WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

Диссертационный совет Д 208.072.01 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» направляет сведения о предстоящей защите диссертации и автореферат диссертации Никулиной Дины Максимовны

Отправитель: Ученый секретарь диссертационного совета профессор Платон Харитонович Джанашия.

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

На правах рукописи




Никулина Дина Максимовна

МИНОРНЫЙ БЕЛОК СЫВОРОТКИ КРОВИ

СВЯЗАННЫЙ С БЕРЕМЕННОСТЬЮ АЛЬФА2-ГЛИКОПРОТЕИН:

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

03.00.04. - Биохимия


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва 2008

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Росздрава

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки, Лауреат

Государственной Премии СССР,

доктор медицинских наук, профессор

Татаринов Юрий Семенович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

академик РАМН

ФГУ «ГНЦ ССП» Росздрава

Чехонин  Владимир Павлович

доктор медицинских наук, профессор

ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

Тогузов Руслан Тимофееевич

доктор медицинских наук, профессор

НИИ скорой помощи имени

Н.В.Склифосовского

Хватов Валерий Борисович

Ведущее учреждение:

ФГУ «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Росздрава. Адрес: 119992, Адрес: Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.

Защита состоится  « »  2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.208.072.01 ГОУ ВПО «Российского государственного университета министерства здравоохранения Российской Федерации» по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

Автореферат разослан « »  2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор  П.Х.Джанашия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

На современном этапе развития науки геномика, протеомика и биоинформатика определяют высокую скорость накопления данных о нуклеиновых кислотах и белках, обеспечивающих основные функции живой материи. Причем, на первое место выходит протеомика, поскольку именно через белки, как структуры матричного синтеза, реализуются генетически обусловленные морфо-функциональные и физиологические особенности биологического вида вообще и отличительные особенности каждого индивида. В связи с этим изучение белков становится стратегическим направлением в биологии, биотехнологии, медицине и фармакологии [А.И. Арчаков, 2000; Л.Л. Кисилев, 2000; JS. Albala, 2001; P. Angenendt at al., 2004; O.Drews at al., 2002-2005; A. Gorg, 2003; N. Taniguchi, 2008].

Теоретически все белки организма могут быть маркерами развития того или иного состояния и, в первую очередь, болезни. Определение патогенетического и диагностического значения продукции индивидуальных белков крови и разработка на их основе диагностикумов представляет одну из важных проблем медицины [Г.И. Абелев, 2001; Л.А. Алексеева, 2003; Е.Ю. Лысюк, 2004; А.М. Сапожников, 2003; В.А. Фунт, 2005; Л.С. Еремина, 2006; П.Г.Прокопенко и соавт., 2002; В.П. Чехонин и соавт., 2003; J.Solasol at al., 2005; A. Sutnar at al., 2007; M. Shabani at al., 2007; O. Topolcan, 2007]. 

По количественным и качественным характеристикам белки плазмы крови подразделяются на мажорные (основные) и минорные. Основные белки присутствуют в большой концентрации и выполняют постоянную выраженную функцию (альбумин, гемоглобин, альфа2-макроглобулин, фибриноген и т.д.) Минорные же присутствуют в крови в малых количествах, а по функциональным свойствам, чаще всего, относятся к регуляторным молекулам или реактантам. К этой группе относятся также некоторые межорганные и органоспецифические тканевые белки. В некоторых случаях – это продукты патологической генетической модификации.

В норме синтез многих минорных белков репрессирован, но при особых физиологических состояниях (беременность) или патологических - (воспаление, опухоль) их продукция резко возрастает, не в разы, а на порядки, и подобный феномен может быть использован в качестве диагностического критерия. Например, классический маркер воспаления – СРБ. [В.А. Алешкин,1988; П.Г. Назаров, Л.К. Берестовая, 1995, П.Г. Назаров, 2001; А.В. Полевщиков, 2001; М.В.Буракова, 2006; М.А. Гуревич и соавт, 2006]. Минорные белки крови остаются наименее изученными, что долгое время было обусловлено недостаточным уровнем чувствительности применяемых методов.

Наряду с новыми методами, не способными решить всех задач изучения белков, чрезвычайно востребованными остаются иммунохимические методы [А.Д. Дмитриев, 2003; B.B. Dzantiev at al., 1993; D.N.Ermolenko at al., 2002]. Именно их развитие позволило идентифицировать на молекулярном уровне ряд не известных ранее белков, что сразу раздвинуло горизонты представления о мозаике белков в биологических жидкостях и тканях организма человека.

Среди белков сыворотки крови уже более 30 лет пристальное внимание ученых и врачей привлекают так называемые белки беременности. Для диагностики состояния матери и плода важными являются специфические белки беременности, имеющие плодовое и плацентарное происхождение. К ним относятся альфа-фетопротеин, хорионический гонадотропин, плацентарный лактоген, плацентарная щелочная фосфатаза, трофобластический бета-глобулин и другие. [Ю.С.Татаринов, 2003; Л.В. Посисеева и соавт., 2004; А.А.Терентьев, 2006; Duc-Goiran at al., 2006; R.F.Harrison, S.Biswas, 1980].

Не менее интересными с позиций биологической роли и диагностического значения при беременности являются белки материнского происхождения, секретируемые в кровь. К этой группе белков относится, прежде всего, минорный белок сыворотки крови - связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (СБАГ) [Ю.С. Татаринов и соавт., 1971; H. Bohn, 1972; W.H. Stimson, 1973; G.N. Than, I.F. Csaba, D.G. Szabo, 1974].

Белки беременности с момента их обнаружения и описания многими авторами в конце 60-х – начале 70-х годов прошлого века остаются в центре внимания медиков, биологов, химиков, так как до настоящего времени сведения об их структуре и свойствах остаются неполными и многие вопросы нуждаются в уточнении. Анализ накопившихся литературных данных о СБАГ нередко свидетельствует об их разноречивом характере, что не позволяет сделать окончательного вывода о месте синтеза, биологической роли и клинической значимости этого белка [А.В. Афанасьева и соавт., 1976; K. Bauer, 1986; G. Birkenmeier at al, 1989; S.M. Petersen at al, 1990; P. Marynen at al, 1993; C.H. Nielsen at al, 1993; R.F. Arbelaez at al, 1993; A. Philip at al, 1994; K. Guruprasad at al, 1996; B.F. Jr. Bebo, G.S. Dveksler, 2005]. С позиций вышеизложенного уточнение ряда свойств и формирование целостного представления об этом белке является целесообразным и своевременным. 

Цель исследования. Научно обосновать теоретические положения о свойствах и биологической роли минорного белка сыворотки крови - связанного с беременностью альфа2-гликопротеина, а также его клиническое применение в качестве диагностического теста для улучшения оценки течения беременности и воспалительного процесса.

Задачи исследования:

  1. Определить и уточнить физико-химические свойства СБАГ.
  2. Выявить наличие и выраженность возможных межмолекулярных взаимодействий СБАГ с некоторыми белками сыворотки крови.
  3. Провести сравнительный анализ аминокислотного состава СБАГ и белков крови, участвующих в межмолекулярных взаимодействиях.
  4. Разработать на основе результатов изучения физико-химических свойств новые подходы к получению высокоочищенных препаратов СБАГ для экспериментальных исследований и приготовления компонентов иммунохимических тест-систем.
  5. Определить локализацию и возможное место синтеза СБАГ методом иммунофлюоресцентного анализа тканей различных органов и выявить изменение накопления СБАГ в малигнизированных тканях.
  6. Изучить распределение СБАГ в биологических жидкостях организма человека и обезьян.
  7. Провести параллельное изучение иммуномодулирующей активности СБАГ и других белков, ассоциированных с беременностью, в эксперименте in vivo.
  8. Установить уровень СБАГ в крови здоровых лиц и зависимость его продукции от возраста и пола.
  9. Оценить клиническое значение иммунохимического теста на СБАГ при физиологически протекающей и осложненной беременности.
  10. Установить диагностический диапазон применения теста на СБАГ при воспалительных и онкологических заболеваниях.
  11. Сравнить продукцию СБАГ с другими молекулами, обеспечивающими физиологические и патогенетические процессы в клетке и организме при беременности и воспалении.

Научная новизна и теоретическая значимость исследования 

Исследование в значительной степени носило поисковый характер, что определило закономерную научную новизну в получении оригинальных данных по физико-химическим свойствам, определении подходов к установлению места локализации или синтеза, установлении патогенетического значения и диагностического диапазона продукции минорного альфа2-гликопротеина, связанного с беременностью.

Впервые выявлены и обоснованы межмолекулярные взаимодействия СБАГ с другими белками сыворотки крови, что, вероятно, связано с его функциональным предназначением, и отмечено изменение физико-химических характеристик нативного белка, обусловленное этими взаимодействиями.

Впервые получены результаты сравнительного анализа аминокислотного состава и последовательности СБАГ и МГ, позволяющие предположительно указать радикалы, обеспечивающие межмолекулярные взаимодействия СБАГ.

Впервые иммунофлюоресцентными исследованиями показано повышение концентрации СБАГ в тканях эндометрия и толстого кишечника при малигнизации.

Впервые проведена сравнительная оценка иммуносупрессивных свойств СБАГ с другими белками беременности (ТБГ и АФП) и показана зависимость концентрации СБАГ в сыворотке крови матери не только от сроков и характера течения беременности, но и от уровня ТБГ, также обладающего иммуносупрессивным действием.

Установлены параллели в продукции СБАГ и некоторых биологически активных компонентов гомеостаза, а именно: иммуноглобулинов, интерлейкинов, маркера апоптоза. 

Впервые показано изменение продукции СБАГ в зависимости от характера и степени выраженности воспалительного процесса при разных локализациях.

Практическая ценность и внедрение результатов исследования 

Предложен рациональный метод одновременного выделения СБАГ и двух других белков, имеющих с ним межмолекулярные связи (МГ и ТБГ). Этот метод позволяет экономить исходный биоматериал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты могут быть использованы для научных исследований и практического применения.

Разработан метод иммуноферментного определения уровня СБАГ в биологических жидкостях организма с формированием опытного образца набора ИФА на СБАГ на производственной линии. Составлена инструкция по применению сформированного набора реагентов для ИФА-СБАГ.

Обоснованы практические рекомендации по применению иммунохимического теста на СБАГ, которые могут быть направлены на улучшение диагностики течения беременности и воспалительного процесса. 

Разработаны способы определения воспалительного заболевания и оценки течения беременности, рассчитан коэффициент иммунологической адаптации системы мать-плод-плацента, основанный на взаимозависимости уровня двух белков беременности, обладающих идентичной иммуномодулирующей активностью, и позволяющий в динамике оценивать характер протекающей беременности. Разработки защищены патентами РФ.

Результаты исследований внедрены в практику МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахани, а также используются в научной и практической работе кафедр теоретического и клинического профиля ГОУ ВПО АГМА: биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, медицинской биологии и генетики, акушерства и гинекологии, педиатрии, госпитальной терапии с курсом функциональной диагностики, пропедевтики внутренних болезней с курсом ревматологии, хирургии, урологии.

Внедрение практических результатов диссертации может быть распространено на все лечебные учреждения акушерско-гинекологического, педиатрического и терапевтического профиля на федеральном уровне.

В 2007 и 2008 годах новые способы и иммунохимические тест-системы для лабораторной диагностики воспаления, течения беременности и оценки состояния новорожденных, включавшие результаты данного исследования, были удостоены 2 золотых медалей на VII и VIII Московских международных салонах инноваций и инвестиций. В 2007 году инвестиционный проект «Новые иммунохимические тест-системы для лабораторной диагностики осложненного течения беременности, гипоксии и деструктивных процессов» был представлен на выставке: «Инновационные достижения России» XI Петербургского международного экономического форума.

Основные положения, выносимые на защиту

1. СБАГ, имеющий аналог у обезьян, является не строго гравидарным, а минорным сывороточным белком, частота выявления и уровень в крови доноров и здоровых детей которого зависит от пола, возраста и группы крови. Продукция СБАГ возрастает не только при беременности, но и при целом ряде патологических состояний: воспалении, опухолях, системных заболеваниях у взрослых и детей. Причем, в некоторых случаях (ревматизм, гломерулонефрит, бронхиальная астма и другие) уровень СБАГ достигает величин, сопоставимых с уровнем этого белка при беременности (до 100 и более мг/л). 

2. СБАГ участвует в поддержании иммуногоместаза матери и плода, а также больных воспалительными, аутоиммунными и опухолевыми заболеваниями, что подтверждено полученными в ходе диссертационной работы результатами эксперимента in vivo по иммуносупрессивному эффекту СБАГ, связи его продукции с другими биологически активными компонентами гомеостаза, а именно: с иммуноглобулинами, интерлейкинами, маркером апоптоза. 

3. Сывороточный СБАГ, обладая высокой молекулярной массой, практически не выявляется в других биологических жидкостях. Обнаруженная иммунофлюоресцентным методом его локализация на лимфоцитах и в тканях некоторых органов с увеличением содержания СБАГ в плаценте и малигнизированных клетках позволяет предположить наличие факторов, активирующих синтез СБАГ для реализизации его иммуномодулирующих свойств, наиболее выраженных при беременности и опухолях.

4. При выделении и очистке СБАГ из сыворотки крови следует учитывать возможность его межмолекулярных взаимодействий с некоторыми другими белками крови, например, с МГ, приводящих к изменению распределения этих белков на разделительных средах (эти взаимодействия снимаются воздействием детергентов), а также сродство СБАГ к гормональным компонентам сорбентов, содержащим эстрогены.

5. Использование теста на СБАГ в оценке течения беременности основано на достоверных изменениях концентрации СБАГ в зависимости от сроков нормально протекающей беременности и развития осложнений беременности. Его диагностическая значимость возрастает при одновременном определении СБАГ с ТБГ, так как синтез этих белков, обладающих идентичной иммуномодулирующей активностью, взаимозависим.

6. Применение иммунохимического теста на СБАГ позволяет выявлять воспаление, в том числе скрытые формы, вне зависимости от локализации и на всем протяжении процесса. Особенно полезен тест в оценке эффективности лечения при многих нозологических формах воспалительных заболеваний сердца, легких, почек и других органов.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на тематических и итоговых научно-практических конференциях сотрудников ГОУ ВПО АГМА и врачей Астраханской области, а также на российских и международных форумах: V Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1986); конференции «Биохимия – медицине /молекулярные механизмы формирования патологических состояний/» (Ленинград, 1988); Всесоюзном симпозиуме с международным участием «Патогенез хронического воспаления» (Новосибирск, 1991); Всероссийской научной конференции «Современные проблемы диагностики и лечения хронических неспецифических заболеваний легких у детей» (Москва-Нальчик, 1991); 1-st International Conference on Immunoreabilitation (Sochi, 1992); 1-м съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); of the Meetings FEBS (Federation of European Biochеmical Societies) –1993 (Stockholm), 1995 (Basel); of the Meetings ISOBM (International Sotiety for Oncodevelopmentitae Biology and Medicine) – 1989 (Freiburg), 1990 (Moscow), 1998 (Umea, Sweden), 2000 (Munich), 2004 (Helsinki), 2005 (Greece); 5-й научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге, 2001»; Европейском конгрессе по астме и IV съезде клинических иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001); 3-rd Central European Conference on Human Tumor Markers. - Cechtuma (Praga, 2001); Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (С-Пб. - 23-26 июня 2002); 3-й научной конференции и школе-семинаре для молодых ученых «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань-Москва, 2003); XVII Всемирном конгрессе по астме и V съезде иммунологов и аллергологов СНГ (С.-Пб., 2003); II Европейском конгрессе по Астме и I Международном конгресс «Здоровье и лекарство» (Тбилиси, Грузия, 2004); научно-практических конференциях и школах-семинарах для молодых учёных с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2004, 2006); VI съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2006); II и IV международных ежегодных конференциях «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы» (С.-Пб. – 2005, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликована 91 научная работа, из них 16 в рекомендуемых ВАК изданиях, 2 патента.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 253 страницах компьютерного текста, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, 2 приложений, библиографического указателя, включающего в себя 302 литературных источника: 101 отечественный и 197 иностранных. Иллюстративный материал представлен  29 таблицами, 36 рисунками.

Личное участие автора в получении научных результатов заключается в формировании идеи исследования, планировании и выполнении основного объема экспериментальной части работы, в разработке плана изучения клинического материала и тестировании большей части коллекций образцов биологического материала обследуемых лиц, статистической обработке, анализе и интерпретации полученных результатов.

В работу вошли результаты исследований, проведенных совместно с представителями клинических кафедр и научных лабораторий АГМА, РГМУ, других учебных и научных учреждений. Автор выражает благодарность всем коллегам, в соавторстве с которыми были опубликованы работы.

Работа выполнена на кафедре биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики и на базе учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Росздрава. Отдельные фрагменты работы были поддержаны грантами ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России», Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере РФ и Губернатора АО.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для теоретического и клинического изучения СБАГ использовали биологические жидкости и ткани лиц здоровых и страдающих воспалительными, онкологическими и другими заболеваниями, заведомо или предположительно содержащими объект исследования. 

Поскольку этим объектом являлся сывороточный белок крови беременных женщин, то, прежде всего, изучению были подвергнуты образцы сыворотки крови женщин различных сроков беременности, рожениц, родильниц, плодов и новорожденных, женщин, страдающих онкологическими и нераковыми гинекологическими заболеваниями, доноров - мужчин и женщин. Исследовали и другие биологические жидкости организма человека: мочу беременных и небеременных женщин, амниотическую жидкость, ликвор, плевральный и перикардиальный экссудат, маточные смывы, а также различные тканевые экстракты взрослых людей и плодов (табл 1).

Кроме того, при изучении видового распределения СБАГ тестировали сыворотку крови обезьян Macaca Rhesus, Macaca Cynomolgus, Macaca Fascicularis (резус, яванская, лапундер).

В качестве исходного материала при выделении и очистке СБАГ использовали кровь женщин с поздними сроками беременности (36-40 недель развития), рожениц и ретроплацентарную кровь.

Группы обследованных формировали из беременных женщин, рожениц и родильниц, находившихся в МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахани, больных специализированных терапевтических и хирургических отделений клинических больниц г. Астрахани, включая областную и городскую детские клиники. В качестве контроля использовали образцы сыворотки крови доноров, полученные со станции переливания крови, и здоровых детей.

Образцы биологического материала, при необходимости, хранили до исследования при температуре не выше -180 С.

Таблица 1

Количественная характеристика исследованного материала

Материал исследования

Количество образцов

Сыворотка крови:

доноров-мужчин и женщин

1586

здоровых детей

243

беременных женщин рожениц и родильниц

1697

плодов и новорожденных

226

гинекологических больных

195

онкологических больных

608

больных другими заболеваниями, включая детей

2526

практически здоровых лиц

1475

Ретроплацентарная кровь

182

Экстракты:

плаценты

95

различных тканей плодов

16

различных тканей взрослых людей

39

моча здоровых и больных лиц

124

моча беременных женщин: здоровых  и с гестозами

3428

Маточный смыв

139

Молоко матери

78

Амниотическая  жидкость

63

Экссудат:

плевральный

27

перикардиальный

9

Бронхиальный секрет

128

Желчь

23

Ликвор

104

Образцы тканей для морфологических исследований

175

ИТОГО

13186

Для определения места локализации и предполагаемого синтеза использовали гистологические препараты из тканей здоровых (аутопсийный материал от лиц, погибших в результате случайных причин) и патологически измененных тканей (операционный материал), полученных в патологоанатомическом бюро областного онкологического диспансера города Астрахани, ГНЦ колопроктологии РФ, МНИОИ им. Герцена. Образцы ткани плаценты получали в клиническом родильном доме и родильном отделении Астраханской областной Александро-Мариинской больницы. (табл 2). 

Полученный материал обрабатывали в лабораториях Астраханской государственной медицинской академии и Центральной научно-исследовательской лаборатории Российского государственного медицинского университета.

Таблица 2

Характеристика материала для морфологических исследований

Исследуемый материал

Кол-во

Возрастная группа

Пол

20-29

30-39

40-49

50 и >

М

Ж

1

Эндометрий

30

5

8

10

7

30

2

Плацента

20

18

9

3

30

3

Толстый кишечник

20

7

6

2

5

13

7

4

Аппендикс

10

5

4

1

-

8

2

5

Печень

12

4

6

1

1

4

8

6

Рак и атипичная  гипер-плазия эндометрия

53

3

12

38

53

7

Рак толстого кишечника

30

3

27

18

12

Всего

175

В ходе работы по экспериментальному и клиническому направлениям исследования были использованы биохимические, иммунохимические, в том числе гистохимические, и статистические методы.

Биохимические методы применяли для выделения и очистки белков: реакции осаждения, диализ, аналитический и препаративный электрофорез в агаре, агарозе и в полиакриламидном геле (ПААГ), гельпроникающая, ионообменная и аффинная хроматография, спектрофотометрия, лиофилизация.

Иммунохимические методы: варианты иммунодиффузионного анализа в геле, иммуноэлектрофорез, иммуноферментный анализ (ИФА) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ). В работе были использованы иммунохимические тест-системы на СБАГ, трофобластический бета-глобулин (ТБГ), альфа2-макроглобулин (МГ), С-реактивный белок (СРБ), цитокины и маркер апоптоза DR5. Моделирование иммунодиффузионных тест-систем на СБАГ, ТБГ и МГ осуществляли из самостоятельно полученных реагентов в лабораториях АГМА, лабораторные образцы ИФА наборов на СБАГ формировали в АГМА и НВО «Иммунотек», г.Москва. В других случаях были использованы коммерческие антисыворотки. Методом ИФА на аппаратуре фирмы BioTechnics определяли макрофагальный белок воспаления (MIP-1), IL4 и TNF (Cytimmune); DR5 (Biosource International); СРБ (диагностические наборы отечественного и импортного производства). Часть образцов тестировали на СРБ также методом ИДА с коммерческой антисывороткой. Уровень СБАГ, МГ, ТБГ в исследуемых образцах экспериментального и клинического материала определяли имунодиффузионным титрованием со стандартной тест-системой.

Антисыворотки к СБАГ и белкам сравнения получали на кроликах породы шиншил весом 2-3 кг. Иммунизацию проводили по модифицированной схеме с использованием адъювантов. Антигенами были выделенные из крови беременных женщин методами высаливания, препаративного электрофореза, ионообменной и гельпроникающей хроматографии препараты СБАГ, ТБГ, МГ, в качестве дополнителей - адъювант Фрейнда и ланолин-вазелиновая смесь.

В первый день вводили смесь антигенного материала с полным адъювантом Фрейнда (0,4 мл раствора антигена, 3,2 мл адъюванта, 0,4 мл 0,15М раствора NаСl) подкожно в несколько мест (до 8), реже в лимфузлы подколенных ямок. После трехдневного перерыва инъекции возобновляли и вводили антиген с равным объемом 2,5% раствора алюмокалиевых квасцов через день в возрастающих дозах внутримышечно. Каждую дозу вводили дважды. Всего 10 подкожных и внутримышечных введений. Заключительную инъекцию проводили внутривенно или внутрибрюшинно чистым антигеном. Общее количество белка, вводимого животному за весь цикл иммунизации, составляло 150-200 мг. Для получения антисывороток с высоким уровнем антител через 2-3 месяца проводили реиммунизацию введением 100-120 мг белка тремя инъекциями: подкожной, внутримышечной и внутривенной с интервалами в 90-120 мин. Забор крови осуществляли из краевой вены уха кролика в количестве 40-50 мл на 7-9 день после заключительного введения антигена. Полученные антисыворотки проверяли на специфичность сопоставлением со стандартной тест-системой на исследуемый белок. Поливалентные антисыворотки дополнительно истощали лиофилизированной плазмой донора.

Экспериментальную часть по изучению биологической роли СБАГ проводили по двум направлениям: оценки иммуномодулирующей активности белка на лабораторных мышах и определению его сродства к стероидным гормонам методом аффинной хроматографии. Иммуномодулирующая активность белка была изучена методом локального гемолиза (Jerne, Nordin) по первичному иммунному ответу на эритроциты барана у здоровых половозрелых мышей линии СВА, иммунизированных внутрибрюшинно и антигеном (ЭБ) в количестве 5х108  клеток (0,5 мл 5%), и белком, введенным животным через 48 часов. На 5-е сутки после иммунизации подсчитывали число антителообразующих клеток (АОК) селезенки и измеряли ее массу. В опытах было использовано 180 мышей, так как параллельно со СБАГ в качестве объекта сравнения были изучены препараты ТБГ, α2-МГ, АФП.

Для проведения морфологических исследований образцы нормальных и малигнизированных тканей размерами от 0,5до 1см помещали в фиксатор – абсолютный спирт для дальнейшего получения парафиновых блоков, либо замораживали при минус15-20С и изготавливали криостатные срезы. В проведении реакции иммунофлюоресценции использовали антикроличьи диагностические иммуноглобулины, меченные флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) из НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалея.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета статистического анализа Statistica 6.0, SPSS 7.0 for Windows и Microsoft Office Excel 2003 с учетом стандартных методик вариационной статистики и критерия t Стьюдента для оценки достоверности различий.

Результаты исследований и их обсуждение

При изучении физико-химических свойств СБАГ в нативных условиях использовали биохимические методы в сочетании с иммунохимическими для идентификации изучаемого белка в исходном материале и на разных этапах достижения конечного результата (табл. 3). СБАГ является гликопротеином – наличие углеводного компонента было подтверждено специфическим окрашиванием его линий преципитации в агаре на высушенной иммуноэлектрофореграмме. Определение относительной электрофоретической подвижности проводили в агаре «Дифко», в агарозе «Calbiochem» и полиакриламидном геле (ПААГ).

Таблица 3

Основные физико-химические свойства СБАГ

Свойства

Метод, среда, носитель

Результат

Относительная электрофоретическая подвижность

В агаре, агарозе,

ПААГ

0,76,

зона гамма-глобулинов

Коэффициент диффузии

В агарозе

3,48 (х10-7см2/сек)

Молекулярная масса

Тонкослойная хроматография,

гель-фильтрация

280–365 кДа

Наличие небелковых компонентов

Окраска по методу Шифф-йодная кислота

Сложный белок - гликопротеин

Отношение к осаждающим агентам

Сульфат аммония,

риванол, спирты,

полиэтиленгликоль,

и другие.

Выпадает в осадок в широком диапазоне

Основная часть – во фракции тяжелых белков

Распределение на

молекулярных ситах

Сефадекс G-50 – 200,

и Toyopearl-65

Элюция сразу за свобод-ным объемом с МГ

Распределение на

ионообменных носителях

DEAE-сефадекс, DEAE -SS- и CM-целлюлоза, DEAE-servacelle,

SC- гидроксиапатит, фенилсефароза и другие.

Хорошо выделяется на анионитах.

       Электрофоретическая подвижность относительно альбумина в агаре составила 0,76 ± 0,035, а коэффициент диффузии в агарозе – 3,48±0,45 х10-7см2/сек. При электрофоретическом разделении в ПААГ изучаемый белок обнаруживали в зоне гамма-глобулинов.

Молекулярную массу СБАГ определяли в двух вариантах распределительной гель-хроматографии. При гель-фильтрации сыворотки крови беременных женщин в колонке с сефадексом -200 в фосфатном буфере пик СБАГ выходил в соотношении 1,14 объема элюции к свободному объему, что соответствует молекулярной массе 350-380 кДа. Среднее значение составило 365,8±34,1 кДа. Методом тонкослойной хроматографии, имеющей ряд преимуществ перед колоночным вариантом (малое количество исследуемого вещества и быстрота определения) молекулярную массу СБАГ установили равной 279±1,77 кДа.

Сульфатом аммония СБАГ из сыворотки крови беременных осаждался полностью в диапазоне 35-40% насыщения раствора. При риваноловом фракционировании того же исходного материала СБАГ полностью выводился в осадок.

Было замечено, что электрофоретическая подвижность в геле и объем элюции при гель-хроматографии на сефадексе, отношение к осаждающим агентам СБАГ не соответствуют молекулярной массе этого белка. Особенно наглядно эти несоответствия проявлялись при распределении белков сыворотки крови беременных в хроматографической колонке при гель-фильтрации на сефадексе G-200 (рис. 1). Присутствие СБАГ выявляли во фракциях «тяжелых белков»: его объем элюции совпадал с пиком выхода альфа2-макроглобулина (МГ), молекулярная масса которого превышает таковую по СБАГ более чем в два раза. Кроме того, в объеме выхода СБАГ и МГ присутствовала часть первой фракции ТБГ.

Ранее при изучении физико-химических свойств и выделении белков сыворотки крови человека нами было показано, что некоторые из них, в частности ТБГ и иммуноглобулины класса G (1977), изменяют свои параметры подвижности в геле, отношение к осаждающим реагентам, вероятно, за счет межмолекулярных взаимодействий.

Рис. 1. Элюция СБАГ, МГ и ТБГ на сефадексе G-200

Предположение о том, что СБАГ в нативных условиях проявляет способность к межмолекулярным взаимодействиям, косвенно было подтверждено применением детергентов (оптимальным оказался раствор 0,5М мочевины) при разделении белков сыворотки крови беременных (рис. 2). 

Рис. 2. Элюция СБАГ, МГ и ТБГ на сефадексе G-200 с 0,5М мочевиной

Полученные факты, а также появившиеся работы об участии неполярных радикалов в связывании протомеров сложных белков определили задачу следующего этапа работы по проведению сравнительного качественного анализа гидрофобных радикалов (ГР) в первичной структуре СБАГ и МГ.

Исходным материалом для исследования послужили данные по структуре белков из международной базы данных SwissProt. Белок беременности, по мнению некоторых авторов, является димером, а более изученный МГ, однозначно, тетрамером. Мономер СБАГ содержит 1482 аминокислотных остатка, а МГ – 1474, то есть разница в их количестве составляет всего 8 аминокислот.

Сравнительный анализ аминокислотной последовательности указанных белков показал, что процентное содержание неполярных аминокислот (НПА) составляет для МГ 46% (578), а для СБАГ 39% (684). Процентное отношение каждой НПА к их общему количеству составляет для МГ: вал 20% (139), про 11% (73), лей 32% (221), илей 11% (73), ала 14% (96), гли 12% (86); для СБАГ: вал 23% (135), про 14% (79), лей 24% (137), илей 9% (53), ала 16% (91), гли 14% (83). То есть, количество каждой из НПА в этих белках различается на 2-3% (за исключением лейцина, для которого разница составляет 8%). Анализ расположения в полипептидной цепи одиночных и сгруппированных по 2 и более ГР (для МГ это 251 и 327, а для СБАГ- 250 и 464 соответственно) позволяет выявить аналогичные звенья ГР, которые вероятно участвуют в формировании пространственной конформации белка, и отдельно расположенные ГР, которые могут оставаться на поверхности уже сформировавшейся третичной структуры белка и участвовать в обеспечении межмолекулярных взаимодействий или эффекта прилипания.

Такие связи, несмотря на малое количество энергии (0,1кДж), при образовании их в большом количестве, по-видимому, могут обеспечивать достаточную прочность, которая приводит к значительным трудностям при разделении белков с помощью гель-фильтрации и даже электрофореза.

Для разработки оптимального метода выделения и очистки СБАГ были учтены результаты поисковых экспериментов с использованием многих носителей для ионообменной, распределительной и аффинной хроматографии. С учетом того, что СБАГ является гликопротеином, изучали его поведение в колонке с гепарин-CNBr-cефарозой и в растворе под воздействием полиэтиленгликоля молекулярной массы от 300 до 40000 и различного процентного содержания. Для получения чистых препаратов очень важно было отделить СБАГ от МГ. Наибольшего внимания заслуживают два варианта, позволяющих разделять СБАГ и МГ методами аффинной хроматографии на гепарин-CNBr-cефарозе или эстрадиол-сефарозе с триазиновой вставкой (Е2-S1). Результаты эксперимента показали, что МГ обладает значительно меньшим сродством к гепарину и гормональному компонентам аффинного сорбента, чем СБАГ и ТБГ.

Неожиданно интересные данные были получены при разделении методом гидрофобной колоночной хроматографии на фенилсефарозе CL-4B белков фракции крови беременных (осадок после воздействия 40% раствора сульфата аммония), содержащей СБАГ, а также МГ и ТБГ (рис 3) .

Рис. 3. Элюция СБАГ, МГ и ТБГ на фенилсефарозе 4B

в градиенте 1М раствора (NH4)2SO4

1-5 – фракции несорбировавшихся белков

Значительная часть МГ выходила в объеме несорбировавшихся белков, что, на первый взгляд, мало согласуется с наличием в МГ 46% неполярных аминокислот (в СБАГ - 39%). Вероятным объяснением может быть участие большей части гидрофобных радикалов в образовании связей между протомерами и снижение вследствие этого гидрофобных свойств четвертичной структуры. Для разделения СБАГ и ТБГ было отработано несколько вариантов

Наиболее рациональной оказалась схема выделения с последовательным использованием методов, указанных в таблице 4.

Таблица 4

Очистка СБАГ из сыворотки крови беременных женщин поздних сроков

Этап очистки

Концентрация белка, мг

Кратность очистки

Выход (%)

общий

СБАГ

Исходный материал

31200

28,8

1

100

(NH4)2SO4 (35-40%), осадок

6736

28,8

4,63

100

фенилсефароза CL-4B

194,7

12,45

34,6

43,23

Sc-гидроксилапатит

18,9

7,5

10,3

26,04

Сефадекс-G200

2,85

2,25

6,63

7,81

На последнем этапе можно использовать разделение на сефакриле. При указанном алгоритме очистки был получен препарат высокой степени чистоты (рис 4).

Рис 4. ПААГ электрофореграмма белков фракций основных этапов очистки

Еще одним эффективным способом выделения и очистки СБАГ оказалась последовательность применения следующих методов: осаждение 40% раствором (NH4)2SO4, диализ, ионообменная хроматография на сефадексе DEAE-50 (или Servacelle DEAE-52), распределительная хроматография на Toyopearl-65 (или сефадексе G 200 + детергент), аффинная хроматография на эстрадиол-сефарозе с триазиновой вставкой.

Распределение СБАГ в биологических жидкостях. С учетом того, что СБАГ впервые был выявлен в крови беременных женщин, ранее нами были предприняты поиски его в таких биологических объектах, как сыворотка крови плодов и новорожденных, амниотическая жидкость, моча беременных и молоко матерей (Д.М.Никулина и соавт,1976), табл.5. Позднее поиски были расширены и СБАГ определяли в других биологических жидкостях организма здорового человека и больных с воспалительными и опухолевыми заболеваниями (табл 6).

Таблица 5

Выявление СБАГ в биологических жидкостях беременных женщин и плодов

Биологическая

жидкость

Всего n

Частота выявления

Уровень СБАГ в мг/л.

n

%

M±m

Min - max

Сыворотка крови:

- беременных женщин

- рожениц

- плодов

новорожденных

121

163

22

167

121

163

-

2

100

100

1,2

38,4±20,7

95,07±17,1

следы

10 – 128

40 – 320

Амниотическая

жидкость *

51

5

9,8

6,0±2,24

5 – 10

Моча беременных

113

-

Молоко матерей -

2–10 день после родов

78

-

*/  пробы концентрировались до 1/4 - 1/5 исходного объема

При онкологических заболеваниях независимо от локализации процесса продукция СБАГ значительно увеличивается, однако высокий уровень этого белка не может быть специфическим показателем опухолевого процесса. Наиболее интересным представляется факт обнаружения СБАГ в маточных смывах при патологии эндометрия. Всего было исследовано 139 образцов лаважной жидкости: 52 больных раком тела матки; 19 – атипической железистой гиперплазией эндометрия; 51 – миомой матки. СБАГ выявлен, соответственно, в 86,54; 47,37; 23,53 и 13,73% случаев без существенной разницы в концентрации этого белка, хотя отмечена некоторая зависимость уровня СБАГ от количества экзогенных эстрогенов в случаях гормонотерапии.

Таблица 6

Выявление СБАГ в биологических жидкостях организма человека

Биологическая

жидкость

Всего образ-цов

Наличие СБАГ в биологической жидкости

здоровых лиц

при

беремен-ности

при

воспа-лении

при

опухолях

Сыворотка крови

>3000

+

+

+

+

Моча

186

-

-

-

-

Спинномозг. жидкость

104

н/опр

н/опр

-

-

Бронхиальный секрет

128

-

+

+

желчь

23

-

н/опр

-

-

Маточный смыв

139

н/опр

н/опр

+

Методом иммунодиффузионного титрования со стандартной тест-системой (чувствительность 5 мг/л.) СБАГ был выявлен у здоровых лиц только в сыворотке крови при концентрации 5-10 мг/л в среднем при 20-30% случаев (табл 7), крайне редко – в крови новорожденных, в околоплодных водах при тяжелых формах позднего гестоза.

Таблица 7

Частота выявления СБАГ иммунодиффузионным методом в сыворотке крови здоровых лиц в различные возрастные периоды и в зависимости от пола

Обследуемая

группа

Число

обследованных

Частота выявления α2-PAG

при  концентрации:

< 5 мг/л

> 5 мг/л

Дети в возрасте:

n

%

n

%

До 1 года

22

13,6

4,5

1 – 3 года

45

10 

22,2

4,4

4 – 6 лет

44

20,4

6,8

7 – 10 лет

68

15

22,0

8,8

11-14 лет

64

13

20,3

5

7,3

Всего

243

50

20,6

17

7,0

из них:

мальчиков

152

33

21,7

4

2,6

девочек

91

17

18,7

13

14,3

здоровые лица 18 –40 лет

мужчины

67

14

20,9

2

2,98

женщины

64

13

20,3

4

6,3

Всего:

131

27

20,6

6

4,6

За весь период работы целенаправленно или в качестве контроля изучено более 3000 образцов крови здоровых лиц разных возрастов, в том числе 243 детей, 269 студентов и 643 доноров. Частота выявления этого белка колебалась в разных группах у здоровых мужчин от 18 до 30%, а у женщин от 20 до 45%.

Частота выявления СБАГ выше не только у женщин в 1,5-2 раза, чем у мужчин, но и у девочек по сравнению с мальчиками.

Самая высокая частота обнаружения СБАГ отмечена у лиц с I группой крови (рис 5).

Рис 5.  Частота выявления СБАГ в сыворотке крови доноров

в зависимости от групп крови

Поиск аналогов белков у животных, как правило, преследует цель определить эволюционные изменения первичной структуры белков, находящих отражение в соответствующих изменениях их антигенной специфичности. ИДА является незаменимым в этих целях по сравнению с другими иммунохимическими методами, особенно подходят оранжировки анализа в штампах «четверка» и «семерка».

В таблице 8 приведены полученные результаты иммунохимической идентификации СБАГ параллельно с другими индивидуальными белками человека у обезьян Macaca: Rhesus, Cynomolgus, Fascicularis. В качестве объектов были выбраны белки, имеющие разное происхождение: материнское, плодовое и плацентарное.

Таблица 8

Идентификация аналогов СБАГ и других белков, синтез которых усиливается при беременности, в крови обезьян Старого Света

Белки человека

Наличие аналога у обезьян

Характеристика идентичности

Полная

Неполная с числом общих детерминант

высоким

низким

Сывороточные: СБАГ

+

+

МГ

+

+

Плацентарные: ТБГ

+

+

ПЛЧ

+

+

Плодовые: АФП

+

+

Установлено, что полной идентичностью обладают СБАГ (рис 6) и МГ, неполной – АФП, очень низкой – ТБГ, ПЛЧ.

     

  А – антисыворотка на СБАГ

  1 - пул сыворотки крови беременных женщин;

  2 - пул сыворотки крови беременных обезьян

 

Рис. 6. Идентификация СБАГ в сыворотке крови беременных обезьян

СБАГ был выявлен во всех исследуемых образцах крови беременных обезьян и в 70% случаев небеременных самок (табл 9).

Таблица 9

Количественное определение СБАГ в сыворотке крови обезьян

Сыворотка крови обезьян

Число образцов

Концентрация СБАГ (мг/л)

Min - max

M±m

P

небеременных

9

10 - 20

15,55±1,66

беременных

6

20 -0

64,0±13,94

<0,001

кормящих

3

5 - 10

8,33 ±1,98

Всего:

18

5 - 80

Высокие значения частоты выявления и концентрации (5-20 мг/л) СБАГ у небеременных особей могут служить основой для обсуждения эволюционных изменений иммунореактивности организма, так как у человека этот белок в концентрации >10 мг/л присутствует только при беременности, воспалении, опухолях. Установленный факт можно предположительно объяснить с разных позиций: во-первых, не исключено, что он является филогенетически древним (распространенным) и его основная функция активнее востребована у животных, стоящих на более низких ступенях эволюционной лестницы, а у человека заменена другими структурами и этот белок становится дополнительным звеном защиты; во-вторых, более прозаическая причина может заключаться в том, что практически все обезьяны имеют хронические воспалительные заболевания, которые и вызывают усиленную продукцию СБАГ.

Полученные результаты позволяют предположить, что структурные гены СБАГ и МГ являются наиболее стабильными в течение эволюционного времени, а с позиций филогенетической дивергенции самыми молодыми из изученных белков являются ТБГ и ПЛЧ, обладающие слабо выраженной неполной антигенной идентичностью с их аналогами у обезьян.

Клеточная локализация СБАГ. Наиболее убедительными являются литературные данные о том, что местом синтеза сывороточного СБАГ являются плазматические клетки. Отсутствие его в других биологических жидкостях логично объясняется большой молекулярной массой. Выявление СБАГ в маточных смывах при патологии эндометрия побудило к проведению сравнительного иммуногистохимического изучения СБАГ в 43 образцах дефинитивных и патологически измененных тканей эндометрия в сопоставлении с тканью плаценты, толстого кишечника, аппендикса и печени.

Методом непрямого иммунофлюоресцентного анализа выявлено, что СБАГ содержится в тканях нормального (рис 7) и патологически измененного эндометрия (гиперплазия, дифференцированный рак). Интенсивность свечения колебалась в различных образцах от умеренной до высокой. Флюоресценцию наблюдали в апикальных отделах железистого эпителия и в крупных клетках стромы, расположенных ближе к базальному отделу железистого эндометрия, а также  в просветах железистых образований. При атипичной гиперплазии СБАГ выявляли в 100% случаев, при умеренно дифференцированном раке лишь в 56,5%. При железистой гиперплазии СБАГ не был выявлен.

При изучении плаценты отмечена интенсивная флюоресценция в клетках крови матери - сегментоядерных лейкоцитах и лимфоцитах (рис. 8),  что позволяет предположить функционально обусловленную (за счет соответствующих рецепторов) локализацию на этих клетках белков беременности (аналогичная картина была и для ТБГ) или их синтез клетками крови.

Рис 7. Выявление СБАГ

в тканях пролифирирующего

эндометрия

Установлено, что в тканях толстого кишечника и эндометрия концентрация СБАГ существенно возрастает при малигнизации (рис 9, 10). Влияние аденокарциноматоза на содержание СБАГ в органе и, соответственно, на его синтез проявляется в зависимости от органа в различной степени. Так, максимальное увеличение концентрации СБАГ более чем в 4 раза отметили в малигнизированном кишечнике. Увеличение содержания СБАГ в малигнизированном эндометрии выражено меньше.

а) б)

Рис 9. Иммунофлюоресцентный анализ СБАГ в нормальном (а) и

малигнизированном эндометрии (б)

Полученные результаты о достоверном увеличении уровня СБАГ при злокачественных опухолях подтверждают ранее высказанные предположения о возможности включения его в  группу неспецифических сывороточных маркеров рака.

а) б)

Рис 10. Иммунофлюоресцентный анализа СБАГ в нормальном (а) и

малигнизированном (б) толстом кишечнике

Вероятно, при канцерогенезе в клетке увеличивается содержание факторов, играющих роль индукторов дерепрессии структурного гена СБАГ.

Вслед за выявлением корреляции между уровнем СБАГ и иммуноглобулинов классов A и G нами было проведено изучение иммуномодулирующего действия белковых препаратов СБАГ и ТБГ in vivo. На первом этапе мы не стремились полностью очистить исследуемые белки  от основных белковых компонентов сыворотки крови для максимального сохранения нативных свойств исследуемых белков, включая заряд, конформацию и межмолекулярные взаимодействия, и вводили мышам полуочищенные препараты СБАГ и ТБГ после препаративного электрофореза в агаре и диализа. Были получены предварительные результаты по иммуносупрессивному действию обоих белков, более выраженному у ТБГ.

На втором этапе исследования использовали высокоочищенные препараты белков беременности и двух сывороточных белков в качестве объекта сравнения (табл 10, 11).  При расчете дозы препарата исходили из удельной физиологической концентрации исследуемых белков.

Таблица 10

Сравнительное определение влияния белковых препаратов  на количество

антителообразующих клеток в селезенках мышей при первичном

иммунном ответе

Белковые

препараты

0,1% - 0,5 мл

n

Доза

мг/кг

АОК,

M±m

% от

контроля

Степень

достовер

ности

ТБГ 1 мг/мл

15

25

27395±3850,3

40,79

р<0,001

СБАГ 1 мг/мл

21

25

59429±2552,8

88,49

p<0,05

α2-МГ 1 мг/мл

16

25

62860±3241,2

93,60

p>0,05

АФП 0,5 мг/мл

15

12,5

70000±3228,8

104,24

p>0,05

АФП 1 мг/мл

14

25

86643±4005,0

129,01

p<0,02

АФП 3 мг/мл

17

75

163714±4851,2

243,78

  p<0,001

Контроль

37

-

67155±2904,8

100,0

-

Полученные данные полностью подтверждают сложившееся представление об иммуносупрессивном влиянии ТБГ и СБАГ на систему иммунитета, а также о дозазависимом иммуностимулирующем эффекте АФП.

Число АОК в селезенках опытных мышей на пике иммунного ответа составило от аналогичных показателей в контрольной группе животных в 2 раза большее для ТБГ, чем для СБАГ, значение, то есть, ТБГ отличается более выраженным эффект иммуносупрессии. Такое распределение иммунотропного влияния, очевидно, имеет глубокий биологический смысл, так как ТБГ, эволюционно более молодой, является специфическим белком беременности, синтезируемым синцитиотрофобластом, а СБАГ - сывороточным минорным компонентом, реагирующим не только на беременность, но и на воспаление.

Таблица 11

Сравнительное определение влияния белковых препаратов на массу селезенки мышей при первичном иммунном ответе на ЭБ

Белковые препараты

Доза

мг/кг

Число

n

Масса

селезенки,

мг,  M±m

%  от

контроля

Степень

достоверности

СБАГ

25

21

150±3,1

86,75

р<0,001

ТБГ

25

15

158±4,6

91,33

p<0,05

α2-МГ

25

16

174,3±5,2

100,8

p>0,05

АФП 0,25мг

12,5

15

252,8±3,7

146,21

р<0,001

АФП 0,5 мг

25

14

314,6±5,1

181,95

р<0,001

АФП 1,5 мг

75

17

372,4±9,3

215,38

р<0,001

Контроль

-

37

172,9±4,4

100,0

-

Возможно, что СБАГ является полифункциональным белком и оказывает опосредованное регулирующее воздействие на иммунные реакции.

Изучение тропности СБАГ к половым гормонам (эстрадиолу, эстриолу, тестостерону) методом аффинной хроматографии показало максимально выраженное сродство к эстрадиолу и минимальное – к мужскому половому гормону.

При анализе более 1000 случаев была отмечена закономерность в динамике продукции материнского (СБАГ) и плацентарного (ТБГ) белков на протяжении всей беременности (рис 11). При физиологически протекающей беременности уровень материнского белка, как правило, выше плацентарного только в начале беременности. Во второй половине беременности ТБГ «обгоняет» СБАГ, то есть плацента за счет увеличения объема берет на себя большую часть функции поддержания иммунотолерантности в системе мать-плод-плацента. Следовательно, иммуносупрессивная активность указанных белков в норме сбалансирована и имеет важное значение для благоприятного течения беременности и благополучного исхода родов. По всей вероятности, огромное значение в препятствии отторжению фетоплацентарного комплекса организмом матери играет суммарный иммуносупрессивный эффект белков беременности.

Рис 11. Динамика концентрации белков беременности материнского, плацентарного и плодового происхождения

В практических целях для оценки течения беременности был проведен математический расчет отношения материнского белка к плацентарному. Этот показатель назван коэффициентом иммунологической адаптации (КИА). Выход коэффициента за пределы физиологического диапазона может свидетельствовать о наличии осложнений беременности.

Контрольное обследование 446 женщин с патологически протекающей беременностью показало достоверное изменение КИА при поздних гестозах, плацентарной недостаточности, внутриутробном инфицировании плода и пролонгированной беременности (табл 12). В зависимости от тяжести гестоза КИА заметно повышается за счет снижения концентрации ТБГ (деструктивные изменения в плаценте) и повышения уровня СБАГ. При перенашивании плода изменяется динамика обоих белков, их уровень снижается, но быстрее падает уровень ТБГ. Таким образом, выход коэффициента за пределы физиологического диапазона может свидетельствовать о наличии осложнений беременности.

Таблица 12

Характеристика материала клинических испытаний

Характер патологии

беременности

n

СБАГ

ТБГ

КИА

Поздние гестозы

103

  N-38 (36,9%)

>N-51 (49,5%)

<N-14 (13,6%)

  N-31 (30,1%)

>N-24 (23,3%)

<N-48 (46,6%)

  N-35 (34,0%)

>N-47 (45,6%)

<N-21 (20,4%)

Фетоплацентарная недостаточность

27

  N-15 (55,6%)

>N-  2 (7,4%)

<N-10 (37,0%)

  N-11 (40,7%)

>N-11 (40,7%)

<N-  5 (18,5%)

  N-  3 (11,1%)

>N-  7 (25,9%)

<N-17 (63,0%)

Внутриутробное инфицирование плода

79

  N-23 (29,1%)

>N-42 (53,2%)

<N-14 (17,7%)

  N-38 (48,1%)

>N-32 (40,5%)

<N-  9 (14,4%)

  N-  3 (3,8%)

>N-13 (16,7%)

<N-63 (79,5%)

Эндоцервикоз

14

  N-  5 (35,7%)

>N-  8 (57,1%)

<N-  1 (7,2%)

  N-  2 (14,3%)

>N-10 (71,4%)

<N-  2 (14,3%)

  N-  0

>N-  3 (24,4%)

<N-11 (78,6%)

Угроза отслойки

плаценты

41

  N- 18 (43,9%)

>N-15 (36,6%)

<N-  8 (19,5%)

  N-6 (14,6%)

>N-32 (78,0%)

<N-  3 (7,4%)

  N-  0

>N-  5 (12,2%)

<N-36 (87,8%)

Переношенная беременность

75

  N-  1 (1,3%)

>N-  0

<N-74 (98,7%)

  N-35 (46,7%)

>N-  0

<N-40 (53,3%)

  N-35 (46,7%)

>N-13 (17,3%)

<N-27 (36,0%)

Результаты исследований, подтвержденные другими авторами, показали, что продукция СБАГ возрастает при целом ряде патологических состоянии, не связанных с беременностью: воспалении, опухолях,  системных заболеваниях, как у взрослых, так и у детей. Его максимальные концентрации были отмечены при активном ревматизме, при туберкулезном бронхоадените, при гломерулонефрите, инфекционно-аллергическом миокардите (табл 13).

На основании выявления этого белка при воспалительном процессе различной нозологии можно считать СБАГ неспецифическим маркером воспаления. При определении СБАГ параллельно с другими БОФ была выявлена иная, чем, например у СРБ, динамика его синтеза в течение развития и разрешения воспалительного процесса. Он выявляется на всем протяжении воспаления, что позволяет отнести СБАГ к индикаторам и латентных форм воспаления. При динамическом наблюдении снижение уровня СБАГ всегда совпадало с улучшением самочувствия и функциональных показателей.

Таблица 13

Определение СБАГ в сыворотке крови больных воспалительными

и невоспалительными заболеваниями в концентрации

Заболевания

n

Выявление СБАГ при концентрации < 5 мг/л

Выявление  С Б А Г

Частота

М±m

Диапазон

  С е р д ц а

Ревмокардит I

105

0.85

9.88

5 - 20

Ревмокардит II-III

73

0.98

17.50

10 - 80

Инфаркт миокарда

103

0.52

9.14

5 - 20

Кардиопатия

40

0.15

5.83

5 - 10

инфекционно-аллер-гический миокардит

54

0,76

20,98

5 - 80

Ревматоидный полиартрит

63

0,68

17,36

5-40

Л е г к и х

Острая пневмония

83

0.71

15.84

5 - 40

Хронический бронхит

133

0.67

12.69

5 - 40

Бронхиальная астма

124

0.68

16.19

5 - 40

Т у б е р к у л е з

-вираж  туберк. проб

84

0.65

18.28

5 - 40

-бронхоаденит

118

0.73

20.34

5 - 80

-инфильтрат. форма

72

0.73

22.29

10 - 80

-диссеминир. форма

45

0.80

19.86

5 - 80

-фиброзно-каверноз.

32

0.84

24.07

10 -120

Пневмокониозы

49

0.67

10.45

5 - 20

П о ч е к

Гломерулонефрит

20

0.75

14.33

5 - 80

Пиелонефрит

51

0.66

13.52

5 - 40

К и  ш е ч н и к а

Хронический колит:

-язвенный

36

0,58

12,14

5-40

- постдизентерийный

43

0,60

9,80

5-20

- эндогенный

33

0,36

7,91

5-20

Всего

1256

Тест на СБАГ предпочтительнее других лабораторных показателей для оценки эффективности лечения и диспансерного наблюдения за больными. Сравнение теста на СБАГ с традиционными лабораторными показателями воспаления выявило его преимущество в оценке эффективности лечения и диспансерном наблюдении при различных формах заболеваний с выраженным аутоиммунным компонентом.

В таблице 16 приведена часть результатов изучения клинической значимости иммунохимического теста на СБАГ в онкологической практике.

Таблица 14

Выявление СБАГ в сыворотке крови больных в зависимости от вида и локализации опухолей

Локализация

Количество образцов

всего / позитивных

Частота

выявления, %

Концентрация,

мг/л

общее

муж

жен

Злокачественные опухоли:

Тела матки

-

46/41

89,13

82,67±9,4

Шейки матки

10/ 9

90

37,77±6,13

Яичников

24/22

91,25

21,78±3,51

Молочной железы

43/39

90,7

32,52±5,23

Простаты

39/33

84,61

23,24±3,27

Бронхолегочной системы

48/48

22/22

16/16

100

55,34±8,13

Пищевода и

желудка

5/5

3/3

2/ 2

100

17,52±2,48

Прочие

17/15

5/4

12/11

88,23

29,83±3,84

Доброкачественные опухоли:

Матки

39/34

87,20

19,61±2,38

Простаты

48/31

64,58

7,65±0,85

Прочие

12/10

4/3

8/7

83,33

15,27±0,30

Показатели СБАГ в крови больных со злокачественными новообразованиями достоверно превышают таковые при доброкачественных  опухолях, что позволяет рекомендовать тест на СБАГ в качестве дополнительного лабораторного критерия диагностики, а, главное, оценки эффективности лечения онкологических заболеваний.

       Для расширения диагностического диапазона СБАГ и технического упрощения практического использования  теста получены предварительные результаты по разработке набора реагентов для  иммуноферментного анализа, который может быть использован не только в клинических, но и поликлинических условиях при скрининг-обследовании населения с целью выявления латентного воспаления.

СБАГ был отнесен к белкам острой фазы (БОФ) с момента его обнаружения (Ю.С. Татаринов, 1971). Именно поэтому представляется логичным его изучение параллельно с классическим острофазовым белком –  СРБ. Был проведен сравнительный анализ результатов определения обоих белков и показателей клеточного и гуморального иммунитета у 93 больных с различными соматическими заболеваниями (табл 15).

Таблица 15

Показатели иммунограммы в группах БОФ-позитивных и  БОФ-негативных обследованных лиц

Показатели

Еди-ницы

изме-рений

Значения показателей иммунограммы в группах:

P

БОФ-позитивных

(n=42)

БОФ-негативных

(n=51)

M ± m

min - max

M ± m

min - max

Возраст

лет

34,50 ± 3,58

1,00 - 71,00

30,23±2,60

1,00 - 64,00

Лейкоциты

109/л

5,79 ± 0,35

4,20 - 11,20

5,82±0,28

3,00 - 11,60

Эозинофилы

%

3,00 ± 0,58

1,00 - 18,00

2,49±0,34

1,00 - 14,00

Нейтрофилы  п/я

%

1,69 ± 0,16

1,00 - 5,00

1,88±0,21

1,00 - 10,00

Нейтрофилы с/я

%

52,20 ± 2,21

16,00-82,00

46,70±2,04

19,00-79,00

Лимфоциты

%

40,59 ±1,84

23,00-71,00

46,37±2,09

15,00-78,00

0,04

Моноциты

%

2,38 ± 0,18

1,00 - 6,00

3,17±0,25

1,00 - 8,00

0,01

Т-лимфоциты

%

60,02 ± 2,46

29,00-90,00

64,72±1,77

37,00-91,00

Т-лимфоциты

109/л

1,57 ± 0,16

0,45 - 5,04

1,81±0,13

0,37 - 5,99

Т-лимфоциты акт.

%

57,80 ± 2,44

19,00-90,00

64,96±1,85

26,00-90,00

0,02

В-лимфоциты

%

18,61 ± 1,67

5,00 - 52,00

19,12±1,58

7,00 - 53,00

В-лимфоциты

109/л

0,47 ± 0,06

0,08 - 2,65

0,54±0,06

0,05 - 1,89

Фагоцитарный индекс

%

60,07±2,24

30,00-90,00

65,82±1,77

30,00-88,00

0,04

Фагоцитарное число

5,46±0,27

2,00 - 10,50

6,32±0,24

8,20 - 12,00

0,02

Количество активных

фагоцитов

1,80±0,12

0,56 - 4,10

1,84±0,15

0,58 - 6,92

Циркулирующие иммунные комплексы

у.е.

32,20±3,08

2,00 - 80,00

31,2±2,61

2,80 - 82,00

Ig A

г/л

1,13±0,10

0,19 - 4,46

1,07±0,05

0,11 - 2,22

Ig G

г/л

12,9±0,53

4,26 - 23,60

11,55±0,58

5,61 - 25,32

Ig M

г/л

1,03±0,08

0,23 - 3,58

1,17±0,08

0,34 - 3,92

В БОФ-положительных образцах достоверно ниже значения по числу лимфоцитов, моноцитов, активированных Т-лимфоцитов и показателей фагоцитоза. Полученные результаты свидетельствуют о том, что БОФ объективно отражают снижение активности иммунитета и могут быть использованы на первом этапе профилактического обследования.

Результаты исследования СБАГ параллельно с маркером апоптоза - DR 5 и двумя маркерами воспаления  - макрофагальным белком воспаления MIP-1 и СРП в 91 образце сыворотки крови детей больных воспалительными заболеваниями почек и легких (гломерулонефрит, пиелонефрит, тубулоинтерстициальный нефрит, липоидный нефроз, хроническая почечная недостаточность, инфекция мочевых путей, цистит, обструктивный бронхит, бронхиальная астма средней и тяжелой степеней тяжести)        свидетельствуют о том, что все белки острой фазы связаны с разными патогенетическими звеньями и могут иметь значение взаимно дополняющих диагностических факторов. MIP-1 и СБАГ имеют наибольшую прямую корреляционную связь, а СБАГ и DR5 - наибольшую обратную корреляцию, что может быть связано с регуляцией иммунного ответа, так как СБАГ обладает иммуномодулирующими свойствами.

ВЫВОДЫ

  1. Установлено, что электрофоретическая подвижность в геле и объем элюции при гель-хроматографии на сефадексе, отношение к осаждающим агентам СБАГ не соответствуют молекулярной массе этого белка (365 кДа): его присутствие выявляется во фракциях «тяжелых белков». Получены прямые доказательства межмолекулярных взаимодействий СБАГ с МГ и ТБГ по достоверному (р<0,05) изменению скорости распределения указанных белков в носителях после воздействия детергентов на нативную смесь.
  2. При анализе аминокислотной последовательности полипептидных цепей СБАГ и МГ показаны высокий процент неполярных аминокислот (39 и 46% соответственно) и наличие аналогичных звеньев гидрофобных радикалов (ГР), вероятно участвующих в формировании пространственной конформации белка, а также отдельно расположенных ГР, которые могут обеспечивать межмолекулярные взаимодействия или эффект прилипания на поверхности молекулы.
  3. Разработан новый рациональный способ выделения и очистки СБАГ из исходного биоматериала с использованием раствора мочевины для устранения межмолекулярных взаимодействий СБАГ с ТБГ и МГ, а также аффинной хроматографии на эстрадиол-сефарозе с триазиновой вставкой.
  4. Выявлено, что иммунофлюоресцентным методом СБАГ обнаруживается в зрелой плаценте в симпласте ворсин хориона, в толстом кишечнике в эпителии крипт, в аппендиксе в области базальной мембраны, в печени в прослойках междольковой соединительной ткани, в тканях нормального и патологически измененного эндометрия. Аденокарциноматоз существенно влияет на содержание СБАГ в органе и, соответственно, на его синтез в зависимости от органа и различной степени малигнизации. Вероятно, при канцерогенезе в клетке увеличивается содержание факторов, выполняющих роль индукторов дерепрессии структурного гена СБАГ.
  5. Показано, что СБАГ в редких случаях может быть выявлен в амниотической жидкости, а при воспалении и опухолях в бронхиальном секрете и в маточном смыве. Разница в частоте выявления СБАГ в крови по полу более выражена в детском возрасте: у женщин выше в 1,5-2 раза, чем у мужчин, а у девочек раннего возраста в 4 – 7 раз по сравнению с мальчиками.
  6. Установлено, что СБАГ имеет в крови обезьян полностью идентичный белок, а ТБГ – аналог с низким числом общих детерминант. Уровень СБАГ в некоторых образцах небеременных самок, сопоставимый с концентрацией его у беременных обезьян (20 мг/л), может быть основой для обсуждения эволюционных изменений иммунореактивности организма: ТБГ является более молодым белком в филогенетическом смысле, чем СБАГ, выполняющий важную биологическую роль при вынашивании материнским организмом плода.
  7. Выявлена корреляция между уровнем СБАГ и иммуноглобулинами классов A и G, а также экспериментально доказан иммуносупрессивный эффект СБАГ in vivo на формирование первичного иммунного ответа у мышей, иммунизированных внутрибрюшинно эритроцитами барана. В дозе 25 мг/кг ТБГ снижает число АОК на 59,21 %, СБАГ – на 11,51%. Установлено также, что СБАГ имеет однонаправленные изменения с противовоспалительными цитокинами и разнонаправленные с провоспалительными цитокинами и маркером готовности к апоптозу.
  8. Выявлены сродство СБАГ и ТБГ к гормональным компонентам сорбентов, содержащим эстрогены и, зависимость уровня СБАГ в крови больных с онкогинекологическими заболеваниями от гормонотерапии. Феномен сродства СБАГ к стероидам может быть использован при выделении и очистке белков беременности.
  9. Установлено, что СБАГ является минорным белком сыворотки крови, продукция которого возрастает при ряде физиологических и патологических состояний: воспалении, опухолях, системных заболеваниях у взрослых и детей. Причем, в некоторых случаях (ревматизм, гломерулонефрит и т. д.) его уровень повышается на один-два порядка по сравнению с концентрацией в крови здоровых лиц и достигает величин, сопоставимых с уровнем этого белка при беременности. 

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Трубников Г.А., Никулина Д.М., В.И.Балашов и другие. Роль иммунохимических проб на альфа2-глобулин и гамма-фрагмент фибриногена в диагностике вялотекущего ревматизма. Тезисы Всероссийской научной конференции в Иванове. – 1972. - С.44.
  2. Трубников Г.А., Никулина Д.М. Оценка иммунохимического теста на альфа2- глобулин при ревматизме. Тезисы 55-й научной сессии АГМИ, Астрахань. – 1973. - С.152-153.
  3. Трубников Г.А., Никулина Д.М., Балашов В.И., Рагозин Ю.Е., Кривоносов С.К. Клинико-иммунохимические исследования некоторых острофазовых протеинов при ревматизме // Терапевтический архив. – 1975. №11. - С.55-61.
  4. Трубников Г.А., Никулина Д.М., Кучерова Т.П. и другие Значение некоторых клинических, биохимических и иммунохимических показателей активности ревматического процесса Сборник «Ишемическая болезнь сердца и ревматизм», Волгоград, 1975. – С.120-132.
  5. Л.М.Лунева, В.В.Бочановский, Д.М Никулина и другие. Активносекрктируемые тканевые антигены в сыворотке крови больных лепрой Ученые записки института по изучению лепры, Астрахань. – 1976. – 9 (14). - С.197-200.
  6. Прошина П.П., Никулина Д.М. К вопросу об изучении острофазовых белков и иммуноглобулинов у больных хроническим колитом Труды 2-го Всесоюзного съезда гастроэнтерологов, Л. – 1978. - т.2. - С.430-431.
  7. Трубников Г.А., Грачева Л.Н., Никулина Д.М. и другие. Тканевая антигенемия и вопросы диагностики активности ревматического процесса Сборник тез. докл. 60-ой Юбилейной научной сессии АГМИ. – 1978. - С.36.
  8. Афанасьева А.В., Грачева Л.Н., Никулина Д.М. Липсон Э.Д., Парфенова Л.Ф., Меснянкина Н.В.. Канцероплацентарные антигены при патологии беременности. Сборник «Энзимология новообразований», Саратов, 1981. - С.81-88.
  9. Никулина Д.М., Трубников Г.А., Афанасьева А.В. Яценко К.С., Сухарев А.Е. Сравнительное изучение острофазовых белков в сыворотке крови больных со злокачественными и неопухолевыми заболеваниями легких Сборник «Маркеры опухолей», Саратов. – 1981. - С.64-71.
  10. Николаев А.А., Никулина Д.М. Антонов Н.М., Острофазовые протеины в диагностике опухолей предстательной железы // Лабораторное дело. – 1981. – 4. - С.230-232.
  11. Никулина Д.М., Костина Л.А., Вереина Т.Л., Толстых В.В.,  Краморенко В.А. К вопросу о биологической роли трофобластического бета-1-глобулина и клиническом значении теста на этот белок. Краткие тезисы докладов к 64-й итоговой научной сессии АГМИ. – 1983. - С.41.
  12. Трубников Г.А., Никулина Д.М., Балашов В.И.. Значение иммунохимических тестов на острофазовые белки в оценке эффективности лечения больных с неспецифическими заболеваниями легких. Тезисы к Республиканской конференции «Новые методы диагностики и реабилитации больных НЗЛ», М.-Барнаул. – 1985 - т.1. - С.163-164.
  13. Никулина Д.М. Тезисы докладов к научной конференции «Медицинские проблемы биохимии», Кемерово. - 1985, С.9-11.
  14. Никулина Д.М. Воробьева Т.Б., Костина Л.А., Шульгина А.П. Теоретические и практические аспекты изучения альфа2-глобулина, связанного с беременностью. Тезисы V Всесоюзного биохимического съезда, М. - 1986- т.2.- С.288-289.
  15. Жучкова Л.И., Никулина Д.М. Значение иммунохимического определения некоторых белков сыворотки крови при туберкулезе у детей. Тезисы докладов Х Всесоюзного съезда фтизиатров, Киев. – 1986. - С.80.
  16. Никулина Д.М., Г.А.Трубников, Л.И.Жучкова. Связанный с беременностью альфа2-гликопротеин сыворотки крови как один из показателей реактивности организма у больных с заболеваниями легких. Сборник научных трудов «Реактивность организма и антигенность соединительной ткани при туберкулезе и нетуберкулезных заболеваниях легких», Саратов. – 1986. - С.86-91.
  17. Дербенева Л.И., Никулина Д.М. Клиническая оценка иммунохимического теста на связанный с беременностью альфа2-гликопротеин как показателя острой фазы ревматизма у детей // Вопросы охраны материнства и детства. – 1986. – №12. - С.28-31.
  18. Жучкова Л.И., Никулина Д.М. Винник Л.А., Трубников Г.А. Концентрация связанного с беременностью альфа2-гликопротеина сыворотки крови у больных с различными заболеваниями легких // Проблемы туберкулеза. – 1987. - №3. - сС.57-59.
  19. А.Е.Сухарев, Г.А.Трубников, Н.А.Талукдер, Никулина Д.М., Л.И.Жучкова. Иммунохимическое изучение сывороточных острофазовых белков и тканевых протеинов в мокроте при специфической и неспецифической легочной патологии. Тезисы докладов V1 Всероссийского съезда фтизиатров, Кемерово. – 1987. - С.160-161.
  20. Никулина Д.М. Подходы к выделению и очистке связанного с беременностью альфа2-гликопротеина Тезисы докладов 68-й итоговой научной сессии сотрудников АГМИ и областной научно-практич. конференции врачей, Астрахань. – 1987. - С.201-202.
  21. Белопасова Н.А., Никулина Д.М. Клиническое значение связанного с беременностью альфа2-гликопротеина при заболеваниях легких у детей. Сборник научных работ «Профилактика, диагностика, лечение бронхолегочных заболеваний у детей», Саратов. – 1987. - С.25-28.
  22. Макаревич А.Я., Прошина П.П., Никулина Д.М. Острофазовые белки и иммуноглобулины у больных хроническим колитом Хронические болезни кишечника. Республиканский сборник научных трудов под ред. проф. А.Р.Златкиной, М. – 1987. - С.56-64.
  23. Трубников Г.А., Никулина Д.М., Грачева Л.Н., Николаева Н.Н. Клиническое значение иммунохимического исследования сывороточных и тканевых белков в мокроте при легочной патологии // Терапевтический архив. – 1988. – 12. - С.66-70.
  24. Никулина Д.М., А.П.Шульгина, Ю.Е.Рагозин, А.А.Терентьев, Ю.А.Калинин. Определение биологической роли связанного с беременностью альфа2-гликопротеина Тезисы докладов итоговой научной сессии сотрудников АГМА и областной научно-практической конференции врачей, Астрахань. 1988. - С.181-182.
  25. Никулина Д.М. Колебания уровня связанного с беременностью альфа2-гликопротеина сыворотки крови при воспалительных заболеваниях Тезисы докладов итоговой научной конференции «Биохимия – медицине (молекулярные механизмы формирования патологических состояний)», Ленинград. – 1988. С.147-148.
  26. Никулина Д.М., Аншакова Н.И., Белопасова Н.А., Малометов А.В. Сравнительное изучение острофазовых белков в сыворотке крови детей, проживающих в особо контролируемой зоне Астраханского газового комплекса /АГК/. Тезисы региональной конференции «Экологические проблемы Волги», Саратов, 1989. C.81.
  27. Nikulina D.M., Nikolaev AA., Volodin M.A. Reproductive system antigen in the diagnosis of cancer Abstract book XVII-th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Freiburg. – 1989. - P.79.
  28. Nikulina D.M., Shvarev E.G., Vorobyeva T.B. The defection of pregnancy-associated alpha-2-glycoprotein in oncologic patient’s body fluids. Abstract book XVIII-th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Moscow, 1990. P. 261-263.
  29. Никулина Д.М., Рагозин Ю.Е., Кривенцев Ю.А. Иммунохимическая характеристика фракции «тяжелых» глобулинов сыворотки крови беременных женщин. Тезисы докладов областной научно-практической конференции сотрудников Мединститута и врачей Астраханской обл., Астрахань, 1990. - C.261-263.
  30. Никулина Д.М., Шульгина А.П., Аншакова Н.И., П.А.Иванов. Иммунохимическое изучение некоторых компонентов крови у лиц, работающих на Астраханском газовом комплексе. Тезисы докладов областной научно-практической конференции сотрудников Мединститута и врачей Астраханской обл., Астрахань. – 1990. - C. 271-272.
  31. Nikulina D.M., Trubnikov G.A., Derbeneva L.A. Diagnostic and pathogenetic role of pregnancy-associated alpha2-glycoprotein /a-2-PAG/ in inflammation. Interscience World conference of inflammation Geneva, 1991, P.106.
  32. Белопасова Н.А., Д.М.Никулина, Касаткина Т.И. Диагностическая ценность связанного с беременностью альфа2-гликопротеина как показателя активности воспалительного процесса при  рецидивирующих и хронических заболеваниях легких у детей. Тезисы докладов Всероссийской научной конференции «Современные проблемы диагностики и лечения хронических неспецифических заболеваний легких у детей», М.-Нальчик. – 1991. С. 9-10.
  33. Никулина Д.М. Иммунохимические тесты в диагностике и оценке эффективности лечения воспалительных заболеваний. Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума с международным участием «Патогенез хронического воспаления», Новосибирск. – 1991 - С. 175-176.
  34. Никулина Д.М, Белопасова Н.А., Аншакова Н.И., Шульгина А.П., Иванов П.А., Малометов А.В. Значение ряда иммунохимических тестов в формировании групп риска по воспалительной патологии // Лабораторное дело. - 1991. - №1.- С. 23-27.
  35. Никулина Д.М. Изучение сывороточных иммуноглобулинов и ОФБ у практически здоровых мужчин Тезисы докладов 1 съезда иммунологов России, Новосибирск. - 1992. С. 334-335.
  36. Nikulina D.M., Trubnikov G.A., Vorobyeva T.B. Diagnostic range of pregnancy-associated alpha2-glycoprotein /a2-PAG/ immunochemical test Abstract 1-st International Conference on Immunoreabilitation, Sochi. – 1992. - P. 54.
  37. Nikulina D.M., Vorobjeva T.B., Ivanov P.A. Pregnancy-associated alpha-2-glycoprotein /a2-PAG/ is the humoral immunity component. // Abstracts book of the 22-rd Meeting of the Federation of European Biochеmical Societies (FEBS.), Stockholm, 1993, № 304/809.
  38. Никулина Д.М., Гайнуллина Л.Х., Сахарова Т.В., Степанов Б.Г. Изучение белков беременности приматов. Тезисы докладов юбилейной научно-практической конференции сотрудников АГМИ и врачей Астраханской области, Астрахань. – 1993. – С. 52.
  39. Nikulina D.M., Gainullina L.Ch., Sakharova T.B., Lepekhina L.A., Stepanov B.G. Analogues of human fetoplacental and pregnancy proteins in primates. / In Book of abstracts interscience world conference on inflammation, India, Deli, 1993, Р.45.
  40. Nikulina D.M., Korovina N.A., Lepekhina L.A., Magomedova M.P., Kuznetsov V.P., Beljaev D.L. Kallikrein-kinin System and photolytic enzyme inhibitors in children with tubulointerstitiel nephritis. In Book of abstracts 5th  interscience world conference on inflammation. – Geneva. - 1993.
  41. Nikulina D.M., Ivanov P.A., Stepanov B.G., Vorobyeva T.B., Elaboration of optimal laboratory parameter complex in body reactivity evaluation under mass health examinations. // International J. of Immunorehabilitation, 1994. - №1-Suppl. Р.147-148.
  42. Stepanov B.G., Nikulina D.M., Kriventsev Yu.A., Vorobyeva T.B., Gainullina L.Kh.. Getting antibody to preghensy associated alpha2-glycoprotein. //Abstract book of the 23-rd Meeting of the Federation of European Biochеmical Societies (FEBS Lett.), Basel.-1995. - P.138.
  43. Nikulina D.M., Vereina T.L., Kriventsev Yu.A., Lepekhina L.A., Stepanov B.G. Pregnancy associated blood serum protein immunosuppresive properties. Getting antibody to preghensy associated alpha2-glycoprotein //Abstract book of the 23-rd Meeting of the Federation of European Biochеmical Societies (FEBS Lett.), Basel.-1995. - P.267.
  44. Никулина Д.М. Изучение белков, ассоциированных с репродуктивной функцией и реактивностью организма. Труды АГМА. - Т.I (XXV) (по основным научным направлениям), Астрахань. – 1996. - С. 27-34.
  45. Никулина Д.М., Мамиев О.Б., Воробьева Т.Б., Шульгина А.П., Степанов Б.Г. Диагностика осложненного течения беременности и прогнозирование исхода родов. // Intern. J. of Immunorehabilitation, 1996. - № 2. - P. 309.
  46. Никулина Д.М., Трубников Г.А., Дербенева Л.И., Белопасова Н.А. Новый способ диагностики воспаления. Тезисы докл. обл. научно-практич. конференции, посвященной 120-летию Александро-Мариинской ОКБ №1.Астрахань,1996. – С. 54-55.
  47. Никулина Д.М., Трубников Г.А., Белопасова Н.А., Николаев А.А. Иммунохимические тесты в диагностике и оценке эффективности лечения воспалительных заболеваний Тезисы докл. I Международного конгресса по интегративной медицине, Пафос, Кипр. – 1997. - С. 118-119.
  48. Ржечицкий В.С., Панова Т.Н., Никулина Д.М. Иммунохимическое изучение белков «острой фазы» для дифференциальной диагностики больных с сердечно-сосудистой патологией. Материалы II Всероссийской конференции «Реабилитация больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями».- Москва, 1997. – С. 183.
  49. Nikulina D.M., Rzhechitsky V.N., Agapova A.B. Differetial diagnosis and evaluation of efficacy in rheumatism treatment.// International journal on immunorehabilitation. July Sept. 1998. - № 9. P.19.
  50. Nikulina D.M., Kriventsev Y.A., Lepekhina L.A., Vorobyeva T.B. Functional and physico-chemical parallels of pregnancy proteins. // Tumor Biology. (J.of the Intern.Soc.for Oncodevel. Biol.and Medicine). Abstract book of the ISOBM Meeting, Umea, Sweden. - Tumor Biologi J. -1998. - P. 35.
  51. Никулина Д.М., Агапова А.Б., Шабанов Д.И. Изучение связи между синтезом белков беременности, вынашиванием плода и солнечной активностью. Труды Астраханской гос. медицинской академии (Том XXXVIII). Астрахань: АГМА. – 1999. – С.130-135.
  52. Никулина Д.М., Иванов П.А., Бабаева Е.Е. Корреляция уровня белков острой фазы и некоторых показателей иммунитета // International journal on immunorehabilitation. – 1999. - № 12. – P. 133.
  53. Панова Т.Н., Никулина Д.М., Савельева Л.Н. Иммунохимические тесты в диагностике поражений миокарда. Материалы VI Всероссийского съезда кардиологов. Москва. - 1999. -1с.
  54. Nikulina D.M.- Volodin M.A., Vorobyeva T.B.,.Kostina Yu, Kulikov S..Alpha2-pregnancy associated glycoprotein localization in placental and endometrial tissues // Tumor Biologi, 2000. - 21 (suppl. 1). - P.153.
  55. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Дячина М.Н. Иммунохимические тест-системы для диагностики и оценки эффективности лечения воспалительного процесса. // International journal on immunorehabilitation. - Sotchi. - 2000 - V.2. - №2. - P.12.
  56. Володин М.А., Никулина Д.М., Коханов А.В., Сухарев А.Е. Иммуногистохимическое определение локализации фетоплацентарных и других белков в эмбриональных тканях и в организме взрослого человека. Материалы международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье населения». – Астрахань. 2000. – С. 205-206.
  57. Лепехина Л.А., Никулина Д.М., Сальникова Г.Г. Изучение диагностической значимости иммунохимических тестов на белки острой фазы в оценке эффективности иммунокоррекции. Труды Астраханской Государственной Медицинской Академии, Том 20 (XLIV). Материалы 77-й итоговой научно-практической конференции сотрудников АГМА. Астрахань. – 2001. - С.150-154.
  58. Кривенцев Ю.А., Дячина М.Н., Никулина Д.М. Разработка высокочувствительного метода определения связанного с беременностью альфа2-гликопротеина. Труды Астраханской Государственной Медицинской Академии, Том 20 (XLIV). Материалы 77-й итоговой научно-практической конференции сотрудников АГМА. Астрахань. – 2001. - С. 155-159.
  59. Безрукавникова Н.В., Коханов А.В., Никулина Д.М., Григорьева Т.А Иммунохимические маркеры в клинической оценке дисгормональных заболеваний и гормонзависимых опухолей. Материалы пятой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001». – Медицинская иммунология - С-Пб. – 2001. - Т.3. - №2. – С. 263-264.
  60. Лепехина Л.А., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А. Изучение иммуномодулирующей активности канцероэмбриональных белков in vivo. Материалы V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001». – Медицинская иммунология - С-Пб. – 2001. - Т.3. - №2.
  61. Никулина Д.М. Биологическая роль и диагностический диапазон белков беременности. Материалы конференции молодых ученых с международным участием «Белки-маркеры патологических состояний». – Астрахань-Москва. – 2001. – С. 89-101.
  62. Nikulina D.M., Volodin M.A., Kostina J., Ostroverchova I. Pregnancy proteins localization in placental and endometrial tissues. CECHTUMA 2001.3-rd Central European Conference on Human Tumor Markers. - Czech Republic, Karlovy Vary, 2001, 22th-25th February. Biomarkers and Environment, 2001 - P.68.
  63. Lepechina L.A., Nikulina D.M., Kostina J.M. Study of immunological properties of canceroembryonic proteins in vivo. CECHTUMA 2001.3-rd Central European Conference on Human Tumor Markers. - Czech Republic, Karlovy Vary, 2001, 22th-25th February. Biomarkers and Environment, 2001. - P.40.
  64. Агапова А.Б., Никулина Д.М., Ржечицкий В.Н., Дербенева Л.И., Агапова Н.П. Диагностическое значение продукции минорного альфа2-гликопротеина крови при ревматизме Материалы международной научно-практической школы-конференции "Цитокины. Воспаление. Иммунитет". - С-Пб. - 23-26 июня 2002. - С.157-158.
  65. Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Никулина Д.М., Лепехина Л.А., Бабаянц А.А., Дубенский В.В., Кузнецова С.Ю. Системные и местные воспалительные реакции как показатель депрессии иммунитета и их коррекциия комплексом цитокинов первой фазы иммунного ответа. Материалы международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет». - С-Пб. - 23-26 июня 2002. - С.35.
  66. Иванов П.А., Никулина Д.М., Островерхова И.О., Куликов В.В. Изучение корреляции между уровнем белков острой фазы воспаления и показателями иммунограммы Материалы международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет». - С-Пб. - 23-26 июня 2002. - С.160.
  67. Никулина Д.М., Воробьева Т.Б., Мамиев О.Б., Л.А.Лепехина. Роль белков беременности как компонентов гуморального иммунитета в вынашивании плода и исходе родов. Материалы международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет». - С-Пб. - 23-26 июня 2002. - С.163.
  68. Кчибеков Э.А., Никулина Д.М., Коханов А.В., Кутуков В.Е. Острофазовые белки в диагностике острого холецистита. Сборник трудов Астраханской государственной медицинской академии. - Астрахань. – 2002. – Т.24. – С.70-74.
  69. Мамиев О.Б., Никулина Д.М. К вопросу о биохимических маркерах адаптации плода к родовому стрессу Материалы 4-го Российского научного форума «Охрана здоровья матери и ребенка 2002». – М., «Авиаиздат». – 2002. – С. 232-233.
  70. Никулина Д.М., Лепехина Л.А., Славянская Т.А.. Исследование иммуномодулирующей активности белков беременности in vivo // Аллергология и иммунология. – 2003. – №2.- т.4. - С.155.
  71. Воробьева Ю.А., Никулина Д.М., Иванов П.А., Белопасова Н.А. Изучение маркера апоптоза у детей с воспалительными заболеваниями. Материалы 3 научной конференции и школы-семинара для молодых ученых "Белки-маркеры патологических состояний". - Астрахань-Москва. - 2003. - С.85-88.
  72. Кчибеков Э.А., Никулина Д.М., Коханов А.В., Кутуков В.Е. Иммунохимические показатели в дифференциальной диагностике скрытых форм холециститов. Материалы 3 научной конференции и школы-семинара для молодых ученых «Белки-маркеры патологических состояний». - Астрахань-Москва. - 2003. - С.117-120.
  73. Никулина Д.М., Сентюрова Л.Г., Кривенцев Ю.А, Агапова А.Б., Дьякова О.Н. «Разработка иммунохимических тест-систем для выявления и оценки гипоксических состояний и деструкции тканей в организме человека». (Отчет о НИР по гранту Федерального Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере). - Национальный информационный фонд РФ. - Инвентарный № 02.2.00403489. – 2004. -. 67 с.
  74. Никулина Д.М., Воробьева Ю.А. Воробьева Т.Б. Продукция белков воспаления и рецептора апоптоза при некоторых аутоиммунных заболеваниях Материалы научно-практической конференции и школы-семинара для молодых учёных с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Москва. – 2004. С. 118-123.
  75. Кчибеков Э.А., Никулина Д.М., Кутуков В.Е., Кривенцев Ю.А, Петрова О.В. Мониторинг острофазовых белков при холециститах. Материалы научно-практ. конференции и школы-семинара для мол. учёных с междунар. участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Москва. – 2004. – С. 106-109.
  76. Сентюрова Л.Г., Куликов В.В., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А. Иммуногистохимическое определение локалазации белка беременности в структурах нормального эндометрия и при опухолях. Материалы научно- практической конференции и школы-семинара для молодых учёных с междунар. участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Москва. – 2004. – С. 229-233.
  77. Nikulina D.M., Vorobjeva J.A., Ivanov P.A., Belopasova N.A. Comparative analysis of acute-phase protein apoptosis levels in patient blood. Abstracts book of the XXXII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM). Helsinki (Finland). - 19-23 June 2004. - P.94.
  78. Безрукавникова Н.В., Никулина Д.М. Патогенетическая и клиническая роль белков острой фазы при раке молочной железы // Материалы первой международной ежегодной онкологической конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы» С.-Пб. – 2004. – С. 98.
  79. Безрукавникова Н.В., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Исследование уровня связанного с беременностью альфа2-гликопротеина при раке молочной железы. Материалы II международной ежегодной конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы». С.-Пб. – 2005. – С. 109.
  80. Nikulina D, Miroshnikov V, Ivanov P, Seidov K. Comparative analysis of some humoral components of reactivity in prostate diseases. Abstracts book of the XXXIII Meeting of the ISOBM. - Rhodos, Greece. - 2005. - P.55.
  81. Безрукавникова Н.В., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Кутуков В.В. Определение связанного с беременностью альфа2-гликопротеина при раке молочной железы Материалы 83-й итоговой научно-практич. конференции сотрудников академии, врачей города и области. - Астрахань. - 2005. - Т.31. – С.164-166.
  82. Безрукавникова Н.В., Коханов А.В., Никулина Д.М., Кутуков В.В. Связанный с беременностью альфа2-гликопротеин при различных вариантах рака молочной железы. Материалы III международной ежегодной конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы». С.-Пб – 2006. - С. 56-57.
  83. Воробьева Ю.А., Никулина Д.М., Воробьева Т.Б., Иванов П.А. Сравнительный анализ продукции белков воспаления и рецептора апоптоза при некоторых аутоиммунных заболеваниях у детей // Известия высших учебных заведений Северо-Кавказский регион «Актуальные проблемы диагностики и лечения иммуноопосредованных и аллергических заболеваний» Естественные науки.-2006.-С.14-17.
  84. Савенков М.С., Мустафин Д.Г., Никулина Д.М. Особенности деструктивных форм обтурационного холецистита у пожилых. Сборник трудов юбил. науч.-практич. конференции «Актуальные вопросы геронтологии и гериатрии».-СПб., 2006.- С. 266-268
  85. Никулина Д.М. Постгеномный этап изучения диагностически значимых белков Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». Астрахань-Волгоград- Москва. – 2006. – С.17-19.
  86. Савенков М.С., Петрова О.В., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М. Комплексная лабораторная оценка выраженности воспалительных изменений при обструктивном холецистите // Бюллетень Волгогр. Центра РАМН и администрации Волгогр. Области. – 2006. -№2.-С.51.
  87. Никулина Д.М., Мирошников В.М., Воробьева Ю.А., Воробьева Т.Б., Сеидов К.С., Иванов П.А. Иммунохимические маркеры при воспалительных, аутоиммунных и опухолевых заболеваниях. Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. - С.19-21.
  88. Сентюрова Л.Г., Куликов В.В., Никулина Д.М. Сравнительное иммуногистохимическое исследование содержания общего белка и белка беременности в организме человека. // Естественные науки. – 2007. – №1 (18). –С.78-83.
  89. Безрукавникова Н.В., Никулина Д.М., Кутуков В.В. Стероидсвязывающие белки при морфологических вариантах рака молочной железы. Материалы IV международной ежегодной конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы».- С.-Пб. – 2007. – С.63.
  90. Безрукавникова Н.В., Коханов А.В., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Берштейн Л.М., Кутуков В.В. Стероидсвязывающие белки у больных раком молочной железы // Вопросы онкологии. - 2007.- Т.- 53.- N4. – С.409-413.
  91. Никулина Д.М., Воробьева Т.Б., Кривенцев Ю.А. Стадиоспецифические белки как маркеры развития плода и состояния новорожденного. Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. – Новосибирск. – 2008. – С.474.

Патенты

  1. Никулина Д.М., Ю.С.Татаринов, Г.А.Трубников, Л.И.Дербенева, А.П.Шульгина. Способ определения воспалительного заболевания. Авторское свидетельство на изобретение № 1527589 от 8 августа 1989, патент РФ №1527589 от 25.06.1993.
  2. Никулина Д.М., Мамиев О.Б., Воробьёва Т.Б., Степанов Б.Г. Способ диагностики осложнений беременности и прогнозирования состояния плода и новорожденного. Патент РФ №2120636 на изобретение от 20.10.1998.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.