WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Афиногенова Анна Геннадьевна

микробиологические аспекты

разработки и применения

антисептиков и антисептических средств

для профилактики и лечения раневых инфекций

03.02.03 микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Российский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Р.Р. Вредена» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Елинов Николай Петрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Кочеровец Владимир Иванович

доктор биологических наук, профессор

Рыбальченко Оксана Владимировна

доктор медицинских наук, профессор

Пхакадзе Тамара Яковлевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (г. Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится «____»______ 2011 г. в «____» часов

на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10

Автореферат разослан «____»____________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук                                                О.Ю.  Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время гнойные осложнения повреждений костей и суставов занимают ведущее положение в общей структуре хирургических инфекций и отличаются тем, что часто ведут к длительной, в течение многих лет, инвалидности пострадавшего (Тихилов Р.М., 2008). Микроорганизмы различных таксономических групп, представляющие потенциальную опасность раз­вития инфекционного процесса, обладают рядом свойств, которые с известной долей условности можно разде­лить на несколько групп, первая из которых включает биоцикличность, реактивность, тропность, адаптогенность к условиям внешней среды и репродуктивность. Ко второй группе свойств относятся патогенность, токсинообразование, «чувство кворума» (QS – quorum sensing), которые экспрессируются лишь при наличии к тому определенных условий (Ерюхин И.А., 2003).

Важным свойством микроорганизмов является их способность формировать биопленки, которые образуются возбудителями в процессе большинства гнойно-воспалительных процессов (Donlan R,M., Costerton J.W., 2002). При этом микроорганизмы переносят высокие дозы антибиотиков и проявляют свои вирулентные свойства, приводящие к повреждению тканей организма хозяина, что значительно ограничивает возможность их эрадикации (Артеменко К.Л., 2007; Бехало В.А. и др., 2010).

Рассматривая бактериальную инфекцию на клеточном уровне, можно сказать, что она представляет собой результат взаимодействия бактериальной клетки с клеткой организма хозяина, при этом после необратимого прикрепления (адгезии) бактерий к клеткам хозяина и последующего их заселения (колонизации) формируется первичный микробный очаг.

Факторы патогенности с инвазивной функцией и функцией защиты от фагоцитоза можно объединить в одну группу факторов, обеспечивающих развитие начальной, часто клинически не выраженной, стадии инфекционного процесса – адгезии, колонизации бактерий и формирования бактериальной биопленки. К другой группе факторов патогенности можно отнести биологически активные биомолекулы, проявляющие токсичность возбудителя, обуславливающие синдром заболевания с выраженной клинической картиной, вплоть до летального эффекта (Бондаренко В.М., Вертиев Ю.В., 2008).

Известны немногочисленные публикации, свидетельствующие о влиянии антисептиков на ранние этапы инфекционного процесса в ране, об антимикробном эффекте на популяционном уровне и о чувствительности раневой микробиоты к ним. Особенно перспективны биодеградируемые антисептики и антисептические средства (Афиногенов Г.Е., Елинов Н.П., 1987; Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф., 1993; Russel A.D., 2002; Schwazkopf A., 2003; Kramer A., 2008). В последние годы наиболее эффективными и перспективными считаются антисептики и лекарственные средства на основе полимерных полигексаметиленгуанидинов (Кузнецов Н.А. и др., 2009). Хронические гнойно-воспалительные инфекции, ассоциированные с формированием, так называемых медицинских биопленок, становятся все более распространенными, в том числе, из-за широкого применения имплантатов (катетеров, различных протезов, шовного материала и пр.), в связи с чем разработка препаратов, подавляющих формирование бактериальных биопленок или дезорганизующих уже образованные биопленки, является весьма актуальной проблемой.

Цель исследования разработка критериев отбора антисептиков для лечения ран на разных стадиях раневого процесса и создание изделий медицинского назначения, предупреждающих формирование микробных биопленок.

Задачи исследования:

  1. Изучить влияние естественных нейтрализаторов на антимикробную активность антисептиков.
  2. Оценить антифаговую активность антисептиков из различных химических групп, изучить их возможность блокировать передачу плазмид лекарственной устойчивости в процессе трансдукции у стафилококков.
  3. Выявить влияние полимерных бигуанидинов и бисфосфонатов на устойчивость грамотрицательных бактерий к карбапенемам и цефалоспоринам.
  4. Показать антимикробный и антитоксический эффект высокомолекулярного поливинилпирролидона в эксперименте для профилактики послеоперационного остеомиелита с помощью оригинальной композиции на его основе.
  5. Разработать способы придания с помощью нанокластеров серебра антимикробной активности изделиям медицинского назначения – протезу для герниопластики, биоситаллу, костному цементу, стоматологическим материалам, а также аппликационным сорбентам и дать микробиологическую характеристику их эффективности.
  6. Дать микробиологическую характеристику новой антимикробной композиции на основе природных полимеров (гидролизата коллагена, альгината натрия) и антисептиков и разработать способ лечения воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта, ассоциированных с использованием зубных протезов.
  7. Оценить перспективность применения природных антисептиков в эксперименте.

Научная новизна

Впервые методом «двойных дисков с ЭДТА» выявлена перспективность в качестве эффективных ингибиторов металло-бета-лактамазы (МБЛ) комплексонов, разрешенных для использования в клинической практике (Ксидифон, Бонефос, Унитиол), и антисептика из группы полигексаметиленгуанидинов «ПРОНТОСАН®». Обнаружена неизвестная ранее функция этих препаратов, традиционно используемых в терапии болезней костной ткани, которая открывает новые возможности в борьбе с устойчивыми к антибиотикам бактериями. При этом установлен терапевтический эффект сочетанного применения суббактерицидных концентраций антисептика и комплексонов (бисфосфонатов), которые воздействуют на разные механизмы антибиотикорезистентности Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii (ингибируют МБЛ и бета-лактамазу), что определяет перспективу совместного использования этих препаратов для повышения чувствительности клеток возбудителей к антибиотикам группы карбапенемов и цефалоспоринов.

Впервые получены данные о перспективности  использования природных антисептиков для предупреждения формирования микробных биопленок и для применения их в фазе регенерации и эпителизации раневой поверхности.

Стандартными микробиологическими методами, а также количественным чашечно-суспензионным методом показано, что чувствительность клинических изолятов к антисептикам гораздо выше, чем к антибиотикам, применяемым местно (аминогликозидам, левомицитину и полимексинам), и находится примерно на одном уровне по сравнению с чувствительностью в антибиотикам общего действия. Чашечно-суспензионный метод бактериологического анализа позволяет получать достоверные результаты оценки антимикробной активности различных препаратов при коротких экспозициях от нескольких секунд до 24 часов в присутствии естественных нейтрализаторов.

Разработанные способы придания антисептических свойств изделиям медицинского назначения – протезу для герниопластики, биоситаллу, костному цементу, стоматологическим материалам для изготовления зубных протезов – с помощью антисептиков, антибиотиков и полимеров предупреждают формирование микробных биопленок на поверхности изделия и в ране, что позволяет значительно сократить число инфекционных осложнений и сроки лечения пациентов в травматологии, хирургии, стоматологии.

Теоретическая значимость

Научно обоснована и разработана новая концепция предупреждения формирования микробных биопленок в ранах и на изделиях медицинского назначения при использовании бактерицидных и суббактерицидных концентраций антисептиков, в том числе в антисептических средствах.

Предложены теоретические основы и разработаны методы придания пролонгированной антимикробной активности с помощью антисептиков, антибиотиков и полимеров изделиям медицинского назначения (имплантатам, раневым покрытиям), аппликационным сорбентам, а также окружающим рану тканям с целью профилактики и лечения раневых инфекций.

Практическая значимость

Установлено, что использование метода серийных разведений позволяет одновременно определять собственную противомикробную активность препаратов и их различных сочетаний, а также их способность ингибировать металло-бета-лактамазы клинических штаммов резистентных грамотрицательных бактерий. Показано, что сочетанное применение суббактерицидных доз антисептика «ПРОНТОСАН®» и комплексонов (Бонефоса, Ксидифона) усиливает действие антибиотиков меропенема и цефтазидима в отношении резистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii в 16-1024 раза.

Результаты, полученные на примере препарата «ПРОНТОСАН®» с содержанием бигуанидина 0,1%, подтверждают предположение о важности подавления с помощью полимерных антисептиков адгезивной активности бактерий, инициирующей колонизацию и формирование бактериальной биопленки  возбудителями, а также возможное воздействие антисептика на ферменты патогенности (металло-протеазы условно-патогенных бактерий, нейраминидазу стрептококка, коллагеназу клостридий и др.).

Созданная антимикробная композиция на основе высокомолекулярного ПВП, антибиотика амикацина и антисептика диоксидина обладает пролонгированным действием, высокой антимикробной и антитоксической активностью, способностью локализовать инфекционный очаг и придавать антимикробные свойства окружающим тканям.

Разработанные и внедренные в практику новые изделия медицинского назначения – протез сетчатый антисептический для герниопластики и клей хирургический антисептический «АРГАКОЛ», а также предложенные новые методы придания и пролонгации антимикробных свойств различных медицинских имплантатов и аппликационных сорбентов позволяют предотвращать формирование микробных биопленок на поверхности изделий и в ранах, способствуют снижению числа инфекционных осложнений при хирургическом вмешательстве, ускоряют процесс заживления и предупреждают осложнения открытых ран и слизистых оболочек, перспективны для профилактики и лечения раневых инфекций.

Разработано антимикробное средство на основе водных и водно-спиртовых экстрактов из бересты березы, проведена оценка антиадгезивной активности зубных паст на основе природных антисептиков при коротких экспозициях на модели культуры клеток фибробластов кожи эмбриона человека и дана микробиологическая характеристика нового антисептика Галенофиллипт. Полученные результаты исследований показали, что природные антисептики, даже при больших разведениях, обладают высокой антимикробной и антиадгезивной активностью и низкой токсичностью, что обеспечивает перспективность их применение в фазе регенерации и эпителизации ран.

Внедрение результатов исследования

На основании проведенных исследований оформлено 8 патентов на изобретения:

1. Пат. 2284824 RU, А61Р 31/00. Клей хирургический антисептический «АРГАКОЛ» / Афиногенов Г.Е, Афиногенова А.Г. (RU).  Заявка № 2005107523. Приоритет изобретения 18.03.2005. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.10.2006. Патентообладатель ООО «Сирена».

2. Пат. 2292224 RU, А61К 33/38. Способ изготовления сетчатого протеза с антимикробными свойствами для герниопластики / Басин Б.Я., Афиногенов Г.Е., Пострелов Н.А., Афиногенова А.Г., Кольцов А.И. (RU). Заявка № 2005121826. Приоритет изобретения 11.07.2005. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.01.2007. Патентообладатель коллектив авторов.

3. Пат. 2298036 RU, C12N 5/00. Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента / Афиногенов Г.Е, Тихилов Р.М., Афиногенова А.Г. (RU). Заявка № 2004132319. Приоритет изобретения 04.11.2004. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.04.2007. Патентообладатель ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена Росздрава».

4. Пат. 2314821 RU, A61P 31/00. Антимикробное средство / Никуленкова Т.Ф., Афиногенова А.Г. (RU).  Заявка № 2007102244. Приоритет изобретения 23.01.2007. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.2008. Патентообладатель коллектив авторов.

5. Пат. 2324499 RU, A61L 2/03. Способ профилактики развития гнойных процессов в области послеоперационных костных дефектов / Афиногенов Г.Е., Жирнов В.А., Тараненко М.Ю., Афиногенова А.Г. (RU). Заявка № 2006124960. Приоритет изобретения 11.07.2006. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.05.2008. Патентообладатель ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена Росздрава».

6. Пат. 2343925 RU, А61М 37/00. Способ профилактики послеоперационного остеомиелита / Афиногенов Г.Е., Тихилов Р.М., Афиногенова А.Г., Мироненко А.Н., Богданова Т.Я., Краснова М.В., Козлов И.В., Анисимова Л.О. (RU). Заявка № 2006144370. Приоритет изобретения 12.12.2006. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.2009. Патентообладатель ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена Росмедтехнологий».

7. Пат. 2354389 RU, А61Р 1/02. Способ лечения воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта протетической этиологии / Сапронова О.Н., Кусевицкий Л.Я., Афиногенов Г.Е., Трезубов В.Н., Афиногенова А.Г., Колесов О.Ю., Айвазов Т.Г., Капустин С.Ю. (RU). Заявка № 2007146755. Приоритет изобретения 11.12.2007. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.05.2009. Патентообладатель коллектив авторов.

8. Пат. 2414882 RU, А61К 6/02. Антибактериальный материал для базисов съемных зубных протезов / Семенов С.С., Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Трезубов В.Н., Сапронова О.Н. (RU). Заявка № 2010102999. Приоритет изобретения 01.02.2010. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.03.2011. Патентообладатель коллектив авторов.

Получены регистрационные удостоверения на разработанные изделия медицинского назначения:

1. «Композиция пленкообразующая биодеградирующая антисептическая для лечения ожогов II-IIIа степени, трофических язв, пролежней «АРГАКОЛ». Регистрационное удостоверение МЗ РФ  № ФС 012б2005/1878-05 от 05.07.05, продление – регистрационное удостоверение № ФСР 2010/08285 от 09.07.2010 г.

2. «Протез сетчатый для герниопластики антисептический». Регистрационное удостоверение № ФСР 2007/01388 от 10.12.2007 г.

Результаты проведенных исследований послужили основой лекционного курса и практических занятий, которые внедрены в учебный процесс и лечебную практику СПб ГМА им. И.И. Мечникова: кафедры травматологии, ортопедии и ВПХ с курсом стоматологии (акт о внедрении от 08.06.2011); кафедры хирургических болезней с курсом детской хирургии (акт о внедрении от 08.06.2011); ФГУ «Российский НИИ травматологии и ортопедии им. Р.Р. Вредена» (акт о внедрении от 08.06.2011); СПб ГМУ им. акад. И.П. Павлова: кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии (акт о внедрении от 10.06.2011); кафедры ортопедической стоматологии и материаловедения с курсом ортодонтии (акт о внедрении от 09.06.2011); кафедры травматологии и ортопедии (акт о внедрении от 10.06.2011); ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава (акт о внедрении от 10.06.2011).

Разработанные изделия медицинского назначения внедрены в практическую работу лечебно-профилактических организаций – ГУ СПб НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе (акт о внедрении от 10.06.2011); СПб ГМА им. И.И. Мечникова; ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена».

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Полимерные антисептики из группы полигексаметиленгуанидинов предупреждают формирование микробных биопленок, проявляют антитоксический эффект. Эти антисептики, в том числе в сочетании с комплексонами из группы бисфосфонатов и Унитиолом, ингибируют металло-бета-лактамазу и бета-лактамазу полирезистентных грамотрицательных бактерий, при этом усиливают действие карбапенемов и цефалоспоринов.
  2. Композиция на основе высокомолекулярного поливинилпирролидона, амикацина и диоксидина обладает пролонгированным эффектом, антитоксическими свойствами, способностью локализовать инфекционный очаг и придавать антимикробную активность окружающим рану тканям.
  3. Нанокластеры серебра придают пролонгированную антимикробную активность протезу-сетке для герниопластики, биоситаллу, костному цементу, стоматологическим материалам для изготовления зубных протезов.
  4. Выбор антисептика для применения в клинике должен быть связан со стадией раневого процесса. В период экссудации и инфильтрации необходимо применять антисептики, которые не теряют своей активности в присутствии естественных нейтрализаторов; в фазе регенерации и эпителизации – антисептики с наименьшей токсичностью.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена» 19 октября 2010 г., протокол №8.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 30 различных конгрессах и конференциях, в том числе на Международном конгрессе Европейского общества клинической микробиологии и инфекционных заболеваний (ESCMID, 2000, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология – XXI век», Саратов, 2004; 1-й Европейской конференции по биопленкам «Предотвращение микробной адгезии», Оснабрюк, Германия, 2004; Международных конгрессах МАКМАХ/ESCMID «Антимикробная терапия», Москва, 2005, 2008, 2009, 2010; Итоговом заседании отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области, НИИ микробиологии им. Пастера, 2010.

Публикации

По материалам диссертации опубликована 81 печатная работа, в том числе: в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации – 15 статей, в периодических изданиях – 2 статьи, в сборниках научных трудов и в материалах конференций – 54, в 2 главах в книгах, в патентах на изобретения РФ – 6, монография – 1.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на русском языке и состоит из введения, 9 глав, заключения, выводов, списка литературы. Общий объем диссертации 325 страниц. Работа иллюстрирована 58 таблицами и 82 рисунками. Список литературы включает 276 работ, в том числе 111 – отечественных и 165 – иностранных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Материалы. В исследованиях использовали референс-штаммы и тест-штаммы микроорганизмов, выделенные у пациентов: Staphylococcus aureus 209 Р «Оксфорд» (получен из ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), S. aureus АТСС 6538, Escherichia coli АТСС 25922, E. coli АТСС 1257, E. coli АТСС 35218, Pseudomonas aeruginosa АТСС 15442, P. aeruginosa АТСС 9027, Candida albicans АТСС 10232, C.albicans АТСС 15, Clostridium perfringens 276, Proteus vulgaris АТСС 1459 (из ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича).

Антифаговое действие антисептиков изучали в отношении стафилококковых бактериофагов №№ 80, 85, 53, а для опытов трансдукции использовали штаммы S. aureus (получены от профессора В.С.Зуевой, НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва): 1) штамм 8325-1, служивший реципиентом, обладал хромосомной устойчивостью к стрептомицину; 2) штамм 8325 11de, служивший донором, у которого фактор резистентности к эритромицину (ero) распола­гался внехромосомно (уровень устойчивости 400 мкг/мл). Культура 8325 de была лизогенна по фагу P11.

При оценке ингибирования металло-бета-лактамаз грамотрицательных микроорганизмов контрольным считали штамм Р. aeruginosa АТСС 27853 МБЛ– (из ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича), а рабочими – Р. aeruginosa 804, оцененный методом «двойных дисков с ЭДТА» как МБЛ+ (клинический изолят из коллекции д.м.н. Суборовой Т.Н., кафедра военно-полевой хирургии ВМА им. С.М. Кирова), и Acinetobacter baumannii 4257 (клинический изолят из коллекции отдела раневой инфекции ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена»).

Тест-штамм Streptococcus agalactiae: 1) клинический изолят серотипа IV выделен в России в НИИ акушерства и гинекологии им. Отто с кожных покровов новорожденного с септицемией (О7у/08), продуцирующий белок SspB1 (SspB1+); данный изолят характеризовался выраженной вирулентностью и высокой адгезивной активностью, проверенной на суспензиях вагинального эпителия; 2) изолят 74-430 выделен в США от бактерионосителя СГВ, дефектный по гену SspB1 и не продуцирующий белок SspB1-. Изоляты получены из отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН от д.м.н., профессора А.Н. Суворова.

Тестируемые антисептики, антибиотики, лекарственные препараты

В исследованиях оценивали специфическую активность антисептиков из различных химических групп: полигексаметиленгуанидины, йодофоры, производное оксихинолина (диоксидин), препарат серебра (повиаргол), а также повязки аппликационной углеродноволокнистой сорбирующей, стерильной ПАС-У1, хитозана низкомолекулярного пищевого водорастворимого с молекулярной массой 30 кДа. Тестировали антибиотики из различных химических групп: цефтазидим, имипенем, меропенем, амикацин, ванкомицин; комплексоны (этилендиаминтетраацетат натрия, Бонефос, Ксидифон, Унитиол); природные антисептики Галенофиллипт и Хлорофиллипт; ферменты агрессии бактерий – препарат «Коллализин»; изделия медицинского назначения – протез-сетка из лавсана для герниопластики, биоситалл, порошок костного цемента DePuy CMW-1 Gentamicin 20 g  с содержанием гентамицина 1,7%, порошок зубопротезной пластмассы «Фторакс». В качестве основы для разрабатываемых композиций использовали поливинилпирролидон высокомолекулярный в виде коммерческого препарата Kollidon 90F (фирмы BASF, Германия).

Животные. Оценку токсичности разрабатываемых антисептических средств проводили на кроликах породы «Шиншилла» обоего пола массой 3,0-3,5 кг; мышах линии SHR массой 18,0-20,0 г одного пола; морских свинках массой 250,0-300,0 г; крысах линии Вистар обоего пола массой 150,0–200,0 г на базе вивария ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена». Изучение формирования микробных биопленок на поверхности протеза-сетки для герниопластики проводили в эксперименте на морских свинках массой 250,0-300,0 г на базе вивария СПб ГМА им. И.И. Мечникова.

       Микробиологические методы

Для выращивания микроорганизмов использовали бульон Мюллер-Хинтон для аэробных бактерий, бульон Сабуро, соответствующие плотные питательные среды. В чашечно-суспензионном методе использовали 5% кровяной агар. Исследования с анаэробами (клостридии) проводили в анаэростатах с использованием газ-паков фирмы «Becton Dickinson» (США). В тестах по оценке антимикробной активности антисептиков в присутствии естественных нейтрализаторов использовали эмбриональную бычью сыворотку (ООО «БИОЛОТ», Россия). Инактивацию остаточных количеств антисептиков проводили с помощью универсального нейтрализатора следующего состава: твин-80 3%, сапонин 3%, гистидин 0,1%, цистеин 0,1%. В опытах по изучению трансдукции плазмид лекарственной устойчивости у стафилококков использовали бульон Хоттингера (ООО «БИОЛОТ», Россия) и селективную агаризованную среду (мясо-пептонный агар), содержащую 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл эритромицина или оба препарата одновременно в тех же концентрациях.

Взятие биологического материала из ран и количественное определение микробиоты осуществляли согласно Методическим рекомендациям «Лабораторный контроль противоэпидемического режима стационаров и методика бактериологических исследований при возникновении гнойно-септических инфекций» (Л., 1985).

Выделение и идентификацию возбудителей проводили в соответствии с Приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.85 г. и Приказом № 8 МЗ РФ от 1995 г.

Все работы с микроорганизмами и с культурой клеток фибробластов проводили в ламинарных шкафах II класса фирмы JOUAN, Франция.

Определение видового состава клинических изолятов раневой микробиоты проводили с использованием автомата iEMS Reader-MF (фирмы «ThermoLabsystems», Финляндия) и программ «Микроб-Автомат» и «Микроб-2»© МедПроект-3, а также на микробиологическом автоматическом анализаторе VITEK-2 фирмы «Bio-Merieux» (Франция).

Культуры микроорганизмов хранили в стандартных пробирках Microbankтм с питательной средой (производства фирмы «PRO-LAB Diagnostics», Канада) в холодильнике при –70°С.

       Антимикробную активность тестируемых препаратов оценивали стандартными микробиологическими методами: диско-диффузионным (Методические рекомендации по определению чувствительности микроорганизмов методом диффузии в агар с использованием дисков», М., 1985); двукратных серийных разведений в жидкой среде (А.П. Красильников, 1995; Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»); оценку эффективности антисептиков в присутствии естественных нейтрализаторов проводили количественным чашечно-суспензионным методом в соответствии с методическими рекомендациями № 2003/17 «Чашечный метод оценки эффективности дезинфектантов и антисептиков» (М., 2004).

В работе по оценке ингибирования металло-бета-лактамаз грамотрицательных микроорганизмов использовали фенотипический метод «двойных дисков с этилендиаминтетраацетатом» (Шевченко О.В., Эдельштейн М.В., Степанова М.Н., 2007), а также его модификацию (Lee К. et al, 2001).

Для определения количества частиц фага применяли метод агаровых слоев по Грациа; в опытах по изучению передачи плазмиды ero – метод классического совместного культивирования.

Формирование биопленок оценивали при помощи видеотест-системы «ВидеоТесТ-Морфология», а также по наличию микробного матрикса на поверхности протеза-сетки при просмотре в сканирующем электронном микроскопе JSM-35С (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Физико-химические методы

Для количественной оценки белка в матриксе микробной биопленки использовали метод Лоури (Lowry O.H. et al, 1951).

Сорбционную емкость сорбентов оценивали по метиленовому синему (Решетников В.И., 2003).

Цитологические методы

Для работы с культурой клеток формировали монослой фибробластов в 96-луночных планшетах (Sarstedt, Германия) в ростовой питательной среде Игла в течение 48 часов при 37°С по методике (Грабовская К.Б., Тотолян А.А., 1977; Грабовская К.Б., Афиногенов Г.Е., Копылова Т.В., Тотолян А.А., 1987). Для оценки острого цитотоксического действия (ЦТД) использовали 5-бальную шкалу FDA, США: 0 баллов – отсутствие цитотоксического действия, 1 балл – слабое токсическое действие (20-25% лизированных клеток), 2 балла – мягкое токсическое действие (50% гибели клеток), 3 балла – умеренное токсическое действие (70-75% клеточного монослоя содержат округлые и/или лизированные клетки), 4 балла – тяжелое токсическое действие (100% деструкция клеточного монослоя). В каждом опыте оценивали не менее 100 клеток. Согласно данной шкале тестируемые препараты отвечают требованиям безопасности, если во всех опытных лунках степень ЦТД не более 1 балла (МУ 1.2.1105-02).

Экспериментальные методы

Модель экспериментального остеомиелита воспроизводили по методу Riegels-Nielsen P. et al., 1995. Острую токсичность и общетоксическое действие вытяжек из костного цемента in vivo изучали по методу Дейхмана и Ле Бланка на мышах массой 18,0-20,0 г (Голиков С.Н., Саноцкий Н.В. и др., 1986). Оценку местно-раздражающего действия проводили на морских свинках белой масти обоего пола массой 250,0-300,0 г и на кроликах породы Шиншилла массой 2,5-3,0 кг по МУ 1.2.1105-02.

       Статистическая обработка результатов.

Математическую обработку полученных данных осуществляли с использованием компьютерных программ STATISTICA for Windows v.5.0 (Stat Soft Inc., 1995) (Ойвин И.А., 1960; Стентон Г., 1999; Юнкерова В.И., Григорьева С.Г., 2002), рассчитывая среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической, доверительный интервал. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (уровень значимости Р<0,05).

Микробиологические исследования выполнены под руководством и при личном участии автора в отделении профилактики и лечения раневой инфекции ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена». Экспериментальные и патоморфологические исследования проведены при содействии сотрудников и руководителя экспериментально-морфологического отделения д.м.н. Г.И. Нетылько. Электронную микроскопию проводили совместно с в.н.с. И.Л. Потокиным (лаборатория электронной микроскопии ГНИИОЧБ ФМБА); гистологические и клинические исследования протеза сетчатого для герниопластики – совместно с проф. Н.А. Постреловым (кафедра хирургических болезней с курсом детской хирургии СПБ ГМА им. И.И. Мечникова); клиническая апробация антисептической композиции «АРГАКОЛ» в стоматологии – совместно с профессором, Заслуженным деятелем науки В.Н. Трезубовым (кафедра стоматологии и материаловедения с курсом ортодонтии СПб ГМУ им. акад. И.П. Павлова).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка перспективности применения антисептиков в клинических условиях

Чашечно-суспензионный метод бактериологического анализа позволяет получать достоверные результаты оценки антимикробной активности различных препаратов при коротких экспозициях от нескольких секунд до 24 часов в присутствии естественных нейтрализаторов, что, в свою очередь, способствует рациональному использованию клиницистами эффективных и нетоксичных средств. Критерием эффективности антисептика при этом служит коэффициент снижения числа тест-микроорганизмов – Кред (коэффициент редукции). Он выражается в десятичных логарифмах и характеризует порядок уменьшения контаминации в результате воздействия антисептика при заданной экспозиции. Достаточной считают эффективность антисептиков при Кред ≥ 1. По результатам исследований (табл.1) можно говорить о высокой противомикробной активности антисептиков различных химических групп, антибиотика амикацина и антисептического геля «АРГАКОЛ». Коэффициент редукции во всех случаях составил от 3,5 до 9,5 lg.

Впервые методом «двойных дисков с ЭДТА» выявлена перспективность комплексонов в качестве эффективных ингибиторов МБЛ. Наибольшим ингибирующим действием в отношении металло-бета-лактамазы P. aeruginosa, сходным с ЭДТА, обладают комплексоны бисфосфонаты (например, дифосфоновая, метиленфосфоновая кислоты) и  Унитиол.

Использование метода серийных разведений позволило одновременно определять собственную противомикробную активность препаратов и их различных сочетаний, а также их способность ингибировать МБЛ клинических штаммов резистентных грамотрицательных бактерий. Полученные данные свидетельствуют о высоком уровне устойчивости штамма P. aeruginosa 804 МБЛ+ к меропенему, а также о наличии бактериостатического и бактерицидного действия комплексонов Унитиол, Ксидифон, Бонефос, антисептика «ПРОНТОСАН®» в отношении штаммов P. aeruginosa 804 МБЛ+ и A. baumannii 4257. В наших исследованиях показано, что сочетанное применение мерапенема или цефтазидима с суббактерицидными концентрациями антисептика «ПРОНТОСАН®» и комплексонов усиливает действие антибиотика (табл.2-3).

Показано, что в отношении штамма P. aeruginosa 804 МБЛ+ действие антибиотика меропенема в присутствии суббактерицидной концентрации препарата «ПРОНТОСАН®» усиливается в 8 раз, при добавлении к смеси в суббактерицидной концентрации Унитиола – в 16 раз, Бонефоса – в 512 раз, Ксидифона – в 1024 раза. Наилучшие результаты в усилении действия цефтазидима наблюдали при его сочетании с суббактерицидными концентрациями препарата «ПРОНТОСАН®» и Ксидифона – в 85 раз, препарата «ПРОНТОСАН®» и Бонефоса – в 43 раза. Сочетанное применение цефтазидима и препарата «ПРОНТОСАН®» усиливало действие антибиотика в 11 раз (различия достоверны, Р<0,05). В случае использования препарата «ПРОНТОСАН®» с Унитиолом не наблюдали усиления действия цефтазидима (различия не достоверны, Р>0,05).

В отношении штамма A. baumannii 4257 действие антибиотиков меропенема и цефтазидима (табл.3) достоверно усиливалось в сочетаниях с антисептиком «ПРОНТОСАН®», Ксидифоном и Бонефосом в 85-170 раз (P<0,05). Сочетанное применение меропенема или цефтазидима с антисептиком и Унитиолом достоверно не усиливало действие соответствующего антибиотика (Р>0,05).

Таким образом, в исследованиях показано, что сочетанное применение мерапенема или цефтазидима с суббактерицидными концентрациями антисептика «ПРОНТОСАН®» и комплексонов значительно усиливает действие антибиотика (до уровня чувствительного штамма). Полученные результаты позволят клиницистам эффективно использовать сочетанное применение антибиотиков общего действия, антисептиков и комплексонов для терапии инфекций, вызванных антибиотикорезистентными неферментирующими грамотрицательными бактериями.

Таблица 1 – Определение антимикробной активности антисептиков, амикацина, антисептических средств (чашечно-суспензионный метод, 37С, экспозиция 60 мин)

Препарат

Коэффициент редукции (Кред)

в отношении соответствующего тест-штамма

S. aureus АТСС 6538 (микробная нагрузка 109 КОЕ/мл)

E. coli

АТСС 25922 (микробная нагрузка 109 КОЕ/мл)

P. aeruginosa АТСС 15442 (микробная нагрузка 109 КОЕ/мл)

C. albicans

АТСС 10231

(микробная нагрузка 107 КОЕ/мл)

Контроль

lg Nо 9,52

Контроль

lg Nо 9,18

Контроль

lg Nо 9,24

Контроль

lg Nо 7,5

К ред

К ред

К ред

К ред

Клей хирургический «АРГАКОЛ»

4,81

4,5

4,42

3,9

Диоксидин 1%

5,83

9,18

9,24

3,9

Катапол 0,5%

5,77

6,62

6,61

7,5

Амикацин 1%

9,52

9,18

9,24

3,88

Повиаргол 5%

4,98

4,88

4,89

7,5

ТефлексА

0,4% ПГМГ

5,81

4,86

6,49

7,5

Лавасепт®

0,4% ПГМГ

9,52

9,18

9,24

7,5

Пронтосан®

0,1% ПГМГ

5,81

4,86

6,49

7,5

Хлоргексидина биглюконат 0,05%

5,11

5,17

5,25

7,5

Препарат

Контроль

lg Nо 9,3

Контроль

lg Nо 9,32

не изучали

Контроль

lg Nо 7,6

К ред

К ред

не изучали

К ред

ПВП 10% + Диоксидин 1% + Амикацин 1%

9,3

9,32

не изучали

4,95

Таблица 2 – Значения МБцК антибиотиков в сочетаниях с другими лекарственными средствами в отношении штамма Pseudomonas aeruginosa 804 МБЛ+

Антибиотики в сочетании с другими лекарственными средствами в суббактерицидных концентрациях

МБцК антибиотика, мкг/мл (n = 5)

Усиление действия антибиотика

Меропенем

1843,2 ± 197,1

-

Меропенем + «ПРОНТОСАН®»

230,4 ± 24,6

в 8 раз

Меропенем + «ПРОНТОСАН®» + Унитиол

115,2 ± 12,3

в 16 раз

Меропенем + «ПРОНТОСАН®» + Ксидифон

1,8 ± 0,2

в 1024 раза

Меропенем + «ПРОНТОСАН®» + Бонефос

3,6 ± 0,4

в 512 раз

Цефтазидим

153,6 ± 24,6

-

Цефтазидим + «ПРОНТОСАН®»

14,4 ± 1,5

в 11 раз

Цефтазидим + «ПРОНТОСАН®» + Унитиол

115,2 ± 12,3

в 1,3 раза

Цефтазидим + «ПРОНТОСАН®» + Ксидифон

1,8 ± 0,2

в 85 раз

Цефтазидим + «ПРОНТОСАН®» + Бонефос

3,6 ± 0,4

в 43 раза

Таблица 3 – Значения МБцК антибиотиков в сочетаниях с другими лекарственными средствами в отношении штамма Acinetobacter baumannii 4257

Антибиотики в сочетании с другими лекарственными средствами в суббактерицидных концентрациях

МБцК антибиотика, мкг/мл (n = 5)

Усиление действия антибиотика

Меропенем

307,2 ± 49,3

-

Меропенем + «ПРОНТОСАН®»

28,8 ± 3,1

в 11 раз

Меропенем + «ПРОНТОСАН®» + Унитиол

115,2 ± 12,3

в 2,3 раза

Меропенем + «ПРОНТОСАН®» + Ксидифон

1,8 ± 0,2

в 170 раз

Меропенем + «ПРОНТОСАН®» + Бонефос

3,6 ± 0,4

в 85 раз

Цефтазидим

307,2 ± 49,3

-

Цефтазидим + «ПРОНТОСАН®»

14,4 ± 1,5

в 21 раз

Цефтазидим + «ПРОНТОСАН®» + Унитиол

115,2 ± 12,3

в 3 раза

Цефтазидим + «ПРОНТОСАН®» + Ксидифон

3,6 ± 0,4

в 85 раз

Цефтазидим + «ПРОНТОСАН®» + Бонефос

1,8 ± 0,2

в 170 раз

При оценке количества частиц фага методом агаровых слоев по Грациа пре­параты на основе бисгуанидинов (ТефлексА и хлоргексидина биглюконат 0,05%) снижали титр бактерио­фагов на 4 lg в концентрации 0,1%; в концентрации 0,01% оба тестируемых препарата снижали титр на 2 lg; в концентрации 0,001% только препарат ТефлексА прояв­лял слабое антифаговое действие, снижая титр на 1 lg. Йодофоры (Йодонат, Монклавит) снижали титр бакте­риофагов на 4-6 lg в концентрациях 0,1-0,001%.

В исследованиях по подавлению трансдукции плазмиды ero использовали суббактерицидную концентрацию Монклавита 0,0125%, поскольку именно в этой дозе он оказывал антифаговое действие. Аналогичный эффект бисгуанидинов наблюдали только в бактерицидных концентрациях. Частоту передачи вычисляли по отноше­нию числа клеток трансдуктантов к числу клеток реципиентов в 1 мл. Из результатов исследований следует, что новый отечественный антисептик Монклавит (йод на основе высокомолекулярного ПВП) в суббактерицидной концентрации в 1000 раз снижал частоту передачи внехромосомного фактора устойчивости к эритромицину у стафилококков. Таким образом, можно предположить, что снижение интенсивности передачи плазмиды ero йодофорами в значительной мере связано с антифаговым действием суббактерицидных доз этих препаратов. Есть вероятность, что антисептики, обладающие антифаговой активностью в дозах 0,1%-0,001% (по препарату), в клинических дозах будут снижать частоту переда­чи плазмид устойчивости в стафилококковых популяци­ях на коже и слизистых оболочках. А также они смогут препятствовать формированию «островов патогенности» у микроорганизмов.

Перспективность применения полимерных антисептиков бисгуанидинов

Модель культуры клеток фибробластов кожи эмбриона человека (Грабовская К.Б., Тотолян А.А., 1977; Грабовская К.Б., Афиногенов Г.Е., Копылова Т.В., Тотолян А.А., 1987) адекватна для изучения адгезивных свойств микроорганизмов и формирования ими микробной биопленки, а также для оценки антитоксического и антиадгезивного эффекта антисептиков и антисептических средств. Такая модель позволяет оценить специфическую активность антисептиков одновременно в отношении большого числа патогенов, которые могут участвовать в формировании микробных биопленок на поверхности ран и изделиях медицинского назначения, в условиях, максимально приближенных к условиям макроорганизма.

Было показано, что в присутствии суббактерицидных доз антисептика «ПРОНТОСАН®» и всех тестируемых микроорганизмов (S. aureus, P. aeruginosa, P. vulgaris, S. agalactiae генотипа SspB1+) монослой фибробластов полностью сохранялся. Из результатов исследований следует, что полимерные антисептики влияют на фенотипические маркеры вирулентности условно-патогенных микроорганизмов: адгезины и факторы колонизации. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения антисептиков из класса полигексаметиленбигуанидинов для профилактики и лечения раневых инфекций.

Заслуживает внимания эффект препарата «ПРОНТОСАН®» в отношении формирования биопленки клиническим штаммом Streptococcus agalactiae – клиническим изолятом серотипа IV, характеризующимся высокой адгезивной активностью и продуцирующим белок SspB1+. В контрольных опытах без антисептика через 2 часа инкубации монослой был разрушен ферментами агрессии стрептококка (рис.1-2). В это же время, в присутствии антисептика монослой полностью сохранялся (рис.3-4). Необходимо отметить, что антиадгезивный и антитоксический эффект у препарата «ПРОНТОСАН®» проявлялся в суббактерицидной дозе 0,25 мкг/мл, что в 4000 раз меньше клинической (0,1% бисгуанидина соответствует дозе 1000 мкг/мл препарата), что свидетельствует о пролонгированном действии средства.

Рис. 1 – Состояние монослоя клеток фибробластов кожи эмбриона человека (1) после воздействия S. agalactiae SspB1+ (2) в течение 30 минут. Окраска по Романовскому-Гимза, х630.

Рис. 2 – Состояние монослоя клеток фибробластов кожи эмбриона человека (1) после воздействия S. agalactiae SspB1+ (2) в течение 2 часов. Окраска по Романовскому-Гимза, х1000, имерсия.

Рис. 3 – Состояние монослоя клеток фибробластов кожи эмбриона человека (1) после воздействия S. agalactiae SspB1+ (2) в течение 30 минут в присутствии дозы 0,25 мкг/мл «ПРОНТОСАН®». Окраска по Романовскому-Гимза, х1000, имерсия.

Рис. 4 – Состояние монослоя клеток фибробластов кожи эмбриона человека (1) после воздействия S. agalactiae SspB1+ (2) в течение 2 часов в присутствии дозы 0,25 мкг/мл «ПРОНТОСАН®». Окраска по Романовскому-Гимза, х1000, имерсия.

Оценка антитоксического эффекта высокомолекулярного поливинилпирролидона в эксперименте и разработка способа профилактики послеоперационного остеомиелита с помощью антимикробной композиции на его основе

Предварительные опыты на модели дермонекроза у кроликов показали перспективность использования полимерного носителя высокомолекулярного ПВП, который обладает антитоксическим эффектом в отношении факторов агрессии стафилококка золотистого, а также способностью локализовать инфект в ране. Важно отметить, что смесь амикацина, диоксидина и полимера обладает высокой антимикробной активностью при коротких экспозициях (табл.1).

Эффективность разработанной антимикробной композиции оценивали на модели экспериментального острого послеоперационного остеомиелита. Костные дефекты у кроликов заполняли 0,1N раствором NaOH (50 мкл) для получения поверхностного некроза кости. Через 1 минуту отверстия заполняли 0,5 мл микробного инокулята S. aureus 209 Р «Оксфорд» с микробной нагрузкой 2х108 КОЕ/мл; спустя еще 2 минуты вводили 0,1 мл полимерной композиции. Затем в отверстия устанавливали отрезки спиц Киршнера и дополнительно вводили 0,5 мл микробного инокулята поверх спиц. Лекарственную композицию общим объемом 5 мл дополнительно распределяли поверх спиц и послойно по мере ушивания раны. Кожу после наложения швов обрабатывали 5% спиртовым раствором йода и накладывали стерильные повязки. В таблице 4 приведены данные по оценке микробной обсемененности костного мозга и мягких тканей, окружающих рану, у экспериментальных животных в динамике, а также данные по контаминации спиц Киршнера стафилококком. Отмечены следующие закономерности: на 7 сутки после операции обсемененность мышечной ткани и костного мозга у животных контрольной группы была на 3 порядка выше, чем у животных опытной группы; на 14 сутки – на 2 и 3 порядка соответственно. На 21 сутки наблюдения у животных опытной группы отмечено отсутствие роста стафилококка, в то же время у животных контрольной группы микробная контаминация оставалась высокой – 105 КОЕ/г в мышцах и 102 КОЕ/г в костном мозге (P<0,05). У животных контрольной группы контаминация спиц Киршнера стафилококком сохранялась до 21 суток наблюдения, а у животных опытной группы – только до 7 суток.

В таблице 5 приведены величины зоны задержки роста культуры S. aureus 209 P «Оксфорд» у гомогенизированных тканей, свидетельствующие о наличии антимикробной активности костного мозга, костной ткани и окружающих рану мягких тканей.

Таблица 4 – Показатели контаминации бактериальными клетками S. aureus 209 Р Оксфорд тканей и спиц Киршнера

Объект исследования

Микробная обсемененность тканей (КОЕ/г), n=2

Контроль без лечения

Опыт

7 сутки

14 сутки

21 сутки

7 сутки

14 сутки

21 сутки

Мышечная ткань

1,5±0,6

х 106

4,1±0,8

х 104

2,3±0,1

х 105

4,55±0,8

х 103

6,0±0,6

х 102

0

Костный мозг

2,4±0,2

х 105

1,8±0,5

х 105

1,2±0,09

х 103

7,5±0,3

х 102

6,0±0,7

х 102

0

Спицы Киршнера

есть рост

S. aureus

есть рост

S. aureus

есть рост

S. aureus

есть рост

S. aureus

нет роста

S. aureus

нет роста

S. aureus

Таблица 5 – Оценка антимикробной активности костного мозга и окружающих рану тканей у экспериментальных животных после операции (методом диффузии в агар)

Объект исследования

Зона задержки роста S. aureus 209 P «Оксфорд», мм

7 сутки

(n=6)

14 сутки

(n=4)

21 сутки

(n=2)

Костный мозг

20,0 ± 1,1

20,0 ± 0,8

13,1 ± 1,2

Мышца

20,0 ± 2,2

13,2 ± 2,3

6,1 ± 0,4

Кость

не изучали

не изучали

11,1 ± 1,5

Установлено, что антимикробная активность препаратов в составе лечебной композиции сохранялась в биосубстратах  (костном мозге, костной и мышечной ткани) до 21 суток. Максимальные зоны задержки роста зафиксированы на 7-14 сутки наблюдения при исследовании ткани костного мозга и мышечной ткани. Различия в показателях зоны задержки роста на разные сроки в опытах с костным мозгом были не достоверны (Р>0,05). К 21 суткам наблюдения в опытах с мышечной тканью зона задержки роста несколько уменьшилась (отличия от аналогичных показателей на сроки 7 и 14 суток достоверны, Р<0,05). Важно отметить, что исследуемая полимерная композиция, постепенно растворяясь, находилась в костном мозге и мягких тканях до 21 суток, не проявляя отрицательного воздействия на них. Можно предположить, что постепенная деградация полимера происходит за счет его окисления О2-радикалами до момента, когда остатки ПВП могут выводиться из организма, например, почками (при молекулярной массе не более 80000). Таким образом, результаты проведенных исследований демонстрируют наличие противомикробной и противовоспалительной активности изучаемой полимерной композиции при однократном применении с целью профилактики острого послеоперационного остеомиелита.

Разработка способа придания антисептической активности изделиям медицинского назначения с помощью нанокластеров серебра

Разработанное изделие медицинского назначения – протез для герниопластики представляет собой сетку из лавсана, покрытую антимикробной композицией из повиаргола с ПВП высокомолекулярным из расчета 1% повиаргола на 1 см2 сетки. В течение 3-х недель еженедельно оценивали скорость формирования микробной биопленки в контроле (сетка без повиаргола) и в опыте (сетка с повиарголом) по количеству КОЕ/см2 и белка по Лоури в питательной среде (методом титрования с последующим высевом на плотные питательные среды) и на поверхности сетки. В контрольных планшетах (in vitro) наблюдали значительный рост инфекта в питательной среде после инкубации сетки без антимикробного состава: к концу 1 недели – до 109 КОЕ/мл; к концу 2 недели – до 1010 КОЕ/мл; к концу 3 недели – до 1011 КОЕ/мл. В отличие от этого, в опытных планшетах с сеткой, пропитанной антимикробным составом, не наблюдали роста тест-штамма в питательной среде в течение 3-х недель. После имплантации протеза сетчатого с повиарголом и без него в эксперименте in vivo (на морских свинках) проводили изучение формирования микробной биопленки S. aureus 209 Р «Оксфорд» в гомогенизате с поверхности сетки. Проведенными исследованиями показано, что на контрольной сетке формировалась микробная биопленка S. aureus 209 Р «Оксфорд»: на 1-ый день – 103 КОЕ/см2, на 3-ий – 106 КОЕ/см2, на 5-ый – 109 КОЕ/см2. Образцы сетки с повиарголом на 1-ый, 3-ий, 5-ый дни были стерильны и, при исследовании методом диффузии в агар, обладали антимикробным эффектом в отношении культуры S. aureus. Оценивали также формирование биопленки по наличию микробного матрикса на поверхности сетки при просмотре в системе «ВидеоТесТ-Морфология» (рис.5-6), а также в сканирующем электронном микроскопе (рис.7-8).

Рис. 5 – Формирование микробной биопленки стафилококка (1) между нитями сетки без повиаргола через 5 суток в опытах in vivo, окраска гематоксилином и эозином, х400

Рис. 6 – Отсутствие микробной биопленки стафилококка между нитями сетки с повиарголом через 5 суток в опытах in vivo, окраска гематоксилином и эозином, х200

Рис. 7 – Формирование микробной биопленки S. aureus  209 Р «Оксфорд» на поверхности лавсановой сетки без повиаргола in vivo в течение 3 недель, 4000, сканирующий электронный микроскоп JSM-35С (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Рис. 8 – Отсутствие формирования микробной биопленки S. aureus  209 Р «Оксфорд» на поверхности лавсановой сетки с повиарголом in vivo в течение 3 недель, 2000, сканирующий электронный микроскоп JSM-35С (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Показана эффективность насыщения пористых стеклокристаллических имплантатов повиарголом с использованием метода электрофореза. При изучении антимикробной активности установлено, что у биоситалла, насыщенного повиарголом по предлагаемой методике, она оказалась значительно выше, чем в контроле, то есть у имплантатов, в которые антисептик вводили методом инфузии. Наиболее эффективным является применение 3% раствора повиаргола при экспозиции электрофореза 30 и более минут. Применение имплантатов из биоситалла, насыщенных повиарголом с помощью электрофореза, позволяет создавать внутри инфицированной костной раны длительный антибактериальный эффект в течение 22 суток и более. Клинические результаты показали, что имплантируемый биоситалл с повиарголом, способен не только эффективно и стойко купировать гнойно-воспалительный процесс в костях, но и позволяет добиться реституционального пути замещения костного дефекта.

Вытяжку готовили из образцов костного цемента: (1) с 1,7% гентамицина, (2) с 1,7% гентамицина и 6% ванкомицина или (3) с 1,7% гентамицина, 5% повиаргола и 5% ПВП, выдерживая их 24 часа в физиологическом растворе при температуре 42°С (условия «ускоренного старения» по И-42-2-82); посевы на агар Мюллер-Хинтон проводили каждые 14 суток в течение 3 месяцев, а затем – каждые 7 суток. Для изучения антимикробного действия использовали метод диффузии в агар, оценивая величину зоны задержки роста тест-штамма  S.  aureus  AТCC 6538. Микробная нагрузка составила 106 КОЕ/мл. Посевы инкубировали при 37оС в течение 24 часов. Результаты сравнительной оценки антимикробной активности вытяжек из различных образцов костного цемента представлены в таблице 6.

Таблица 6 – Сравнительная оценка антимикробной активности вытяжек из образцов костного цемента

Срок испытания вытяжки (сутки)

Зона задержки роста S. aureus  AТCC 6538, мм

Вытяжка (1)

Вытяжка (2)

Вытяжка (3)

1

25 ± 0,1

25 ± 0,1

30 ± 0,2

14

20 ± 0,1

20 ± 0,1

31 ± 0,2

28

25 ± 0,2

25 ± 0,2

25 ± 0,3

42

22 ± 0,3

22 ± 0,3

30 ± 0,3

56

13 ± 0,2

13 ± 0,2

22 ± 0,2

112

0

0

24 ± 0,3

268

0

0

13 ± 0,2

Примечание: в каждом исследовании n=5, различия показателей в каждой группе не достоверны (P>0,05).

Показано, что введение ванкомицина в композицию костного цемента с гентамицином не усиливает антимикробное действие костного цемента, тогда как введение повиаргола и ПВП пролонгирует антимикробный эффект до 1 года. Учитывая изученное антитоксическое действие высокомолекулярного ПВП и способность его медленно растворяться в ране, мы использовали сочетание ПВП с нанокластерами серебра для пролонгации антимикробного эффекта костного цемента. Полученные нами результаты показали перспективность данного направления исследований. Особенно в плане создания спейсеров, обладающих пролонгированными антимикробными свойствами в период до момента реэндопротезирования суставов.

Для придания антисептической активности стоматологическим материалам расчетное количество повиаргола вводили в пудру акрилового полимера «Фторакс», распределяли по всей массе полимера при постоянном перемешивании и высушивали. Затем готовили пластмассовое «тес­то», смешивая полученный модифицированный акриловый полимер с мономером. Далее методом высокотемпературной полимеризации получали образцы – диски диаметром 10,6 мм и толщиной 13 мм для визуальной оценки цвета полимера и проведения микробиологических исследований. Вышеуказанным способом были получены по 20 штук образцов с содержанием наносеребра:  0,0001 мас.%, 0,0005 мас.%, 0,002 мас.%, 0,01 мас.%, 0,03 мас.%, 0,04 мас.%. В качестве контроля готовили образцы дисков из акриловой пластмассы без добавления повиаргола (20 штук). Оценку антимикробной активности дисков проводили чашечно-суспензионным методом. Образцы дисков хранили методом «ускоренного старения» (И-42-2-82) с последующим высевом дисков по вышеуказанной методике. В качестве тест-щтамма использовали S. aureus 209 Р «Оксфорд» с микробной нагрузкой 103 КОЕ в 0,1 мл, экспозиция составила 24 часа. Контроль посевов осуществляли на 1-ые сутки после получения образцов дисков, на 30, 60, 90, 125, 185 и 250 сутки. Установлено, что верхний предел содержания наносеребра в полимере для создания базисов зубных протезов целесообразно ограничивать 0,03 мас.%. Образцы с содержанием наносеребра 0,0001 мас.% не оказывали антибактериального действия в отношении тест-штамма S. aureus на 1-ые и 30-ые сутки после приготовления (Кред 0). Диски с содержанием наносеребра 0,0005 мас.% имели незначительный антимикробный эффект до 30 суток (Кред 1); с содержанием наносеребра 0,002 мас.% – до 60 суток (Кред 1); с содержанием наносеребра 0,01 мас.% – до 125 суток (Кред от 2 до 1). Диски с содержанием наносеребра 0,03 мас.% имели выраженный антимикробный эффект до 250 суток (Кред от 3 до 2). Таким образом, разработанный нами стоматологический материал на основе акриловых полимеров, содержащий в своем объеме равномерно распределенное нанокристаллическое серебро в количестве 0,03 мас.%, оказывает выраженное антибактериальное действие и отвечает эстетическим требованиям при изготовлении базисов зубных протезов.

Оценка антитоксических свойств сорбентов и разработка способа придания им антисептической активности

Исследования по оценке активности сорбентов, в том числе в присутствии ферментов агрессии бактерий, проводили на примере углеволокнистого сорбента (УВС) и хитозана. На модели культуры клеток фибробластов кожи эмбриона человека оценивали уровень сорбции микроорганизма по степени уменьшения его адгезии в отсутствии и присутствии фермента агрессии в отношении тест-штамма суточной культуры S. aureus 209 Р «Оксфорд» в дозе 108 КОЕ/мл. В качестве фермента агрессии тестировали максимальную дозу коллагеназы 900 КЕ в виде стандартного коммерческого препарата «Коллализин» (коллагеназа Clostridium histolyticum), разведенного на среде Игла до соответствующих концентраций. Присутствие сорбентов (УВС и хитозана) предотвращало адгезию стафилококка золотистого на 25% и 33% соответственно (отличия от контроля достоверны, Р<0,05). В присутствии коллализина уровень адгезии S. aureus увеличился в 4,5 раза. Сорбенты предотвращали микробную адгезию в присутствии токсиканта, что позволило оценить уровень сорбции самого коллализина (различия между опытом и соответствующим контролем достоверны, Р<0,05). В исследованиях показано, что уровень сорбции самого токсиканта был обратно пропорционален его дозе; чем выше доза коллагеназы, тем меньше процент ее сорбции сорбентом. Из результатов проведенных исследований следует, что применение аппликационных сорбентов способствует снижению уровня микробной адгезии, сорбции факторов агрессии бактерий и сохранению целостности монослоя фибробластов в культуре.

Для придания бактерицидных свойств углеволокнистому сорбенту ПАС-У использовали водные растворы – 1% диоксидина, 1% повиаргола, 1% амикацина, смеси 1% диоксидина и 1% повиаргола, смеси 1% диоксидина и 1% амикацина. Пропитка антимикробными агентами сорбента снижала сорбционную емкость аппликационной повязки в 2-4 раза. Наибольшая сорбционная емкость по метиленовому синему отмечена у сорбентов, пропитанных 1% диоксидином, 1% амикацином или их смесью; наименьшая – у сорбента, пропитанного 1% повиарголом. Пропитанная сорбционная повязка обладала высокой бактерицидной активностью в отношении тест-культур микроорганизмов как аэробов, так и анаэробов. Наибольшие зоны задержки роста и значения Кред получены при посеве образцов сорбента, пропитанных амикацином, диоксидином или их смесью. Это подтверждает, что сорбция самих антимикробных агентов аппликационной повязкой не является необратимой.

Микробиологическая характеристика и клиническое применение новой антимикробной композиции

Разработанное изделие медицинского назначения – клей хирургический антисептический «АРГАКОЛ» – содержит в своем составе: гидролизат коллагена, натриевую соль альгиновой кислоты, антисептики – катапол, диоксидин, повиаргол, глицерин, гипохлорит натрия (до 100), консерванты – нипагин, нипазол. Из результатов оценки антимикробной активности клея в отношении референс-штаммов микроорганизмов следует, что показатели МБцК препарата значительно ниже терапевтических доз используемых антисептиков в клее (в 10000-30000 раз), а коэффициент редукции во всех случаях составил от 3,9 до 4,81 lg.

Изучали влияние клея «АРГАКОЛ» на заживление ран у белых беспородных крыс в 2-х сериях опытов, по 10 крыс в каждой: на модели свежей контаминированной раны (1-ая серия) и на модели инфицированной раны при отсроченном применении клея (через 3 суток) после нанесения травмы (2-ая серия). В результате показано, что через 2 суток выраженность воспалительного процесса в области ран 1-ой и 2-ой серии, закрытых клеем «АРГАКОЛ», была значительно меньше, чем в контроле; раневая площадь сокращалась на 15%. На 4-ые сутки площадь ран, леченных клеем, уменьшилась в 2 раза, а у контрольных ран – только в 1,3 раза. Полное заживление ран под клеем отмечали на 9-11 сутки, контрольных ран – оно закончилось к 14-21 суткам, при этом в 50% случаев их заживление осложнялось нагноением.

Полученные данные подтверждали динамикой обсемененности ран микроорганизмами (Staphylococcus sp., P. aeruginosa, Enterococcus sp.). На протяжении всего срока наблюдения при использовании клея микробная обсемененность ран составляла 0-10 КОЕ/см2, в контроле она нарастала от 102 до 105 КОЕ/см2.

Клинические испытания клея «АРГАКОЛ» проведены в отделении гнойной хирургии ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена», а также в клиниках НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе (Санкт-Петербург), НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского (Москва). Результаты бактериологических исследований раневой микробиоты в процессе лечения клеем, как и при терапии традиционными средствами (левомеколь, дермазин, хлоргексидин), всегда выявляли наличие ассоциаций различных видов микроорганизмов. Однако отмечено, что, например, у ожоговых пациентов количество видов микробов в ассоциациях при использовании клея «АРГАКОЛ» всегда было меньше (2-3 вида микроорганизмов против 3-5 видов в контроле). При бактериологическом исследовании (табл.7) показано снижение уровня микробной обсемененности ран на 2-3 порядка, независимо от наличия ассоциаций различных видов микробов – Staphylococcus sp., Streptococcus sp., грамотрицательных бактерий (табл.8). При этом наблюдали снижение отечности тканей, воспалительной реакции краев раны и окружающей ее кожи.

При микробиологическом исследовании отмечали существенное снижение уровней микробной обсемененности ран в ходе применения препарата (от 103-106 КОЕ/см2 до начала исследования до 101-103 КОЕ/см2 – к 7 дню лечения, Р<0,05). Качественным анализом вегетирующей микробиоты показана сравнительно высокая активность препарата в отношении Гр(+) и Гр(-) микроорганизмов. Эффективность антимикробного действия клея «АРГАКОЛ», по сравнению с препаратами сравнения, была на 2 порядка выше, и это способствовало более благоприятному течению раневого процесса. Побочных реакций или осложнений течения раневого процесса, а также токсических или аллергических реакций на применяемый клей не отмечено.

Результаты проведенного клинического исследования доказывают эффективность применения антисептической биодеградируемой композиции «АРГАКОЛ» при лечении поражений слизистой оболочки полости рта протезно-обусловленной этиологии (гингивита, стоматита, пародонтита, мукозита).

Таблица 7 – Бактериальная контаминация ран различной этиологии при лечении клеем «АРГАКОЛ»

Виды ран пациентов

Кол-во пациентов (чел.)

Бактериальная контаминация ран (КОЕ/см2) на сроки

до лечения

после лечения (сутки)

5-7

10-14

21-24

Донорские участки

23

103

101

0

не исследовали

Ожоги:

II степени

IIIa степени

17

17

105

106

102

103

101

102

Не исследовали

0-101

Инфицированные и гнойные раны (посттравматические раны, трофические язвы, пролежни)

36

106

103

102

0-101

Таблица 8 – Видовой состав микробиоты ран (количество обследованных пациентов 93)

Видовой состав микробиоты ран

Количество выделенных штаммов

Процент от общего количества выделенных микроорганизмов

Монокультуры

Staphylococcus aureus

102

38.1

Staphylococcus epidermidis

23

8.6

Enterococcus faecalis

16

6.0

Pseudomonas aeruginosa

15

5.6

Klebsiella pneumoniae

9

3.4

Corynebacterium sp.

8

3.0

Acinetobacter calcoaceticus / baumannii complex

8

3.0

Escherichia coli

7

2.6

Enterobacter cloacae

6

2.2

Proteus mirabilis

4

1.5

Stenotrophomonas maltophilia

4

1.5

Staphylococcus warneri

3

1.1

Streptococcus acidominimus

3

1.1

Serratia marcescens

3

1.1

Clostridium perfringens

3

1.1

Микробные ассоциации, состоящие из различных штаммов

54

20,1

Оценка перспективности применения природных антисептиков

Разработано антимикробное средство на основе концентратов водорастворимых веществ из бересты березы и дана его микробиологическая характеристика. Образцы получали экстракцией полярными растворителями, а именно: водой, водно-спиртовыми растворами – с использованием 96% этилового спирта и 1,5% изопропилового спирта. При анализе МБцК методом серийных разведений получены результаты, подтверждающие антимикробное действие тестируемых разведений всех образцов концентратов (1:10, 1:100, 1:1000), при этом два последних разведения не оказывали цитотоксического действия на культуру фибробластов кожи эмбриона человека. Все тестируемые концентраты водорастворимых веществ из бересты в суббактерицидном разведении 1:2000 оказывали выраженное антиадгезивное действие в отношении тест-штамма золотистого стафилококка на модели культуры клеток фибробластов кожи человека (отличия от контроля достоверны, Р<0,05). При этом процент подавления адгезии S. aureus 209 P «Оксфорд» составил более 95.

Галенофиллипт  –  новый  антисептик природного происхождения для внутреннего и наружного применения, аналогичный коммерческому препарату Хлорофиллипту (1% спиртовой раствор). Сырьём для обоих препаратов являются листья эвкалипта  прутовидного, настоянные на 95–96% этиловом спирте. При этом Галенофиллипт содержит медные производные хлорофилла, фенол-альдегиды, цинеол, пинены. В  настоящем разделе работы приведены  результаты  сравнительного исследования активности указанных препаратов in  vitro  на  штаммах  тест-микроорганизмов  и  in vivo  на  модели  стафилококковой  локализованной инфекции  в  кожно-мышечной ране  у белых мышей. Результаты оценки бактерицидного действия изучаемого препарата Галенофиллипт и  препарата  сравнения  Хлорофиллипт чашечно-суспензионным методом показали, что значение коэффициента  редукции  обоих  препаратов  было  больше  5. Результаты, полученные при высевах из кожно-мышечных ран у животных контрольных и опытной групп, демонстрируют, что на 5-ые сутки уровень микробной контаминации в группе с Галенофиллиптом снизился на 1 порядок по сравнению с контрольными группами. На 10-ые сутки наблюдения показатели микробной контаминации ран у животных из групп, леченных антисептиками, снизились в 5,6 раза по сравнению с контрольной группой животных без лечения. В ходе патоморфологических исследований выявлено, что через 10 суток после начала эксперимента у животных контрольной группы без лечения происходило очищение очага воспаления через свищевой канал. В стенках свищевого канала, вскрывшегося абсцесса и прилежащих тканях наблюдали мелкие очаговые скопления лейкоцитов и незначительное количество диффузно рассеянных кокков. К этому сроку наблюдения у животных, леченных Хлорофиллиптом, сохранялись очаги воспаления, заполненные организующимися белковыми массами, в которых также встречались скопления лейкоцитов и небольшое количество кокков. У животных, леченных Галенофиллиптом, через 10 дней наблюдали почти полную эпителизацию и замещение воспалительного дефекта созревающей грануляционной тканью, в которой были единичные макрофаги и кокки. Следует отметить, что препарат Галенофиллипт отличала способность к стимуляции макрофагальной реакции и функции макрофагов в плане усиления фагоцитоза. Уже на третий день наблюдения лейкоцитарная инфильтрация в очаге у животных, леченных Галенофиллиптом, была менее выражена, а макрофагальная реакция – значительно более выражена в окружающих тканях, чем у животных двух других групп.

Исследовали детскую зубную пасту R.O.C.S., содержащую ксилит («R.O.C.S. Kids фруктовый рожок»), и зубную пасту «R.O.C.S.», содержащую протеолитический фермент бромелаин растительного происхождения  (производства фирмы ООО «ВДС», Москва). В предварительных опытах стандартным методом двукратных серийных разведений в жидкой среде была определена минимальная подавляющая концентрация зубных паст. МИК обоих тестируемых образцов составила 0,007%. В дальнейших исследованиях на модели культуры клеток фибробластов кожи эмбриона человека по оценке антиадгезивной активности была использована суббактерицидная концентрация зубных паст (разведение 1:20000), которая при этом не оказывала повреждающего действия на фибробласты. В опыте использовали две экспозиции – 2 часа и 3 минуты. Путем прямого посева тампоном из полости рта у 10 волонтеров на 5%  кровяной агар получены чистые культуры микроорганизмов: Staphylococcus aureus 20, Streptococcus salivarius 67, Streptococcus sangius 12, Streptococcus sobrinius 83. Показано выраженное цитотоксическое воздействие адгезированных штаммов микроорганизмов на культуру клеток: монослой фибробластов во всех случаях практически полностью разрушен; в цитоплазме уцелевших фибробластов и в межклеточном пространстве наблюдали значительное число микробных клеток. Из результатов исследований следует, что эффективность подавления адгезии нормальной микробиоты ротовой полости в присутствии зубных паст с антисептиками зависит от экспозиции: через 2 часа эффективность зубных паст невысокая (подавление адгезии микроорганизмов на 26-31%), а при времени выдержки 3 минуты – 79-83% подавления адгезии (отличия от контроля достоверны, Р<0,05). При этом 3 минуты – обычное время для чистки зубов. Это, по-видимому, связано с обратимостью адгезии в короткие сроки после внесения штаммов в модельную систему, т.к. обычно через 2 часа и более бактериальная адгезия становится менее обратимой. На основании полученных результатов можно говорить о перспективности разработки рецептур средств гигиены полости рта, содержащих природные антисептики, для профилактики формирования микробной биопленки в полости рта на зубах и слизистых оболочках.

Таким образом, показано, что природные антисептики даже при больших разведениях обладают высокой антимикробной и антиадгезивной активностью и низкой токсичностью, что делает особенно перспективным их применение в фазе регенерации и эпителизации.

ВЫВОДЫ

  1. Выбор антисептика для обработки ран для разных стадий раневого процесса зависит от уровня его антимикробной активности и его способности сохранять ее в присутствии естественных нейтрализаторов.
  2. Антисептики различных химических групп (йодофоры, полигексаметиленгуанидины) обладают выраженной антифаговой активностью в отношении трансдуцирующих стафилококковых бактериофагов; йодофоры (на примере нового полимерного антисептика Монклавит) в суббактерицидной концентрации в 1000 раз снижают частоту передачи внехромосомного фактора устойчивости к эритромицину у стафилококков.
  3. Полимерные антисептики из группы полигексаметиленгуанидинов, комплексоны из группы бисфосфонатов предупреждают формирование бактериальных биопленок, проявляют антитоксический эффект, ингибируют металло-бета-лактамазу и бета-лактамазу грамотрицательных антибиотикорезистентных микроорганизмов и усиливают действие антибиотиков группы карбапенемов и цефалоспоринов. Сочетанное применение суббактерицидных концентраций антисептика из группы полимерных бисгуанидинов «ПРОНТОСАН®» и комплексонов усиливает действие меропенема и цефтазидима в отношении P. aeruginosa и A. baumannii в десятки и сотни раз.
  4. Антимикробная композиция на основе высокомолекулярного поливинилпирролидона, антибиотика амикацина и антисептика диоксидина обладает пролонгированным действием, высокой антимикробной и антитоксической активностью, способностью локализовать инфекционный очаг и придавать антимикробные свойства окружающим тканям за счет постоянного высвобождения антимикробных веществ из полимерной матрицы в течение срока наблюдения, что позволяет предупреждать развитие послеоперационного остеомиелита.
  5. Разработаны способы придания с помощью нанокластеров серебра биоситаллу, костному цементу, протезу для герниопластики, стоматологическим материалам пролонгированной антисептической активности и дана микробиологическая характеристика их эффективности. По результатам оценки бактерицидной активности можно выбрать наиболее эффективные антимикробные агенты, незначительно снижающие сорбционную емкость аппликационных сорбентов, однако потеря сорбции повязкой после пропитки антибактериальным агентом не является необратимой.
  6. Разработка и применение нового изделия медицинского назначения – клея хирургического антисептического «АРГАКОЛ» – подтвердили его функциональность и эффективность для профилактики и лечения раневой инфекции с целью снижения микробной контаминации кожи и раневых поверхностей, ускорения процесса заживления и профилактики осложнений открытых ран. По результатам проведенного исследования показана эффективность применения антисептического препарата «АРГАКОЛ» при лечении поражений слизистой оболочки полости рта, ассоциированных с использованием зубных протезов.
  7. Природные антисептики даже при больших разведениях обладают высокой антимикробной и антиадгезивной активностью и низкой токсичностью, что делает особенно перспективным их применение в фазе регенерации и эпителизации раневой поверхности.

Практические рекомендации

1. На основании данных по устойчивости микробиоты к используемым антибиотикам и антисептикам рекомендуем обязательное тестирование выделяемых изолятов на чувствительность к применяемым антимикробным средствам не только общего, но и местного действия.

2. Оценка терапевтического индекса (соотношение минимальной ингибирующей концентрации и минимальной токсической дозы) антисептиков служит базой для выявления наиболее перспективных препаратов для использования в присутствии естественных нейтрализаторов (крови, тканевой жидкости, синовиальной жидкости и пр.), что, в свою очередь, способствует рациональному использованию клиницистами эффективных и нетоксичных средств.

3. Антимикробная композиция на основе ПВП, амикацина и диоксидина обладает пролонгированным действием, высокой антимикробной и антитоксической активностью, способностью локализовать инфекционный очаг и придавать антимикробные свойства окружающим тканям. Данная композиция может быть рекомендована в качестве профилактического средства в травматологии и ортопедии.

4. Использование нового изделия медицинского назначения – клея хирургического антисептического «АРГАКОЛ» – подтверждает его функциональность и эффективность для профилактики и лечения раневой инфекции с целью снижения микробной контаминации кожи и раневых поверхностей, ускорения процесса заживления и профилактики осложнений открытых ран.

5. Новое изделие медицинского назначения – протез сетчатый для герниопластики антисептический хорошо зарекомендовал себя при операциях герниопластики. Протез сетчатый не вызывает побочных эффектов, прост в применении, значительно снижает число инфекционных осложнений при хирургических вмешательствах.

6.  Использование в хирургических стационарах различных имплантатов, обладающих антисептическими свойствами (биоситалл, костный цемент, стоматологические материалы), приведет к снижению числа инфекционных осложнений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Афиногенов Г.Е. К вопросу о выборе метода тестирования антимикробной активности дезинфектантов и антисептиков / Афиногенов Г.Е., Мамонтов В.Д., Афиногенова А.Г. // Матер. 3-й Рос. науч.-пр. конф. с межд. участием «Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики внутрибольничных инфекций», СПб: П. – 2003. – С. 148-149.
  2. Краснова М.В. Качество дезинфекционных и антисептических мероприятий в зависимости от выбора препаратов / Краснова М.В.,  Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Егорова Л.Л. // Задачи современной дезинфектологии и пути их решения // Матер. Всерос. науч. конф., посв. 70-летию НИИ дезинфектологии Минздрава России. Часть I, М.: ИТАР-ТАСС. – 2003. – С.159-160.
  3. Афиногенов Г.Е. Кожные антисептики / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004. - том 6, №1. С.65-91.
  4. Афиногенов Г.Е. Требования к раневым антисептикам с микробиологических и практических позиций / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. // Сб. тезисов Межд. конгресса «Современные технологии в травматологии, ортопедии: ошибки и осложнения – профилактика, лечение», М. – 2004. – С.9-10.
  5. Афиногенов Г.Е. Перспективы применения антисептиков и антисептических средств в комплексном лечении больных с хроническими гнойными ранами / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Козлов И.В., Разоренов В.Л. // Сб. тезисов Межд. конгресса «Современные технологии в травматологии, ортопедии: ошибки и осложнения – профилактика, лечение», М. – 2004. – С.10.
  6. Афиногенов Г.Е. Предупреждение формирования микробной биопленки с помощью антисептиков и антисептических средств на модели культуры клеток / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. // Матер. Всерос. науч.-практ. конф. «Медицинская микробиология – XXI век», Саратов. – 2004. – С.26-27.
  7. Афиногенов Г.Е. Изучение механизмов антимикробного действия антисептиков и дезинфектантов на модели культуры клеток эмбриона человека / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. // Матер. XI Нац. конгресса «Человек и лекарство», Москва. – 2004. – С.419-420.
  8. Афиногенов Г.Е. Применение антимикробной биодеградируемой композиции на основе поливинилпирролидона для профилактики послеоперационных инфекций / Афиногенов Г.Е., Тихилов Р.М., Богданова Т.Я., Афиногенова А.Г., Козлов И.В., Краснова М.В., Анисимова Л.О. // Матер. конф. «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», СПб, ВМА. – 2004. – С.15-16.
  9. Афиногенов Г.Е. Новый способ моделирования хирургической раны в эксперименте / Афиногенов Г.Е., Пострелов Н.А., Смирнов О.А., Афиногенова А.Г., Кольцов А.И. // Успехи современного естествознания. – 2004. - №2. – С.57-58.
  10. Галынкин В.А. Дезинфекция и антисептика в промышленности и медицине / Галынкин В.А., Заикина Н.А., Афиногенова А.Г., Потехина Т.С., Афиногенов Г.Е., СПб: «Фолиант». – 2004. – 96 с.
  11. Афиногенов Г.Е. Глава 4 «Лабораторные методы исследования в травматологии и ортопедии» / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. // 1 том руководства «Травматология и ортопедия» под редакцией проф. Н.В. Корнилова и проф. Э.Г. Грязнухина, СПб: «Гиппократ». – 2004. – С.227-285.
  12. Афиногенов Г.Е. Применение клея хирургического антисептического «АРГАКОЛ» для профилактики и лечения раневой инфекции у травматологических больных / Афиногенов Г.Е., Тихилов Р.М., Разоренов В.Л., Козлов И.В., Родоманова Л.А., Афиногенова А.Г. // Сб. трудов конф. «Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике», СПб. – 2005. – С.62-64.
  13. Краснова М.В. Динамика микробных популяций гнойно-воспалительных процессов / Краснова М.В., Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Петрова Т.М. // Матер. Рос. науч.-пр. конф., посв. 110-летию каф. инфекционных болезней ВМА им. С.М. Кирова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины», СПб, ВМА. – 2006. – С.172-173.
  14. Афиногенова А.Г. Предупреждение формирования микробной биопленки in vitro и in vivo с помощью антисептиков и антисептических средств / Афиногенова А.Г., Афиногенов Г.Е., Зубова Е.Н. // Матер. Межд. конгресса «Стратегия и тактика борьбы с ВБИ на современном этапе развития медицины», М. – 2006. – С.29.
  15. Пострелов Н.А. Новые сетчатые протезы для герниопластики с антимикробными свойствами / Пострелов Н.А., Басин Б.Я., Афиногенов Г.Е., Кольцов А.И., Афиногенова А.Г. // Матер. юбил. конф. «Актуальные вопросы герниологии». – Герниология. – 2006. - №3 (11). – С.33.
  16. Афиногенов Г.Е. Антиадгезивная активность зубных паст / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Даровская Е.Н., Гроссер А.В. // Клиническая стоматология. 2006. том 39, №3. С.54-57.
  17. Афиногенов Г.Е. Влияние полимерных антисептиков на трансдуцирующие бактериофаги и трансдукцию плазмид лекарственной устойчивости у стафилококков / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Светлов Д.А. // Дезинфекционное дело. 2006. - №4. - С.18-20.
  18. Афиногенов Г.Е Клей хирургический антисептический «АРГАКОЛ» / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. / Патент на изобретение № 2284824. Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели» - 2006. - №28 6 с.
  19. Афиногенова А.Г. Применение антисептиков и антисептических средств для предупреждения формирования микробной биопленки in vitro и in vivo // Тез. юбил. науч-пр. конф. «Актуальные вопросы травматологии и ортопедии», СПб. – Травматология и ортопедия России. – 2006. - №2 (40). – С.27.
  20. Краснова М.В. Изменения микробиоты гнойно-воспалительных процессов в клинике травматологии и ортопедии / Краснова М.В., Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Петрова Т.М., Спиридонова А.А. // Современные проблемы медицинской микробиологии: Мат. Всерос. науч. конф., посв. 90-летию каф. микробиол. и микол. МАПО (ХХХХ юбилейная конф. «Хлопинские чтения») / Под ред. А.П. Щербо, В.Д. Бадикова, В.Г. Кубася, СПб: ГНУ РАО. – 2007. –  С.211-213.
  21. Краснова М.В. Видовой спектр этиологически значимых стафилококков в клинике травматологии и ортопедии / Краснова М.В., Афиногенов Г.Е., Яковлева О.М., Гулова А.Ф., Петрова Т.М., Афиногенова А.Г. // Матер. юбил. конф. с межд. участием, посв. 175-летию со дня рожд. С.П. Боткина под ред. акад. РАМН Б.В. Гайдара, ВМА им. С.М. Кирова, СПб: «Человек и здоровье». – 2007. – С. 350-351.
  22. Афиногенов Г.Е. Глава «Инфекционный контроль» / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. // Современные клинические рекомендации по антимикробной терапии. Выпуск 2, Смоленск: МАКМАХ. – 2007. – С.182-228.
  23. Басин Б.Я. Способ изготовления сетчатого протеза с антимикробными свойствами для герниопластики / Басин Б.Я., Афиногенов Г.Е., Пострелов Н.А., Афиногенова А.Г., Кольцов А.И. / Патент на изобретение № 2292224. Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели» - 2007. - №3 11 с.
  24. Афиногенов Г.Е. Разработка антисептиков и антисептических средств для предупреждения формирования микробных биопленок и для деструкции сформировавшихся биопленок в травматологии и ортопедии / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Богданова Т.Я., Краснова М.В., Даровская Е.Н., Деев Р.В., Пострелов Н.А. // Труды Всерос. науч. конф. «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний», СПб. – Вестник Российской Военно-медицинской академии. – 2008. - №2 (22) Приложение. – С.170-171.
  25. Афиногенов Г.Е. Влияние ксилита в составе зубных паст на специфическую адгезию некоторых клинических штаммов микроорганизмов полости рта / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Даровская Е.Н., Матело С.К. // Стоматология детского возраста и профилактика. 2008. том 25, №2. С.73-78.
  26. Афиногенов Г.Е. Влияние нанокластеров серебра на формирование микробных биопленок на изделиях медицинского назначения / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Пострелов Н.А., Краснова М.В. // Дезинфекционное дело. 2008. - №3. С.48-50.
  27. Афиногенов Г.Е. Сравнение методов оценки эффективности дезинфектантов и антисептиков / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Краснова М.В. // Дезинфекционное дело. 2008. - №4. С.40-44.
  28. Афиногенов Г.Е. Предупреждение формирования микробных биопленок на ИМН под влиянием нанокластеров серебра / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Пострелов Н.А., Краснова М.В. // Вестник СПб государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. – 2008. – том 28, №3. – С.171-174.
  29. Аболин А.Б. Исследование остеокондуктивных свойств гранулированного стеклокерамического материала «Биосит» в эксперименте / Аболин А.Б., Зайцева М.Ю., Афиногенова А.Г., Нетылько Г.И. // Травматология и ортопедия России. 2008. - №4. С.67-71.
  30. Афиногенов Г.Е. Поиск новых антисептиков и сорбентов, эффективных в отношении детекции и ингибиции металло-бета-лактамаз Pseudomonas aeruginosa / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Лебедева И.К. // Тез. Межд. конгресса МАКМАХ/ESСMID, Москва. – Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2009. – т.11, №2, Приложение 1. – С.10-11.
  31. Пострелов Н.А. Обоснование клинического применения протеза сетчатого для герниопластики с антимикробными свойствами. (Герниопротез сетчатый с антимикробными свойствами) / Пострелов Н.А., Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Басин Б.Я., Кольцов А.И., Клюев А.Н.// Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2009. - том 168, №6. С.21-24.
  32. Афиногенов Г.Е. Способность высокомолекулярного поливинилпирролидона локализовать инфект на модели дерманекроза у кроликов / Афиногенов Г.Е., Лебедева И.К., Афиногенова А.Г., Богданова Т.Я., Зайцева М.Ю., Даровская Е.Н., Петрова Т.М. // Тез. XII Межд. конгресса МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии, Москва. – Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2010. – том 12, №2. – С.14.
  33. Афиногенов Г.Е. Новый природный антисептик «Галенофиллипт» для лечения стафилококковой локализованной инфекции в кожно-мышечной ране у белых мышей / Афиногенов Г.Е., Лебедева И.К., Даровская Е.Н., Афиногенова А.Г., Зайцева М.Ю.,  Молдавер Б.Л., Балаев Т.А., Богданова Т.Я. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2010. - том 12, №2. С.170-176.
  34. Афиногенов Г.Е. Антимикробная биодеградируемая композиция на основе высокомолекулярного поливинилпирролидона для профилактики экспериментального остеомиелита / Афиногенов Г.Е., Тихилов Р.М., Афиногенова А.Г., Краснова М.В., Козлов И.В., Лебедева И.К., Богданова Т.Я., Анисимова Л.О., Даровская Е.Н., Петрова Т.М. // Травматология и ортопедия России. 2010. - 3(57). С.47-54.
  35. Афиногенов Г.Е. Создание антимикробного материала, содержащего наносеребро, для базисов зубных протезов / Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Трезубов В.Н., Семенов С.С., Сапронова О.Н. // Институт стоматологии. 2010. - №2(47). С.22-23.
  36. Сапронова О.Н. Исследование эффективности антисептического препарата «Аргакол» при лечении поражений слизистой оболочки полости рта протетической этиологии / Сапронова О.Н., Афиногенов Г.Е., Трезубов В.В., Афиногенова А.Г., Кусевицкий Л.Я., Привалов А.В. // Ученые записки СПб Государственного медицинского университета им. Акад. И.М. Павлова. 2010. том XVII, №2. С.31-32.
  37. Афиногенова А.Г. Влияние бигуанидов на формирование стрептококковой биопленки на модели культуры клеток фибробластов кожи эмбриона человека / Афиногенова А.Г., Грабовская К.Б., Кулешевич Е.В., Суворов А.Н., Афиногенов Г.Е. // Инфекции в хирургии. 2011. том 9, №1. С.5-13.
  38. Afinogenov G.E. The Study Of Microorganism’s Susceptibility To Antiseptics By Agar Disc Method In The Presence Of Natural Neutralizers / Afinogenov G.E., Krasnova M.V., Domorad A.A., Afinogenova A.G. // Abstracts of the XI International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology «Microbes in a Changing World», San-Francisco, California, USA. – 2005. – B-1000. – Р.31.
  39. Afinogenov G.E. The in vitro study of the polymer silver-containing antiseptic poviargol pharmacodynamics features / Afinogenov G.E., Krasnova M.V., Afinogenova A.G. // Abstracts der 8.Int. Kongress der DGKH, Berlin. – Hygiene and Medizin. – 2006. – Bd.31. – Suppl. 1. – P.55.
  40. Afinogenova A. The influence of antiseptics and antiseptic agents on the microbial biofilm formation in the cell culture model / Afinogenova A., Afinogenov G., Tikhilov R. // Abstracts der 8.Int. Kongress der DGKH, Berlin. – Hygiene and Medizin. – 2006. – Bd.31. – Suppl. 1. – P.55.
  41. Afinogenova A. The influence of polyhexanide on the group B streptococcal with different pathogenicity / Afinogenova A., Grabovskaya K., Kuleshevich E., Suvorov A., Afinogenov G. // EWMA Journal. – 2011. – Vol.11, №2. – P.176.

ИЗОБРЕТЕНИЯ

42. Пат. 2298036 RU С2, МПК C12Q 1/04, C12N 5/00. Заявка № 2004132319/13 от 04.11.2004. Приоритет изобретения 04.11.2004. Опубликовано 27.04.2007 Бюл. №12. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.04.2007. Страниц 5. Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента / Афиногенов Г.Е, Тихилов Р.М., Афиногенова А.Г. (RU). Патентообладатель ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена Росздрава» (RU).

43. Пат. 2314821 RU С1, МПК А61К 36/185, A61P 31/00. Заявка № 2007102244/15 от 23.01.2007. Приоритет изобретения 23.01.2007. Опубликовано 20.01.2008 Бюл. №2. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.2008. Страниц 7. Антимикробное средство / Никуленкова Т.Ф., Афиногенова А.Г. (RU).  Патентообладатели Никуленкова Т.Ф., Афиногенова А.Г. (RU).

44. Пат. 2324499 RU С2, МПК A61L 2/03. Заявка № 2006124960/14 от 11.07.2006. Приоритет изобретения 11.07.2006. Опубликовано 20.05.2008 Бюл. №14. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.05.2008. Страниц 8. Способ профилактики развития гнойных процессов в области послеоперационных костных дефектов / Афиногенов Г.Е., Жирнов В.А., Тараненко М.Ю., Афиногенова А.Г. (RU). Патентообладатель ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена Росздрава» (RU).

45. Пат. 2343925 RU С2, МПК А61К 31/79, А61К 31/7036, А61К 31/495, А61Р 19/08, А61М 37/00. Заявка № 2006144370/14 от 12.12.2006. Приоритет изобретения 12.12.2006. Опубликовано 20.01.2009 Бюл. №2. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.2009. Страниц 4. Способ профилактики послеоперационного остеомиелита / Афиногенов Г.Е., Тихилов Р.М., Афиногенова А.Г., Мироненко А.Н., Богданова Т.Я., Краснова М.В., Козлов И.В., Анисимова Л.О. (RU). Патентообладатель ФГУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена Росмедтехнологий» (RU).

46. Пат. 2354389 RU С1, МПК А61К 31/734, А61К 31/715, А61К 38/01, А61К 31/495, А61К 33/14, А61Р 1/02. Заявка № 2007146755/14 от 11.12.2007. Приоритет изобретения 11.12.2007. Опубликовано 10.05.2009 Бюл. №13. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.05.2009. Страниц 4. Способ лечения воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта протетической этиологии / Сапронова О.Н., Кусевицкий Л.Я., Афиногенов Г.Е., Трезубов В.Н., Афиногенова А.Г., Колесов О.Ю., Айвазов Т.Г., Капустин С.Ю. (RU). Патентообладатели Кусевицкий Л.Я., Сапронова О.Н. (RU).

47. Пат. 2414882 RU С1, МПК А61К 6/02. Заявка № 2010102999/15 от 01.02.2010. Приоритет изобретения 01.02.2010. Опубликовано 27.03.2011 Бюл. №9. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.03.2011. Страниц 9. Антибактериальный материал для базисов съемных зубных протезов / Семенов С.С., Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г., Трезубов В.Н., Сапронова О.Н. (RU). Патентообладатели Семенов С.С., Трезубов В.Н., Афиногенов Г.Е. (RU).

Список сокращений

КОЕ

- колониеобразующая единица

МБЛ

- металло-бета-лактамаза

ПВП

- поливинилпирролидон

УВС

- углеволокнистый сорбент

ЭДТА

- этилендиаминтетраацетат

МИК

- минимальная ингибирующая концентрация

МБцК

- минимальная бактерицидная концентрация

ПАС-У

- повязка аппликационная сорбирующая углеволокнистая

ПГМГ

- полигексаметиленгуандина гидрохлорид

 






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.