WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Зацепина Ольга Георгиевна

Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания

03.00.03 – молекулярная биология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва, 2009 г.

Работа выполнена в , в Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Научный консультант

д. б. н. проф. М. Б. Евгеньев

Официальные оппоненты:

д. б. н. проф. Б. А. Маргулис, Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН.

д. б. н. Н. А. Чуриков, Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии РАН.

д.б. н. А. М. Сапожников, Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН.

Защита диссертации состоится­­­ 27-го октября 2009 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан ________________2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат химических наук Крицын А. М.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Повышенная температура или тепловой шок (ТШ) при воздействии на все известные организмы, от бактерии до человека, активирует гены теплового шока (бтш), представляющие собой эффективную защитную систему как на клеточном уровне, так и на уровне целого организма. Гены теплового шока кодируют специфические белки (БТШ).

Гены ТШ и их продукты, сразу после открытия в 1974 г., стали объектом пристального исследования. Оказалось, что БТШ индуцируются не только теплом, но и целым рядом других повреждающих факторов как физического, так и химического происхождения.

Система генов ТШ очень быстро реагирует на внешний стимул. Гены ТШ высоко консервативны. Наиболее консервативными являются гены бтш70. Аминокислотные последовательности БТШ70 у человека и E. сoli гомологичны на 50%, а ряд доменов – на 96% (Schlesinger, 1990). Такой консерватизм БТШ у всех изученных организмов свидетельствует об исключительно важной роли этих белков в защите клеток от повреждений во время и после стресса (Lidquist, 1986; Feder and Hoffman, 1999).

Основная функция БТШ при стрессе – предотвращение агрегации и восстановление нативной третичной структуры денатурированных белков, концентрация которых резко увеличивается при повышении температуры (Fink 1999; Hartl and Hayer, 2002).

Со времени открытия БТШ были подробно исследованы их структура и функции, а также молекулярные механизмы их экспрессии.

Вопрос об участии БТШ70 в адаптации на уровне целого организма в течение длительного времени оставался неисследованным. Наиболее актуальным в этом направлении является изучение молекулярных механизмов адаптации организмов и возможной роли БТШ в этом процессе у разных географических популяций одного и того же вида, а также у близких видов, живущих в условиях, резко отличающихся по средней температуре обитания. Такой подход, впервые предложенный М.Б. Евгеньевым, дает возможность не только исследовать молекулярно-физиологические функции БТШ при стрессе, но и понять их значение в экологии, адаптации и эволюции популяций.

Первые работы такого плана были выполнены в России на различных видах шелкопряда и на девяти видах ящериц, отличающихся по температуре обитания (Шейнкер и др., 1987; Ulmasov et al., 1992). В этих исследованиях были обнаружены различия в уровне синтеза БТШ70 у разных видов, в зависимости от температуры района их обитания. Однако, в то время было неясно, какие механизмы регуляции экспрессии БТШ лежат в основе этих различий.

В частности, не было известно, имеются ли какие-нибудь различия в ответе на ТШ у теплокровных организмов, тысячелетиями проживавших в контрастных по температурному режиму районах (например, пустыни Средней Азии и северные районы России).

Основным механизмом термоустойчивости у пустынных видов ящериц (Ulmasov et al., 1992) и муравьев (Gehring and Wehner, 1995) является, по-видимому, конститутивный синтез БТШ в нормальных условиях, обусловливающий готовность организма пережить резкий подъем температуры. У мух рода Drosophila синтез БТШ70 в норме репрессирован. Было актуально узнать, существует ли взаимосвязь между уровнем индукции БТШ70 и термоустойчивостью у разных видов мух рода Drosophila. Важно было выяснить, какие молекулярные механизмы лежат в основе вариабельности уровня индукции БТШ70, обеспечивающей адаптацию мух и других организмов к различным условиям обитания.

Устройство кластера генов бтш70 у D. melanogaster хорошо изучено, известна также и структура промоторной области генов бтш у этого вида. Было интересно провести сравнительный анализ локуса генов бтш70 у видов Drosophila группы virilis, отделённых от группы  melanogaster десятками миллионов лет дивергентной эволюции. Следовало также выяснить, имеются ли различия в устройстве кластера генов бтш70 и внутри самой группы  virilis, у контрастных по температуре обитания видов, таких как D. virilis, D. lummei. Такого плана исследования могут прояснить пути эволюции и адаптации у родственных видов, обитающих в разных температурных нишах.

В последние десятилетия накоплено много фактов, говорящих о важной роли мобильных генетических элементов (МЭ) в адаптации и эволюции самых различных видов животных. Однако, возможный вклад МЭ в адаптацию видов к определенным температурным режимам обитания не был изучен. Встраивание МЭ в регуляторную область генов бтш может иметь весьма важные последствия, способные повлиять на тонкие механизмы регуляции и эволюции этой важнейшей адаптационной системы. Соответственно, актуальность изучения закономерностей встраивания МЭ в промоторную область генов бтш и влияние таких встраиваний на термоустойчивость организмов не вызывает сомнения.

Цель работы. Выявление основных молекулярных механизмов регуляции генов бтш при адаптации организмов к различным условиям обитания.

Основные задачи исследования

1. Провести анализ кинетики и уровня синтеза БТШ70 в норме и после ТШ у ящериц, резко различающихся по температуре среды обитания.

2. Выявить молекулярные механизмы регуляции экспрессии БТШ70 у изучаемых модельных видов. В частности изучить:

а) число копий бтш70 у сравниваемых видов,

б) регуляцию транскрипции бтш.

3. На примере первичной культуры фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и центральной части России, изучить возможные различия в термоустойчивости у теплокровных.

4. Провести детальное исследование ответа на ТШ на примере рядов видов и линий Drosophila (D. melanogaster, D. lummei, D. montana, D. texana, D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis), различающихся по температуре экологической ниши обитания. Для этого исследовать:

а) базальную и индуцируемую термоустойчивость,

б) уровень экспрессии БТШ70,

в) паттерн белкового синтеза после ТШ,

г) регуляцию транскрипции бтш.

5. Исследовать механизмы эволюции генов бтш70 у группы видов с хорошо изученной филогенией (на примере группы virilis). Для этого изучить:

а) строение кластера генов бтш70 у D. virilis и D. lummei.

б) клонировать и секвенировать гены бтш70 с фланкирующими последовательностями у изучаемых видов и линий.

6. Оценить вклад других групп БТШ в термоустойчивость организмов.

7. Изучить роль МЭ в адаптации организмов к изменяющимся условиям среды обитания. Для этого на модельной системе исследовать частоту и локализацию внедрения Р элемента в гены бтш70 D. melanogaster, а также описать функциональные последствия таких внедрений.

Научная новизна

1. В ходе исследования на примере нескольких видов ящериц было показано, что основную защитную роль при ТШ у южных видов играет конститутивный синтез БТШ70, отсутствующий у северных видов. Впервые выявлена корреляция между естественными колебаниями температуры в течение дня и уровнем синтеза БТШ70 в клетках животных. Впервые показано, что конститутивный синтез БТШ70 обусловлен особенностями связывания фактора транскрипции ТШ с промотором. Выявлены характерные различия в пороге индукции БТШ и длительности их синтеза, в зависимости от температуры среды обитания сравниваемых видов.

2. Впервые выявлены различия в термоустойчивости клеток у теплокровных, на примере культур первичных фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и центральной части России.

3. Впервые у видов Drosophila группы virilis изучен паттерн индукции ряда групп БТШ в ответ на различные температурные воздействия. Выявлен преимущественный синтез низкомолекулярных БТШ и БТШ40 у термоустойчивых видов, по сравнению с более термочувствительными, при жестком температурном воздействии.

3. Методом масс-спектрометрии достоверно определены основные члены семейства БТШ70 у видов группы virilis.

4. Впервые обнаружены различия в числе генов бтш70 у разных линий и видов данной группы.

5. Подробно изучена структура кластера генов бтш70 у группы видов virilis; предложена модель, объясняющая эволюцию этого кластера в роде Drosophila.

6. На примере видов Drosophila показаны сложные взаимоотношения между уровнем синтеза БТШ и термотолерантностью. Впервые выявлено встраивание МЭ Jockey в промоторную область терморезистентной линии D. melanogaster (ТТ), способной размножаться при повышенной температуре (32С). Показано снижение экспрессии генов бтш70 и изменение паттерна синтеза БТШ в этой линии.

7. На модельной системе, разработанной для D. melanogaster, методом направленного Р-мутагенеза выявлено специфическое встраивание конструкции на основе Р элемента исключительно в промоторную область генов бтш70. Найдены горячие точки встраивания.

Положения, выносимые на защиту

1. Адаптационная эволюция ответа организма на стрессирующее воздействие окружающей среды может существенно различаться в зависимости от вида и/или группы организмов.

2. Важную роль в термоустойчивости организмов играет БТШ70.

3. Пластичность индукции БТШ в значительной степени определяется фактором теплового шока (HSF). Как правило, у пустынных теплолюбивых видов температурный порог индукции белков теплового шока выше, чем у видов средней полосы.

4. Терморезистентные виды при физиологически нормальной температуре часто характеризуются наличием определенного базального уровня БТШ70 в клетках.

5. Базальный уровень синтеза БТШ может быть обусловлен свойствами HSF и промотора генов бтш.

7. В большинстве случаев адаптация организма к гипертермии достигается без изменения числа генов теплового шока, хотя у некоторых видов вариабельность в числе генов в популяции может иметь адаптивный характер.

8. Низкомолекулярные БТШ вносят существенный вклад в термоустойчивость организмов.

9. Мобильные элементы играют важную роль в регуляции активности и эволюции генов теплового шока.

Практическая ценность. Полученные в ходе исследований результаты важны для понимания механизмов адаптации организмов к изменяющимся условиям окружающей среды. В условиях глобального изменения климата и загрязнения окружающей среды, эти знания могут быть полезными для сохранения вымирающих видов. Полученные данные представляют ценность для создания практически важных трансгенных животных и растений, способных жить и размножаться в экстремальных условиях внешней среды.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 6-й Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (29 июня – 5 июля 2003 г., Санкт-Петербург – Москва); 11-й Международной Конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» в сессии «Молекулярные и клеточные аспекты биологии стресса» (6 – 10 октября 2003 г., Санкт-Петербург); 1-м Международном Конгрессе по роли ответа на стресс в биологии и медицине (Квебек, Канада, 2003 г.); на международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Ереван, 8 – 11 сентября 2005 г.); на международной конференции "Генетика в России и мире" (Москва, 28 июня – 2 июля 2006 г.); на конференциях «Динамика генофондов» 2006, 2007 гг., на 13 Международной Конференции по молекулярным механизмам старения (Квебек, Канада, май 2009 г.).

Вклад автора. Основные результаты получены лично и совместно с Евгеньевым М.Б., Ульмасовым Х.А., Гарбузом Д.Г., Молодцовым В.Б., Шиловой В.Ю., Зеленцовой Е.С.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 статей в научных рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, описания материалов и методов, пяти глав, посвященных выявлению основных молекулярных механизмов регуляции генов бтш при адаптации организмов к различным условиям обитания, выводов, списка цитируемой литературы, в который входит _____ ссылки. Работа изложена на_____страницах, сдержит ______ рисунков и _____ таблицы.

Благодарности. Автор благодарит всех сотрудников Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации за помощь и поддержку в работе, особенно д.б.н. проф. М.Б. Евгеньева, который инициировал весь проект и все годы активно участвовал в экспериментах, во всех обсуждениях и анализе результатов. Автор весьма признателен за активное участие в работе Ульмасову Х.А, Ляшко В.Н., Караванову А.А., Зеленцовой Е.С., Мяснянкиной Е.Н., Гарбузу Д.Г., Шиловой В.Ю., Молодцову В.Б., Шостак Н.Г. Автор благодарит за поддежку и дружеское участие сотрудников Лаборатории подвижности генома во главе с акад. Ильиным Ю.В.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Изучение молекулярных механизмов адаптации у холоднокровных животных из контрастных по температуре экологических ниш

1.1. Экспрессия БТШ70 и HSF у ящериц. Для изучения роли БТШ в адаптации целого организма к определенным условиям обитания, в качестве объекта исследования мы использовали разные виды ящериц, населяющих пустыни Средней Азии. Для сравнения с ними мы выбрали вид из средней полосы, живущий в условиях холодного и умеренного климата (живородящая ящерица – Lacerta vivipara). Среди пустынных видов для подробных исследований выбрали ящериц, активных в дневное время суток (песчаная круглоголовка –Phrynocephalus interscapularis) и в ночное (каспийский геккон – Caspian gecko).

Проведенное нами сравнение уровня синтеза БТШ70 у видов ящериц трех указанных выше категорий показало, что активные днем пустынные ящерицы характеризуются заметным уровнем БТШ70 в клетках и при нормальной температуре, у ночных уровень БТШ70 при нормальной температуре значительно ниже, а у видов ящериц средней полосы БТШ70 в клетках в норме почти полностью отсутствует (рис. 1).

1  2 3

Рис. 1. Иммуноблот-анализ уровня БТШ70 для круглоголовки (1), живородящей ящерицы (2), каспийского геккона (3) в нормальных условиях (25С).

Интересно было выяснить, колеблется ли уровень синтеза БТШ70 у одного из самых термофильных на земле животных, песчаной круглоголовки, в норме в течение дня, в связи с естественными колебаниями температуры воздуха, почвы и тела животного. Мы показали, что тепловой шок у ящериц вызывает активный синтез двух изоформ БТШ70: БТШ68(-) и БТШ68(+). Одна изоформа, БТШ68(+), синтезируется преимущественно при ТШ, а другая, БТШ68(-), при нормальных условиях, при умеренном ТШ, а также при критических для жизни температурах, когда синтез всех других белков подавлен (Ulmasov et al., 1999).

Для выявления возможных колебаний в синтезе БТШ70 в зависимости от изменения температуры тела ящериц, в течение дня in vivo вводили 35S-L-метионин в тело песчаных круглоголовок, отловленных в различное время светового периода суток. Через час после введения метки из печени выделяли белки. После разделения методом двумерного

Рис. 2. Динамика колебаний: температуры тела – 1; синтеза БТШ68(+) – 2 и БТШ68(-) – 3 у песчаной круглоголовки в светлый период суток.

электрофореза выделенных из печени белков, из геля вырезали зоны, соответствующие БТШ68(-) и БТШ68(+), и определяли уровень включенного 35S-L-метионина. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 2.

Из графика видно, что уровень синтеза БТШ70 в клетках этого вида ящериц имеет положительную корреляцию с колебаниями температуры тела животного, достигающей максимума в середине дня, во время дневной жары. Следует отметить, что высокий уровень синтеза БТШ сохраняется даже после снижения температуры тела до 30 – 35°С. (Ульмасов и др., 1997; Ulmasov et al., 1999).

Чтобы выяснить, обеспечивается ли высокий уровень накопления БТШ70 на стадии транскрипции, или же он достигается за счет высокой стабильности самих БТШ70, мы провели анализ экспрессии мРНК бтш70 в норме и после ТШ у живородящей ящерицы и круглоголовки. Проведенный Нозерн-анализ показал примерно одинаковый уровень накопления мРНК бтш70 после ТШ (42°С 1 ч) для обоих видов, при значительно более высоком конститутивном (при 25°С) уровне синтеза мРНК у круглоголовки (рис. 3).

  К.к  Ж.я.к К.ТШ  Ж.я.ТШ  Рис. 3. Нозерн-блот гибридизация с меченым

фрагментом гена бтш70 Xenopus laevis. К.к и К. ТШ – круглоголовка, контроль и тепловой шок, Ж.я.к и Ж.я.ТШ – живородящая ящерица, контроль и ТШ.

Различия в уровне мРНК бтш70 и БТШ70 в норме могут достигаться с помощью разных молекулярных механизмов. Одним из них, возможно, является изменение числа генов бтш70 в ходе эволюции у южных и северных видов ящериц. Для проверки этой гипотезы был проведен анализ по Саузерну геномной ДНК, выделенной из песчаной круглоголовки и живородящей ящерицы. При обработке геномной ДНК ферментами рестрикции с последующей гибридизацией с меченым зондом (ген бтш70 Xenopus laevis), получена идентичная картина как по паттерну, так и по интенсивности полос гибридизации.

Исходя из полученных результатов, можно предположить сходную организацию генов бтш70 и равное число (вероятно 2 – 3) их копий у сравниваемых видов. То есть, наблюдаемые нами различия в уровне экспрессии БТШ70 у этих видов, скорее всего, обусловлены различиями в системе регуляции синтеза этих белков.

На стадии транскрипции регуляцию осуществляют факторы транскрипции ТШ (HSF – позитивный регулятор и CHBF – негативный). Было интересно выяснить, имеются ли различия в уровне мРНК hsf и соответствующего белка у изучаемых видов ящериц. Нельзя было исключить и вероятность того, что организация и число копий самих генов hsf различно. Для выяснения этого вопроса был проведен Саузерн-анализ с меченой пробой hsf L. vivipara. Паттерн гибридизации ДНК круглоголовки и живородящей ящериц, обработанных ферментами рестрикции, с пробой к гену hsf, совершенно различен. Это свидетельствует в пользу сильной дивергенции этих генов, а также о возможном их количественном различии, в отличие от изученных у этих же видов генов бтш70. Для выяснения имеющихся различий в уровне мРНК hsf и, соответственно, белка у контрастных по термоустойчивости видов ящериц до и после ТШ были проведены Нозерн- и Вестерн-анализы.

А  Б

Рис. 4. Анализ уровня экспрессии HSF (А и Б). А. Нозерн анализ РНК (1, 2 – контроль, круглоголовка и живородящая ящерица. 3, 4 – ТШ, круглоголовка и живородящая ящерица (см. рис. 3) с меченой пробой первого экзона гена hsf L. vivipara. Б. Иммуноблот-анализ уровня HSF для круглоголовки (1, 2), живородящей ящерицы (3, 4), каспийского геккона (5, 6) при 25 С (1, 3, 5) и после шока в 42 С в течение 1 ч (2, 4, 6).

Из рисунка 4А видно, что у круглоголовки уровень синтеза мРНК hsf значительно ниже, чем у живородящей ящерицы. Для подтверждения результатов Нозерн-гибридизации был проведен сравнительный анализ содержания общего количества HSF методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к HSF1 человека (рис. 4Б). Для каспийского геккона характерна единственная полоса иммунопреципитации с антителами к HSF в районе 75 кДа, для живородящей ящерицы, кроме сходной по молекулярной массе полосы, обнаружена вторая в 77 кДа. Обе полосы характеризуются большей интенсивностью у живородящей ящерицы в сравнении с полосами у круглоголовки. Таким образом, данные Нозерн- и Вестерн-анализа подтверждают предположение, сделанное на основе Саузерн-анализа о возможности существования различий в количестве и организации генов HSF у данных видов.

Совокупность полученных результатов указывает на возможную взаиморегуляцию различных компонентов системы ТШ у сравниваемых видов. Суммарное содержание HSF позитивно коррелирует с уровнем индукции синтеза БТШ70 при ТШ и негативно – с внутриклеточным уровнем БТШ70 при нормальной температуре. Биологическое значение установленного феномена может состоять в том, что виды южного происхождения, с исходно высоким внутриклеточным содержанием БТШ70, регулярно подвергающиеся ТШ, не испытывают необходимости в резком увеличении количества этих белков при незначительном повышении температуры. При этом спасающую функцию берут на себя конститутивно присутствующие БТШ70. Виды северного происхождения, редко

  А  Б

Рис. 5. Электрофорез меченных in vivo 35S L-метионином белков, после различных температурных воздействий, из печени живородящей ящерицы и каспийского геккона. А – живородящая ящерица, Б – каспийский геккон.

испытывающие в процессе жизнедеятельности резкие колебания температуры, имеют исходно низкий уровень БТШ70, но высокий конститутивный уровень HSF. Высокий уровень HSF в клетках этих видов обеспечивает быструю и интенсивную индукцию БТШ при ТШ. Из рис. 5 видно, что у живородящей ящерицы интенсивность включения метки в БТШ70 при температурах 37 – 42С значительно выше, чем у каспийского геккона. Также видно, что у северного вида индукция БТШ происходит при более низкой температуре, а у южного – при более высоких температурах. Иными словами, у северных видов порог индукции БТШ ниже, а уровень индукции выше, чем у южных.

Известно, что интенсивность транскрипции зависит от эффективности связывания факторов транскрипции с промоторным участком генов БТШ при ТШ, которая определяется сродством факторов транскрипции к элементам теплового шока (HSE). При этом возможна конкуренция между позитивным фактором транскрипции HSF и негативными регуляторами транскрипции (CHBF). Для исследования взаимодействия факторов транскрипции с промотором у контрастных по теплоустойчивости видов ящериц было проведено исследование комплексов белок – ДНК (HSE).

1.2. Исследование комплексов факторов транскрипции с элементами теплового шока. Активация HSF сопровождается его тримеризацией и связыванием с HSE. Анализировали связывание HSF и других факторов транскрипции с HSE, используя метод электрофореза в неденатурирующих условиях. При этом образцы белковых экстрактов различных видов ящериц до и после ТШ инкубировали с меченым 32P HSE-содержащим олигонукдеотидом. Анализ эффективности связывания HSE с факторами транскрипции в суммарных белковых экстрактах ящериц при нормальных условиях и сразу после ТШ (30 мин) представлен на рис.6.

Из рисунка видно, что в условиях опыта существуют три различных комплекса: I – комплекс характерен для южных видов в нормальных условиях; II – комплекс присутствует в

Рис. 6. Анализ связывания факторов транскрипции с HSE.

Каспийский геккон (1, 2); круглоголовка (3 – 6); живородящая ящерица (7 – 8); контроль 25°С (1, 3, 7); после ТШ 42°С (4, 8); 45°С (2, 5); 49° С (6). Стрелки указывают расположение HSE-связывающих комплексов (I, II, III).

нормальных условиях у всех видов, при этом его содержание заметно выше у живородящей ящерицы; III – комплекс появляется после ТШ. При ТШ наблюдается уменьшение связывания для комплекса II и его полное исчезновение при критических для жизни ящериц температурах (круглоголовка – 49°С 20 минут). Важно отметить, что у южных видов (особенно ярко это выражено у геккона) в контроле (25°С) наблюдается комплекс III. Присутствие HSF в изучаемых комплексах можно доказать замедлением подвижности рассмотренных выше комплексов после инкубации их с антителами к HSF (рис. 7).

Рис. 7. Анализ специфичности связывания факторов транскрипции. Круглоголовка (1 – 2); живородящая ящерица (3 – 4); 1, 2 – ТШ 45С; 3, 4 – ТШ 42С; 2, 4 – добавлены антитела к HSF.

Резкое замедление подвижности комплексов ΙΙΙ (2 и 4) после инкубации c антителами к HSF ясно показывает, что самый медленный комплекс – III появляется в результате связывания транскрипционного фактора HSF с HSE.

У контрастных по температуре среды обитания ящериц могут различаться пороговая температура индукции БТШ, кинетика накопления БТШ, а также продолжительность их синтеза. Изучая динамику связывания HSF и CHBF с HSE после ТШ, можно установить эти характеристики (рис. 8).

Видно, что температурный порог активации HSF и его связывания с HSE для живородящей ящерицы наступает уже при 34С, а при шоке 42С 15 мин наблюдается более

Рис. 8. Анализ интенсивности связывания факторов транскрипции с HSE при ТШ и в период восстановления. Круглоголовка (1 – 6); живородящая ящерица (7 – 13). Контроль (1 и 7); ТШ 34С 15 мин (2 и 8); ТШ 42С 15 мин (3 и 9); ТШ 42С 30 мин (4); ТШ 42С 60 мин (5 и 10); ТШ 42С 60 мин и восстановление в течение 60 мин (6 и 11); 3 ч (12); и 6 ч (13).

мощное связывание, чем у круглоголовки. Процесс возврата в нормальное состояние у живородящей ящерицы также продолжается значительно дольше, чем у круглоголовки (6 ч против 1 ч).

Другой характеристикой эффективности функционирования системы ТШ может быть степень сродства HSF и CHBF к HSE. Были поставлены эксперименты по конкурентному связыванию HSF и CHBF с HSE, которые выявили большее сродство HSF к HSE для пустынных видов в сравнении с обитателем средней полосы (L. viviparа).

Таким образом, в экспериментах по связыванию белковых экстрактов с HSE были обнаружены следующие закономерности.

Повышенная экспрессия БТШ70 у южных видов в норме (геккон и круглоголовка) контролируется на уровне транскрипции и обусловлена, по-видимому, присутствием незначительного количества активной формы фактора транскрипции генов ТШ в нормальных физиологических условиях, что приводит к «подтеканию» транскрипции.

Северные виды характеризуются более низким порогом индукции и значительно более продолжительным временем связывания HSF с HSE после ТШ (6 ч против 1 ч), что обусловливает более длительное время транскрипции бтш после ТШ, и, соответственно, значительное накопление БТШ после ТШ.

Показана бльшая степень сродства HSF к промоторной части генов бтш у круглоголовки, по сравнению с живородящей ящерицей. Возможно, благодаря этому, южным видам требуется меньшее количество HSF для активации транскрипции.

Для северных видов выявлена более значительная роль негативного фактора в регуляции транскрипции генов ТШ, чем, возможно, обусловлено отсутствие связывания HSF с HSE в нормальных условиях.

Проводимые нами исследования реакции на ТШ и синтеза БТШ у пустынных организмов не ограничились пойкилотермными (холоднокровными) организмами. Следовало выяснить, справедливы ли обнаруженные нами корреляции между синтезом БТШ и термоустойчивостью у теплокровных животных.

2. Синтез БТШ у народов, населяющих пустыни

и области с умеренным климатом

На следующем этапе наших исследований мы решили сравнить характер синтеза БТШ у двух этнических групп людей: русских, проживающих в центральных районах России, и туркмен, живущих в Средней Азии. Проведенный сравнительный анализ показал, что фибробласты туркмен после длительного ТШ 42.5°С в течение 6 ч способны в полной мере синтезировать весь набор белков, в то время как фибробласты русских полностью прекращают синтез всех белков после такого воздействия (рис. 9). При сравнении выживаемости фибробластов (способности образовывать клоны) после длительного ТШ,

АБ.

Рис. 9. Флюорограммы двумерных электрофорезов белков, синтезируемых в фибробластах кожи человека (А – туркмены; Б – русские). Белки метили 14С-аминокислотами (37°С, 1 ч после теплового шока 42,5°С, 6 ч). Стрелками показана индукция БТШ70 (ас – актин).

оказалось, что, как и ожидали, фибробласты туркмен характеризовались значительно более высокой частотой выживания, по сравнению с фибробластами русских (Lyashko et al., 1994).

Ранее в работе Ульмасова (Ulmasov et., 1993) на лимфоцитах верблюда (Camelus dromedaries) было показано, что они способны синтезировать БТШ при более высоких температурах, по сравнению с лимфоцитами человека.

В сумме, результаты этих исследований свидетельствуют о том, что и у теплокровных организмов, обитающих в условиях жарких пустынь, выработались молекулярные механизмы для обитания в экстремальных условиях.

3. Внутривидовые различия по термоустойчивости на примере

Drosophila melanogaster

При исследовании механизмов адаптации к высокой температуре у ящериц приходилось вести сравнение между филогенетически весьма отдалёнными видами, резко отличающимися по температуре экологических ниш. В связи с этим возникал вопрос: не обусловлены ли найденные различия в системе ответа на ТШ у видов, контрастных по температуре обитания, простой дивергенцией между видами (Garland and Adolph, 1994), либо они действительно вызваны адаптацией к высоким температурам среды обитания. С этой точки зрения наиболее корректно изучать эволюцию генов, кодирующих белки семейства БТШ70, их структуру и характер экспрессии у близкородственных видов, различающихся по климатическим условиям среды обитания и характеризующихся разным уровнем естественной термальной адаптации. Удобной модельной системой для изучения структуры и эволюции генов ТШ являются различные виды или популяции рода Drosophila.

Адаптация к ТШ у мух рода Drosophila, по-видимому, шла отличным путем, чем у ящериц. У разных видов ящериц мы обнаружили одинаковое число генов бтш70. У всех видов мух рода Drosophila произошла амплификация индуцибельного гена бтш70. Так, у D. auraria в единственном локусе находятся 3 копии бтш70, а виды D. simulans и D. mauritiana содержат в двух локусах по 2 тандемные копии БТШ70. У D. melanogaster произошла дальнейшая амплификация копий гена бтш70. При этом в локусах 87В и 87А расположено по 3 – 4 и 2 копии, соответственно. Структура кластера генов бтш70 у группы D. virilis не была изучена вовсе. В начале наших исследований мы остановили свой выбор на мухах вида Drosophila melanogaster. Для сравнения взяли хорошо изученную линию Oregon R (OR) и линию, обозначенную нами как Termotolerance (TT). Линия ТТ была отловлена в начале 70-х годов в центральном Чаде (Африка). В данной местности в марте-июне наблюдается колебание дневных температур в диапазоне 20 – 38 С. Как оказалось, мухи линии ТТ остаются фертильными и способными к развитию при 32С. Отловленные мухи линии ТТ в течение последних 20 лет велись в лабораторных условиях как при температуре 25С (линия Т25), так и при температуре 32С (линия Т32). При температуре выше 29С мухи OR, так же, как и все другие линии D. melanogaster, становятся стерильными. Ответ на ТШ у мух линии OR, в отличие от линий ТТ, подробно изучен. В связи с этим интересно было выяснить, отличается ли линия ТТ от OR только способностью развиваться при более высоких температурах, либо она характеризуется также более высокой устойчивостью к экстремальным шоковым воздействиям и отличается по уровню синтеза БТШ от OR.

3.1. Сравнение линий по термоустойчивости. Для ответа на этот вопрос были проведены опыты по определению критической температуры выживания (рис.10). Под критической мы понимаем температуру, при которой количество выживших мух составляет менее 1% от числа подвергнутых ТШ. Из рисунка 10A видно, что для OR критической является температура 40С, а для линий Т25 и Т32 – 40.5, 41С, соответственно. Примечательно, что при 40С выживает 75% мух линии Т32 и 25% – Т25. Известно, что предварительный слабый ТШ (35 – 37С) ведет к увеличению количества выживших мух после сильного ТШ и повышает на 1.5 – 2С критическую температуру выживания (индуцированная термотолерантность) (Krebs, 1999). Из рисунка видно (рис. 10Б, В, Г), что при индуцированной термотолерантности критическая температура выживания остается неизменной для всех рассматриваемых линий. С другой стороны, явно увеличивается количество выживших мух при температурах, близких к критической. Таким образом, установлено различие рассматриваемых линий по критической температуре выживания при схожести в динамике проявления индуцированной термотолерантности.

Рис. 10. Выживаемость мух в зависимости от ТШ (A) и индуцированной термотолерантности (Б, В, Г). По оси абсцисс указаны температуры теплового воздействия, по оси ординат – процент выживших мух через сутки после ТШ.

3.2. Сравнение уровня содержания БТШ70. Мы предположили, что основной причиной повышения термоустойчивости линий ТТ может являться повышенное содержание белков-членов семейства БТШ70. Для точного количественного определения содержания БТШ70 был использован метод иммуноферментного анализа (ИФА – ELISA). На рис. 11 представлено содержание БТШ70, накопленного в течение 1 ч восстановления после 30 мин ТШ. Представлено процентное содержание от стандарта БТШ70, выделенного из 20 нг белков, полученных из клеток Drosophila Schneider 2 после ТШ 36.5С и восстановления в течение 1 ч (25С). Результат анализа показывает, что в данных условиях OR, и ТТ достигают относительного пика индукции БТШ70 после ТШ 37С, причем у OR уровень накопления БТШ70 значительно больше, чем у ТТ.

  Рис. 11. Количественный анализ содержания индуцибельного БТШ70 в зависимости от температуры ТШ.

При более высоких температурах у OR индукция БТШ70 резко падает (до нуля при 39 С), при сохранении детектируемых данным методом количеств белка у линии Т32. После шока 38С индукция БТШ70 примерно одинакова для всех линий, поэтому данная температура была выбрана для изучения кинетики накопления БТШ70 во время восстановительного периода. Максимальное содержание БТШ70 достигается у обеих линий после 3 ч восстановления. В этом случае, у OR и Т25 накапливается белка примерно в три раза больше, чем после 1 ч. Падение до исходного уровня происходит между 5 и 6 ч. Таким образом, кинетика накопления индуцибельного БТШ70 в период восстановления после ТШ у разных линий одинакова, и различается по количеству синтезируемого БТШ70.

3.4. Анализ геномной ДНК линий ТТ и Oregon R. Обнаруженные различия в уровне индукции БТШ70 могут быть обусловлены отличиями в числе копий гена бтш70 и (или) в системе регуляции синтеза БТШ70. Для проверки первого предположения был проведен Саузерн-анализ геномной ДНК (рис. 12). Была получена идентичная картина гибридизации с пробой к гену HSF. При обработке ДНК ферментами рестрикции BamHI и HindIII и гибридизации с фрагментом гена бтш70 D. melanogaster для ДНК OR наблюдается 5 фрагментов гибридизации, каждый из которых совпадает с определенной копией гена (один с двумя копиями). При этом для линий Т25 и Т32 видно также 5 полос, но 3 из них отличаются по подвижности от полос гибридизации у OR. В случае использования других рестриктаз картина гибридизации для OR и ТТ также различна. На основании примерно одинаковой интенсивности полос гибридизации можно предположить равное число копий гена бтш70 в сравниваемых линиях (у Oregon R – шесть копий). 

5 т.п.н.

2 т.п.н.

1. т.п.н.

Рис 12. Саузерн-блот гибридизация геномной ДНК c XbaI/BamHI фрагментом гена бтш70 D. melanogaster.

Важно было выяснить, вызваны ли различия в картине гибридизации рестрикционным сайт-полиморфизмом, либо произошли какие-то существенные изменения в структуре генов бтш70, приведшие к изменению уровня экспрессии БТШ70. Методом ПЦР у линии ТТ в 5’-районе одной из копий гена бтш70 была выявлена вставка. Оказалось, что в Ва-копию гена бтш70 между первым и вторым HSE произошло внедрение ретротранспозона Jockey (Zatsepina, 2001; Lerman, 2003). Последовательность депонирована в GeneBank под номером AY032740. Мутации, затрагивающие HSE, или встраивания МЭ между этими элементами, особенно между HSE1 и HSE2, существенно (по нашим данным, примерно на 75%) снижают уровень транскрипции гена. Таким образом, снижение уровня экспрессии БТШ70 в линии ТТ можно объяснить внедрением МЭ в промотор одного из генов бтш70. 

Сейчас убедительно показано, что повышение количества БТШ70 у D. melanogaster выше определенного уровня приводит к повышенной смертности во время развития (Feder, 1999). Таким образом, возможно, число генов и, соответственно, уровень индукции БТШ70 у D. melanogaster достиг оптимального уровня, а для дальнейшего повышения термоустойчивости вовлекаются другие механизмы.

3.5. Синтез белков при тепловом шоке. Картина синтеза БТШ70 для D. melanogaster до и после ТШ хорошо изучена. Наряду с белком с молекулярной массой 70 кДа, семейство БТШ70 включает также индуцируемый тепловым шоком белок с молекулярной массой 68 кДа, который кодируется уникальным геном, расположенным в локусе 95D (Palter et al., 1986). При этом, как индуцибельные (БТШ68 и БТШ70), так и конститутивно синтезируемые члены семейства БТШ70 имеют общие антигенные детерминанты, что обусловливает их

Рис.13. Включение in vivo 35S L – метионина в белки слюнных желез личинок линий ТТ (слева) и OR (справа) после ТШ 39С 20 мин.

а – актин; b – БТШ22; 

d, c, e – белки, индуцируемые ТШ в линии ТТ.

совместное обнаружение методом иммуноблоттинга. Кинетику синтеза БТШ de novo после шока можно проследить, проанализировав включение in vivo 35S-L-метионина в белки слюнных желез личинок.

Из рис. 13 видно преимущественное включение метки после ТШ в белки семейства БТШ70, БТШ83 и низкомолекулярные БТШ (22 – 27кДа и 40 кДа). У линии ТТ повышена экспрессия низкомолекулярных БТШ (нмБТШ), по сравнению с OR, а также обнаруживается новая изоформа БТШ70 после ТШ. Чтобы однозначно определить, какие белки относятся к семейству БТШ70, был проведен иммуноблоттинг разделенных методом двумерного электрофореза белков с антителами 7.10.3 (Lindquist Lab.), узнающими индуцибельные и конститутивные члены семейства БТШ70. Результаты, отраженные на рис. 14, указывают на принадлежность рассматриваемых белков к семейству БТШ70.

Рис. 14. Вестерн-блот анализ белков, разделенных двумерным электрофорезом с использованием антител 7.10.3 к белкам семейства БТШ70 для линий OR и ТТ. 1 – при 25С; 2 и 3 – после ТШ 37.5С 30 мин. 1 ч и 3 ч восстановления при 25С, соответственно. Окрашенный серебром актин служит для нормализации количества белка.

Таким образом, анализ белков после ТШ методом двумерного электрофореза выявил следующие различия между линиями OR и ТТ: 1) снижение индукции БТШ68 у линии ТТ, по сравнению с OR; 2) при температурах ТШ, близких к критическим, у линии ТТ видна индукция дополнительных низкомолекулярных БТШ; 3) существование дополнительной изоформы БТШ69, принадлежащей семейству БТШ70, для линии ТТ. Таким образом, у линии ТТ повышение терморезистентности происходит не за счет увеличения накопления БТШ70, а, возможно, связано с индукцией дополнительного белка семейства БТШ70 (БТШ69), а также с повышенной экспрессией ряда низкомолекулярных БТШ.

4. Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов бтш70 у видов филады virilis, обладающих различной термальной адаптацией

Для дальнейших исследований были выбраны несколько видов Drosophila, относящихся к филаде virilis с мало изученной системой ответа на ТШ. Группа virilis является одной из наиболее древних групп подрода Drosophila, что позволяет исследовать возможные этапы эволюции генов бтш70 путём анализа их структуры и сравнения ее со структурой генов других видов (D. melanogaster). Время дивергенции видов D. virilis – D. melanogaster ~ 50 миллионов лет. Данные виды обитают в различных климатических поясах и, соответственно, должны отличаться по приспособляемости к воздействию высоких температур. Сравнивали пары видов, контрастные по уровню термальной адаптации: D. virilis (южный) – D. lummei (северный) и D. novamexicana (южный) – D. texana (северный). Данные пары видов способны скрещиваться в лабораторных условиях с получением частично фертильного потомства. D. virilis является предковым видом всей группы видов virilis, в пределах которой хорошо изучены филогенетические отношения. Время дивергенции видов D. virilis – D. lummei составляет ~ 4 – 5 млн. лет. Можно предположить, что изменения в структуре и характере экспрессии генов ТШ у этих близких видов связаны с формированием термальной адаптации, а не обусловлены изменениями в ходе эволюционной дивергенции. В качестве дополнительного объекта исследования был взят вид D. montana (филада montana), распространенный в пределах Северной Европы и США и, вероятно, близкий по термочувствительности к D. lummei.

4.1. Изучение термоустойчивости. Для определения устойчивости к кратковременному интенсивному тепловому шоку использовали мух из популяции, поддерживаемой при 25°С.

Таблица 1. Значения LT50 и критической температуры для разных видов и линий группы

virilis и вида D. mojavensis.

Вид

Линия

Географическое происхождение, широта

LT50, °С

Т критическая

D. virilis

9

101

160

1433

T-53

T-61

Т-40

Батуми, Грузия (42°N)

Япония (~ 32 – 36°N)

Япония (~ 32 – 36°N)

Южная Англия (53°N)

Ташкент, Узбекистан (41°N)

Ташкент, Узбекистан (41°N)

Ташкент, Узбекистан (41°N)

41,3

41,2

40,8

41,1

41,2

41,1

42,5

42,5

41,5

42,0

42,5

42,0

D. lummei

200

202

207

1102

1109

Москва (55°N)

Краснодар (45°N)

Краснодар (45°N)

Финляндия (60°N)

Финляндия (60°N)

40,1

40,1

40,1

39,9

40,2

41,0

41,0

41,0

41,0

41,0

D. texana

423

Техас, США (32°N)

40,0

41,0

D.montana

1071.0

Финляндия (60°N)

39.7

41.0

D. novamexicana

424

Невада, США (32 – 37°N)

40,8

42,0

D. mojavensis

Мексика (30°N)

41,8

43,5

Определяли LT50 и критическую температуру. Число выживших мух определяли через 48 ч после ТШ. Из таблицы 1 видно, что все изученные линии D. lummei и D. montana характеризуются меньшей термоустойчивостью, чем линии D. virilis.

В целом, значения LT50 и критической температуры для D. virilis на 1,0 – 1,5°С выше, чем для D. lummei и D. montana. D. novamexicana – вид, обитающий в условиях аридной зоны, проявляет более высокую термоустойчивость, чем D. texana, и схож по этому показателю с D. virilis.

4.2. Определение индуцируемой термоустойчивости у видов и линий группы D. virilis. В наших экспериментах по изучению индуцированной термоустойчивости мы подвергали мух предварительному ТШ интенсивностью 35,0, 36,0 и 37,0С в течение 30 мин. Тепловой шок высокой интенсивности давали через 1 ч, 3 ч или сразу после предварительного ТШ. У D. lummei индуцированная термотолерантность не обнаруживается. D. lummei – первый изученный вид Drosophila, у которого практически отсутствует индуцируемая термоустойчивость. Для D. virilis (предварительный ТШ 36 – 37С), была выявлена высокая индуцированная термотолерантность. Исходя из величины предварительного ТШ и данных по накоплению БТШ70 (см. ниже), можно предположить, что у D. virilis индуцированная термоустойчивость обусловливается индукцией и накоплением БТШ, предохраняющих клетки от более интенсивного ТШ.

4.3. Определение термоустойчивости реципрокных гибридов D. virilis и D. lummei. Гибриды были получены путём реципрокных скрещиваний линии D. virilis 9 и линии D. lummei 200. Было интересно сравнить термоустойчивость родительских линий D. virilis и D. lummei с термоустойчивостью межвидовых гибридов для того, чтобы определить, существует ли доминирование термоустойчивого, либо термочувствительного фенотипа.

Рис. 15. Базовая и индуцированная термоустойчивость гибридов D. virilis и D. lummei.

(pt 36,0C – предварительный ТШ 36С)

Гибриды в обоих направлениях показывали приблизительно одинаковую базальную термоустойчивость. В отличие от D. lummei, гибриды проявляют достоверную индуцированную термоустойчивость при действии предварительного ТШ в обоих направлениях скрещивания (рис. 15).

4.4. Изучение общего белкового синтеза при ТШ у D. virilis и D. lummei. Важнейшим показателем степени воздействия теплового шока на организм является уровень синтеза белка в клетках. Для определения воздействия ТШ на общий белковый синтез были поставлены эксперименты по определению включения 35S-L-метионина в общий пул синтезируемых белков в клетках слюнных желёз личинок третьего возраста. В эксперименте использовали линию D. virilis 9 и линию D. lummei 200. Полученные результаты суммированы на рис. 16. Видно, что интенсивность включения метки в белки через 1 ч после ТШ 37,5°С не отличается от контрольного значения (25°С), т. е., происходит интенсивное

включение метки в БТШ. После восстановительного периода продолжительностью 3 ч, уровень включения метки в белки выше у D. lummei, чем у D. virilis. Это связано с тем, что, синтез БТШ у D. lummei протекает более интенсивно и в течение более длительного времени, чем у D. virilis. Кроме того, в клетках D. lummei после возвращения к нормальным условиям уровень синтеза клеточных белков для восстановления их пула в цитоплазме, вероятно, выше, чем у D. virilis. Это можно объяснить тем, что тепловой шок 37,5°С оказывает более выраженное повреждающее воздействие на D. lummei, чем на D. virilis. При температурах близких к критическим, после восстановительного периода продолжительностью 1 ч, достоверной разницы в количестве включившейся метки между D. lummei и D. virilis не наблюдается. Очевидно, у обоих видов, при температурах выше 40°С, синтез белка блокируется практически полностью. Совершенно иная картина наблюдается через 3 ч после ТШ.

Рис. 16 Интенсивность включения 35S-L-метионина в общий пул клеточных белков при ТШ разной интенсивности. По оси абсцисс – температура ТШ и время восстановления. По оси ординат – имп/мин.

Интенсивность включения метки у D. virilis превышает интенсивность включения у D. lummei в 2 раза после ТШ 40,0°С и в 3 раза – после ТШ 40,5 и 41,0°С. Это свидетельствует о восстановлении функций аппарата трансляции у D. virilis и глубоких нарушениях в механизме синтеза белка у D. lummei. При ТШ 41,0°С интенсивность включения метки в белки у D. lummei падает практически до нуля, что коррелирует с данными по выживаемости.

4.5. Накопление БТШ70 при тепловом шоке. Исходя из имеющихся литературных данных (Ulmasov, 1992; Gehring and Winner, 1995), мы предполагали, что у терморезистентных видов Drosophila будет обнаружена корреляция между повышенной термоустойчивостью и уровнем накопления БТШ70. Для проверки этой гипотезы мы провели иммуноблоттинг белков, выделенных из мух исследуемых видов и линий, с использованием моноклональных антител 7FB к индуцибельному БТШ70 и антител 7.10.3, реагирующих со всеми членами семейства БТШ70 (рис. 17).

Мух подвергали ТШ продолжительностью 30 мин, с последующим восстановительным периодом продолжительностью 1 и 3 ч, затем получали белковые экстракты для иммуноблоттинга. Выяснилось, что положительная корреляция между содержанием БТШ70 и терморезистентностью наблюдается в пределах филады D. virilis. Уровень накопления БТШ70 у D. virilis (линии 9, 101, 160) значительно превышает уровень накопления БТШ70 при соответствующих температурах у D. lummei (линия 200). У D. novamexicana (линия 424)

Рис. 17. Количественный анализ накопления индуцибельной формы БТШ70 у имаго разных видов и линий Drosophila в зависимости от ТШ. Значения даны относительно концентрации БТШ70 в линии Oregon R при 37,5°С после 1 ч восстановления.

уровень накопления БТШ70 в два раза выше, чем у D. texana (линия 423) при 37,5С. Линия D. lummei 200, с северным ареалом распространения, характеризуется более низким уровнем накопления БТШ70, по сравнению с более южными линиями 202 и 207. Особенно заметной разница в накоплении БТШ70 между парами контрастных по термоустойчивости видов становится при температурах, близких к критическим (40 – 41С). При ТШ выше 40С экспрессия БТШ70 практически полностью прекращается у D. lummei и D. texana, но сохраняется на достаточно высоком уровне у D. virilis и D. novamexicana. Эти показатели хорошо соотносятся с данными по термоустойчивости и включению радиоактивной метки в общий пул синтезируемых белков (рис. 16).

Однако, у термоустойчивой линии ТТ D. melanogaster уровень накопления БТШ70 после ТШ интенсивностью 37,5С почти в 2 раза ниже, чем у стандартной линии OR (рис.17). У D. mojavensis, наиболее термоустойчивого вида Drosophila, накопление БТШ70 значительно ниже, чем у OR, даже при максимальном уровне индукции (Krebs, 1999). По нашим данным, все линии D. virilis и изучаемая линия D. novamexicana также характеризуются более низким уровнем накопления БТШ70, по сравнению с OR (см. рис. 17), которая является наиболее термочувствительной из всех изученных линий (критическая температура выживаемости – 40,0С). Таким образом, во многих случаях наблюдается отрицательная корреляция между содержанием БТШ70 при умеренных тепловых шоках (37 – 38С) и термоустойчивостью вида или линии. Однако, при более высоких температурах все линии термоадаптированных видов накапливают БТШ70 в количествах, многократно превышающих накопление у термочувствительных видов. Кроме того, максимум индукции БТШ70 у D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis сдвинут в сторону более высоких температур по сравнению с D. lummei, D. texana и OR (см. рис. 17). Таким образом, можно сделать вывод о преимущественной защитной роли БТШ70 именно при высоких температурах. 

4.6. Определение кинетики индукции мРНК БТШ70. Представляло интерес сопоставить данные по накоплению БТШ70 и кинетике синтеза мРНК бтш70. Сравнивали линию D. lummei 200 и линии D. virilis 9 и 160 (см. рис. 18). Видно, что у D. lummei полностью прекращается синтез мРНК бтш70 при 40,0 и 41,0С. Восстановление транскрипции происходит через час после ТШ 40,0С. Накопление белка при этом крайне незначительно даже после 3-х часов восстановительного периода (см. выше). У D. virilis 9 синтез мРНК бтш70 сохраняется как при 40,0, так и при 41,0С. Таким образом, через 1 ч после ТШ 40,0С у линии D. lummei 200 наблюдается уровень транскрипции, сравнимый с линиями D. virilis 9 и 160, тогда как накопления белка, судя по данным Вестерн-анализа, не происходит.

Рис. 18. Уровень индукции мРНК бтш70 при различных значениях ТШ. 1 – 25°С, 2 – 31,5°С, 3 – 37,5°С, 4 – 40,0°С, 5 – 41,0°С, 6 – 40,0°С, 1 ч восстановления. Внизу – гибридизация с зондом к гену актина D. melanogaster.

Следовательно, отсутствие синтеза БТШ70 у D. lummei при сублетальных температурах можно объяснить подавлением или нарушением трансляции мРНК бтш70. Аналогичную картину (транскрипцию РНК без последующего синтеза белка у OR) мы наблюдали при сравнении ответа на ТШ 39°С линий D. melanogaster OR и ТТ.

4.7. Исследование ДНК-связывающей активности HSF. Методом связывания и торможения фрагмента ДНК в геле определяли температуру тримеризации HSF. У D. lummei 200 комплекс HSF-HSE образуется при 31С, а у D. virilis 160 – при 32С. Это отличие свидетельствует о более низком пороге индукции генов бтш у северного вида D. lummei, по сравнению с более южным видом D. virilis. При температурах 37,5 – 40,0С существенных отличий в связывании HSF с HSE не наблюдается. Следует отметить тот факт, что при ТШ 40 и 41С у D. lummei связывание HSF с ДНК имеет место, а транскрипции генов бтш70 не происходит. По-видимому, при столь высокой температуре ДНК-связывающая активность HSF сохраняется, но происходит нарушение функций других компонентов аппарата транскрипции. Транскрипционная активность генов бтш70 восстанавливается только через 1 ч после ТШ 40С (см. выше). Сходный характер связывания HSF с HSE у сравниваемых видов при высоких температурах позволяет предположить, что разница в накоплении белкового продукта у исследуемых видов объясняется не особенностями активации HSF, а, скорее всего, разницей в числе генов бтш70.

4.8. Анализ спектра изоформ БТШ70. Представляло интерес сравнить паттерн индукции БТШ70 у D. lummei и D. virilis. Для этого белки разделяли методом двумерного электрофореза и детектировали методом окрашивания азотнокислым серебром, радиоавтографией радиоактивного метионина, либо с помощью иммуноблоттинга. Характер синтеза БТШ у видов группы virilis изучался Sinibaldi и Storti (Sinibaldi and Storti, 1982).

 

Рис. 19. Схема паттерна и серологические свойства БТШ70 разных видов Drosophila. Указаны значения градиента рН и молекулярные массы в кДа.

Нами был проведён анализ с более высоким разрешением зоны 70 кДа и изучен характер экспрессии БТШ при различных температурах. Паттерн БТШ70 разных линий и видов внутри группы D. virilis имеет сходные характеристики, сильно отличаясь от паттерна у D. melanogaster и D. mojavensis (рис. 19). У всех исследованных видов и линий группы D. virilis индуцибельные БТШ70 делятся на две группы, отличающиеся по молекулярной массе и изоэлектрической точке, причём каждая группа может включать несколько изоформ. Молекулярные массы белков, входящих в каждую группу, были ориентировочно определены методом электрофореза по маркеру как 70 и 72 кДа.

Практически каждая исследованная линия D. virilis и D. lummei имеет индивидуальный паттерн БТШ70. Интересно, что у всех видов группы D. virilis только группа БТШ70 с молекулярной массой 70 кДа узнаётся антителами 7FB. Белки с молекулярной массой 72 кДа реагируют только с антителами 7.10.3, то есть их серологические свойства напоминают свойства БТШ68 D. melanogaster. Паттерн конститутивных БТШ70, реагирующих с антителами 7.10.3, не отличается у всех рассматриваемых видов, что, очевидно, говорит об их более высокой эволюционной консервативности. Чтобы классифицировать две группы БТШ70 видов филады D. virilis, был предпринят пептидный анализ белков, относящихся к обеим группам. Подтвердилось, что белок с массой 70 кДа и изоэлектрической точкой ~ 6,1 у видов филады D. virilis является гомологом БТШ70 D. melanogaster, а белок с массой 72 кДа и изоэлектрической точкой ~ 5,75 гомологичен БТШ68.

Результаты секвенирования гена бтш68 выявили удлинение С-концевого домена, что объясняет бльшую молекулярную массу белка (Velikodvorskaia et. al., 2005).

4.9. Изучение паттерна других групп БТШ, индуцируемых тепловым шоком у видов группы virilis. Кроме БТШ70, была изучена экспрессия других семейств БТШ у видов группы virilis. У всех термоадаптированных разновидностей наблюдается более интенсивное включение L-35S-метионина в низкомолекулярные БТШ и БТШ40.

Это было показано на примере линий 9, 101, 160, 1433, Т53 и Т61 D. virilis, линии 424 D. novamexicana, D. mojavensis и линии ТТ D. melanogaster. У D. lummei (линии 200, 202, 207, 1102 и 1109), D. texana (линия 423) и D. melanogaster (линия OR) включение метки в низкомолекулярные БТШ и БТШ40 происходит со значительно более низкой интенсивностью (рис. 20). При субкритических температурах у них снижается уровень включения метионина в БТШ70. Увеличение уровня экспрессии БТШ40 и низкомолекулярных БТШ у видов, обитающих в жарком климате и подверженных действию более высоких температур, может играть значительную роль в формировании термальной адаптации (см. ниже).

1  2

Рис. 20. Двумерный электрофорез белков, меченных 35S-L-метионином. 1 – D. lummei 200, 2 – D. virilis 9.

Все точки – 40,5С, 3 ч восстановления. Числами указаны молекулярные массы белков в кДа, 70с – конститутивные формы БТШ70.

4.10. Вклад нмБТШ в термоустойчивость. Из ряда работ известно, что большой вклад в термоустойчивость вносит семейство низкомолекулярных БТШ (Tanguay, 2006). Результаты двумерного электрофореза, показывают, что у более термоустойчивых видов: – D. virilis и D. novamexicana включение 35S -L-метионина в группу низкомолекулярных белков 22 – 27 кDa и 40 кDa значительно выше, чем у линий D. lummei и D. texana.

Аналогичная картина характерна для линий D. melanogaster OR и ТТ, а именно, у линии ТТ наблюдается более значительное включение 35S-L-метионина в группу с мол. массой 40 кD и 22 – 27 кD. Нами был подробно изучен синтез нмБТШ у видов Drosophila с разным уровнем термальной адаптации – D. virilis, D. lummei, и D. melanogaster OR. Количественное определение содержания нмБТШ, у всех трёх видов методом Вестерн-блоттинга с антителами, реагирующими с нмБТШ, с последующей денситометрией автографов, выявило более высокое содержание нмБТШ у D. virilis по сравнению с D. lummei и D. melanogaster как при контрольной температуре (25С), так и при ТШ различной интенсивности (рис. 21).

Рис. 21. Результаты исследований нмБТШ у разных видов Drosophila. Содержание нмБТШ у

D. melanogaster OR, D. lummei 200 и D. virilis 9 в зависимости от значений ТШ и времени восстановления. Значения даны относительно концентрации нмБТШ у OR при 37.5ОС и 1 ч восстановления.

Спектр изоформ нмБТШ у D. melanogaster OR значительно отличается от сходных друг с другом спектров изоформ нмБТШ у линий D. virilis и D. lummei (рис. 22.) При этом следует отметить большее число изоформ у термоустойчивого вида D. virilis, чем у D. lummei и D.

melanogaster OR.

Рис. 22. Двумерный электрофорез белков, выделенных из слюнных желез личинок, меченных 35S-L-метионином в течение 1 ч после ТШ (37.5ОС 30 мин).

4.11. Анализ структуры кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei. Исходя из имеющихся литературных данных о важной роли БТШ70 в термальной адаптации у разных организмов, представляло интерес определить структуру кластера генов бтш70 у используемых в работе видов и линий, контрастных по термоустойчивости. Интересно также выяснить, обусловливается ли повышенный синтез БТШ70 при ТШ у некоторых линий D. virilis увеличением числа копий гена бтш70 или изменениями в их структуре. Для выяснения этих вопросов был проведён Саузерн-анализ геномной ДНК разных линий D. virilis и D. lummei с использованием различных зондов к кодирующей части генов бтш70. Для анализа использовались ферменты рестрикции, сайты которых находятся преимущественно вне кодирующей последовательности генов. При обработке ДНК всех линий D. virilis рестриктазой XbaI образуются три фрагмента ДНК длиной 3, 4 и 10 т.п.о., гибридизующиеся как с 5’-, так и с 3’-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster, меченными 32Р (рис. 23).

Таким образом, сайты XbaI расположены за пределами структурной части генов и консервативны для всех линий D. virilis. Гибридизация в области фрагмента длиной 4 т.п.о. у разных линий D. virilis имеет разную интенсивность, что позволяет предположить наличие разного числа копий данных фрагментов и, соответственно, входящих в их состав генов бтш70 у разных линий. Внутривидовые различия в числе копий бтш70 ранее не были описаны в литературе.

Рис. 23. Саузерн-анализ геномной ДНК из разных линий D. virilis и D. lummei. Гибридизация с PCR-фрагментом гена бтш70 D. lummei 200. 1 – D. lummei 200; 2 – D. lummei 202; 3 – D. lummei 1102; 4 – D. virlis 160; 5 – D. virlis 1433; 6 – D. virilis T-53; 7 – D. virilis 9; 8 – D. virilis T-40.

4.12. Определение числа копий гена бтш70 у разных линий D. virilis и D. lummei. Для проверки гипотезы о наличии разного количества копий гена бтш70 у разных линий внутри вида Drosophila virilis было проведено измерение интенсивности гибридизации радиоактивно меченого зонда из гена бтш70 D. lummei с фрагментами, получаемыми при обработке геномной ДНК разными ферментами рестрикции (метод определения числа копий гена по Саузерну). Рестрикция для анализа проводилась ферментами XbaI, XbaI/AccI и XbaI/HindIII.

Интенсивность гибридизации линейно зависит от содержания ДНК в геле. В качестве внутреннего стандарта для рестрикции XbaI использовались уникальные фрагменты длиной 10 и 3 т.п.о., содержащие по одной копии гена, а в случае рестрикции по XbaI/AccI – фрагменты длиной 5 и 3 т.п.о. Число копий гена бтш70 у различных линий D. virilis приводится в таблице 2. Расчеты проводились на основе обсчета четырех независимых экспериментов, с достаточно высокой точностью (относительная ошибка не превышает 10%). Внутривидовые различия в числе копий бтш70 у природных линий Drosophila обнаруживаются впервые.

Как уже говорилось выше, наибольший интерес в данной работе представляет сравнение числа копий и структуры генов бтш70 D. virilis и D. lummei. Будучи северным видом с низкой термальной адаптацией, D. lummei резко отличается от D. virilis по количеству и динамике синтеза мРНК и белка БТШ70 (см. выше).

При рестрикции XbaI у всех линий D. lummei образуются четыре фрагмента длиной 2,8; 3,2; 4,5 и 10 т.п.о. (рис. 23). У 200-й линии все четыре фрагмента с одинаковой

Таблица 2. Число копий гена бтш70 у разных линий D. virilis и D. lummei. * – одна из копий функционально неактивна.

Линия

Число копий бтш70

D. virilis

9

160

101

1433

Т40

Т53

Т61

6

7

7

6

6

5

5

D. lummei

200

202

1102

4*

5*

5*

интенсивностью гибридизуются с 5’-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster, у остальных линий фрагмент длиной 4,5 т.п.о. гибридизуется более интенсивно. При рестрикции XbaI/AccI из XbaI-фрагмента длиной 2,8 т.п.о. вырезается участок длиной ~ 1,6 т.п.о. Оба эти

фрагмента не гибридизуются с зондом к 3’-кодирующей части гена бтш70 D. melanogaster., По всей видимости, данная копия бтш70, утратила 3’-кодирующую часть гена и представляет собой функционально неактивный псевдоген. Таким образом, анализ геномной ДНК по Саузерну выявляет значительные отличия в структуре кластера генов бтш70 D. lummei по сравнению с D. virilis.

4.13. In situ-гибридизация с политенными хромосомами D. virilis и D. lummei. В работе М.Б. Евгеньева с соавторами (Evgen’ev M.B., et al., 1978) было показано, что мРНК, выделенная из клеток D. virilis после ТШ, меченная радиоактивным йодом, гибридизуется с двумя единичными локусами политенных хромосом – 29С и 20F. Нами было показано, что гены бтш70 расположены в локусе 29С. Для наглядной иллюстрации различия числа копий генов у D. virilis и D. lummei была поставлена in situ-гибридизация с политенными хромосомами гибридов F1 D. virilis 160 х D. lummei 200. Гибридизация была поставлена с меченой пробой D. lummei 200, содержащей бтш70 и прилежащую 3’-фланкирующую последовательность, включающую в себя повтор, специфичный для D. lummei. На рис. 24 видно, что бльший по размеру пуф D. virilis, содержащий 7 копий генов бтш70, гибридизуется с пробой интенсивнее, чем меньший по размеру пуф D. lummei 200, содержащий 3 копии.

Рис. 24. Анализ генов бтш70 у гибридов D. virilis и D. lummei
методом in situ гибридизации на политенных хромосомах.

4.14 Определение структуры кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei на основе рекомбинантных фагов . Исходя из картины in situ-гибридизации, а также из данных, полученных для других видов Drosophila, мы предполагали, что у D. virilis и D. lummei гены бтш70 организованы в виде одного кластера, как, например, у D. auraria. Для проверки этой гипотезы, а также для определения нуклеотидной последовательности генов бтш70 и прилегающих последовательностей были получены геномные библиотеки в фаговом векторе DASH. Для получения библиотек использовались линия D. virilis 160 и линия D. lummei

Рис. 25. Структура рекомбинантных фагов и кластеров генов бтш70 D. virilis 160 и D. lummei 200. Красными стрелками выделены гены бтш70, нефункциональная копия D. lummei отмечена розовой стрелкой. Подробнее см. в тексте.

200. Было отобрано пять фагов из библиотеки D. virilis, обозначенных как 1, 2, 3, 7 и 17, и четыре фага из библиотеки D. lummei, обозначенных как 1/1, 17, 39 и 42 (см. рис. 25). 

Фрагменты, полученные при расщеплении фаговой ДНК различными рестриктазами и их комбинациями, были переклонированы в плазмиду pBluescript SK-. Были построены рестриктные карты, проанализированы данные по гибридизации фрагментов рестрикции с зондами к различным участкам генов бтш70 и фланкирующих последовательностей, и определены нуклеотидные последовательности ряда фрагментов. На основе этих результатов были сделаны выводы о перекрывании фагов, взаимной ориентации генов бтш70 и расстояниях между ними. В состав рекомбинантных фагов из линии 160 D. virilis входят шесть полных копий генов бтш70 и 3’-фрагмент седьмой копии, ограниченный сайтом Sau3A, образованный при частичной рестрикции ДНК для последующего клонирования в составе вектора DASH.

Фаги, полученные из линии 200 D. lummei, также имеют в своём составе перекрывающиеся последовательности: было показано перекрывание между фагами 17, 39 и 42. В составе этих фагов были клонированы три полноразмерных копии гена бтш70 D. lummei. Данные по перекрыванию фагов и структуре кластера генов бтш70 D. virilis 160 и D. lummei 200 суммированы на рис. 25.

Было показано, что гены бтш70 линии D. virilis 160 действительно организованы в форме кластера из 7-и копий, что подтверждает данные Саузерн-анализа и гибридизации in situ. Шесть генов расположены в тандемной ориентации на расстоянии 4,8 т.п.о. один от другого (считая границами ТАТА-бокс и сигнал полиаденилирования ААТААА), а седьмая копия имеет обратную ориентацию и расположена на расстоянии ~ 1,5 т.п.о. от соседней (см. рис. 25). Таким образом, два гена бтш70 у линии D. virilis 160 образуют инвертированный повтор, что характерно для всех изученных на сегодняшний день видов Drosophila.

У 200-й линии D. lummei так же, как и у D. virilis, два гена бтш70 расположены в виде инвертированного повтора на расстоянии ~ 1,5 т.п.о. друг от друга. Третья копия в составе фагов 17 и 42, как и копии, входящие в инвертированный повтор, является полноразмерной. Расстояние до этой копии установить не удалось, так как между фагами 1 и 17 отсутствует перекрывание. Для клонирования усеченной копии бтш70, из обработанной ферментом рестрикции XbaI геномной ДНК D. lummei, была получена плазмидная библиотека, которую скринировали XbaI/BamHI фрагментом гена бтш70а D. lummei. Полученные позитивные клоны секвенировали и обнаружили, что в состав клонированного 2.8 т.п.о. фрагмента входит усеченная копия бтш70с. У данной копии отсутствуют 300 н.п. кодирующей последовательности с 5’ конца и 813 н.п. из 3’ участка. Для определения локализации псевдогена были подобраны праймеры из 3’ участка полученного клона и из 5’-конца фага 17. Методом ПЦР был амплифицирован, клонирован и секвенирован межгенный район бтш70с – d.

Можно сделать вывод, что кластеры генов бтш70 у D. virilis и D. lummei различаются по структуре, что выражается в различном числе копий, бльших расстояниях между тандемно расположенными генами у D. lummei и разной структуре межгенных участков. Кроме того, одна из копий в составе кластера бтш70 D. lummei, является псевдогеном с делецией 5’- и 3’-участков. С другой стороны, у D. lummei, как и у D. virilis имеются два гена, образующие инвертированный повтор.

4.15. Определение первичной последовательности генов бтш70 и прилежащих участков у D. lummei, D. virilis и D. montana. Для более детального функционально-структурного анализа кластера генов бтш70 была полностью определена нуклеотидная последовательность шести генов из линии D. virilis 160 (бтш70a – c и бтш70e – g), и всех четырёх генов из линии D. lummei 200 (бтш70d), клонированных в плазмиду pBluescript SK-. Из генома D. montana 1071.0 был клонирован и секвенирован ген бтш70, с прилежащими 5`- и 3`-фланкирующими последовательностями.

Результаты сиквенса и трансляции белковых продуктов опубликованы в базе данных GenBank NCBI под номерами AY445083, AY445084, AY445085, AY445086, AY445087, AY445088, AY445089, AY445090, AY445091, AY445092, AY445093, AY665298 и AY665299. Полная нуклеотидная последовательность гена бтш70 D. montana депонирована под номером EU523047.

Шесть полностью секвенированных копий генов бтш70 D. virilis высоко консервативны и содержат всего 5 замен на всём протяжении кодирующей последовательности. Из них три замены приходятся на незначащий третий нуклеотид в мультикодирующих кодонах и две – приводят к замене аминокислотного остатка в последовательности кодируемого белка: замена GGG (глицин) на GTG (валин) и GTA (валин) на GCA (аланин). По сравнению с генами бтш70 D. virilis, ген бтш70d D. lummei содержит 33 нуклеотидных замены в составе кодирующей последовательности, из которых 28 являются незначащими, а 5 приводят к замене аминокислотного остатка, и делецию 9-и пар оснований после 1456-го нуклеотида относительно старта транскрипции.

Интересные результаты дало сравнение области промотора бтш70 D. virilis с промоторами генов бтш70 D. lummei, D. montana и D. melanogaster. Промоторные области генов бтш70 D. virilis, D. lummei и D. montana имеют по две канонических последовательности HSE, тогда как в составе промотора бтш70 D. melanogaster обнаружены четыре копии HSE.

В области 3’-фланкирующей последовательности генов бтш70 D. virilis и D. lummei наблюдается бльшая дивергенция, чем между самими генами, выражающаяся в наличии нуклеотидных замен и делеций. Нуклеотидная последовательность генов бтш70 D. virilis , D. lummei и D. montana на 80% гомологична генам бтш70 D. melanogaster, такая же гомология наблюдается и между аминокислотными последовательностями белковых продуктов.

В области 3’-фланкирующей последовательности всех генов бтш70 D. virilis, D. lummei и D. montana обнаружен фрагмент мобильного элемента SGM (Corvelo, 2004). Данный мобильный элемент относится к эволюционно древним повторяющимся последовательностям. Был клонирован XbaI/AccI-фрагмент из фага №7 D. virilis, содержащий данную последовательность, и проведён Саузерн-анализ геномной ДНК D. virilis и D. lummei на содержание последовательностей, гомологичных SGM. Как видно из рис. 26, у D. virilis данные повторы локализованы преимущественно в области генов бтш70. В случае D. lummei повторы амплифицированы и, помимо локуса бтш70, распространены по всему геному. Повторяющиеся последовательности, в том числе мобильные элементы, могут играть важнейшую роль в эволюции, в частности способствовать изменению числа копий генов путём неравного кроссинговера и/или внутрихромосомной рекомбинации.

Для проверки гипотезы о роли ретроэлемента SGM в возможных перестройках кластера генов бтш70 у видов группы virilis был проведён Саузерн-анализ структуры кластера у 10 различных генетических линий вида D. virilis. В ходе исследования в линии А11 была обнаружена вставка размером 3,6 т.п.о. в участок ДНК между генами бтш70a и бтш70b, расположенными в виде инвертированного повтора. Клонирование и последующее секвенирование участка ДНК между генами бтш70a и бтш70b линии А11 D. virilis показало,

А Б 

 

Рис. 26. А – Саузерн-гибридизация геномной ДНК с зондом к бтш70. Рестрикция NciI. 1 – D. lummei 1102, 2 – D. lummei 200, 3 – D. virilis 9, 4 – D. virilis T-53. Б – то же, гибридизация с зондом к SGM.

что в данном участке находится интермедиатный повтор SGM.

Кластер генов бтш70 D. lummei отличается от кластера D. virilis по числу и расположению тандемно ориентированных копий, находящихся на больших расстояниях друг от друга. Таким образом, можно сказать, что в ходе эволюции группы virilis изменялось число тандемно ориентированных копий. Общая схема предполагаемой эволюции кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei приведена на рис. 27.

D. pseudoobscura, один из предковых видов рода Drosophila, имеет единственный локус, содержащий два гена бтш70 в виде инвертированного повтора (B. Bettencourt, unpublished data). Из этого следует, что дополнительные копии бтш70 D. virilis (бтш70c – g) образовались в ходе тандемных дупликаций. В ходе дивергенции видов D. virilis – D. lummei, по-видимому, произошла потеря части тандемно ориентированных копий и увеличение длины межгенных участков между ними. Возможным механизмом участия SGM в увеличении или уменьшении числа копий генов бтш70, а также увеличения расстояния между генами бтш70 у D. lummei, может являться неравный кроссинговер и/или рекомбинация между гомологичными участками одной хромосомы.

Особи D. lummei с уменьшенным числом копий генов бтш70 и пониженной экспрессией БТШ70 не выбраковывались в ходе естественного отбора, так как, будучи

Рис 27. Эволюция кластера генов у группы virilis.

обитателями климатических зон с умеренным климатом, не подвергались воздействию высоких температур. Эта гипотеза подтверждается наличием в 3’-фланкирующей последовательности генов бтш70g D. virilis и бтш70d D. lummei специфичной 24-нуклеотидной последовательности, не встречающейся в составе других генов. Возможно, гены бтш70g D. virilis и бтш70d D. lummei являются гомологами, и в ходе эволюции D. lummei были делетированы копии бтш70c – f D. virilis.

5. Роль мобильных элементов в эволюции генов бтш

Одним из важных вопросов, привлекающих внимание исследователей, является анализ закономерностей эволюции семейства генов бтш70. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при эволюции системы генов бтш70 могли происходить как изменения в числе копий бтш70, так и изменения в структуре самого кластера генов, как это было обнаружено у видов D. virilis и D. lummei. По-видимому, важную роль в этом процессе играет древний мобильный элемент SGM. Мобильные элементы (МЭ), встраиваясь в промоторную область генов, могут частично или полностью инактивировать соответствующие копии (Lerman et al., 2003), что приводит к изменению уровня экспрессии БТШ и терморезистентности организма. Некоторые исследования указывают на то, что МЭ неслучайно перемещаются по геному в процессе транспозиции (Евгеньев, 1998). Имеются данные, что гены бтш70, в особенности их регуляторные зоны, являются «горячими точками» при транспозиции МЭ, из-за конститутивно деконденсированного состояния хроматина таких районов ДНК (Karpov,1984). Выявление преимущественных мест встраиваний и оценка влияния МЭ на функционирование генов бтш70 позволяет изучить возможный путь эволюции основной защитной системы организмов, а также установить роль МЭ в процессах микроэволюции и адаптации.

Очередной задачей данного исследования была попытка ответить на вопрос – действительно ли промоторы генов бтш70 являются «горячими точками» инсерций МЭ, и как такие встраивания влияют на терморезистентность. Для выполнения этой задачи, на модельной системе D. melanogaster, исследовали перемещение конструкции, созданной на основе Р элемента, в гены бтш70.

5.1. Получение инсерций конструкции на основе Р элемента в гены бтш70 методом Р-инсерционного мутагенеза. В данной работе была использована модель целенаправленного получения транспозиций конструкции EPgy2 на основе Р элемента в локус генов теплового шока, примененная при изучении малых генов ТШ (Timakov B., 2002), с некоторыми изменениями. Из коллекции центра (Bloomington Drosophila Stock Center) были получены две лабораторные линии D. melanogaster №15616 и №15904 (обозначенные

 

Рис. 28. Расположение исходной конструкции EPgy2 в линиях US-4 (в положении +243 относительно старта транскрипции гена CG12213) и US-2 (+33 относительно старта транскриции гена aur) D. melanogaster. Стрелками указано направление транскрипции генов.

далее как US-4 и US-2), содержащие исходную конструкцию EPgy2 в локусе 87А на расстоянии 8 и 5 т.п.о., соответственно, от старта транскрипции гена бтш70 Ab (рис.28).

Также была получена линия №1429 (обозначена далее как 2-3), несущая ген транспозазы Р элемента.

В результате скрещиваний (Рис. 29) нами были выведены линии с перемещением конструкции. Для линий, полученных из US-4, общая частота перемещения конструкции составляет 7,5%, для линий US-2 – 4,9%. Некоторые инсерции конструкции в гены бтш70 были переведены в гомозиготное состояние.

Рис. 29. Генетическая схема, использованная для получения локальных перемещений конструкции EPgy2. Знаком * отмечены самцы с дополнительными копиями EPgy2 в геноме.

5.2 Идентификация инсерций EPgy2 методом Саузерн-блот-анализа. Анализ проведенных скрещиваний позволил отобрать линии с дополнительными инсерциями EPgy2 в той же хромосоме, что и стартовый элемент. Для того чтобы определить, произошло ли встраивание EPgy2 в какую-либо из шести копий гена бтш70, был проведен Саузерн-анализ геномной ДНК трансгенных линий. При обработке геномной ДНК D. melanogaster парой рестриктаз BamHI/HindIII образуется набор фрагментов разной величины, специфичный для разных копий гена бтш70 (рис. 30А, Б, В).

Использование данных рестриктаз и последующая гибридизация с зондами к 5' и 3' участкам гена бтш70 позволяет выявить изменения, происходящие со всеми копиями гена бтш70. Так как конструкция EPgy2 содержит на 5’- и 3’-концах сайты для рестриктазы HindIII, то появление инсерций в генах бтш70 в гетерозиготных линиях фиксировали как

Рис. 30. А. Гибридизация с 5’-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster. Стрелками показаны линии, несущие инсерции EPgy2 в разных копиях бтш70 (Аа и Аb). Справа указан молекулярный вес фрагментов гибридизации, специфичных для разных копий бтш70. Б. Гибридизация с 3’-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster. В. Схема сайтов рестрикции BamHI/HindIII генов бтш70, расположенных в локусе 87А (бтш70 Aa , Ab) и 87С (бтш70 Ba, Bbb, Bb, Bc) (Gong and Golic, 2004); сайты рестриктаз BamHI и HindIII обозначены серыми треугольниками.

появление низкомолекулярного дополнительного фрагмента гибридизации. При этом наблюдали уменьшение интенсивности гибридизации той копии гена бтш70, в которую произошло встраивание. При выведении линий в гомозиготное состояние, полностью исчезает фрагмент, соответствующий исходной копии гена, и увеличивается интенсивность гибридизации нового фрагмента с инсерцией EPgy2. Нами не было зафиксировано ни одного случая внедрения конструкции в 3’-кодирующий или фланкирующий участок бтш70 (рис. 30Б); все встраивания произошли в 5’-район генов бтш70, расположенных в локусе 87А – бтш70Aa и Ab.

Нами было зарегистрировано 31 встраивание EPgy2 в гены бтш70 из 375 локальных перемещений конструкции для линий, выведенных из US-4, и 14 инсерций для линий, полученных из US-2 (из 160 проанализированных локальных перемещений).

5.3. Точная локализация полученных инсерций EPgy2. C помощью Саузерн-анализа было выявлено, что все инсерции EPgy2 происходят в 5’-районы генов бтш70 локуса 87А. Для точной локализации места встраивания были проведены полимеразные цепные реакции с разным набором праймеров с последующим секвенированированием полученных фрагментов. После серии ПЦР было доказано, что конструкция встраивается в регуляторную область бтш70. На рис. 31 приведен пример ПЦР для нескольких линий.

На дорожках 1 – 5 представлены результаты ПЦР для пяти разных трансгенных линий с праймерами из 5'-конца бтш70 (№2) и из 3'-конца EPgy2 (№7). Разный размер синтезированных фрагментов свидетельствует о разных местах встраивания.

Рис. 31. Локализация инсерций и ориентации конструкции EPgy2 методом ПЦР. А. ПЦР с праймерами: 2-7: 1 – линия 31IIa, 2 – 5IId, 3 – 111IIa, 4 – 1IIa, 5 – 134Ib; с праймерами 2-6: 6 – 1IIa; с праймерами к Р элементу и гену aur для идентификации исходной конструкции: 7 – 31IIa, 8 – 5IId, 9 – 111IIa, 10 – 1IIa, 11 – 134Ib. Б. Схематическое изображение встраивания EPgy2 в промоторную область гена бтш70Аа и праймеров, использованых для локализации инсерции.

Саузерн-анализ показал, что инсерции EPgy2 происходят в 5’-регуляторную зону генов бтш70 Aa и Ab. Для подтверждения транспозиции в ту или иную копию гена бтш70 были поставлены ПЦР с праймерами из 5'-кодирующей части бтш70 наружу (последовательность идентична для обеих копий гена бтш70 Aa и Ab) и праймерами из 5' и 3'-участков EPgy2 (№6 и 7). Соответственно, синтезировались фрагменты размером ~ 2.5 и 0.5 т.п.о. В качестве примера приведена картина ПЦР для линии 1IIа (на рис. 31А дорожки 4, 6). Секвенирование показало, что фрагмент размером 2.5 т.п.о. соответствует межгенному участку, примыкающему к гену бтш70Ab (см. схему на рис. 31Б.) Таким образом, инсерция в линию 1IIа произошла в регуляторный район гена бтш70Аа.

А.

Рис. 32. Результаты анализа трансгенных линий. А. Процент встраивания конструкции EPgy2 в гены бтш70Аа и бтш70Ab в трансгенных линиях, полученных из US-4 (слева) и US-2 (справа); Б. Сайты инсерций EPgy2 в генах бтш70 (суммарно для бтш70Aa и бтш70Ab) для линий, полученных из US-4; цифрами указан нуклеотид, выше которого произошло встраивание (относительно старта транскрипции гена бтш70); в скобках указано число зафиксированных инсерций в данный сайт. В. Аналогичные результаты для линий, выведенных из US-2. Условные обозначения: Т – ТАТА-бокс, Н – HSE (heat shock element), G – сайт для связывания GAF (GAGA-factor).

ПЦР-анализ с праймерами из инвертированного повтора конструкции и из гена бтш70, направленными внутрь и наружу гена, показал, что ни в одном случае не произошло инсерций в кодирующую и 3’-фланкирующую области генов бтш70.

Результаты анализа трансгенных линий, полученных из US-4 и US-2, показали, что во всех случаях транспозиции EPgy2 происходят с переворотом по отношению к стартовому элементу (рис. 32), в промоторную область генов бтш70 между -28 и -240 п.о. выше старта транскрипции. Проведенный анализ выявил «горячие точки» встраиваний EPgy2: 59% всех инсерций для US-4 и 40% для US-2 происходят в одну и ту же область промотора -96 и -97 п.о. от старта транскрипции. Результаты по локализации инсерций EPgy2 в гены бтш70 трансгенных линий представлены в таблице 3.

Встраивание EPgy2 исключительно в 5'-область генов бтш70 можно объяснить свойствами Р элемента и особой организацией промоторной области генов теплового шока (Nacheva, 1989). Из литературы известно, что предпочтительным местом встраивания Р элемента являются регуляторные области генов (Spradling, 1995), преимущественно несколько сотен п.о. от старта транскрипции генов (Liao, 2000).

Промоторные районы генов бтш70 обладают рядом свойств, делающих их уязвимыми для инсерций: в них отсутствует нуклеосомная организация и хроматин находится в деконденсированном состоянии. «Горячие точки» встраивания EPgy2, нуклеотиды -96, -97 выше старта транскрипции генов бтш70, также располагаются в особой области промотора.

In vivo, ДНК промоторных областей бтш70 находится в связанном состоянии со многими белками (GAF, TBF и др.), поддерживающими «открытую» структуру хроматина. Белки GAF способны взаимодействовать друг с другом таким образом, что ДНК оборачивается вокруг нескольких GAF (Georgel, 2005), при этом определенные участки ДНК оказываются «открытыми». Нуклеотиды -96, -97 находятся в центре такого участка ДНК (с -80 по -111 п.о.), образованного GAF. Также известно, что Р элемент предпочтительно встраивается в районы ДНК с повышенным содержанием CG-пар (Liao, 2000). Нами был выявлен 8-нуклеотидный сайт дупликации в месте инсерций EPgy2: CGGCGCAC при транспозиции в положение -97 выше сайта инициации транскрипции и GGCGCACT при транспозиции в положение -96. Таким образом, предпочтительное встраивание EPgy2 в 5'-область бтш70 и наличие «горячих» сайтов инсерций можно объяснить совокупностью многих факторов.

Большинство инсерций EPgy2 в промоторные области единичны; мы зафиксировали лишь два случая двойного встраивания – в линиях 198I и 30IIb. В обоих случаях двойное встраивание выявлено по результатам Саузерн-гибридизации. Методами ПЦР и

Таблица. 3. Сводная таблица локализации сайтов инсерций EPgy2 в гены бтш70 трансгенных линий, выведенных из исходных линий US-4 и US-2 (). Знаком * обозначены линии с перестройками геномной ДНК. 

Локализация инсерций EPgy2 относительно старта транскрипции

ген

линия

-28

Aa

134Ib

-40

Aa

288I(a, b, c, d, e, k), 196II

-42

Aa

186Ib, 309Ib

-96

Aa

48Ia, 61Ib, 105Ig, 177I, 148IIa

-96

Ab

79Ia, 198I

-96

Aa, Ab

30IIb

-97

Aa

1IIa, 5IId, 86I, 111IIa, 163Ia, 169Ig, 179I, 253Ia, 255Ia, 284Ia, 9Ib, 138IIa

-97

Ab

332II*, 332IIb*, 34I,

-135

Aa

31IIa, 123Ia, 246I, 258II, 196Ia, 250Ia

-135

Ab

200I, 227I

-137

Ab

310II

-144

Aa

369I

-160

Aa

198I

-174

Ab

377II

-200

Aa

33Ib

-229

Aa

21Ib*

-230

не определен

99IIa*

-240

Aa

60IIa*

не определена

Aa

121I*, 184I*

не определена

не определен

2Ia*, 244Ia*, 120I*, 121I*

секвенирования полученных фрагментов было установлено, что в линии а198I произошли внедрения EPgy2 в разные места 5’-регуляторных районов генов бтш70 (-160 п.о. гена Аа и  -96 гена Аb). В линии 30IIb инсерции были зафиксированы выше -96 п.о. от старта транскрипции генов бтш70 Аа и Ab. 

Получение гомозиготной линии 30IIb давало возможность исследовать влияние большой вставки (20 т.п.о.) на морфологию пуфа, образующегося в локусе 87А. Особое расположение генов бтш70Aa и Ab в виде сближенных инвертированных копий важно для быстрого начала транскрипции этих генов в условиях ТШ, поэтому увеличение расстояния между генами может влиять на характер функционирования генов бтш70 и вызывать изменение морфологии пуфа. По результатам иммунофлуоресцентного окрашивания хромосом (совместно с С. Г. Георгиевой), было установлено, что при активации транскрипции генов ТШ происходит изменение структуры пуфа в локусе 87А линии 30IIb по сравнению с линией Oregon R. В контрольной линии две инвертированные копии гена бтш70, расположенные в локусе 87А, при ТШ образуют одиночный пуф, в линии 30IIb этот пуф становится двойным (рисунок не приводится), т.о. происходит физическое отдаление двух копий гена бтш70 локуса 87А друг от друга, что может затруднять координированную регуляцию транскрипции этих генов.

5.4. Влияние инсерций EPgy2 на уровень транскрипции бтш70. Инсерции МЭ могут по-разному влиять на экспрессию генов. Из экспериментальных работ (Lerman, 2003; Lerman, 2005; Michalak, 2001) известно, что в природе встречаются популяции Drosophila, содержащие инсерции МЭ в промоторных областях генов бтш70. Эти инсерции нарушают нормальное функционирование тех копий генов бтш70, в которые произошло встраивание. Представлялось интересным оценить влияние встраиваний EPgy2 в гены бтш70 на уровень транскрипции этих генов.

В результате проведенной Нозерн-гибридизации нами было зафиксировано снижение уровня синтеза тотальной мРНК бтш70 в гомозиготных трансгенных линиях 30IIb (двойное встраивание в гены Аа и Аb в положение -96), 134Ib (встраивание в положение -28 в район ТАТА-бокса), по сравнению с контрольной линией US-4.

Снижение уровня синтеза РНК в трансгенных линиях было подтверждено методом количественного ПЦР в реальном времени (quantitative real time PCR) с праймерами, позволяющими различить группу генов бтш70А и бтш70В (рис. 33). На рис. 33А приведена картина экспрессии генов бтш70А после 30 мин ТШ 37ОС и 30 мин восстановительного периода при температуре 25ОС, нормализованных относительно рибосомального гена rp49. Этот эксперимент позволил выявить зависимость снижения синтеза мРНК от места встраивания (рис. 33). У D. melanogaster в регуляторной области генов бтш70 содержится 4 копии HSE (Jachansan A., 1987). Мутации, затрагивающие HSE, или встраивания между этими элементами, особенно между HSE1 и HSE2, могут существенно снижать уровень транскрипции гена. Нами было показано, что при инсерции EPgy2 в район ТАТА-бокса (положение -28) уровень транскрипции двух генов локуса 87А, бтш70Аа и Ab, составляет лишь 44%, по сравнению с контрольной линией (уровень синтеза мРНК в линии US-4 принят

за 100%); при инсерции в район -42 эти гены функционируют только на 51%; при двойном встраивании в положение -96 (линия 30IIb) – на 52%.

Согласно полученным данным, можно предположить, что при встраивании EPgy2 в ТАТА-бокс (положение -28) и в положение -42 (между ТАТА-боксом и HSE1) один из генов группы бтш70А перестает транскрибироваться; при двойном встраивании, вероятно, существенно нарушается транскрибирование обеих копий гена бтш70. При инсерциях в область -134 и -144 п.о. от старта транскрипции уровень синтеза РНК составляет, соответственно 81 и 97%. Таким образом, чем ближе к старту транскрипции происходит встраивание, тем существеннее снижение уровня синтеза РНК генов бтш70.

Рис. 33. А. Относительная экспрессия генов бтш70A (Aa и Ab) в трансгенных линиях (по оси ординат), определенная методом количественного ПЦР в реальном времени. В качестве контроля представлена линия US-4. РНК была выделена после ТШ (37ОС 30 мин) и последующего периода восстановления (25ОС 30 мин). Б. Уровень синтеза мРНК бтш70А у трансгенных линий относительно контрольной линии US-4 (принят за 100%). Цифрами указан нуклеотид относительно старта транскрипции гена бтш70, выше которого произошло встраивание.

5.5. Анализ синтеза БТШ70 в трансгенных линиях. Влияние инсерций EPgy2 на уровень трансляции генов бтш70 в трансгенных линиях было оценено по результатам одномерного и двумерного электрофореза белков.

Количественная оценка накопления индуцибельного БТШ70 после ТШ была получена с помощью иммуноблоттинга с 7FB антителами. Результаты для некоторых трансгенных линий представлены на рис. 34. После ТШ 30 мин при температуре 37ОС в линиях 30IIb и134Ib наблюдается более низкий уровень индукции БТШ70 по сравнению с US-4. После

Рис. 34. Количественный анализ накопления БТШ70 в линиях с инсерциями EPgy2 в гены бтш70. Относительная концентрация БТШ70 (ось ординат) в трансгенных линиях: А – сразу после ТШ (37ОС 30 мин) и Б – через 30 мин после ТШ.

получасового периода восстановления разница в уровне синтеза БТШ70 между линиями становится меньше.

Проведенный анализ показал снижение уровня трансляции бтш70, что согласуется с пониженным уровнем индукции мРНК бтш70 в трансгенных линиях, по сравнению с контрольной. Несмотря на снижение уровня синтеза мРНК и белка БТШ70, вследствие внедрения EPgy2, термоустойчивость трансгенных линий существенно не меняется.

5.6. Определение плодовитости потомства трансгенных линий. Инсерции мобильных элементов по-разному проявляются на уровне целого организма. Известно, что они могут влиять на одно из самых важных свойств всех живых существ – способность давать плодовитое потомство. Поскольку данное свойство является одним из главных факторов действия естественного отбора, представляло интерес оценить последствия внедрения EPgy2 на фертильность трансгенных линий. Эксперимент по оценке плодовитости потомства был проведен на гомозиготных трансгенных линиях (рис. 35).

В эксперимент были отобраны мухи, находящиеся на одной и той же стадии развития, четырех трансгенных линий 30IIb, 111IIa, 134Ib, 369I (c инсерциями EPgy2 соответственно в положения -96 генов бтш70 Aa и Ab; -97 бтш70Аа; -28 бтш70Аа; -144 бтш70Аа) и линии US-4 (контроль). Ставили серии индивидуальных скрещиваний (одна самка х два самца) и исследовали фертильность мух трех-, шести- и девятидневного возраста. Были проведены исследования репродуктивной способности самок в нестрессовых условиях (постоянное развитие при 25С) и самок, перенесших тепловой шок (в этом случае девственные самки были подвергнуты ТШ при температуре 37С в течение 30 мин и скрещены с нестрессированными самцами). Подсчет потомства проводился после вылупления всех куколок (рис. 35). Было показано, что у самок с инсерцией EPgy2 в промотор гена бтш70 после ТШ увеличивалось число потомков, а у контрольной линии – снижалось.

Рис. 35. Определение фертильности трансгенных линий. Столбиками обозначено число потомков трансгенных линий от индивидуальных скрещиваний после 4 – 6; 7 – 9; 10 – 12 дней после вылупления. Белые столбики – потомство от нестрессированных самок, темные от самок после ТШ. Для каждой линии было поставлено 12 независимых скрещиваний; проведен подсчет потомства и статистическая обработка.

Таким образом, эти линии могут иметь преимущество в размножении в условиях незначительных температурных перепадов. В работе (Lerman et al., 2003) было обнаружено, что природные линии с инсерцией Р-элемента в промоторную область гена бтш70Ва, более плодовиты, чем линии без инсерций. В работе (Walser, 2006) обнаружили преимущественное встраивание Р-элемента в промоторную область именно генов теплового шока на примере 48 естественных популяций. Так как большинство генов бтш мультикопийно, то встраивание Р-элемента в отдельные промоторы генов бтш, и незначительное снижение уровня их экспрессии в условиях отсутствия резких перепадов температур может быть эволюционно выгодным. Дальнейший естественный отбор на термоустойчивость может приводить к появлению линий типа Termotolerance. Таким образом, МЭ, вероятно, играют важную роль в эволюции адаптации организмов к условиям их обитания.

Выводы:

1. Молекулярные механизмы адаптации к условиям обитания значительно различаются у разных организмов и связаны с уровнем БТШ70 в клетках при нормальных условиях и тепловом шоке. Экспрессия БТШ70 у разных видов может определяться:

а) регуляцией транскрипции,

б) числом копий гена бтш70,

в) встраиванием в промоторную область генов бтш70 мобильных элементов.

2. Основным молекулярным механизмом, обеспечивающим термоустойчивость пустынных видов ящериц, является повышенная экспрессия БТШ70 при нормальных условиях. У северных видов при нормальных условиях синтез БТШ70 отсутствует. Уровень БТШ70 у пустынных организмов претерпевает значительные колебания в течение суток, коррелируя с изменениями температуры окружающей среды и тела животного.

3. Повышенная экспрессия БТШ70 у термофильных ящериц контролируется на уровне транскрипции и обусловлена присутствием активной формы HSF, связанной с промотором в нормальных условиях.

4. На примере культур первичных фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и России, впервые выявлены различия в термоустойчивости клеток у теплокровных.

5. На примере видов Drosophila выявлены сложные взаимоотношения между уровнем синтеза БТШ и термотолерантностью. Показана положительная корреляция между уровнем синтеза БТШ70 и термоустойчивостью у различных географических линий и видов Drosophila группы virilis, однако при сравнении видов, принадлежащих к разным группам рода Drosophila, такой корреляции не наблюдается.

6. Показано наличие индивидуального спектра изоформ БТШ70 у всех изученных линий и видов Drosophila. Показано, что у термоустойчивых видов более интенсивно экспрессируются низкомолекулярные БТШ и БТШ40, по сравнению с термочувствительными, при жестком температурном воздействии.

7. Подробно изучена структура и функционирование системы генов ТШ у нескольких видов Drosophila группы virilis:

а) обнаружены различия как в строении самого кластера генов, так и в числе генов бтш70 у видов и линий данной группы. Показано, что линии термофильного южного вида D. virilis имеют больше копий бтш70, чем линии северного филогенетически близкого вида D. lummei, что может иметь адаптивное значение;

б) у всех копий генов бтш70 видов группы virilis в 3’-фланкирующей последовательности обнаружен древний МЭ SGM. На основании этих результатов предложена модель, объясняющая адаптивные изменения числа копий генов бтш70 у видов группы D. virilis.

8. Промоторная область генов бтш70 D. melanogaster имеет особую структуру, которая определяет преимущественное встраивание Р элемента в определенные участки промотора. Показано, что МЭ играют важную роль в функционировании и эволюции генов бтш70 у различных видов рода Drosophila. 

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Lyashko VN, Vikulova VK, Chernicov VG, Ivanov VI, Ulmasov KA, Zatsepina OG, Evgen'ev MB. Comparison of the heat shock response in ethnically and ecologically different human populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91 (26): 12492 – 5.
  2. Ульмасов Х.А., Зацепина О.Г., Рыбцов С.А., Джумагельдыев Б.Т., Евгеньев М.Б. Некоторые аспекты состояния компонентов системы теплового шока у ящериц различных экологических ниш. Известия АН. Серия биологическая. 1997. 2: 133 – 44. 
  3. Ulmasov KA, Zatsepina OG, Molodtsov VB, Evgen'ev MB. Natural body temperature and kinetics of heat-shock protein synthesis in the toad-headed agamid lizard Phrynocephalus interscapularis. Amphibia-Reptilia. 1999. 20: 1 – 9.
  4. Zatsepina OG, Ulmasov KA, Beresten SF, Molodtsov VB, Rybtsov SA, Evgen'ev MB. Thermotolerant desert lizards characteristically differ in terms of heat-shock system regulation. J. Exp. Biol. 2000. 203 (6): 1017 – 25.
  5. Zatsepina OG, Velikodvorskaia VV, Molodtsov VB, Garbuz D, Lerman DN, Bettencourt BR, Feder ME and Evgenev MB. A Drosophila melanogaster strain from sub-equatorial Africa has exceptional thermotolerance but decreased Hsp70 expression. The J. Exp. Biol. 2001. 204: 1869 – 81.
  6. Молодцов В. Б., Великодворская В. В., Гарбуз Д. Г, Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Анализ экспрессии белков теплового шока и терморезистентной линии Drosophila melanogaster. Известия Академии наук, Серия биологическая, 2001. 5: 522 – 32.
  7. Гарбуз Д. Г., Молодцов В. Б., Великодворская В. В., Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Эволюция ответа на тепловой шок внутри рода Drosophila. Генетика, 2002. 38 (8): 1097 – 109.
  8. Garbuz DG, Zatsepina OG, Feder ME, Evgen'ev MB. Evolution of termotolerance and the heat-shock response: evidence from inter/intra specific comparison and interspecific hybridization in the Drosophila virilis species group. I/ Thermal phenotype. J. Exp. Biol. 2003. 206: 2399 – 408.
  9. Michael B. Evgen'ev, Martin E. Feder, David Garbuz, Daniel Lerman, Vera Velikodvorskaia and Olga G. Zatsepina. Evolution of Thermotolerance and Heat-Shock Response in the virilis Species Group of Drosophila. Biology International. 2004. 46: 49 – 51.
  10. Evgenev MB, Zatsepina OG, Garbuz DG, Lerman DN, Velikodvorskaia VV, Zelentsova ES, Feder ME. Evolution and arrangement of the hsp70 gene cluster in two closely related species of the virilis group of Drosophila. Chromosoma. 2004. 113 (5): 223 – 32.
  11. Zatsepina OG, Garbuz DG, Shilova V, Karavanov AA, Tornatore P, Evgen’ev MB. Use of surface-enhanced laser desorption ionization – time-of-flight to identify heat shock protein 70 isoforms in closely related species of the virilis group of Drosophila. Cell Stress and Chaperones. 2005. 10 (1): 12 – 6.
  12. Евгеньев М. Б., Гарбуз Д. Г., Зацепина О. Г. Белки теплового шока: функции и роль в адаптации к гипертермии. Онтогенез. 2005. 36 (4): 267 – 75. 
  13. Шилова В. Ю., Гарбуз Д. Г., Евгеньев М. Б., Зацепина О. Г.. Низкомолекулярные белки теплового шока и адаптация к гипертермии у видов Drosophila. Молекулярная биология. 2006. 40 (2): 271 – 6.
  14. Victoria Y. Shilova, David G. Garbuz, Elena N. Myasniankina, Bing Chen, Michael B. Evgen’ev, Martin E. Feder, and Olga G. Zatsepina. Remarkable Site Specificity of Local Transposition into the hsp70 Promoter of Drosophila melanogaster. Genetics. 2006. 173: 809 – 20.
  15. M. B. Evgen’ev, D. G. Garbuz, V.Y. Shilova and O. G. Zatsepina. Molecular mechanisms underlying thermal adaptation of xeric animals. J. Biosci. 2007. 32 (3): 489 – 99.
  16. Savvateeva-Popova E, Popov A, Grossman A, Nikitina E, Medvedeva A, Peresleni A, Korochkin L, Moe JG, Davidowitz E, Pyatkov K, Myasnyankina E, Zatsepina O, Schostak N, Zelentsova E, Evgen'ev M. Pathogenic chaperone-like RNA induces congophilic aggregates and facilitates neurodegeneration in Drosophila. Cell Stress Chaperones. 2007. 12 (1): 9 – 19.
  17. В. Ю. Шилова, Д. Г. Гарбуз, Е. Н. Мяснянкина, М. Б. Евгеньев, Е. С. Зеленцова, О. Г. Зацепина. Качественный и количественный анализ транспозиций генетической конструкции на основе Р элемента в область генов бтш70 Drosophila melanogaster. Генетика, 2007. 43 (12): 1333 – 43.
  18. Bing Сhen, V. Yu. Shilova, O. G. Zatsepina, M. B. Evgen’ev, M. E. Feder. Location of P element insertions in the proximal promoter region of Hsp70A is consequential for gene expression and fecundity in Drosophila melanogaster. Cell Stress Chaperones. 2008. 13 (1): 11 – 7.
  19. Д.Г. Гарбуз, И.А. Юшенова, М.Б. Евгеньев, О.Г. Зацепина. Сравнительный анализ структуры кластера генов hsp70 у видов Drosophila группы virilis. Молекулярная биология. 2009. 43 (1): 44 – 52.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.