WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Часовских Наталия Юрьевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АПОПТОЗА

ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

14.00.16 – патологическая физиология

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Томск – 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор

Рязанцева Наталья Владимировна

доктор медицинских наук,

профессор, академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ

Новицкий Вячеслав Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН

Лишманов Юрий Борисович

доктор медицинских наук,

профессор, академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ

Шкурупий Вячеслав Алексеевич

доктор медицинских наук

Масная Наталья Владимировна

Ведущая организация: ГУ НИИ физиологии СО РАМН

Защита состоится «_____» _________ 2009 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан «_____» ___________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук  Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

На современном этапе развития зарубежной и отечественной медико-биологической науки накоплен большой объем знаний о механизмах повреждения и адаптации клеточных систем при патологических процессах разного генеза. В центре внимания исследователей находятся ключевые механизмы регуляции апоптоза, который представляет собой активную форму клеточной гибели и является физиологическим механизмом устранения избыточных и/или функционально аномальных клеток. Известно, что развитие различных болезней (злокачественные новообразования, сердечно-сосудистые, нейродегенеративные, острые и хронические воспалительные процессы, сахарный диабет и др.) связано с нарушениями механизмов реализации апоптоза, приводящими к его излишнему активированию или ингибированию [Bredesen D.E., 2000; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Наряду с этим важным звеном патогенеза данных заболеваний является дисбаланс окислительного метаболизма [Зенков Н.К. и соавт., 2001].

Развитие окислительного стресса при ряде патологий обусловлено резкой интенсификацией процессов свободно-радикального окисления и/или снижением резерва антиоксидантной защиты, что приводит к значительному накоплению активных форм кислорода (АФК) [Скулачев В.П., 1996]. Последние вызывают окислительную модификацию белковых и липидных молекул, повреждение ДНК, нарушение структуры мембран и др. [Дубинина Е.Е., 2001; Zhu H. et al., 2001; Mathers J. et al., 2004]. Вместе с тем известно, что АФК являются внутриклеточными мессенджерами, участвующими в регуляции различных клеточных процессов, в частности - апоптоза [Safa O., 2001; Sorescu D., 2001; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007].

Влияние АФК на про- и антиапоптотические мишени и механизмы осуществляется непосредственно или через внутриклеточные редокс-зависимые сигнал-передающие системы [Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. При этом в клетке может происходить одновременная активация нескольких молекулярных путей, взаимодействующих между собой [Wajant H., 2002; Schultz D.R., Harrington W.G., 2003].

Индуцирующие апоптоз сигналы стимулируют множество киназ, включая митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38. Последние воздействуют на белки-мишени, связанные с функционированием факторов транскрипции и регуляцией программированной клеточной гибели: р53, NF-B, АР-1 и др. [Gallo K.A., Johnson G.L., 2002; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Под контролем редокс-чувствительных транскрипционных факторов находится синтез белков семейства Bcl-2, являющихся ключевыми регуляторами апоптоза. В частности, р53 активирует экспрессию Bid, PUMA и Noxa [Oda E. et al., 2001; Sax J.K. et al., 2002], NF-B управляет генами, кодирующими белки Bcl-XL, IAP, A1, отвечающие за угнетение процесса апоптоза [Kucharczak J. et al., 2003]. Вместе с тем ряд исследований свидетельствуют о проявлениях редокс-чувствительными элементами сигнальной трансдукции как про-, так и антиапоптотической активности [Perkins N.D., 2004; Harada C., Nakamura K., 2006], зависящей от особенностей индуцирующих сигналов, комбинации возможных путей их передачи и типа клеток.

Данное обстоятельство затрудняет возможность идентификации механизмов развития заболеваний, сопровождающихся развитием окислительного стресса и сопряженных с дизрегуляцией летальной программы клеток. Необходимость разработки и внедрения селективных технологий управления апоптозом ставит перед фундаментальной наукой задачу идентификации редокс-чувствительных молекулярных мишеней и обосновывает целесообразность проведения комплексного исследования фундаментальных механизмов нарушения программированной гибели клеток в условиях окислительного стресса.

Цель исследования: установить редокс-чувствительные молекулярные механизмы апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

  1. Установить особенности реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов, состояния рецепторного и митохондрий-опосредованного путей инициации апоптоза при окислительном стрессе.
  2. Оценить характер изменений МАР-киназных элементов (JNK, р38) системы сигнальной трансдукции в мононуклеарных клетках крови с использованием селективных ингибиторов (SP600125, ML3403) in vitro при окислительном стрессе.
  3. Оценить роль транскрипционных факторов NF-B и р53 в механизмах регуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при дисбалансе окислительного метаболизма.
  4. Выявить особенности экспрессии мРНК и оценить содержание белков семейства Bcl-2 с про- и антиапоптотической активностью при окислительном стрессе.
  5. Установить общие закономерности и особенности дизрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалительном процессе, сопровождающемся нарушением окислительного метаболизма.

Научная новизна.

Впервые с помощью современных молекулярно-биологических методов проведено исследование редокс-чувствительных молекулярных механизмов реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении.

Впервые при культивировании in vitro мононуклеарных лейкоцитов крови с 1 мМ Н2О2 показано, что нарастание продукции активных форм кислорода в клетках сопровождается увеличением содержания апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, опосредованным активацией митохондриального и повышенной готовностью клеток к TNF-рецепторному пути инициации апоптоза. Установлено, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма усиливается фосфорилирование редокс-чувствительных JNK и p38 МАР-киназ, являющихся важным элементом системы сигнальной трансдукции апоптогенных сигналов. Впервые в эксперименте с использованием селективных ингибиторов МАР-киназ показано, что JNK влияет на продукцию IL-8, но не участвует (также как р38) в регуляции синтеза IL-10 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Факторы транскрипции NF-B и p53 через механизмы фосфорилирования МАР-киназами и/или непосредственного действия АФК влияют на экспрессию генов, кодирующих белки-регуляторы апоптоза (увеличение экспрессии проапоптотического протеина Вах и антиапоптотичекого Bcl-XL). Получены приоритетные данные об изменении содержания про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2 в мононуклеарных клетках крови при экспериментальном окислительном стрессе. Изменение соотношения ключевых белков-регуляторов апоптоза семейства Bcl-2 сопряжено с последовательной активацией редокс-чувствительных элементов сигнальной трансдукции (МАР-киназ и факторов транскрипции). Установлены однотипные молекулярные механизмы дизрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при экспериментальном окислительном стрессе, индуцированном 1 мМ перекисью водорода, и остром воспалительном процессе. Выявлено, что редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем являются мишенями для терапевтической коррекции нарушений апоптотической программы клеток.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют существующие представления о фундаментальных механизмах дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса. Установлена роль редокс-чувствительных МАР-киназ p38, JNK и факторов транскрипции р53, NF-kB в изменении баланса про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2. Полученные знания носят фундаментальный характер и могут служить основой для разработки молекулярной технологии воздействия на оксидант-опосредованную модуляцию активности ключевых регуляторов апоптоза. Идентифицированные в ходе исследования редокс-чувствительные молекулярные мишени могут быть использованы в разработке подходов селективного управления апоптозом клеток при патологических процессах, патогенез которых сопряжен с развитием окислительного стресса, а также с нарушением реализации летальной программы клеток.

Положения, выносимые на защиту:

1. Усиление программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса сопряжено с активацией митохондрий-опосредованного и повышенной готовностью клеток к TNF-рецепторному пути инициации апоптоза.

2. В реализацию летальной программы мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе вовлечены редокс-чувствительные элементы внутриклеточной сигнальной трансдукции (МАР-киназы р38 и JNK, факторы транскрипции NF-kB и р53).

3. В изменении баланса ключевых белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе участвуют факторы транскрипции NF-kB и р53, контролирующие экспрессию соответствующих генов.

4. Дизрегуляция апоптоза представляет собой один из компонентов патогенетических изменений при воспалении, сопровождающемся дисбалансом окислительного метаболизма.

Апробация и внедрение результатов работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на Российском медицинском форуме с международным участием «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006), 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), III Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2007), научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения» (Санкт-Петербург, 2007).

Исследования поддержаны Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ в рамках проекта «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), РФФИ - «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150), «Разработка технологии селективного управления внутриклеточными редокс-зависимыми сигнальными системами» (№ 09-04-99026), а также выполнены в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы» (государственные контракты № 02.442.11.7276 от 20.02.2006, № 02.445.11.7419 от 09.06.2006), ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (государственные контракты № 02.512.12.0013 от 01.08.2008, № 02.512.11.2285 от 10.03.2009). Основные результаты диссертационного исследования включены в лекционный курс по патологической физиологии («Патофизиология клетки», «Типовые патологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии») для студентов лечебного и педиатрического факультетов ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, из них 8 – в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, одна монография в соавторстве.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 219 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 471 источник, из них - 122 отечественных и 349 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 46 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Регуляцию апоптоза при окислительном стрессе мы рассматривали с позиции существования типовых неспецифических механизмов изменения летальной программы клеток. Для того чтобы понять особенности влияния окислительного стресса на реализацию апоптоза, проводимое нами исследование (в соответствии с поставленными целью и задачами) было разделено на два последовательных этапа.

На первом этапе исследования предстояло выяснить, приводит ли дисбаланс окислительного метаболизма к нарушению реализации летальной программы клеток. Для этого проводили оценку выраженности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях оксилительного стресса, состояния ключевых путей инициации программированной гибели клеток (рецепторный, митохондрий-опосредованный, ядерный).

На втором этапе исследования предполагалось проверить гипотезу о вовлечении редокс-чувствительных элементов сигнальной трансдукции в механизмы нарушения летальной программы клеток при окислительном стрессе. Для определения роли митоген-активированных протеинкиназ р38 и JNK в регуляции апоптоза клеток при окислительном стрессе использовали селективные ингибиторы МАР-киназ (ML3403 и SP600125), определяли наличие общих и фосфорилированных форм МАР-киназ, транскрипционных факторов р53 и NF-kB, фосфорилированного р53. Для определения участия протеинов семейства Bcl-2 в регуляции апоптоза измеряли внутриклеточное содержание про- (Вах, Bad) и антиапоптотических (Вcl-2, Bcl-XL) представителей данного семейства белков (табл. 1). Затем оценивали экспрессию генов белков-регуляторов апоптоза, находящихся под транскрипционным контролем р53 и NF-kB.

Для верификации молекулярных мишеней, ответственных за редокс-зависимую модуляцию апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови, проводилось манипулирование in vitro мононуклеарными лейкоцитами крови, полученными у здоровых доноров и больных острыми воспалительными заболеваниями.

В исследование были включены 46 здоровых доноров в возрасте от 18 до 50 лет (мужчины - 20, женщины – 26) и 49 больных (25 мужчин и 24 женщины в возрасте от 18 до 50 лет, средний возраст – 32±3 лет) с острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония, острый аппендицит). Критериями исключения из программы исследования для здоровых доноров и больных острыми воспалительными заболеваниями являлись: возраст моложе 18 и старше 50 лет; период обострения хронических воспалительных заболеваний; аутоиммунные, наследственные и психические болезни, злокачественные новообразования, алкогольная и наркотическая зависимости; отсутствие информированного согласия.

Пациенты были обследованы при госпитализации в терапевтическое и хирургическое отделения ММЛПУ Городская больница №1 (главный врач - С.М. Кирютенко), госпитальные клиники ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач – Заслуженный врач РФ, канд. мед. наук В.М. Шевелев), клиники Военно-медицинского института МОРФ (зав. кафедрой терапии и усовершенствования врачей – канд. мед. наук, доцент Т.С. Агеева).

Материалом для исследования служила венозная кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл и стабилизированная гепарином (25 Ед/мл).

Исследование проводилось на базе Межкафедральной научно-образовательной лаборатории молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководители – д-р мед. наук, проф. Н.В. Рязанцева, акад. РАМН В.В. Новицкий), лаборатории фармакогеномики НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) (зав. лабораторией – канд. мед. наук М.Л. Филипенко).

Мононуклеарные лейкоциты выделяли из крови путем центрифугирования на слое фиколла (“Pharmacia” Швеция) плотностью 1,077 и инкубировали в течение 18 ч при температуре 37С в полной питательной среде. Для определения роли митоген-активированных протеинкиназ р38 и JNK в регуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе использовали селективные ингибиторы МАР-киназ (ML3403 и SP600125 («Biosource», США) соответственно). Для индукции окислительного стресса в клеточные культуры добавляли перекись водорода в различных концентрациях (10 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 500 мкм и 1 мМ). Методом проточной лазерной цитофлуориметрии с использованием цитометра Epics XL («Beckman Coulter», Франция) оценивали уровень внутриклеточной продукции АФК, количество апоптотически измененных клеток, содержание мононуклеарных лейкоцитов со сниженным трансмембранным митохондриальным потенциалом и число TNFR1-презентирующих клеток. Оценку реализации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов проводили с использованием ФИТЦ-

меченного аннексина V («ANNEXIN V FITC» («Beckman Coulter», Франция)), обладающего сродством к мембранно-связанному фосфатидилсерину [Van Engeland M., 1998]. Для подтверждения наличия в

Таблица 1

Распределение здоровых доноров и пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в соответствии с проведенными методами исследования

Методы исследования

Группы обследованных (условия эксперимента)

Здоровые доноры

Больные с острым воспалением

Интактные клетки

Культивирование клеток in vitro с 10, 50, 100, 500 мкМ, 1мМ и 5мМ Н2О2

Культивирование клеток in vitro с 1мМ Н2О2 и селективными ингибиторами p38 ML3403 и JNK SP600125

Культивирование клеток, полученных у больных с острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония и острый аппендицит)

Культивирование клеток у больных с острыми воспалительными заболеваниями и селективными ингибиторами p38 ML3403 и JNK SP600125

1

2

3

4

5

6

Оценка апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в аннексиновом тесте с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии

34

82

Не опреде-ляли

49

Не опреде-ляли

Определение уровня АФК в клетках с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии

34

82

68

49

98

Оценка уровня митохондриального трансмембранного потенциала с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии

34

82

Не опреде-ляли

49

Не опреде-ляли

Определение количества TNFR1-презентирующих клеток с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии

18

18

Не опреде-ляли

49

Не опреде-ляли

Определение содержания общих и фосфо-форм

МАР-киназ (JNK, p38) и фосфорилированного р53 методом вестерн-блоттинга

4

4

4

4

4

Продолжение таблицы 1

1

2

3

4

5

6

Исследование содержания факторов транскрипции (p53 и NF-kB) и белков-регуляторов апоптоза (Bad и Bcl-XL) с использованием метода вестерн-блоттинг

4

4

Не опреде-ляли

4

Не опреде-ляли

Исследование содержания белков-регуляторов апоптоза (Bax и Bcl-2) с использованием метода вестерн-блоттинг

4

4

4

4

4

Оценка экспрессии мРНК генов белков-регуляторов апоптоза (bad, bax, bcl-2, bcl-XL) с использованием метода ПЦР в реальном времени

12

12

Не опреде-ляли

7

Не опреде-ляли

Исследование содержания IL-8, IL-10 и TNF в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов методом иммуноферментного анализа

11

11

22

22

22

Определение количества апоптотически измененных клеток TUNEL-методом

Не опреде-ляли

Не опреде-ляли

Не опреде-ляли

10

Не опреде-ляли

исследуемой культуре клеток с апоптотическими изменениями применяли TUNEL-метод («Webstain», США). Количество клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальных мембран () регистрировали с использованием набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США). Уровень активных форм кислорода в клетках оценивали с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией – дихлорфлюоресцеина диацетата («Sigma», США). Содержание мононуклеарных лейкоцитов, презентирующих на своей поверхности мембранную форму рецептора к фактору некроза опухоли- 1-го типа (TNF-RI), определяли с помощью стандартных моноклональных антител к TNF-RI, меченных ФИТЦ («Immunotech», Франция).

Продукцию мононуклеарными лейкоцитами TNF оценивали с помощью иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой фирмой-производителем тест-систем («Протеиновый контур», Россия). В супернатантах интактных, перекись-стимулированных и культивированных с ингибиторами МАР-киназ культур мононуклеарных лейкоцитов определяли содержание IL-8 и IL-10, используя метод иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией к набору («Biosurce», USA) на микропланшетном фотометре Multiscan EX («ThermoLabSistems», Финляндия). Концентрации TNF, IL-8 и IL-10 вычисляли по калибровочной кривой.

Для определения содержания активных и неактивных форм МАР-киназ р38, JNK, транскрипционных факторов (NF-kB, p53 и фосфо-формы р53) и белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad) был использован метод вестерн-блоттинга. Клеточные экстракты получали путем лизиса клеток. Белки разделяли по молекулярной массе под действием электрического поля в течение 60 мин при напряжении 120 В. Для последующего исследования белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США). Перенос белков осуществлялся электрофоретически в течение 90 мин при силе тока 60 мА. Нитроцеллюлозные блоты инкубировали с первичными антителами к активным и общим формам МАР-киназ (JNK 1 и 2, р38, фосфо JNK 1 и 2, фосфо р38), факторам транскрипции (р53 («Biosource», США), NF-kB («Biosource», США)), к фосфо-форме р53 («Biosource», США) и белкам-регуляторам (Bax («Biosource», США), Bcl-XL («Sigma», США), Bad («Biosource», США), Bcl-2 («Biosource», США)) в разведении 1:200. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу («Chemicon», США).

Для количественного определения экспрессии РНК генов bcl-2, bax, bcl-XL и bad использовали метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Выделение РНК из мононуклеаров крови осуществляли с применением гуанидин изотиоционата с последующей фенол-хлороформной экстракцией [Chomczynski P., Sacchi N., 1987]. Оценку качества выделенного препарата РНК проводили по итогам электрофоретического разделения. Возможные примеси геномной ДНК удаляли при помощи переосаждения в 2,5 М LiCl. Следующим шагом синтезировали ДНК на матрице РНК при участии обратной транскриптазы. Полученный фрагмент ДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием SYBR Green I («Мolecular Probe», США) на амплификаторе IQ5 («Bio-Rad», США). Амплификацию проводили с использованием режима, предполагающего предварительную денатурацию образцов (95°С, 2 мин) с последующими сорока циклами, включающими денатурацию (95°С, 15 сек) и отжиг (60°С, 45 сек). Праймеры, позволяющие специфично амплифицировать фрагменты кДНК генов bcl-2, bcl-XL, bax и bad, были предоставлены лабораторией фармакогеномики НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Для определения относительного количества кДНК в образце использовали критерий ddCt.

При оценке полученных данных использовали методы статистического описания и проверки статистических гипотез [Лакин Г.Ф., 1980]. Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибка среднего или медиана, первый и третий квартили. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стъюдента. В случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между зависимыми выборками применяли непараметрический критерий Вилкоксона. Для оценки достоверности различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни. Наличие связи между изученными показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 [Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1999].

ОСОБЕННОСТИ РЕАЛИЗАЦИИ АПОПТОЗА

МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ

В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

Интенсификация окислительных реакций при различных патологических состояниях может оказывать влияние на процессы реализации апоптоза (как в сторону активации, так и в сторону ингибирования), выступая в качестве дополнительного патогенетического механизма развития сердечно-сосудистых, онкологических заболеваний, воспалительных и нейродегенеративных процессов. Особый интерес исследователей в этом плане привлекает роль изменений редокс-статуса клетки в модуляции ее программированной гибели [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Вместе с тем особенности функционирования отдельных систем передачи апоптогенных сигналов (вне- и внутриклеточных) в условиях изменения окислительного метаболизма требуют детального изучения.

При выборе методологии исследования мы руководствовались следующими позициями. С одной стороны, известно, что окислительный стресс выступает в качестве одного из важнейших патогенетических факторов развития различных заболеваний (воспалительные процессы любого генеза, злокачественные новообразования, сердечно-сосудистая и бронхо-легочная патологии, неврологические и психические заболевания, интоксикации разного генеза и др.). При этом механизмы генерации АФК носят типовой универсальный характер [Дубинина Е.Е., 2001]. В качестве примера патологического процесса, сопровождающегося дисбалансом окислительного метаболизма, нами был выбран острый воспалительный процесс у больных внебольничной пневмонией и острым аппендицитом.

С другой стороны, изучение роли какого-либо определенного молекулярного механизма требует создания экспериментальной модели, существенным плюсом которой является возможность анализа изолированной цепи событий, приводящих к патологическим изменениям [Веденов А.А., 1988]. В связи с этим в программу исследования был включен экспериментальный блок, основанный на моделировании окислительного стресса in vitro с использованием Н2О2.

Добавление в культуральную среду Н2О2 в различных конечных концентрациях является одним из наиболее распространенных способов моделирования окислительного стресса in vitro [Abe J. et al., 1997; Griendling K.K. et al., 2000; Chen K., Vita J.A. et al., 2001; Ding B., 2007].

Задачей экспериментального раздела исследования явилась оценка уровня внутриклеточной продукции АФК и количества апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов при различных концентрациях перекиси водорода. При этом оптимальной для моделирования окислительного стресса in vitro считалась концентрация Н2О2, при которой внутриклеточный уровень АФК, превышая контрольные значения и вызывая интенсификацию процессов апоптоза, не приводил к возрастанию числа некротизированных клеток в культуре.

Оценка содержания АФК в клетках при добавлении в культуральную среду перекиси водорода в диапазоне концентраций от 10 до 500 мкМ не выявила значимых отклонений исследуемого показателя от аналогичного параметра в контроле (р>0,05) (рис. 1). Полученные нами данные свидетельствуют о сохранении баланса между анти- и прооксидантными системами мононуклеарных лейкоцитов при воздействии указанных концентраций перекиси водорода. Известно, что устойчивость клеток к воздействию Н2О2 обеспечивается глутатионпероксидазной и каталазной ферментативными системами [Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006].

Добавление перекиси водорода в конечной концентрации 1 мМ в культуру мононуклеарных лейкоцитов приводило к повышению внутриклеточной продукции АФК в 2,5 раза (р<0,05) (рис. 1), что свидетельствует о нарушении баланса между про- и антиоксидантными системами клетки и может служить признаком дисбаланса окислительного метаболизма.

Помимо окислительного стресса, носящего как адаптивный, так и дезадаптивный характер, апоптоз является одним из фундаменальных механизмов регуляции клеточного гомеостаза. В связи с этим чрезвычайно интересна взаимозависимость и участие АФК в регуляции клеточного саморазрушения [Зенков Н.К. и соавт., 2001].

Рис.1. Уровень активных форм кислорода, содержание апоптотических клеток и клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий  в общей популяции мононуклеарных лейкоцитов периферической крови в условиях культивирования in vitro с различными концентрациями перекиси водорода и у больных острыми воспалительными заболеваниями

Примечание: 1 - интактная культура мононуклеарных лейкоцитов; 2 - инкубирование клеток с 10 мкМ Н2О2; 3 - инкубирование клеток с 50 мкМ Н2О2; 4 - инкубирование клеток с 100 мкМ Н2О2; 5 - инкубирование клеток с 500 мкМ Н2О2; 6 - инкубирование клеток с 1 мМ Н2О2; 7 - мононуклеарные лейкоциты крови, полученные у больных внебольничной пневмонией; 8 - мононуклеарные лейкоциты крови, полученные у больных острым аппендицитом

Показано, что ранним признаком апоптогенных изменений может служить изменение локализации фосфатидилсерина, а точнее - его перемещение с внутренней стороны клеточной мембраны на внешнюю. Исходя из факта присутствия фосфотидилсерина на поверхности мембраны апоптозных клеток, их регистрация может осуществляться с помощью соединения, обладающего сродством к нему, - ФИТЦ-меченного аннексина V [Van Engeland M. et al., 1998]. Именно такой методологический подход был использован в нашем исследовании.

Добавление в культуральную среду малых концентраций перекиси водорода (10-500 мкМ) не вызывало достоверных изменений количества апоптотически измененных клеток (р>0,05) (рис. 1). Выраженная индукция летальной программы была обнаружена в культуре мононуклеарных клеток, подверженной воздействию 1 мМ перекиси водорода.

Выявленные при экспериментальном окислительном стрессе изменения подтверждают факт участия АФК в индукции и передаче апоптотического сигнала.

Культивирование мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, с Н2О2 в концентрации, превышающей 1 мМ, приводило к возрастанию в культуре числа некротизированных клеток, определяемых при окраске трепановым синим. Данное обстоятельство заставило нас исключить дальнейшее исследование влияния перекиси водорода в концентрации выше 1 мМ на процесс апоптоза.

Как известно, реализация апоптогенной программы представляет собой три последовательных стадии: инициации, эффекторная и деградации [Thornberry N.A., Lazebnik Y., 1998; Kroemer G., Reed J., 2000]. Исследование различных путей инициации апоптоза способствует более глубокому пониманию механизмов его регуляции при окислительном стрессе, поэтому в ходе настоящего исследования оценивались основные варианты запуска программированной гибели клеток: митохондриальный, рецепторный (TNF-опосредованный) и ядерный (р53-опосредованный).

В настоящее время накоплено большое количество данных, подтверждающих взаимосвязь между генерацией АФК, функцией митохондрий и реализацией апоптоза [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Показано, что митохондрии могут выступать в качестве мишеней регуляторных молекул при передаче апоптогенного сигнала, а также в роли источника АФК, являющихся сигнальными молекулами данных каскадов [Green D.R., Reed J.C., 1998; Zhu H., Bunn H.F., 2001].

Митохондриальный путь инициации программы апоптоза включает изменения электронного транспорта и клеточного редокс-баланса, потерю митохондриального трансмембранного потенциала, взаимодействие про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2, выход апоптогенных факторов (цитохром с, AIF, Smac/DIABLO) [Liu X. et al., 1996; Antonsson B., 2001; Du C. et al., 2000; Wu G. еt al., 2000; Joza N. еt al., 2001; Li L.Y. et al., 2001; Cory S. еt al., 2002]. Последнее возможно только при повышении проницаемости ее наружной мембраны. В связи с этим нами в качестве показателя, характеризующего вовлеченность митохондриального пути в реализацию апопотоза при окислительном стрессе, оценивалась целостность митохондриальных мембран по показателю трансмембранного потенциала. Он является электрохимическим градиентом протонов, создаваемым цепью переноса электронов на внутренней мембране митохондрий. Рассеивание может происходить за счет открытия неселективных пор пермеабилизационного перехода между наружной и внутренней мембранами митохондрий [Susin S.A. et al., 1998].

Проведенное нами исследование показало, что добавление в культуральную среду Н2О2 в диапазоне концентраций от 10 до 500 мкМ не вызывало изменений уровня митохондриального трансмембранного потенциала мононуклеарных лейкоцитов (р>0,05), число аннексин-положительных клеток также не изменялось (рис. 1). В соответствии с гипотезой J.J. Lemasters et al. [1998], уменьшение в результате повышения проницаемости наружной митохондриальной мембраны является критическим фактором для развития апоптоза. Оказалось, что число клеток со сниженным трансмембранным потенциалом после воздействия 1 мМ перекиси водорода превышало аналогичные значения в контроле в 6,8 раза (р<0,05) (рис. 1), свидетельствуя об активации программированной гибели клеток по митохондриальному пути в условиях окислительного стресса.

Предположение об индукции апоптоза по митохондриальному пути в условиях окислительного стресса подтверждалось наличием положительной корреляции между увеличением числа апоптотически измененных клеток и возрастанием количества мононуклеарных лейкоцитов со сниженным при окислительном стрессе in vitro (r=0,78, p<0,05). Полученые результаты позволяют сделать вывод о том, что в условиях усиленной внутриклеточной продукции АФК передача сигнала апоптоза сопряжена с дисфункцией митохондрий, выражающейся в повышении проницаемости их мембран и снижении .

Другой важнейший путь запуска программы апоптоза, реализуемый в условиях окислительного стресса, - рецепторный [Самуилов В.Д. и соавт., 2000]. Его наиболее распространенный вариант - индукция летальной программы клеток с помощью суперсемейства TNF-рецепторов [Ярилин А.А., 2001]. Данное семейство включает Fas (C95, APO-1), TNF-R1, DR3/WS1-1, DR4/TRAIL-R1, DR5/TRAIL-R2 и DR6, «домены смерти» которых находятся в цитоплазматическом участке и обеспечивают активацию каспазного каскада [Garg A.K., Aggarwal B.B., 2002].

Проведенная нами оценка содержания клеток, несущих на своей поверхности TNFR1 выявила увеличение (в 4,7 раза) количества TNFR1-презентирующих клеток в случае воздействия на культуру мононуклеарных лейкоцитов in vitro 1 мМ перекиси водорода (p<0,05) (рис. 2). Полученные данные свидетельствуют о повышенной готовности клеток к запуску апоптотической программы по рецепторному пути в условиях окислительного стресса.

А В

Рис.2. Содержание TNFR1–презентирующих клеток (А) и уровень TNF в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови (В)

при экспериментальном окислительном стрессе и у больных острыми воспалительными заболеваниями

Поскольку запуск TNF-опосредованного апоптоза обусловливается взаимодействием данного цитокина с соответствующим лигандом, для нас представляло интерес исследование продукции клетками TNF, запускающего внутриклеточный каскад активации каспаз. Основными продуцентами TNF являются моноциты и макрофаги, а также лимфоциты, естественные киллеры и гранулоциты крови [Фрейдлин И.С., 2001].

Оценка содержания TNF в супернатантах культуры мононуклеарных лейкоцитов у здоровых доноров продемонстрировала, что добавление в культуральную среду перекиси водорода в концентрации 1 мМ не приводило к выраженному увеличению продукции TNF клетками (p>0,05). Выявленное отсутствие изменений продукции TNF в условиях окислительного стресса может свидетельствовать о нарушении вовлеченности редокс-сигнальных систем в наработку данного цитокина. Вместе с тем полученные результаты свидетельствуют о повышенной готовности клеток к реализации рецептор-опосредованного пути запуска апоптоза в условиях окислительного стресса in vitro.

Известно, что одной из мишеней АФК в клетке являются нуклеиновые кислоты. Возникающие при этом повреждения ДНК, обусловливающие активацию гена р53, могут приводить к запуску ядерного пути апоптоза [Чумаков П.М., 2000]. Данные, свидетельствующие о вовлеченности р53 в редокс-зависимые пути инициации апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах, представлены в следующих главах.

Активация либо ингибирование программированной гибели клеток, как ведущего механизма ограничения пролиферации клеточных популяций, может лежать в основе развития ряда патологических состояний. С другой стороны, в качестве ведущего патогенетического фактора для большого числа заболеваний выступает окислительный стресс - универсальный механизм повреждения клеток, при котором механизмы генерации АФК являются однотипными. Отличительные особенности образования внутриклеточных АФК можно выявить только на начальных стадиях развития болезни [Дубинина Е.Е., 2001]. Острое воспаление является одним из примеров патологических процессов, характеризующихся как дисбалансом окислительного метаболизма, так и нарушениями реализации апоптоза. При воспалении усиление процессов свободно-радикального окисления сопровождается увеличением наработки АФК, играющих важную роль в регуляции редокс-чувствительных сигнальных систем клетки, экспрессии воспалительных медиаторов, программ выживания или гибели клетки.

Излишняя активация апоптотической гибели клеток может приводить к истощению защитных сил организма, в то время как ее ингибирование - к хронизации воспалительного процесса. Основные эффекторные молекулы воспалительной реакции - АФК, обеспечивая микробицидное, фугицидное и цитотоксическое действие, могут изменять жизнедеятельность всех клеток организма. В связи с этим в проведенном нами исследовании влияние дисбаланса окислительного метаболизма на программированную гибель мононуклеарных лейкоцитов оценивали на модели острого воспаления (внебольничная пневмония и острый аппендицит).

Анализ уровня АФК в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у пациентов с острым воспалением, показал увеличение значений указанного параметра по сравнению с таковым в клетках у здоровых доноров в 2,1 раза (р<0,05) (рис. 1). Известно, что воспалительный процесс в тканях сопровождается значительной продукцией АФК, и прежде всего наиболее стабильной их формы - перекиси водорода [Крыжановский Г.Н., 2002]. Образованная при «дыхательном взрыве» перекись водорода может проникать в рядом расположенные клетки, вызывая в них увеличение продукции АФК за счет разобщения окислительного фосфорилирования. Распространяясь таким образом на значительные расстояния в отсутствие прямых межклеточных контактов, Н2О2 приводит к изменениям структуры и функции клеток крови, в частности, к зарегистрированному нами повышению продукции АФК мононуклеарными лейкоцитами крови, полученными у больных острыми воспалительными заболеваниями.

В результате исследования количества апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из крови у пациентов с внебольничной пневмонией и острым аппендицитом, было продемонстрировано повышение данного показателя в 7,3 и 7,7 раза, соответственно, по сравнению с нормой (p<0,05) (рис. 1). Влияние окислительного стресса на развитие апоптоза мононуклеарных лейкоцитов подтверждалось наличием положительной корреляции между повышением уровня АФК и возрастанием количества аннексин-положительных мононуклеарных лейкоцитов при экспериментальном окислительном стрессе (r=0,84, p<0,05) и острых воспалительных заболеваниях (r=0,71, p<0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличение внутриклеточной продукции АФК является одним из ведущих факторов интенсификации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при воспалении.

Помимо окислительного стресса, апоптоз, как это показано выше, также относится к типовым универсальным механизмам дизрегуляции клеточного гомеостаза, лежащим в основе развития большого числа распространенных заболеваний, в том числе воспалительных процессов.

Оценка выраженности апоптоза в культуре мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из крови у пациентов с внебольничной пневмонией, показала увеличение данного показателя до 9,98(8,79-11,33)% по сравнению с контролем (p<0,05) (рис. 1). Количество апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, полученных у больных острым аппендицитом (10,46(9,83-10,94)%), также достоверно превышало их содержание в норме (p<0,05).

Отсутствие различий показателей апоптотической активности мононуклеарных лейкоцитов у больных острым аппендицитом, определенных с использованием лазерной проточной цитофлуориметрии и TUNEL-метода (р>0,05), подтверждает адекватность примененного нами аннексинового теста для характеристики реализации летальной программы клеток.

Относительное содержание апоптотических клеток в культурах мононуклеарных лейкоцитов у больных острым воспалением (внебольничная пневмония и острый аппендицит) оказалось достоверно ниже их количества при окислительном стрессе in vitro (р<0,05) (рис.1). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что острый воспалительный процесс характеризуется нарушением редокс-гомеостаза и сопровождается активацией процессов апоптотической гибели мононуклерных лейкоцитов крови.

Оценка количества мононуклеарных лейкоцитов со сниженным показала, что данная величина при остром воспалении в 5,6 раза превышала аналогичный параметр в контроле (р<0,05) и не отличалась от таковой в случае экспериментального окислительного стресса (р>0,05) (рис. 1).

Таким образом, нарушения баланса окислительного метаболизма мононуклеарных лейкоцитов, как в случае индукции окислительного стресса перекисью водорода, так и в случае острого воспаления (внебольничная пневмония и острый аппендицит) сопровождаются возрастанием числа клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий.

Численность TNFR1-экспрессирующих клеток, выделенных из крови у больных острыми воспалительными заболеваниями, превышала в 4,5 раза соответствующие параметры в интактной культуре (p<0,05). По полученным данным, индуцируемый добавлением в культуральную среду перекиси водорода окислительный стресс и острый воспалительный процесс сопровождаются повышением готовности клеток к реализации TNF-опосредованного программированного механизма летальной программы клеток. Подтверждением этому служат результаты проведенной нами оценки продукции TNF мононуклеарными лейкоцитами крови при остром воспалении. Анализ уровня продукции TNF- показал, что величина этого показателя повышалась по сравнению с контролем в культурах мононуклеарных лейкоцитов крови, полученных у больных острым воспалением (p<0,05) и достоверно превышала таковую при окислительном стрессе in vitro (p<0,05).

В целом, проанализировав данные, характеризующие особенности реализации апоптоза при окислительном стрессе, полученные на первом этапе настоящего исследования, можно утверждать, что возрастание уровня АФК в мононуклеарных лейкоцитах крови сопряжено с активацией митохондриального и ядерного вариантов запуска апоптотической гибели, а также с повышенной готовностью инициации рецепторного пути (рис. 1).

Следующий этап нашего исследования был посвящен изучению молекулярных редокс-чувствительных механизмов данного явления, позволяющему идентифицировать молекулярные мишени для коррекции нарушений апоптоза при окислительном стрессе.

В настоящее время выявлено большое число сигнальных путей, регулируемых АФК. Среди них в наибольшей степени изучены механизмы, основанные на фосфорилировании и дефосфорилировании белков специфическими киназами и фосфатазами [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. В частности, универсальными трансмиттерами сигналов от множества трансмембранных рецепторов к внутриклеточным компартментам являются МАР-киназы. К числу последних относятся митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38, фосфорилирующие ответственные за реализацию летальной программы клеток белки-мишени, среди которых важное место занимают факторы транскрипции NF-kB и р53 (Gallo K.A., Johnson G. L., 2002). Активируемые киназами NF-kB и р53, в свою очередь, контролируют синтез ключевых белков-регуляторов апоптоза. Выбор про- или антиапоптогенной функции данными элементами сигнальной трансдукции зависит от особенностей инициирующих сигналов, комбинации возможных путей их передачи и типов клеток.

РОЛЬ МАР-КИНАЗ В РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

Различные воздействия на клетку - цитокины, гормоны, факторы роста и др. – обусловливают активацию определенных элементов системы сигнальной трансдукции [Гусев Н.Б., 2000]. Ее важнейшими звеньями являются протеинкиназы, активирующие друг друга по каскадному принципу. Особая роль в реализации клеточного ответа принадлежит редокс-чувствительным МАР (Mitogen-activated protein) киназам (МАРК). Данные киназы представлены тремя семействами: р38 (протеинкиназа 38 кДа), JNK/SAPK (c-Jun N-terminal kinase/Stress activated protein kinase) и ERK (Extracellular signal-regulated kinase). Последние  ответственны за выживание и пролиферацию клеток, в то время как активация киназ семейств р38 и JNK/SAPK связана с инициацией апоптоза [Xia Z., Dickens M. et al., 1995; Потехина Е.С., Надеждина Е.С. 2002; Gallo K.A., Johnson G.L., 2002; Владимирская Е.Б., 2004].

JNK и p38 протеинкиназы фосфорилируют проапоптотические белки-мишени, связанные с регуляцией программированной клеточной гибели и функционированием соответствующих факторов транскрипции [Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004]. Вместе с тем, ряд исследований свидетельствуют о наличии антиапоптотической активности JNK и p38 [Zechner D. et al., 1998; Craig R. et al., 2000; Hoover H.E. et al., 2000; Andrekа P. et al., 2001], зависящей от природы индуцирующего сигнала, сопутствующих условий стимуляции и типов клеток. В связи с этим возникает необходимость более подробного изучения роли стресс-активируемых протеинкиназ JNK и p38 в реализации летальной программы клеток при окислительном стрессе.

Активация JNK играет ведущую роль в запуске летальной программы клеток в ответ на стресс (воздействие воспалительных цитокинов IL-1 и TNF-, свободных радикалов и др.) [Srivastava R.K., 1999]. Наиболее подвержен стрессовым воздействиям (в частности, при повреждении белков) механизм активации JNK, связанный с ингибированием JNK-инактивирующих фосфатаз [Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004]. Вместе с тем JNK может оказывать и антиапоптогенное действие: выявлена активация процессов NO-индуцированного апоптоза за счет экспрессии доминант-негативной JNK1 либо доминант-негативной МКК4 [Andrekа P. et al., 2001]. Показано предотвращение апоптоза кардиомиоцитов (в условиях ишемии) ингибированием JNK1 [Hreniuk D. et al., 2001].

JNK может индуцировать апоптоз путем фосфорилирования и активации фактора транскрипции р53 по Thr8 [Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004]. Известно, что редокс-чувствительная киназа JNK играет важную роль в митохондриальном пути реализации апоптоза [Tournier C. et al., 2000; Aoki H. et al., 2002; Baines C.P., Molkentin J.D., 2002]. Установлено, что JNK-киназа может проникать в митохондрии, где фосфорилирует и активирует проапоптотические белки Bax и Bad, а также инактивирует антиапоптотические белки семейства Bcl-2 [Fan M. et al., 2000; Tournier C. et al., 2000; Chawla-Sarkar M. et al., 2003; Harada C., Nakamura K., 2006]. Так, H. Aoki et al. [2002] показали, что активированные JNK и МКК4, локализованные в митохондриях, индуцируют высвобождение цитохрома с и усиливают апоптоз кардиомиоцитов. В литературе имеются сведения о том, что JNK, независимо от каспазы-8, непосредственно активирует расщепление Bid, облегчая таким образом реализацию митохондриального пути клеточной смерти [Deng J. et al., 2003]. Наконец, JNK киназа прямо фосфорилирует два дополнительных про-апоптотических белка Bim и Bmf, облегчая тем самым их транслокацию в митохондрии [Lei K., Davis R.J., 2003].

Роль р38 в реализации программированной гибели также неоднозначна. Установлено, что трансфекция МКК6 - элемента р38 киназного каскада - вызывает фосфорилирование шаперона α-В-кристаллина, усиливая антиапоптотический эффект [Zechner D. et al., 1998; Craig R. et al., 2000; Hoover H.E. et al., 2000]. По данным C. Communal et al. [2000], ингибирование р38 приводит к увеличению апоптотической активности кардиомиоцитов.

Вместе с тем результаты большого числа исследований свидетельствует о вовлеченности р38 в индукцию летальной программы клеток. Ингибирование р38 блокирует апоптоз кардиомиоцитов, индуцированный ишемией, в культуре и in vivo [Zhu W. et al., 1999; Kang Y.J. et al., 2000; Sharov V.G. et al., 2003]. Активация р38 способствует экспрессии и митохондриальной трансдукции одного из важнейших апоптогенных белков - Вах, опосредуя свое влияние через фосфорилирование р53 [Kim S.J. et al., 2002; Mayr M. et al., 2002].

Таким образом, стресс-активируемые киназы, с одной стороны, являются неотъемлемым элементом системы регуляции летальной программы, а с другой, - играют ключевую роль в процессах пролиферации и дифференцировки клеток. Однако условия и факторы, способствующие проявлению апоптогенной функции МАР киназ (в том числе окислительный стресс), требуют детального изучения.

Для выяснения роли JNK, р38 в регуляции программы апоптоза при окислительном стрессе в нашей лаборатории было проведено двухэтапное исследование. На начальном этапе применялся широко распространенный подход к изучению функций МАР-киназ, основанный на оценке результатов эксперимента при их избирательном блокировании. В нашем исследовании регистрировалась активность процесса апоптоза в культурах клеток, инкубируемых с селективными ингибиторами JNK и р38 (SP600125 и ML3403, соответственно) в присутствии 100 мкМ либо 1 мМ Н2О2 (рис. 3).

Полученные данные свидетельствуют о том, что добавление ингибитора JNK (так же как и ингибитора р38) в культуру мононуклеарных лейкоцитов крови препятствовало увеличению числа аннексин-положительных клеток при окислительном стрессе in vitro и снижало их содержание у пациентов с острым воспалением.

Рис. 3. Содержание апоптотических клеток в общей популяции мононуклеарных лейкоцитов крови, при окислительном стрессе в условиях культивирования in vitro с ингибиторами МАР-киназ

Примечание: а - контроль; б - окислительный стресс in vitro; в - культивирование с 1 мМ Н2О2 и ингибитором ML3403; г - культивирование с 1 мМ Н2О2 и ингибитором SP600125; д - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями; е - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в условиях in vitro c ML3403; ж - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в условиях in vitro c SP600125

Таким образом, результаты проведенного исследования продемонстрировали, что ингибирование МАР-киназ р38 и JNK препятствует реализации программированной клеточной гибели мононуклеарных лейкоцитов в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Полученные данные могут служить доказательством того, что в условиях окислительного стресса мононуклеарных лейкоцитов МАР-киназы JNK и р38 выступают в качестве проапоптогенных регуляторных молекул. Это предположение согласуется с приводящимися в литературе сведениями о защитной роли ингибиторов р38 и JNK в случае сердечной дисфункции и апоптоза кардиомиоцитов, индуцированного ишемией [Meldrum D.R. et al., 1998; Barancik M. et al., 2000; Schneider S. et al., 2001]. Так, апоптоз кардиомиоцитов, индуцированный ишемией и доксорубицином в культуре, снижался при ингибировании р38 МАРК [Zhu W. et al., 1999; Kang Y.J. et al., 2000; Sharov V.G. et al., 2003]. V.L.Gabai et al. [2000] показали, что ингибирование JNK в Н9с2 миоцитах блокировало апоптоз, вызванный окислительным стрессом.

При обсуждении результатов, полученных в экспериментах с ингибиторами МАР-киназ, возникают следующие вопросы: каковы молекулярные механизмы проапоптогенного эффекта МАР-киназ в условиях изменения редокс-статуса клетки; сопряжена ли данная функция JNK и р38 с увеличением содержания в мононуклеарных лейкоцитах их активных (фосфорилированных) форм, которые могут оказывать воздействие на другие мишени - элементы сигнальной системы (факторы транскрипции, белки-регуляторы апоптоза); чем может быть обусловлено это увеличение – изменением общего содержания киназ при окислительном стрессе за счет увеличения их экспрессии, либо только активацией процесса фосфорилирования?

Результаты проведенной методом вестерн-блоттинга оценки содержания в мононуклеарных лейкоцитах общих и фосфорилированных форм JNK и р38 показали, что при окислительном стрессе, индуцированном добавлением 1мМ Н2О2 в культуру клеток, полученных у здоровых доноров, общее содержание  JNK (JNK1 и JNK2) и р38  не изменялось по сравнению с контролем. Аналогичные результаты были получены и в клинике острого воспаления – общий уровень JNK и р38 в мононуклеарных лейкоцитах в этом случае соответствовал норме. Вместе с тем содержание фосфорилированных форм МАР-киназ (р-JNK и р-р38) увеличивалось по отношению к контролю при инкубации мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, с 1мМ Н2О2, и в клетках крови у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями (рис. 4, 5). Полученные данные свидетельствуют о том, что при окислительном стрессе увеличение уровня р-JNK и р-р38 обусловлено АФК-зависимой активацией процесса фосфорилирования и не связано с изменением активности экспрессии данных ферментов в клетке.

АФК могут влиять на активность JNK и р38 посредством различных реакций [Brumell J.H., 1996; Турпанов К.Т., 2002; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. В частности, АФК активируют белки MAPK Kinase Kinase (в частности, белок ASK1- Apoptosis signal-regulating kinase 1, активирующий как JNK, так и р38), которые запускают сигнальный каскад [Tobiume K. et al., 2001; Matsuzawa A., Ichijo H., 2005]. JNK удерживается в неактивной форме глутатион-S-трансферазой класса Pi (GSTPi). Под действием Н2О2 происходит диссоциация этого комплекса и активация киназы JNK [Mathers J. et al., 2004; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Гидроксиноненаль - конечный продукт перекисного окисления липидов - образует аддукт с JNK, вызывая ее активацию [Дубинина Е.Е., 2001]. АФК инактивируют фосфатазы, отщепляющие фосфатные группы от специфических ферментов, вызывая тем самым их инактивацию [Klein J.A, Ackerman S.L., 2003; Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004]. Повышенный уровень АФК часто коррелирует с активацией фосфорилирования JNK и р38 [Baines C.P. et al., 2005; Gautam D.K. et al., 2005; Teraishi F. et al., 2005; Cho S.D. et al., 2006], что подтверждается результатами настоящего исследования.

Рис. 4. Содержание общих и фосфо-форм р38 МАРК в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе

(содержание белка р38 в интактной культуре здоровых доноров принято за 100%)

При окислительном стрессе МАР-киназы опосредованно влияют на реализацию программы апоптоза, участвуя в регуляции продукции ряда цитокинов. В указанном аспекте нами было рассмотрено влияние JNK и р38 на продукцию IL-8 и IL-10 мононуклеарными лейкоцитами при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении. С одной стороны, продукция IL-8, обусловленная NF-B-зависимой индукцией промотора гена IL-8, может служить косвенным признаком активации данного транскрипционного фактора, предположительно участвующего в апоптозе; IL-10 интересовал нас в силу своего антиапоптогенного действия. С другой стороны, данные цитокины обладают про- и антивоспалительным эффектами (IL-8 и IL-10 соответственно), что еще более обосновывает целесообразность оценки их продукции в случае острого воспаления.


Рис. 5. Содержание общих и фосфо-форм JNK1/2 в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

(содержание JNK1/2 в интактной культуре у здоровых доноров принято за 100%)

Как свидетельствует проведенное исследование, содержание провоспалительного цитокина IL-8 в супернатантах исследованных культур мононуклеаров превышает контрольные значения в случае окислительного стресса in vitro и при остром воспалении. Редокс-чувствительная киназа JNK (в отличие от р38) влияет на продукцию IL-8, что подтверждается экспериментом с использованием селективного ингибитора SP600125; ингибитор р38 МАРК ML3403 не обладает таким эффектом (рис. 6).

Представленные результаты вполне согласуются с данными литературы, в соответствии с которыми ингибитор JNK SP600125 блокирует экспрессию мРНК IL-8 и уменьшает продукцию данного цитокина различными клетками (эндотелиоциты, альвеолоциты А549, бронхиальные эпителиоциты человека) [Li L.F. et al., 2003; Saatian B. et al., 2006]. Для экспрессии воспалительных медиаторов — цитокинов, металлопротеиназ и адгезивных молекул - необходима активация JNK в присутствии АФК [Kathleen A., Johnson G. L., 2002; Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004].

Регуляция IL-8 МАР-киназами отличается в зависимости от природы стимулов [Shapiro L., Dinarello C.A., 1995; Li L.F. et al., 2003; Kim M.S. et al., 2005; Harimaya A. et al., 2007] и типа клетки [Hashimoto S. et al., 1999; Li J. et al., 2002; Oudin S., Pugin J., 2002; Li L.F. et al., 2003; Aydin M. et al., 2007]. Окислительный стресс, вызванный экзогенной Н2О2, индуцирует синтез IL-8 в эпителиальных и эндотелиальных клетках [Lakshminarayanan V. et al., 1997; Shimada T. et al., 1999]. Этот факт подтверждают и результаты проведенного нами эксперимента. После культивирования мононуклеарных лейкоцитов крови, полученной у здоровых доноров, с 1 мМ Н2О2 определялось, как было показано выше, повышенное содержание IL-8 в супернатантах клеток (рис. 6).

Рис. 6. Содержание IL-8 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов при ингибировании МАР-киназ р38 и JNK в условиях окислительного стресса  in vitro и при остром воспалении

Примечание: а - контроль; б - окислительный стресс in vitro; в - культивирование клеток с 1 мМ Н2О2 и ингибитором JNK SP600125; г – культивирование клеток с 1 мМ Н2О2 и ингибитором р38 ML3403; д - интактная культура клеток у больных острым аппендицитом; е - интактная культура клеток у больных внебольничной пневмонией; ж - инкубирование клеток у больных острыми воспалительными заболеваниями с ингибитором JNK SP600125; з - инкубирование клеток у больных острыми воспалительными заболеваниями с ингибитором р38 ML3403

Роль р38 МАР-киназы в регуляции синтеза IL-8 неоднозначна. Так, по данным ряда авторов, ингибитор р38 МАРК (SB 203580) значительно снижает продукцию данного цитокина, опосредуя свое действие через NF-kB [Kim M.S. et al., 2005; Saatian B. et al., 2006; Harimaya A. et al., 2007]. Напротив, L.F. Li et al. (2003) показали, что ингибирование р38 МАРК не вызывает снижение экспрессии и секреции IL-8, предположив, что регуляция данных процессов осуществляется через активацию АР-1, NF-kB, зависящую от JNK и NIK (NF-kB-inducing kinase).

Еще одним важным цитокином, продуцируемым мононуклеарными лейкоцитами крови при острых воспалительных заболеваниях, сопровождающихся окислительным стрессом, является интерлейкин-10. Известно, что IL-10 способен подавлять апоптоз [Go N.F. et al., 1990]. Имеются многочисленные сведения о способности этого цитокина ингибировать апоптоз В-лимфоцитов, активированных Т-клеток [Pawelec G. et al., 1996; Cohen S.B. et al., 1997; Рубцова И.Е. и соавт., 2004].

Результаты проведенного нами исследования свидетельствуют об отсутствии изменений содержания IL-10 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов как в случае окислительного стресса in vitro так и при острых воспалительных заболеваниях.

Для выяснения роли р38 и JNK МАР-киназ в регуляции синтеза IL-10 в условиях окислительного стресса мы использовали их селективные ингибиторы (ML3403 и SP600125, соответственно). В результате настоящего исследования было показано, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма ни р38, ни JNK не влияют на продукцию IL-10 мононуклеарами. Отсутствие изменений синтеза IL-10 в условиях окислительного стресса и при ингибировании МАР-киназ наводит на мысль об отсутствии участия обозначенных редокс-сигнальных систем в продукции данного цитокина.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что роль киназ JNK и р38 в регуляции апоптоза и продукции клетками IL-8 и IL-10 в условиях острого воспаления весьма неоднозначна. Факт возрастания продукции IL-8 может свидетельствовать об активации в условиях воспалительного процесса JNK транскрипционных факторов (в частности, NF-kB). Последний в ряде случаев может выполнять как про-, так и антиапоптогенную функцию. Отсутствие возрастания продукции антиапоптотического цитокина IL-10 может являться одним из условий для активации летальной программы клеток. Кроме того, в рассмотренных условиях имеет место отчетливый дисбаланс между продукцией про- и антивоспалительных цитокинов (IL-8 и IL-10, соответственно) в пользу первых.

В целом, рассмотренные в данной главе результаты исследования свидетельствуют об участии МАР-киназ JNK и р38 в реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе в условиях in vitro и в клинике острого воспаления. Регуляторное влияние данных МАР-киназ может быть опосредовано другими редокс-чувствительными элементами внутриклеточных систем сигнальной трансдукции, в частности транскрипционными факторами. Среди последних важнейшую роль в инициации/блокировании летальной программы клеток играют р53 и NF-kB, влияющие на баланс про- и антиапоптогенных белков-регуляторов.

УЧАСТИЕ РЕДОКС-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОГРАММЫ АПОПТОЗА

ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

Известно, что АФК влияют на жизнеспособность клетки, изменяя экспрессию генов за счет транскрипционных факторов, которые связываются с регионами генов-мишеней и изменяют их транскрипцию. Находясь в цитоплазме в неактивном состоянии, данные факторы не могут влиять на генетическую информацию. Сигнальное событие (непосредственное воздействие АФК, фосфорилирование киназами и др.) приводит к транслокации белковых субъединиц транскрипционного фактора в ядро [Wenger R.H., 2000].

Одним из важнейших редокс-регулируемых транскрипционных факторов является р53. Под контролем p53 находится огромное число генов, белковые продукты которых в ответ на различные стрессорные воздействия индуцируют апоптоз, клеточное старение или арест деления клетки [Моргункова А. А., 2005]. Другим транскрипционным фактором, активирующимся в условиях окислительного стресса, является NF-kB. Данный протеин играет существенную роль в регуляции иммунного ответа, воспалительной реакции, а также в контроле клеточного деления и апоптоза [Pahl H.L., 1999; Bonizzi G., Karin M., 2004; Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006].

Механизмы взаимодействия транскрипционных факторов NF-kB и р53 относятся к числу наиболее противоречивых вопросов в оценке влияния генотоксического стресса на жизнедеятельность клетки. Несмотря на накопленный к настоящему времени фактический материал о роли NF-kB и р53 в жизнедеятельности клетки, существуют значительные пробелы в оценке исходов активации данных транскрипционных факторов в зависимости от природы индуцирующего сигнала и сопутствующих условий стимуляции. Неоднозначность влияния данных транскрипционных факторов на реализацию апоптоза затрудняет понимание их участия в возникновении нарушений летальной программы клеток при окислительном стрессе. Данное обстоятельство явилось предпосылкой для проведения нами исследования роли NF-kB и р53 в реализации прогаммированной гибели при дисбалансе окислительного метаболизма.

Методом вестерн-блоттинга нами было зарегистрировано появление р53 в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров, после воздействия на клетки перекиси водорода в концентрации 1мМ; примечательно, что данный белок отсутствовал в контроле и в клетках, полученных у больных пневмонией. По данным литературы, р53 имеет короткий период полужизни и, в зависимости от типа клеток и природы стрессового сигнала, инактивируется в течение 6-20 мин MDM2 убиквитин-лигазой [Dornan D. et al., 2004]. Отсутствие р53 в мононуклеарах, выделенных из периферической крови у больных внебольничной пневмонией, несмотря на высокий уровень внутриклеточной продукции АФК, может быть обусловлено, на наш взгляд, образованием комплекса р53-MDM2 в результате более продолжительного, по сравнению с экспериментальной моделью, нарушения окислительного баланса в организме.

Результаты исследования свидетельствуют, что при культивировании мононуклеарных лейкоцитов с селективными ингибиторами JNK и р38 в условиях эксприментального окислительного стресса имеет место снижение содержания фосфо-формы белка р53 (рис. 7). Следует заметить, что применение как ингибитора JNK (SP600125), так и р38 (ML3403) предотвращало запуск апоптогенной программы, индуцированной окислительным стрессом. Таким образом, полученные данные подтверждают факт участия редокс-чувствительных киназ JNK и р38 в р53-опосредованном апоптозе. С позиции р53 могут быть объяснены выявленные нами особенности реализации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе.

Известно, что р53 необходим для реализации митохондриального пути апоптоза [Juin P. еt al., 2002; Moll U.M. et al., 2005]. Он способствует снижению трансмембранного митохондриального потенциала и выходу цитохрома с в цитоплазму, так как связывает антиапоптотические протеины Bcl-2 и Bcl-XL [Prives C., Hall P.A., 1999; Fridman J.S., Lowe S.W., 2003]. Как свидетельствуют данные литературы, р53 способен осуществлять транскрипционный контроль апоптотических протеинов семейства Bcl-2 (мультидоменный Bax, только-BH3 протеины: PUMA, Noxa, Bid) [Nakano K., Vousden K.H., 2001; Oda E. et al., 2001; Sax J.K. et al., 2002].

Рис. 7. Содержание фосфо-формы р53 в мононуклеарных лейкоцитах крови у здоровых доноров в условиях окислительного стресса при ингибировании

МАР-киназ р38 и JNK

(уровень фосфо-формы р53 в культуре мононуклеарных лейкоцитов в условиях инкубирования с 1мМ Н2О2 принят за 100%)

Транскрипционный фактор NF-kB сформирован из нескольких субъединиц (чаще всего из р50/RelA(p65) частиц) [Hayden M.S., Ghosh S., 2004]. Анализ содержания р65 субъединицы в мононуклеарных лейкоцитах показал, что данный белок появляется в клетках, полученных у здоровых доноров, после воздействия на них 1 мМ Н2О2 и присутствует в мононуклеарных лейкоцитах, выделенных из крови у больных внебольничной пневмонией. Индукция NF-kB происходит при высвобождении р65 частицы из комплекса с ингибитором за счет фосфорилирования последнего IkB-киназным комплексом. Подобный «классический» вариант активации наблюдается при воздействии воспалительных цитокинов, таких как TNF- и IL-1, под влиянием бактериальной инфекции и липополисахаридов [Haddad J., 2002]. Также активация NF-kB может быть опосредована каскадом TNF-TNFR1-TRADD–RIP-NIK-киназа–NF-kB и атипичными индукторами (УФ-излучение, гипоксия/реоксигенация, перекись водорода, лекарственные вещества) [Mukhopadhyay A. et al., 2000; Bui N.T. et al., 2001; Bonizzi G., Karin M., 2004; Hayden M.S., Ghosh S., 2004]. В нашем случае при добавлении экзогенной перекиси водорода в культуру клеток, полученных у здоровых доноров и больных острым воспалением, в мононуклеарных лейкоцитах происходило появление активной формы NF-kB. Полученные результаты позволяют предполагать доминирующую роль АФК в индукции данного транскрипционного фактора при дисбалансе окислительного метаболизма. Возможно, активирующие сигналы при остром воспалении (TNF-, бактериальные липополисахариды), наряду с АФК, приводят к высвобождению NF-kB из комплекса с ингибитором. Однако показано, что р65 субъединица вызывает индукцию генетической транскрипции IkB частицы, которая может связаться с NF-kB и вернуть его в неактивное состояние [Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Viatour P. et al., 2005]. Подобная негативная регуляция функции NF-kB может объяснять одинаковый уровень данного транскрипционного фактора в клетках при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении.

Таким образом, в нашей работе продемонстрирована редокс-зависимая активация NF-kB – фактора, ответственного за выживание клеток и пролиферацию [Kucharczak J. et al., 2003; Perkins N.D., 2004], и р53, индуцирующего апоптоз [Schmitt C.A. et al., 2002; Soussi T., 2005; Levine A. et.al., 2006], на что указывало появление р53 и незаингибированной формы NF-kB в мононуклеарных лейкоцитах крови под действием 1 мМ перекиси водорода. Однако, как свидетельствуют полученные ранее данные, результирующим вектором актвации р53 и NF-kB является повышение апоптотической реакции клеток, что свидетельствует о неэффективности антисуицидальной регуляции NF-kB. Показано, что указанные транскрипционные факторы конкурируют между собой за один пул генов–коактиваторов, поэтому недостаток транскрипционной активности NF-kB связывают с ее повышением для р53 [Mattson M.P., Meffert M.K., 2006].

В литературе существует ряд гипотез, объясняющих отсутствие антиапоптотического эффекта активации NF-kB. Так, по данным N.D. Perkins, T.D. Gilmore [2006], функция NF-kB из антиапоптотической может трансформироваться в проапоптотическую в зависимости от природы индуцирующего сигнала. Существует другая гипотеза, объясняющая проапототическую роль NF-kB под действием ряда стимулов (например, УФ-излучение, доксорубицин). Показано, что высвобождение RelA субъединицы из комплекса с ингибитором является лишь первым этапом функционирования NF-kB. Вторая фаза заключается в перемещении  транскрипционного фактора из цитоплазмы в ядро, при котором может происходить модификация NF-kB, приводящая к изменению его транскрипционного потенциала [Chen L.F., Greene W.C., 2004]. Однако итоговый результат транскрипционной активности NF-kB и р53 определяется во многом особенностями ответа генов-мишеней [Ho W.C. et al., 2005]. В связи с этим следующим шагом нашего исследования явилась оценка экспрессии м-РНК и содержания белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе.

СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ АПОПТОЗА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

Среди генов, являющихся мишенями NF-kB и р53, важную роль в регуляции летальной программы клеток играют гены, кодирующие белки семейства Bcl-2 с про- и антиапоптотической функцией. Баланс системы этих белков определяет исход индукции программированной гибели. Данное соотношение может определяться как активацией экспрессии соответствующих генов, так и посттрансляционной модификацией протеинов [Wenger R.H., 2000; Chen L. et al., 2005]. Чтобы выяснить, вовлечены ли указанные механизмы в дизрегуляцию апоптоза клеток при окислительном стрессе, нами было проведено исследование, результаты которого отражены в данной главе.

Про- и антиапоптогенные белки регулируют реализацию программы апоптоза, а модуляция баланса различных активирующих и ингибирующих взаимодействий данных протеинов играет определяющую роль в судьбе клетки. В связи с этим при изучении молекулярных механизмов регуляции летальной программы в условиях окислительного стресса особый интерес для нас представляло исследование экспрессии и содержания про- и антиапоптотических белков (Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad). Мы исходили из предпосылок, что взаимодействие данных протеинов определяется состоянием редокс-зависимых сигнальных систем клеток, включающих в том числе МАР-киназы и факторы транскрипции NF-kB и р53. Если МАР-киназы могут непосредственно фосфорилировать белки-регуляторы апоптоза, действуя на посттрансляционном уровне, то транскрипционные факторы изменяют экспрессию соответствующих генов-мишеней. Исходя из данного предположения, в нашем исследовании определялись экспрессия м-РНК и содержание белков в мононуклеарных лейкоцитах при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении. Кроме того, для оценки роли редокс-чувствительных МАР-киназных систем сигнальной трансдукции в механизмах нарушения баланса про- и антиапоптогенных белков при окислительном стрессе, было исследовано содержание Bcl-2 и Вах в мононуклеарных лейкоцитах, инкубированных с селективными ингибиторами SP600125 и ML3403.

Полученные методом ПЦР в реальном времени данные свидетельствуют о повышении по сравнению с контролем (p<0,05) уровня экспрессии мРНК гена bcl-XL в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении (табл. 2).

Таблица 2

Уровень экспрессии мРНК (усл.ед.) генов bcl-2, bcl-XL и bax в мононуклеарных лейкоцитах крови у здоровых доноров, при экспериментальном окислительном стрессе и у больных внебольничной пневмонией (Me(Q1-Q3))

Регистриру-емый показатель

Интактные клетки

Клетки, инкубированные с 1мМ Н2О2

Клетки, полученные у больных внебольничной пневмонией

bax

0,39(0,23-0,63)

1,64(1,02-1,96) p1<0,05

1,21(1,02-1,45)

p1<0,05

р2>0,05

bcl-XL

0,50(0,35-0,60)

1,79(1,52-2,27) p1<0,05

0,89(0,69-1,64)

p1<0,05

р2>0,05

bcl-2

1,67(1,37-2,96)

3,23(2,63-3,71) p1>0,05

2,77(1,79-4,13) p1>0,05

р2>0,05

Примечание:

p1 - достоверность различий по сравнению с аналогичными показателями в интактной культуре мононуклеарных лейкоцитов; p2 - по сравнению с окислительным стрессом in vitro.

Известно, что ген bcl-XL кодирует антиапоптотический белок семейства Bcl-2 и является мишенью NF-kB [Kucharczak J. et al., 2003]. В связи с этим логично было бы ожидать, что активация NF-kB приводит к индукции антисуицидальных генов-мишеней. Вместе с тем, как свидетельствуют представленные выше данные, несмотря на адекватную стимуляцию NF-kB-зависимого антиапоптотического ответа, мононуклеарные лейкоциты вступают на путь программированнной гибели в условиях увеличения внутриклеточной АФК-продукции. При этом исследование содержания Bcl-XL в мононуклеарных лейкоцитах крови у здоровых доноров (интактная культура, экспериментальный окислительный стресс) и у пациентов с острым воспалением не выявило различий (рис. 8). Полученные данные, вероятно, правомерно объяснить посттрансляционной модификацией Bcl-XL, приводящей к изменению его нативной структуры и функции. В частности, возможна модификация указанного белка в результате фосфорилирования или взаимодействия с регуляторными ВН3-протеинами [Willis S.N. et al., 2005].

Анализ уровня экспрессии мРНК гена bcl-2 и содержания антиапоптотического белка Bcl-2 в мононуклеарных лейкоцитах не выявил каких-либо достоверно значимых различий по сравнению с контролем в случае воздействия Н2О2 на клетки здоровых доноров и в случае острого воспаления.

А  В

  С

Рис .8. Содержание Вах (А), Bcl-2 (В) и Bcl -XL (С) в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении (содержание белков в интактной культуре здоровых доноров принято за 100%)

Описанные результаты исследования являются косвенным доказательством отсутствия редокс-чувствительного механизма регуляции активности Bcl-2 или подавления функции данного белка при дисбалансе окислительного метаболизма. Для того, чтобы проверить данное предположение, мы оценивали внутриклеточное содержание Bcl-2 при окислительном стрессе в присутствии ингибиторов МАР-киназ SP600125 и ML3403. Оказалось, что уровень белка Bcl-2 в мононуклеарных лейкоцитах крови, полученной у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, возрастал как при действии ингибитора SP600125, так и ML3403. Это свидетельствовало в пользу того, что МАРК-опосредованные редокс-чувствительные механизмы препятствуют увеличению содержания антиапоптотического Bcl-2 в клетках при окислительном стрессе.

Исходя из полученных данных, отсутствие адекватного увеличения содержания в клетках антисуицидальных белков Bcl-XL и Bcl-2 в ответ на апоптогенный стимул при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении может быть причиной зарегистрированного нами повышения количества аннексин-положительных мононуклеарных лейкоцитов.

Следующим этапом нашего исследования было изучение содержания и экспрессии генов проапоптотических белков в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе. Оценка уровня мРНК гена bах продемонстрировала статистически достоверное возрастание содержания мРНК гена bах относительно контрольного значения (p<0,05) в мононуклеарных лейкоцитах у больных с острым воспалением, а также в условиях экспериментального окислительного стресса. Вместе с тем, значимые различия экспрессии мРНК bах при окислительном стрессе in vitro и внебольничной пневмонии (р>0,05) отсутствовали.

Известно, что ген bах является мишенью транскрипционного фактора р53 [Sax J.K. et al., 2002]. С нашей точки зрения, увеличение экспрессии указанного гена свидетельствует об эффективной трансактивационной функции р53 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Отсутствие различий экспрессии bax при окислительном стрессе in vitro и в случае острого воспаления позволяет предположить схожий механизм активации р53 в обеих ситуациях, несмотря на отсутствие белка р53 (за счет образования комплекса р53-MDM2) в клетках, полученных у больных внебольничной пневмонией.

Анализ внутриклеточного содержания проапоптотического протеина Вах, проведенный методом вестерн-блоттинга, показал, что в мононуклеарных клетках крови у пациентов с острым воспалением величина исследованного параметра превышала контрольные значения. Инкубация мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, с 1 мМ перекисью водорода приводила к возрастанию уровня Вах по сравнению с нормой, который, однако, не отличался от соответствующего параметра в группе больных острым воспалением. Добавление в культуральную среду ингибиторов МАР-киназ SP600125 и ML3403 снижало содержание белка Bax в мононуклеарных лейкоцитах у больных с острым воспалением. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении редокс-чувствительных механизмов в регуляцию содержания проапототического белка Bax при окислительном стрессе.

Поскольку важную роль в регуляции взаимоотношений между анти- и проапоптотическими белками семейства Bcl-2 играет группа ВН3-только протеинов (Bad, Bim, tBid, PUMA, Noxa и др.), нами также была проведена оценка экспрессии мРНК гена bad и содержания белка Bad в мононуклеарных лейкоцитах в условиях окислительного стресса. Данный белок, а также мРНК гена bad, не были выявлены в мононуклеарных лейкоцитах у здоровых доноров (интактные культуры), при индукции окислительного стресса перекисью водорода и в случае острого воспаления. Полученные данные указывают на отсутствие активации транскрипции гена bad при окислительном стрессе.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о повышении экспрессии мРНК генов как анти-, так и проапоптотических белков (Bcl-XL и Вах, соответственно) в мононуклеарных лейкоцитах у здоровых доноров (при добавлении в культуральную среду 1 мМ перекиси водорода) и у больных с внебольничной пневмонией. При этом изменения уровня мРНК гена bcl-2, обладающего антисуицидальной активностью, отсутствовали во всех случаях, а экспрессия мРНК гена bad в нашем иследовании обнаружена не была. Поскольку ген bcl-xL является мишенью ядерного фактора NF-kB, а ген bах – транскрипционного фактора р53, нами было высказано предположение, что в условиях окислительного стресса происходит активация данных транскрипционных факторов, выполняющих анти- и проапоптотические функции, соответственно. Проведенное нами исследование содержания белков-регуляторов апоптоза семейства Bcl-2 свидетельствует о возрастании содержания проапоптотического протеина Вах в мононуклеарных лейкоцитах крови как в случае экспериментального окислительного стресса, так и при остром воспалении. Отсутствие изменений внутриклеточного уровня антиапоптотических Bcl-XL и Bcl-2 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма может обусловливаться как посттрансляционными модификациями данных белков, так и регулирующим влиянием МАР-киназных каскадов (в случае Bcl-2) (рис. 9).

В целом, в ходе проведенного нами исследования оценены редокс-чувствительные элементы сигнальной трансдукции апоптогенных сигналов мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса. Установлено, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма

Рис. 9. Роль элементов внутриклеточной сигнальной трансдукции в механизмах дизрегуляции апоптоза при окислительном стрессе (по данным литературы и результатам собственных исследований (выделено))

важную роль в реализации летальной программы клеток играют МАР- киназы JNK и p38. Активация факторов транскрипции NF-B и p53 (за счет их фосфорилирования МАР-киназами и/или воздействия АФК) приводит к изменению уровня экспрессии генов, кодирующих белки-регуляторы апоптоза семейства Bcl-2. Последние играют решающую роль в выборе клеточного ответа при окислительном стрессе. Данные протеины могут изменять свою активность в результате взаимодействия друг с другом, под влиянием вышестоящих компонентов редокс-чувствительных сигнальных систем, а также окислительной модификации. Наряду с этим, АФК выступают в роли вторичных мессенджеров, опосредующих активацию ключевых белков-регуляторов апоптоза.

Идентифицированные нами редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем, участвующих в модуляции программы апоптоза при окислительном стрессе, могут выступать в качестве мишеней для терапевтической коррекции нарушений летальной программы. Полученные данные в дальнейшем послужат основой для разработки способов управления программированной гибелью клетки при патологиях, сопровождающихся дисбалансом окислительного метаболизма, с применением молекул, опосредованно регулирующих функцию про- и антиапоптогенных сигнальных систем. Это позволит повысить эффективность существующих методов патогенетической терапии большого числа социально-значимых заболеваний, характеризующихся дизрегуляцией клеточной гибели.

ВЫВОДЫ

  1. В условиях экспериментального окислительного стресса, индуцированного воздействием на мононуклеарные лейкоциты крови 1 мМ Н2О2, увеличение числа апоптотически измененных клеток сопряжено с активацией митохондриального и TNF-опосредованного рецепторного путей запуска летальной программы клеток.
  2. В процессе реализации летальной программы мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе in vitro участвуют редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем (МАР-киназы р38 и JNK, факторы транскрипции NF-kB и р53).
  3. В условиях дисбаланса окислительного метаболизма в мононуклеарных лейкоцитах активация апоптогенной системы сигнальной трансдукции, осуществляемой с участием редокс-чувствительных МАР-киназ JNK и р38, сопряжена с увеличением уровня их фосфо-форм.
  4. При окислительном стрессе in vitro селективное ингибирование редокс-чувствительной киназы JNK SP600125 приводит к снижению продукции мононуклеарными лейкоцитами IL-8. В условиях дисбаланса окислительного метаболизма МАР-киназы р38 и JNK не участвуют в регуляции продукции IL-10.
  5. Активация фактора транскрипции р53 в условиях окислительного стресса в клетках обусловлена его фосфорилированием МАР-киназами и/или непосредственным эффектом АФК.
  6. При окислительном стрессе in vitro в мононуклеарных лейкоцитах увеличивается содержание проапоптотического белка Вах, не изменяется содержание антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-XL, проапоптотический белок Bad в клетках отсутствует.
  7. Механизмы изменения экспрессии генов bcl-XL и bax при окислительном стрессе связаны с активацией транскрипционных факторов р53 и NF-kB.
  8. При остром воспалителительном процессе (острый аппендицит, внебольничная пневмония), сопровождающемся нарушениями окислительного метаболизма, молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза сопряжены с активацией МАР-киназ, факторов транскрипции, нарушением баланса про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2.
  9. Редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем (МАР-киназы р38, JNK, факторы транскрипции и белки семейства Bcl-2) являются молекулярными мишенями для терапевтической коррекции нарушений апоптотической программы при окислительном стрессе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Состояние митохондриального пути апоптоза лимфоцитов крови при хронических вирусных гепатитах / О.Б. Жукова, Л.С. Литвинова, В.В. Новицкий, И.О. Наследникова, Н.Ю. Часовских // Тезисы докладов 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины».- Астрахань, 5-10 мая 2006.- Астрахань.- 2006.- С. 126.
  2. Цитокины и противовирусный иммунитет / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, В.В. Белоконь, А.П. Зима, О.Б. Жукова, И.О. Наследникова, Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, Н.Ю. Часовских // Успехи физиологических наук. – 2006. – Т. 37, № 4. – С. 34-44.
  3. Влияние рекомбинантных форм интерлейкинов-5, -3 и эотаксина на апоптоз эозинофильных гранулоцитов / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Л.С. Литвинова, С.Б. Ткаченко, Ю.В. Колобовникова, О.Б. Жукова, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, Е.Н. Кнутарева, Т.Т. Радзивил, Н.Ю. Часовских // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 143, № 4. – С. 370-373.
  4. Модуляция программируемой гибели лимфоцитов периферической крови при хронической вирусной инфекции / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Т.Т. Радзивил, Л.С. Литвинова, Н.Ю. Часовских // Цитология. – 2007. – Т. 49, № 1. – С. 26-31.
  5. Изменение реакции лимфоцитов крови на апоптозмодулирующие факторы при вирусной инфекции / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Т.Т. Радзивил, Л.С. Литвинова, Н.Ю. Часовских // Бюллетень СО РАМН. – 2007. – Т. 128, № 6. – С.44 - 48.
  6. Стресс-активируемая протеинкиназа JNK - молекулярная мишень для коррекции дизрегуляции апоптоза при патологических состояниях, сопровождающихся дисбалансом окислительного метаболизма / Н.Ю. Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова и др. // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения, больных в многопрофильном лечебном учреждении» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007.- Вестник Российской военно-медицинской академии (приложение). – Санкт-Петербург. - 2007. – С. 497.
  7. Ингибиторование митоген-активированных протеинкиназ p38 и JNK как молекулярный механизм коррекции нарушений программированной гибели клеток при воспалении / Н.Ю. Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова и др.// Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения, больных в многопрофильном лечебном учреждении» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007.- Вестник российской военно-медицинской академии (приложение). - Санкт-Петербург. – 2007. – С. 497-498.
  8. Часовских, Н.Ю. Влияние окислительного стресса на реализацию апопототической программы мононуклеаров периферической крови в условиях in vitro / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Е.В. Кайгородова // Материалы межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007. - Санкт-Петербург, 2007. – С. 139.
  9. Часовских, Н.Ю. Роль протеинкиназ Р38 и JNK (С-Jun NH2-terminal kinases) в дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса in vitro / Н.Ю. Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова / Материалы межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007. - Санкт-Петербург – 2007. – С. 140.
  10. Часовских, Н.Ю. TNFR-1 опосредованный и митохондриальный пути запуска апоптотической программы в условиях окислительного стресса  in vitro / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Е.В. Кайгородова // Материалы межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007. - Санкт-Петербург, 2007. – С. 141.
  11. Митохондриальный, TNF- и р53–опосредованные пути реализации апоптотической программы мононуклеаров в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Е.В. Кайгородова и др. // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» - г. Абакан, 17-19 мая 2007. – Абакан, 2007.- С. 29 - 30.
  12. Часовских, Н.Ю. Молекулярные механизмы реализации апоптотической программы мононуклеаров в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова // Материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» г. Томск, 17-18 мая 2007.- Томск, 2007.- С. 208-209.
  13. Кайгородова, Е.В. Роль митоген-активируемых протеинкиназ JNK(С-Jun NH2-terminal kinases) и р38 в регуляции апоптоза мононуклеаров периферической крови в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении / Е.В. Кайгородова, Н.Ю. Часовских // Материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» Томск, 17-18 мая 2007.- Томск. – 2007.- С.182-183.
  14. Дизрегуляция летальной программы мононуклеаров в условиях окислительного стресса / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Ю.В. Стариков и др. // Материалы III всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - г. Новосибирск, 7–9 ноября 2007. – Медико-фармацевтический журнал. – Новосибирск, 2007. – С.85.
  15. Роль протеинкиназ JNK и р38 в реализации программы апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса in vitro / Н. Ю.Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова и др. // Материалы III всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» - Новосибирск, 7 – 9 ноября 2007. – Медико-фармацевтический журнал. – 2007. – С.84 - 85.
  16. Модуляция апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Н.Ю. Часовских и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. - №3.- С. 251-254.
  17. Роль митогенактивированных протеинкиназ JNK и р38 в регуляции апоптоза мононуклеаров крови в условиях окислительного стресса in vitro / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Н.Ю. Часовских и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. - №5.- С. 505-509.
  18. Редокс-зависимая регуляция апоптоза: адаптивная роль активных форм апоптоза при окислительном стрессе / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Н.Ю. Часовских и др. // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. – 2008. – Т. 94, № 6. – С. 710-718.
  19. Часовских, Н.Ю./ Роль протеинкиназ JNK и р38 в регуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе // Бюллетень сибирской медицины. – 2008. – № 3. – С.38-42.
  20. Регуляторная роль оксида азота в апоптозе нейтрофилов / Е.А. Степовая, Т.В. Жаворонок, Ю.В. Стариков, В.А. Бычков, Н.Ю. Часовских и др.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – № 12. - С. 646-650.
  21. Часовских, Н.Ю. Апоптоз и окислительный стресс / Н.Ю. Часовских, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий. – Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2009. – 148 с.
  22. Белки семейства Вcl-2 участвуют в редокс-зависимой дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при воспалении / Н.Ю. Часовских, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий и др. // Иммунология. – 2009. – Т. 30, № 2. – С. 98-101.
  23. Роль факторов транскрипции р53 и NF-B в редокс-зависимой дизре-гуляции апоптоза / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Н.Ю. Часовских и др. // Вестник РАМН. – 2009. – № 4. – С. 3-10.
  24. Роль редокс-зависимых сигнальных систем в регуляции апоптоза при окислительном стрессе / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Н.Ю. Часовских и др. // Цитология. – 2009. – Т. 51, № 4. – С. 329-334.
  25. Митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38 являются редокс-зависимыми молекулярными мишенями нарушения апоптоза при окислительном стрессе / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Е.В. Кайгородова, Н.Ю. Часовских, Е.Г.Старикова // Успехи физиологических наук. – 2009. – Т. 40, № 2. – С. 3-11.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК – активные формы кислорода

ФИТЦ - флюоресцеинизотиоцианат

УФ-излучение – ультрафиолетовое излучение

ANT – транслокатор адениловых нуклеотидов

IkB – ингибитор kappa B

VDAC – порин-вольтаж зависимый канал




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.