрофила крупные гранулы, быстро концентрирует весь цитоплазматический материал в центре клетки, после чего периферическая часть истончается и клетка формирует характерные «волдырчатые» тени. Смертельность CdSe/ZnS в концентрации 0,1 мг/мл подтверждена и в отношении клеток линии HeLa и в отношении человеческих гепатоцитов, однако в этих работах авторы фиксировали цитотоксический эффект в течение 24 часовой инкубации (Shiohara et al., 2004).

Обсуждая механизмы цитотоксичности, авторы отмечают, что кадмий вызывает гибель клеток в концентрации 100 – 400 мМ, поскольку ионы токсиканта способны связывать сульфгидрильные группы многих, в том числе митохондриальных белков. При этом тиогруппы инактивируются, что приводит к митохондриальной дисфункции и гибели клеток по механизму некроза. Морфологическое описание некротической гибели гепатоцитов полностью соответствуют тем, что наблюдались в наших экспериментах в отношении нейтрофильных гранулоцитов, т.е. после воздействия квантовыми точками, покрытыми меркапто-уксусной кислотой, обнажается гранулированная цитоплазма, границы клеток становятся нечеткими и расплывчатыми, ядро не определяется и формируются очевидные волдырчатые структуры.

В следующей серии экспериментов нами была взята концентрация квантовых точек равная 0,03 мг/мл. Через 20 мин после внесения в ячейку квантовых точек CdSe/ZnS-МУК (0,03 мг/мл) наблюдалось постепенное концентрирование квантовых точек в одном из компартментов у 28 ± 1,9 % из исследуемых клеток. Однако образования псевдоподий у данных нейтрофилов за все время наблюдения не происходило. Формирование изображения в режиме 3D показало, что в данном случае квантовые точки заполняют объем клетки, концентрируясь в ней (рис. 12).

Рис. 12. Аккумулирование квантовых точек в объеме нейтрофилов первого типа: 3D изображение. Светлый цвет – границы клетки, темный цвет – аккумулированные квантовые точки (бар: 5 мкм)

Через 45 мин после добавления  CdSe/ZnS-МУК у 10 ± 2 % нейтрофилов появлялась высокая степень двигательной активности. Морфология клеток существенно изменялась: в распластанной части клетки визуализировались атипично крупные гранулы. Клетки формировали псевдоподии, однако не поглощали квантовые точки (рис. 13).

Через 100 мин от начала инкубации с квантовыми точками четко выделялись три типа клеток: (1) клетки «аккумулировавшие» в своем объеме квантовые точки – 28,0 ± 1,9 %; (2) клетки, не поглощавшие квантовых точек – 10,0 ± 2 %  и (3) клетки, окруженные ореолом квантовых точек – 59,0 ± 2,2% (рис. 13). Возникновение «ореола» происходило в разное время наблюдения за клетками (от 40 до 90 мин).

Интересной особенностью является сходство морфологической градации клеток с результатами, полученными В. П. Сапрыкиным и С.Л. Кузнецовым (2001). Представленные авторы, используя метод электронной микроскопии, разделяют все нейтрофилы крови на три субпопуляции: (1) клетки с хорошо выраженной зернистостью цитоплазмы – 58,0 ± 1,0 %; (2) клетки с умеренно выраженной зернистостью цитоплазмы – 30,0 ± 1,2 % и (3) нейтрофилы с отсутствием зернистости цитоплазмы – 12,0 ± 0,9 %.

Рис. 13 Три субпопуляции нейтрофильных гранулоцитов, различаемые по способности поглощать квантовые точки (квантовые точки обозначены белым цветом).  (а) клетки «аккумулировавшие» в своем объеме квантовые точки; (б) клетки, не поглощавшие квантовые точки; (в) клетки, окруженные ореолом квантовых точек

Таким образом, процентное соотношение практически идентично тому, что получено в ходе наших экспериментов. По-всей вероятности, праймированные нейтрофилы (12% по Сапрыкину – Кузнецову или 10% по нашим данным) меняют структуру цитоплазматической мембраны таким образом, что она становится непроницаемой для квантовых точек. В пользу того, что клетки, не поглощавшие квантовых точек обладают высокой физиологической активностью говорит тот факт, что на всем протяжении эксперимента они проявляли высокую подвижность, формировали атипично крупные гранулы, активно перемещавшиеся внутри цитоплазмы. Таким образом, можно констатировать функциональную неоднородность нейтрофильных гранулоцитов в реакциях с квантовыми точками: выделено три субпопуляции клеток, различающихся по способности к интернализации и накоплению квантовых точек.

ВЫВОДЫ

1.        При использовании режима микротвердости методом сканирующей зондовой микроскопии обнаружены мягкие области на поверхности буккальных эпителиоцитов – эти области не являются следствием активности микоплазм или хламидий.

2.        Оценка активности лизоцима слюны по нефелометрическому тесту показала перспективность использования метода для скрининговых исследований тяжести кариозного процесса в полости рта.  У детей с компенсированной и субкомпенсированной формой кариозного процесса отмечалось достоверное повышение активности лизоцима слюны по сравнению с контрольным уровнем, а при декомпенсированной форме кариеса активность лизоцима либо сильно возрастает – 60,52±0,99%, либо выражена очень слабо.

3.        Установлено, что межштаммовая вариабельность АПАК-реактивности намного выше межвидовой. Обнаружено, что низкая активность некоторых штаммов бактерий в системе альтернативного каскада комплемента (Staphylococcus epidermidis 178M, Proteus vulgaris 1418-1) определяется комплексом поверхностных факторов, среди которых определенную роль играют сиаловые кислоты.

4.        Выявлено, что альтернативный каскад комплемента может вызывать бактериолиз некоторых штаммов грамотрицательных микроорганизмов, тогда как в отношении других штаммов того же вида реализуется только опсоническая функция. 

5.        Определено, что липополисахарид бактерий рода Proteus слабо стимулирует респираторную активность нейтрофилов, а предварительная инкубация ЛПС в системе альтернативного каскада приводит к практически полной потере активирующей способности ЛПС.

6.        Продемонстрирован феномен функциональной дискретности процессов образования псевдоподий и респираторного взрыва в ходе реализации нейтрофильным гранулоцитом программы фагоцитоза: образование псевдоподий происходит на 5-й минуте процесса, тогда как максимум респираторного взрыва достигается на 25-й минуте.

7.        Пчелиный яд в концентрациях от 1 до 100 мкг/мл обнаруживает ярко выраженную токсическую активность, проявляющуюся как в изменении морфологических параметров клетки (разрушение мембран), так и в подавлении функциональной активности (респираторного взрыва нейтрофилов в реакциях хемилюминесценции). Гепарин в концентрации 5 МЕ/мл проявляет протективную активность и в комплексе с пчелиным ядом нивелирует токсическую активность, определяемую по изменению морфологии. Меньшей протективной активностью гепарин обладает в отношении функциональных свойств клеток: способность поддерживать респираторную активность на уровне контроля клетки обнаруживали только при низких концентрациях яда в комплексе «яд-гепарин» (1 мкг/мл и 10 мкг/мл) и только в том случае если клетки находились в состоянии функционального покоя.

8.        Показано, что состав и рН буфера являются критичными для наблюдения за нейтрофильными гранулоцитами в витальном состоянии методом СЗМ. Оптимально наблюдения вести в физиологическом растворе (рН 7,2), либо в забуференном растворе Хенкса (рН 7,2). В фосфатно-солевом буфере (рН 7,4), в небуферном растворе Хенкса (рН меняется в ходе эксперимента с 7,2 до 8,2) клетки демонстрируют реакцию набухания, свидетельствующую о неблагоприятном окружении для клетки.

9.        Установлено, что ригидность мембран нейтрофилов, измеренная с помощью модуля Юнга и рассчитанная по модели Герца составляет 2,1 ± 0,7 кПа.  Проведение спектроскопии приводит к реакции набухания клеток, что отражается на морфологических параметрах нейтрофилов, но не влияет на ригидность их мембран. Поэтому исследование изменений клеточной морфологии и определение ригидности мембран нужно проводить в сериях независимых экспериментов.

10.        Доказано, что инкубация нейтрофильных гранулоцитов с ЛПС P. mirabilis 210  (10 мкг/мл) и с ЛПС E.coli O127:B8 (25 мкг/мл) вызывает сходные изменения в морфологии клеток, общая направленность которых: образование «апоптозоподобных» телец и увеличение ригидности мембраны свидетельствуют о реализации нейтрофильными гранулоцитами программы апоптоза.

11.        В реакциях с экзогенным пероксидом водорода (концентрация от 3 до 25 мкМ/мл) отмечено два варианта клеточной гибели: некроз и не описанный ранее механизм «мумификации», сопровождающийся субнормальным увеличением ригидности мембраны. В результате исследования высоких концентраций экзогенного пероксида водорода зафиксировано значительное увеличение некротической гибели клеток, в то время как апоптоз нейтрофилов сохраняется приблизительно на одном уровне при разных концентрациях Н2О2 и не превышает уровня 15,9±5 %.

12.        Зафиксирована токсическая активность квантовых точек CdSe/ZnS в отношении нейтрофильных гранулоцитов, которая может быть усилена фототоксичностью. В результате инкубации с квантовыми точками обнаружена функциональная гетерогенность нейтрофильных гранулоцитов: они разделялись на три фракции – (1) клетки, накапливающие квантовые точки в одном из компартментов, (2) клетки, окруженные ореолом квантовых точек, и (3) клетки, не поглощавшие квантовых точек.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Плескова С.Н. Функциональные изменения в системе альтернативного каскада комплемента, инициированные стафилококком / С.Н. Плескова // Нижегородский медицинский журнал. – 2000. - №2. – С. 25-28.

2. Плескова С.Н. Принцип стандартизации оценки функциональной активности альтернативного пути активации комплемента / С.Н. Плескова,  А.Н. Маянский //Иммунология. – 2000. - №4. – С. 61-62.

3. Плескова С.Н. Стандартизация методов изучения ингибиторной активности в системе альтернативного пути активации комплемента / С.Н. Плескова, А.Н. Маянский //  Клиническая лабораторная диагностика. – 2000. – С. 25.

4. Плескова С.Н. Кондиционирование альтернативного каскада комплемента в системе со стафилококком / С.Н. Плескова,  А.Н. Маянский //Иммунология. – 2001. - №5. – С. 30-33.

5. Плескова С.Н. Исследование морфологических параметров нейтрофильных гранулоцитов методом сканирующей зондовой микроскопии / С.Н. Плескова, М.Б. Звонкова, Ю.Ю. Гущина // Морфология. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. – 2005. – Т.127. – №1. – С. 60 - 62.

6. Гущина Ю.Ю. Исследование различий морфологических параметров клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии / Ю.Ю. Гущина, С.Н. Плескова, М.Б. Звонкова // Поверхность. Рентгеновские, синхронные и нейтронные исследования. – 2005. – №1. – С. 48 – 53.

7. Плескова С.Н. Использование метода сканирующей зондовой микроскопии в биомедицинских исследованиях / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова // Вестник Нижегородского университета. Серия биология. Выпуск 1 (7). Электромагнитные поля и излучения в биологии и медицине. – Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 2004, С. 127 – 134.

8. Плескова С.Н. Исследование морфологии и ригидности мембран нейтрофильных гранулоцитов в режиме реального времени методом сканирующей зондовой микроскопии / С. Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова, А.Е. Хомутов //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2006. – т. 141. – №6. – С. 712 - 715.

9. Плескова С.Н. Исследование морфологической структуры буккальных эпителиоцитов / С. Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова, А.Е. Хомутов // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. Серия Биология. Выпуск 1 (11). – Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 2006, С. 170 – 173.

10. Pleskova  S. N. Research of neutrophils reaction on the lipopolisaccharides by atomic force microscopy  / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, M. B. Zvonkova // The FEBS Journal. – 2006. – V. 273, Р. 110.

11. Плескова С.Н. Особенности морфологии нейтрофилов, исследованные методом сканирующей зондовой микроскопии / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина // Цитология. – 2007. – т. 49. – № 9. – С. 783 – 784.

12. Плескова С.Н. Различия в функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в реакциях с квантовыми точками / С.Н. Плескова,  И.В. Балалаева,  Ю.Ю. Гущина, Е.А. Сергеева, Т.А. Здобнова, С.М. Деев, И.В. Турчин// Принята к печати в журнал «Морфология».

Статьи, опубликованные в иностранных изданиях:

13. Pleskova S.N. Morphological investigation of human blood neutrophil phagocytosis in vitro by AFM/ S.N.  Pleskova, M.I. Zaslavskaja, Yu.Yu. Guschina, I.A. Koksharov, Yu.G. Erastova // Physics of low-dimensional structures, ѕ (2001) pp. 229 - 236.

14. Pleskova S.N. Investigation of the influence of complement system on the various strains of Proteus by methods of atomic force microscopy and luminol-dependent chemiluminescence / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, M. B. Zvonkova// Physics of low-dimensional structures, (2004) pp. 77 – 81.

Статьи в сборниках научных трудов:

15. Плескова С.Н. Проявление активности протея в системе альтернативного каскада комплемента / С.Н. Плескова, И.А. Зубарева, Е.Н. Сулимова// Сборник научных работ «Актуальные проблемы медицины», Томск, 2004 г., т. 3, №2 C.302 – 304.

16. Плескова С.Н. Изучение литической активности лизоцима слюны в отношении Micrococcus lysodeikticus методом санирующей зондовой микроскопии / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова // Сборник научных работ «Актуальные проблемы медицины», Томск, 2004 г., т. 3, №2 С. 304 – 305.

17. Рацюк М.М. Изменение активности лизоцима и биохимических показателей ротовой жидкости на фоне проведения профилактических мероприятий/ М.М. Рацюк, С.Н. Плескова// Сборник научных статей «Актуальные вопросы экспериментальной, клинической и профилактической стоматологии» – 2005. – 169-175 с.

18. Гущина Ю.Ю. Морфометрический АСМ-анализ клеток крови в норме и при альтерациях / Ю.Ю. Гущина, С. Н. Плескова, В.Н. Крылов, Н.А. Преснухина, М.И. Заславская, И.А. Кокшаров // «Электромагнитные поля и излучения в биологии и медицине: межвузовский сборник научных трудов». – Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 2006. – 24 – 34 с.

19. Весновских Е.Ю. Гибель нейтрофильных гранулоцитов по механизмам апоптоза и некроза при внесении Н2О2 разной концентрации / Е.Ю. Весновских, С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина //Межвузовский сборник научных трудов «Современный мир, природа и человек», Томск, 2007 г., т. 4, №4, с. 62.

Статьи, опубликованные в материалах международных конференций и конгрессов:

20. Плескова С.Н. Нарушения в системе альтернативного пути активации комплемента, ассоциированные со стафилококком / С.Н. Плескова // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2000». – Вып. 4. – 2000. – 58-59 с.

21. Koksharov I.A. Discreteness of erythrocyte membrane functional states: 2-fold transitions in response to an oxidative activation / I.A.Koksharov, A.G. Sanin, Yu.Yu. Guschina, M.I. Zaslavskaja, S.N. Pleskova, A.A. Mironov // Proceedings of the Scanning Probe Microscopy – 2001 Workshop 26 – February – 1 March 2001, Nizhny Novgorod, Russia pp. 179 – 181.

22. Звонкова М.Б. Изучение структурно-морфологических параметров эпителиальных клеток трахеи и интестинального тракта методом сканирующей зондовой микроскопии / М.Б. Звонкова, С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина// 8-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология- наука ХХI века», Сборник тезисов, 2004 г.

23. Pleskova S.N. Influence of methods of fixing on structural and morphological parameters of human cells of blood reveal by scanning probe microscopy / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, M. B. Zvonkova // Proceedings of the Scanning Probe Microscopy – 2004 Workshop 2 6 May 2004, Nizhny Novgorod, Russia pp. 256 – 258.

24. Guschina Yu. Yu. Influence of methods of fixing on structural and morphological parameters of human cells of blood reveal by scanning probe microscopy / Yu. Yu. Guschina, S. N. Pleskova, M. B. Zvonkova // Abstracts EMBO/FEBS Workshop AFM applications in Biology 2004 7 – 9 July, Oeiras, Portugal p. 15

25. Pleskova S.N. Investigated of the factor nonspecific defenses of oral cavity (lysozyme and buccal epithelium) by scanning probe microscopy / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, M. B. Zvonkova // Abstracts EMBO/FEBS Workshop AFM applications in Biology 2004 7 – 9 July, Oeiras, Portugal p. 17

26. Pleskova S.N. Apoptosis of the Human Neutrophils under a Lipopolisaccharide (LPS) of Proteus mirabilis Condition Observed in Real Time by Atomic Force Microscopy (AFM) / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, M. B. Zvonkova // NSTI-Nanotech 2005, ISBN 0-9767985-0-6 Vol.1, pp. 377 – 380.

27. Pleskova S.N The influence of quantum dots on the morphology of neutrophil granulocytes / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, I.V. Balalaeva // Proceedings of International symposium “Topical problems of biophotonics” 4 – 11 august, 2007, Nijny Novgorod – Moskow, p. 182 – 184.

28. Плескова С.Н. Изменения нейтрофильных гранулоцитов в средах с разными значениями рН при механическом воздействии на клетки / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина // Materiay IV Midzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji 1 – 15 czerwca 2008, Tym 16, Przemyl, Nauka I studia, 2008. – s. 45 – 47.

29. Весновских Е.Ю. Морфологические изменения нейтрофилов, исследованных методом сканирующей зондовой микроскопии / Е.Ю. Весновских, С.Н. Плескова // Материалы II международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» 15 – 16 сентября, Казань, с. 154 – 155.

30. Гиматдинова Э.Р. Цитотоксический эффект квантовых точек на нейтрофильные гранулоциты / Э.Р. Гиматдинова, С.Н. Плескова // Материалы II международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» 15 – 16 сентября, Казань, с. 155 – 156.

31. Весновских Е.Ю. Морфологические изменения нейтрофилов / Е.Ю. Весновских, С.Н. Плескова // Сборник тезисов Пущино – 2008, 12-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, с. 123 – 124.

32. Гиматдинова Э.Р. Морфологическая неоднородность нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками / Э.Р. Гиматдинова, С.Н. Плескова // Сборник тезисов Пущино – 2008, 12-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, с. 172 – 173.

33. Плескова С.Н. Проявление токсичности квантовых точек в реакциях с нейтрофилами / С.Н. Плескова, И.В. Балалаева, Ю.Ю.Гущина, Э.Р. Гиматдинова, Е.А. Сергеева // I Международный конгресс по нанотехнологиям, конференция «Нанотехнологии в онкологии», Москва. – 2008.

Статьи в региональных изданиях и материалах конференций:

34. Плескова С.Н. Характеристика альтернативного пути активации комплемента в системе с нейтрофильными гранулоцитами в состоянии апоптоза / С.Н. Плескова, М.И. Заславская, А.Н. Маянский // Тезисы докладов II Всероссийского симпозиума «Хроническое воспаление», 2000. – 59-60 с.

35. Плескова С.Н. Особенности антиопсонической активности различных штаммов стафилококка / С.Н. Плескова // Материалы 65-й конференции молодых ученых и студентов. – Курск: КГМУ. – 2000. – с. 50-51.

36. Плескова С.Н. Взаимодействие нейтрофилов в состоянии апоптоза с системой альтернативного пути активации комплемента / С.Н. Плескова, М.И. Заславская // Материалы 5-й Нижегородской сессии молодых ученых. –  Дзержинск. – 2000. – 209-210 с.

37. Маянская И.В. Значение альтернативного каскада комплемента в диагностике и лечении органов пищеварения у детей / И.В. Маянская, Е.И. Шабунина, Л.Н. Казначеева, В.И. Ашкинази, Н.И. Толкачева, С.Н. Плескова // Сборник материалов 6-й конференции «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей». – 1998. – 60-62 с.

38. Плескова С.Н. Проявление активности протея в системе альтернативного пути активации комплемента / С.Н. Плескова // Тезисы докладов молодых ученых, аспирантов, студентов. - Иваново. – 2001. – 50 с.

39. Плескова С.Н. Взаимодействие продуктов деградации нейтрофилов с иммобилизованным С3b-компонентом комплемента / С.Н. Плескова // Сборник материалов 4-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». – 2001. – 165-166 с.

40. Плескова С.Н. Определение структурно-функционального состояния цитоплазматической мембраны клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии в системах in vitro / С.Н. Плескова, М.И. Заславская, А.А. Миронов, Ю.Ю. Гущина // Сборник материалов 5-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология- наука ХХI века». – 2001.  –  129 с.

41. Плескова С.Н. Исследование морфологических параметров клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова // Материалы научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» Казань 17 – 18 июня 2004 г. с. 70 – 71.

42. Плескова С.Н. Вариабельность активности альтернативного каскада комплемента в отношении бактерий рода Proteus / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова // Материалы научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» Казань 17 – 18 июня 2004 г. с. 68 – 69.

43. Звонкова М.Б. Использование морфологических и функциональных изменений клеток в качестве тест-системы для оценки повреждающего и протективного действия экологических факторов / М.Б. Звонкова, С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина //IV сессия научной молодежной школы-семинара «Промышленная безопасность и экология» Саров 20 – 24 сентября 2004г.

44. Плескова С.Н. Изучение факторов неспецифической резистентности (лизоцима и буккальных эпителиоцитов) методом сканирующей зондовой микроскопии у здоровых детей и детей, страдающих кариесом / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова // Материалы третьей междисциплинарной конференции с международным участием («НБИТТ – 21») Петрозаводск, 21 – 23 июня 2004, с. 13.

45. Плескова С.Н. Влияние методов фиксации на морфологию и размеры нейтрофилов и лимфоцитов крови / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова // Материалы третьей междисциплинарной конференции с международным участием («НБИТТ – 21») Петрозаводск, 21 – 23 июня 2004, с. 30.

46. Плескова С.Н. Исследование ригидности мембран интактных и кондиционированных нейтрофилов методом сканирующей зондовой микроскопии / С. Н. Плескова // 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология- наука ХХI века», 17 – 221 апреля, 2006 г. Сборник тезисов, с. 118.

47. Плескова С.Н. Исследование нативных нейтрофильных гранулоцитов методом сканирующей зондовой микроскопии в средах с различными значениями рН / С. Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова // Тезисы докладов XV Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел, 4 июня – 7 июня, 2007, Черноголовка, с. 304.

48. Гиматдинова Э.Р. Цитологический эффект квантовых точек на нейтрофильные гранулоциты / Э.Р. Гиматдинова, Д.И. Князев, С.Н. Плескова, И.В. Балалаева, Ю.Ю. Гущина // XIII Нижегородская сессия молодых ученых. Естественно-научные дисциплины. – 2008. – с. 11.

49. Плескова С.Н. Токсикология и наноматериалы – взаимодействие на арене бионанотехнологии / С.Н. Плескова // Материалы X международного форума «Высокие технологии XXI века». – 2009. – с. 255 – 257.

Список используемых сокращений

АПАК –        альтернативный путь активации комплемента

АСМ –        атомно-силовая микроскопия

АФК –        активные формы кислорода

БЭ –                буккальные эпителиоциты

ЗФР –        забуференный физиологический раствор

КОЕ –        колоние-образующие единицы

ЛЗХЛ –        люминолзависимая хемилюминесценция

ЛПС –        липополисахарид

МАК –        мембраноатакующий комплекс

ПМЯЛ –        полиморфно-ядерные лейкоциты

СЗМ –        сканирующая зондовая микроскопия

СХЛ –        спонтанная хемилюминесценция

ФИТЦ –        флюоресцеина изотиоцианат

ФСБ –        фосфатно-солевой буфер

ЭГТА –        этиленгликоль тетраацетат

ЭДТА –        этилендиамин тетраацетат

Автор выражает глубокую признательность за возможность проведения экспериментов коллективу НОЦ ФТНС ННГУ им. Н.И. Лобачевского, в особенности м.н.с. Гущиной Ю.Ю. и директору НОЦ ФТНС ННГУ, к.ф.-м.н. Горшкову О.Н., коллективу кафедры микробиологии и иммунологии НГМА, в особенности д.м.н., проф. Маянскому А.Н., и за совместные исследования коллективу лаборатории биофотоники ИПФ РАН, в особенности к.б.н., н.с. Балалаевой И.В., доценту кафедры анатомии, физиологии и гигиены человека Нижегородского государственного педагогического университета, к.б.н. Звонковой М.Б. и стоматологу-клиницисту Рацюк М.М.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.