WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Плотников Егор Юрьевич

Митохондрии как центральное звено повредающих и защитных сигнальных путей при развитии почечной недостаточности

03.00.25-03 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва

2009

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, на факультете биоинженерии и биоинформатики, МГУ им. М.В.Ломоносова и в НЦ Акушерства, гинекологии и перинатологии им.М.В.Кулакова.

Научные консультанты 

доктор биологических наук,

профессор Зоров Д.Б.,

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Сухих Г.Т.

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук,

профессор Макарова О.В.

Доктор физико-математических

наук, профессор Рууге Э.К.

Доктор биологических наук

Исмаилов А.Д.

Ведущая организация:                        Институт Биофизики клетки РАН.

Защита состоится « » _________ 2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «___»_______________2009 г. 

 

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук                                        Е.Н.Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нарушения функции почек различного генеза являются распространенной клинической патологией, часто угрожающей жизни больного. Несмотря на прогресс в развитии методов терапии, не уменьшается количество пациентов с ишемической острой почечной недостаточностью (ОПН), высока смертность от этого состояния (Himmelfarb J. and Ikizler T.A., 2007). Острый некроз скелетных мышц (рабдомиолиз) и обусловленная им миоглобинурия также являются достаточно распространенной патологией, ведущей к развитию ОПН (Zager R.A., 1996).  Поскольку основной причиной рабдомиолиза (также называемого краш-синдромом, наблюдаемого при техногенных и природных катастрофах, военных действиях) являются травмы, сопровождающиеся раздавливанием тканей, эта проблема представляется чрезвычайно актуальной из-за высокой клинической распространенности и тяжести течения болезни (Vanholder R. et al., 2000). При хронической почечной недостаточности (ХПН) возникает необходимость замещения функции поврежденного органа путем гемодиализа или трансплантации почки, что серьезно ухудшает качество жизни больного (Mucsi I. et al., 2008) и является крайне затратным с экономических позиций. Все это указывает на необходимость изучения фундаментальных клеточно-биологических процессов, лежащих в основе повреждения и механизмов защиты почки, а также разработки новых подходов к терапии и профилактике нарушений функций почек. 

В последнее время становится очевидным, что механизмы патологических процессов, протекающих в почке, всвязаны с развитием «окислительного стресса» (Cadenas E. and Sies H., 1985), который является выраженным и в значительной мере необратимым деструктивным процессом, ведущим к гибели клеток нефрона и функциональной несостоятельности органа (Basnakian A.G. et al., 2002).

Основными участниками цепи событий, приводящих к окислительному стрессу, являются активные формы кислорода и азота (АФК и АФА, соответственно). Однако их роль не сводится к повреждающим реакциям, они также участвуют и в сигнальных путях, ведущих к защите клетки и органа (Зоров Д.Б.и др., 2005). Центральной фигурой как повреждающих, так и защитных путей следует признать митохондрии, и именно исследование их функционирования в условиях различных почечных патологий может помочь в составлении целостной картины регуляции выживания или гибели клетки в ходе развития окислительного стресса.

Нет сомнений, что итоговыми результатами исследований фундаментальных механизмов повреждения почки должна стать разработка принципиально новых стратегий защиты почки, причем выявление центральных звеньев деструктивного процесса позволит разработать универсальные методы защиты, актуальные для самых разных почечных патологий. 

В этой связи нами были выбраны два направления разработки нефропротекторных технологий. В основе первой лежит повышение толерантности почки к окислительному стрессу, направленное на снижение тяжести повреждения в условиях его развития. Основными средствами для достижения этой цели являются фармакологические препараты с антигипоксическим и мембранопротекторным действием, и методы физиологического и фармакологического прекондиционирования клеток почки. Вторым направлением стало исследование возможностей улучшения функции поврежденной почки с помощью клеточных технологий, то есть использования различных типов стволовых и прогениторных клеток для регенеративной терапии почечной ткани.

В основе действия антигипоксантов лежит активация анаэробной продукции макроэргических соединений на фоне дефицита кислорода в клетке (Костюченко А.Л. и Семиголовский Н.Ю., 2002), тогда как антиоксиданты уменьшают последствия окислительного стресса, устраняя избыток свободных радикалов, и тем самым препятствуют возникновению повреждений клеток и ткани почки (Koyner J.L. et al., 2008). Однако, пока нет убедительных клинических данных о способности антиоксидантов предотвращать ишемическое повреждение (Kromhout H., 2001), что отчасти объясняется проблемой доставки этих соединений в места генерации АФК в нужное время и достаточном количестве для снижения окислительного стресса (Becker L.B., 2004). В этой связи наиболее перспективным представляется принципиально новое направление разработки антиоксидантов для терапии заболеваний связанных с окислительным стрессом – создание антиоксидантов, направленно доставляемых в митохондрии (Скулачев В.П., 2007).

Основным началом всех подходов клеточной терапии является использование стволовых клеток или специализированных почечных клеток на разных этапах дифференцировки. Данная область может быть охарактеризована, как использование различных типов клеток для восстановления поврежденной почки за счет стимуляции собственных репаративных процессов в ткани, регенерации структур почки или биоинженерии (Little M.H., 2006). Однако, механизмы взаимодействия стволовых клеток с тканью поврежденного органа изучены слабо, особенно в отношении почечной ткани. Остается неясным, какие типы клеток (эмбриональные, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, прогениторные клетки почки и др.) наиболее эффективны в защите и восстановлении функций почки, а также каким образом может реализовываться положительной эффект клеточной терапии: интеграцией введенных клеток в почку, с последующей дифференцировкой и встраиванием в нефрон (Morigi M. et al., 2004), паракринным влиянием (Togel F. et al., 2005) или различными межклеточными взаимодействиями вплоть до слияния клеток (Bussolati B. and Camussi G., 2007). В данной работе исследовалась не только возможность восстановления функций почки с помощью клеточной терапии, но и механизмы взаимодействия стволовых клеток в поврежденной тканью.

Исходя из вышеизложенного, в работе исследованы на клеточном уровне механизмы развития самых распространенных в клинической практике почечных патологий, таких как острая ишемическая почечная недостаточность и миоглобинурия, вызванная рабдомиолизом. Изучена возможность предотвращения и терапии дисфункции почки с помощью фармакологического и ишемического прекондиционирования, применения митохондриально-адресованных антиоксидантов и клеточной терапии.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было исследование роли митохондрий клеток почки в повреждающих и защитных сигнальных путях при почечной недостаточности, вызванной ишемией/реперфузией и миоглобинурией, а также поиск стратегий нефропротекции и восстановления почечной ткани.

Задачи исследования:

  1. изучение морфо-функционального состояния митохондрий клеток почки при острой почечной недостаточности, вызванной ишемией/реперфузией и рабдомиолизом;
  2. исследование механизмов продукции активных форм кислорода и азота в клетках почки при ишемии/реперфузии и рабдомиолизе;
  3. выявление роли митохондрий в развитии окислительного и нитрозильного стресса;
  4. изучение действия физиологического прекондиционирования (ишемической и гипоксической тренировки) на выраженность патологических изменений при ишемии/реперфузии почки;
  5. исследование механизмов прекондиционирования почки и защиты от дисфункции с помощью фармакологических агентов: ингибиторов киназы гликогенсинтазы-3 (GSK-3) и митохондриально-адресованных антиоксидантов;
  6. изучение эффекта введения стволовых и прогениторных клеток на функции почки при острой и хронической почечной недостаточности;
  7. исследование механизмов межклеточных взаимодействий стволовых клеток с дифференцированными клетками органа и роли митохондрий в этих процессах.

Научная новизна работы. В работе показана ведущая роль митохондрий в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки, в управлении гибелью клетки, а также возможность участия в процессах клеточной дифференцировки.

Показано нарушение работы митохондриального аппарата клеток почки, выражающееся в падении трансмембранного потенциала, индукции неспецифической проницаемости митохондрий, их набухании и фрагментации при И/Р почки. Впервые на модели ишемии/реперфузии почки показано, что основными источниками повышенной продукции активных форм кислорода и NO являются митохондрии. Показано, что ишемия/реперфузия вызывает запуск в клетках почки апоптотических сигнальных путей, которые реализуются через транслокацию в митохондрии белка Вах и выход из митохондрий цитохрома с.

Обнаружено, что физиологическое прекондиционирование (воздействие периодов гипоксии на животное или кратковременные периоды ишемии почки), и фармакологическое прекондиционирование хлоридом лития вызывают ингибирование киназы GSK-З, предотвращают развитие неспецифической проницаемости митохондрий, снижают повреждение митохондрий и генерацию активных форм кислорода и, в конечном счете, защищают почку от повреждения.

Изучение механизмов острой почечной недостаточности при рабдомиолизе показало, что именно повреждение митохондрий и развитие в них перекисного окисления является одной из основных причин дисфункции почки. Показано, что миоглобин индуцирует в митохондриях гиперпродукцию активных форм кислорода и NO, окисление митохондриальных мембран и разобщение окислительного фосфорилирования.

Исследование влияния митохондриально-адресованных антиоксидантов 10-(6'-пластохинонил) децилтрифосфония (SkQ1) и 10-(6'-пластолхинонил) децил-родамина (SkQR1), показало их высокую эффективность в предотвращении окислительного стресса в почечных клетках после ишемии и защите почки от повреждения. Эти соединения уменьшают гибель клеток почечного эпителия, снижают выраженность пост-ишемической почечной недостаточности и повышают выживание животных с острой почечной недостаточностью.

Введение мультипотентных мезенхимальных стромальных  клеток (ММСК) нормализует функциональное состояние почки при хронической и острой почечной недостаточности, способствует уменьшению выраженности патоморфологических изменений в почечных канальцах, и повышает выживание животных. Показано образование различных типов межклеточных контактов между стволовыми и дифференцированными клетками и передача по этим контактам цитоплазмы и митохондрий, что может играть роль в определении направления дифференцировки стволовых клеток и в развитии их терапевтического эффекта.

Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования углубляют представления о фундаментальных клеточных механизмах, лежащих в основе развития окислительного стресса и повреждения почки при таких клинически распространенных почечных патологиях, как острая ишемическая почечная недостаточность и миоглобинурия.

Показано нефропротективное действие ионов лития, митохондриально-адресованных антиоксидантов семейства SkQ и ишемического прекондиционирования, что позволяет использовать их для разработки фармакологических препаратов, способных уменьшать, предупреждать обращать патологические изменения при острой почечной недостаточности, миоглобинурии и краш-синдроме, оперативных вмешательствах. Показано, что введение ММСК способствует улучшению функций почки при ОПН и ХПН, что дает основание для использования ММСК для терапии этих патологий. Результаты исследования могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии, цитологии,  биохимии, нефрологии и патофизиологии.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. При ишемии/реперфузии почки митохондрии клеток почечных канальцев являются основными источниками АФК и NO, что указывает на ведущую роль этих органелл в развитии окислительного стресса.
  2. Ионы лития, гипоксическое и ишемическое прекондиционирование вызывают  ингибирование GSK-3β, что предотвращает негативные последствия ишемии/реперфузии почки, снижая продукцию активных форм кислорода в митохондриях, гибель клеток почечных канальцев и выраженность признаков почечной недостаточности.
  3. Миоглобин вызывает перекисное окисление липидов митохондрий почки как при рабдомиолизе in vivo, так и при воздействии на изолированные митохондрии почки in vitro
  4. Митохондриально-адресованные антиоксиданты SkQ и SkQR1 эффективно предотвращают развитие окислительного стресса в клетках почки при ишемии/реперфузии и восстанавливают нарушенные функции почки.
  5. Мультипотентные мезенхимальные стромальные  клетки  при введении животным способствуют уменьшению выраженности повреждения почек при острой и хронической почечной недостаточности
  6. Мультипотентные мезенхимальные стромальные  клетки  могут при совместном культивировании образовывать контакты с клетками почки и другими дифференцированными клетками. Между контактирующими клетками происходит транспорт клеточного содержимого, в том числе митохондрий.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах отдела биоэнергетики НИИ Физико-Химической биологии им. А.Н.Белозерского. Отдельные аспекты работы представлялись на Международной конференции “Ломоносов”, (Москва, 2001, 2006, 2007, 2008), 5-ой конференции “Биология — наука 21-го века” (Пущино, 2001, 2007), 6-ой школе Джона Хамфри по иммунологии (Пущино, 2002), конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2001), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005, 2007), 3-ем съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), международной научной школе «Free radicals and diseases: gene expression, cellular metabolism and pathophysiology» (Греция, 2004), конференции «Российская Биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), европейских биоэнергетических конференциях EBEC (Москва, 2006, Дублин, 2008), конференции FEBS2007 (Вена, 2007), конференции Mitochondrial physiology. MiP2007 64th Harden conference (Австрия, 2007), XI съезде урологов России (Москва, 2007), Международном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008), IV Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2008).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 64 печатных работах, из них 25 – в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация написана на 325 страницах, состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы включает 34 отечественных и 558 иностранных источника.

Материалы и методы исследования

Опыты по моделированию ишемии/реперфузии (И/Р) почки проводились на самцах белых беспородных крыс массой тела 180-200 г, содержавшихся в условиях вивария. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике НИИ Физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского. Для моделирования И/Р под хлоралгидратным наркозом выделяли и пережимали сосудистую ножку почки сосудистым зажимом на различные периоды времени. После снятия зажимов отсчитывали время реперфузии. После окончания периода реперфузии либо удаляли почку для дальнейших экспериментов, либо накладывали швы и выводили животное из наркоза. Рабдомиолиз вызывали по стандартной методике - введением 50%-ного водного раствора глицерина в мышцы задних конечностей крысы из расчета 10 мл/ кг (Zurovsky Y., 1993).

Митохондрии почек крысы выделяли методом дифференциального центрифугирования. Использовали среду выделения: 0,25 М сахароза, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% БСА, рН7,5. Эксперименты проводили в среде выделения, не содержащей БСА и ЭДТА. Содержание белка определяли с помощью бицинхониновой кислоты.

Первичную культуру клеток почечных канальцев  крыс получали путем диссоциации ткани в 0,1% растворе коллагеназы, клетки осаждали центрифугированием при 400 g. Осадок клеток ресуспендировали в среде DMEM/F-12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и высаживали на  культуральные планшеты или специальные культуральные флаконы с плотностью 1х105 клеток/мл. Клетки культивировали в инкубаторе с влажной атмосферой и концентрацией СО2 5% в течение 1-2 дней, после чего использовали для проведения экспериментов.  Ишемию моделировали в растворе Хенкса, насыщенном газообразным азотом для создания аноксических условий. Клетки инкубировали в аноксичных условиях в течение 24 ч при 37оС.

Митохондриальный трансмембранный потенциал Δψ оценивали при помощи этилового эфира тетраметилродамина (TMRE, Invitrogen, США). Образование АФК детектировалось с помощью 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF, Invitrogen, США). Образование оксида азота исследовали с помощью 4,5-диаминофлуоресцеина (DAF-2 DA, Invitrogen, США).

Культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и прогениторных клеток почки (ППК), полученные из аутопсийного материала плодов 8-12 недель гестации, были предоставлены НЦ Акушерства, гинекологии и перинатологии им.В.И.Кулакова. Фенотип ММСК был подтвержден позитивной окраской на маркеры CD90 и CD105, и отрицательной на маркеры CD34, CD45.

Для оценки транспорта цитоплазматического содержимого клетки окрашивались 2,5 мкМ Calcein AM (Invitrogen, США). Для оценки транспорта митохондрий клетки окрашивались 1 мкМ Mitotracker Green FM или Mitotracker Red (Invitrogen, США). Для оценки транспорта липидов мембран клетки окрашивались 2,5 мкМ DiO, DiD или DiL (Vybrant, Invitrogen, США). Микроскопическое изучение клеток почки производилось на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Изображение обрабатывалось программным пакетом ImageJ. Проточная цитофлуориметрия проводилась с помощью проточного цитометра CyFlow (Partec GmbH, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение структуры и функций митохондрий клеток витальных срезов почки после ишемии/реперфузии

В данной работе разработана методика изучения функционального состояния клеток ткани в витальных срезах коры почки. Данные, полученные при окрашивании срезов почки красителем TMRE, свидетельствуют о значительном падении Δψ в митохондриях почки после прекращения кровотока на 40 мин и последующей реперфузии, когда относительная интенсивность флуоресценции TMRE снизилась на 60% по сравнению с контрольной почкой (рис. 1А). Такое снижение может быть вызвано в частности индукцией в митохондриях неспецифической проницаемости (НП) внутренней мембраны (митохондриальной поры). В результате воздействия циклоспорина А на срезы почки после И/Р доля высоко энергизованных митохондрий увеличилась на 18% по сравнению с необработанными срезами, что указывает на открытие митохондриальной поры (рис. 1В).

Изучение морфологического состояния митохондрий показало значительные изменения структуры митохондрий после И/Р (рис. 1Б). Митохондрии контрольной почки имели палочковидную  или нитевидную структуру, характерную для митохондрий большинства клеток в норме. В то же время в опытных образцах митохондрии сильно увеличивались в объеме, заполняя практически всю цитоплазму (рис. 1Б). Помимо набухания часто И/Р вызывала фрагментацию единой митохондриальной сети на мелкие частицы, обладающие мембранным потенциалом (рис. 1Б). Таким образом, данные конфокальной микроскопии клеток почки позволяют предположить, что при И/Р почки происходит индукция НП и подавление функций митохондрий, приводящее к их набуханию, а крайнем варианте и фрагментации.

Электронная микроскопия также выявила значительное набухание митохондрий клетках почек, подвергшихся И/Р. По сравнению с нормальной ультраструктурой митохондрий в контрольной почке, после ишемии митохондрии имели увеличенный объем матрикса, часто становились плохо различимыми структуры крист (рис. 1Г).

Повышение продукции АФК в клетках витальных срезов почки

После И/Р в клетках почечной ткани образовывалось вдвое больше АФК чем в контрольной почке (рис. 2А,Б). Это указывает на развитие окислительного стресса в клетках, подвергшихся И/Р, и может объяснять фрагментацию митохондрий, поскольку основным ее индуктором, как сказано выше, являются АФК. Воздействие ионов лития в пред-ишемический период приводило к значительному снижению флуоресценции DCF в клетках после И/Р, то есть уменьшало выраженность генерации АФК и окислительного стресса. Повышенная продукция кислородных радикалов (интенсивность флуоресценции DCF) находится в обратной зависимости от величины потенциала митохондрий (интенсивность флуоресценции TMRE).

Локализация генерации АФК определялась методом двойного окрашивания клеток почки TMRE и DCF. Была обнаружена практически полная колокализация изображения митохондрий, окрашенных TMRE, и структур, окрашенных на АФК (рис. 2Г-Е). Это свидетельствует о том, что продукция АФК происходит преимущественно в митохондриях.

Таким образом, полностью подтвердилась гипотеза о митохондриальном происхождении АФК, образующихся в ходе И/Р в клетках почки.

Повышение продукции NO в клетках почки.

Исследование концентрации нитрита в ткани почки показало, что генерация продукции нитрита начинается уже в ходе ишемии, достигает максимума (5,5 мг/г ткани почки) на 10 мин реперфузии и снижается до 3,8 мг/г ткани почки после 1 ч реперфузии. Основная активация образования нитрита приходится на первые минуты реперфузии, очевидно именно в это время происходит максимальная функциональная активация синтеза NO.

Для более детального исследования генерации NO в клетках почки при И/Р было использовано окрашивание витальных срезов почки DAF-2 DA, который является специфическим флуоресцирующим зондом на оксид азота (Nagano T. and Yoshimura T., 2002). По относительной интенсивности флуоресценции DАF-2 можно судить о продукции NO в клетке. В клетках контрольных почек средняя интенсивность флуоресценция DАF-2 составляла 9,5±0,5 отн.ед., то есть продукция NO находилась на низком уровне (рис. 3А И/Р почки вызывала возрастание продукции NO до 33,0±0,8 отн.ед., что коррелирует с данными образования нитрита в почке, причем эта генерация обусловлена именно активностью NO-синтазы, поскольку специфически подавляется ингибитором NOS, L-NAME (рис. 3А).

Интересно, что предварительное введение крысам ионов лития очень слабо влияло на продукцию NO после И/Р (рис. 3А). По-видимому, активация NO-синтаз в клетках при И/Р не является следствием открытия митохондриальной поры.

Было проведено исследование локализации генерации оксида азота методом двойного окрашивания клеток почки TMRE и DАF-2-DA. Анализ изображений показал совпадение локализации окраски на митохондриальный мембранный потенциал и на NO (рис. 3Б-Д). Таким образом, большая часть продукции NO в анализируемых клетках приходится на митохондрии.

Защитный эффект ионов лития и роль GSK-3β. при повреждении, вызванном ишемией/реперфузией

Как показано для кардиомиоцитов, ключевую роль в процессе ишемического прекондиционирования (ПК) играет GSK-3β (Juhaszova M. et al., 2004), на которой сходятся многие пути защитной сигнализации. Защитный эффект Li+ объясняется тем, что ионы лития блокируют активность GSK-3β, и это делает его перспективным антиишемическим агентом для любых тканей, подвергающихся И/Р.

После внутрибрюшинной инъекции LiCl (50 мг/кг) перед ишемией почки, деполяризация митохондриальных мембран в клетках канальцев, вызываемая И/Р, значительно снижалась (рис. 4А).  Учитывая чувствительность индуцированной потери потенциала  Δψ к циклоспорину А, мы предположили, что защитный эффект введения Li+ достигался через снижение возможности индукции НП, как это имело место в случае кардиомиоцитов (Juhaszova M. et al., 2004). Так как индукция НП в кардиомиоцитах сопровождалась окислительным взрывом (ROS-induced-ROS-release; Zorov D.B. et al., 2000), то защита от индукции НП снижает избыточную продукцию АФК в клетках. На это указывает то, что обработка Li+ перед ишемией почки приводила к значительному снижению флуоресценции DCF, и следовательно, к меньшему окислительному стрессу после И/Р (рис. 4Б). Такая же тенденция наблюдается на митохондриях, выделенных из почки, подвергнутой И/Р (рис. 4Д). В таких митохондриях значение Δψ было существенно ниже нормы и значительно восстанавливалось  при предобработке почки Li+.  Прямым доказательством того, что действие ионов лития направлено на активность GSK-3β в клетках почки, является тот факт, что инъекция LiCl приводила к накоплению фосфорилированной формы GSK-3β (рис. 4В), для которой известно, что она неактивна (Sutherland C. et al., 1993).

Изучение влияния ионов лития на функциональное состояние ишемизированной почки у животных in vivo показало, что введение хлорида лития в дозе 10 мг за час до 60-минутной ишемии значительно улучшало функциональные параметры почки, наблюдаемые после ишемии. Выявлено, что показатели эндогенного креатинина крови после перенесенной ишемии составляли более 140 мкМ по сравнению с 40 мкМ в контроле, что свидетельствует о неспособности почек удалять продукты азотистого обмена из крови. На фоне предварительного введения хлорида лития уровень креатинина снижался до 60 мкМ. Клиренс креатинина, снижавшийся после ишемии, на фоне предварительного введения лития оставался в пределах нормы. Концентрация мочевины крови, также значительно повышенная после перенесенной ишемии, на фоне введения LiCl на 3 сут снижалась до нормы.

Защитные эффекты ингибирования GSK-3β фармакологическими агентами были подтверждены на модели ишемии/реоксигенации культивируемых клеток почечных канальцев. Для этого клетки инкубировали в течение ишемии с LiCl и инсулином в концентрациях 6 мМ и 60 нМ, соответственно.  Найдено, что обработка ионами лития приводит к снижению флуоресценции DCF (рис. 5), повышенной после И/Р приблизительно в 2 раза, что означает соответственное снижение уровня генерации АФК. К аналогичному эффекту приводит и инкубация первичной культуры клеток почки с инсулином. Пониженный после ишемии потенциал, наоборот, частично восстанавливался (рис. 5 флуоресценция TMRE). Эти данные говорят о том, что и инсулин и ионы лития препятствуют развитию окислительного стресса в клетках, подвергшихся действию И/Р.

Для доказательства GSK-опосредованного действия исследуемых веществ мы исследовали степень фосфорилирования GSK-3β и ее локализацию в клетках методами иммуноцитохимии и иммуноблоттинга (рис. 6). В необработанных клетках фосфорилированной формы киназы не выявляется, тогда как при обработке LiCl в течение 6 ч и особенно 24 ч наблюдается значительное повышение количества фосфо-GSK-3β. Таким образом, при используемом нами времени ишемии 24 ч, ионы лития вызывают значительное фосфорилирование GSK-3.

Иммуноцитохимическое  окрашивание на фосфорилированную форму GSK-3β выявило, что в интактных клетках количество фосфорилированной формы очень мало, тогда как 24-ч инкубация с LiCl вызывает значительное увеличение содержания фосфо-GSK-3β в клетках почки. При этом отмечено, что фосфо-GSK-3β локализуется в основном в митохондриях, хотя уровень фосфорилирования цитоплазматического пула GSK-3β также выше, чем в контроле.

Влияние гипоксического и ишемического прекондиционирования на пост-ишемические изменения в ткани почки

ПК является наиболее эффективным способом защиты, снижающим клеточную гибель, вызываемую И/Р. В живых органах традиционная защита ПК достигается короткими эпизодами ишемии и реперфузии, предваряющими длительную окклюзию артерий. Обработка ионами лития может считаться фармакологическим ПК как в кардиомиоцитах (Juhaszova M. et al, 2004), так и в ткани почки. Мы сравнивали эффекты вызываемого ионами лития фармакологического ПК, ишемического ПК, вызываемого краткими эпизодами ишемизации отдельного органа, и действие гипоксического ПК, вызываемого короткими периодами гипоксии у животного.

На рис. 7А показано, что митохондриальный мембранный потенциал Δψ после И/Р (30% от контроля) частично восстанавливался при ишемическом ПК (до 56%), тогда как гипоксическое ПК сохраняло более высокие значения Δψ (78% от контроля). Продукция АФК в почках, подвергнутых ишемическому ПК, была более низкой по сравнению с почками после И/Р. Гипоксическое ПК снижало индуцированную И/Р продукцию АФК приблизительно на 66% от контроля (рис. 7Б).

Гипоксическое ПК также влияло на продукцию NO в клетках канальцев после И/Р. По сравнению с контролем, в срезах почек крыс после коротких эпизодов гипоксии и дальнейшей И/Р регистрировали снижение флуоресценции DAF-2 почти на 50% (рис. 7В).

Детальное исследование механизмов, лежащих в основе гипоксического ПК, выявило ряд взаимосвязанных сигнальных путей, повышающих устойчивость клеток почки к ишемии. Выявлено, что уже через 3 суток гипоксического ПК в почках крыс более чем вдвое повышается количество эритропоэтина (рис. 8). Также обнаружено, что эритропоэтин снижает гибель культивируемых клеток почки, сопровождающуюся освобождением в среду лактатдегидрогеназы (ЛДГ) после ишемии. Через 24 ч после ишемии выявлено увеличение активности ЛДГ в среде приблизительно в 3 раза по сравнению с контролем. В присутствии эритропоэтина эти значения снижались практически до контрольных. Кроме того, при гипоксическом ПК в клетках почки увеличивается количество фосфорилированной митохондриальной GSK-3β. Ионы лития и инсулин, индуцирующие фосфорилирование GSK-3β, также защищали клетки почки от гибели.

При введении эритропоэтина в дозе 100МЕ/кг массы тела животного выявлено выраженное увеличение пула фосфо-GSK-3β в клетках почки. Таким образом, действие гипоксической тренировки реализуется, скорее всего, через каскад сигналов: гипоксия вызывает повышение эритропоэтина в ткани почки, а эритропоэтин индуцирует фосфорилирование GSK-3β, как это показано при ПК сердца (Nishihara M. et al., 2006).

Активация апоптотических сигнальных путей при ишемии/реперфузии почки

При изучении участия апоптотических сигналов в повреждениях почки, обнаружено, что уже через 10 мин реперфузии количество белка Вах в митохондриях возрастает (рис. 9Г) приблизительно на 50%. Количество цитохрома с в тех же образцах митохондрий снижалось после И/Р на 40%. Эти  данные указывают на запуск апоптотических сигналов под влиянием окислительного стресса в клетках почки. Транслокация белка Вах может индуцировать открытие митохондриальной поры и участвовать в развитии НП и снижении митохондриального потенциала, показанном в данной работе.

Эксперименты по иммуногистохимическому выявлению белка Вах в клетках почки подтвердили перераспределение Вах в клетках, подвергшихся И/Р. В контроле наблюдалось диффузное окрашивание цитоплазмы клеток анти-Вах антителами, тогда как после 40-минутной ишемии и 10-минутной реперфузии наблюдалась компартментализация Вах, а через 3 ч - дальнейшее сосредоточение Вах в митохондриях (рис. 9А-В), что отражает развитие апоптотического процесса во времени.

Эти результаты свидетельствуют о том, что при И/Р в клетках почечных канальцев уже в первые минуты реперфузии индуцируются апоптотические сигнальные пути.

Влияние активности NO-синтазы на функционирование митохондрий почки

Одним из мощных регуляторных эффектов оксида азота является подавление митохондриального дыхания через ингибирование цитохромоксидазы дыхательной цепи (Brown G., 2001). Нами было исследовано влияние эндогенно продуцируемого в митохондриях оксида азота на скорость потребления кислорода дыхательной цепью митохондрий, окисляющих сукцинат. Было показано (рис. 10Б), что при добавлении в суспензию митохондрий  ионов Ca2+ и аргинина скорость разобщенного дыхания снижалась приблизительно на 18,5% с 0,75±0,025 до 0,61±0,02 мкМ О2/сек. При этом добавление  Ca2+ само по себе изменений в скорости дыхания не вызывало. Аналогичные данные получены на срезах почки при исследовании влияния продукции NO на падение Δψ после ишемии. В то время как И/Р вызывала значительное уменьшение мембранного потенциала, обработка срезов ингибитором NO-синтазы L-NAME восстанавливала его до 50% от уровня контроля (рис. 10А). То есть падение мембранного потенциала митохондрий в этих условиях может быть результатом увеличенной продукции NO в клетках и, в частности, в митохондриях.


Повреждение митохондрий при миоглобин-индуцированной острой почечной недостаточности

Исследование динамики развития ОПН при рабдомиолизе показало, что в первые 2 сут происходит значительное увеличение активности в крови ферментов, маркеров разрушения ткани: ЛДГ, аланин-аминотрансферазы (АЛТ) (рис. 11А). Основным признаком развития почечной недостаточности служило повышение в крови крыс с рабдомиолизом концентрации продуктов азотистого обмена - мочевины и креатинина (уремия и азотемия), которые  достигали своего пика на 1-2 сут (рис. 11В). В более поздние сроки большинство показателей нормализовались, что отражает о восстановление функции почек.

Исследование содержания миоглобина в ткани почек после индукции рабдомиолиза выявило его накопление уже в первые часы после введения глицерина животным (рис. 11В). В контрольной почке миоглобин не определяется, однако уже через 4 ч после индукции рабдомиолиза миоглобин появляется в ткани почки, достигает максимальной концентрации через 9 ч, и перестает обнаруживаться в почках через сутки.

В качестве маркера повреждения  митохондрий почки мы использовали выход из них цитохрома с. Выявлено, что количество цитохрома в митохондриях, выделенных из почек на разных сроках рабдомиолиза, уменьшается, причем максимальная потеря цитохрома наблюдается через 4 ч после введения глицерина (рис. 11Д).

Окислительный стресс и дисфункция митохондрий при рабдомиолизе

Были проанализированы основные функциональные характеристики митохондрий, выделенных из почек в различные сроки после индукции рабдомиолиза. Оценивались скорость дыхания, дыхательный контроль митохондрий и уровень в них малонового диальдегида (МДА). Обнаружено, что в первые сутки миоглобинурии происходит нарастание количества МДА в митохондриях, что свидетельствует о перекисном окислении митохондриальных липидов, как очевидном результате окислительного стресса.

Скорость дыхания митохондрий в состоянии 4 в этот же период времени возрастает вплоть до 24 ч после глицерин-индуцированной миоглобинурии. Это свидетельствует о значительном разобщении дыхания митохондрий, то есть нарушении барьерной функции внутренней мембраны. Об этом же свидетельствует достоверное уменьшение дыхательного контроля митохондрий через 4 и 15 ч рабдомиолиза.

Влияние миоглобина на функции митохондрий в системе in vitro

Для более детального анализа возможно опосредованного воздействия миоглобина на митохондрии нами изучалось прямое влияние миоглобина на изолированные митохондрии почки. Данные о нарушении функций митохондрий под действием миоглобина обобщены в таблице 1.

Обнаружено, что через 1 ч инкубации в присутствии миоглобина скорость дыхания митохондрии в состоянии 4 возрастает вдвое по сравнению с контролем, при концентрации миоглобина 100 мкМ, а при концентрации 500 мкМ почти в 3 раза. Соответственно, падает и дыхательный контроль митохондрий инкубированных с миоглобином, то есть происходит значительное разобщение дыхания. Очевидно, нарушение барьерной функции внутренней мембраны митохондрий может происходить из-за окисления ее липидов, в результате чего внутренняя митохондриальная мембрана становится проницаемой для ионов.

Однако, падение дыхательного контроля и разобщение окислительного фосфорилирования, происходящие под действием миоглобина, практически не предотвращаются хелатором ионов железа десфероксамином (ДФО, таб.1). Интересно, что и применение митохондриального антиоксиданта SkQ1 (см. ниже), не влияло на степень сопряженности изолированных митохондрий. В то же время, и ДФО и данный антиоксидант серьезно уменьшали генерацию МДА-продуктов и образование нитрита (см. ниже).

Окислительный стресс и продукция NO в митохондриях, спровоцированные миоглобином

Предположение об окислении липидного бислоя при воздействии миоглобина было подтверждено при измерении накопления МДА в таких митохондриях (рис. 12А). Было выявлено, что количество МДА возрастает при инкубации со 100 мкМ миоглобина в 2 раза, а при 500 мкМ в течение 1 ч утраивается. Интересным оказался эффект ДФО и митохондриального антиоксиданта SkQ1. Так при действии ДФО на фоне инкубации с миоглобином  происходило значительное снижение уровня МДА в митохондриях по сравнению с инкубацией только с миоглобином, хотя значения МДА и не достигали уровня контроля. Аналогичным образом проявился эффект SkQ1. Известно, что этот новый митохондриально-адресованный антиоксидант накапливается в митохондриях и эффективно предотвращает продукцию АФК и дисфункцию митохондрий при различных типах окислительного стресса (Скулачев В.П. и др.,2008). В данной модели окислительного стресса SkQ1 также снижал накопление МДА в митохондриях (рис. 12А). Таким образом, важной составляющей повреждающего воздействия миоглобина является высвобождающееся из гема железо, которое, очевидно, вызывает перекисное окисление липидов, инициируемое реакцией Фентона. Предотвращение такого окисления с помощью удаления ионов железа или антиоксиданта значительно снижает накопление МДА, однако не может полностью блокировать открытие неспецифической поры митохондрий (см. выше).

Наконец, было изучено изменение продукции NO при миоглобин-индуцированном повреждении митохондрий. Предпосылкой для этого послужило обнаруженное нами увеличение концентрации нитрита, продукта окисления NO, в крови крыс, подвергшихся рабдомиолизу. В этом случае концентрация нитрита составляла 12±1,5 мкМ на 2 сутки начала миоглобинурии против 4,5±0,5 мкМ у контрольных крыс.

При воздействии миоглобина in vitro нами также было обнаружено увеличение содержания нитрита в среде инкубации митохондрий (рис. 12В). При инкубации с 500 мкМ миоглобина содержание нитрита возрастало почти в 7 раз по отношению к контролю. Таким образом, мы предположили, что при воздействии миоглобина в митохондриях активируется митохондриальная NO-синтаза, что значительно увеличивает продукцию NO. Это предположение подтвердилось при инкубации митохондрий с субстратом синтеза NO, L-аргинином. При инкубации митохондрий с миоглобином в присутствии 5 мМ аргинина содержание нитрита возросло не только по сравнению с контролем, но и по сравнению с инкубацией только с миоглобином (рис. 12В). Наоборот, присутствие в среде инкубации ингибитора NO-синтазы, L-нитроаргинина снижало содержание нитрита до контрольных значений. В этих условиях ДФО и антиоксидант SkQ1 также снижали миоглобин-индуцированный рост концентрации нитрита. Можно предполагать, что высвобождаемые из гема миоглобина ионы железа и вызванный ими окислительный стресс вызывают увеличение активности митохондриальной NO-синтазы, поэтому снижение процессов перекисного окисления за счет хелатирования ионов железа или снижения уровня АФК, приводит к соответствующему снижению активации NO-синтазы.

Окислительный стресс и дисфункция митохондрий почечных канальцев, спровоцированные миоглобином

Индукция миоглобином окислительного стресса и дисфункция митохондрий, которые были продемонстрированы на изолированных митохондриях, были подтверждены на модели выделенных почечных канальцев с помощью конфокальной микроскопии. Было показано, что инкубация почечных канальцев с 100 мкМ миоглобина приводила к увеличению флуоресценции DCF в клетках канальцев (рис. 13Б), что свидетельствует о повышении продукции АФК. Одновременно выявлено значительное падение интенсивности флуоресценции TMRE, то есть снижение митохондриального мембранного потенциала (рис. 13А). Эти факты подтверждают сделанные нами выводы о повреждении под действием миоглобина барьерных функций митохондриальной мембраны и о развитии окислительного стресса. Интересно, что одновременное окрашивание канальцев DCF и TMRE выявило колоколизацию этих зондов, что указывает на преимущественную генерацию АФК именно в митохондриях.

Влияние SkQ1, инсулина и ионов лития на гибель при ишемии/реоксигенации

На модели И/Р почки были получены свидетельства ведущей роли митохондрий в развитии окислительного стресса и участия в этом процессе неспецифической митохондриальной поры, регулируемой GSK-3β. Поэтому, далее были детально исследованы сигнальные пути, ассоциированные с митохондриями и гибелью клеток при ишемии на модели ишемии/реоксигенации культуры клеток почечного эпителия. В первую очередь было исследовано взаимоотношение сигнальных путей фрагментации митохондрий и гибели клетки при ишемии и других проапоптотических стимулах. В качестве защитных агентов использовались ионы лития и инсулин, а также митохондриально-адресованный антиоксидант SkQ1 (Скулачев В.П., 2007).

Было выявлено, что при воздействии на культивируемые  клетки почки крыс 24-часовой ишемии с последующей  реоксигенацией в течение 24 ч гибель клеток превышала 80% (рис. 14А).  При инкубации клеток почки с различными концентрациями SkQ1 в течение 5 сут с последующей 24-часовой ишемией и реоксигенацией в течение 24 ч гибель клеток снижалась. Выявлены достоверные защитные эффекты SkQ1, которые проявлялись при его присутствии в среде в концентрациях 31, 62, 125 и 250 нМ (рис. 14А). При этом концентрация 250 нМ оказывала меньший эффект, чем 125 нМ, а при концентрации SkQ1 500 нМ выживание клеток снижалось, то есть SkQ1 начинал оказывать повреждающий, возможно прооксидантный, эффект в условиях ишемии.

В результате инкубации клеток почки с инсулином и ионами лития мы также наблюдали выраженный защитный эффект на культуру клеток почки, которая находилась в условиях ишемии/реоксигенации. Как видно из рис. 14Б, количество живых клеток после ишемии/реоксигенации увеличилось более чем вдвое при инкубации с 3 мМ LiCl. Аналогичное увеличение устойчивости клеток к И/Р наблюдалось при инкубации в ходе ишемии с 120 нМ инсулина. Таким образом, можно заключить, что и ионы лития, и инсулин, и митохондриально-адресованный антиоксидант SkQ1 являются агентами, защищающими клетки почки от гибели, вызванной  И/Р.

Окрашивание культивируемых клеток с помощью Аннексин V-ФИТЦ показало, что спустя 24 ч после ишемии в культуре наблюдается значительное увеличение количества апоптотических клеток по сравнению с контролем (рис. 14, внизу). В случае предобработки клеток ионами лития, инсулином или SkQ1 количество апоптотических клеток после ишемии сокращалось почти вдвое.

Изменение морфо-функционального состояния митохондрий клеток почки после ишемии/реоксигенации

При изучении морфологического состояния митохондрий клеток почки были выявлены значительные изменения структуры митохондрий после ишемии/реоксигенации. Обнаружено, что через 15 мин реоксигенации после 24-часовой ишемии митохондрии клеток оказываются значительно фрагментированы (рис. 15). В это же время в контрольных клетках митохондрии имеют нитевидную структуру с возможными разветвлениями. В клетках, подвергшихся ишемии/реоксигенации митохондриальный аппарат дробится на отдельные мелкие фрагменты. Ранее было известно, что гибель клетки может сопровождаться фрагментацией митохондриальной сети (Parra V. et al., 2008, Brooks C. and Dong Z., 2007).

Мы обнаружили, что обработанные 120 нМ SkQ1 в течение 5 сут клетки после 24-часовой ишемии и 15-минутной реоксигенации содержали нефрагментированные митохондрии (рис. 15). Несмотря на то, что часть клеток в условиях ишемии гибла, в оставшихся клетках морфо-функциональное состояние митохондриального аппарата было близким к норме. Кроме того мы показали, что схожий эффект на структуру митохондриального ретикулума оказывает инкубация с 120 нМ инсулина, когда фрагментация митохондрий после 24-часовой ишемии и 15-минутной реоксигенации также существенно снижалась.

Подсчет клеток с фрагментированными митохондриями показал, что контрольные клетки содержат в основном нефрагментированные митохондриальные филаменты, а после И/Р только около 10-20% клеток сохраняют нитевидную структуру митохондрий, в остальных клетках митохондрии частично или полностью фрагментированы (рис. 15).

Так как фрагментация митохондрий наблюдалась на ранних стадиях после ишемии/реоксигенации, можно заключить, что предотвращение фрагментации митохондрий обеспечивает лучшую выживаемость клеток при данных условиях. То есть фрагментация митохондрий и дальнейшее выживание клеток тесно взаимосвязаны, и такие агенты, как антиоксидант (SkQ1), ингибитор GSK-3 (LiCl) и сигнальная молекула (инсулин) являются одинаково эффективными для защиты как от фрагментации митохондрий, так и индуцированной клеточной гибели.

Влияние митохондриальных антиоксидантов на течение ишемической острой почечной недостаточности

В связи с тем, что при И/Р почки было показано развитие окислительного стресса и дисфункции митохондрий, в ряде экспериментов исследовали влияние  митохондриальных антиоксидантов, поскольку на модели ишемии/реоксигенации культивируемых почечных клеток эти вещества показали высокую эффективность в предотвращении гиперпродукции АФК и нарушении структуры митохондрий.

После 40 мин почечной ишемии ex vivo с последующей реоксигенацией было найдено, что продукция АФК (определяемая по флуоресценции DCF в срезах почки) значительно возрастает (рис. 16Б, Г-Е). Однократная внутрибрюшинная инъекция животным SkQR1 (1 мкмоль/кг) за сутки до ишемии вызывала частичную нормализацию уровня АФК (рис. 16В,Г). Инъекция того же количества SkQ1 или MitoQ (рис. 16Д,Е) не оказывала статистически значимого эффекта.

При моделировании И/Р почки с одновременным удалением второй почки был обнаружен выраженный антиишемический эффект SkQR1 при введении его в дозе 1 мкмоль/кг за сутки до ишемии. Нормализация функционального состояния почки выражалась в снижении концентрации креатинина в крови, повышенной после И/Р и восстановлении нарушенной реабсорбции Са2+. Эти наблюдения указывают на то, что SkQR1, по крайней мере частично, защищает почечную ткань от повреждения, вызванного И/Р. В то же время, аналогичные дозы SkQ1 не оказывали заметного влияния на уровень креатинина. Положительный эффект  наблюдался лишь при увеличении длительности воздействия SkQ1, когда антиоксидант давался крысам с пищей в течение 3 недель в дозе 250 нмоль/кг в сутки.

Ишемия единственной почки с последующей реоксигенацией вызывала гибель большинства крыс погибало к 4 сут после операции. В то же время, предварительное введение SkQR1 или SkQ1 почти полностью предотвращало гибель экспериментальных животных (рис. 17). Исследование зависимости выживания крыс от дозы введенного SkQ1 показало, что оптимальными концентрациями являются дозы от 100 нмоль/кг до 1 мкмоль/кг при введении за сутки до ишемии. При снижении концентрации до 5 нмоль/кг или повышении ее до 5 мкмоль/кг выживание крыс значительно снижалось.

Для улучшения понимания процессов, происходящих in vivo в почке при ишемии и реперфузии, были разработаны режимы магнитно-резонансной томографии (МРТ)  почки животных (автор выражает признательность директору Центра магнитной томографии и спектроскопии (ЦМТС) МГУ  профессору Пирогову Ю.А. за предоставленную возможность проведения исследований)

В ишемизированной почке происходит значительное снижение интенсивности МР-сигнала в корковой зоне почки по сравнению с контролем (рис. 18). Это свидетельствует о нарушении гемодинамики и тока первичной мочи в канальцах. В ходе последующей реперфузии наблюдается постепенное, но достаточно быстрое восстановление нормальной МР-плотности ткани почки (рис. 18). Кроме того, обнаружено, что с помощью МР-сканирования мы можем оценивать наполненность магистральных и других крупных кровеносных сосудов почки. Этот признак может быть информативным для оценки действия препаратов, поскольку вазоконстрикция является одним из серьезных последствий ишемии и первостепенным повреждающим фактором.

При исследовании влияния введения антиоксиданта SkQR1 за сутки до ишемии было выявлено его влияние на гемодинамику в поврежденной почке. В частности, ишемизированная зона, видимая на томографических изображениях в виде затемнения паренхимы почки, при введении SkQR1 исчезала уже к 30 мин реперфузии, тогда как без обработки антиоксидантом эта зона продолжала выявляться на 30 мин реперфузии (рис. 19).

Аналогичные изменения выявлены в наполненности магистральных сосудов почки. Так, после ишемии происходила значительная вазоконстрикция, и сосуды в большинстве случаев не выявлялись на МРТ-изображениях, что указывает на сужение их просвета. В то же время при введении 1 мкмоль/кг SkQR1 за сутки до ишемии сужение просвета сосудов было выражено в значительно меньшей степени.

Клеточная терапия острой и хронической почечной недостаточности

Наши исследования показывают, что ни один из исследованных способов нефропротекции не способен обеспечить абсолютное восстановление почки при различных нефропатиях, поэтому очевидно, что для получения оптимального эффекта в клинике необходимо одновременное применение широкого арсенала средств нефропротекции. Одним из широко исследуемых сейчас направлений является клеточная терапия различных заболеваний с помощью стволовых и прогениторных клеток. Поэтому в следующей части работы исследовали возможности клеточной терапии различных типов почечной недостаточности с помощью введения мультипотентныхмезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и фетальных почечных прогениторных клеток (ППК).

Мы обнаружили, что интрапаренхиматозное введение культивированных как клеток почки, так и ММСК достоверно улучшает функциональное состояние почек у крыс с ХПН, способствуя нормализации функциональных показателей в пределах 2-х нед (табл. 2). Стимулирующий эффект у всех животных сохранялся более 1 мес. Существенной разницы в динамике восстановления функции поврежденной почки в опытах с использованием почечных клеток и мезенхимальных стволовых клеток не выявлено (табл. 2).

При пост-ишемической ОПН введение в паренхиму почки ППК существенно не влияло на развитие почечной недостаточности, тогда как введение ММСК достоверно ускоряло восстановление функциональной активности ишемизированной почки и предотвращало гибель животных от почечной недостаточности.

После 90-минутной тепловой ишемии единственной почки все крысы гибли при явлениях уремии на 2-3 сут после моделирования ОПН. При введении ППК также погибло большинство крыс, причем гибель животных происходила на 1-2 сут. После пересадки ММСК ни одна из 10 крыс не погибла от уремии. Показатели функции почки у выживших крыс восстанавливались до нормальных значений через 1-2 мес, за исключением канальцевой реабсорбции натрия, которая нормализовалась уже через 2 нед. При введении ММСК достоверно лучшие показатели функционального состояния ишемизированной почки отмечались уже на ранних сроках пост-ишемического периода (табл. 3).

При гистологическом исследовании почек после ишемии в корковом веществе выявляли участки с полной деструкцией почечных структур разной площади. В дистальных извитых канальцах у подавляющего большинства эпителиоцитов цитоплазма вакуолизирована за счет гидропической дистрофии вплоть до фокального клеточного некроза (рис. 20А). В целом гистологическая картина соответствует выраженному острому канальцевому некрозу.

В опытах с интрапаренхиматозным введением ММСК на 4-е сутки очагов деструкции почечных структур не отмечено. Наряду с участками гидропической дистрофии эпителия канальцев, выявляются зоны, в которых канальцы нефрона выстланы набухшими эпителиоцитами, суженным просветом и базальным расположенными обычного вида ядрами (рис. 20Б). Такая гистологическая картина, по всей видимости, является проявлением повышенной функциональной активности этих структур почки.

Через 1 мес после ишемии с введением ММСК отмечалось значительное уменьшение площади участков с морфологическими проявлениями повышенной функциональной активности канальцевого эпителия. Эпителий большинства канальцев сохранял признаки гидропической дистрофии. В отдельных канальцах отмечалась кальцификация погибших эпителиоцитов (рис. 20В). Через 3 мес после перенесенной ишемии патологические изменения минимизируются.

Для уточнения вопроса, связано ли терапевтическое действие ММСК при постишемической ОПН с интеграцией пересаженных клеток в почечные структуры или оно обусловлено их паракринным влиянием, в части опытов мы инъецировали в почку ММСК, нагруженные флуоресцентным красителем Calcein-АМ. При исследовании срезов почки через 1 сут выявляли наличие флуоресцирующих ММСК в месте инъекции и в прилежащих областях (рис. 21А).

Меченые клетки выявлялись лишь в интерстициальном пространстве ткани почки, причем даже на достаточно большом расстоянии от зоны введения, и не определялись в канальцах. В более отдаленные сроки (7 сут) после трансплантации, меченные калцеином клетки по-прежнему выявлялись в почке, однако их распределение по интерстицию было еще более диффузным. Не выявлялось группирования клеток в месте инъекции, число клеток, выявляемых на одном срезе, было значительно меньше (рис. 21Б), чем в первые сутки. При этом происходила миграция ММСК на большие расстояния от места инъекции практически по всей паренхиме почки, что подтверждалось анализом серийных срезов почки.

В отдельной серии экспериментов была определена эффективность клеточной терапии для лечения ОПН и ХПН при внутривенном введении клеток, что более соответствует потребностям клинического применения. Введение крысам с ХПН как культивированных ММСК, так и культивированных ППК приводило к постепенному улучшению всех функциональных параметров. Динамика восстановления была быстрее в опытах с трансплантацией ППК. В этих экспериментах уже через 2 недели происходила нормализация всех функциональных показателей, и они держались в пределах нормы более 2 мес. В экспериментах с введением ММСК улучшение функционального состояния почек происходило медленнее: для достижения нормальных или субнормальных значений требовалось более 1 мес.

Выживаемость крыс после введения ППК составила 50%, а после введения ММСК – 83%. Оценка динамики функциональных показателей состояния почки у выживших крыс показала, что в опытах с внутривенным введением ППК нормализация функции почки происходила уже через 2 недели после ишемического воздействия, а при введении ММСК – через 3 недели. Снижение концентрации креатинина крови после введения обоих видов клеток происходило почти одинаково, тогда как снижение концентрации мочевины было заметно более медленным в опытах с введением ММСК. В отдаленные сроки в обеих группах концентрация мочевины в крови несколько повышалась, превышая ее концентрацию у интактных крыс. Клиренс креатинина в опытах с ППК на 4-е сутки снижался в меньшей степени, чем в опытах с ММСК, в последующем стабилизируясь в пределах нормы. Реабсорбция ионов натрия в почечных канальцах после введения ППК также снижалась в меньшей степени, чем после введения ММСК и быстрее восстанавливалась.

Сравнивая эффективность терапии ОПН двумя видами клеток, можно отметить двойственность эффекта ППК. С одной стороны, эти клетки в меньшей степени, чем ММСК улучшали выживаемость животных, а с другой – у выживших крыс они обеспечивали лучшую функциональную сохранность органа и более быстрое восстановление его полноценности.

Образование межклеточных контактов при сокультивировании

В данной работе была подтверждена высокая эффективность различных типов стволовых и прогениторных клеток в восстановлении функций поврежденной почки. Однако, остается невыясненным механизм положительного влияния введения этих клеток. В частности наибольший интерес представляет степень интеграции чужеродных клеток в ткань поврежденного органа и взаимодействия клеток донора и реципиента.

В этой связи была исследована возможность транспорта цитоплазмы, митохондрий и других мембранных структур между ММСК и дифференцированными специализированными  клетками: культивируемыми кардиомиоцитами и клетками почечного эпителия. По ряду методических причин первые эксперименты были проведены на кардиомиоцитах. Прежде всего, это связано с возможностью более четкого фенотипирования мышечных клеток сердца по ряду специфических маркеров, в отличие от эпителия канальцев почки.

Мы обнаружили, что в процессе культивирования ММСК человека и кардиомиоцитов крысы оба типа клеток демонстрировали образование множества протяженных межклеточных структур (рис. 22А,Б). Электронная сканирующая микроскопия показала (рис. 22В), что эти структуры могут быть либо натянуты между соседними клетками или располагаться свободно вдоль субстрата. Эти структуры различаются по диаметру и форме. Диаметр некоторых почти одинаков на всем протяжении, за исключением начальной/концевой части, имеющей форму воронки, диаметр других изменяется по всей длине. Учитывая небольшой размер трубочек, для простоты мы назвали их туннельными нанотрубочками (ТНТ), согласно термину, предложенному Rustom (Rustom A. et al., 2004).

Передача цитоплазмы между ММСК человека и кардиомиоцитами крысы.

Для выявления транспорта цитоплазмы и определения направления такого транспорта были проведены две серии экспериментов с окрашиванием клеток флуоресцентным красителем Calcein-AM. Было обнаружено, что через 4 ч после пересадки окрашенных калцеином ММСК в культуру кардиомиоцитов крысы первые начинали образовывать контакты с кардиомицитами в виде нанотрубочек. Флуоресценция Calcein на этом сроке наблюдалась только в ММСК, то есть передачи цитоплазматического содержимого не происходило. Через 24 ч сокультивирования во многих кардиомиоцитах, контактирующих с ММСК, нагруженных калцеином (с высокой интенсивностью флуоресценцией калцеина в цитоплазме), также наблюдалась зеленая флуоресценция, однако более низкой интенсивности (рис. 23А,Б). Таким образом, происходила передача красителя из цитоплазмы ММСК человека в цитоплазму кардиомиоцитов крысы, что свидетельствует о миграции цитоплазматического содержимого ММСК в цитозоль соседних кардиомиоцитов.

Образование межклеточных контактов и обмен содержимым цитоплазмы между клетками были также проанализированы с помощью проточной цитометрии. Окрашенные калцеином ММСК пересевали на флаконы с неокрашенными кардиомиоцитами. Было обнаружено, что через 3 ч смешанная культура клеток четко подразделялась на 2 субпопуляции по интенсивности флуоресценции Calcein (рис. 23В). После 24 ч сокультивирования деление клеток на 2 субпопуляции исчезало. В суспензии клеток наблюдалось усредненное распределение флуоресценции по интенсивности (рис. 23Б). Это подтверждает предположение об образовании между сокультивируемыми клетками контактов, по которым часть окрашенного калцеином цитоплазматического содержимого передается в неокрашенные клетки кардиомиоцитов.

Передача цитоплазматического содержимого по туннельным нанотрубочкам была подтверждена опытами, в которых сокультивирование происходило в условиях, препятствующих образованию нанотрубочек. В этих условиях через 24 ч наблюдалось такое же разделение клеток на 2 популяции (рис. 23В), как и в начале сокультивирования, то есть передачи цитоплазматического содержимого не происходило.

Передача митохондрий от ММСК к кардиомиоцитам.

При изучении обмена митохондриями между ММСК человека и кардиомиоцитами крысы мы использовали два митохондриальных красителя: Mitotracker Green FM (зеленая флуоресценция) и Mitotracker Red (красная флуоресценция).  ММСК окрашивались красителем Mitotracker Green FM перед сокультивированием и помещались в плашку с кардиомиоцитами, нагруженными красителем Mitotracker Red. Через 3 ч сокультивирования перенос митохондрий не детектировался. Через 24 ч сокультивирования большинство клеток содержали митохондрии, окрашенные либо  зеленым, либо красным зондом (рис. 24А). Однако некоторые клетки содержали органеллы с зеленой флуоресценцией среди митохондрий, окрашенных красным красителем (рис. 24Б). Малый процент митохондрий с зеленой флуоресценцией среди митохондрий с красной флуоресценцией явно демонстрирует однонаправленный перенос митохондрий, окрашенных зеленым красителем, из ММСК. Интересно отметить, что в данной смешанной культуре клеток мы никогда не наблюдали ММСК, содержащие митохондрии, окрашенные красителем Mitotracker Red, то есть передача митохондрий от кардиомиоцитов к ММСК не происходит. В то же время, после 24 ч сокультивирования зеленая и красная флуоресценция не солоколизовались, что подчеркивает отсутствие внутри одной клетки слияния митохондрий из разных источников.

Исследования с помощью электронной микроскопии показали, что цитоплазматические выросты частично содержат везикулярные структуры, окруженные двойной мембраной, которые напоминают митохондрии по внешнему виду (рис. 24В,Г). Иногда внутри этих везикул можно распознать структуру крист. Часто в нанотрубочках маленького диаметра (≈0,1 мкм) мы видели везикулы малых размеров, у которых наличие двойной мембраны не было явным (рис. 24Д,Е). В некоторых нанотрубочках мы обнаружили элементы цитоскелета (рис. 24Ж).

Экспрессия кардиоспецифического β-миозина в ММСК

Одним из важных результатов сокультивирования является обнаруженный синтез кардиоспецифичного β-миозина в ММСК человека после их контактирования с кардиомиоцитами крысы. Нами были использованы высокоспецифичные антитела к тяжелой цепи человеческого β-миозина, что исключает возможность окраску крысиного миозина в кардиомиоцитах. Было показано, что через сутки после совместного культивирования ММСК и кардиомиоцитов в ММСК выявляются компартменты, положительно окрашивающиеся на кардиоспецифичный β-миозин. При окрашивании чистой культуры ММСК подобной окраски на β-миозин в клетках обнаружено не было. Эти результаты указывают на появление экспрессии сократительных белков в ММСК человека после контакта с кардиомиоцитами крысы и на начало кардиоспецифичной дифференцировки стволовых клеток, в результате которой в ММСК начинает формироваться свой сократительный аппарат. 

Транспорт митохондрий и других клеточных компартментов между ММСК и клетками почки

Явления транспорта цитоплазмы и митохондрий, обнаруженные при совместном культивировании кардиомиоцитов и ММСК были проверены и расширены на культуре клеток канальцевого эпителия почки. На модели совместной культуры клеток канальцевого эпителия почки крысы и ММСК человека было подтверждено явление образование множества межклеточных нанотрубочек. Активация их образования происходила именно в условиях сокультивирования, причем они начинали образовываться и у ММСК и у канальцевых клеток.

Обмен цитоплазматическим содержимым был исследован с помощью окраски ММСК зондом Calcein и последующим сокультивированием с почечными клетками крысы. Непосредственно после начала сокультивирования клеток выделяются две популяции: неокрашенные и имеющие высокую интенсивность флуоресценции Calcein (рис. 25А). При анализе клеток через 3, 6, 24 и 48 ч сокультивирования обнаружена тенденция к уменьшению обеих начальных популяций и появлению значительного числа клеток с промежуточными значениями интенсивности флуоресценции калцеина. В условиях, когда непосредственный контакт клеток невозможен (в одной культуральной чашке, но на отдельных покровных стеклах), даже через 48 ч совместного культивирования клетки по-прежнему четко разделялись на две популяции, значительно различающиеся по интенсивности флуоресценции (рис. 25А).

Обмен митохондриями исследовали аналогичным образом с помощью окраски ММСК флуоресцентным зондом Mitotraсker Green и последующего сокультивирования (рис. 25Б). Уже через 3 ч наблюдался сдвиг средней интенсивности флуоресценции Mitotraсker Green в окрашенной популяции в сторону уменьшения интенсивности флуоресценции. К 24 ч этот сдвиг становился еще более выраженным, одновременно средняя интенсивность флуоресценции популяции клеток почки увеличивалась за счет появления в этих клетках красителя, а к 48 ч сокультивирования пики обеих популяций практически сливались. Можно сделать вывод, что ММСК довольно быстро после образования контактов начинают передавать митохондрии, нагруженные красителем, в клетки почки. При сокультивировании клеток обнаружено некоторое сближение пиков через 48 ч, что указывает на незначительный обмен митохондриальным зондом через культуральную среду, независящий от образования межклеточных контактов.

Наконец, в третьей серии экспериментов была исследована передача между клетками липидного красителя DiO, который накапливается преимущественно в мембранных компартментах клетки, прежде всего в плазмалемме (Honig M.G. and Hume R.I., 1986). Динамика обмена мембранным зондом оказалась схожей с динамикой транспорта калцеина. Уже через 3 ч сокультивирования появлялась популяция клеток со средней интенсивностью флуоресценции, что говорит о начале транспорта красителя из ММСК в эпителиальные клетки (рис. 25В). Через 6 ч доля таких клеток составляла уже 14,5%, а через 24 ч и 48 ч – около 45% всей культуры. Сокультивирование в течение 48 ч в условиях, когда непосредственный контакт клеток невозможен, не привело к значительному изменению средней интенсивности флуоресценции окрашенной и неокрашенной популяций клеток, то есть в данном случае обмена красителем через культуральную среду не происходит.


Выводы

  1. При исследовании срезов почки с помощью витальных флуоресцентных зондов показано, что в условиях ишемии/реоксигенации в клетках почки происходит резкое усиление генерации активных форм кислорода и NO, основным источником которых служат митохондрии. При этом происходит нарушение морфо-функционального состояния митохондрий: падение митохондриального трансмембранного потенциала, набухание митохондрий и фрагментация хондриома.
  2. При рабдомиолизе развитие почечной недостаточности сопровождается дисфункцией митохондрий почки и развитием окислительного стресса, индуцированного накоплением миоглобина в почечных канальцах. При воздействии in vitro на выделенные митохондрии миоглобин вызывает разобщение окислительного фосфорилирования, возрастание перекисного окисления липидов митохондрий и повышение продукции оксида азота в митохондриях.
  3. При ишемии/реоксигенации и при рабдомиолизе в митохондриях клеток почки наблюдаются проапоптотические изменения, такие как выход из митохондрий цитохрома с и транслокация в митохондрии белка Вах. Это свидетельствует об активации в клетках почки апоптотических сигнальных путей под действием ишемии/реоксигенации и миоглобинурии.
  4. Ишемическое и гипоксическое прекондиционирование приводит к  ингибированию GSK-3β, что защищает митохондрии клеток почки от развития неспецифической проницаемости, уменьшает генерацию активных форм кислорода и предотвращает гибель клеток почки. Схожий защитный эффект, опосредованный прямым и непрямым ингибированием GSK-3β, оказывают ионы лития и инсулин, снижая окислительный стресс в  почке, гибель клеток и в конечном итоге предотвращая развитие почечной недостаточности.
  5. По данным исследований на культивируемых клетках почки и переживающих почечных срезах адресованные в митохондрии антиоксиданты 10-(6'-пластохинонил) децилтрифосфоний (SkQ1) и 10-(6'-пластолхинонил) децил-родамин (SkQR1) снижают вызванное ишемией/реперфузией повреждение, уменьшают окислительный стресс, предотвращают дисфункцию митохондрий и защищают клетки почки от гибели. Защитное действие SkQ1 и SkQR1 проявляется также в защите животных от гибели после 90-минутной ишемии единственной почки
  6. Введение ММСК внутривенно или в ткань почки существенно улучшает функции почки при ОПН и ХПН, что выражается в снижении повышенной концентрации креатинина и мочевины в крови, уменьшении патоморфологических изменений в ткани почки и повышает выживание животных.
  7. Введение прогениторных почечных клеток оказывает менее выраженный положительный эффект на функции почки при ОПН и ХПН. Введение этих клеток также снижает концентрации креатинина и мочевины в крови, однако, в меньшей степени, чем при введении ММСК. Выживание животных с почечными патологиями при введении прогениторных почечных клеток тоже улучшается незначительно.
  8. Выявлено, что ММСК могут образовывать контакты с различными типами дифференцированных клеток при совместном культивировании. При этом между клетками возможен транспорт клеточного содержимого, в том числе митохондрий, на что указывают данные электронной микроскопии и окрашивание специфическими митохондриальными зондами.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Плотников Е.Ю., Фрезе К.В.,  Коц А.Я., Хропов Ю.В., Овчинников И.В., Махова Н.Н. Ограниченный тепловой шок повышает устойчивость клеток линии HeLa к цитотоксическому действию оксида азота // Тезисы международной конференции студентов и аспирантов “Ломоносов-2001”, М.: 2001, 34-35
  2. Плотников Е.Ю., Фрезе К.В.,  Коц А.Я., Хропов Ю.В., Овчинников И.В., Махова Н.Н. Изучение цитотоксической активности донора оксида азота 3-нитро-4-фенилфуроксана на экспериментальной модели культивируемых опухолевых клеток // Тезисы 5-ой пущинской конференции молодых ученых “Биология — наука 21-го века”, Пущино, 2001, 166.
  3. Фрезе К.В.,  Плотников Е.Ю., Коц А.Я., Хропов Ю.В., Белов Г.А., Овчинников И.В., Махова Н.Н. Индукция апоптоза донором оксида азота 3-нитро-4-фенилфуроксаном в клетках опухолевых линий HeLa, различающихся по экспрессии протоонкогена bcl-2 // Медицинская иммунология, 2001, 3 (2), 132-133.
  4. Plotnikov E.Y., Freze K.V., Kots A.Y., Belov G.A, Khropov Y.V., Ovchinnikov I.V.,  Makhova N.N. Apoptosis induced by NO-donor 3-nitro-4-phenylfuroxan in HeLa cells with different expression of bcl-2 protooncogene. // 6th J.Humphrey advanced summer program in immunology, 2002, abstract, 104-105.
  5. Плотников Е.Ю., Фрезе К.В.,  Коц А.Я., Хропов Ю.В., Овчинников И.В., Махова Н.Н. Митохондриальные эффекты NO-донора 3-нитро-4-фенилфуроксана // Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2003, 267-270.
  6. Плотников. Е.Ю., Высоких М.Ю., Зоров Д.Б. Функционирование митохондрий клеток почки в условиях гипоксии-реоксигенации. Участие митохондриальной NO-синтазы // Тезисы III съезда биофизиков России, Воронеж, 2004,
  7. Плотников, Е.Ю., Высоких, М.Ю., Цвиркун, Д.В., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров, Д.Б.  Митохондриальная регуляция продукции активных форм кислорода и азота в клетках почки крысы при ишемии/реперфузии // Докл. Росс. Акад. Наук. , 2005, 400, №5, 80-83.
  8. Зоров Д.Б., Банникова С.Ю., Белоусов В.В., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Красников Б.Ф., Плотников Е.Ю. Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота // Биохимия, 2005, том 70 (2), 265-272.
  9. Плотников Е.Ю., Высоких М.Ю., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б. Участие митохондрий в апоптозе клеток почки, индуцированном ишемией/реперфузией // Депон. в ВИНИТИ 19.10.2004, 12, №1638-В2004.
  10. Плотников Е.Ю., Фрезе К.В. Защитный эффект сверхэкспрессии bcl-2 при апоптозе опухолевых клеток, индуцированном NO-донором 3нитро4фенилфуроксаном // Депон. в ВИНИТИ 19.10.2004, №1639-В2004.
  11. Plotnikov E.Y., Vyssokikh M.Y., Zorov D.B. Oxidative and nitrosative stress in rat kidney cells after ischemia/reperfusion. Critical role of mitochondria. Biophysical Journal, 2005, v.88(1), part 2 of 2, 564a.
  12. Плотников Е.Ю., Фрезе К.В.,  Коц А.Я., Хропов Ю.В., Овчинников И.В., Махова Н.Н. (2005) Цитотоксическая активность донора оксида азота 3-нитро-4-фенилфуроксана при действии на культивируемые опухолевые клетки // Вестник Московского университета Сер.16, Биология, N2, с.19-22.
  13. Плотников Е.Ю., Казаченко А.В., Высоких М.Ю., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б Участие митохондрий в окислительном стрессе при ишемии/реперфузии почки. Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2005.
  14. Зоров Д.Б., Банникова С.Ю., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю. (2005). Митохондрии в антиишемической защите. Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, с.243-244.
  15. Плотников Е.Ю., Высоких М.Ю., Зоров Д.Б. Окислительный и нитрозильный стресс при ишемии/реперфузии почки. Тезисы конференции «Российская Биоэнергетика: от молекул к клетке», Москва, 2005.
  16. Сысоева Т.А., Пустовидко А.В., Плотников Е.Ю., Высоких М.Ю., Зоров Д.Б. Разработка и синтез ДНК конструкции для экспрессии и  очистки апоптоз-индуцирующего фактора человека. Тезисы конференции «Российская Биоэнергетика: от молекул к клетке», Москва, с. 64, 2005
  17. Зоров Д.Б., Банникова С.Ю., Белоусов В.В., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Красников Б.Ф., Плотников Е.Ю. Активные формы кислорода и азота: друзья или враги? Тезисы конференции «Российская Биоэнергетика: от молекул к клетке», Москва, с. 21, 2005.
  18. Плотников Е.Ю., Марей М.В., Подгорный О.В., Александрова М.А., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т.. Функциональная активность митохондрий нейральных клеток-предшественников в культуре. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2006, №1, 34-38.
  19. Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Голованов С.А., Сыромятникова Е.В., Плотников Е.Ю., Высоких М.Ю., Зоров Д.Б. Роль генерации митохондриями активных форм кислорода и оксида азота в постишемических расстройствах функции почки // Урология, 2006, №4, 19-23.
  20. Васильева А.К., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Изучение окислительного стресса и участия в нем митохондрий при ишемии/реоксигенации культуры клеток почки. Тезисы XIII Международной конференции «Ломоносов-2006», Москва, с. 34-35, 2006.
  21. Plotnikov E.Y., Kazachenko A.V., Vyssokikh M.Y., Kirpatovsky V.I., Zorov D.B. (2005) Mitochondrial role in oxidative stress under ischemia/reperfusion in the rat kidney. Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports, v.14(1757), 477.
  22. Vyssokikh M.Y., Ivanova D.P., Nevedomskaya E.V., Pustovidko A.V., Plotnikov E.Y., Sysoeva T.A., Zorov D.B. (2005) Age-dependent character of mitochondria targeted antioxidants (MTA) mediated protective effect on cardiolipin peroxidation and creatine kinase functioning in rat heart mitochondria. Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports, v.14(1757), 457.
  23. Плотников Е.Ю., Васильева А.К., Зоров Д.Б. Окислительный стресс в клетках первичной культуры почки при ишемии/реоксигенации.// Цитология, 2006, 48, 789-790.
  24. Плотников Е.Ю., Марей М.В., Подгорный О.В., Александрова М.А., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т.. Функциональная активность митохондрий нейральных клеток-предшественников в культуре. // Цитология, 2006, 48, 819.
  25. Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Мусина Р.А., Конькова Т.А., Дрожжева В.В., Надточий О.Н., Сухих Г.Т. Функциональные последствия интрапаренхиматозного введения фетальных стволовых и прогениторных клеток человека при хронической и острой почечной недостаточности у крыс. // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2006, № 2, 70-76
  26. Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Мусина Р.А., Надточий О.Н., Конькова Т.А., Дрожжева В.В., Сухих Г.Т.  Внутривенная клеточная терапия острой и хронической почечной недостаточности в эксперименте // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2007, № 1, 52-56.
  27. Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Конькова Т.А., Дрожжева В.В., Зоров Д.Б.. Влияние ишемической и гипоксической тренировки на состояние митохондрий и функцию ишемизированных почек. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007, 143(1), 112-117.
  28. Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Функциональная гетерогенность первичной культуры кардиомиоцитов крысы. // Вестник РГМУ, 2007, 2(55), 323-324
  29. Сухих Г.Т., Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю. Возможности использования фетальных соматических стволовых и прогениторных клеток в терапии острой почечной недостаточности.// Здравоохранение и медицинские технологии,2007, 1.
  30. Васильева А.К., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Предотвращение дисфункции митохондрий и гибели клеток почки ингибиторами GSK-3. // Тезисы XIV Международной конференции «Ломоносов-2007», Москва, с. 34-35, 2007.
  31. Плотников Е.Ю., Васильева А.К., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б. Механизмы развития почечной недостаточности при ишемии/реперфузии и способы ее предотвращения. Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2007 с.275-277
  32. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Васильева А.К., Марей М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б.  Межклеточный транспорт цитоплазмы и органелл между мезенхимальными стволовыми клетками и кардиомиоцитами при совместном культивировании. Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2007, с.278-279
  33. Plotnikov E.Y., Vasileva A.K., Shashkova A. Zorov D.B. (2007) Mitochondrial fragmentation induced by UV and ischemia. Effects of GSK-3 inhibitors Li+ and insulin. // FEBS J., 274(S1), 205
  34. Vasileva A.K., Plotnikov E.Y., Kazachenko A.V., Kirpatovsky V.I., Zorov D.B. (2007) Glycogen synthase kinase-3 inhibitors Li+ and insulin prevent mitochondrial dysfunction and cell death in rat kidney after ischemia/reoxygenation (I/R). // FEBS J., 274(S1), 205
  35. Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Архангельская А.А., Хряпенкова Т.Г. Митохондрия как многоликий Янус. Биохимия, 2007, 72(10), 1371-1384.
  36. Plotnikov E.Y., Kazachenko A.V., Vyssokikh M.Y., Vasileva A.K., Tcvirkun D.V., Isaev N.K., Kirpatovsky V.I., Zorov D.B. The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney. Kidney International (2007), 72(12):1493-1502
  37. Archipova M., Bakeeva L., Fursova A., Isaev N., Kapelko V., Khoroshilova-Maslova I., Kolosova N., Kopenkin E., Kovaleva N., Lakomkin V., Pisarenko O., Plotnikov E., Senin I., Serebryakova L., Skulachev M., Skulachev V., Sotnikova L., Trofimova N., Zorov D. (2007) SkQ treatment of certain ROS-related diseases. // Mitochondrial physiology. MiP2007 64th Harden conference.
  38. Лопаткин Н.А., Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Дрожжева В.В., Сухих Г.Т.. Применение клеточных технологий для терапии почечной недостаточности (экспериментальное исследование) // Урология, 2007, №3, 3-7.
  39. Плотников Е.Ю., Хряпенкова Т.Г., Марей М.В., Сухих Г.Т. , Зоров Д.Б. Обмен цитоплазмой между мезенхимальными стволовыми клетками и кардиомиоцитами при совместном культивировании. Роль туннельных нанотрубочек. Тезисы 11-ой пущинской конференции молодых ученых “Биология — наука 21-го века”, Пущино, 2007, 163-164
  40. Васильева А.К., Плотников Е.Ю., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б. Механизмы развития почечной недостаточности при ишемии/реперфузии и способы ее предотвращения. Тезисы 11-ой пущинской конференции молодых ученых “Биология — наука 21-го века”, Пущино, 2007, 234.
  41. Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Кирпатовский В.И., Бойко Т.А., Зоров Д.Б. Использование лазерной конфокальной микроскопии для витального исследования биохимических процессов в ткани почек. Материалы XI съезда урологов России, Москва, 2007, 471-472.
  42. Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Голованов С.А., Дрожжева В.В., Сухих Г.Т. Терапевтический эффект трансплантации стволовых и прогениторных клеток человека крысам с хронической и острой почечной недостаточностью. Материалы XI съезда урологов России, Москва, 2007, 473-474.
  43. Plotnikov E.Y., Khryapenkova T.G., Vasileva A.K., Marey M.V., Galkina S.I., Isaev N.K., Sheval E.V., Polyakov V.Y., Sukhikh G.T., Zorov D.B. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in coculture. J Cell Mol Med. 2008, 12(5), 1622-1631.
  44. Васильева А.К., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Защитное действие ингибиторов GSK-3 и митохондриально-ориентированного антиоксиданта SkQ1 при ишемии/реоксигенации в культуре клеток почки. Материалы II Международного молодежного медицинского Конгресса, Санкт-Петербург, 2007, 45-46
  45. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Сухих Г.Т. , Зоров Д.Б. Исследование путей взаимодействия кардиомиоцитов и мезенхимальных стволовых клеток в совместной культуре. Материалы II Международного молодежного медицинского Конгресса, Санкт-Петербург, 2007, 54-55.
  46. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Дирнагл У., Плотников Е.Ю., Кувшинова Е.А., Зоров Д.Б.. Глюкозная депривация стимулирует продукцию свободных радикалов в митохондриях культивированных зернистых нейронов мозжечка. Биохимия, 2008, 73(2), 185-192.
  47. Чупыркина А.А., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Участие митохондрий в миоглобин-индуцированном окислительном стрессе в клетках почки // Тезисы XV Международной конференции «Ломоносов-2008», Москва, с. 50, 2008
  48. Хряпенкова Т.Г., Коротецкая М.В., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Гетерогенность митохондриального потенциала как маркер для выделения чистой популяции кардиомиобластов. // Тезисы XV Международной конференции «Ломоносов-2008», Москва, с. 248-249, 2008
  49. Плотников Е.Ю., Чупыркина А.А., Васильева А.К., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б. Роль активных форм кислорода и азота в патогенезе острой почечной недостаточности. // Тезисы IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, с. 474, 2008
  50. Plotnikov E.Y., Vasileva A.K., Arkhangelskaya A.A., Pevzner I.B., Skulachev V.P., Zorov D.B. Interrelations of mitochondrial fragmentation and cell death under ischemia/reoxygenation and UV-irradiation: Protective effects of SkQ1, lithium ions and insulin. FEBS Lett. 2008; 582(20):3117-24.
  51. Плотников Е.Ю., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Васильева А.К, Зоров Д.Б. Влияние митохондриально-ориентированных антиоксидантов на экспериментальную острую почечную недостаточность. Тезисы международного симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Судак, 2008, с.109-110
  52. Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Кудрявцев Ю.В., Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Восстановление функций почки при интрапаренхиматозном и внутривенном введении стволовых и прогениторных клеток при хронической и острой почечной недостаточности Тезисы международного симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Судак, 2008, с.68-70.
  53. Plotnikov E.Y., Chupyrkina A.A., Vasileva A.K., Kazachenko A.V., Kirpatovsky V.I., Zorov D.B. The role of reactive oxygen and nitrogen species in the pathogenesis of acute renal failure. Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports, 2008, 1777, S58-59
  54. Khryapenkova T.G., Plotnikov E.Y., Korotetskaya M.V., Vasileva A.K., Marey M.V., Sukhikh G.T., Zorov D.B. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes: The role of mitochondria. Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports, 2008, 1777, S53-54
  55. Бакеева Л.Е., Барсков И.В., Егоров М.В., Исаев Н.К., Капелько В.И., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Козловский С.В., Лакомкин В.Л., Левина С.В., Писаренко О.И., Плотников Е.Ю., Сапрунова В.Б., Серебрякова Л.И., Скулачев М.В., Стельмашук Е.В., Студнева И.М., Цкитишвили О.В., Васильева А.К., Викторов И.В., Зоров Д.Б., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных АФК (сердечной аритмии, инфарктов сердца и почки и инсульта головного мозга). Биохимия, 2008, 73(12), 1607-1621.
  56. Исаев Н.К., Е.В. Стельмашук, Е.Ю. Плотников, Т.Г. Хряпенкова, Е.Р. Лозиер, Ю.В. Долудин, Д.Н. Силачев, Д.Б. Зоров. Роль ацитоза, NMDA-подтипа глутаматных рецепторров и кислоточувствительных ионных каналов (ASIC1a) в развитии нейрональной гибели при ишемии. Биохимия, 2008, 73(11), 1461-1466.
  57. Плотников Е.Ю., Хряпенкова Т.Г., Марей М.В., Сухих Г.Т.,  Зоров Д.Б. Взаимодействие стволовых и дифференцированных соматических клеток при совместном культивировании. Цитология, 2008, 50(9), 817-819.
  58. Сухих Г.Т., Полтавцева Р.А., Зарайский Е.И., Камалов А.А., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Павлова Г.А., Охоботов Д.А. Оценка фертильности у животных при изучении эффектов ксеногенной трансплантации культур, обогащенных стволовыми клетками на модели двухстороннего трехнедельного абдоминального крипторхизма. Тезисы конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», Москва, 2008, с.151-153.
  59. Камалов А.А., Сухих Г.Т., Кирпатовский В.И., Зарайский Е.И., Полтавцева Р.А., Плотников Е.Ю., Кудрявцев Ю.В., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А. Особенности регенерации тестикулярной ткани и восстановление фертильности у крыс на фоне ксенотрансплантации обогащенных  фетальных клеточных культур при двухстороннем абдоминальном крипторхизме. Урология, 2008, 6, 7-11.
  60. Камалов А.А., Сухих Г.Т., Зарайский Е.И., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А. Лечение инфертильности у животных трансплантацией обогащенных клеточных культур различных видов в эксперименте. Первый пленум научного общества урологов Узбекистана, Ташкент,2008, с.228-229.
  61. Сухих Г.Т., Камалов А.А., Полтавцева Р.А., Зарайский Е.И., Плотников Е.Ю., Кирпатовский В.И., Ефремов Е.А., Орлова Е.В., Павлова Г.А., Охоботов Д.А. Влияние ксенотрансплантации клеточных культур, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками на гормональный профиль крыс с абдоминальным крипторхизмом. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2008, 4, 201-205.
  62. Хряпенкова Т. Г., Коротецкая М. В., Зоров Д. Б., Плотников Е. Ю. Исследование  гетерогенности первичной культуры клеток сердца эмбрионов крысы и выявление маркеров для выделения кардиомиобластов и кардиомиоцитов. Цитология, 2008, 50(9), 828-829.
  63. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Коротецкая М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Гетерогенность митохондриального потенциала как маркер для выделения чистой популяции кардиомиобластов. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2008, 4, 188-194
  64. Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Мусина Р.А., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Терапия острой и хронической почечной недостаточности ксеногенными фетальными стволовыми и прогениторными клетками в эксперименте. Тезисы IV Всероссийского съезда трансплантологов, Москва, 2008, с.248-249.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.