WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Ботина Светлана Геннадиевна

Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии

03.02.03 - микробиология

03.01.06 - биотехнология

Автореферат диссертации

на соискание степени

доктора биологических наук

Москва

2011

Работа выполнена в Центральной лаборатории микробиологии Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности Россельхозакадемии

Научный консультант:

Доктор технических  наук, профессор  Семенихина Вера Филатовна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Шендеров Борис Аркадьевич

Доктор биологических наук, профессор  Складнев Дмитрий Анатольевич

Доктор медицинских наук,  профессор  Суворов Александр Николаевич

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Оболенск.

Защита состоится «__»________ 2011  года в___ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

Автореферат разослан «____» ____________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук                                                О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

       

Актуальность проблемы

В настоящее время производственные процессы, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов, приобрели огромное значение. Современная биотехнология неразрывно связана с использованием новых подходов к созданию и отбору новых микроорганизмов, что влечет за собой увеличение разнообразия биотехнологической продукции. Фундаментальные основы промышленной биотехнологии микроорганизмов, направленные на получение продуктов питания и пробиотических препаратов нового поколения, заложены в трудах российских и зарубежных ученых (Семенихиной В.Ф., 2007; Ганиной В.И., 2005; Рогова И.А., 2006; Шевелевой С.А., 2005; Шендерова Б.А., 2005; Алешкина В.А., 2003; Алешкина А.В., 2010; Амерхановой А.М., 2009; Бондаренко В.М., 2007; Bover-Cid S., 2003; De Vuyst L., 2008; Eerola S., 2006; Klaenhammer T.R., 2008; Leroy F., 2008; Madsen S.M., 2004; Niinivaara F., 2005; Tanous C., 2003; Vandamme E.J., 2004 и др.)

Исследования и фундаментальные достижения последних десятилетий в микробиологии, генетике и молекулярной биологии дали возможность изучения генетического разнообразия бактериальных штаммов. С развитием генетической систематики, с расширением круга используемых методов, направленных на изучение бактериального генома и накоплением экспериментальных данных, касающихся генетического разнообразия различных таксономических групп бактерий, современная таксономия бактерий стала быстро развиваться, что позволило решить многие спорные вопросы систематики конкретных групп микроорганизмов (Турова Т.П.,  2009). Вместе с тем оставались нерешенными проблемы, связанные с противоречиями между данными молекулярной систематики и традиционными представлениями, основанными на анализе фенотипа в отношении группы молочнокислых бактерий имеющих практическое применение.

  До недавнего времени при отборе штаммов для создания бактериальных заквасок использовались только стандартные микробиологические подходы оценки стартерных культур, такие как выделение, идентификация таксономического положения на основе изучения их морфологических, физиолого-биохимических свойств, определение условий культивирования и их технологических свойств. Однако использование только этих традиционных технологий не всегда позволяет эффективно отбирать безопасные и технологичные штаммы молочнокислых бактерий для использования их в качестве заквасочных культур в производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов. Многими исследователями отмечалось, что у микробиологов возникают трудности при идентификации на видовом и дифференциации на внутривидовом уровне бактерий различных родов факультативных анаэробов. Особенно трудно идентифицировать виды внутри родов: Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus с помощью классических фенотипических методов (Dellaglio F., 1999; Giraffa G., 2002; Andrighetto C., 2004;  Neviani E., 2003; Stackebrandt E., 2002; Facklam R., 1989; Eaton T.J., 1999; Gasson M.J., 2005; Стоянова Л.Г., 2006, Машенцева Н.Г., 2008). В этой связи особую актуальность приобретает проблема использования современных фундаментальных научных достижений изучения бактериального генетического разнообразия в прикладных областях науки. Фенотипическая характеристика штамма, применяемая для идентификации, паспортизации и типирования штаммов бактерий в настоящее время уже не является достаточной для установления таксономического положения изучаемого организма и целостной характеристики его свойств. Что же касается штаммов молочнокислых бактерий, практически использующихся в пищевой промышленности, использование современных молекулярно-биологических подходов для таксономической идентификации, молекулярно-генетической паспортизации, генотипирования бактерий позволит выбирать лучшие стартовые культуры для промышленного применения и получения качественных и безопасных пищевых продуктов и бактериальных препаратов.

  Цель работы - применение комплекса молекулярно-биологических методов для изучения генетического разнообразия штаммов молочнокислых бактерий и использование результатов этого исследования при отборе бактериальных культур для создания заквасок, позволяющих гарантировать производство качественных и безопасных кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.

Задачи исследования

1. Выделить природные штаммы молочнокислых бактерий из естественной среды обитания (молоко, кисломолочные продукты домашнего изготовления, микробиота человека).

2. Показать необходимость использования молекулярно-биологических методов при установлении видовой принадлежности молочнокислых бактерий. Применить метод анализа последовательности гена 16S рРНК для идентификации бактериальных штаммов, принадлежащих к родам Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus.

3. Изучить генетическое разнообразие природных штаммов Streptococcus thermophilus с использованием методов геномной рестрикции и PFGE.

4. Продемонстрировать возможность использования метода анализа данных о последовательности гена 16S рРНК для внутривидовой дифференциации подвидов L. lactis subsp. cremoris и L. lactis subsp. lactis. Применить этот метод для идентификации бактериоцинпродуцирующих штаммов L. lactis.

5. Изучить разрешающую способность метода RAPD-PCR для штаммовой идентификации молочнокислых бактерий и осуществить генетическую паспортизацию природных и промышленных культур бактерий Streptococcus и Lactobacillus с использованием этого метода.

6. Продемонстрировать необходимость проведения исследований с использованием молекулярно-биологических подходов для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Применить метод ПЦР-генотипирования штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса.

7. Протестировать штаммы Streptococcus thermophilus на наличие технологичных и пробиотических свойств (способность синтезировать экзополисахариды, витамин и утилизировать галактозу) и отобрать среди них наиболее перспективные культуры для использования в качестве заквасок и бактериальных концентратов при производстве кисломолочных продуктов общего и функционального назначения.

Научная новизна работы

Впервые проведено выделение и изучение новых штаммов молочнокислых бактерий из различных экологических ниш (молоко, кисломолочные продукты домашнего изготовления, микробиота человека: гастроинтестинальный тракт, ротовая полость и грудное молоко кормящих женщин) и разных географических регионов (Россия, страны Восточной и Западной Европы), на основании этого получены новые фундаментальные знания о физиолого-биохимических и генетических особенностях штаммов бактерий родов Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus.

  Получены новые фундаментальные знания о внутривидовом разнообразии природных изолятов молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus. При использовании методов геномной рестрикции и пульс-гель электрофореза (PFGE) и сравнительного анализа подобия геномных фингерпринтов продемонстрированы доказательства вариабельности изученных штаммов по размерам их геномов. Показано, что размер геномов у исследованных штаммов сильно варьирует – от 1417 до 2075 т.п.н., т.е. различия между минимальным и максимальным значением размера генома составляет около 600 т.п.н., что свидетельствует о внутривидовом генетическом полиморфизме бактерий данного вида.

  Впервые выявлено генетическое разнообразие изученных в работе штаммов бактерий рода Enterococcus, что послужило основой классифицировать организмы, имеющие существенное отличие в нуклеотидных последовательностях генов rrs, как новый вид - Enterococcus lactis (нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК типового штамма нового вида Enterococcus lactis СК1114 депонирована в базе данных NCBI (номер депонированной последовательности AY902459). Штамм депонирован в коллекции ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов (номер депонированного штамма В8713).

Впервые продемонстрировано существование уникальных замен в проксимальной области гена 16S рРНК у штаммов подвида Lactococcus lactis subsp. cremoris, дающее возможность проводить точную молекулярную таксономическую идентификацию культур L. lactis subsp. cremoris и L. lactis subsp. lactis, трудно дифференцируемых с использованием классических микробиологических подходов.

Теоретическая значимость работы

Теоретически обоснована необходимость использования молекулярно-биологических подходов для отбора бактериальных стартерных культур при создании заквасок для биотехнологии, позволяющих гарантировать выпуск качественных и безопасных кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.

Полученные новые данные о таксономическом, генетическом разнообразии и биохимических, технологических, пробиотических и генетических свойствах штаммов бактерий родов Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus расширяют границы фундаментальных знаний о бактериях этих систематических групп и возможностях их использования в различных биотехнологических процессах.

  Практическое значение работы

  Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий родов Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus, дало возможность целенаправленно проводить отбор штаммов, перспективных для использования в биотехнологии, учитывая их генетические характеристики.

Проведена реклассификация (с применением методов молекулярно-генетической идентификации) некоторых производственных культур рода Lactobacillus, применяемых в промышленности РФ в качестве заквасок при изготовлении кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов, что позволяет производителям использовать современные данные об истинном таксономическом положении культур и их генетических характеристиках.

  Показана необходимость проведения исследований с помощью молекулярно-биологических подходов для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Примененное ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса, служит основанием исключения из состава заквасок культур, которые могут быть источником трансмиссивных генов антибиотикорезистентности в микробиоте человека.

Проведенная паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью методики RAPD-PCR и неспецифических праймеров дает возможность защиты правообладателей бактериальных культур от несанкционированного использования штаммов, авторами которых они являются, в аналогичных биотехнологических процессах недобросовестными производителями.

Полученные данные о наличии технологических, производственно - ценных и пробиотических свойств у штаммов Streptococcus thermophilus (способность синтезировать экзополисахариды, витамин и утилизировать галактозу), могут быть критерием отбора  наиболее перспективных культур для применения в качестве заквасок и бактериальных концентратов при изготовления кисломолочных продуктов общего и функционального назначения в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии. Штаммы термофильного молочнокислого стрептококка депонированы в коллекцию молочнокислых культур и бифидобактерий ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Определенные в ходе проведения работы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК некоторых из изучаемых штаммов лактококков, лактобацилл, стрептококков и энтерококков были депонированы в базу данных Nucleotide Sequence Database of National Center for Biotechnology Information (GenBank NCBI) в качестве референтных последовательностей при проведении филогенетических и биоинформатических исследовательских работ (www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/?term=Botina). Номера депонированных последовательностей:  DQ255948, AY902459, AY683836, AY902456, AY902457, AY902458, AY902459, AY902460, AY902461, AY683829, AY683830, AY683831, AY683832, AY683833, AY683834, AY683835, AY683836, DQ255948, DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, EF102815, EF102814, EF114309, EF114308,  EF114307, EF114306, EF114305, EF100778, EF100777, DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, EF102815, EF102814, EF114309, EF114308,  EF114307, EF114306, EF114305, EF100778, EF100777, GU560031, GU560032, GU560033, GU560034, GU560035, GU560036, GU560037, GU560038, GU560039, GU560040, GU560041, GU560042, GU560043.

Внедрение результатов работы

Полученные данные о технологических и производственно-ценных свойствах культур термофильных молочнокислых стрептококков послужили основой для оформления патента на изобретение №2337953, Российская Федерация, МПК C12N1/20, A23C9/12, заявка 2007117139/13 от 08.05.2007, публикация патента 11.10.2008 г., бюллетень № 31. «Штамм бактерий Streptococcus thermophilus для сквашивания молока в процессе приготовления кисломолочных продуктов, включая йогурты».

На основании теоретических и практических результатов были разработаны «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, протокол № 2 от 14.10.2010. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко  6 декабря 2010.

  Современные молекулярно-биологические методики, разработанные в ходе исследования, используются при проведении научных исследований в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Основные результаты работы нашли применение в лекционных курсах по повышению квалификации для практикующих микробиологов молочного производства «Микробиология молока и молочных продуктов», «Методы и организация производственного контроля» и в обучающем процессе при подготовке аспирантов ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При таксономической идентификации  штаммов молочнокислых бактерий, принадлежащих к родам Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus следует опираться на результаты исследований, полученных с помощью применения молекулярно-биологических методов, основанных на анализе последовательности рибосомальных генов.

2. Применение методов геномной рестрикции и PFGE, а так же метода RAPD-PCR дает возможность оценить генетическое разнообразие природных штаммов молочнокислых бактерий и позволяет осуществлять генетическую паспортизацию промышленных штаммов молочнокислых бактерий.

3. Необходимо использовать молекулярно-биологические подходы для изучения устойчивости к антибиотикам производственных штаммов молочнокислых бактерий с целью исключения из состава заквасок культур, которые могут служить источником генов трансмиссивной антибиотикорезистентности в микробиоте человека.

4. Применение в лабораторной практике молекулярно-биологических подходов при видовой идентификации, молекулярно-генетической паспортизации и определения в составе геномов генов, отвечающих за антибиотикорезистентность, позволяет проводить отбор безопасных производственных культур с целью их последующего  использования в составе заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотических препаратов.

Апробация работы

Диссертация апробирована на расширенном заседании Ученого Совета ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности Россельхозакадемии  24 ноября 2010 г., протокол № 8.

Основные результаты работы доложены на Международных и Российских научных конференциях: Вторая Международная Научно-Практическая конференция «Перспективы развития биотехнологий в России» (2005, Пущино), 10-ая школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), Международная научная конференция: «Современное состояние и перспективы развития микро­биологии и биотехнологии» (Минск, 2006), ASM Conference on Streptococcal Genetics, (France, Sain-Malo 2006), Международная конференция «Успехи биотехнологии» (г. Цахкадзор, Республика Армения,  2006), Международная конференция «Микробные биотехнологии» (Одесса,  2006), Российская школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённая 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна (Москва-Пущино, 2006), Международный конгресс по пробиотикам (Санкт-Петербург, 2007), The 3th European Conference on Prokaryotic Genomics, ProkaGENOMICS (2007, Gottingen), Second International Congress of Central Asia Infectious Diseases (Alma Aty, 2008), Пятый съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва,  2009), 13-ая международная Пущинская школа конференция молодых ученых «Биология-наука 21 века» (Пущино, 2009), Юбилейный Пятый Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и  перспективы развития" (Москва, 2009), 11-й международный славяно-балтийский научный форум "Санкт-Петербург – Гастро-2009" (Санкт Петербург, 2009), XXXII International Congress of the Society for Microbial Ecology and Disease (2009, St. Petersburg, Russia), Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», (Ростов на Дону, 2009), Конференция РАСХН-РФФИ. Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России. (Сергиев Посад, 2009), Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике (Москва, 2010).

       Исследования, вошедшие в основу работы, были поддержаны грантами РФФИ,  Грантами Президента Российской Федерации для молодых российский ученых кандидатов наук.

  Публикации. По материалам диссертации опубликована 61 научная работа, из них 29 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 30 - в материалах научных конференций, 1 патент на изобретение, 1 методические указания.

  Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста, включает 22 таблицы, 21 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы включающего 43 отечественных и 323 зарубежных цитируемых источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили 155 штаммов бактерий следующих видов: Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus lactis sp. nov., Lactococcus lactis subsp. cremoris и Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum,  Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

В процессе исследований были использованы классические микробиологические, молекулярно-генетические, аналитические методы и их модификация.

Микробиологические методы исследования. В работе использовались классические микробиологические методы работы с непатогенными бактериальными культурами. Основными средами для культивирования штаммов бактерий служили среда М21 и MRS. При выращивании бактерий на плотных питательных средах применялись анаэростаты и газогенерирующие пакеты  (bioMerieux, Франция), обеспечивающие атмосферу, содержащую 10% СО2. Для изучения морфологических характеристик изучаемых культур готовили препараты, окрашенные по Граму и метиленовым синим, микроскопировали с иммерсией при увеличении 90х15. Биохимическая идентификация проводилась с использованием тест-системы API-50CHL (bioMerieux, Франция), позволяющей оценивать ферментативную активность 50 субстратов и программного обеспечения к ней API WEB, согласно инструкции к набору. Способность культур сквашивать молоко оценивали, используя лакмусовое молоко фирмы “Difco”. Способность бактерий расщеплять эскулин определяли с применением среды следующего состава: казеиновый пептон - 0,5%, мясной экстракт - 0,3%, цитрат железа – 0,05%, эскулин – 0,1%, агар – 1,5%, рН 6,6. Для исследования антибиотикочувствительности был применен диско-диффузный метод на основе методических рекомендации по определению чувствительности  микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04). Способность штаммов синтезировать экзополисахариды оценивалась при росте бактерий на среде следующего состава: сухое молоко с пониженным содержанием жира - 10% (или цельное обезжиренное молоко в качестве основы среды), дрожжевой экстракт - 0,5%, агар – 1,5%, сахароза - 1%, рутениевый красный – 80 мг/л. Кислотообразующая активность штаммов оценивалась по снижению рН молока, сквашенного соответствующим бактериальным штаммом. Бактерии инкубировали в цельном стерильном молоке с пониженным содержанием жира (0,5%) без внесения дополнительных компонентов в термостате при оптимальной для вида температуре инкубации в течение 3, 6, 8, 168 ч. Измерение рН проводилось при помощи электронного рН-метра “Mettler Toledo MP220”. Титруемую кислотность определяли по ГОСТ 3624-92 “Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности”.

Молекулярно-биологические методы исследования: генетические методы, используемые в работе (выделение плазмидной ДНК из микроорганизмов, выделение хромосомной ДНК, электрофорез ДНК, рестрикция ДНК и др.) являются модификацией известных методов (Маниатис Т., 1984). Получение препаратов плазмидной ДНК из молочнокислых бактерий проводили согласно методике (Anderson, McKay, 1983). Компьютерный анализ подбора праймеров проводили с применением компьютерных программ: NSBI Blast2 – определение гомологии при изучении сиквенсов с соответствующих праймеров, Oligo 6.31 – основной расчет характеристик ПЦР, возможности образования праймерами дуплексов и вторичных структур, определение мест неспецифического праймирования на матрице, Oligonucleotide Properties Calculator – определение температуры отжига праймеров и % GC состава. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её модификации (видоспецифическая, штаммоспецифическая, RAPD-PCR) проводилась по стандартным или модифицированным методикам. Для постановки ПЦР использовали реактивы фирмы “Fermentas”, праймеры, специально подобранных нами и синтезированные фирмой “Синтол”, амплификатор фирмы “Perkin Elmer”. Выделение и очистку ДНК из арагозного геля проводили с использованием набора для очистки амплифицированной ДНК фирмы “Sigma”, согласно рекомендациям фирмы-производителя. Секвенирование фрагментов генов осуществляли по методу Сэнгера (Senger et al., 1977) на автоматическом анализаторе ДНК ABI PRISMTM фирмы “Applied Biosystems”, с набором реактивов “ABI Prism BygDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” фирмы “Applied Biosystems”. Пульс-гель электрофорез геномной ДНК проводили в 1% агарозном геле, приготовленном на агарозе “Sigma”, тип А при напряженности поля 6 В/см в 0,5 % буфере TBE при 14оС в аппарате CHEF-DRIII фирмы “BioRad”, с режимом постепенного изменения времени пульса с 5 до 15 сек в течение 24 ч. Изображение гелей получали при помощи цифрового фотоаппарата “Casio QV-3500 EX”, изображения сохранялись в виде графических файлов с расширением .TIFF и экспортировались в программу для обработки гелей. Геномный анализ проводился по полным последовательностям геномов бактерий, доступных в GenBank, на основе гомологии к нуклеотидным последовательностям интересующих генов у молочнокислых бактерий с помощью программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Филогенетический анализ. Для анализа полученных последовательностей генов применяли программу Blast в Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Результаты  секвенирования анализировались с использованием компьютерной программы Vector NTI: ContigExpress. Множественное выравнивание последовательностей проводились в программе ClustalX (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html), филогенетический анализ, расчет генетических дистанций, построение дендрограмм - в программе Mega4.0 в Internet (http://www.megasoftware.net). Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом PFGE и анализ фореграмм, полученных методом RAPD-PCR, построение филогенетических дендрограмм осуществлялись с применением компьютерного обеспечения BioNumerics (версия 4.0; Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Для анализа рестриктограмм проводилось вычисление подобия геномных фингерпринтов согласно алгоритму Дисе (Dice) и по методу корреляции Пирсона (с учетом коэффициента корреляции для континуальных переменных). Для построения дендрограмм использовали матрицу подобия, полученную согласно алгоритму последовательной кластеризации. Для вычисления статистической значимости были применены два основных инструмента программы: метод выключения кластеров (cluster cut-off method) и кофенетическая корреляция (cophenetic correlation). Подсчет величин фрагментов рестрикции осуществлялся в  программе BioNumerics.

  Аналитические методы исследования. Определение синтезируемых веществ проводили методом ВЭЖХ на хроматографе “Alliance” (Separations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996).

Статистическую обработку результатов экспериментов осуществляли по стандартным программам и общепринятым алгоритмам с применением регрессионного анализа и оптимизации.

Экспериментальные результаты работы получены автором лично и совместно с коллегами из лаборатории генетики микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов, Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, кафедр микробиологии и генетики МГУ им. М.В. Ломоносова, Национального института сельскохозяйственных исследований  Франции  (INRA), лаборатории генетики микроорганизмов отдела генетических основ биотехнологии Института общей генетики РАН, ФГУН Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, центральной лаборатории микробиологии ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии, а также с сотрудниками, работавшими под руководством диссертанта.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

  1. Применение молекулярно-биологических подходов для видовой идентификации молочнокислых бактерий

1.1. Сравнение генотипических и биохимических характеристик штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов

Термофильные молочнокислые стрептококки (Streptococcus thermophilus) - немногочисленные представители «полезных» бактерий этого рода, с точки зрения их широкого применения при изготовлении кисломолочных продуктов. В связи с тем, что в России продолжается поиск конкурентоспособных стартовых культур для пищевой промышленности, актуальными являются исследования, направленные на детализацию биологических, генотипических и производственно-ценных характеристик штаммов S. thermophilus, использующихся в качестве заквасок при промышленном производстве йогурта, ряженки, простокваши и некоторых видов сыров. Целью данного раздела работы являлось изучение фенотипических и генотипических характеристик 72 штаммов S. thermophilus, выделенных из различных кисломолочных продуктов домашнего приготовления (йогурт, сметана, сыры, простокваша, творог, кислое молоко), изготовленных в разных географических регионах мира (России, странах СНГ, Италии, Хорватии, Словении, Франции). Для этого была проведена работа по изучению сахаролитических свойств у всех штаммов из собранной нами коллекции бактерий, и определена последовательность гена 16S рРНК в проксимальном участке гена протяженностью 500 пар нуклеотидов. Сравнительный анализ фрагмента гена 16S рРНК, у собранных нами штаммов позволил обнаружить гомологию этого фрагмента с нуклеотидными последовательностями у типового представителя этого вида АТСС 19258, а также с другими последовательностями, характерными для бактерий вида S. thermophilus (AB161183, AB200871, DQ295043, AY730718, AY687382, AY687383, DQ176426), депонированными в NCBI, и с последовательностью AY683829, депонированной ранее нами (рисунок 1), на уровне 100%.

Результаты проведенного исследования показали, что большинство изученных культур обладают способностью утилизировать только три сахара: лактозу, сахарозу и глюкозу. В то же время, некоторые из исследуемых штаммов оказались неспособными утилизировать фруктозу или сахарозу, и были обнаружены штаммы, способные ферментировать галактозу, целлобиозу, тагатозу, рибозу, раффинозу, мальтозу. Эти данные подтвердили известное явление гетерогенности сахаролитической активности у представителей термофильного стрептококка и демонстрируют сложность интерпретации результатов биохимических показателей при идентификации бактерий S. thermophilus с использованием классических микробиологических методов или коммерческих тест-систем, основанных на способности исследуемых штаммов ферментировать сахара. Такие штаммы можно отнести к «нетипичным», и их легко перепутать с другими молочнокислыми бактериями. С другой стороны, разнообразие в биохимических параметрах метаболизма штаммов S. thermophilus дает большой потенциал для использования бактерий этого вида в качестве объекта исследования в научных целях, а также в производственных биотехнологических процессах, основанных на ферментации нетрадиционных углеводов штаммами данного вида.

 

Рисунок 1. Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов S. thermophilus, основанная на сходстве нуклеотидных последовательностей проксимального участка гена 16S рРНК, протяжённостью в 500 нуклеотидов.

1.2. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы salivarius рода Streptococcus

Метод сравнения последовательностей генов 16S рРНК часто используется для определения видовой принадлежности микрофлоры, присутствующей в молочных продуктах. Целью данного раздела работы являлось исследование строения генов 16S рРНК у представителей различных видов стрептококков для выявления внутриродовых различий в последовательностях этого гена и возможности использования полученных результатов при молекулярной идентификации близкородственных видов рода Streptococcus.

Для проведения филогенетического анализа нами были исследованы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК у 10 типовых штаммов из группы viridans рода Streptococcus. Особенно детально было изучено разнообразие строения генов 16S рРНК у представителей трёх видов стрептококков, принадлежащих группе salivarius: Streptococcus thermophilus, Streptococcus salivarius, Streptococcus vestibularis. Основываясь на анализе последовательностей гена 16S рРНК, все исследованные стрептококки нами были распределены на кластеры, соответствующие трём филогенетическим группам: salivarius (в которую вошли типовые штаммы S. thermophilus, S. salivarius, S. vestibularis), bovis (штаммы S. macedonicus, S. bovis, S. equinus) и mitis (штаммы S. mitis, S. gordonii, S. oralis,  S. sanguinis) (рис. 2).

Рисунок 2. Филогенетическое дерево, построенное с использованием bootstrap-анализа по результатам сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК десяти видов - представителей группы viridans рода Streptоcoccus

На основании данных о строении гена 16S рРНК гомология нуклеотидных последовательностей между типовыми представителями видов S. thermophilus и S. salivarius по нашим данным составляет 99.8%, в отношении же ещё одного представителя группы salivarius - вида S. vestibularis гомология со S. thermophilus составляет 99.6%. Столь высокие уровни гомологии гена 16S рРНК у разных видов внутри группы salivarius объяснимы наличием всего 4 нуклеотидных замен (из 1540 п.н.) между последовательностями генов типовых представителей видов S. thermophilus и S. salivarius, а также 6 замен и 1 мононуклеотидной делеции в последовательностях этого гена видов S. thermophilus и S. vestibularis (таблица 1).

Таблица 1. Позиции варьирующих нуклеотидов у представителей группы salivarius рода Streptococcus (по результатам анализа полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, представленных в базе данных NCBI). *

Позиция\ Последовательность

193

195

277

468

513

1290

1494

S. thermophilus

AY188354

G

A

T

G

A

G

C

S. vestibularis

AY188353

A

G

C

A

-

A

T

S. salivarius

AY188352 

G

A

C

A

A

A

T

*Примечание: 193 нуклеотид в последовательности гена 16S рРНК представителей рода Streptococcus соответствует 188 нуклеотиду малой субъединицы рРНК E. coli штамма АТСС 25922 (номер последовательности DQ360844).

Три близкородственных вида, рассмотренные нами как представители группы salivarius, имеют разное происхождение. Так, штаммы S. thermophilus нередко выделяются из кисломолочных продуктов; представители этого вида рассматриваются как стартовые культуры при изготовлении заквасок. Местом обитания бактерий вида S. salivarius является ротовая полость животных и человека; его представители могут быть этиологическим фактором заболеваний зубов. Источником выделения бактерий вида S. vestibularis также является ротовая полость человека, однако они не ассоциированы с каким либо инфекционным процессом. Исходя из полученных данных о филогенетическом родстве стрептококков группы salivarius, отметим, что определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК может быть рекомендовано в качестве быстрого и достоверного приема при дифференциации близкородственных видов этих бактерий.

1.3. Молекулярно-генетическая идентификация подвидов Lactococcus lactis

Молочнокислые лактококки (Lactococcus lactis) широко применяются в молочной промышленности при изготовлении творога, сметаны и некоторых видов сыров. Фенотипически штаммы L. lactis subsp. lactis и L. lactis subsp. cremoris различают по способности расти в присутствии 4% NaCl и при температуре 40°C, а также гидролизировать аргинин. Однако, как отмечают многие авторы (это подтверждено и в наших исследованиях), в некоторых случаях, фенотипическая характеристика представителей подвидов L. lactis не коррелирует с генотипической классификацией. Это позволяет придти к заключению, что фенотипическая характеристика штамма уже не является достаточной для установления таксономического положения изучаемого организма. В случае, когда при идентификации традиционными микробиологическими методами организмы трудноотличимы, применение генотипических методов при установлении таксономического положения бактерий, используемых в пищевой промышленности, следует рассматривать как обязательную процедуру.

  Нами был проведен филогенетический анализ полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК у штаммов, принадлежащих подвидам Lactococcus lactis, депонированных в базе данных NCBI, для рассмотрения возможности применения этого метода для точной идентификации представителей L. lactis subsp. lactis и L. lactis subsp. cremoris.

Результаты филогенетического анализа последовательностей гена 16S рРНК у изучаемых штаммов представлены на филогенетическом дереве (рис. 3) построенном в программе Mega4, с использованием Neighbor-Joining кластерного метода расчёта генетических расстояний и bootstrap анализа, отражающего достоверность кластеризации. Как видно из представленных данных, по характеру последовательностей штаммы можно распределить в 2 кластера, один из которых составляют культуры Lactococcus lactis subsp. сremoris, полные нуклеотидные последовательности которых характеризуются 100% сходством. Второй кластер включает штаммы подвидов Lactococcus lactis subsp. lactis и Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis, сходство последовательностей гена 16S рРНК у которых колеблется у отдельных штаммов от 100 до 99,3%.

Рисунок 3. Филогенетическое дерево, построенное на основании сходства полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК подвидов Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris и Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis.

  На рисунке 4 представлены участки нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК у изученных штаммов Lactococcus lactis subsp. сremoris, содержащие 10 нуклеотидных замен, позволяющих точно различать их от представителей близкородственного подвида Lactococcus lactis subsp. lactis.

.

 

Рисунок 4. Участки нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК подвидов Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris и Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis, содержащие нуклеотидные замены.

  Эти замены располагаются в проксимальной части гена от 63 до 181 позиции (нумерация дана по последовательности AM088020). Таким образом, даже имея возможность секвенирования первых 200 нуклеотидов гена 16S рРНК у штамма со спорным таксономическим положением внутри вида Lactococcus lactis, можно точно установить его принадлежность к подвиду lactis или сremoris. Последовательности генов 16S рРНК, свойственных бактериям Lactococcus lactis subsp. lactis и Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis идентичны; поэтому дифференциацию бактерий варианта diacetylactis, следует производить путем биохимического исследования способности бактерий Lactococcus lactis subsp. lactis продуцировать диацетил. Таким образом, проведенные нами исследования позволили продемонстрировать существование уникальных замен в проксимальной области гена 16S рРНК у представителей подвида cremoris, позволяющие проводить точную дифференциацию культур L. lactis subsp. cremoris и L. lactis subsp. lactis.

1.4Реклассификация таксономической принадлежности некоторых отечественных пробиотических штаммов лактобацилл

  Лактобациллы – важный биотехнологический объект, поскольку они широко применяются в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания (йогурт, простокваша, ряженка и сыры); некоторые штаммы лактобацилл (обладающие пробиотическими свойствами) используются в составе лекарственных препаратов, БАД, продуктов функционального питания для человека и кормовых добавок для животных.

Для уточнения систематического положения с использованием комплекса микробиологических и молекулярно-биологических методик нами было проведено уточнение таксономической принадлежности производственных штаммов лактобацилл, на протяжении нескольких десятилетий используемых в РФ в качестве заквасок в различных биотехнологических процессах.

  Филогенетический анализ данных о строении генов 16S рРНК у производственных и референтных штаммов приведен на рисунке 5. Полученные результаты позволили провести молекулярно-генетическую идентификацию родовой и видовой принадлежности всех исследованных культур. Исключение представляют штаммы, относящиеся к группе L. casei-paracasei. Анализ литературы свидетельствует, что установить видовую принадлежность на основе сравнения 16S РНК невозможно из-за её 100%-го сходства у представителей этой группы (Acedo-Felix E. and Perez-Martinez G., 2003). Отечественные производственные штаммы лактобацилл по результатам нашего анализа последовательностей их генов 16S рРНК были разделены на 2 группы. В первую группу вошли штаммы L. casei ГКНМ 577, L. plantarum 8-РА-3, L. plantarum CS 396, видовая принадлежность которых соответствует их исходным паспортным данным, составленным на основании традиционных микробиологических методов исследования. Ко второй группе отнесены штаммы L. аcidophilus (NK-1, Er317/402 НАРИНЭ, К3Ш24, 100 аш, NNIE), L. brevis ГКНМ 23, L. delbrueckii (ГКНМ 101, ГКНМ 526), L. fermentum 90-ТС-4 и L. plantarum 421-2, у которых последовательность гена 16S рРНК не соответствует видовому положению, указанному в паспортных данных. Сравнение нуклеотидной последовательностей генов 16S рРНК производственных штаммов с таковой международных баз данных позволило установить, что штаммы NK-1, Er317/402 НАРИНЭ, 100 аш, NNIE, идентифицированные ранее, как L. аcidophillus, на самом деле относятся к L. helveticus, штаммы L. brevis ГКНМ 23 и L. acidophillus К3Ш24 – к группе L. casei/paracasei,  штаммы L. delbrueckii ГКНМ 101 и fermentum 90-ТС-4 – к L. plantarum, штамм L. delbrueckii ГКНМ 526 – к L. fermentum, а штаммы L. plantarum 421-2 – к L. rhamnosus.

Номера, последовательностей генов 16S рРНК, реклассифицированных нами штаммов лактобацилл, в базе данных NCBI: GU560031, GU560032, GU560033, GU560034, GU560035, GU560036, GU560037, GU560038, GU560039, GU560040, GU560041, GU560042, GU560043

Рисунок 5. Филогенетическое дерево, построенное на основании анализа последовательности генов 16S рРНК исследуемых и референтных штаммов лактобацилл.

  1. Изучение генетического разнообразия бактерий рода Enterococcus, выделенных из кисломолочных продуктов

Стабильность оперонов рРНК (rrn), обычно присутствующих в клетках бактерий в виде множественных копий (Klappenbach J.A., et al., 2001), зависит от генетического взаимодействия между ними по механизму генной конверсии, что приводит к гомогенизации rrn оперонов и содержащихся в них генов 16S (rrs) и 23S (rrl) рРНК (Liao D., 2000). Рекомбинационный механизм генной конверсии состоит в особом разрешении структур Холлидея, которое приводит к односторонней передаче генетической информации в виде относительно коротких (содержащих до нескольких сот нуклеотидов) фрагментов однонитевой ДНК от одного rrn оперона к другому  (Liao D., 2000, Betran E., et al., 1997). Однако важно отметить, что полной гомогенизации rnn оперонов в клетках бактерий не происходит: некоторые rrn опероны сохраняют определенные отличия в генах rrs и rrl. Тем не менее, высокий уровень сходства (>99 %) между множественными rrn оперонами одной клетки позволяет определять последовательность генов 16S рРНК, используя суммарную ДНК штамма бактерий. Именно такие данные о нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК в разных штаммах бактерий представлены в базе данных GenBank.

  В нашей работе было показано, что штаммы E. durans и E. faecium, выделенные из кисломолочных продуктов, имеют некоторые отличия в нуклеотидных последовательностях генов rrs по сравнению со штаммами этих видов энтерококков, представленными в базе данных GenBank. Помимо этого, среди энтерококков, используемых в качестве заквасок, была обнаружена группа штаммов (рис. 6), имевших существенное отличие в последовательностях генов rrs. В проксимальной области генов rrs эти штаммы несли конфигурацию нуклеотидных замен, характерную для вида E. durans, а в дистальной части – для E. faecium. Образование данной группы штаммов (СК1026, СК1114, СК1025) могло быть следствием образования особого вида бактерий  (E. lactis sp. nov.), использующего в качестве основной среды обитания молоко.

Рисунок 6. Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов различных видов энтерококков, построенная исходя из степени гомологии нуклеотидных последовательностей генов rrs.

Вывод о возможной принадлежности группы штаммов к предположительно новому виду подтверждается данными исследований, в которых, в частности, проведено сравнение полных нуклеотидных последовательностей генов rrs  предположительно нового вида и родственного вида E. hirae. Исходя из полученных данных, можно предположить, что отличия в гомологии различных оперонов рРНК отражают изменения структуры геномов в процессах видообразования у бактерий.

Как следует из дедрограммы, представленной  на рис. 6, группа штаммов СК1025, СК1026 и СК1114, предположительно относящихся к отдельному виду E. lactis,  попала в одну ветвь дерева с E. faecium. Степень гомологии между этими штаммами очень высокая – 99.7-99.9%, причем особенно высокий уровень гомологии по отношению к виду E. lactis, т.е. штаммам СК1025, СК1026 и СК1114, обнаружил штамм E. faecium  (номер депонированной последовательности в NCBI - AY675247). Но этот штамм, выделенный из пищевого продукта, обнаруживает существенное сходство с E. lactis в наборах варьирующих нуклеотидов (рисунки 6 и 7) и, вероятно, должен быть отнесен к данному виду. Здесь важно обратить внимание на то, что разные виды энтерококков отличаются наличием в генах rrs определенных устойчивых комбинаций варьирующих нуклеотидов (рис. 7).

Рисунок 7. Позиции общих варьирующих нуклеотидов в генах rrs у родственных видов энтерококков.

Примечание: Номера позиций соответствуют последовательности, приближенной к гену 16S рРНК E. coli. Подчеркнуты комбинации нуклеотидов –  предположительные продукты конверсионного переноса фрагментов ДНК между генами rrs. В нижней части  рисунка представлены позиции соответствующих нуклеотидов у штамма молочнокислых энтерококков СК1106  E. durans, штамма AY675247  и у  E.  mundtii. Такую же последовательность нуклеотидов, как у СК1106, имеют  штаммы СК1107 и СК1116. Варьирующие нуклеотиды,  характерные для  E. mundtii, не показаны. Y = C или T.

Такие комбинации из близко расположенных друг к другу нуклеотидных замен принято рассматривать в качестве продуктов однонаправленных генных конверсий, ответственных за гомогенизацию  множественных оперонов rrn (Cilia V., et al., 1996, Hashimoto J.G., et al., 2003). Как показано на рис. 7, виды  E. durans и E. faecium отличаются друг от друга наличием определенных комбинаций близлежащих нуклеотидных замен, как в проксимальной, так и в дистальной областях генов rrs.  Так, у штаммов E. durans в проксимальной и дистальной областях генов rrs имеются наборы нуклеотидов Т-А и С-Т-А, соответственно, тогда как у штаммов E. faecium в этих позициях обнаруживаются другие наборы: A-G и T-C-G. Исключение составил упомянутый выше штамм E. faecium  AY675247, который имел наборы варьирующих нуклеотидов, характерные для предположительно нового вида E. lactis. Такого же типа отличия имеются между E. hirae и новым видом E. lactis. Интересно, что E. hirae имеет в проксимальной области (позиции 54-98) комбинацию нуклеотидов свойственную E. faecium, а в дистальной области генов (позиции 1268-1321-1338)  –  комбинацию, свойственную E. durans. E. lactis, напротив, имеет в проксимальной области комбинацию нуклеотидов, свойственную E. durans, а в дистальной области генов rrs  – комбинацию, свойственную E. faecium, рис. 7.  Следует отметить также тот факт, что штаммы E. mundtii имели в указанных позициях такие же наборы нуклеотидов как E. hirae, но E. mundtii,  как более далеко отстоящий вид, имел особые специфические наборы варьирующих нуклеотидов, которые на рис. 7 не показаны.

На основании полученных данных, делается предположение, что образование нового вида у бактерий может быть следствием такого преобразования генов рРНК, которое приводит к появлению качественно измененной динамической структуры генома, способного к видоизменению в результате генетических рекомбинаций между rrn оперонами. В геноме бактерий E. faecium имеется 6 rrn оперонов (Oana K., et al., 2002) и, возможно, они также как rrn опероны E. coli образуют некоторую динамическую систему, в которой отдельные опероны (и гены rrs в них) могут отличаться по гомологии и по этой причине иметь разную вероятность вступления в генетическое взаимодействие друг с другом. Мы предполагаем, что в процессе образования новых видов у бактерий должно происходить формирование новой динамической системы как особой системы взаимодействия между rrn оперонами. Формирование новой системы взаимодействия между rrn оперонами может инициироваться стечением случайных событий в процессах генной конверсии, приводящих к появлению негомологичных комбинаций отдельных нуклеотидов в прежде полностью гомологичных rrn оперонах и в генах rrs, в частности. В таких случаях последующий естественный отбор, ведущий новый вид (в соответствии с адаптационной моделью Фишера (Fisher R.A., 1958)) к вершине приспособленности, произведет постепенное «отлаживание» уровня гомологии между различными rrn оперонами, требуемого в контексте достижения максимально возможного уровня приспособленности. Таким образом, фиксация  новой  комбинации нуклеотидов в генах rrs создает базу для формирования новой динамической системы бактериального генома, т.е. нового вида.

  1. Изучение генетического разнообразия и анализ размеров геномов штаммов Streptococcus thermophilus

  Генетическое разнообразие в рамках вида выражается в различиях на физиологическом уровне и в строении генома у отдаленных групп из разных экологических ниш. Изучение этих различий имеет значение для характеристики вида как таксона. В связи с этим представляет интерес сравнение как фенотипических, так и генотипических свойств сформировавшихся в разных природных условиях групп микроорганизмов вида Streptococcus thermophilus, культуры которого широко используются в составе заквасок при промышленном и домашнем изготовлении кисломолочных продуктов. Поэтому актуальным является использование различных методов ДНК-типирования для разграничения культур бактерий на уровне штамма и изучения внутривидового разнообразия бактерий Streptococcus thermophilus.

Метод сравнения фингерпринтов, полученных при рестрикции геномной ДНК широко используется, прежде всего, для паспортизации культур бактерий одного вида, что в условиях продолжительного исследования коллекции штаммов, не имеющих генетических маркеров, является необходимым. Для штаммов термофильных стрептококков анализ фрагментов ДНК, полученных при использовании эндонуклеазы рестрикции SmaI, позволяет оценивать сходство геномов по числу общих (идентичных по величине) фрагментов рестрикции в составе полученных паттернов и оценить генетическое разнообразие культур по величине их геномов.

  Рестриктограммы хромосомной ДНК изучаемых нами штаммов, полученные при помощи эндонуклеазы рестрикции SmaI и результаты сравнительного анализа профилей рестрикции представлены в виде филогенетического дерева со схематичным изображением фрагментов геномной рестрикции изучаемых штаммов на рисунке 8. Как видно из приведенных результатов, фингерпринты разных штаммов сильно отличаются друг от друга. Штаммы исследованной нами коллекции характеризовались большим разнообразием в наборе рестрикционных фрагментов геномной ДНК, хотя для многих из них показано наличие близких или практически одинаковых по величине фрагментов.

Генетическая организация бактерий термофильных стрептококков имеет ряд особенностей. Прежде всего, представители вида Streptococcus thermophilus отличаются от других молочнокислых бактерий относительно небольшим размером генома. Например, для разных видов стрептококков величина хромосомы варьирует в следующих пределах: S. mutans – 2030-2200 т.п.н., S. agalactiae – 2200 т.п.н., S. waius – 2150-2250 т.п.н., S. macedonicus – 2150-2250 т.п.н. Геном S. thermophilus самый маленький и составляет по разным данным от 1500 до 1824 т.п.н. Размер генома исследованных нами штаммов сильно варьирует и составляет значения от 1417 до 2075 т.п.н., что говорит о значительной внутривидовой дивергенции геномов изучаемых нами штаммов. Таким образом, исходя из полученных нами данных размер геномов изученных нами штаммов S. thermophilus варьирует в пределах до 30%, что говорит о внутривидовом генетическом полиморфизме бактерий данного вида.

В настоящее время доказано, что в эволюции бактерий генетический обмен играет такую же важную роль, как и в эволюции высших организмов. Наиболее убедительные данные в пользу такого заключения были получены при помощи метода "геномного вычитания", основанного на гибридизации ДНК разных штаммов одного вида: было показано, что разные штаммы в рамках вида могут отличаться по содержанию чужеродной ДНК, полученной в результате горизонтального переноса генов. Чужеродная ДНК, происходящая от других видов бактерий, может составлять до 30% размера генома бактерий. Таким образом, благодаря горизонтальному переносу генов между разными видами геном бактерий, помимо несущественных генов, имеющих адаптивное значение, может содержать также чужеродные гены, несвойственные данному виду.

Рисунок 8.  Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов S. thermophilus,  основанная на результатах сравнительного анализа фингерпринтов, полученных методом геномной рестрикции с использованием эндонуклеазы SmaI и пульс-гель электрофореза (согласно корреляции Дисе).

  Примечание: Ветви дендрограммы, уровень подобия которых менее значения воспроизводимости (в данном случае значение составляет 70%), считаются разными кластерами, и обозначены прерывистой линией. Ветви дендрограммы, уровень подобия которых превышает значение воспроизводимости, обозначены сплошной линией. Для каждой ветви представлены значения кофенетической корреляции. Справа от фингепринтов располагаются названия штаммов, а сверху – шкала величин фрагментов, выраженная в т.п.н.

Следует отметить, что метод геномной рестрикции может быть использован для молекулярного типирования штаммов, ненесущих генетических маркеров, однако он не может быть рекомендован для оценки видовой принадлежности и степени филогенетического родства штаммов, таксономически удаленных видов. Полученные индивидуальные паттерны промышленных штаммов микроорганизмов могут быть использованы для паспортизации культур в решении вопроса об авторстве производственно-ценных штаммов молочнокислых бактерий.

  1. Генетическое разнообразие природных и промышленных штаммов молочнокислых бактерий

4.1. Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus. Генетическая паспортизация бактериальных культур методом RAPD-PCR

Было проведено изучение внутривидовых различий штаммов вида S. thermophilus методом RAPD-PCR. Метод анализа полиморфизма амплифицированных фрагментов  (randomly amplified polymorphic DNA или RAPD-PCR) с применением случайных праймеров) используется для дифференциации генетически не маркированных штаммов молочнокислых бактерий. Он основан на использовании коротких праймеров, которые достаточно эффективно гибридизуются с хромосомной ДНК. Число и расположение сайтов связывания таких неспецифических праймеров различаются среди бактерий разных видов и штаммов. При разделении RAPD-PCR-фрагментов на электрофорезе получаются паттерны, которые служат «дактилоскопическими» характеристиками определенных штаммов. Метод RAPD-PCR является быстрым методом идентификации и паспортизации природных изолятов бактерий, для микробиологического анализа (контроля качества продуктов) и мониторинга культур молочнокислых бактерий, входящих в состав производственных заквасок, а также таксономического и генотипического анализа штаммов бактерий на уровне рода (вида) и на штаммовом уровне.

  Дендрограммы, полученные с использованием программы BioNumerics для анализа экспериментов, построенные на основании данных RAPD-PCR с использованием различных праймеров различаются (рис. 9, 10). Это связано с тем, что праймеры подобраны для разных участков генома, что не дает возможности построения совокупного филогенетического дерева. Сопоставление результатов RAPD-PCR с использованием нескольких вариантов праймеров, подобранных таким образом, чтобы затронуть как консервативные области генома бактерий, так и более вариабельные участки, позволяет получить представление о внутривидовом разнообразии S. thermophilus.

 

Рисунок 9 (а). Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов S. thermophilus,  основанная на результатах сравнительного анализа фингерпринтов, полученных посредством метода RAPD-PCR с использованием праймера M13, согласно корреляции Пирсона.

Примечание. Справа от фингепринтов располагаются названия штаммов, сверху – шкала величин фрагментов, выраженная в т.п.н.

Рисунок 9 (b). Трехмерное изображение дендрограммы  взаимоотношений штаммов S. thermophilus на основе сравнения фингерпринтов, полученных посредством анализа RAPD-PCR с использованием праймера M13, согласно корреляции Пирсона.

 

Рисунок 10 (а). Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов S. thermophilus,  основанная на результатах сравнительного анализа фингерпринтов, полученных посредством метода RAPD-PCR с использованием праймера ERIC-1, согласно корреляции Пирсона.

Рисунок 10 (b). Трехмерное изображение дендрограммы взаимоотношений штаммов S. thermophilus на основе сравнения фингерпринтов, полученных посредством анализа RAPD-PCR с использованием праймера ERIC-1, согласно корреляции Пирсона.

При использовании метода RAPD-PCR и сравнительном анализе подобия ПЦР-фингерпринтов нами были получены данные о внутривидовом разнообразии природных изолятов Streptococcus thermophilus. На основании полученных данных мы пришли к заключению, что использование метода RAPD-PCR с применением праймера ERIC-1 более предпочтительно для видовой идентификации бактерий вида Streptococcus thermophilus, а при использовании праймера М13 - для паспортизации природных изолятов бактерий этого вида на уровне штамма (рис. 9, 10).

4.2. Генетическое разнообразие и генетическая паспортизация производственных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus

  Генетическое типирование штаммов лактобацилл проводили с помощью анализа полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК (RAPD-PCR) с тремя вариантами праймеров (M13, MSP, ERIC-1). Показано, что применение этой методики с использованием праймера ERIC-1 дает наиболее достоверные и воспроизводимые результаты по сравнению с использованием праймеров М13 и MSP и позволяет проводить идентификацию на видовом и паспортизацию на штаммовом уровне у лактобацилл, используемых для биотехнологических целей (рис. 11-13).

При использовании праймеров M13 и MSP образовывалось большое количество фрагментов, размер которых варьировал от 200 до 5000-6000 п.н.; основная зона разделения фрагментов находилась в пределах 400-2500 п.н. (рис. 11 и 12). При этом идентификация значительной части фрагментов, полученных с обоими указанными праймерами, была затруднена из-за присутствия неспецифических продуктов реакции. При использовании праймера ERIC-1 количество ПЦР-фрагментов для всех штаммов, как правило, не превышало 10, и основная зона разделения фрагментов находилась в пределах 400-2000 п.н. (рис. 13). Также следует отметить хорошую воспроизводимость результатов. Таким образом, на основании проведенных исследований нами показано, что для идентификации культур лактобацилл на штаммовом уровне наиболее удобным является использование праймера ERIC-1, который в отношении исследуемых видов латобацилл можно рассматривать как инструмент для идентификации на видовом и паспортизации на штаммовом уровне. Но использование его одного не дало бы полной картины генетического разнообразия культур в пределах одного вида, поскольку не редко в результате эксперимента на электрофореграммах разных штаммов с использованием этого праймера (рис. 11, 12 и 13) присутствуют одинаковые наборы РАПД-фрагментов (например дорожки 1, 2, 4 и 5 на рис. 13), что не подтверждается данными об идентичности культур при использовании других праймеров в данной работе (например дорожки 1, 2, 4 и 5 на рис. 11 и 12).

Рисунок 11. Электрофореграммы RAPD - фрагментов изучаемых и типовых штаммов, полученных с использованием праймера М13. Слева указаны размеры фрагментов маркера ДНК.

Примечание: Последовательность расположения штаммов на рисунке 12 аналогична последовательности расположения штаммов на рисунке 14.

Рисунок 12. Электрофореграммы RAPD - фрагментов изучаемых и типовых штаммов, полученных с использованием праймера MSP.

Примечание: Слева указаны размеры фрагментов маркера ДНК. Последовательность расположения штаммов на рисунке 13 аналогична последовательности расположения штаммов на рисунке 14.

Рисунок 13. Электрофореграммы RAPD - фрагментов изучаемых и типовых штаммов, полученных с использованием праймера ERIC-1. Примечание: Слева указаны размеры фрагментов маркера ДНК.

1 - L. plantarum  АТCC 8014, 2 - L. plantarum 90-ТС-4, 3 - L. plantarum ГКНМ 101, 4 - L. plantarum 8-РА-3, 5 - L. plantarum CS 396, 6 - L. brevis  DSM 20054, 7 - L. fermentum  DSM 20052, 8 - L. fermentum ГКНМ 526, 9 - L. rhamnosus 421-2, 10 - L. buchneri  DSM 20057, 11 - L. casei/paracasei  DSM 20011, 12 - L. casei/paracasei ГКНМ 23, 13 - L. casei/paracasei ГКНМ 577, 14 - L. casei/paracasei К3Ш24, 15 - L. delbrueckii  DSM 20072, 16 - L. helveticus NK-1, 17 - L. helveticus Er 317/402, 18 - L. helveticus 100аш, 19 - L. helveticus NNIE.

5. Устойчивость к антибиотикам пробиотических лактобацилл

5.1. Характеристика устойчивости к антибиотикам пробиотических бактерий рода Lactobacillus

  Известно, что представители симбионтной микробиоты (лактобациллы и бифидобактерии) могут выступать в качестве резервуара генов антибиотикорезистинтности, которые способны передаваться патогенным и условно патогенным бактериям в пищеварительном тракте человека. Изучение распространения генов антибиотикорезистентности у молочнокислых бактерий помогает лучшему пониманию роли молочнокислых бактерий в передаче признаков антибиотикорезистентности и решению проблемы биологической безопасности стартовых и пробиотических культур молочнокислых бактерий. В этой связи становится понятным необходимость определения у потенциальных пробиотических штаммов не только наличия признака устойчивости к антибиотикам, но и их тестирование на предмет обнаружения генов антибиотикорезистентности и возможности передачи этих генов другим представителям кишечной микробиоты.

  13 штаммов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus (4 штамма L. plantarum, 4 штамма L. helveticus, 3 штамма L. casei, по одному штамму L. rhamnosus и L. fermentum), использующихся в качестве стартовых культур при производстве пробиотических препаратов на территории РФ, были исследованы на устойчивость к 15 антибиотикам, принадлежащим к пенициллинам, аминогликозидам, макролидам, линкозаминам, тетрациклину, хлорамфениколу и рифампицину. Все исследованные культуры проявили относительную чувствительность к ампициллину, хлорамфениколу, рифампицину, рокситромицину, эритромицину и азитромицину. При этом ни один штамм не был чувствителен ко всем использованным антибиотикам. Представители L. plantarum демонстрировали наиболее широкий спектр устойчивости: один штамм – к тетрациклину и трем аминогликозидам, и три штамма – к тетрациклину и пяти аминогликозидам; у одного штамма обнаружена высокая устойчивость к клиндамицину и у двух штаммов – к линкомицину. Вместе с тем два штамма L. plantarum отличались устойчивостью к бензилпенициллину, сопряженной с чувствительностью к другому -лактамному антибиотику ампициллину. Очевидно, такая устойчивость не связана с активностью -лактамазы и может объясняться специфическим мутационным изменением одного из пенициллин-связывающих белков клеточной стенки. У штаммов L. helveticus, L. casei/paracasei, L. rhamnosus и L. fermentum выявлена перекрестная устойчивость к двум, четырем или пяти различным аминогликозидам. Данные об определении устойчивости к антибиотикам пробиотических штаммов лактобацилл представлены в таблице 2.

Таблица 2. Устойчивость к антибиотикам пробиотических штаммов Lactobacillus

5.2. ПЦР-генотипирование штаммов молочнокислых лактобацилл на наличие генов устойчивости к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса

ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов антибиотикорезистентности. Был проведен молекулярно-генетический анализ штаммов лактобацилл на наличие генов антибиотикорезистентности: tetW/O и tetM, кодирующих устойчивость к тетрациклину; ermT и ermB, кодирующих устойчивость к эритромицину; и catTC, кодирующего устойчивость к хлорамфениколу. Наличие перечисленных выше генов, отвечающих за признаки устойчивости к антибиотикам, проводили с помощью ПЦР.

ПЦР-тест на детерминанты устойчивости к широко используемым в клинической практике антибиотикам - тетрациклину, хлорамфениколу и эритромицину, показал наличие гена tetM конъюгативного транспозона у одного штамма L. casei/paracasei и у двух штаммов L. helveticus. Результаты исследования представлены на рисунке 14. Определение нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов генов tetM у штаммов L. casei/paracasei К3Ш24, L. helveticus NNIE и L. helveticus Er 317/402 и их сравнительный анализ подтвердил идентификацию гена tetM по участку кодирующей последовательности в 400 нуклеотидов (99,8-100% совпадения друг с другом и с аннотированными генами у Enterococcus faecalis и Streptococcus pneumoniae).

Рисунок 14. Электрофорез с результатами детекции гена TetM у штаммов лактобацилл.

  Примечание: 1 – L. helveticus Er 317/402; 2 – L. helveticus 100аш; 3 – L. casei/paracasei К3Ш24; 4 – L. helveticus NNIE; 5 – L. fermentum ГКНМ 526; 6 – L. casei/paracasei ГКНМ 577; 7 – L. plantarum 8-РА-3; 8 – L. plantarum 90-ТС-4; 9 – L. plantarum  СS396; 10 – L. helveticus NK-1; 11 – L. plantarum ГКНМ 101; 12 – L. rhamnosus 421-2; 13 – L. casei/paracasei ГКНМ 23 л1; 14 – маркер ДНК.

Геномный анализ. Для лактобацилл характерно наличие природной устойчивости к ряду антибактериальных  препаратов. В связи с этим был проведен геномный анализ трех штаммов лактобацилл – L. helveticus DPC 4571, L. casei ATCC 334, L. casei BL23 - для выявления генов (tetW/O/M,  ermT/B, catT/C), определяющих резистентность к тетрациклину, эритромицину и хлорамфениколу. Для геномов этих штаммов полная нуклеотидная последовательность доступна в базе данных NCBI, а их видовое положение идентично таксономическому положению изучаемых штаммов, у которых обнаружены вышеупомянутые гены. Геном L. helveticus DPC 4571 и L. casei BL2 представлен только  хромосомными генами, у L. casei ATCC 334 помимо хромосомы присутствует также одна плазмида (plasmid 1). Как показал проведенный нами биоинформатический анализ генов tetW/O/M,  ermT/B, catT/C, в геномах перечисленных штаммов лактобацилл они не обнаруживались ни в хромосомах, ни в плазмиде.

ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов репликации и конъюгативного переноса. Плазмиды являются генетическими структурами, способными достаточно легко передаваться между клетками микроорганизмов как одного вида, так и других видов и даже родов бактерий. Плазмиды несут различные гены, в том числе гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому желательно, чтобы штаммы, используемые в качестве пробиотических, не содержали плазмид. 

  С использованием сконструированных праймеров были проведены исследования  по обнаружению у трех штаммов лактобацилл генов, гомологичных генам репликации  плазмид L. helveticus pLH1 и pLJ1 и L. casei plcа36, а также гена соединительного белка конъюгации (trsK) плазмиды L. casei plса36. Результаты этих исследований представлены на рисунке 15. Из представленных данных видно, что ген rep, гомологичный гену rep плазмид L. helveticus pLH1 и pLJ1,  присутствует у  всех 3-х исследованных культур микроорганизмов. Ген rep, гомологичный гену rep плазмиды L. casei plca36, обнаружен у штамма L. casei/paracasei К3Ш24; ген trsK, гомологичный гену trsK плазмиды L. casei plca36, обнаруживался у всех исследованных штаммов. Таким образом, вероятность того, что исследуемые штаммы содержат плазмиды, (причем конъюгативные), является достаточно высокой. Поскольку исследуемые штаммы содержали ген, кодирующий резистентность к тетрациклину (tetM),  исключить плазмидную его локализацию не представляется возможным. На основании полученных результатов, мы полагаем, что  штаммы L. casei/paracasei К3Ш24, L. helveticus NNIE, L. helveticus Er 317/402 не пригодны для прямого использования в качестве пробиотиков, поскольку могут служить источником трансмиссивных генов устойчивости к антибиотикам в микробиоте человека.

Исследования штаммов  L. casei/paracasei К3Ш24, L. helveticus Er 317/402 и  L. helveticus NNIE показали, что они содержат ген резистентности к тетрациклину (tetM).  При этом уровень устойчивости к тетрациклину у штаммов L. casei/paracasei К3Ш24 и L. helveticus Er 317/402  был крайне низок, в то врем как штамм L. helveticus NNIE проявил высокую устойчивость к этому антибиотику (табл. 2). Проведенные нами исследования демонстрируют определенные трудности, возникающие при тестировании признака антибиотикорезистентности, поскольку штаммы могут содержать молчащие гены, либо обладать генами, определяющими другие механизмы устойчивости.

Рисунок 15. Электрофорез с результатами детекции генов репликации и конъюгативного переноса у штаммов лактобацилл.

  Примечание: а – ген rep Lactobacillus casei plca36

б - ген rep Lactobacillus helveticus pLH1

в - ген trsK Lactobacillus casei plca36

1, 11 – маркер ДНК; 2, 5, 8 – L. helveticus NNIE; 3, 6, 9 – L. casei/paracasei К3Ш24; 4, 7, 10  – L. helveticus Er 317/402.

6. Изучение технологических и пробиотических свойств штаммов молочнокислых бактерий

6.1. Технологические и пробиотические свойства штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов домашнего изготовления

Способность штаммов Streptococcus thermophilus ферментировать галактозу. Особенностью термофильного стрептококка является слабовыраженная сахаролитическая активность. Бактерии вида S. thermophilus обычно ферментируют только лактозу, глюкозу и сахарозу, реже сбраживают раффинозу и, как правило, не ферментируют манит, инулин, глицерин, сорбит, салицин, рамнозу, трегалозу и декстрин. Способность S. thermophilus быстро поглощать и перерабатывать лактозу является определяющим фактором в некоторых биотехнологических процессах. Лактоза – дисахарид, состоящий их двух частей – глюкозной и галактозной. S. thermophilus утилизирует глюкозный, но, как правило, не использует галактозный остаток.  Накопление галактозы в продуктах питания нежелательно по разным причинам – галактоза плохо усваивается человеком, избыток галактозы в молочных продуктах может неблагоприятно сказаться на самочувствии людей, особенно страдающих лактазной недостаточностью. Галактоза в молочнокислых продуктах может приводить к  потемнению сыров типа «моццарелла», развитию гнилостной и/или патогенной микрофлоры, образованию СО2 бактериями, не входящими в состав закваски.  Среди изученных нами культур лишь 5 штаммов (ВС216, ВС227, ВС315, ВС324, ВС337) были способны утилизировать галактозу.

   Качественное определение продукции экзополисахаридов осуществлялось микробиологическим методом с использованием среды с красителем. Нами было установлено, что примерно четвертая часть изученных коллекционных штаммов термофильных стрептококков были способны в процессе культивирования продуцировать ЭПС.

  Количественное определение ЭПС.  При  изучении  культуральной жидкости, полученной при выращивании  штаммов термофильных стрептококков в питательной среде М21  при температурах 370С, 420С и 500С в течение 1, 2 и 3 суток инкубации, нами было обнаружено, что максимальная продукция ЭПС у исследуемых штаммов термофильных стрептококков наблюдалась при температуре 420С. Исключение составляет штамм ВС227, для которого этот параметр составляет 500С. Максимальное количество ЭПС синтезируется к концу 3 суток инкубирования. Исключением является штамм ВС320,  продукция ЭПС которого на вторые и третьи сутки не различалась. Наибольшие показатели продукции ЭПС выявлены у штаммов BC320 и BC321; количество продуцируемых ими ЭПС составляет 5,864 и 6,127 г/л, соответственно.

  Синтез витаминов стартовыми культурами молочнокислых бактерий. Тенденцией сегодняшнего дня является создание функциональных продуктов питания с целью профилактики заболеваний потребителей. В настоящее время чаще всего в этой роли выступают кисломолочные продукты. Нами с использованием метода ВЭЖХ была изучена способность штаммов Streptococcus thermophilus к продукции фолиевой кислоты (витамина группы В). По результатам проведенных экспериментов нами были отобраны штаммы, способные к синтезу этого витамина. На рисунке 16 приведены данные для штамма ВС323, способного при культивировании в течение  суток при температуре 370С  синтезировать фолат в концентрации 4,5810 мкг/л.

 

Рисунок 16.  Хроматоргамма культуральной жидкости штамма S. thermophilus 323,  продуцирующего фолат при выращивании в жидкой питательной среде при температуре 370С в течение 1 суток.

Способность молочнокислых бактерий синтезировать витамины группы В показана у многих штаммов стрептококков, лактобацил, лактококков и бифидобактерий и является пробиотической характеристикой этих микроорганизмов, обосновывающая их использование в качестве стартовых культур при производстве пробиотических и функциональных продуктов питания. Применение современных подходов для обнаружения наличия у промышленно значимых видов бактерий технологических и пробиотических свойств позволяет более грамотно использовать культуры бактерий в различных биотехнологических процессах и проводить выбор стартовых культур молочнокислых бактерий для разных кисломолочных продуктов, что является основой для гарантии качества готового продукта.

6.2. Идентификация антагонистически активных культур

Lactococcus lactis ssp. lactis

Бактериоцины, образуемые молочнокислыми бактериями, разрешены для применения в пищевой промышленности в качестве природных консервантов, способствуют увеличению сроков хранения сельскохозяйственного сырья и пищевой продукции, обеспечивают сохранность продуктов питания и при этом безвредны для здоровья человека. Наиболее изученным и широко применяемым в качестве биологического  консерванта  является бактериоцин - низин, известный как полипептидный антибиотик. Продуцентами низина являются штаммы L. lactis subs. lactis.

  На рисунке 17 представлены результаты сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК  у различных штаммов лактококков, принадлежащих виду  L. lactis subs. lactis.

Рисунок 17. Филогенетическое дерево, построенное по результатам анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых антагонистически активных штаммов лактококков и референтных последовательностей, представленных в базе данных NCBI.

Таблица 3. Антагонистическая активность изученных штаммов  лактококков в отношении различных микроорганизмов

Тест-культура

Зоны подавления исследуемых штаммов

(в мм)

Низин,

3000 МЕ/мл

L. lactis 115

L. lactis 229

L. lactis 194

L. lactis МГУ

Bacillus mycoides

18,0

16,0

19,5

13,0

17,0

Bacillus subtilis

12,0

15,0

22,0

16,0

18,0

Bacillus coagulans

17,0

15,0

23,0

14,0

21,0

Bacillus cereus

18,5

14,0

21,0

16,0

18,0

Micrococcus luteus

21,5

20,0

22,5

19,0

25,0

Staphylococcus aureus

16,0

16,0

20,0

12,0

15,0

Alcaligenes faecalis

0

10,0

12,5

0

0

Escherichia coli

0

0

15,0

0

0

Proteus vulgaris

0

0

16,5

0

0

Pseudomonas aeruginosa

0

0

16,5

0

0

Fusarium oxysporum

0

0

16,5

0

0

Penicillium chryzogenum

0

0

17,5

0

0

Aspergillus niger

0

0

21,0

0

0

Rhodotorula aurantiaca

0

0

19,5

0

0

Candida guellermondii

0

0

11,0

0

0

  В таблице 3 представлены значения антагонистической активности отобранных штаммов L. lactis subs. lactis 194, 229, 115 в отношении различных грамотрицательных и грамположительных бактерий и грибов  (в сравнении с низинобразующим штаммом МГУ и препаратом Nisaplin, представляющего собой низин группы А).  Как видно из таблицы,  все выделенные штаммы подавляли рост грамположительных бактерий, включая спорообразующие бациллы и микрококки, что характерно также для низина и низинобразующего штамма из коллекции МГУ. Однако штамм 194 оказывал также антимикробное действие и на ряд грамотрицательных бактерий, а также на дрожжи и другие грибы, которые способны вызывать микробиологическую порчу продуктов и пищевого сырья. Таким образом, штамм 194, синтезировал антибиотические вещества более широкого спектра действия, что делает его перспективным для дальнейшего использования.

Антагонистически активные штаммы Lactococcus lactis. subsp. lactis депонированы в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова. Номера определенных нами последовательностей генов 16S рРНК изученных штаммов лактококков депонированы в базе данных NCBI: DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, EF102815, EF102814, EF114309, EF114308,  EF114307, EF114306, EF114305, EF100778, EF100777.

ВЫВОДЫ

1. Установлена вариабельность изученных штаммов Streptococcus thermophilus по величине их геномов. Показано, что размер геномов у исследованных штаммов (определенный на основании данных геномной рестрикции и PFGE) сильно варьирует – от 1417 до 2075 т.п.н., что свидетельствует о внутривидовом генетическом полиморфизме бактерий данного вида.

2. Выявлено генетическое разнообразие изученных в работе штаммов рода Enterococcus, выражающееся в особом строении гена 16S рРНК. Предложено отнести организмы имеющие существенное отличие в последовательностях генов 16S рРНК к новому виду - Enterococcus lactis sp. nov.

3. Продемонстрировано существование уникальных замен в проксимальных областях генов 16S рРНК подвидов Lactococcus lactis subsp. lactis и L. lactis subsp. cremoris, позволяющее проводить точную молекулярную идентификацию культур внутри вида L. lactis.

4. Установлено, что метод RAPD-PCR обладает хорошей разрешающей способностью при видовой и штаммовой идентификации бактерий Streptococcus thermophilus, Lactobacillus plantarum, L. helveticus, L. casei, L. rhamnosus, L. fermentum. Продемонстрированы преимущества метода RAPD-PCR с применением праймера М13 для штаммовой паспортизации S. thermophilus и с применением праймера ERIC-1 - для паспортизации перечисленных видов лактобацил.

5. Проведена реклассификация систематического положения (на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК) и генетическая паспортизация методом RAPD-PCR некоторых производственных культур рода Lactobacillus, использующихся в промышленности РФ в качестве заквасок при изготовлении кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов, что позволяет производителям использовать современные данные об истинном таксономическом положении культур и их генетических характеристиках.

6. Показана необходимость проведения исследований с применением молекулярно-биологических подходов для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Применено ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса, что дает возможность исключения из состава заквасок культур, которые могут служить источником трансмиссивных генов антибиотикорезистентности в микробиоте человека.

7. Определено наличие технологических и пробиотических свойств (способность синтезировать экзополисахариды, витамин и утилизировать галактозу) у штаммов Streptococcus thermophilus, что позволило отобрать наиболее перспективные культуры для использования в качестве заквасок и бактериальных концентратов в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. При таксономической идентификации  штаммов молочнокислых бактерий, принадлежащих родам Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus следует опираться на результаты исследований, полученных с применением молекулярно-биологических методов, основанных на анализе последовательности рибосомальных генов.
  2. При генетической паспортизации промышленных штаммов молочнокислых бактерий следует использовать метод RAPD-PCR, позволяющий получать индивидуальные геномные паттерны, что служит дактилоскопическими характеристиками штамма и защищает авторов культуры от несанкционированного применения.
  3. При изучении антибиотикорезистентности штаммов молочнокислых бактерий необходимо использовать молекулярно-биологические подходы, основанные на генотипированиии наличия генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса с целью исключения из состава заквасок культур, которые могут служить источником генов  трансмиссивной антибиотикорезистентности в микробиоте человека.
  4. Применение в лабораторной практике комплексного подхода, реализуемого с помощью молекулярно-биологических методов при видовой идентификации, молекулярно-генетической паспортизации и определения в составе геномов генов, отвечающих за антибиотикорезистентность, что позволяет проводить отбор безопасных производственных культур с целью для заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотических препаратов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

  1. Лысенко А.М. Подтверждение систематического положения Streptococcus salivarius / Лысенко А.М., Ботина С.Г., Суходолец В.В. // Микробиология. -  2002. -  Т. 71. -  № 5. - С.713-716.
  2. Ботина С.Г. Генетическое многообразие штаммов молочнокислых термофильных бактерий на территории стран СНГ / Ботина С. Г., Лобанов А.О., Лысенко А. М., Суходолец В.В. // Биотехнология. - 2004. - Т.2. -  С.3-12.
  3. Ботина С.Г. Выяснение таксономического положения отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий по данным секвенирования генов 16S рРНК / Ботина С.Г., Лысенко А. М., Суходолец В.В. // Микробиология. 2005. -  Т.74. - №4. - С.520-525.
  4. Ботина С.Г. Отечественные штаммы энтерококков, используемые в качестве заквасок, не содержат генов вирулентности, обычно присутствующих в патогенных штаммах E. faecalis / Ботина С.Г., Суходолец В.В. // Биотехнология. -  2005. -  №2. -  С.33-37.
  5. Суходолец В.В. Молочнокислые энтерококки Enterococcus faecium и Enterococcus durans: разнообразие в последовательностях нуклеотидов в генах 16S рРНК / Суходолец В.В., Ботина С.Г., Лысенко А.М., Тренина М.А. // Микробиология. -  2005. -  Т.74. -  №6. -  С.810-815.
  6. Сультимова Т.Д. Скрининг бактериоцин-продуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis / Сультимова Т.Д., Стоянова Л.Г.,  Ботина С.Г. //  Материалы Всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии». -  1-3 ноября 2005, г. Москва. -  С.107.
  7. Ботина С.Г. Изучение видового и генетического разнообразия термофильных молочнокислых бактерий с применением комплексного подхода к идентификации и оценке свойств штаммов / Ботина С.Г., Корниенко М.А., Пиксасова О.В., Нетрусов А.И., Суходолец В.В. // Материалы Второй Международной Научно-Практической конференции «Перспективы развития биотехнологий в России». -  1-2 декабря 2005. – Пущино. -  С.49–51.
  8. Ботина С.Г. Изучение видообразования у бактерий при сравнительном анализе генов 16S рРНК у близкородственных видов энтерококков. Материалы научного симпозиума, посвященного памяти Е. Н. Кондратьевой / Ботина С.Г., Суходолец В.В. // 21-24 декабря 2005 года, биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва. - С.84.
  9. Ботина С.Г. Видовое и генетическое разнообразие природных штаммов молочнокислых бактерий. / Ботина С.Г., Корниенко М.А., Пиксасова О.В., Нетрусов А.И., Суходолец В.В // Материалы научного симпозиума, посвященного памяти Е. Н. Кондратьевой. -  21-24 декабря 2005 года, биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва. -  С.85.
  10. Ботина С.Г. Видообразование у бактерий: сравнение генов 16S рРНК у близкородственных видов энтерококков / Ботина С.Г., Суходолец В.В. // Генетика. -  2006. -  Т.42. -  №3. -  С.325-332.
  11. Стоянова Л.Г. Выделение и идентификация бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из свежего молока / Стоянова Л. Г., Сультимова Т. Д., Ботина С. Г., Нетрусов А. И. // Прикладная биохимия и микробиология. -  2006.-  Т.42. -  № 5.-  С.560-568.
  12. Ботина С.Г. Идентификация промышленных штаммов молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования / Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. //  Генетика. -  2006. -  Т. 42. -  № 12. - С.1621-1635.
  13. Ботина С.Г.. Изучение возможности использования бактерий рода Enterococcus в качестве стартовых культур. / Ботина С.Г., Машенцева Н.Г., Баранова Е.А., Осанова А.А., Корниенко М.А., Пиксасова О.В. // Материалы 10-ой школы-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века».  Пущино, 17-21 апрель, 2006. - С. 359.
  14. Ботина С.Г. Изучение генетического разнообразия молочнокислых бактерий, выделенных из различных регионов России и Белоруссии / Ботина С.Г., Корниенко М.А., Пиксасова О.В., Н.А. Белясова // Материалы Международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микро­биологии и биотехнологии». -  Минск, 1-2 июня 2006 г. -  С.92-93.
  15. Ботина С.Г. Генотипический анализ молочнокислых бактерий, выделенных из национальных кисломолочных продуктов различных регионов мира / Ботина С.Г., Пиксасова О.В., Корниенко М.А., Нетрусов А.И. // Материалы Международной научной конференции «Успехи биотехнологии» - г. Цахкадзор, Республика Армения, 11-14 июля 2006 года. -  С.120.
  16. Пиксасова О.В. Изучение внутривидового разнообразия бактерий Streptococcus thermophilus методами PFGE и RAPD-PCR / Пиксасова О.В., Корниенко М.А., Ботина С.Г// Международная конференция «Микробные биотехнологии». - Одесса, 11-15 сентября 2006 года. -  С.90.
  17. Ботина С.Г., Суходолец В.В. Изучение генетического разнообразия бактерий вида Streptococcus thermophilus методами молекулярного типирования Ботина С.Г., Суходолец В.В. // Материалы Российской школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна. - 26 ноября – 2 декабря 2006 г. Москва-Пущино. - С.35.
  18. Ботина С.Г. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы salivarius рода Streptococcus на основании данных о строении генов 16S рРНК / Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. // Микробиология. -  2007. -  Т.76. -  №3 - С.429-432.
  19. Ботина С.Г. Технологические свойства штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов / Ботина С.Г., Корниенко М.А., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. // Биотехнология. -  2007. -  №3. -  С.21-27.
  20. Ботина С.Г. Генетическое разнообразие природных штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus / Ботина С.Г., Пиксасова О.В., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. // Генетика. 2007. - Т. 43. -  № 5. -  С.601-608.
  21. Ботина С.Г. Сравнительный анализ размеров геномов штаммов Streptococcus thermophilus / Ботина С.Г., Пиксасова О.В., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. // Генетика. -  2007 - Т.43. -  №7. - С.891-897.
  22. Ботина С.Г. Сравнение данных генотипических и биохимических характеристик штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов / Ботина С.Г., Тренина М.А., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. -  №6. -  С.670-676.
  23. Ботина С.Г. Идентификация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования. / Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д.,  Нетрусов А.И., Хлебников В.С., Харитонов В.Д. // Материалы Международного конгресса по пробиотикам. -  Санкт-Петербург, 15–16 мая 2007 г. -  С.94.
  24. Ботина С.Г. Видовая идентификация и генетическая паспортизация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования / Ботина С.Г. // Молочная промышленность. -  2008. - №3. -  С.50-52.
  25. Ботина С.Г. Штаммы Streptococcus thermophilus, ферментрующие галактозу / Ботина С.Г. // Молочная промышленность.  -  2008. -  №4. - С.54-56.
  26. Семенихина В.Ф. Закваски с низкой постокислительной активностью / Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Ботина С.Г., Абрамова А.А. // Молочная промышленность. -  2009. -  № 5. - С.61-62.
  27. Ивашкина Н.Ю. Оригинальный отечественный пробиотик аципол: молекулярно-биологические и метаболические характеристики / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастероэнтерологии, гепатологии и колипроктологии. -  2009. -  №2. -  С.72-78.
  28. Ботина С.Г. Идентификация подвидов Lactococcus lactis / Ботина С.Г., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В. // Молочная промышленность. -  2009. -  №6. - С.68-69.
  29. Ботина С.Г. Генотипические и метаболические характеристики бактерий рода Enterococcus, выделенных из молочных продуктов / Ботина С.Г., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В. // Молочная промышленность. -  2009. -  №8. -  С.47-49.
  30. Ботина С.Г. Молекулярно-генетическая идентификация, ДНК-генотипирование и паспортизация пробиотических культур микроорганизмов с целью разработки технологий производства бактериальных заквасок для биотехнологической промышленности / Ботина С.Г., Даниленко В.Н. // Материалы Пятого съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. -  Москва, 21 - 27 июня 2009 г. - С.56.
  31. Ботина С.Г. ДНК-генотипирование, молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация стартовых культур молочнокислых бактерий, используемых в производстве заквасок для молочной промышленности  / Ботина С.Г., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Харитонов В.Д. // Материалы Юбилейного Пятого Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и  перспективы развития". - 16-20 марта 2009 г. -  С.24.
  32. Ботина С.Г. ДНК-генотипирование и молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация пробиотических культур микроорганизмов, используемых в производстве заквасок прямого внесения для биотехнологической промышленности / Ботина С.Г., Даниленко В.Н. // Материалы 11-й международного славяно-балтийского научного форума "Санкт-Петербург – Гастро-2009". - 20–22 мая 2009 г. - С.44.
  33. Ивашкина Н.Ю. Генетические характеристики пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. //  Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -  2009. -  №1. -  С.93.
  34. Ивашкина Н.Ю. Устойчивость пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus к воздействию среды верхних отделов желудочно-кишечного тракта / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -  2009. -  №1. - С.93.
  35. Ивашкина Н.Ю. Определение способности штаммов лактобактерий продуцировать биогенные амины / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -  2009. -  №5. -  С.55.
  36. Ивашкина Н.Ю. Определение способности штаммов лактобактерий продуцировать витамины / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -  2009. -  №5. -  С.56.
  37. Ивашкина Н.Ю. Продуцирование полисахаридов штаммами лактобактерий // Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -  2009. - №5. -  С.56.
  38. Ботина С.Г. Генотипическая характеристика и изучение пробиотических свойств культур бактерий рода Lactobacillus / Ботина С.Г., Бабыкин М.М., Зинченко В.В., Даниленко В.Н.  // Материалы XXXII International Congress of the Society for Microbial Ecology and Disease. -  Октябрь, 29–30, 2009. – Санкт Петербург. – С.38.
  39. Глазова А. А. Изучение технологических характеристик и пробиотических свойств молочнокислых бактерий рода Lactobacillus / Глазова А. А.,  Климина К. М., Ботина С.Г. // Материалы 13-ой международной Пущинской школы конференция молодых ученых «Биология-наука 21 века». - сентябрь-октябрь, 2009. - С.160.
  40. Климина К. М. Генотипическая характеристика молочнокислых бактерий рода Lactobacillus / Климина К. М., Глазова А. А.,  Ботина С.Г. //Материалы 13-ой международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века». -  сентябрь-октябрь, 2009. - С.166.
  41. Ботина С.Г. Реклассификация отечественных производственных культур бактерий рода Lactobacillus и сравнительная характеристика их технологических свойств / Ботина С.Г., Климина К. М., Глазова А. А., Зинченко В.В., Даниленко В.Н.  // IМатериалы II Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». -  Ростов на Дону, сентябрь, 2009. - С.10.
  42. Ботина С.Г. Изучение физиолого-биохимических, фенотипических, генотипических, технологических характеристик и производственно-ценных свойств штаммов из коллекции ВНИМИ видов: Str. thermophilus, L. bulgaricus и создание высокотехнологичных заквасок для производства кисломолочных продуктов: йогурта, ряженки, простокваши / Ботина С.Г., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В. // Материалы Конференции РАСХН-РФФИ. Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России. - Сергиев Посад, октябрь, 2009. - С. 168-171.
  43. Ботина С.Г. Экзополисахариды молочнокислых бактерий. Использование штаммов, синтезирующих ЭПС в производстве кисломолочных продуктов питания / Ботина С.Г., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф. // Хранение и переработка сельхозсырья. -  2010. -  №1. -  С.42-45.
  44. Ботина С.Г. Штаммы Streptococcus thermophilus, продуцирующие экзополисахариды / Ботина С.Г., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф. // Хранение и переработка сельхозсырья.  -  2010. -  №2. -  C.33-35.
  45. Ботина С.Г. Синтез витаминов стартовыми культурами молочнокислых бактерий   Streptococcus thermophilus / Ботина С.Г., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф. // Хранение и переработка сельхозсырья,  2010. - №3. -  C.54-56.
  46. Ботина С.Г. Генетическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей / Ботина С.Г., Червинец Ю.В., Климина К.М., Коробан Н.В., Червинец В.М., Гаврилова О.А., Лебедев Д.В., Миронов А.Ю. // Клиническая лабораторная диагностика. 2010. -  №11. - С.43-46.
  47. Ботина С.Г. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus / Ботина С.Г., Климина К.М., Коробан Н.В., Амерханова А.М., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. // Генетика. -  2010. -  Т. 46.  -  № 11. -  С.1306-1313.
  48. Ботина С.Г. Генетическое разнообразие бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы людей / Ботина С.Г., Коробан Н.В., Климина К.М., Глазова А.А., Захаревич Н.В., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. // Генетика. 2010. - Т.46. -  №12. - С.15891597.
  49. Климина К.М. Выделение и молекулярно-генетическая идентификация аэротолерантной бактериальной микрофлоры из грудного молока / Климина К.М., Глазова А.А., Ботина С.Г. // Материалы 14-ой Международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века». -  19 – 23 апреля 2010 г. - С.232.
  50. Ботина С.Г. Тестирование резистентности потенциальных пробиотических бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы людей к антибактериальным препаратам: определение и способность к переносу генов устойчивости / С.Г. Ботина, А.А. Глазова, К.М. Климина, Н.В. Коробан, О.Г. Жиленкова, Е.У. Полуэктова, В.В. Зинченко, В.Н. Даниленко // Материалы Второго Международного Конгресса-Партнеринга и Выставки по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике. - 12 - 15 апреля 2010 года  в Центре Международной Торговли, Москва. -  С.28.
  51. Ботина С.Г. Разработка технологий универсального  быстропереориентируемого производства заквасок прямого внесения для биотехнологической промышленности / Ботина С.Г., Даниленко В.Н., Бабыкин М.М., Зинченко В.В., Будрик В.Г., Харитонов В.Д. // Материалы Международной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия». - Саранск, май, 2010. -  С.70.
  52. Ботина С.Г. Определение генетических детерминантов, ответственных за проявление технологических свойств у стартовых культур молочнокислых бактерий: тестирование наличия генов синтеза экзополисахаридов у произ-водственных штаммов Lactobacillus helveticus.  Научно-инновационный подход при моделировании технологического процесса производства заквасок прямого внесения / Ботина С.Г., Абрамова А.А., Раскошная Т.А., Зинченко В.В. Коробан Н.В., Бабыкин М.М. // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции  «Принципы пищевой комбинаторики – основа моделирования поликомпонентных пищевых продуктов». – Углич, сентябрь, 2010. – С.33-34.
  53. МУ 2.3.2.2789-10 «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». Методические указания. – М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. – 2010. –  93 с. Авторский коллектив: В.А.Тутельян, С.А.Шевелёва, С.А.Хотимченко, В.А.Исаков, И.Я.Конь, В.К.Мазо, Н.Р.Ефимочкина, Э.Н.Трушина, С.Ю.Батищева, А.В.Черкашин, А.В.Булахов, Н.К.Янковский, В.Н.Даниленко, С.Г.Ботина, О.В.Аверина, В.А.Алешкин, А.М.Амерханова, О.Г.Жиленкова, М.С.Бляхер, И.М. Федорова, Е.А.Воропаева, Ю.В.Черепанова, А.Л.Гинцбург, Ю.В.Ананьина, Б.С. Народицкий, Н.А.Зигангирова, Л.Н.Нестеренко, И.А.Шагинян, М.Ю.Чернуха, А.А.Ховаев, В.М.Червинец, Ю.В.Червинец, В.В.Зинченко,  Е.А.Карбышева, В.Д.Харитонов, В.Ф.Семенихина, И.В.Рожкова, В.Г.Будрик, А.И.Туркин. Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, протокол № 2 от 14.10.2010. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 декабря 2010.
  54. Ботина С.Г. Молекулярно-генетическая характеристика и пробиотический потенциал бактерий рода Lactobacillus / Ботина С.Г., Ивашкина Н.Ю., Маев И.В. // Молекулярная медицина. -  2011. -  №1. -  С.53-57.
  55. Ивашкина Н.Ю. Экспериментальные доказательства пробиотических свойств бактерий рода Lactobacillus / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г. // Российские медицинские вести. -  2011. -  №1. -  С.27-32.
  56. Червинец Ю.В. Генетическая паспортизация и изучение способности к формированию биопленок лактобациллами, выделенными из полости рта здоровых людей / Червинец Ю.В., Ботина С.Г., Глазова А.А., Коробан Н.В., Червинец В.М., Самоукина А.М., Гаврилова О.А., Лебедев Д.В., Миронов А.Ю. // Клиническая лабораторная диагностика. -  2011. -  №2. - С.43-46.
  57. Ботина С.Г. Характеристика устойчивости к антибиотикам потенциальных пробиотических бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы человека / Ботина С.Г., Е.У. Полуэктова, А.А. Глазова, Н. В. Захаревич, Н.В. Коробан, М.М. Бабыкин, В.В. Зинченко, О.Г. Жиленкова, А.М. Амерханова, В.Н. Даниленко // Микробиология. -  2011. - Т. 80. - № 2.- С.1-9.
  58. Botina S.G. Rearrangement of the RNA genes in closely related Enterococcus Species: new species Enterococcus lactis / Botina S.G. and Sukhodolets V.V. // ASM Conference on Streptococcal Genetics. -  France, Sain-Malo 18-21 June, 2006. - Р. 117.
  59. Bolotin A. Genomic signatures of food-associated Enterococci / Bolotin A., Barbe V., Botina S., Quinquis B.,  Weissenbach J., Ehrlich SD // The 3th European Conference on Prokaryotic Genomics, ProkaGENOMICS. -  2007, Gottingen, October 7-10. - Р.27.
  60. Bolotin A. Genomic signatures of food-associated Enterococci  / Bolotin A., Barbe V., Botina S., Quinquis B., Tanganurat W., Couloux A., Weissenbach J., Ehrlich SD. // Second International Congress of Central Asia Infectious Diseases. -  March 27-30, 2008. - Р.32.

Изобретения

  1. Патент на изобретение №2337953 Российская Федерация, МПК C12N1/20, A23C9/12, заявка 2007117139/13 от 08.05.2007, публикация патента 11.10.2008 г., бюллетень № 31. Штамм бактерий Streptococcus thermophilus для сквашивания молока в процессе приготовления кисломолочных продуктов, включая йогурты / Тренина М.А., Ботина С.Г., Стоянова Л.Г., Цыганков Ю.Д. Заявитель и патентообладатель ФГУП ГосНИИгенетика.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАД – биологически активная добавка

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

МГУ – Московский государственный университет

РФ - Российская Федерация

РАН – Российская академия наук

п.н.- пара нуклеотидов

ПЦР – полимеразная цепная реакция

т.п.н. – тысяча пар нуклеотидов

ЭПС - экзополисахариды

NCBI - National Center for Biotechnology Information

рН - водородный показатель

PFGE - пульс-гель электрофорез

RAPD-PCR (РАПД-ПЦР) - анализ полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.