WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Богданов Алексей Алексеевич

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ ПРИ ПОМОЩИ БИОСОВМЕСТИМЫХ ЗОНДОВ: НОВЫЕ ПОДХОДЫ

Специальность 03.00.02 Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

МОСКВА 2009

Работа выполнена в Центре Молекулярного Имаджинга Главного Госпиталя Штата Массачузеттс (г. Бостон) и Медицинском отделении Массачузеттского Университета  (г. Вустер).

Официальные оппоненты:

Академик РАН и РАМН,  докт. биол. наук, профессор Ткачук Всеволод Арсеньевич

Чл.-корр. РАН, докт. физ.-мат. наук Гурский Георгий Валерьянович

Докт. хим. наук, профессор Польшаков Владимир Иванович

Ведущая организация: 

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и  Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится «29» октября 2009 г. в 15.30 ч.  на заседании Диссертационного совета Д.501.001.96 по биологическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу:  119991 Москва, Ленинские горы,  д. 1, стр. 13, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, аудитория "Новая".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан  «________»  _________________ 2009 г. 

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор                         Кренделева Т.Е. 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микроскопическое исследование морфологии образцов тканей традиционно является одним из главнейших методических подходов в экспериментальной биологии уже на протяжении нескольких столетий. Тем не менее, потребности развития современной биологии диктуют необходимость проведения исследований биохимических процессов в интактных (живых) системах. Внедрение неинвазивных методов диагностики в экспериментальную биологию представляет собой одну из наиболее активно развивающихся областей биомедицины.  Применение методов неинвазивной диагностики в биологических  исследованиях позволяет: 1) получать и анализировать информацию, отражающую изменение физиологических и молекулярных параметров во времени в живом организме с высоким пространственным разрешением, т.е. вплоть до уровня визуализации отдельных клеток (шкала разрешения  от 50 мкм до 2 мм); 2) одновременно регистрировать различные классы изображений, анатомически точно картирующие живые ткани и отражающие функциональный статус органов; 3)  более эффективно внедрять достижения фундаментальной физико-химической биологии непосредственно в клинические испытания. В последнее время широкую известность получила неинвазивная диагностика на молекулярном уровне (т.н. «molecular imaging»), основанная либо на использовании сигнала молекулярных зондов, введенных искусственно, либо на  интерпретации сигнала, вызванного присутствием эндогенных молекул живой системы. Молекулярная неинвазивная диагностика в живых системах развивается на стыке многих наук, включающих, прежде всего, медицинскую физику, биофизику, синтетическую органическую химию и молекулярную биологию. В последние годы на практике было показано, что одним из необходимых условий для успешного проведения неинвазивной диагностики на молекулярном уровне является применение молекулярных зондов (т.н. «репортеров»), которые обладают способностью генерировать специфические сигналы, отражающие наличие компонентов микроокружения зонда в живом организме. Эти сигналы регистрируются при помощи современных диагностических методов (магнитно-резонансная томография (МРТ), гамма сцинтиграфия, позитронно–эмиссионная томография (ПЭТ), оптическая визуализация флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне).  Для применения подобных зондов в живых системах необходимым условием является наличие биосовместимости, специфичности и низкой эффективной (граничной) концентрации зонда в живой ткани организма. В 90-х и начале  2000-х годов нами были разработаны несколько классов подобных биосовместимых зондов для визуализации биологически важных процессов в живых интактных системах. Наиболее широкое практическое использование и научное признание получили биосовместимые зонды для визуализации: 1) лизосомной и экстраклеточной ферментативной активности катепсинов; 2) визуализации ангиогенеза и аномальной проницаемости стенки сосудов;  3) оксидоредуктазной (в том числе, пероксидазной) активности. Эти три класса зондов объединяет способность усиливать специфические сигналы, которые регистрируются приборами, разработанными для диагностической визуализации в живых системах. Их активность в первом случае основана на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции (как излучательного, так и темного), а во втором и третьем случаях – на эффекте увеличения молярной релаксивности парамагнитных катионов (т.е. изменения способности укорачивать времена релаксации протонов воды). Это происходит за счет положительных изменений корреляционных времен в парамагнитных зондах, достигнутых либо с применением методов химической иммобилизации, либо в результате ферментативной реакции.  Все три класса диагностических зондов в настоящее время успешно используются для решения нескольких фундаментальных и прикладных задач в ряде лабораторий, в том числе, в качестве коммерчески доступных макромолекулярных оптических зондов для преклинических исследований (Visen Medical, Inc.), МРТ препаратов для преклинического тестирования экспериментальных лекарственных средств (Novartis Research Inst., Sanofi) или в качестве носителя для доставки биологически активных пептидов и рекомбинантных белков (PharmaIn Corp).

Целью работы явилось развитие методических подходов к визуализации специфической ферментативной активности и активации факторов транскрипции в живых системах. В качестве основных направлений работы были выбраны прикладные исследования, целью которых являлось изучение ответа живого организма на стимуляцию воспалительного каскада, в частности, модельное исследование визуализации оксидоредуктазной активности  при развитии нестабильной атеромы и рака, а также активации стромы и ангиогенеза в раковых опухолях. 

Задачи исследования. Для достижения целей работы были поставлены и поэтапно решены следующие задачи:

  1. Разработка и синтез макромолекулярного наноносителя (PGC) для диагностических меток (НМН).
  2. Изучение поведения парамагнитного аналога PGC в кровотоке нормальных животных и в экспериментальных моделях рака, ишемии головного мозга и инсульта с помощью МРТ.
  3. Создание зонда для оптической визуализации протеолиза в живых системах на основе PGC.
  4. Изучение и идентификация источников протеолитической активности в раковых опухолях путем флуоресцентной визуализации в интактных животных в ближнем инфракрасном диапазоне длин волн.
  5. Разработка, синтез и изучение свойств парамагнитных субстратов оксидоредуктаз (пероксидаз растений и миелопероксидазы), а также тирозиназ и лакказ.
  6. Разработка метода визуализации активности миелопероксидазы в модельных системах в качестве маркера нестабильной атеромы.

Научная новизна и практическая значимость. В 1992 году нами был впервые разработан и запатентован макромолекулярный синтетический парамагнитный нанозонд (Protected Graft Copolymer, PGC), с характерной длительной циркуляцией в кровотоке и относительно узким молекулярно-массовым распределением.  Этот зонд был использован для визуализации обьема крови в моделях рака и тромбоза легочных артерий, а также для одновременного определения объема и скорости кровотока в головном мозге в норме и патологии при индуцированном ишемическом инсульте. Использование PGC в сочетании с МРТ показало, что этот нанозонд позволяет определить эффективность антиангиогенных терапевтических средств на ранних стадиях испытаний на экспериментальных животных. Высокоэффективное мечение PGC радиоизотопом 99mТс дало возможность провести предварительные клинические испытания (Фаза 1А) этого зонда в качестве макромолекулярного радиоизотопного маркера для вентрикулографии, а также позволило исследовать некоторые особенности метаболизма PGC в организме человека.

Важной особенностью подобных контрастирующих веществ (зондов) является сильное изменение свойств диагностических меток в ковалентно связанной форме.  В то время как релаксивность парамагнитных хелатов Gd(III) (т.е. способность катионов гадолиния к сокращению времени релаксации координированных протонов воды), связанных с PGC, возрастает в несколько раз, интенсивность флуоресценции ковалентно связанных молекул инфракрасных флуорохромов резко уменьшается. Использование этого явления в исследованиях на животных впервые позволило использовать возрастание интенсивности флуоресценции в ткани в результате деградации PGC лизосомными катепсинами для полуколичественной оценки протеолитической активности в раковых опухолях. Дальнейшие исследования на моделях рака позволило идентифицировать фракции клеток опухолей с наиболее выраженной протеолитической активностью, присутствие которых связано с повышенной инвазивностью аденокарцином.

В начале 2000-х годов нам впервые удалось показать, что каталитическую активность пероксидаз в живой ткани можно обнаруживать с помощью МРТ, при условии, если в качестве восстанавливающего субстрата были использованы парамагнитные моно- и бис- фенэтиламидные или оксииндолэтиламидные производные хелатов парамагнитного Gd(III) в качестве пероксидазо- чувствительных контрастирующих зондов. Данные производные восстанавливают окисленные формы пероксидаз с высокой эффективностью, и в результате ферментативного окисления вступают в реакции гомоолигомеризации, а также ковалентной модификации белков, и, тем самым, повышают релаксивность хелатированного гадолиния. Релаксометрические измерения показали, что МРТ сигнал возрастает преимущественно за счет удлинения корреляционного времени реориентации спинов протонов воды (τр), взаимодействующих с локальным электромагнитным полем парамагнитного катиона. Данные контрастирующие зонды были использованы для визуализации трех классов оксидоредуктаз: 1) миелопероксидаз (т.е. эндогенных высокомолекулярных белков первичных секреторных гранул гранулоцитов); 2) пероксидаз растений, используемых в качестве меток для ферментативного обнаружения антител, связанных с антигенами в системах in vitro, а также in vivo; 3) тирозиназ; 4) лакказ. Миелопероксидаза (МПО) секретируется преимущественно нейтрофилами,  при трансмиграции через стенку сосудов в ответ на локальную активацию эндотелиальных клеток. Активация происходит в результате воздействия различных эндогенных и экзогенных факторов, с высокой вероятностью приводящим к развитию ишемической болезни. Обнаружение миелопероксидаз в живой ткани организма при помощи неинвазивной диагностики позволяет проводить прямое обнаружение очагов воспаления в стенке кровеносных сосудов, что важно для проведения оценки нестабильности атеросклеротической бляшки. Подобная оценка нестабильности при помощи МРТ была проведена нами в живых моделях спонтанного атеросклероза и экспериментального аневризма сонных артерий.  Детекция миелопероксидазной активности, проведенной на основе анализа результатов томографической визуализации ферментативной активности, в отличие от определения концентрации МПО в плазме крови,  позволит различать стабильные и нестабильные атеросклеротические бляшки и определять степень риска острых сердечно- сосудистых заболеваний. Подобная же практическая направленность наших исследований на живой модели, полученной искусственно с применением катетеризации и частичной окклюзии сонной артерии кролика, позволила произвести оценку специфичности визуализации воспаления в области расширения стенки экспериментальной аневризмы.  Как и в случае атеросклеротического поражения стенок сердечно-сосудистой системы, развитие нестабильности аневризм артерий головного мозга зависит от интенсивности местных воспалительных процессов. Предсказание нестабильности аневризмы на основании МРТ визуализации с применением парамагнитных субстратов миелопероксидазы важно потому, что субарахноидальное кровоизлияние из разорвавшейся аневризмы приводит к геморрагическому инсульту с летальным исходом у 55-60% пациентов.

Обнаружение ферментативной активности иммуноконъюгатов в живых системах при помощи МРТ было впервые предложено и исследовано нами в 2001 году с применением модельных систем с целью визуализации клеток, экспрессирующих маркеры клеточной поверхности, типичные для онкологической трансформации. Активность данных рецепторов (например, EGFR, т.е. рецептора эпидермального фактора роста)  можно ингибировать антителами, которые препятствуют димеризации рецепторов и, как следствие, ингибируют рецептор-опосредованную передачу сигнала. Мы показали, что блокирующие химерные антитела, используемые в клинических испытаниях в качестве антипролиферативного средства при раке головы и шеи, можно ковалентно связывать с пероксидазами для визуализации рецепторположительных опухолей. Эксперименты, проведенные  с помощью МРТ в живых моделях плоскоклеточной карциномы и глиомы человека у атимусных мышей и крыс, соответственно, показали, что после двухстадийного последовательного внутривенного введения конъюгатов антител и субстрата происходит не только общее возрастание МРТ сигнала (по сравнению с контрольным введением  субстрата без конъюгатов), но и замедление скорости выведения  парамагнитного МРТ контраста, связанное с образованием олигомеров и хелат-белковых конъюгатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Разработанный макромолекулярный носитель (PGC) является нанобиотехнологической системой, предназначенной для синтеза зондов-носителей диагностических меток, используемых для проведения исследований в живых системах с применением МРТ, радиоизотопных и флуоресцентных методов.
  2. Связывание парамагнитных катионов PGC приводит к 2-3 кратному увеличению молярной спин-спиновой и спин-решеточной релаксации. Визуализация и биораспределение парамагнитного зонда на основе PGC в кровотоке нормальных животных свидетельствует о длительном времени полужизни при отсутствии детектируемой токсичности и иммунногенности.
  3. PGC применим для визуализации и слежения за изменениями перфузируемого объема крови, отражающими особенности кровоснабжения раковой опухоли и ответ на антиангиогенную терапию.
  4. Ковалентное связывание карбоцианиновых красителей с PGC приводит к самотушению флуоресценции, позволяя разрабатывать зонды для визуализации источников протеолитической активности в раковых опухолях с применением флуоресцентной визуализации в интактных животных в ближне-инфракрасном диапазоне длин волн.
  5. Низкомолекулярные конъюгаты парамагнитных хелатов и  соединений, содержащих монофенольные  или триптаминовые остатки, являются эффективными субстратами-восстановителями пероксидаз, катализирующих образование продуктов с высокой релаксивностью парамагнитного Gd(III). Визуализация рецепторов на поверхности клеток может быть достигнута с применением МРТ, пероксидазной амплификации и  парамагнитных зондов пероксидазной активности. 
  6. Зонды пероксидазной активности позволяют производить визуализацию локальных очагов тканевой миелопероксидазы в модельных системах. Визуализация миелопероксидазной активности при помощи разработанных зондов позволяет определять наличие нестабильности в атероме и аневризме сосудистой стенки.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на открытом семинаре Радиологического факультета Университета штата Массачузеттс (февраль 2009 г.). Основные результаты работы были доложены на следующих международных конференциях:

Международном симпозиуме «Современные методы спектроскопии в исследовании структуры и функции биополимеров в биологии и медицине» (Май 2007, Дубна);  Международного общества магнитного резонанса в медицине ISMRM: (Берлин, 1992 г.; Нью- Йорк, 1993 г.; Сан Франциско, 1994 г.; Сидней 1998 г.; Гонолулу, 2003 г.; Киото, 2004 г.; Сиаттл, 2006 г.; Берлин, 2007 г.);

Североамериканского радиологического общества RSNA (Чикаго 1992 г., 1997 г., 2003 г.);

Американской ассоциации по изучению рака AACR (Сан Франциско 2002 г.; Вашингтон, 2003 г., 2005 г.; Лос Анджелес 2005 г., Денвер 2009 г.); 

Общества ядерной медицины SNM (Торонто, 2001 г.); 

Американского химического общества ACS (Филадельфия, 2004 г.); 

Academy of Molecular Imaging AMI (Орландо 2002 г., Сан Диего, 2003 г.; 2004 г. (1-e место в категории научных докладов);

The Society of Molecular Imaging  SMI (Бостон, 2002 г.; Сан Франциско, 2003 г.; Сант Луис, 2004 г.; Кельн, 2005 г.; Провиденс, 2007 г.; Ницца, 2008 г.);

Гордоновской конференции по доставке лекарств (Блу Скай, Монтана 2004 г.); Международных конференциях по наномедицине и доставке лекарств (Балтимор, 2005 г.; Торонто, 2008 г.);

The Controlled Release Society CRS (Ницца, 1994 г.; Палм Бич, 2007 г.)

На Нобелевском Форуме (Стокгольм, 2007 г.).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных исследований и обработки полученных результатов, а также в проведении теоретических исследований. Основные результаты получены либо лично автором, либо под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации

Результаты исследования опубликованы в 102 работах, включающих статьи, монографии, тезисы конференций и патенты. Диссертация обобщает данные  44 основных статей.

Структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 220 страницах, содержит 44 рисунка и 12 таблиц. Список литературы включает 350 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА  I.  ПРИНЦИПЫ НЕИНВАЗИВНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ

Глава посвящена анализу литературных данных. При анализе использованы обзорные статьи и монографии из различных областей применения комбинированных методов неинвазивной визуализации и направленной доставки диагностических контрастирующих веществ (КВ). В обзоре подробно освещены принципы и основы фермент чувствительной диагностики в живых системах.

ГЛАВА II.  ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАБОТЫ

II.А МЕТОД МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ ТОМОГРАФИИ И

КОНТРАСТИРУЮЩИЕ ЗОНДЫ

Метод магнитно-резонансной томографии (МРТ) основан на эффекте “пространственной кодировки”, позволяющей наблюдать эффект ядерного магнитного резонанса (ЯМР) только в определяемом исследователем пространственном фрагменте, часто называемым “срезом” объекта. Возможность достижения томографического эффекта при помощи ЯМР была впервые продемонстрирована П. Латербуром в 1973 г. Впоследствии метод МРТ был кардинально модифицирован с применением градиента внешнего магнитного поля,  что позволяет достичь определенной резонансной частоты возбуждения ядерного спина строго в определяемым исследователем срезе трехмерного пространства. На этом принципе основаны современные МРТ методы. МРТ позволяет управлять процессами релаксации макроскопической магнетизации (М) в данной единице объема исследуемого объекта. Радиочастотный импульс, отклоняет  вектор М от положения равновесия, т.е. от ориентации по внешнему полю Во. После отключения импульса М продолжает вращение около Во с угловой скоростью, соответствующей частоте Лармора (Рис. 1А). Благодаря процессам релаксации вектор М возвращается в положение равновесия. Механизм возвращения Мz компонента М в положение равновесия называется спин-решеточной или Т1-релаксацией, а уменьшение Мxy составляющей до нуля называется Т2- или спин-спиновой релаксацией. Т1-релаксация (т.е. переход на более низкий энергетический уровень ядра) стимулируется любым флуктуирующим магнитным полем с частотой Лармора, т.е. угловой скоростью, необходимой для достижения энергетического перехода. Флуктуирующее магнитное поле, которое создается в результате броуновского движения молекул, вызывает также случайные изменения угловой частоты спинов и «флип-флоп» переходы, которые вызывают потерю фазовой когерентности у вращающихся ядерных спинов. В результате фазовая дисперсия увеличивается и Мxy составляющая уменьшается, чему способствуют негомогенности магнитного поля (Т2-эффекты).

Рис. 1. Релаксация магнетизации и контрастирующие вещества. А– во время возбуждающего радиочастотного импульса (поле В1) вектор магнетизации М отклоняется на флип угол 1 и прецессирует относительно Во с угловой скоростью 1 (соответсвующей частоте Лармора). Проекция М на ось z’ (в Декартовой системе координат х’y’z’) со временем возрастает (Т1 релаксация), а проекция М в плоскости х’y’ уменьшается до нуля (Т2 релаксация) Б–Схема, иллюстрирующая процессы релаксации протонов молекул воды во внутренней (ВКО) и во внешней координационных оболочках хелатированного Gd(III). M – время жизни молекулы воды во ВКО. R – ротационное корреляционное время.

Главной целью использования КВ в МРТ является ускорение процессов релаксации спинов протонов воды в окружающей ткани, т.е. укорачивание спин-решеточного Т1 и спин- спинового Т2 времен релаксации. Первое парамагнитное КВ, т.е. раствор соли Mn(II),  было использовано для достижения контраста в МРТ в работах Латербура в конце 1970-х годов. В настоящее время в качестве КВ получили широкое применение соли гадолиния Gd(III),  так как катион Gd(III) имеет 7 неспаренных f-электронов, и симметричное S-состояние, что определяет, с одной стороны, большой магнитный момент, а с другой – медленную релаксацию электронов, что необходимо с точки зрения эффективности парамагнитного  КВ. Общая теория релаксации в разбавленных растворах парамагнитных веществ была разработана Блюмбергеном, Соломоном и Морганом в 1950-х годах. Согласно этой теории, частота релаксации (релаксивность R(1,2)=1/T(1,2), т.е. величина обратная времени релаксации) в присутствии катиона Gd(III) 1/Т(1,2) =1/Тd(1,2) +1/Tp(1,2)=1/Тd(1,2)+r(1,2)[Gd], где 1/Тd(1,2) диамагнитный терм, описывающий релаксацию в отсутствие КВ; а r – т.н. молярная релаксивность, являющаяся коэффициентом пропорциональности между релаксивностью и [Gd]- концентрацией парамагнитного катиона. Обычно под релаксивностью понимают протонную релаксивность. Парамагнитная релаксация протонов воды происходит из-за диполь-дипольных взаимодействий между ядерными спинами и флуктуирующим локальным магнитным полем КВ, которое создается благодаря наличию спина у неспаренных электронов. Для того, чтобы парамагнитный эффект релаксации влиял на большое число протонов молекул, они должны находиться в непосредственной сфере воздействия поля КВ, так как это поле быстро уменьшается при удалении от парамагнитного атома. Для комплексов парамагнитных металлов подобным специфическим взаимодействием является координационное связывание молекул воды  с КВ, т.е. взаимодействие во внутрнней координационной оболочке (Рис.1). Кроме внутреннеоболочечного эффекта существует также внешнеоболочечный, который зависит от стохастической поступательной диффузии протонов вблизи КВ. Кроме того, молекулы воды образуют водородные связи с хелатирующим веществом. Эти молекулы воды во вторичной координационной оболочке вносят вклад во внешнеоболочечный эффект. Таким образом, суммарная релаксивность протонов воды в упрощенном виде  равна сумме релаксивностей, где R= RIS+ ROS , IS внутренняя оболочка, а OS внешняя оболочка. Величина обратная времени спин-решеточной релаксации во внутренней координационной оболочке (т.е. релаксивность) записывается в виде: 1/Т1=(([Gd].q)/55.5)(T1m+m)-1, где q число молекул воды связанных с Gd (число гидратации), T1m время релаксации связанной воды и m время жизни молекулы воды во внутренней координационной оболочке.

Релаксация связанных с хелатированным парамагнитным катионом протонов воды (T1m) описывается с применением двух формальных механизмов: 1) диполь-дипольного, т.е. описывающего релаксацию под влиянием: а) реориентации вектора взаимодействия ядерного спина и электронного спина, б) изменениями в ориентации электронного спина и в) кинетикой обмена протонов; 2) скалярного, который не зависит от взаимной реориентации молекул, а зависит только от электронной релаксации и скорости обмена протонов воды. Таким образом, 1/T1m = 1/TDD + 1/TSC . В общем случае оба компонента можно записать в виде функций общего вида:  1/TDD =k.f (1/r6GdH, c2, c1, 2S, 2I ),  1/TSC = k.f (2S, е2), т.е. диполь–дипольный компонент релаксивности обратно пропорциональны шестой степени расстояния между электронным спином катиона металла и протонным спином (rGdH) и сложным образом зависят от времен корреляции и ядерной и электронной частоты Лармора. Время корреляции записывается в виде: 1/c=1/R+1/Tе+1/m, где R ротационное (спиново-вращательное) корреляционное время, т.е. время реорентации вектора металл-протон, Tе - время  релаксации спина электронов иона металла.  Поскольку Gd(III) образует ионные связи, а протоны удерживаются координационными связями на большом расстоянии от парамагнитного центра, скалярное спаривание спинов вносит крайне малый вклад в суммарную релаксацию,  и, поэтому, релаксация протонов воды под влиянием парамагнитных катионов лантанидов протекает преимущественно по диполь -дипольному механизму.

Релаксация протонов в присутствии хелатированных парамагнитных катионов подвержена воздействию целого комплекса факторов. Если хелатирующее вещество препятствует образованию координационных связей между водой и катионом во внутренней оболочке, число гидратации катиона q<1, а релаксивность хелатированного катиона значительно меньше, чем релаксивность гидратированного катиона. Наиболее часто используемые на практике хелаты Gd(III) и Mn(II) допускают образование координационной связи с q=1. Если выполняется соотношение T1m<<m, то скорость обмена координированных с КВ молекул воды является единственным определяющим фактором релаксивности. Если же обратное соотношение верно, т.е. m<<T1m, наблюдаемая релаксивность определяется исключительно скоростью релаксации координированных протонов, т.е. параметром 1/T1m, который, в свою очередь, зависит от скорости обмена протонов воды, спиново-вращательной и электронной релаксаций.

Таким образом, анализ зависимости спин-решеточной релаксивности (1/Т1) от параметра T1m показывает, что при создании новых КВ именно эти два фактора (т.е. скорость обмена протонов координированной воды и вращательная свобода хелатированного парамагнитного иона) оказывают наибольшее влияние на конечную релаксивность и, как следствие, на эффективность КВ в биологических системах. Модуляция релаксивности за счет перехода из свободного в связанное, т.е. иммобилизованное на макромолекуле, состояние парамагнитного КВ было использовано нами при создании полимерного парамагнитного КВ (PGC, см. Гл. IIА), а также при разработке фермент чувствительных сенсоров пероксидаз (см. Гл. V).

II.Б ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНЫХ КОНТРАСТИРУЮЩИХ ЗОНДОВ ДЛЯ МУЛЬТИКОМПАРТМЕНТНОГО АНАЛИЗА ТКАНИ

Компартментализация различных КВ в живой ткани в применении к МРТ может быть  описана с применением упрощенной модели, в которой сосудистый, интерстициальный и внутриклеточный компоненты представляют собой отдельные протонные пулы, находящиеся в состоянии взаимного равновесного обмена протонами воды (Рис.2).  Так как клеточные мембраны интактных клеток во временной шкале МРТ исследования ткани представляют собой в норме практически непроницаемые барьеры для водорастворимых КВ, данную модель можно упростить и рассматривать обмен между кровеносным потоком (сосудистым компонентом) и экстрасосудистым пространством. В условиях, когда изменение магнитной восприимчивости () после введения КВ невысоко, например, при напряженности поля 0.5-3Т в клинических МРТ системах, влиянием Т2* (связанным с уменьшением спин-спинового времени релаксации протонов воды под влиянием микрогетерогенности поля) на релаксацию воды обычно пренебрегают. Вследствие того, что разработанный нами зонд PGC-Gd (см.Гл. Гл. IIА) обладает большим гидродинамическим диаметром (5<Dh<10 нм), экстравазация PGC-Gd протекает крайне медленно. В условиях медленной скорости (низкой частоты) обмена протонов воды между кровотоком и внешнесосудистым объемом, которая близка к трансмембранному обмену молекулами воды в эритроцитах, т.е. 1 Гц, абсолютный объем крови может быть рассчитан как отношение изменений интенсивности МРТ сигнала в ткани и в кровотоке  VBABS = SIТ /SIB. Локальное изменение МРТ сигнала измеряется как разность интенсивностей сигнала до и после введения КВ. В условиях эксперимента измерение SIТ производится в ткани, в то время как SIB определяют в кровеносном сосуде (вене или артерии), изображение которого получено на том же томографическом срезе. Приведенная выше формула может быть использована только при выполнении следующих условий: 1) концентрация КВ должна быть постоянной в течение МРТ исследования (примерно 45 мин), 2) мембраны эритроцитов непроницаемы для КВ, в то время как протоны воды быстро обмениваются через мембраны эритроцитов, 3) обен молекул воды через эндотелиальные барьеры происходит медленно, 4) время релаксации зависит от концентрации КВ в плазме крови и произведена корректировка с учетом местных различий в уровне гематокрита. Последнее условие можно считать заведомо выполненным в большинстве случаев. Тем не менее, в случае определения объема крови в опухоли гематокрит крови в опухоли может сильно отличаться от гематокрита в основном кровотоке. При использовании градиентной системы МРТ пульсов (объемного построения с применением градиентного эха со спойлером, 3DSPGR) измеряемая интенсивность МРТ сигнала равна:

SIP=М0*sin*((1-exp(-TR/Т1P)/(1- exp(-TR/Т1P)*cos)

и 1/ Т1P=(1-)*(1/Т1PP)+*(1/Т1RBC),

где 1/Т1PP=(1-)*( 1/Т10PP) + r[КВ]; М0 – протонная плотность, – флип угол; TR – время повторения МРТ импульса, Т1P– спин решеточное время релаксации в крови после введения КВ, Т1PP– спин решеточное время релаксации в плазме крови после введения КВ, Т10PP – спин решеточное время релаксации в плазме крови до введения КВ, – фракция объема крови, занимаемая эритроцитами, r – молярная релаксивность КВ, [КВ] – молярная концентрация КВ.

Оба параметра, т.е. r и [КВ],  были определены нами экспериментально с применением плазмаионизационного метода для определения концентрации парамагнитного гадолиния. Величина параметра Т10PP примерно равна величине времени релаксации Т1RBC.  Для определения величины Т1P вначале нам было необходимо измерить локальный гематокрит в органах, что было достигнуто путем радиоактивного мечения эритроцитов при помощи восстановления пертехнетата ([99mTc]O4-) в присутствии Sn(II) и определения их биораспределения через 5 мин после внутривенного введения.

II.В САМОТУШЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И КОНТРАСТИРУЮЩИЕ ЗОНДЫ

Флуоресценция, как частный случай люминесценции, наблюдается при испускании фотона при возвращении электрона из возбужденного синглетного состояния в основное энергетическое состояние молекулы. Энергия испускаемого фотона меньше, чем энергия поглощенного молекулой фотона, за счет внутримолекулярных переходов с более высокого уровня вибрационной энергии в основном состоянии молекулы в состояние термодинамического равновесия. Данные переходы вызывают спектральный эффект Стокса, т.е. сдвиг спектрального  максимума флуоресценции в длинноволновую область по сравнению со спектральным максимумом возбуждающего света. Как правило, данный сдвиг невелик, и его величина особенно мала в случае многих полиароматических флуорохромов с высокими коэффициентами экстинкции и со спектральными максимумами поглощения при длинах волн возбуждающего света >450 нм (т.е. флуоресцеин, родамин, Texas Red, карбоцианиновые красители Cy).  Многие из данных флуорохромов традиционно используются для ковалентной модификации макромолекул, применяемых  в микроскопии (т.е. флуоресцеин, родамин) и обладают способностью к самотушению флуоресценции. В общем случае, тушение флуоресценции в разбавленных растворах может происходить в результате действия одного или нескольких молекулярных механизмов, которые включают химические реакции в возбужденном состоянии молекул, внутримолекулярные переходы, перенос энергии на другую молекулу, образование комплексов в основном энергетическом состоянии (т.н. статическое тушение) и тушение при столкновении молекул (т.н. динамическое тушение).

При ковалентном связывании с макромолекулами, несущими реакционоспособные группы, с увеличением плотности посадки флуорохромов (Ф) на макромолекуле флуоресценция нелинейным образом зависит от концентрации [Ф], и начинает уменьшаться при достижении определенной локальной концентрации [Ф] на макромолекуле. Данный эффект можно объяснить с точки зрения переноса энергии возбужденного состояния молекулы Ф на другую молекулу Ф (динамическое самотушение по Ферстеру или Декстеру). Вероятность самотушения зависит от расстояния между флуорохромами: W(r)=(1+(r/R0)6))-1, где R0–радиус Ферстера соответствующий 50% вероятности переноса W(r) = 0,5. При ковалентном связывании флуорохромов с полипептидами расстояние между отдельными молекулами Ф с высокой вероятностью меньше 4 нм, т.е. в границах Ферстеровского диапазона расстояний, при которых перенос энергии высоковероятен, т.е.  в границах 1,5-6 нм.  Тем не менее, несмотря на то, что теория динамического самотушения Ферстера широко используется при трактовании резонансного переноса энергии, она не всегда подходит для описания эффектов самотушения в макромолекулах, содержащих более двух близко расположенных ковалентно связанных флуорохромов. Если бы расстояние Ферстера действительно однозначно определяло эффективность самотушения, то эффект самотушения наблюдался бы для любой пары Ф, находящейся на расстоянии меньше 6 нм друг от друга. Однако, известен пример коммерчески доступного красителя  Alexa Fluor 488, который спектрально практически идентичен флуоресцеину, и, тем не менее, не подвержен самотушению при ковалентном связывании с идентичными иммуноглобулинами (Рис.3).

Рис. 3. Зависимость самотушения флуорохромов от структуры молекулы. Структурно различные и спектрально-идентичные Alexa Fluor 488 (A) и флуоресцеин (Б) образуют конъюгаты с антителами (В), в которых флуорохромы гораздо сильнее подвержены самотушению в случае (Б), чем (А). Данный результат подтверждает вклад статических механизмов в эффект самотушения в ковалентных конъюгатах. 

Данный пример доказывает, что т.н. статические эффекты самотушения в случае ковалентных макромолекулярных конъюгатов должны преобладать над динамическими.  Образование нефлуоресцирующих комплексов вида Ф.Ф в основном состоянии молекул сопровождается поглощением света и возвращением в основное состояние без испускания фотона. В отличие от динамического тушения, статическое тушение уменьшается, а не увеличивается с ростом температуры, т.к. константа ассоциации флуорохромов КS=[Ф.Ф]/Ф*Ф зависит от температуры. Концентрация флуорохрома в растворе в упрощенном случае самотушения димеров: [Ф0] =[Ф]+[Ф.Ф], где [Ф]- концентрация флуоресцентных мономеров, а [Ф.Ф]  концентрация нефлуоресцентных димеров. Зависимость соотношения интенсивностей флуоресценции в отсутствие эффекта самотушения F0 и наблюдаемой величины флуоресценции в присутствие эффекта самотушения F  по закону Штерна-Фольмера: F0/F=1+ КS *[Ф].  В общем случае, самотушение вызывается суммарным эффектом динамического и статического самотушения и F0/F=1+ Кнабл *[Ф], где наблюдаемая Кнабл=( KD+ КS ) + KD* КS*[Ф], где KD  константа тушения Штерна-Фольмера.  Данные теоретические соображения распространяются и на флуоресцентные красители с максимумом флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне световых волн. Эти флуорохромы,  крайне легко образуют нефлуоресцентные «агрегаты» молекул в крайне близком, т.е. Ферстеровском расстоянии друг от друга. Агрегацию обычно предотвращают путем специальной модификации с образованием ковалентно связанных сульфогрупп для увеличения суммарной полярности молекул. Тем не менее, благодаря небольшому спектральному сдвигу Стокса и наличию неполярных сопряженных метиновых двойных связей данные флуорохромы легко подвергаются самотушению. Данный факт был использован нами при разработке высокомолекулярных наносенсоров для визуализации протеолитической активности (Гл. II ).

ГЛАВА III.  МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ АГЕНТЫ («НАНО-ЗОНДЫ») ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ

III.А ПОЛИМЕРНЫЙ БИОСОВМЕСТИМЫЙ НОСИТЕЛЬ (PGC) ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МЕТОК

Постановка задачи. МРТ позволяет достичь высокого пространственного разрешения, приближающегося к одноклеточному (шкала 80-160 мкм); и позволяет получать изображения тканей организма с характерными различиями благодаря высокому уровню контрастирования за счет различий во временах релаксации протонов. Времена релаксации различаются вследствие действия нескольких факторов: 1) концентрации протонов в ткани (спиновой плотности); 2) времен релаксации Т1 и Т2. МРТ позволяет дифференцировать различные компартменты в тканях благодаря различиям во временах протонной релаксации в результате действия следующих факторов: 1) присутствие парамагнитного железа, связанного с апогемоглобином и трансферрином, и, в меньшей степени, марганца супероксид-дисмутазы эритроцитов, 2) благодаря наличию кровотока, т.е. циркуляции протонов воды в крови, В настоящее время известен ряд подходов, основанных на эффекте изменения протонной релаксации, вызываемых компартментализацией либо эндогенных (дезоксигемоглобин), либо экзогенных контраст генерирующих веществ. В качестве экзогенных КВ в данном случае используются либо КВ, содержащие нанокристаллический магнетит Fe3O4, либо парамагнитные хелатированные комплексы Gd(III), введенные в кровоток в виде концентрированного болуса. Данные КВ способны индуцировать дальние (микрометровые) локальные возмущения магнитного поля в объеме сосудов и, следовательно, приводить к возрастанию спин-спиновой релаксивности в кровотоке (R2*). Возрастание релаксивности в этом случае сильно зависит от изменения магнитной восприимчивости (),  и наличие данных изменений позволяет определять гемодинамические параметры (обьем крови). Тканевый обьем крови (т.е. обьем крови в вокселе, регистрируемый с помощью МРТ) измеряется путем интегрирования R2* после внутривенного введения КВ (логарифм изменения интенсивности МРТ сигнала пропорционален концентрации КВ в вокселе). 

Тем не менее, несмотря на применимость на  практике,  метод, основанный на изменении магнитной восприимчивости обладает несколькими недостатками: 1) абсолютные значения объема можно определить только после забора образцов крови; 2) низкомолекулярныe КВ, которые представляют собой единственный класс КВ, разрешенных для клинического применения, быстро преодолевают эндотелиальные барьеры, что не позволяет проводить кинетические измерения в кровотоке с помощью МРТ без превышения дозы.

Необходимость неинвазивного мониторинга объема крови в качестве биомаркера ангиогенеза и антиангиогенеза при разработке новых экспериментальных методов терапии рака и воспалительных болезней требовала от нас решения задачи по разработке и применению на практике долгоциркулирующего КВ, которое бы обладало биосовместимостью и позволило бы избежать приведенных выше недостатков.

Результаты и обсуждение. В 1992 г. мы разработали первый биосовместимый синтетический парамагнитный зонд с размерами наночастицы (5-10 нм). Данное КВ, получившее название Protected Graft Copolymer (PGC), было успешно использовано, и мы продемонстрировали его применимость для визуализации сердечно-сосудистой системы при помощи МРТ (Рис. 4А). Мы установили, что PGC обладает высокой стабильностью в отсутствие компонентов плазмы, которые вызывают медленное расщепление PGC, способствующее его выведению из организма (Рис. 4Б-Г). Мы также показали, что PGC можно использовать для доставки контрастных агентов к поверхности эндотелия, а также в областях локально повышенной проницаемости стенки сосудов, и, в конечном итоге,  в межтканевое пространство опухолей  (Табл. 1).

Рис. 4. Макромолекулярный нано-зонд, полученный на основе биосовместимого полимера (конъюгата полилизина и полиэтиленгликоля) [1,3,8]. А-3-мерная схематическое изображение макромолекулярного контрастирующего зонда (PGC); Б- профили биораспределения PGC в модели рака молочной железы R3230 у крыс 6-120 часов после внутривенного введения. Наблюдалось медленное выведение PGC из кровотока, и увеличение накопления в опухоли, почках и селезенке В-гельпроникающая ВЭЖХ образца PGC до и после 24 ч инкубации в нормальном физиологическом растворе,  pH 7.4. PGC был мечен  изотопом [111In;  Г -хроматограмма образца PGC до и после 24 ч инкубации в присутствии 50% плазмы крови человека, стрелка указывает на смещение пика элюции PGC в область макромолекул меньшего диаметра.

Таблица 1. Физико-химические и фармакокинетические характеристики PGC-Gd [1,3,8].

Параметр

Gd-PGC

Формула (приблизительная)

MPEG92-PL-GdDTPA187

Масса (ВЭЖХ)

560 кДа

Диаметр (корреляционая спектроскопия)

10.3±2 нм

Релаксивность (спин-решеточная),  r1

18 мM с-1

Время полужизни в кровотоке,  (t1/2)

36 ч

Объем биораспределения

0.04 л/кг

Экстракция из кровотока, начальная

Не наблюдалась

Связывание с белками плазмы

Не обнаружено

Иммунный ответ (иммуноглобулины G+M, иммуноанализ) на GdДТПК, доза 0.01 ммоль Gd/кг, 2 недели после инъекции.

Не обнаружен

       Свойства PGC приведены в таблице 1. Полученный на основе ковалентной модификации метоксиполиэтиленгликолем -аминогрупп полилизина  графт-сополимер PGC  был впоследствии применен в ряде МРТ исследований в различных моделях  (Таблица 2). Наиболее часто использовалось производное ковалентной модификации PGC диангидридом диэтилентриаминопентауксусной кислоты (ДТПК) с хелатированным Gd(III).

Таблица 2. МРТ исследования с применением долгоциркулирующего сополимера PGC, меченого  катионами лантанидов (Gd или Dy).

Вид экспериментальных животных, Модель заболевания

МРТ режим получения изображений

Основные выводы

Ссылка

CD крысы, balb/c мыши, токсикология, МРТ эффективность

1.5Т градиент эхо (3D-SPGR)

Контрастирующий эффект наблюдался при внутривенной дозе 25 мкмоль Gd /кг . Нетоксичен в мышах и крысах.

[1]

Кролик, модель эмболизма легочных артерий

1.5Т (3D-SPGR)

PGC дает возможность контрастировать разветвление легочных артерий вплоть до 4го уровня.

[2]

Крыса. Модель кровотечения стенки тонкого кишечника

1.5Т (3D-SPGR)

Определен минимальный объем крови в кишечнике, детектируемый с помощью МРТ в после внутривенного введения PGC (50 мкл).

[4]

Крыса. Глубокое воспаление феморальной мышцы

1.5Т (3D-SPGR)

Установлено, что МРТ/PGC дает возможность наблюдать очаг воспаления 72 часа после введения PGC. Накопление PGC в очаге превышает в 8 раз уровень в нормальной мышце.

[5]

Крыса. Глиома головного мозга

1.5Т (3D-SPGR)

Определены условия, при которых можно точно и воспроизводимо измерять объем крови в ткани с учетом кинетики обмена протонов воды.

[6]

Крыса, мышь. Модели рака.

1.5Т (3D-SPGR)

Произведено определение транс- хелатирования катионов связанных с PGC и расщепление PGC в плазме крови и произведена визуализация PGC в опухолях

[8]

Крыса. Глиома

1.5Т (3D-SPGR)

Разработан подход к определению объема крови и общего объема межклеточного объема. В модели экспериментальной глиомы  продемонстрирован эффект блокирования ангиогенеза  под воздействием  пептидов тромбоспондина-1 (TSP-1). 

[8,9,11, 14]

Крыса. Ишемия головного мозга

4.7Т (ASL, SE)

Разработан новый МРТ метод для  одновременного определения объема крови, скорости тока крови и степени экстракции воды из кровотока при помощи МРТ/PGC-Dy.

[12,15]

Мышь. Аденокарцинома молочной железы.

1.5Т 3D-SPGR

Измерены различия в объеме крови опухоли MCF7 и клона с высоким уровнем экспрессии фактора роста сосудов (VEGF).

[17]

Мышь . Аденокарцинома простаты

1.5Т 3D-SPGR

(варьирование флип угла)

Предложен метод измерения объема крови и объема интерстициального пространства в опухолях при помощи PGC.

[22,24]

Мышь. Аденокарцинома кишечника

9.4Т 3D-SPGR

(варьирование флип угла)

Количественно оценено уменьшение объема крови в опухоли на ранней стадии лечения ингибитором киназы рецептора фактора роста сосудов.

[29]

Мышь. Модель диабета 1го типа (инсулит).

9.4Т 3D-GEFC

(компенсация кровотока)

Проведена МРТ ангиография высокого разрешения, продемонстрирована экстравазация PGC-Gd, меченого флуоресцеином, в области островков Лангерганса.

[38]

Мышь. Ишемия полушария головного мозга.

9.4Т 3D-SPGR

(варьирование флип угла)

Измерены барьерные свойства гематоэнцефалического барьера до и после экспериментальной ишемии (инсульта).

[43]

III.Б  ПРИМЕНЕНИЕ PGC В ВИЗУАЛИЗАЦИИ АНГИОГЕНЕЗА РАКОВОЙ ОПУХОЛИ

Постановка задачи. Изменение объема крови в тканях наблюдается в результате ответа организма на различные патологические процессы (например, локальный воспалительный процесс, ишемия мозга, миокарда или почек), а также при ангиогенезе в раковых опухолях. Быстрое развитие новых методов, направленных на локальное уменьшение кровоснабжения опухоли (т.е. антиангиогенез) при терапии рака требует использования методов неинвазивного измерения кровоснабжения опухолей. Количественная оценка ангиогенеза является важной задачей при определении эффективности ингибиторов ангиогенеза и при определении степени пролиферации эндотелиальных клеток в опухоли. Несмотря на то, что кровоснабжение опухоли можно полуколичественно измерить при помощи биопсии и гистологического исследования, неинвазивные методические подходы к измерению объема крови при карциногенезе полностью отсутствовали. Известно, что ангиогенез в опухоли приводит к росту гетерогенных сосудов с атипичной проницаемостью эндотелиальных барьеров и отсутствием нормального ветвления сосудов, появлению артериовенозных шунтов и аномальной переменной направленности кровотока. Наличие приведенных выше особенностей кровоснабжения создает трудности при использовании как низкомолекулярных КВ, так и КВ, основанных на использовании глобулярных белков в качестве носителей КВ, которые, как правило, дают завышенные значения обьема крови в результате экстравазации за пределы кровеносной системы.

Мы поставили задачу определить неинвазивным путем степень кровоснабжения опухоли с применением долгоциркулирующего зонда PGC-Gd. Мы предположили, что в отличие от гистологического исследования, которое позволяет определять усредненное число  кровеносных сосудов на единицу площади среза, визуализация в живых системах с применением PGC-Gd позволит 1) устранить субъективность при полуколичественной гистологической оценке кровоснабжения опухоли; 2) определять функциональный объем крови, т.е. процент общего объема  ткани, который перфузируется при кровоснабжении ткани.

        Результаты и обсуждение. В отличие от низкомолекулярных парамагнитных хелатов Gd(III), а также парамагнитных конъюгатов белков, внутривенное введение PGC-Gd не сопровождалось быстрым выведением из кровотока экспериментальных животных (Рис. 4Б, Табл.1). Данный результат был подтвержден с применением МРТ исследования на модели аденокарциномы крыс R3230 (Рис. 5 А-Г). Оно показало, что PGC-Gd контрастирует как систему кровоснабжения опухоли, так и области накопления КВ через 24 часа после внутривенного введения, т.к. время его полужизни в кровотоке составляет 36 ч. С целью исследования влияния повышенных уровней экспрессии проангиогенных факторов мы использовали две линии клеток рака молочной железы:  аденокарциномы MCF7 и ее генно-инженерного варианта МV165, секретирующего фактор роста сосудов VEGF165. Эти клетки были ортотопически имплантированы в атимусных мышей с целью визуализации объема крови при помощи МРТ (Рис. 5 Д,Е). Данные измерения продемонстрировали следующее: 1) МРТ с применнеием PGC-Gd в качестве КВ, позволила достоверно определить объем крови в обоих типах опухоли, причем средняя фракция объема крови МV165 (8.9±2.1%) достоверно превышала объем крови в ткани аденокарциномы MCF7 (1.7±0.5%, p<0.001); 2) Т1-МРТ, проведенная с высоким разрешением, т.е. с размерами вокселя 0.2х0.1х1.5 мм, продемонстрировала типичную гетерогенность распределения локальной перфузии кровью вокселей в случае опухоли МV165, которая индуцирует крайне высокий уровень локального кровоснабжения за счет интенсивного ангиогенеза, индуцируемого  вследствие секреции VEGF165 (Рис. 5Е).

Рис. 5. Визуализация ангиогенеза в моделях рака с применением PGC-Gd [1,17]. A-МРТ проекционное изображение кровоснабжения опухоли R3230 полученное с использованием MIP алгоритма  после введения макромолекулярного КВ (PGC, гадолиниевой соли);  Б-то же, что и А 24 ч после введения КВ, видно выведение КВ через мочевой пузырь и накопление в тканях опухоли;  В, Г-соответствующие МР томографические срезы во фронтальной проекции;  Д- профили распределения Т1 взвешенного сигнала МРТ в томографических срезах опухоли MCF7 и MV165, экспрессирующей фактор роста сосудов; Е- МРТ картирование объема крови в опухоли MV165.

Распределение PGC-Gd в кровеносной системе позволяет оценить относительные объемы как крови, так и межклеточного пространства (МП) в раковых опухолях. Мы разработали подход, основанный на последовательном внутривенном введении двух КВ: высокомолекулярного (PGC-Gd) и низкомолекулярного (GdДТПК, гадолиниевой соли диэтилентриаминопентауксусной кислоты). В случае высокой концентрации PGC-Gd дальнейшее введение дополнительного количества КВ и укорачивание спин-решеточного времени релаксации протонов воды не приводит к заметному изменению сигнала в крови, т.е. происходит насыщение Т1 взвешенного МРТ сигнала. Благодаря достижению эффекта насыщения сигнала, наблюдаемого в результате увеличения спин-решеточной релаксации воды (R1) при помощи PGC-Gd,  мы смогли наблюдать и производить полуколичественный  анализ как объема крови, так и объема межтканевого пространства опухоли после внутривенного введения GdДТПК. После введения второго КВ (GdДТПК) МРТ сигнал ткани опухоли складывается из насыщенного Т1 сигнала крови (т.е. величины, не изменяющейся за промежуток времени, необходимый для проведения МРТ) и инкремента Т1 сигнала, являющегося следствием диффузии GdДТПК из сосудов с высокой проницаемостью сосудистой стенки. Измерение МРТ сигнала в модели глиомы мозга у крыс (т.е. стереотаксически имплантированными клетками глиомы линии С6) показало, что фракция объема крови в опухолях составляет 1.50±0.67 (n=28), что соответствует примерно 7.5%/г ткани и достоверно (p<0.05) превышает объем крови скелетной мышцы (5%). Относительная фракция объема МП в глиоме С6 (40%) превышала в 4 раза фракцию МП в нормальной мышце (10%), причем эти данные МРТ были подтверждены результатами гистологии, которая показала, что объем МП равен 37.2±7.7%. В дальнейшем нам удалось установить, что определение фракции крови и МП при помощи МРТ можно производить при ненасыщающих, более физиологичных концентрациях PGC-Gd.  МРТ подход в сочетании с терапией рака был применен в следующих моделях: 1) терапии глиомы с применением экспериментальных стабильных ретроинверсных пептидов с триптофан-богатой последовательностью, соответствующей повторам первого типа тромбоспондина-1; 2) терапии аденокарциномы кишечника (MV522) ингибитором VEGF рецепторной киназы (VEGFR2-TKI). При помощи МРТ в клиническом диапазоне напряженностей поля (1.5 и 3Т) мы установили, что ТSP-1 пептиды приводят к стабилизации роста сосудов в С6 глиоме и 9L глиосаркоме и прекращению роста опухолей мозга. Фракция объема крови после терапии оставалась постоянной, в то время как средний объем опухоли в контрольной группе был в 4 раза меньше, чем в опыте. В отличие от ангиостатического эффекта ТSP-1 пептидов, индазол-содержащий ингибитор рецепторной тирозин киназы (VEGFR2-TKI) вызывал быстрое уменьшение объема крови опухоли (с 2.5±1.5% до 1.3±0.3%, p<0.05). Данное уменьшение объема было измерено с применением МРТ метода, описанного в Гл. IIБ, после введения двух доз ингибитора киназы, т.е. через 16 часов после первой дозы. Уменьшение объема крови, сопровождавшееся апоптозом эндотелия сосудов и клеток опухоли, происходило на 7 дней раньше, чем наблюдаемое суммарное изменение объема опухолевой ткани, что говорит о том, что МРТ обладает способностью диагностировать эффективность антиангиогенной терапии на ранней стадии лечения.  Практическая значимость наших работ заключается в том, что: 1) гистологически подтвержденная обратная зависимость между плотностью сосудов в опухоли и процентом выживания пациентов после начальной стадии терапии рака может быть определена неинвазивными методами, без необходимости использования биопсии; 2) терапевтический эффект антиангиогенезных препаратов может быть определен количественно на ранней стадии лечения рака.

ГЛАВА IV. РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ЗОНДА ДЛЯ ОПТИЧЕСКОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ПРОТЕОЛИЗА В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ PGC

Постановка задачи. Определение локализации биомаркеров в живых системах является одной из важнейших задач неинвазивной диагностики. Биомолекулы, обладающие каталитической активностью (ферменты), с одной стороны, представляют собой важный класс биомаркеров для неинвазивной визуализации, с другой стороны, наличие специфической активности создает уникальные возможности не только для идентификации биомаркера, но и для повышения чувствительности и специфичности неинвазивной детекции. Данная концепция проиллюстрирована на Рис. 6. В отличие т.н. зондов для направленной доставки, которые обычно разрабатываются с целью неинвазивной визуализации рецепторов клеточной поверхности, сенсоры ферментативной активности создаются с целью селективной визуализации продуктов каталитической реакции в живых системах (на уровне ткани или клетки). В случае направленной доставки зондов различить несвязанный (свободный) зонд от связанного зонда,  как правило, не представляется возможным. Единственным исключением является т.н. подход с применением «претаргетинга», однако, он неприменим для визуализации каталитической активности. Мы ранее установили, что PGC, как и многие другие долгоциркулирующие молекулы, подвержен захвату в тканях за счет увеличенной проницаемости стенки сосуда (EPR эффект), который типичен для многих патологических процессов, индуцирующих активацию и миграцию выстилающего эндотелия. Как было отмечено выше, структура PGC позволяет «нагрузить» полимерную молекулу различными диагностическими низкомолекулярными веществами с применением как ковалентного, так и нековалентного связывания с полиаминокислотным «скелетом» молекулы. Связывание ДТПК с PGC позволило производить количественные измерения возрастания Т1 взвешенного  МРТ сигнала, а также и радиоактивности PGC, если перед насыщением ДТПК катионами Gd с PGC хелатировали катионы радиоактивного изотопа индия [111In]. Мы предположили, что «нагрузка» PGC самозатушенным флуоресцентным красителем, позволит получить нефлуоресцентный, долгоциркулирующий макромолекулярный субстрат протеаз, который расщепляется протеазами в зоне накопления в живой ткани. Следовательно, оптимальный сенсор ферментативной активности должен иметь высокое соотношение специфического сигнала, т.е. прироста интенсивности флуоресценции, высвобождаемого протеазами,  к фоновому сигналу. Именно поэтому сенсоры на основе PGC обладают преимуществами по сравнению с другими  нефлуоресцентными субстратами ферментов, так как каждая молекула нанополимера «нагружена» десятками самозатушенных молекул флуорохрома. Таким образом,  после введения PGC-Cy5.5 в кровоток по результатам изменения флуоресценции в тканях с аномальной проницаемостью можно судить о локальном уровне протеолитической активности.

Результаты и обсуждение. Детекция фотонов, испускаемых флуоресцирующими молекулами в живом организме представляет собой сложную проблему, связанную с поглощением и рассеянием фотонов в тканях. Флуоресценция в ближне-инфракрасном диапазоне детектируется с большей достоверностью, поскольку в диапазоне длин волн 690-850 нм поглощение фотонов в тканях и крови минимально. Мы использовали ковалентное связывание  цианиновых флуорохромов (F), которые образуют димеры и агрегаты в концентрированных растворах (например, карбоцианинового красителя Cy5.5) с образованием нанополимерного зонда PGC-Cy5.5, несущего большое число (n=15-20) молекул F на каждой молекуле PGC. В данном полимерном нано-зонде образование агрегатов Cy5.5 дополнительно индуцируется в результате близкого взаимного расположения F на полилизиновом “скелете” молекулы. Такое близкое расположение F вызывает самотушение флуоресценции (см. Гл. IIA), и измеряемая суммарная интенсивность флуоресценции интактной молекулы PGC при физиологических концентрациях солей и температуре крайне мала (Рис. 7). Добавление модельных ферментов (например, трипсина или катепсина B), которые с высокой эффективностью гидролизуют пептидную связь между остатками лизина, ацилированными по -аминогруппам, приводило к быстрому возрастанию флуоресценции (эффективная константа скорости реакции псевдопервого порядка К(k1+k-1)app=2.5.10-3±0.5.10-3 сек-1). Возрастание флуоресценции, в данном случае, является следствием расщепления наноконъюгата на фрагменты и увеличения среднего расстояния между молекулами F. Ферментативная специфичность зонда к катепсинам была доказана в экспериментах с применением ингибиторов ферментативной активности. Нами было показано, что катепсины B, Н и L расщепляют полимерный зонд с высвобождением флуоресценции. Благодаря эффекту ферментативного расщепления PGC мы произвели визуализацию активность катепсинов в опухолях с применением постоянного источника возбуждающих фотонов (Рис. 8). Наблюдавшийся эффект является результатом синергизма действия нескольких факторов: 1) накопления полимерного зонда в опухоли в результате высокой проницаемости стенки сосудов; 2) высокого уровня экспрессии катепсинов в клетках стромы опухоли и в собственно раковых клетках; 3) локализации продуктов расщепления полимерного зонда в лизосомах, т.е. внутри клеток; 4) расположения опухоли (подкожная имплантация). Последующий анализ клеточных популяций опухолей, проведенный с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной флуориметрии показал, что именно в клетках стромы опухоли происходит расщепление зонда и высвобождение большей части ближне инфракрасной флуоресценции цианинов (Рис. 8Г).

Рис. 8. Оптическая детекция протеолитической активности в моделях рака у экспериментальных животных [13,19,20]. A- изображение в видимом диапазоне света;  Б- флуоресцентная визуализация расщепления PGC-Cy5.5 в ксенотранспланте человеческой карциномы легкого LX-1. На врезке показана покожная опухоль при анатомическом исследовании;  В – визуализация расщепления PGC-Cy5.5 в модели аденокарциномы молочной железы человека с различной степенью злокачественности (DU4475 и ВТ20); Г – визуализация подкожной опухоли (9L-GFP) с применением комбинированной двухфотонной и конфокальной микроскопии после введения PGC-Cy5.5. Цветокодировка: EGFP (“зеленый”), Cy5.5 (“красный”). Д-  проточная флуориметрия клеток, выделенных из опухоли 9L-GFP. Окно, отмеченное серым цветом, соответствует фракции клеток с высокой интенсивностью флуоресценции Cy5.5 и низким содержанием EGFP (строма опухоли).

       Кроме того, путем сравнения нескольких линий клеток, которые приводят к росту опухолей с различной степенью злокачественности, мы установили, что в случае ксенотрансплантированных клеток аденокарциномы молочной железы наблюдалась корреляция между степенью злокачественности раковой опухоли,  уровнем экспрессии катепсина B и интенсивностью флуоресценции, измеренной с применением неинвазивной визуализации. Например, через 21 день после ортотопической имплантации в атимусных мышей опухоли недифференцированной аденокарциномы человека линии DU4475 достигали веса 593.8 ±171.0 мг и флуоресцировали со средней интенсивностью 861 ±88, по сравнению с весом 29.5±3.3 мг и интенсивностью флуоресценции 566±36 (p<0.01) в случае дифференцированной и неагрессивной аденокарциномы ВТ20 (Рис. 8В). С помощью полуколичественного блоттинга лизатов клеток опухоли было установлено, что в опухоли DU4475 активность катепсина B была в 1.7 раза выше, чем в аденокарциноме ВТ20. Данные различия указывают на наличие корреляции между уровнем экспрессии протеиназы, которая задействована в обеспечении миграции клеток в экстроцеллюлярном матриксе, а также сигнала, генерируемого при расщеплении самозатушенного флуоресцентного макромолекулярного зонда в тканях животных. Измерения ближне- инфракрасного сигнала с поверхности пораженного органа (например, стенки кишечника), в принципе, дает возможность оценить вероятность быстрого агрессивного роста данного новообразования.

ГЛАВА V. РАЗРАБОТКА СЕНСОРНЫХ ПАРАМАГНИТНЫХ КОНТРАСТИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ, ОСНОВАННЫХ НА ЭФФЕКТЕ ФЕРМЕНТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ  ПОЛИМЕРИЗАЦИИ

Постановка задачи.  Разработанные нами подходы к визуализации специфической активации КВ (Глава VI) основаны на эффекте расщепления химических связей гидролазами, и применимы только для данного класса ферментов. Мы поставили задачу разработать альтернативную стратегию, который позволил бы производить визуализацию ферментативной активности, катализирующей или образование олигомеров, или образование конъюгатов с биомакромолекулами в живых системах. Ранее подобные методы не были опробованы для неинвазивной визуализации в живых тканях. Мы разработали методический подход,  основанный на принципе фермент-специфической олигомеризации парамагнитных субстратов. Мы предположили, что  в результате ферментативного окисления зонды-предшественники могут образовывать промежуточные продукты с высокой реакционной способностью. Эти промежуточные продукты способны к рекомбинации с образованием олигомеров, т.е. молекул с большей массой и, следовательно, с меньшей вращательной свободой парамагнитных катионов, входящих в состав олигомеров. Как было показано в Гл. II.А, корреляционное время R, описывающее вращательную свободу хелатированного парамагнитного иона,  оказывает наибольшее влияние на конечную релаксивность и, как следствие, на эффективность КВ в биологических системах.

Результаты и обсуждение. Вначале наша гипотеза была проверена с применением нового монофункционального производного гадолиниевой соли макроциклического хелата (ДО3А), несущего тирамидную группу (Рис. 9А). Производные тирамина и окситирамина (катехоламина) способны с высокой эффективностью восстанавливать окисленную, т.е. каталитически неактивную форму пероксидаз. Роль пероксидазы в изученных нами процессах заключается в катализе образования реакционоспособных свободных радикалов, которые взаимодействуют с образованием олигомеров (гомоконъюгатов) или с образованием конъюгатов с белками (гетероконъюгатов). Образование олигомеров под воздействием пероксидаз  было подтверждено ВЭЖХ и масс-спектрометрией (Рис. 9Б). По данным хроматографии, эффективный гидродинамический диаметр олигомеров соответствовал молекулам со средней массой 7 кДа, причем их профиль элюции не изменялся при десятикратном увеличении начальной концентрации субстрата. Полимеризация сопровождалась быстрым ростом спин-решеточной релаксивности (r1). Слежение за кинетикой реакций по росту релаксивности позволило определить, что полимеризация радикалов гадолиниевой соли монотирамида ДОТА происходит с высокой скоростью (эффективная кинетическая константа реакции псевдопервого порядка К(k1+k-1) app =0.04 с-1). Мы подтвердили данные хроматографии  с помощью масс-спектрометрии и показали, что в процессе реакции образуются олигомерные продукты со степенью полимеризации от 2 до 12 мономерных хелатных единиц. Эксперименты с использованием дисперсионных измерений зависимости релаксации от напряженности магнитного поля (NMRD) показали, что возрастание релаксивности в результате реакции, катализируемой пероксидазой, наблюдается во всем диапазоне напряженности магнитного поля (или диапазона Ларморовых частот) вплоть до 1.2Т (50 МГц).

При этом релаксивность особенно сильно возрастала в более высокочастотном диапазоне спектра, в котором производится большинство МРТ-измерений в клинике. Относительное изменение релаксивности было выше при физиологических температурах (37оС). Увеличение релаксивности в диапазоне 10-40 МГц типично для КВ с длинными ротационными корреляционными временами, обычно наблюдаемыми при связывании хелатированного гадолиния с белками. Например, релаксивность (R1) в случае окситирамидного производного гадолиниевой соли ДОТА (ОТ-ДОТА(Gd) возрастала с 3.75 до 11.50 [мМ.с-1] (при напряженности поля 0.47 Т), т.е. примерно в три раза. Моделирование параметров релаксации протонов воды с применением генетического алгоритма в рамках теории Соломона-Блюмбергена-Моргана, с использованием экспериментальных данных, полученных с помощью NMRD, позволило установить, что в результате фермент-опосредованной полимеризации величина R возрастала с 0,12 до 0,84 нс, т.е. в 7 раз. Таким образом, исследование модельной реакции с участием пероксидазы показало, что олигомеризация низкомолекулярных веществ под воздействием ферментов может приводить к увеличению релаксивности, причем преобладающим фактором является олигомеризация и лимитирование вращательной свободы хелатированного парамагнитного катиона.

Несмотря на наличие физических ограничений, которые влияют на возрастание МРТ-сигнала в присутствии хелатированных парамагнитных катионов, томографическая визуализация позволила различить образцы парамагнитного субстрата, содержащего фермент, и контрольные образцы (Рис. 9Б, врезка). В присутствии пероксидазы и перекиси водорода сигнал МРТ увеличивался на 60% в диапазоне концентраций 50-200 мкМ Gd. Для определения чувствительности данного метода, получившего название МРТ-амплификации, был определен предел обнаружения пероксидазы в растворе, который составил 50 нг фермента /мл, т.е. 1 пМоль. Зависимость МРТ-сигнала от концентрации пероксидазы в присутствии ОТ-ДОТА(Gd) имела типичный сигмоидный характер.

Рис. 9. Принципы и экспериментальное подтверждение эффекта МРТ-амплификации для визуализации активности пероксидазы с применением субстратов Gd [18,27,31,39]. A- схематическое изображение двух путей образования продуктов ферментативной реакции с высокой релаксивностью. В качестве субстратов сенсоров были использованы моно- и бис- тирамиды или триптамиды макроциклических (I) или ациклических хелатов Gd(III) ;  Б- увеличение молярной релаксивности и возрастание МРТ Т1-взвешенного сигнала (на врезке, нижний ряд) в присутствии различных концентраций монотирамида (I);  В- результаты масс-спектрометрии продуктов фермент-опосредованной гомоолигомеризации монотирамида (I), свидетельствующие об образовании олигомеров со степенью олигомеризации 2-12 ; Г-результаты ЯМР дисперсионных измерений растворов мономеров и олигомеров тирамида (I) при двух значениях температуры.

Подобная зависимость, в целом, напоминала концентрационную кривую колориметрического определения пероксидазы. Для того, чтобы сопоставить чувствительность стандартного колориметрического иммуноферментного анализа модельного антигена и разработанной системы пероксидаза-парамагнитный субстрат,  мы использовали систему дигоксигенин-антидигоксигенин с применением МРТ в качестве метода обнаружения фермента. Дигоксигенин-меченый F(ab’)2-фрагмент антитела, адсорбированный на полистироле в количестве 1-1000 нг обнаруживали антидигоксигениновыми моноклональными антителами, мечеными пероксидазой, с последующим добавлением 100 мкМ ОТ-ДОТА(Gd). При помощи данного метода, нам удалось обнаружить фрагмент антитела с нижним пределом чувствительности 1-80 нг, причем чувствительность метода была сравнима с обычным иммуноферментным колориметрическим анализом, проведенным в аналогичных условиях.

ГЛАВА VI. ПРИМЕНЕНИЕ СЕНСОРНЫХ ПАРАМАГНИТНЫХ КОНТРАСТИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ ПРИ ВИЗУАЛИЗАЦИИ РЕЦЕПТОРОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ

Постановка задачи.  Результаты тестирования системы с применением модельного антигена показали, что МРТ-амплификация сигнала обладает достаточной чувствительностью, которая теоретически позволяет визуализировать клетки, экспрессирующие специфические антигены на поверхности. Применение неинвазивной визуализации к детекции антигенов в живых системах ранее было лимитировано низким пространственным разрешением радиоизотопных методов. Применение антител, меченых позитрон-испускающими изотопами, например 18F, дает возможность частично устранить этот недостаток, однако, время жизни изотопов недостаточно для достижения высоких уровней отношения специфического и неспецифического сигналов в ткани. Мы поставили задачу тестирования иммуноферментных конъюгатов и метода МРТ для визуализации рецепторов на поверхности клеток и в живой ткани с применением МРТ-амплификации.

Результаты и обсуждение. Мы использовали модельную систему экспрессии селектина Е на поверхности клеток эндотелия человека,  индуцированной интерлейкином-1 (IL-1beta). Данная экспериментальная система важна потому, что она позволяет моделировать процессы, происходящие на ранней стадии ответа сосудистой стенки на воспалительные и проангиогенные сигналы. Способность эндотелиальных клеток экспрессировать селектин Е в ответ на стимуляцию IL-1beta (или фактором некроза опухоли, TNF) была вначале проверена в эксперименте с использованием флуоресцентный микроскопии (Рис. 10А) и 125I-меченых антител. Эксперимент показал, с одной стороны, высокую аффинность F(ab’)2 фрагментов антител с эффективной константой диссоциации KD=8.5 нМ, а с другой стороны,  наличие большого количества центров связывания на поверхности клеток  (примерно 2 млн молекул селектина Е на клетку). В экспериментах на клеточной культуре было показано, что присутствие селектина Е на поверхности клеток эндотелия человека можно было обнаруживать по увеличению МРТ-сигнала ОТ-ДОТА(Gd), использованного в качестве СКВ, который был специфичен к присутствию пероксидазы (Рис 10А-В).  При этом сигнал увеличивался как в супернатанте, т.е. в несвязанном с клетками состоянии, так и в суспензии клеток, снятых с подложки, что подтвердило наличие связывания олигомеризованного продукта реакции, катализируемой пероксидазой. 

Рис. 10.  Визуализация рецепторов в живых системах при помощи МРТ [18,36,37].

А- иммунофлуоресцентное обнаружение селектина Е (ELAM-1) на поверхности IL-1beta активированных эндотелиальных клеток; Б- контроль; В- Т1-взвешенное МРТ изображение эндотелиальных клеток: 1) положительный контроль (0.25 мкМ ДТПК(Gd); 2) активированные эндотелиальные клетки, инкубированные с антителами к селектину Е и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой и инкубированными с парамагнитным субстратом (0.25 мМ моноокситирамид DО3А),  3) контроль; 4) активированные клетки, не инкубированные с субстратом; Г, Е- МРТ срезы глиомы Gli36 у атимусных крыс (rnu/rnu) после внутривенного введения парамагнитного субстрата (доза - 0.2 ммоль/кг), Д, Ж- после введения конъюгатов антител против EGFR рецептора и парамагнитного субстрата пероксидаз (0.2 ммоль/кг), З- изменение МРТ сигнала в опухоли, измеренного в течение 1 ч после введения субстрата.

Таким образом, мы показали, что индуцированная экспрессия рецепторов на поверхности клеток может быть обнаружена при помощи МРТ с применением субстратов, которые отвечают на присутствие пероксидазной активности, связанной с клетками. В то время как в системах in vitro  задача визуализации рецепторной экспрессии решается достаточно несложно, и определяется лишь разрешающими возможностями МРТ и аффинностью и специфичностью антител, в живых системах задача МРТ-визуализации после направленной доставки антител и их фрагментов значительно осложнена неспецифическими эффектами, связанными с функцией клеток органов ретикулоэндотелиальной системы.  Частичным решением проблемы может служить применение т.н. «претаргетинга», для чего сначала системно вводят конъюгаты антител (или других «векторных» молекул), а затем, после того как большая часть коньюгатов покидает кровообращение,  вводят СКВ. Другими факторами, влияющими на результаты визуализации при помощи пероксидаз являются : 1) распределение  антител, их конъюгатов, а также низкомолекулярных СКВ в организме; 2) зависимость от локального кровоснабжения, т.е. функционального объема крови; 3) местная проницаемость  кровеносных сосудов; 4) локальная концентрация центров связывания на поверхности клеток; 5) кинетика  удаления коньюгатов из центров накопления; 6) наличие биологического источника перекиси водорода.

Одним из возможных подходов к решению проблемы визуализации рецепторов является использование «бинарных» конъюгатов. В частности, нами было показано, что система пероксидаза-глюкозооксидаза (П-ГО) может быть использована для подобной цели in vivo. Моноклональные антитела против мембранного белка принадлежащего к семейству L6  связывали с пероксидазой и глюкозооксидазой путем конъюгирования с образованием бисароматических ковалентных гидразоновых связей. Белок L6 обычно экспрессирован в высоких концентрациях на поверхности плоскоклеточных карцином человека (например, клеток А431, которые содержат до 2,5.105 рецепторов на клетку). На этих клетках данная система и была вначале опробирована. В качестве СКВ была использована гадолиниевая соль бис-(5-окситриптамидо)диэтилентриаминопентауксусной кислоты,  (5ОТ-ДТПА(Gd). Это соединение эффективно восстанавливает окисленные формы пероксидазы и миелопероксидазы (см. ниже).  Релаксивность (R1) продуктов реакции 5ОТ-ДТПА(Gd) с пероксидазой возрастала в 2,1-2,5 раза по сравнению с исходным субстратом, причем скорость возрастания R1 была в 3 раза выше, если перекись водорода генерировали непрямым методом, т.е если в качестве источника перекиси водорода использовали  ГО в присутствии глюкозы. Этот результат можно  объяснить быстрым восстановительным ингибированием пероксидазы с образованием неактивных форм фермента в условиях избытка перекиси водорода. Эксперименты на культуре клеток показали, что в системе с применением П-ГО при помощи МРТ можно производить визуализацию от 0,4 до 0,04 единиц активности (100-10 нг) пероксидазы, связанной с клетками. 

В экспериментах с атимусными крысами с имплантированными клетками опухоли глиомы человека (Gli36), экспрессирующей рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), вводили последовательно конъюгаты антител против EGFR, а затем парамагнитный субстрат.  Сразу после введения СКВ происходило резкое возрастание интенсивности Т1-взвешенного МРТ-сигнала, за которым следовала медленная фаза выведения контрастного вещества из опухоли. У животных, которым вводили конъюгат антител за несколько часов  перед введением СКВ, происходило увеличение сигнала в опухоли примерно в 1.3 раза в течение первого часа после введения СКВ. Этот результат коррелирует с наблюдавшимся in vitro изменением МРТ-сигнала в реакции П-ГО с СКВ,  сопровождавшейся  образованием продуктов с высокой релаксивностью. Путем полуколичественного анализа МРТ изображений мы продемонстрировали наличие распределения парамагнитного продукта реакции в опухоли, которое коррелирует с местной экстравазацией антител в межклеточное пространство в ткани и связыванием клетками опухоли (Рис. 10Г-З). Таким образом, наблюдавшийся эффект контрастирования тонкой структуры опухоли у животных дает основания заключить, что неинвазивная визуализация распределения антител, направленных к маркерным молекулам в опухолевой ткани, позволяет получать МРТ изображения, применимые для картирования экспрессии рецепторов в обьеме опухоли. 

ГЛАВА VII. ВИЗУАЛИЗАЦИЯ АКТИВНОСТИ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ (МПО) В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРА НЕСТАБИЛЬНОЙ АТЕРОМЫ
       Постановка задачи.  Сердечно-сосудистые заболевания атеросклеротической природы (инфаркт миокарда, инсульт, заболевания периферических артериальных сосудов) являются главной причиной смертности населения в развитых странах мира. Атерогенез сосудов является сложным, многоэтапным патологическим процессом, который приводит во многих случаях к дестабилизации атеросклеротических бляшек на стенке пораженных сосудов, с развитием окклюзии сосудов и острой ишемической болезни. В последнее время, теория о преимущественно воспалительной природе атерогенеза сосудов привлекает все большее внимание исследователей.  Наличие локальной повышенной миелопероксидазной активности в стенке сосуда является одним из важнейших факторов в патогенезе атеросклероза. МПО секретируется нейтрофилами и присутствует в макрофагах, локализованных в сосудистой стенке (интиме). МПО быстро восстанавливает перекись водорода, образующуюся при активации нейтрофильной и эндотелиальной НАДФН оксидазы, и индуцирует окисление метиониновых групп, хлорироваие и нитрозилирование остатков тирозина белков, а также образование хлоргидринов ненасыщенных липидов (Рис. 11).

Рис. 11. Схема, иллюстрирующая химические реакции в стенке сосуда, катализируемые миелопероксидазой нейтрофилов (МПО) и механизмы контрастирования атеросклеротической бляшки (атеромы). А- МРТ Т1 субстраты и механизмы их полимеризации. Б- в условиях воспаления миелопероксидаза приводит к олигомеризации и иммобилизации парамагнитных субстратов в матриксе бляшки. В контрольных бляшках этот процесс не наблюдается.

Данные химические процессы вызывают активацию матриксных металлопротеиназ (например, ММП7) и способствуют деградации экстроцеллюлярного матрикса, способствуют окислению липидов липопротеинов низкой плотности, а также аполипопротеина А-I,  и активируют  вторичные воспалительные процессы, приводящие к накоплению пенистых макрофагов в интиме кровеносных сосудов и к дестабилизации атеросклеротической бляшки. Мы поставили задачу произвести неинвазивную визуализацию миелопероксидазной активности стенки сосудов при помощи МРТ,  основанной на эффекте МРТ- амплификации так как благодаря высокому пространственному разрешению МРТ дает возможность с высокой точностью определить локализацию очагов воспаления и потенциальной нестабильности.

Результаты и обсуждение. Мы синтезировали и испытали субстрат бис-(5-окситриптамидо)диэтилентриаминопентауксусной кислоты,  (5ОТ-ДТПА(Gd), который обладает МПО чувствительностью. Эффективность и специфичность визуализации миелопероксидазы была исследована  с применением двух типов экспериментов: 1) в модельных системах, в которых каталитически МПО либо была имплантирована искусственно, либо индуцирована в искусственно вызванном очаге воспаления (в результате инфильтрации нейтрофилов и макрофагов); 2) в модели спонтанного атеросклероза кроликов с визуализацией атеромы. В первом случае в качестве индуцирующего вещества использовали липополисахарид Е. соli, который вводили в мышцу (модель миозита) или в стенку сосуда под рентгенографическим наблюдением (модель воспалительной аневризмы стенки сосуда мозга). Мы установили, что в отличие от неспецифических КВ (ДТПК(Gd) или бис-тирамида ДТПК(Gd), МПО-специфические бис-  или моно 5-окситриптамиды парамагнитных комплексов гадолиния накапливаются как в экспериментальных очагах  воспаления, так и в атероме аорты, что позволяет производить измерение локального изменения МРТ сигнала в течение часов после введения КВ в отличие от ДТПК(Gd), который быстро выводится из атеромы (Рис. 12).  МРТ изображения стенки аорты кролика были получены с помощью системы МРТ последовательности радиочастотных пульсов, которые включали подготовительные пульсы  инверсии-восстановления, позволяющие подавить МРТ сигнал в кровотоке и одновременно усилить контраст между стенкой сосуда и близлежащими тканями. Гистологическое исследование показало, что области атеромы с выраженной анти-МПО реактивностью, обнаруженной при помощи иммуногистохимии, содержат в среднем в 3 раза больше ферментативно-активной МПО, чем нормальная стенка сосуда. Кроме того, мы обнаружили, что данные области реактивности антител совпадают с распределением максимального МРТ сигнала в стенке сосуда, что послужило независимым подтверждением наличия специфичности у сенсорного КВ бис-окситриптамида ДТПК(Gd).

Рис. 12. МРТ визуализация МПО  активности в модели спонтанного атеросклероза кроликов при помощи активируемых парамагнитных субстратов. А- временная зависимость усиления и стабилизации МРТ сигнала после введения контрольного (ДТПК(Gd)  или МПО специфического контрастирующего вещества (бис-5-ОТ- ДТПК(Gd); Б-изменение МРТ сигнала в атеросклеротической бляшке после введиния контрольного (ДТПКGd, верхний ряд) или бис-5-ОТ- ДТПК(Gd). Стрелками указано усиление интенсивности МРТ сигнала в бляшке стенки сосуда; В-активность МПО в образцах нормального сосуда (аорта) и в сосуде подверженному атеросклерозу; Г- сравнение распределения МРТ сигнала и иммуногистохимического окрашивания МПО на срезе сосуда; Д-корреляция между площадью МПО-положительной области среза и площадью МПО-положительного МРТ сигнала.

Наличие небольших очагов воспалительного ответа на локальную стимуляцию эндотелия,  выстилающего стенки сосудов головного мозга, является одним из основных факторов, вносящих вклад в развитие нестабильной аневризмы. Детекция подобных участков является важной задачей при выявлении пациентов, нуждающихся в срочном оперативном лечении аневризмы. Мы использовали принцип МРТ амплификации для визуализации активности МПО в модели аневризмы, полученной при помощи окклюзии основания правой сонной артерии кролика. Использование ангиографического слежения за введением 0.2 мкг липополисахарида E.coli в стенку сосуда через сверхтонкий катетер позволило создавать небольшие локальные очаги воспаления для моделирования последующей визуализации активности МПО. Данная процедура приводила к появлению небольших очагов инфильтрации клеток, положительно реагировавших с анти-МАС387, т.е. кальпротектином гранулоцитов/моноцитов и тканевых макрофагов, а также с анти-МПО антителами. Инфильтрация МПО-положительных клеток приводила к увеличению концентрации МПО в стенке сосуда с 0,12 нг/мг веса ткани до 20,3 нг/мг. При помощи МРТ с применением 5ОТ-ДТПА(Gd) мы показали, что усредненный Т1 взвешенный сигнал в аневризме достоверно увеличивался с 1,16±0,01 до 1,55±0,05 (p<0.02) после введения липополисахарида (Рис.13).

Рис. 13. Визуализация и измерения изменений МРТ сигнала в модели воспалительной аневризме при использовании КВ, специфичного к миелопероксидазе нейтрофилов (МПО) [44].

А, В- Т1-взвешенное МРТ изображение сонных артерий у контрольного животного до (А) и после  введения СКВ  (В, а-аорта). Б-Г-  животное, которому был введен ЛПС в стенку сосуда. Стрелки указывают на аневризму. Изображения были получены с использованием FFE пульсов, т.е. градиент эха). Д- отношение интенсивностей МРТ сигналов после и до введения СКВ.  Отношение в аневризме статистически достоверно выше контрольных тканей (р<0.02). Е, Ж- изменение соотношения МРТ сигналов во времени в аневризме и контрольной левой сонной артерии, в которой различий между контрольным КВ и МПО сенсорным КВ не наблюдалось.

  Данный эффект контрастирования носил специфический характер, так как измерения изменений соотношения МРТ сигнал/фон в левой сонной артерии, а также измерения после введения контрольного КВ (бис-тирамида ДТПК(Gd) не выявили различий, обнаруженных в экспериментальной группе животных (Рис 13 Ж).

Таким образом, данное МРТ исследование показало, что как в модели хронического воспалительного процесса в атеросклеротической бляшке, так и в модели острого процесса в аневризме стенки сосуда визуализация ферментативной активности МПО может быть произведена с применением неинвазивного МРТ исследования и парамагнитного зонда (сенсора) ферментативной активности.

ВЫВОДЫ

  1. Разработан и опробован в экспериментах на животных наномолекулярный биосовместимый контрастирующий зонд PGC-GdDTPA. МРТ с использованием PGC-GdDTPA позволяет визуализировать объем крови в живых моделях различных патологий человека (рак, ишемия головного мозга, локальное воспаление, инсульт).
  2. С применением контрастирующего зонда PGC-GdDTPA осуществлена визуализация ангиогенеза раковых опухолей животных. Показано, что зонд PGC-GdDTPA  позволяет с помощью МРТ измерять ранние изменения в кровоснабжении опухолей.
  3. Получены производные PGC, несущие самозатушенные флуоресцентные красители.  Продемонстрирован принцип неинвазивной визуализации ферментативной активности гидролаз в живых системах в ближне- инфракрасном диапазоне флуоресценции. Установлено, что специфическое расщепление опухолевыми катепсинами позволяет производить визуализацию  аденокарцином и оценивать скорость их роста (злокачественность).
  1. Разработаны активируемые ферментами низкомолекулярные парамагнитные контрастирующие зонды и доказан механизм увеличения релаксивности в присутствии пероксидаз. Продемонстрировано, что данные вещества могут быть использованы в качестве сенсоров пероксидаз при направленной доставке ферментов к рецепторам на поверхности опухолевых клеток.
  2. Разработаны миелопероксидазочувствительные парамагнитные контрастирующие зонды, которые были применены для визуализации очагов локального воспаления  стенки кровеносных сосудов.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

Статьи в научных журналах:

1.        Bogdanov A.A. Jr., Weissleder R., Frank H., Bogdanova A.V., Nossiff N., Schaffer B., Tsai E.,  Papisov M., Brady T.J. (1993)  A new macromolecule as a contrast agent for MR angiography: preparation, properties and animal studies. Radiology. v. 187, pp. 701-706.

2.        Frank H., Weissleder R., Bogdanov A.Jr.,  Brady T.J. (1994) Detection of pulmonary emboli by using MR angiography with MPEG-PL-GdDTPA: an experimental study in rabbits. Amer J Roentgenol. v. 162, pp. 1041-1046.

3.        Bogdanov A.A., Jr., Callahan R.J., Wilkinson R.A., Martin C., Cameron J.A., Fishman  A.J., Brady T.J., Weissleder R. (1994)  A synthetic copolymer kit for radionuclide blood pool imaging. J.Nucl. Med.  V. 35, pp. 1880-1886.

4.        Gupta H., Weissleder R., Bogdanov A.A. Jr., Brady T.J. (1995) Detection of experimental hemorrhage by contrast enhanced MRI and comparison with scintigraphy. Radiology, v. 196, pp. 239-244.

5.        Gupta H., Wilkinson R.A., Bogdanov A.A. Jr, Callahan R.J., Weissleder R. (1995) Inflammation imaging: use of a long circulating graft copolymer (MPEG-PL-DTPA) Radiology v. 197, pp. 665-669.

6.        Bogdanov A.A. Jr., Martin C., Bogdanova A.V., Brady T.J., Weissleder R. (1996) An adduct of cis-diamminodichlorplatinum(II) and poly(ethylene glycol)-poly(l-lysine)-succinate: synthesis and cytotoxic properties. Bioconjugate Chem. v. 7, pp. 144-149.

7.        Donahue K.M., Weisskoff R.M., Chesler D.A., Kwong K.K., Bogdanov A.A. Jr., Mandeville J.B., Rosen B.R. (1996) Improving MR quantification of regional blood volume with intravascular T1 contrast agents: accuracy, precision, and water exchange. Magn Reson Med. v. 36, pp.  858-867.

8.        Bogdanov A. Jr., Wright S.C., Marecos E.M., Bogdanova A., Martin C., Petherick P., Weissleder R. (1997) A long-circulating co-polymer in “passive targeting” to solid tumors. J.Drug Targeting, v. 4, pp. 321-330.

9.        Marecos E., Wiessleder R., and Bogdanov A. Jr. (1998) Antibody-mediated versus nontargeted delivery in a human lung carcinoma model. Bioconj. Chem. v. 9, pp. 184-191.

10.        Callahan R.J., Bogdanov A. Jr., Fischman A.J., Brady T.J., Weissleder R. (1998) Preclinical evaluation and phase I clinical trial of a 99mTc-labeled synthetic polymer used in blood pool imaging. Amer. J. Roentgenol, v. 171, pp. 137-144.

11.        Weissleder R., Cheng H.C., Marecos E., Kwong K., Bogdanov A. Jr. Non-invasive in vivo mapping of tumour vascular and interstitial volume fractions. (1998) Eur. J. Cancer, v.34, pp. 1448-1454. 

12.        Zaharchuk G., Bogdanov A. Jr., Marota J. J. A., Shimizu-Sasamata M., Weisskoff R.M., Kwong K.K., Jenkins B.G., Weissleder R., Rosen B.R. (1998) Continous assesment of perfusion by tagging including volume and water extraction (CAPTIVE): A steady-state contrast agent technique for measuring blood flow, relative blood volume fraction, and the water extraction fraction. Magn. Res. Med. v. 40, pp. 666-678.

13.        Weissleder R., Mahmood U., Tung C., Bogdanov A. Jr. (1999)  In vivo imaging of tumors with protease-activated near infrared fluorescent probes. Nature Biotechnology, v. 17, pp. 375-378.

14.        Bogdanov A. Jr., Marecos E., Cheng H.-C., Chandrasekaran L., Krutzsch H.C., Roberts D.D., and Weissleder R. (1999) Treatment of experimental brain tumors with thrombospondin-1 derived peptides: an in vivo imaging study. Neoplasia, v. 1, pp. 438-445.

15.        Zaharchuk G. , Mandeville J.B., Bogdanov A.Jr., Weissleder R., Rosen  B.R., Marota J.J., Iadecola C., Kim S.G. (1999) Cerebrovascular dynamics of autoregulation and hypoperfusion. An MRI study of CBF and changes in total and microvascular cerebral blood volume during hemorrhagic hypotension. Stroke, v. 30, pp. 2197-2204.

16.        Mahmood U., Tung C.-H., Bogdanov A.Jr., Weissleder R. (1999) Near-infrared optical imaging of protease activity for tumor detection. Radiology, v. 213, pp. 866-870.

  1. Lewin M., Bredow S., Sergeyev N., Marecos E., Bogdanov A. Jr., Weissleder R. (1999) In vivo assessment of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis. Int J Cancer, v. 83, pp. 798-802.
  2. Bogdanov A.Jr, Matuszewski  L., Bremer C., Petrovsky  A., Weissleder R. (2002) Oligomerization of paramagnetic substrates results in signal amplification and can be used for MR imaging of molecular targets. Mol Imaging, v. 1, pp. 16-23.
  3. Bogdanov A.Jr., Lin C.P., Matuszewski L., Simonova M., Weissleder R. (2002) Cellular activation of self-quenched fluorescent reporter probe in tumor microenvironment. Neoplasia, v. 4, pp. 3 228-236.
  4. Bremer C., Tung C.H., Bogdanov A. Jr.,  Moore A., Weissleder R. (2002) Imaging of differential protease expression in breast cancers for detection of aggressive tumor phenotypes. Radiology, v. 222, pp. 814-818.
  5. Kang H.W., Weissleder R., Bogdanov A. Jr.  (2002) Targeting of MPEG-protected polyamino acid carrier to human E-selectin in vitro. Amino Acids, v.  23, pp. 301-308.
  6. Kim Y.R.,  Savellano M.D., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2002) Steady-state and dynamic contrast MR imaging of human prostate cancer xenograft tumors: a comparative study. Techn Cancer Res Treat., v. 1, pp. 1-7.
  7. Bremer C., Mustafa M., Bogdanov A. Jr., Ntziachristos V., Petrovsky A., Weissleder R. (2003) Steady-state blood volume measurements in experimental tumors with different angiogenic burdens- a study in mice. Radiology, v. 226, pp. 214-220.
  8. Kim Y.R.,  Savellano  M.D., Savellano D., Weissleder R., Bogdanov A.Jr. (2004) Measurement of tumor interstitial volume fraction:  method and implication for drug delivery. Magn. Reson.Med. v. 52, pp. 485-494.
  9. Metelev V., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2004) Synthesis and properties of fluorescent NF-kB recognizing hairpin oligodeoxynucleotide decoys. Bioconj Chem., v. 15, pp. 1481-1487.
  10. Chen J.W., Pham W., Weissleder R., Bogdanov A.Jr. (2004) Human myeloperoxidase: a potential target for molecular MR imaging in atherosclerosis. Magn Reson Med., v. 52, v. 1021-1028.
  11. Querol M., Chen J.W., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2005) DTPA-bis-amide based MR sensor agents for peroxidase imaging. Org Lett, 17, pp. 1719-1722. 
  12. Reichardt W., Hu-Lowe D., Torres D., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2005) Imaging of VEGF receptor kinase inhibitor – induced anti-angiogenic effects in drug-resistant human adenocarcinoma model. Neoplasia, v. 7, pp. 847-853.
  13. Kim Y.R., Petrovsky A., Reichardt W.,  Hu-Lowe  D., Kang H.W., Torres D.,  Weissleder R., Bogdanov A.Jr. (2005) Detection of early anti-angiogenic effects: in vivo changes of tumor blood volume in response to the experimental VEGF-receptor tyrosine kinase inhibitor. Cancer Res. v. 65, pp.  9223-9260.
  14. Querol M., Chen J.W., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2005) Myeloperoxidase activity imaging using 67-Ga labeled substrate. Molecular Imaging Biol., v. 7, pp. 403-410.
  15. Querol M., Chen J.W., Bogdanov A. Jr. (2006) A paramagnetic contrast agent with myeloperoxidase-sensing properties. Org Biomol Chem, v. 4, pp. 1887-1895.
  16. Chen J.W., Querol M., Bogdanov A. Jr.,  Weissleder R. (2006) Imaging myeloperoxidase in mice using novel amplifiable paramagnetic substrates. Radiology,  v. 240, pp. 473-481.
  17. Runnels J.M., Zamitri P., Spencer J.A., Veilleux I., Wei X., Bogdanov A., Lin C.P. (2006) Imaging molecular expression on vascular endothelial cells by in vivo immunofluorescence microscopy. Mol Imaging,  v. 5, pp. 31-40.
  18. Bogdanov A.A., Jr., Lin C.P., Kang  H.W. (2007) Optical Imaging of the Adoptive Transfer of Human Endothelial Cells in Mice Using Anti-Human CD31 Monoclonal Antibody. Pharm Res, v. 24, pp. 1186-1192.
  19. Laguillier C., Hbibi A.T., Baran-Marszak F., Metelev V., Cao A., Cymbalista F., Bogdanov A. Jr., Fagard R. (2007) Cell death in NF-kappaB-dependent tumour cell lines as a result of NF-kappaB trapping by linker-modified hairpin decoy oligonucleotide.  FEBS Lett., v. 581, pp. 1143-50.
  20. Bogdanov A. Jr., Kang H.W., Querol M., Pretorius P.H., Yudina A. (2007) Synthesis and testing of a binary catalytic system for imaging of signal amplification in vivo. Bioconjug Chem, v. 18, pp. 1123-1130.
  21. Querol  M.,  Bennett D.G.,  Sotak C.,  Kang H.W.,  Bogdanov A. Jr. (2007) A paramagnetic contrast agent for detecting tyrosinase activity.  ChemBioChem., v. 8, pp. 1637-1641.
  22. Medarova Z., Castillo G., Dai G., Bolotin E., Bogdanov A., Moore A. (2007) Non-invasive Magnetic Resonance Imaging of Microvascular Changes in Type 1 Diabetes. Diabetes, v.  56, pp. 2677-2682.
  23. Богданов А.А. мл., Куерол  М., Чен Д.  (2007) Визуализация ферментативной активности в живых системх при помощи активируемых ЯМР контрастных агентов. Биофизика,  т. 52, с. 389-400. 
  24. Tabatadze D., Zamecnik P., Yanachkov I., Wright G., Pierson K., Zhang S., Bogdanov A.Jr., Metelev V. (2008) A novel thymidine phosphoramidite synthon for incorporation of internucleoside phosphate linkers during automated oligodeoxynucleotide synthesis. NN&NA, v. 27, pp. 157–172.
  25. Zhang S., Metelev V., Tabatadze D., Zamecnik P., Bogdanov A.A..Jr. (2008) Fluorescence resonance energy transfer in near-infrared fluorescent oligonucleotide probes for detecting protein-DNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA, v. 105, pp. 4156-61.
  26. Zhang S., Metelev V., Tabatadze D., Zamecnik P., Bogdanov A. Jr. (2008) Near-infrared fluorescent oligodeoxyribonucleotide reporters for sensing NF-kappaB DNA interactions in vitro. Oligonucleotides, v. 18, pp. 235-43.
  27. Kim Y.R., Tejima E., Huang S., Atochin D.N., Dai G., Lo E.H., Huang P.L., Bogdanov A. Jr., Rosen B.R.  (2008) In vivo quantification of transvascular water exchange during the acute phase of permanent stroke. Magn Reson Med., v.  60, pp. 813-821.
  28. Deleo M., Gounis M., Hong B., Wakhloo A., Bogdanov A. Jr. (2009) In vivo мolecular еnzyme-сpecific MR imaging of аctive inflammation in a pilot аnimal мodel of carotid аrtery аneurysm. Radiology, в печати.

Главы и монографии:

1.        Bogdanov A.A., Jr., Weissleder R., Brady T.J. Protected angiopolymers and their use in blood pool imaging. In: Torchilin VP, ed. Handbook of Targeted Delivery of Imaging Agents. CRC Press, Boca Raton FL, 1995, pp. 502-522.

  1. Bogdanov A. Jr., Petrovsky A., Schellenberger E., Simonova M., Pham W., Josephson L., Weissleder R MRI contrast agents of the future. In: MRI: From current knowledge to new horizons. J. Debatin, H.Hricak, H.P.Niendorf, eds. Experta Medica Int. Amsterdam, 2003, pp. 227-234.
  2. Bogdanov A.A. Jr., Chen J.W., Kang H.W., and Weissleder R. Magnetic resonance signal amplification probes. In: Ernst Schering Research Foundation Workshop 49: Molecular Imaging,  Bogdanov A.A. Jr., Licha K.,  Eds., Springer-Verlag GmbH, Heidelberg, 2005 pp. 147-157.
  3. Bogdanov A.A. Jr. “Molecular probes, delivery”: in Encyclopedic Reference of Imaging, Baert, A.L., Editor, 2008 Springer-Verlag, Heidelberg,  p. 1966.
  4. Querol M., Bogdanov A.A. Jr. Environment-sensitive and enzyme-sensitive MR contrast agents. In: “Handbook of Experimental Pharmacology. Molecular Imaging II”W. Semmler and M. Schwaiger, eds. Springer-Verlag, Heidelberg, 2008, pp. 37-56.
  5. Bogdanov A.A. Jr. Optical Imaging Probes. In: “Molecular Imaging in Oncology” M.G.Pomper and J.G.Gelovani, Eds. Informa Healthcare, NY,London, 2008, pp. 245-260.
  6. Юдина А.Ю., Богданов А.А. мл., Пирогов Ю.А. Магнитно-резонансная томография  в изучении ангиогенеза и его молекулярных маркеров. Под ред. Ю.А. Пирогова. Изд. Физического факультета МГУ, Москва, 2008, 143 стр.

Патенты:

1. Bogdanov A.A. Jr.,  Brady T.J. Medical Compositions. US Patent  5,593,658.

  1. Bogdanov A.A. Jr., Weissleder R., Brady T.J., Callahan R. Blood pool imaging composition and method of its use.  US Patent  5,605,672.
  2. Bogdanov A.A. Jr., Weissleder R., Brady T.J. Graft copolymer adducts of platinum(II) compounds. US Patent 5,871,710. 
  3. Bogdanov A.А. Jr., Tung C.-H.,  Weissleder R. Noninvasive imaging of nucleic acid vectors. US Patent 6,284,220.
  4. Weissleder R., Tung C.-H., Mahmood U., Josephson L., Bogdanov A.A. Jr., Intramolecularly-quenched near infrared fluorescent probes. US Patent 6,083,486.
  5. Bogdanov A.А. Jr., Weissleder R. Imaging of enzymatic activity. US Patent 6,737,247.
  6. Weissleder R., Tung C.-H., Mahmood U., Josephson L., Bogdanov A.A. Jr., Intramolecularly-quenched near infrared fluorescent probes. US Patent 6,592,847.
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.