WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

БОРОНИНА

Любовь Григорьевна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ Haemophilus influenzae, У ДЕТЕЙ

03.00.07 микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук профессор СБОЙЧАКОВ Виктор Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор КАФТЫРЕВА Лидия Алексеевна

доктор медицинских наук профессор КОРОЛЮК Александр Михайлович

доктор медицинских наук профессор КОЧЕРОВЕЦ Владимир Иванович

Ведущая организация: ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится ____ сентября 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.08 при Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова

Автореферат разослан  ___ июня 2007 года

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА

доктор медицинских наук профессор

ПАСТУШЕНКОВ Владимир Леонидович

Актуальность проблемы. Инфекции, этиологическим фактором которых является Haemophilus influenzae, приобретают все более актуальный характер и относятся к числу наиболее распространенных среди детей во всех странах мира. Ранее считалось, что H.influenzae (палочка Афанасьева–Пфейффера) играет роль в респираторной патологии, однако исследования последних десятилетий показали, что этот микроорганизм является причиной многих гнойно-септических заболеваний. По данным ВОЗ, во всех странах мира регистрируются заболевания, вызываемые H.influenzae, как у детей, так и у взрослых (Vaccines and Biology, 2002). Рост числа  инфекций, вызванных H.influenzae, сопровождается изменением спектра заболеваемости, утяжелением течения ранее известных и появлением новых клинических форм с летальным исходом.

Наибольшее значение в патологии человека имеют капсульные серологические варианты (серовары) типа «b» (Hib), вызывающие разнообразные клинические проявления, нередко приводящие к инвалидизации заболевших. Инфекции, обусловленные H.influenzae, разделяют на острые, при которых этот микроорганизм является первичным возбудителем, и хронические, при которых он, по-видимому, играет вторичную роль. Острые инфекции включают менингит, сепсис и гнойно-септические заболевания  с локальными воспалительными проявлениями местного характера.

В нашей стране истинная распространенность инфекций, вызванных H.influenzae, остается невыясненной. По мнению многих авторов, именно несовершенство лабораторной диагностики H.influenzae–инфекции, приводит к снижению истинных показателей заболеваемости. В отечественной литературе описаны,  в основном, гнойные менингиты и эпиглотиты. Противоречивые выводы содержат результаты исследования этиологии пневмоний, вызванных H.influenzae, у детей (Девяткина Н.П. с соавт., 1989; Таточенко В.К., 1998; Демина А.А., 1998; Королева И.С., 2003; 2004; Сорокина М.Н с соавт., 2003; Катосова Л.К. с соавт., 2005; Покровский В.И.,2005). Настороженность вызывает отсутствие сведений о заболеваемости и распространении других нозологических форм гнойно-септических инфекций, вызванных разными серологическими вариантами H.influenzae, у детей.

Практически отсутствуют доступные тест-системы для изучения гуморального иммунитета, сероидентификации культур; не решена проблема производства питательных сред. Для диагностики инфекций, вызванных разными фенотипами H.influenzae, требуются достоверные методы микробиологических исследований, разработка и внедрение которых необходимы для полноценного мониторинга этих инфекций, лечения и профилактики.

Цель исследования — разработать новые, провести сравнительную оценку существующих методов для повышения информативности микробиологических исследований и на этой основе определить частоту инвазивных, первично-локализованных инфекций, вызываемых H.influenzae, у детей.

Задачи исследования

  1. Усовершенствовать способ получения типоспецифических сывороток к капсульным сероварам «а», «b», «с», «d», «e» и «f» для конструирования диагностических тест-систем.
  2. Разработать и практически внедрить питательные среды для выделения H.influenzae, определить методические особенности контроля качества питательных сред для выделения H.influenzae, установить перечень свойств для подготовки  тест–штамма.
  3. Разработать и оценить диагностическую значимость тест–систем иммунофементного анализа (ИФА) для определения антигенов серовара «b» в ликворе (спинномозговой жидкости) и других биосубстратах.
  4. Оценить возможности использования и диагностическую значимость различны методов микробиологического исследования инфекций, вызванных инвазивными H.influenzae. 
  5. Выявить частоту инвазивных, первично–локализованных инфекций и назофарингиального носительства, вызванных различными фенотипическими вариантами H.influenzae, у детей Среднего Урала.
  6. Изучить распространеннность капсульных сероваров «а», «b», «с», «d»,«е», «f», нетипируемых штаммов, различных биоваров, их значение при первично-локализованных и инвазивных инфекциях.
  7. Определить резистентность штаммов, выделенных при инвазивных и первично–локализованных инфекциях, вызванных H.influenzae к антибиотикам различных классов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложенные модификации приготовления питательных сред, методов их контроля, разработанная тест-система ИФА для выявления антигенов, в том числе капсульного полисахарида «b», обеспечивают ускоренную диагностику инвазивных и верификацию этиологического диагноза первично- локализованных инфекций, вызванных H.influenzae.

2. Фенотипы капсульных и бескапсульных штаммов, выделенных при первично-локализованных, инвазивных инфекциях и со слизистой носоглотки детей существенно отличаются.

3. Целесообразно дифференцированное использование серологической диагностики для верификации инфекций, вызванных сероваром «b» и нетипируемыми вариантами H.influenzae.

4.Выявленные изменения фенотипов резистентности к антибиотикам за исследуемый период не существенны, в то время как у нетипируемых штаммов и штаммов серовара «b», существуют различия в резистентности к различным классам антимикробных препаратов.

Научная новизна

Впервые разработаны способ и питательная среда для выделения H.influenzae со слизистой носоглотки (патент № 2186389 от 27 июля 2002 г., патент №21936000 от 27 ноября 2002 г.), двухфазная среда ЭрДС – для выделения из стерильных полостей, ЭрДС-агар – для выделения из нестерильных локусов (заявка № 2006139958 от 18.10.2006г.)

Определены методические критерии оценки тест-штамма для бактериологического контроля качества питательных сред, предназначенных для выделения H.influenzae из клинического материала.

Сконструированы отечественные тест–системы ИФА для выявления  антигенов H.influenzae серовара «b».

Определена частота инфекций и назофарингеальной колонизации, вызываемых сероварами «a», «b», «c», «d», «e», «f» и биоварами I–VIII H.influenzae.

Осуществлено серологическое и биологическое типирование выделенных со слизистой носоглотки штаммов H.influenzae, вызывающих инвазивные и первично-локализованные инфекции.

Определена частота инвазивных и первично-локализованных форм инфекций, вызванных различными фенотипами H.influenzae, у детей Среднего Урала.

Проведено многоцентровое проспективное исследование назофарингеального носительства H.influenzae у больных и здоровых детей в детских коллективах.

Определена резистентность штаммов H.influenzae, выделенных в Свердловской области, к разным классам антимикробных препаратов.

Практическая значимость работы заключается в получении данных, расширяющих представление о роли H.influenzae, не только серовара «b», но и других сероваров и биоваров при гнойно-септических инфекциях у детей. Полученные диагностические препараты позволяют выявить среди капсульных изолятов серовары, которые могут вызывать различные формы инфекций. Разработанные способы приготовления и контроля качества питательных сред с использованием доступных ингредиентов позволяют выделять H.influenzae из клинического материала в лабораториях любого уровня. Разработанные латексные препараты для сероидентификации H.influenzae позволяют определить серовариант у капсульных штаммов. Предложенная схема исследования материала из стерильных полостей позволяет быстро и качественно выявить возбудитель. Определение биовара позволяет выявить потенциально патогенные биовары среди штаммов H.influenzae.

Полученные данные о резистентности H.influenzae к антибактерильным препаратам позволяют назначать рациональную этиотропную антибактериальную терапию. Практическая значимость работы подтверждена использованием её материалов в образовательных программах на теоретических, практических занятиях и семинарах профессиональной переподготовки при последипломном обучении врачей. Результаты определения резистентности штаммов H.influenzae включены в российский реестр резистентности возбудителей инфекций к антимикробным препаратам.

Внедрение результатов работы. По теме работы получено 2 патента на изобретения – «Транспортная среда для выделения Haemophilus influenzae из носоглоточной слизи» (патент № 21936000 от 27.11.2002 г.) и «Способ культивирования Haemophilus influenzae из носоглоточной слизи»  (патент № 2186389 от 27.06.2002 г.). Подана заявка на изобретение «Питательная среда  для выделения H.influenzae и способ её приготовления» - №2006139958 от 18.10.2006 г. Подготовлены методические рекомендации – «Лабораторные методы выделения, идентификации Haemophilus influenzae» (Екатеринбург, 1999), «Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae» (Смоленск, 2003). «Внебольничная пневмония у детей, пособие для врачей-педиатров» (Екатеринбург, 2004), «Лабораторные методы выделения, идентификации, определения чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae» (Екатеринбург, 2006).

Результаты исследований внедрены в лабораториях клинической микробиологии лечебно-профилактических учреждений Министерства здравоохранения Свердловской области, используются в учебном процессе курсов профессиональной переподготовки и тематического усовершенствования для врачей- бактериологов факультета повышения квалификации и последипломной подготовки Уральской государственной медицинской академии, в исследовательской работе лабораторного отдела Уральского НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии, Уральского НИИ фтизиопульмонологии (Екатеринбург).

Полученные диагностические препараты применены в лаборатории менингококковой инфекции и гнойных менингитов Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ, выделенные штаммы представлены для исследования  по программе «Пегас I и II» для составления реестра резистентности штаммов Н.influenzae к антибиотикам в России.

Апробация работы

Материалы работы доложены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики и профилактики инфекции, вызываемой Н.influenzae типа «b» (Москва, 1998), на научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины» (Москва, 1999), на Всероссийской научно-практической конференции «Перинатальная анестезиология и интенсивная терапия матери, плода и новорожденного» (Екатеринбург, 1999), на 9 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Берлин, Германия,1999), на научно-практической конференции Западно-Уральского региона «Вакцинопрофилактика в ХХI веке» (Пермь, 2000), на Юбилейной научно-практической конференции «Роль лабораторной диагностики в современных медицинских технологиях» (Екатеринбург, 2000), на II международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века» (Москва, 2000), на международной научно-практической конференции «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем», посвященной 50-летию НПО «Питательные среды» (Махачкала, 2003), на V международной конференции по антимикробной химиотерапии  (Москва, 2003), на IV межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы обеспечения санитарно- эпидемиологического благополучия населения» (Омск, 2003г), на III Уральской конференции «Болезни органов дыхания» (Екатеринбург, 2003г), на Юбилейной конференции, посвященной 80-летию кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Современная микробиология – клинической медицине и эпидемиологии» (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология -ХХI век» (Саратов, 2004), на первой Российской конференции «Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (Москва, 2004), на заседаниях Свердловского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова (Екатеринбург, 2006) , на VIII международной конференции по антибактериальной химиотерапии (Москва, 2006), на межкафедральном совещании в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации

По результатам исследований опубликовано 96 печатных работ, из них 16 – в журналах, одобренных ВАК.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 372 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов. Указатель литературы включает 141 источник на русском языке и 471 на иностранных языках. В текст включены 22 таблицы и 62 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использовали следующие штаммы микроорганизмов: типовой штамм H.influenzae NCTC № 8143, штаммы H.influenzae: серовара «а» № 1511375/63 IHE, серовара «b» № 151138 11/64 IHE, «b» № 151149 ГИСК, 2«b» 94505/81 HNCВ, серовара «с» № 151140 7/63 IHE, серовара «d» № 151161 27/68, серовара «е» № 151146 9/64 IHE; серовара «f» 10/63 IHE № 151134; АТСС № 49247, АТСС № 49766, H.parainfluenzae № 151135 NCTC 7857, H.haemolyticus NCTC10659 № 151134, H.parahaemolyticus АТСС 10014, Е.coli АТСС 11775, S.pneumoniae АТСС 49619, N.meningitidis АТСС 13077, полученные из музея патогенных бактерий ГИСК им. Л.А.Тарасевича, S.aureus АТСС 12598. авторские H.influenzae серовара «b» - № 98 и № 99.

Методы исследований

Иммунизацию кроликов с целью получения типоспецифических сывороток к капсульным антигенам проводили формолвакцинами штаммов H.influenzae «a», «b», «c», «d», «e», «f» по модифицированной нами схеме  Н.И. Храмовой (Храмова Н.И., 1975). Титр и специфичность капсульных сывороток определяли в агглютинационных и преципитационных тестах до и после истощения, а затем использовали при конструирования тест-системы ИФА и диагностикумов для  реакции агглютинации латекса и ко-агглютинации.

Для определения оптимального состава и способа приготовления питательных сред использовали основы разного состава - экстракт пекарских дрожжей, кровь кролика и эритроцитарную массу из крови человека, сыворотку крови крупного рогатого скота. Определение чувствительности плотных и полужидких сред  по скорости роста и биологическим свойствам культур проводили в соответствии с методическими указаниями (Андреева З.М. с соавт., 1980; Исаева З.А. с соавт., 1980). Исследование параметров роста культур проводили с измерением оптической плотности на этапах культивирования с использованием ФЭК – 56М. Качество питательных сред оценивали, проводя сравнение показателей роста для жидкой среды - по максимальной удельной скорости, экспоненциальной и лаг-фазам, для плотной – по количеству КОЕ и морфологической полноценности культуры.

Твердофазный иммуноферментный анализ для обнаружения антигена H.influenzae «b» в биосубстратах  проводили в непрямом «сэндвич»-варианте. Использовали 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола  производства фирмы «Dynatech» (Щвейцария) и фирмы «Медполимер» (Россия), лунки которых покрывали глобулиновой фракцией, выделенной из кроличьих гипериммунных сывороток против H.influenzae «b». О результатах специфичного связывания антигенов антителами, фиксированными на полистироле, судили по добавлению специфического конъюгата (антитела против H.influenzae «b», меченные пероксидазой). При определении оптимальных параметров проведения ИФА изучали влияние температурных, экспозиционных факторов, состава и величины промывочного и разводящего буферов, различных концентраций сорбируемых антител.

Для выявления специфического комплекса антиген-антитело использовались пероксидазные конъюгаты на основе антител к полирибозилфосфату H.influenzae. В качестве субстрат-индикаторной смеси использовали ортофенилендиамин с пероксидом водорода. Учет реакции проводили после добавления 0,1М H2S04, оптическую плотность окрашенного продукта ферментативной реакции определяли на вертикальном фотометре Dynatech-4000 (Швейцария) при длине волны 450 нм. Конъюгаты получали на основе общеглобулиновой фракции, выделенной с помощью полиэтиленгликоля (молекулярная масса 6000, «Serva») из кроличьей сыворотки к H.influenzae «b» при помощи перйодатного окисления в отделе новых технологий НИИ ЭМ им. Пастера по методу M.Wilson, Р.Nakone в модификации В.Н. Вербова (1988).

Реакция ко-агглютинации. Культуру S.aureus (штамм Cowan I), выращенную в стандартных условиях, формалинизировали 0,5% раствором 2 часа, трёхкратно отмывали в фосфатно-буферном растворе pH 7,2. Из осадка готовили 40% взвесь, к 1,0 мл взвеси стафилококкового иммуносорбента добавляли 2,5 мл кроличьей сыворотки  одного из сероваров H.influenzae, предварительно проверив в реакции агглютинации на отсутствие гетерологичных антител в разведении 1:25. Затем перемешивали при +4С; отмывали забуференным физиологическим раствором дважды, центрифугируя при 1000 об/мин 10 мин. Осадок разводили буфером, получая 1-2% взвесь, проверяли отсутствие спонтанной агглютинации.

Реакция сопровождалась контролями: несенсибилизированный стафилококковый реагент и отдельно – испытуемый материал (культура H.influenzae) с физиологическим раствором; испытуемый материал и несенсибилизированный реагент; сенсибилизированный стафилококковый реагент и физиологический раствор. Использование реакции ко-агглютинации показало оптимальным использование забуференного физиологического раствора pH 7,2 для проведения реакции в равных объёмах (0,02 мл), учёт через 1 мин после лёгкого нагрева и определение не столько размеров агглютинатов, сколько степени просветления.

Реакция латекс-агглютинации. Для получения иммуноглобулиновых фракций из гипериммунных кроличьих сывороток к сероварам «a», «b», «c», «d», «f», «e», апробированных в качестве сенситинов, использовали 0,0156 М фосфатный буфер (pH 7,4). К сывороткам добавляли равный объём 20% полиэтиленгликоля, выдерживали при +4С 10 мин, после центрифугирования при 5000 об/мин в течении 15-20 мин, осадок растворяли до первоначального объёма сыворотки и вновь центрифугировали при указанных параметрах. Надосадочную жидкость растворяли в меньшем количестве забуференного физиологического раствора, проводили диализ в мешке для диализа против забуференного физиологического раствора 24 ч на холоду, затем очищали на колонке с сефадексом G-25, G-200.

Полученный препарат лиофильно высушивали и определяли белок по методу Лоури. Полученные и лиофильно высушенные препараты из сывороток к сероварам «a», «b», «c», «d», «f», «e» содержали в 1 мг от 389-738 белка  (по Лоури). Частицы латекса сенсибилизировали  по методике Severin (1972). Предварительно определяли специфичность полученных иммуноглобулинов в реакции агглютинации с капсульными вариантами  2мг/мл, 1мг/мл, 0,5мг/мл,  0,25мг/мл, 0,125мг/мл H.influenzae в концентрации 5х109 КОЕ/мл. Реакцию проводили в термостате при 37 С 2,5 часа во влажной камере.

Латексные препараты получали путём нагрузки 7% полистирольного латекса модифицированного метакриловой кислотой. Латекс получен из института синтетического каучука (Санкт-Петербург). К 3% взвеси латекса добавляли иммуноглобулины, разведенные по белку: (2мг/мл, 1мг/мл, 0,5мг/мл, 0,25мг/мл, 0,125мг/мл), предварительно растворив из сухого лиофильно высушенного препарата. Для определения параметров, необходимых для получения препарата, использовали фосфатный буфер (pH 7,2), глицериновый буфер (pH 8,2), бычий сывороточный альбумин, азид натрия. Нагрузку латекса осуществляли при +37 С 2 ч при постоянном помешивании, остужали при комнатной температуре без доступа света, затем – в холодильнике при +4С. Отмывание производили при центрифугировании при 8000 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли холодный глицериновый буфер  (pH 8,2) с бычьим сывороточным альбумином, инозит натрия и встряхивали, отмывая затем 3 раза. Полученные латексные  препараты для определения  антигенов «a», «b», «c», «d», «f», «e» испытывали с живыми и формалинизированными культурами  при разных разведениях с латексными препаратами с разной степенью нагрузки (2мг/мл, 1мг/мл, 0,5мг/мл, 0,25мг/мл, 0,125мг/мл).

Контролями служили забуференный физиологический раствор и частицы латекса без белковой нагрузки. Оптимальными концентрациями иммуноглобулинов при сенсибилизации латекса явилась нагрузка для иммуноглобулиновых препаратов H. influenzae: «a» - 2,0 мкг/мл; H. influenzae «b»- 0,5 мкг/мл, H. influenzae «c» -1 мкг/мл, H. influenzae «d» -1 мкг/мл, H. influenzae «f»-1 мкг/мл, H. influenzae «e»-1 мкг/мл. Чувствительность латексных препаратов (ЛП) определяли с гретыми культурами H.influenzae «a», «b», «c», «d», «f», «e» в концентрации: 5х109, 5х108, 5·х107, 5х·106, 5х105, 5х104, 5х103, 5х102 КОЕ. Чувствительность при выделении H.influenzae «b» ПРФ составила 12,5 нг/мл, при типировании культур в реакции латекс-агглютинации составила 5105 КОЕ/мл. Специфичность определяли в реакции латекс-агглютинации культур разных сероваров и нетипируемых штаммов H. influenzae .

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Для разработки  диагностических  препаратов для типирования  капсульных штаммов типоспецифическими сыворотками к капсульным антигенам использовали инокуляты штаммов H.influenzae всех сероваров в концентрации: 5·109, 5·108, 5·107, 5·106, 5·105, 5·104, 5·103, 5·102 КОЕ. Из них готовили препараты на тонких стеклах из нефлюоресцирующего стекла (фирма «Ниармедик Плюс», Москва). Для удаления группоспецифических антител из каждой из исследуемых  кроличьих сывороток применялся сорбент на основе ультраозвученной взвеси H. influenzae других сероваров. На стекла с антигенами H.influenzae наносили разведённые сыворотки, инкубировали во влажной камере при +200С 10 мин. Для выявления комплексов антиген-антитело использовалась антивидовая люминесцирующая сыворотка производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. При микроскопии в люминесцентном микроскопе «Люмам-8» (ЛОМО) оптимальным считали то разведение сыворотки, при котором наблюдалось достаточно интенсивное свечение антигена при постановке реакции с положительными образцами и не наблюдалось – с отрицательными.

Материалы исследований. Обследованы материалы от 1593 больных с подозрением на менингит и 1446 – с другими гнойно-септическими инфекциями, 207 - новорожденных, 253 - с ХНЗЛ; 105 - с острой пневмонией, 399 - с инфекциями Лор-органов; 1061 человек из детских учреждений и 181-здоровых. Проведено микробиологическое исследование следующих клинических биосубстратов: образцы крови – 1892; СМЖ – 1835; раневое отделяемое, пунктаты из ран - 94; пунктаты из плевральной полости – 132; мокрота при острой пневмонии -104, жидкость бронхоальвеолярного лаважа – 452, мокрота при хронических заболеваниях легких - 676, заднеглоточные мазки – 1230, носоглоточные мазки - 56; с конъюнктивы - 340, из половых органов – 96; пунктаты при Лор - инфекциях – 536; сыворотка крови – 1421.

Для определения этиологии инфекций использовали: посевы на кровяной агар на основе Blood agar base, сывороточный агар, желточно-солевой агар (ЖСА), «шоколадный» агар, в соответствии с действующими приказами МЗ (№ 535 от 22.04.85, № 858 от 01.12.88, № 375 от 23.12.98, МУК 4.2.1887-04), и на разработанные автором среды : H. influenzae ЭрДС, H.influenzae ЭрДС-агар с ристомицином, двухфазную среду H.influenzae-ЭрДС. Идентификацию проводили при использовании следующих тест-систем – Api NH, ID Haemo, ID Strep., ID G-; IDC, IDStaph на «ATB Expression»; индикацию антигенов - в «Slidex meningite Kit 5», «Directigen Meningitis combo Test»; МФА M. pneumoniaе, вирусы гриппа А, В, парагриппа, аденовирусы, РС-вирус (НИИ гриппа, НИИМЭ им. Пастера); антитела к M. pneumoniaе определяли в ИФА: SeroMP IgM, SeroMP IgG, МРА Serodia Myco-2; в МФА определяли антитела к C.pneumoniaе C.psittaci, C.trachomatis (IgM, IgA, IgG) (Vircell S.L); в ИФА: SeroСP IgM, SeroMP IgG (Savyon), IgM, IgG, PCHPN, Рneumo (Vircell S.L.). Антитела к S.pneumoniae определяли в ИФА IgG S.pneumoniae, к белкам наружной мембраны  и соматическим антигенам H.influenzae в ИФА IgG HIВ, к полирибозилфосфату в ИФА IgG HIB (НИИВС им. И.И. Мечникова), к вирусу гриппа - в РТГА (НИИ гриппа), к L.pneumophila - в МФА Рneumo (Vircell S.L.).

У культур H.influenzae, выделенных из различных локусов, определяли биовар по выделению индола, наличию ферментов орнитиндекарбоксилазы и уреазы; серовар определяли в РА, латекс-агглютинации и РНИФ препаратами, приготовленными нами из полученных  кроличьих типоспецифических капсульных сывороток к сероварам «a», «b», «c», «d», «f», «e». Резистентность к антибиотикам АТВNH, АТВHaem на «ATB Expression» (bioMeriuex), дискодиффузионным методом на Haemophilus Test Medium (НТМ)-агаре и методом микроразведений, -лактамазы определяли в тесте с нитроцефином и в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Контроль качества питательных сред для определения чувствительности к антибиотикам проводили штаммами H.influenzae.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общеупотребительных методов параметрической и непараметрической статистики. КОЕ рассчитывали,  исходя из распределения Пуассона. Для оценки частоты различий между показателями, в случаях соответствия вариабельности изучаемых показателей закону нормального распределения,  применялся t-критерий Стъюдента. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий) принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основным условием успешного бактериологического исследования является применение высокоэффективных питательных сред для H.influenzae, содержащих «Х» и «V» факторы роста. Сравнительное изучение показателей чувствительности разных сред, приготовленных  на основе доступных ингредиентов по принципу «шоколадного» агара с использованием крови человека, свидетельствует о низких показателях выявления H.influenza. Изучение возможных вариантов питательных сред на различной основе с использованием видов крови различных животных и человека, а также термической обработке, позволяет сделать вывод о наиболее высокой эффективности питательных сред с добавлением крови кролика и термической обработки при 75-80С, что соответствует данным других авторов (Храмова Н.И,1975). Использование этого режима для приготовления сред с кровью человека значительно снижает чувствительность среды за счёт разрушающего действия анти-V-фактора и других возможных ингибиторов крови человека. При термической обработке при 100С разрушается анти-V-фактор. При этом разрушаетcя и большая часть V–фактора, недостаток которого  не позволяет расти H.influenzae без микроорганизмов-саттелитов.

Учитывая трудности практических лабораторий в приобретении крови кролика и дефибринированной крови человека, нами разработан способ приготовления среды оптимального состава. Стандартною эритроцитарную массу, полученную из крови человека, приготовленную в соответствие со стандартными технологиями, принятыми при приготовлении препаратов крови без цитрата натрия, нагревали до 80С, затем добавляли дрожжевой экстракт и сыворотку крупного рогатого скота. Сравнительная оценка питательных сред по показателю экстинции (Ext), показанная на рисунке 1, свидетельствует о высокой эффективности жидкой среды из крови кролика (среда №2): минимальное значение логарифмической фазы роста (tлаг=0,45), при времени регенерации (Gmin=0,87), максимальное значение удельной скорости роста (Mmax=0,7).

Увеличение длительности лог-фазы и минимального времени генерации свидетельствует о меньшей эффективности среды, приготовленной из эритроцитарной массы крови человека (среда № 1 – ЭрДС) по сравнению со средой из крови  кролика, но значительно превосходит по эффективности среды из крови человека (на рис. 1 – среда №3).  Чувствительность среды «H.influenzae-ЭрДС-агар» (Эр – эритоцитарная масса, Д – дрожжевой экстракт, С – сыворотка крупного рогатого скота) составила 106 - 107 КОЕ /мл.

Рис. 1. Оптическая плотность культуры H.influenzae на различных жидких питательных средах. По оси ординат – значения оптической плотности, выраженные в lg (Ext t100) при 540 нм, по оси абсцисс – время взятия пробы.

1) среда ЭрДС, 2) среда с кроличьей кровью, 3) среда с кровью человека.

По изложенному принципу готовится  и «двухфазная» среда, где плотной фазой служит среда ЭрДС, приготовленная на основе питательного агара, а жидкой – жидкая питательная среда ЭрДС, приготовленная на основе питательного бульона, осветлённая при центрифугировании.

Использование «двухфазной» среды для посева материала позволило выделить возбудителей из стерильных локусов при менингите и сепсисе в 2,1 раза чаще, чем при использовании традиционных сред, рекомендованных  приказами МЗ № 535 от 22.04.85, № 858 от 01.12.88, № 375 от 23.12.98. Применение «двухфазной» среды ЭрДС имеет следующие преимущества перед использованием первичных посевов на пластинчатые среды:

  • в зависимости от количества возбудителя в материале существенно ускоряется первый этап выделения культуры – в течение 3 – 4 – 6 часов;
  • прозрачность плотной и жидкой фазы упрощает визуальные исследования;
  • микроскопия мазка из жидкой фазы, окрашенного по Граму и Бурри-Гинсу, увеличивает информативность в изучении морфологии бактерий;
  • культура, выросшая в жидкой среде, может использоваться для реакции агглютинации при сероидентификации и определения биовара;
  • осадок, полученный после центрифугирования из жидкой фазы, может быть использован для ускоренного выявления -лактамаз в хромогенном тесте, что способствует ранней этиотропной антибиотикотерапии;
  • культура может быть использована для определения резистентности к антибиотикам методом диффузии в агар.

Важным является также то, что «двухфазная» среда ЭрДС предлагаемого состава и способа приготовления, является пригодной для выделения других прихотливых возбудителей. Так, с помощью ЭрДС «двухфазной» среды удалось выделить из ликвора как H.influenzae, так и N.meningitidis и S.pneumoniae.

Полученные по оригинальной схеме типоспецифические капсульные сыворотки к полисахаридам H.influenzae «а», «b», «с», «d», «е», «f», в реакции агглютинации имели титр специфических агглютининов от 1:1024 до 1:25600. В развернутой реакции агглютинации все типовые сыворотки агглютинировали с гетерологичными капсульными бактериями не более чем на 1/4 титра специфических антител. С целью устранения гетерологичных антител применяли прогревание и истощение гетерологичными  капсульными штаммами H.influenzae.

Чувствительность и специфичность полученных диагностических капсульных сывороток определяли в реакции агглютинации и в реакции преципитации с штаммами H.influenzae. Чувствительность латексного препарата H.influenzae «b» определяли в агглютинации с полирибозилфосфатом (ПРФ). Чувствительность при индикации ПРФ, полученного из H.influenzae «b» составила 12,5 нг/мл, при определении сероварианта культур в реакции агглютинации латекса составила 5х105 КОЕ/мл. Чувствительность РНИФ при определении сероваров штаммов – 5х102  КОЕ/мл.

При использовании диагностических препаратов в реакции агглютинации, латекс-агглютинации, РНИФ сероварировали 348 штаммов H.influenzae, выделенных из различных мест локализации, 21,8% штаммов которых имели капсулу, из них 78,8% штаммов отнесены к серовару «b», 1,3% - к серовару «а», 1,1% - к серовару «с», 11,0% - к серовару «d», 9,7% - к серовару «f».

Из крови при гнойном менингите, септицемии выделены H.influenzae «b» - 12 штаммов, из ликвора H.influenzae «b» - 31, при остеомиелите из крови - 1 штамм серовара «b»; при деструктивной пневмонии из крови - 1 штамм H.influenzae «d», при септической пневмонии из крови штамм серовара «b» -1; при фульминантном сепсисе из материала аутопсии - 4 штамма H.influenzae «b».

При первично-локализованных инфекциях выделены: при гнойном синусите из материала пункции пазух - 22 нетипируемых штамма H.influenzae; из отделяемого при конъюнктивите 19 штаммов нетипируемых H.influenzae; из раны при воспаление орбиты глаза - 1 штамм, из мокроты при острой пневмонии – 27 нетипируемых и 1 штамм H.influenzae «b».

Из мокроты детей с хроническими заболеваниями лёгких выделено 52 штамма, из них 5 штаммов капсульных («b»-2, «d»-1, «f»-2); из материала бронхоальвеолярноного лаважа выделено 48 штаммов, из них 6 капсульных («b» - 2, «d» - 2, «f» - 2); при хроническом пиелонефрите из мочи 4 нетипируемых штамма, при вульвите из отделяемого со слизистой вульвы-3 нетипируемых  штаммов H.influenzae

Результаты ИФА по определению H.influenzae серовара «b», выраженные в величинах оптической плотности (ОП), во всех случаях находились в прямо пропорциональной зависимости от концентрации изучаемых антигенов, представлены результаты определения разрешающей способности тест-системы по выявлению Н.influenzaе «b». Минимальная концентрация Н.influenzaе (нижний уровень детекции), выявляемая с помощью «сэндвич»- метода ИФА составила 7х104–105 КОЕ/мл. Для определения воспроизводимости метода и стабильности реакции использовали контрольные штаммы Н.influenzae «b»: штамм «b» 11/64, 94505/80 и штаммы 98 «b» и 99 «b», выделенные из ликвора и крови больного. Небольшие вариации оптической плотности были получены при исследовании одинаковых количеств Н.influenzae «b» разных штаммов. Проведенные на основании полученных данных расчеты показали, что ошибка количественного определения клеток указанных штаммов при использовании Н. influenzae II/64 «b» в качестве стандарта не превышает 15%, т.е. находится во вполне допустимых пределах. Различия коэффициентов вариации и дисперсий оптической плотности результатов реакции по определению разных штаммов свидетельствуют о недостоверности различий (р<0,05), поэтому результаты обнаружения Н.influenzae «b» при помощи диагностической тест-системы можно считать воспроизводимыми и стабильными. Диагностическая тест-система «сэндвич» варианта ИФА позволяет обнаружить 10-15 нг/мл растворимого липополисахаридного антигена Н. influenzae.

Контроль специфичности разработанной тест - системы осуществляли двумя способами: реакцией торможения и при постановке реакции с гетерологичными антигенами. Реакцию торможения проводили на стадии взаимодействия антигенов с иммобилизованными антителами, добавляя в реакционную смесь те же антитела в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Наибольшую специфичность предложенного варианта «сэндвич-ИФА» по индикации Н.influenzae определяли при исследовании бактерий различных групп, которые имеют общие антигены с Н.infiuenzae или могут встречаться в тех биологических субстратах, которые предстоит исследовать для обнаружения антигенов Н.influenzaе.

Для определения чувствительности и специфичности разработанной системы ИФА по выявлению антигенов H.influenzae сероварианта «b» провели серию опытов со штаммами микроорганизмов разных видов и родов. Результаты исследований по определению специфичности тест-системы, показанные на рис. 2, свидетельствуют, что другие бактерии не выявляются в максимальной концентрации 5х107 КОЕ/мл.

Несмотря на определенное антигенное сходство Н. influenzae  с пневмококками 6-го типа, другими бактериями рода Haemophilus, конъюгат не выявлял их антигены в концентрации в 100 раз превышающий уровень Н.influenzae-антигенов. При концентрации бактерий менее 2х106 КОЕ/мл разница оптической плотности в пробах, содержащих антигены «b» и других серовариантов (в большей степени сероварианта «с») незначительна, поэтому в концентрациях 104-105 КОЕ/мл, отличие серовара «b» от серовара «с» затруднено.

Рис. 2. Определение специфичности тест-системы «сэндвич»-варианта ИФА в чистых и смешанных бактериальных культурах. По оси абсцисс - концентрация бактериальных клеток КОЕ/мл (х104), по оси ординат – оптическая плотность при 450 нм. 1-H. influenzae «b» II/64; 2-E. cоli + H. influenzae «b» II/64; 3-S. pneumoniae 6A; 4-P. aeruginosa I; 5-K. pneumoniae; 6-Y. enterocolitica; 7-N. meningitidis «C».

Сравнение результатов индикации Н. influenzae «b» в концентрации 5х105 с сероваром «с» в концентрации 107 КОЕ/мл и сероваром «f» в концентрации 2х106 КОЕ/мл показало (рис. 2), что разница в оптической плотности с учетом коэффициента вариации и различия дисперсий не достоверна (р < 0,05).

Несмотря на определенное антигенное сходство Н. influenzae  с пневмококками 6-го типа, другими бактериями рода Haemophilus, конъюгат не выявлял их антигены в концентрации в 100 раз превышающий уровень Н.influenzae-антигенов. При концентрации бактерий менее 2х106 КОЕ/мл разница оптической плотности в пробах, содержащих антигены «b» и других сероваров (в большей степени серовара «с») незначительна, поэтому в концентрациях 104-105 КОЕ/мл, отличие серовара «b» от серовара «с» затруднено. Результаты реакции по определению Н. influenzae, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о затруднении в дифференциации серовара «b» от других сероваров Н. infiuenzae. В то же время результаты реакции с другими видами гемофильных микроорганизмов (Н.parainfluenzae, Н.haemolyticus) не превышают отрицательный контроль. На основании этих исследований можно считать предложенный вариант диагностической тест-системы видоспецифическим, позволяющим определить антигены Н. infiuenzae «а», «b», «c», «d», «e», «f».

Таким образом, показана возможность использования разработанной диагностической тест-системы для обнаружения антигенов в чистых и смешанных культурах, а также в ликворе.

Рис.3. Специфичность «сэндвич» варианта ИФА для определения капсульного полисахарида «b»в сравнении с другими серовариантами. По оси абсцисс - концентрация бактерий в КОЕ/мл (104), по оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.1 - Н.influenzae «b»; 2 - Н. influenzae «c»; 3 – Н. influenzae «f»; 4 - Н.influenzae «e»; 5 - Н.influenzae «d»; 6 – Н. parainfluenzae; 7 - Н. haemolyticus; 8 - Н. рarahaemolyticus.

Разработанный вариант тест-системы по индикации антигенов в ИФА следует считать видоспецифическим, позволяющим обнаружить антигены сероваров Н.influenzae. При этом чувствительность составила 10-45 нг/мл по обнаружению антигена и свыше 7х104-105 КОЕ/мл при хорошей специфичности, воспроизводимости и достоверности исследований.

Предложенные тест-система ИФА, диагностические агглютинирующие капсульные сыворотки, питательные среды (ЭрДС) и способы их приготовления для культурального исследования ликвора и крови, позволили установить этиологический диагноз, определить серовар и биовар при первично-локализованных и инвазивных инфекциях, вызванных Н.influenzae, в том числе у детей с гнойным менингитом, при септической пневмонии, фульминантном сепсисе, остеомиелите. В таб.1 представлены результаты микробиологического исследования крови и ликвора при первичных гнойных менингитах, вызванных Н.influenzae, проведенных различными методами в 1986-2005г.г. Диагноз гнойного менингита, вызванного Н.influenzae, удалось установить с помощью разработанных методов (ИФА, среда ЭрДС) у 32 больных и только у 9 - с помощью и других методов. Как показано в таб.1, у 5 больных микробиологический диагноз был подтверждён при использовании рекомендуемых культуральных методов и у 4 – при индикации антигена методом латекс-агглютинации с использованием коммерческих диагностикумов.

  Таблица 1

  Микробиологическая диагностика H. influenzae- менингита различными методами

Годы

Количество случаев  выявления  H. influenzae методами:

Микроскопия мазка из ликвора ( по Граму или метиленовым синим),пр.№858 от 01.12.88,,№ 37523.12.98

Бактериологическое исследование

Индикация антигена H. influenzae  «b» в ликворе

Итого количество доказанных случаев

Посев** ликвора приказ№535 от 22.04 85,№858 от 01.12.88

Посев** ликвора приказ

№375 от 23.12.98

Посев

ликвора на шоколадный агар из кроличьей крови

Посев

ликвора в 2-х фазную среду ЭрДС

Посев крови в 2-х фазную среду ЭрДС

Латекс-агглютинация

Иммуно-ферментный анализ

1986

0

0

-

  2

-

-

-

-

2

1987

  [2]

1

-

[1] 3

2

[1]

-

  2 [6]

8

1988

0

0

-

[1] 1

1

[1]

-

  1 [2]

3

1996

0

0

-

-

2

-

  [2]

2

1997

  [2]

1

-

-

5[1]

[1]

1 [6]

  [7]

7

1998

0

0

-

1

1[1]

[1]

1 [2]

  [3]

3

1999

0

0

1

-

2[1]

0

[3]

  [3]

3

2000

0

0

1

-

2[1]

-

[3]

  [3]

3

2001

  [1]

-

0

-

2

-

[2]

-

2

2003

  [1]

-

1

-

[1]

-

2 [1]

-

3

2005

  [2]

-

0

-

5

[2]

[5]

-

5

  Всего

  [8]

2

3

[2]7

  [5]22

[6]

4[22]

3[16]

  41

Примечание:«-» - не исследовались;«0» - отрицательный результат;«[ ]» – выявлены и другими методами;« 1 » - выявлено только указанными методом; **шоколадный агар из человечеcкой крови

Бактериальные менингиты, вызванные Н.influenzae, диагностированы в течение периода наблюдений неравномерно, как показано на рисунке 4, в Свердловске- Екатеринбурге H.influenzae были выявлены у 2-9% больных детей в возрасте от 1 месяца до 14 лет, поступивших в стационар с признаками первичного (внебольничного) гнойного менингита. Во всех случаях выявлялись Н.influenzae серовара «b», но разных биовариантов: I, II, III.

Менингиты, вызванные H.influenzae, встречались у детей в возрасте от 3 месяцев до 5 лет, что соответствует результатам исследований гнойных менингитов в Москве (Королёва И.С., 2005). На рисунке 5 показаны случаи менингита в зависимости от возраста: у детей до 3 месяцев и не достигших 6 лет H.influenzae не обнаружены. Необходимо отметить, что H.influenzae-менингиты у детей 5 лет, но не достигших 6 лет, обнаружены не во все годы наблюдения Наибольшее количество заболевших детей было выявлено в возрасте от 1 до 3 лет. С достоверностью 99% доказано, что чаще H.influenzae-менингит встречается у детей до 3 лет, чем у детей старше этого возраста (р < 0,001).

Рис. 4. Выявление случаев первичных гнойных менингитов с установленной этиологией в Свердловске-Екатеринбурге в периоды 1986-1988, 1995-2001г.г. По оси абсцисс абсолютное количество случаев разной этиологии, по оси ординат - периоды времени (год).

Наибольшее количество заболевших детей было выявлено в возрасте от 1 до 3 лет. Для сравнения частоты выделения всех возбудителей, обнаруженных в крови и ликворе, на рисунке 6 приведены результаты исследования 639 случаев гнойных менингитов, этиология которых в 173 (25,2%) случаях установлена у детей в возрасте менее и равном 5 лет.

Рис. 5. Количество случаев H.influenzae-менингита у детей в зависимости от возраста. По оси абсцисс - группы детей разных возрастов: до 3 месяцев; от 3 месяца до 1 года; старше 1 года до 3 лет; от 3 до 5 лет включительно, от 6 до 14 лет включительно. По оси ординат - абсолютное число случаев.

Рис. 6. Частота выявления возбудителей среди гнойных менингитов установленной этиологии у детей в возрасте до 5 лет включительно в Екатеринбурге в периоды 1986-1988г, 1995-2001г., в % (173 случаев с установленной этиологией).

У детей в возрасте до 6 лет первичные гнойные менингиты были вызваны преимущественно менингококками - в 40% случаев, H.influenzae – в 20%, в - 14%. Необходимо отметить, что частота выявления пневмококка и H.influenzae в разные годы отличается, но менингиты, вызванные пневмококком, всегда встречаются достоверно реже, чем менингококковые, и в некоторые годы реже, чем H.influenzae.

При исследовании ликвора у детей при внутрибольничных менингитах и инфекциях церебро-спинального шунта на этапах шунтирующего лечения гидроцефалии H. influenzae не обнаружены.

Среди штаммов H. influenzae, выделенных со слизистой носоглотки, капсульные штаммы всех серовариантов, за исключением сероварианта «а», как показано на рисунке 7, составили 14%. Среди всех штаммов H. influenzae, серовар «b» составил 5%, среди обследованных-1,6%

Рис.7. Cерологические варианты капсулы среди штаммов H.influenzae (n=74), выделенных со слизистой задней стенки носоглотки у детей (в %).

Фенотипическая структура штаммов H.influenzae, выделенных  от больных, здоровых первой группы здоровья, в коллективах детей разных возрастов отличается и зависит от времени года: у 12% - в летнее и у 39% здоровых детей - в зимнее время, у 20-25% детей с хроническими заболеваниями - вне зависимости от времени года. На слизистой носоглотки здоровых детей встречаются преимущественно нетипируемые штаммы всех биоваров, реже IV, V, IV биоваров. У здоровых первой группы наибольшая (64%) частота выявления нетипируемых штаммов VIII биовара.

Штаммы H.influenzae, выделенные при первично-локализованных и инвазивных инфекциях, имели разные биоварианты. Инвазивные формы , в том числе менингит, сепсис, остеомиелит, были вызваны биоварами I, II, реже III. Превично-локализованные формы инфекции, такие как средний отит и другие Лор-инфекции, конъюнктивит, хронические воспалительные заболевания лёгких, вызваны I, II, III биоварами, а также VII, реже VIII. На рисунке 8 показана частота выявления разных биовариантов, выделенных при различной патологии.

По-видимому, обнаружение на слизистой носоглотки детей капсульных штаммов серовара «b» I, II, III биоваров является потенциально опасным в связи с тем, что эти биоварианты и сероварианты чаще вызывают первично-локализовнные и инвазивные H.influenzae-инфекции.

Рис. 8. Частота выделения биовариантов при различных инфекциях , вызванных H.influenzae. По оси абсцисс - биовары, по оси ординат -частота выявления биоварианта(I,II, III, V, VI, VII, VIII ) в % при:1) первично-локализованных инфекциях; 2)при инвазивных инфекциях.

При тестировании 268 штаммов H.influenzae к антибактериальным препаратам выявлены фенотипы резистентности, отличающиеся у нетипируемых и капсульных штаммов. В табл. 2 показаны фенотипы резистентности к -лактамным антибиотикам нетипируемых штаммов H.influenzae, выделенных в 200-2005 г.г. Преимущественно распространены штаммы, не продуцирующие -лактамазу, и чувствительные к ампициллину. Появление небольшого количества штаммов, продуцирующих -лактамазу и резистентных к ампициллину (5,1%), -лактамазанегативных, резистентных или умеренно резистентных к ампициллину (3,6%), свидетельствует о возможном распространении штаммов с разными механизмами резистентности.

Таблица 2

Частота выявления фенотипов резистентности к -лактамам

  у нетипируемых штаммов H.influenzae

Название фенотипа резистентности

Количество штаммов

Частота в %

1) -лактамазонегативные (BLNAS), чувствительные к ампициллину

178

91,3

2) -лактамазопродуцирующие ампициллинорезистентные (BLPAR)

10

5,1

3) -лактамазонегативные ампициллинорезистентные, (BLNAR)

5

2,56

4) -лактамазонегативные умеренно резистентные к ампициллину (BLNAI)

2

1,02

Всего

195

100

Нетипируемые штаммы, выделенные в течение 2000-2005г.г. были резистентны к цефалоспоринам 1 поколения; к цефуроксиму и цефаклору - 4,4%; чувствительны к ампициллину -79,2). -лактамазы обнаружены у 5,1%. Не наблюдалось увеличения количества резистентных штаммов за последние пять лет к хлорамфениколу, тетрациклину, рифампицину, к фторхинолонам. Выявлено увеличение резистентных к триметоприм/сульфаметоксазолу нетипируемых штаммов (10,9%). 2,6%  исследованных штаммов являются -лактамазо-негативными, ампициллинорезистентными; 1% - -лактамазонегативными, умеренно резистентными к ампициллину. Штаммы серовара «b», выделенные при инвазивных формах инфекции, были резистентны к цефалоспоринам I поколения, чувствительны к другим цефалоспоринам, ампициллину, хлорамфениколу. Результаты резистентности к антибактериальным препаратам показаны на рисунке 9.

Рис. 9. Чувствительность штаммов H.influenzae ( n=289), выделенных в 2000-2006 годах, к различным классам  антибактериальных препаратов: - умеренно резистентные, - резистентные, - чувствительные.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствованные и разработанные микробиологические методы позволяют увеличить выявление гнойно-септических инфекций, вызываемых H.influenzae, и выявить распространение фенотипов H.influenzae у больных и здоровых детей.

2. Доказаны и успешно реализованы  диагностические возможности авторских питательных сред - ЭрДС, двухфазной, транспортной, и способа выделения H.influenzae со слизистой носоглотки, что позволило на 28% увеличить выделение возбудителя при первично-локализованных инфекциях и в три раза при инвазивных H.influenzae-инфекциях. Доказана необходимость контроля ростовых свойств питательных сред и определены критерии, предъявляемые к тест-штамму Н.influenzaе. Диагностическая эффективность разработанных культуральных методов позволила определить роль H.influenzae  в структуре гнойных менингитов.

3. Диагностические препараты, полученные из типоспецифических капсульных кроличьих сывороток «a», «b», «c», «d», «e», «f», применимы для серотипирования капсульных штаммов в реакциях ко-агглютинации, латекс-аглютинации и наиболее специфичны в реакции непрямой иммунофлюоресценции.

4. Разработанная тест-система ИФА, являющаяся специфичной и чувствительной (10-20 нг растворимого антигена в 1 мл), позволяет выявлять капсульный полирибозилфосфат H.influenzae в ликворе в течение 3 ч и увеличить этиологическое подтверждение на 29%.

5 Инвазивные Н.influenzaе-инфекции - менингит, сепсис, септическая пневмония, гематогенный остеомиелит вызваны биоварами I, II, III сероваров «b», «d»; первично-локализованные (отит, синусит, коъюнктивит, хронические заболевания легких) – нетипируемыми по капсуле биоварами, чаще I, II, III (63,5%), реже - VII, VIII (30,6%).

6. Показана диагностическая ценность обнаружения сероконверсии IgG-антител к белкам наружной мембраны бескапсульных штаммов Н.influenzaе у больных с хроническими заболеваниями лёгких. Двух-трех-кратное увеличение уровня IgG-антител при выделении возбудителя в концентрации103 КОЕ/мл из жидкости бронхо-альвеолярного лаважа или в концентрации105 КОЕ/мл из мокроты может свидетельствовать об обострении инфекции. При выявления IgG-антител к капсульному полирибозилфосфату «b» у больных гнойным менингитом в тест-системе ИФА не отмечено положительной сероконверсии, в отличии от больных пневмонией, вызванной сероваром «b».

7. Среди фенотипов назофарингеальных штаммов, выделенных от здоровых (первой группы здоровья) детей, выявлены преимущественно нетипируемые, бескапсульные штаммы VIII биовара. У детей, относимых к другим группам здоровья, выявлены как нетипируемые, бескапсульные  штаммы I, II, III, VII, VIII биоваров, так и капсульные серовары «a», «b», «c», «d», «f», выделенные не более, чем у 1% обследованных. Частота выявления фенотипов зависит от возраста, сезона, группы здоровья детей и составляет от 12 до 36% обследованных.

8. В течение 1986-2005 гг. в Екатеринбурге H.influenzae «b»-менингит встречался у 2-9%  среди всех детей, переболевшим гнойным менингитом, чаще у детей до 3 лет, и у 20%  детей среди больных до 5 лет. H.influenzae-менингиты занимают второе - третье место после менингококковых. Увеличения частоты H.influenzae «b»-менингитов у детей за исследованный период не отмечено. Среди инвазивных инфекций, вызванных H.influenzae «b», менингиты составляют 81,1%, септическая пневмония, фульминантный сепсис, остеомиелит – по 6,3%.

9. В структуре гнойно-септических инфекций у детей первично-локализованные формы, вызванные H.influenzae, составили: при среднем отите - 7%, при воспалении околоносовых пазух - 18,1%, при конъюнктивите-5,5%, при хронических инфекциях лёгких - 8,3%. При хронических инфекциях лёгких, кроме нетипируемымых штаммов, выделены серовары  «d» и «b».

10. Фенотипы резистентности среди нетипируемых H.influenzae, вызвавших первично-локализованные, и штаммов серовара «b», вызвавших инвазивные инфекции, существенно отличаются.

11. Нетипируемые штаммы H.influenzae, выделенные в течение 2000 – 2005 г.г., были резистентны к цефалоспоринам 1 поколения; к цефуроксиму и цефаклору - 4,4%; чувствительны к ампициллину -79,2%; -лактамазы обнаружены у 5,1%. В 2,5% среди нетипируемых H.influenzae обнаружены -лактамазо-негативные ампициллинорезистентные штаммы (BLNAR).

12. Штаммы H.influenzae серовара «b», выделенные при  инвазивных формах инфекции, резистентны к цефалоспоринам I поколения, но чувствительны к другим цефалоспоринам, а также к ампициллину и  хлорамфениколу.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для повышения результативности диагностики инфекций, в этиологии которых имеет место H.influenzae, необходимо проводить исследование всех возможных биосубстратов при различных формах инфекции, в том числе материала аутопсий, с использованием двухфазной питательной среды ЭрДС при исследовании стерильных полостей, и плотной среды ЭрДС -  при других локализациях гнойно-воспалительного процесса.
Для контроля качества питательных сред необходимо использовать 18-часовую культуру H.influenzae, выращенную при +37С в атмосфере СО2 с типичными биохимическими с антигенными свойствами без признаков диссоциации и наличия не более 10% удлинённых клеток размером > 5,0 мкм. Качественной можно считать плотную питательную среду для выделения H.influenzae из клинического материала, если при посеве 0,1 мл из разведения 10-7 КОЕ обнаружен рост десятков колоний.
Индикация капсульного антигена H.influenzae «b» различными методами повышает информативность исследования, но не заменяет культуральные методы выделения других (не серовара «b»), сероваров H.influenzae, поэтому культуральное исследование обязательно при диагностике всех случаев инфекций у детей
Использование предлагаемых питательных сред, приготовленных с использованием эритроцитарной массы из крови человека, дрожжевого экстракта, сыворотки крови крупного рогатого скота, вполне доступно для  практических лабораторий.
Применение двуфазной среды ЭрДС для посевов материала из стерильных полостей ускоряет выделение и идентификацию культуры и позволяет выделить из стерильных полостей в минимальных количествах не только H.influenzae, но и другие прихотливые бактерии.
Определение биовара штаммов H.influenzae, являющееся легко выполнимым, позволяет выявить потенциально опасные биовары (I, II, III), чаще вызывающие инвазивные гнойно-воспалительные заболевания. Сероварирование препаратами к  капсульным полисахаридам позволяет выявить штаммы разных сероваров, имеющих значение в инфекционной патологии у детей.
Для определения антибиотикорезистентности в практических лабораториях вполне применимы хромогенный тест выявления -лактамаз, дискодиффузионный метод на НТМ-агаре, а также использование автоматических систем.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
  1. Боронина Л.Г. Новые методы культивирования гемофильных бактерий / Л.Г. Боронина, С.А. Журов // Тезисы докладов конференции «Разработка и использование новых методов диагностики, лечения и профилактики». – Свердловск, 1986. – С. 74.
  2. Боронина Л.Г. Серотипирование Н.influenzae в реакции иммунофлуоресценции / Л.Г. Боронина, С.А. Журов, Е.С. Ворошилина // Тезисы докладов конференции «Разработка и использование новых методов диагностики лечения и профилактики». – Свердловск, 1987. – С. 102.
  3. Боронина Л.Г. К вопросу совершенствования микробиологической диагностики Н.influenzae при гнойных менингитах у детей  / Л.Г. Боронина, С.А. Журов, Л.И. Лисицина // Всесоюзная конференция «Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике», 21-22.06.1988 г., том 1. – С. 61-62.
  4. Боронина Л.Г. Определение антител Н.influenzae типа «b» в сыворотке крови у детей с гнойными менингитами иммуноферментным методом / Л.Г. Боронина, В.Б. Сбойчаков, И.И. Волков // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции. посвященной 60-летию Пермского НИИ вакцин и сывороток «Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов». – Пермь, 1988. – С. 211-213.
  5. Боронина Л.Г. Применение иммуноферментного метода для выявления антител Н.influenzae «b» / Л.Г. Боронина, В.Б. Сбойчаков, И.И. Волков // «Научно-технический прогресс в медицине» тезисы докладов II областной медицинской научно-практической конференции.- Свердловск, 1988. - С. 11-12.
  6. Боронина Л.Г. Усовершенствование этиологической диагностики гемофильной инфекции / Л.Г. Боронина, В.Б. Сбойчаков, И.И. Волков, О.П. Ковтун // Тезисы докладов VI Всероссийского съезда микробиологов и паразитологов. – М.: 1991, том 1. – С. 17-18.
  7. Боронина Л.Г. Разработка иммуноферментного анализа для обнаружения антигенов Н.influenzae «b» / Л.Г. Боронина, В.Б. Сбойчаков, В.Н. Вербов // Сборник научных трудов Свердловского НИИ дерматологии и венерологии «Актуальные вопросы дерматологии и венерологии». - Свердловск, 1991. – С. 48-49
  8. Боронина Л.Г. Среда обогащения для обнаружения носоглоточного носительства гемофильных бактерий / Л.Г. Боронина, Е.С. Ворошилина // Тезисы докладов 48 научной конференции «Актуальные вопросы патогенеза диагностики и лечения». - Екатеринбург, 1993. – С. 86.
  9. Боронина Л.Г. Микробиологическое исследование урогенитального тракта у больных с хроническим хламидиозом / Л.Г. Боронина, Л.К. Глазкова, Е.С. Ворошилина // Тезисы докладов 48 научной конференции «Актуальные вопросы патогенеза диагностики и лечения». - Екатеринбург, 1993. – С. 87.
  10. Боронина Л.Г. Условно-патогенные бактерии – причина инфекции у новорожденных детей / Л.Г. Боронина, М.Э. Саевич, Е.А. Мальцева // Сборник научных трудов Областной детской клинической больницы № 1. -Екатеринбург, 1994. – С. 76.
  11. Кожарская Г.В. Госпитальная инфекция в реанимационно-анестезиологическом отделении детской больницы /Г.В. Кожарская, Л.Г. Боронина, Л.А Уфимцева // Тезисы докладов итоговой научно-практической конференции «Актуальные вопросы педиатрии, анестезиологии и реанимации». - Екатеринбург, 1994.- С. 42.
  12. Боронина Л.Г. Микробиологические аспекты рациональной антибиотикотерапии / Л.Г. Боронина, С.Т. Кузнецова // Тезисы III Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 1996. – С. 82.
  13. Боронина Л.Г. Изучение носительства Н.influenzae с помощью среды обогащения / Л.Г. Боронина // Тезисы  докладов годичной научной сессии «Актуальные вопросы медицины». - Екатеринбург, 1996.- С. 9-10.
  14. Боронина Л.Г. Н.influenzae типа «b» и ее значение в патологии детей раннего возраста / Л.Г. Боронина // Уральское медицинское обозрение. - Екатеринбург, 1997.-№2 (17). – С. 35.
  15. Коточикова Л.Д. Этиология сепсиса и бактериемий у детей группы риска, находящихся в отделении реанимации / Л. Д. Коточикова, Л.Г. Боронина // Тезисы докладов научно-практической конференции «Инфекции плода околоплодной среды и новорожденного», Красноярск, 27-28.11.1997 г., 1997.- С. 49
  16. Боронина Л.Г. Внутрибольничная инфекция у недоношенных больных в условиях реанимационного отделения / Л.Г. Боронина , И.Л. Мамаев, Ф.Г. Мухамедшин, М.Э. Саевич // Вестник Уральской государственной медицинской академии.- Екатеринбург.- 1997. - С. 82-83.
  17. Боронина Л.Г. Особенности биологических свойств Н.influenzae типа «b» / Л.Г. Боронина // Сборник  конференции РАМН «Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики и профилактики инфекции, вызываемой Н.influenzae типа «b». - Москва, 1998. – С. 12.
  18. Кузнецова С.Т. Оптимизация антибактериальной терапии в педиатрической практике / С.Т. Кузнецова, Л.Г. Боронина, О.А. Синявская, Л.А. Уфимцева // Вестник Уральской Государственной медицинской академии. - Выпуск 7. - Екатеринбург, 1998.– С. 110-111.
  19. Боронина Л.Г. Новый метод бактериологической диагностики гемофильной инфекции / Л.Г. Боронина // Материалы VIII съезда педиатров России «Современные проблемы педиатрии». – М.: 1998. – С. 145.
  20. Кузнецова С.Т. Методологические подходы к оптимизации антимикробной терапии / С.Т Кузнецова, Л.Г. Боронина, О.А. Синявская, Л.А. Уфимцева // Материалы VIII съезда педиатров России «Современные проблемы педиатрии». – М.: 1998. – С. 373.
  21. Boronina L.G. The ethiology of the primary bacterial meningitis in children of Ekaterinburg / L.G. Boronina, P.V. Lavrenova. M.P. Kukushkina, S.V. Penzhenina // Abstract book of 8th  International Congress on Infectious Diseases. - Boston, Massachusetts. – 1998. – P.179.
  22. Боронина Л.Г. Проблемы клинической микробиологии в педиатрии / Л.Г. Боронина, С.В Цвиренко // Вестник Уральской Государственной медицинской академии. - Выпуск 7. - Екатеринбург, 1998.– С. 43-47.
  23. Боронина Л.Г. Сравнительная оценка результатов диагностики бактериемий традиционным и современным ускоренным методами / Л.Г. Боронина, И.Л. Мамаев, М.П. Кукушкина // Актуальные вопросы педиатрии и хирургии детского возраста, анестезиологии и реанимации. - Екатеринбург, 1998. – С. 37.
  24. Дёмина А.А. Эпидемиологические  особенности менингитов, вызванных Н.influenzae типа «b» /, А.А. Дёмина, Л.В. Спирихина, Г.В. Крючкова, М.Н. Сорокина, Л.Г. Боронина, М.О. Волкова, Т.А.  Гордиенко,  Т.М. Веселова // Эпидемиология и инфекционные болезни. – М.: 1998.№4 – С. 36-40.
  25. Боронина Л.Г. Гемофильные бактерии и их антибиотикочувствительность при патологии бронхолегочной системы у детей / Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина, М.Э. Саевич, С.С. Устюгова, И.Л. Мамаев // Сборник трудов научно-практической конференции «Актуальные вопросы педиатрии и хирургии детского возраста, анестезиологии и реанимации». - Екатеринбург, 1998. – С. 46-47.
  26. Громада Н.Е. Перинатальные инфекции: клинико-лабораторная характеристика, лечение, профилактика /Н.Е.Громада, Л.Г. Боронина // Методические рекомендации. - Екатеринбург, 1998. – 89 с.
  27. Боронина Л.Г. Антибиотикорезистентность бактерий, вызывающих инфекции новорожденных в реанимационном отделении / Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина, И.Л. Мамаев, Ф.Г. Мухамедшин, Л.А Уфимцева, С.В. Цвиренко // Тезисы докладов  научно-практической конференции МУ  «Детские инфекционные больницы»: «Интенсивная терапия в педиатрии». - Екатеринбург, 1999. – С. 7.
  28. Боронина Л.Г. Этиология бактериальных инфекций детей, находящихся в отделении реанимации / Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина, И.Л. Мамаев, Ф.Г. Мухамедшин, Л.А Уфимцева, С.В. Цвиренко // Всероссийская научно-практическая конференция «Перинатальная анестезиология и интенсивная терапия матери, плода и новорожденного» - Екатеринбург, 21.10.1999. – С. 290-294.
  29. Boronina L.G. Susceptibility of Haemophilus influenzae isolated from respiratory tract / L.G. Boronina, M.P. Kukushkina, M.E. Saevich, S.S. Ustugova // Abstract of 9th European congress of Clinical Micobiology  and Infectious Diseas. - Berlin, Germany.- 21-24.03.1999. – P.167-168.
  30. Боронина Л.Г. Лабораторные методы обнаружения и идентификации Haemophilus influenzae / Л.Г. Боронина // Методические рекомендации. - Екатеринбург: УГМА,1999. -17 с.
  31. Боронина Л.Г. Микробиологический мониторинг за бактериальными менингитами у детей / Л.Г. Боронина, Л.Д. Коточикова, И.Л. Мамаев, М.П. Кукушкина, Ф.Г. Мухамедшин // Клиническая лабораторная диагностика. – 1999. - № 11. – С. 17-18.
  32. Боронина Л.Г. Этиологическая диагностика бактериальных инфекций мочевыделительной системы / Л.Г. Боронина // Вестник Областной клинической больницы. - Выпуск№4. - Екатеринбург,1999. – С. 28-30.
  33. Боронина Л.Г. Клиническая микробиология – опора клинициста / Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина // Материалы научно-практической конференции «Роль лабораторной диагностики в современных медицинских технологиях», Екатеринбург, 21-22.05. 2000 г. – С. 85-91.
  34. Боронина Л.Г. Чувствительность к антибиотикам штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей при инвазивных инфекциях / Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина //Тезисы международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века». Клиническая микробиология и антибактериальная химиотерапия - 2000, том 2.,прил.1 – С. 11.
  35. Боронина Л.Г. Проблемы диагностики и профилактики гемофильной инфекции в России / Л.Г. Боронина // Материалы научно-практической конференции Западно-Уральского региона «Вакцинопрофилактика в ХХI веке». – Пермь, 2000. – С .68-71.
  36. Боронина Л.Г. Этиологическая диагностика первичных бактериальных менингитов у детей / Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина, Н.В. Мурунова, Т.Р. Огневская, С.М. Пинженина // Клиническая лабораторная диагностика. - 2000. - №9. – С. 43.
  37. Боронина Л.Г. Микробный пейзаж у детей с инфекцией мочевых путей / Л.Г. Боронина, Н.В. Котрехова // Актуальные проблемы нефрологии: инфекции мочевой системы у детей. Материалы Российской научно-практической конференции 16-18 октября 2001г.- Оренбург, - 2001. – С. 121-122.
  38. Боронина Л.Г. Микробиологическая диагностика хронических бронхолегочных заболеваний у детей / Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина, Е.Л. Фоминых, И.Ю. Артемкина // Актуальные вопросы педиатрии и хирургии детского возраста, анестезиологии и реанимации. - Екатеринбург, 2002. - С. 108-111.
  39. Боронина Л.Г. Способ культивирования Haemophilus influenzae из носоглоточной слизи / Л.Г. Боронина, Л.И. Павлова // Патент на изобретение №2186389 от 27.07.2002 г. - Москва.– 2 С.
  40. Боронина Л.Г. Транспортная среда для выделения Haemophilus influenzae из носоглоточной слизи / Л.Г. Боронина, Л.И. Павлова // Патент на изобретение №21936000 от 27.11.2002 г., Москва. – 3 с.
  41. Акользин В.В. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции / В.В Акользин, Л.Г. Боронина // Медицинская микробиология / Учебное пособие под ред. В.Б. Сбойчакова, издание второе. – СПб, ЭЛБИ, 2002 – С. 142-146.
  42. Богданович Т.М Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae /Т.М Богданович ,О.У. Стецюк, О.И. Кречикова, Л.Г Боронина, Л.К. Катосова, М.Е. Фаустова, Л.С.Страчунский // Клиническая микробиология и антибактериальная химиотерапия. – 2000. – Том 2.- №2. – С. 34-62.
  43. Богданович Т.М. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae /, Т.М. Богданович, О.У. Стецюк, О.И. Кречикова, Л.Г Боронина, Л.К.Катосова, М.Е. Фаустова, Л.С. Страчунский // Современные методы клинический микробиологии. - Выпуск 1. - Смоленск , 2003. – С. 34-63.
  44. Боронина Л.Г. Гемофильные менингиты в структуре гнойных менингитов у детей Среднего Урала / Л.Г. Боронина, Н.В. Мурунова, А.И. Груздев, С.М. Пинженина // Материалы VI Российского съезда врачей инфекционистов, СПб., 29-31.10.2003 г. – С. 463.
  45. Боронина Л.Г. Возбудители хронических инфекций бронхо-легочной системы у детей в Екатеринбурге и Свердловской области и их антибиотико-резистентность / Л.Г. Боронина, К.В. Крутова, С.М. Блинова // Материалы VI Российского съезда врачей инфекционистов, СПб., 29-31.10.2003 г. – С. 50.
  46. Боронина Л.Г. Получение и использование компонентов питательной среды для Haemophilus influenzae / Л.Г. Боронина // Материалы  международной научно-практической конференции ,посвященной 50-летию НПО «Питательные среды» МЗ РФ «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем», Махачкала 15-17.12.2003 г. – С .69-70.
  47. Боронина Л.Г. Чувствительность к антибиотикам  возбудителей хронических инфекций нижних дыхательных путей, выделенных при бронхоскопии / Л.Г. Боронина, К.В. Крутова, С.М. Блинова, Е.Е. Вол // «Клиническая микробиология и антибактериальная химиотерапия». - М.- 2003, том 5., прил.1. – С. 13.
  48. Боронина Л.Г. Современные технологии в этиологической диагностике  бактериальных менингитов / Л.Г. Боронина // Материалы IV межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения», Омск,13-14.12.2003 г., том.1. – С. 203-207.
  49. Боронина Л.Г. Современные методы бактериологической диагностики больных с бронхолегочной патологией / Л.Г. Боронина // Сборник трудов научно-практической конференции, посвященный 75-летию кафедры инфекционных болезней БГМУ «Актуальные вопросы инфекционных болезней» - Минск,  2003 г. – С. 7-8.
  50. Боронина Л.Г. Chryzeobacterium (Flavodacterium): клиническое значение, идентификация, чувствительность к антибиотикам / Л.Г. Боронина, К.В. Крутова, С.М. Блинова // Клиническая микробиология и антибактериальная. - 2003. - №3. – С. 243-251.
  51. Боронина Л.Г. Об этиологической диагностике гнойных менингитов / Л.Г. Боронина, С.М. Пинженина // Сборник трудов научно-практической конференции, посвященный 75-летию кафедры инфекционных болезней БГМУ «Актуальные вопросы инфекционных болезней» - Минск, 2003. - С. 9-10.
  52. Боронина Л.Г. Бактериологический метод диагностики хронических бронхолегочных заболеваний у детей / Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина, И.Ю. Артемкина // Материалы VIII конгресса педиатров России «Современные проблемы профилактической педиатрии»- Москва, 2003. – С. 44 -45.
  53. Чередниченко А.М. Внебольничная пневмония у детей / А.М Чередниченко., С.В. Цвиренко, Л.Г Боронина, С.Ю. Захарова, В.Р. Липина, И.П Шуляк, Я.Я. Вутирас // Пособие для врачей педиатров. – Екатеринбург, 2004. – 42 С.
  54. Боронина Л.Г. Носоглоточное носительство Haemophilus influenzae у детей в Екатеринбурге и области / Л.Г. Боронина, Е.А. Алексеева, Л.В. Шевелёва, М.П. Кукушкина // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология_- ХХI век» - Саратов, 28-30.09.2004 г. – С. 16-17.
  55. Боронина Л.Г. Этиология внебольничных пневмоний у детей в г. Качканар Свердловской области в 2001 г. /  Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина, С.М. Блинова, Т М. Мотус // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология_- ХХI век» - Саратов, 28-30.09.2004 г. – С. 39-41.
  56. Боронина Л.Г. Современные методы в этиологической  диагностике гемофильной инфекции / Л.Г. Боронина, С.В. Цвиренко // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология_- ХХI век» - Саратов, 28-30.09.2004 г. – С. 41-42.
  57. Boronina L.G. Childhood Haemophilus influenzae type b meningitis in Ural / L.G. Boronina, S.V. Pengenina, N.V. Murunova, A.I. Gruzdev // 14th Europen Congress of Clinical Microbiology and infectious Diseases. – Prague. – 1-4.05.2004. – P. 575.
  58. Боронина Л.Г. Антибиотикорезистентность возбудителей хронических бронхо-деструктивных инфекций у детей к -лактамам  и цефалоспоринам / Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина, С.М. Блинова // Материалы ХI Всероссийского конгресса «Человек и лекарство» - Москва, апрель 2004. – С. 426.
  59. Боронина Л.Г.  Микробиологические аспекты нозокомиальных инфекций в отделениях раннего возраста в детской многопрофильной больнице / Л.Г. Боронина, С.Ю. Устюгова, Л.А. Уфимцева, С.М. Блинова // Сборник научных  статей «Актуальные проблемы профилактики нозокомиальных инфекций в учреждениях родовспоможения и детства». – Екатеринбург. - 2004. – С. 11-17.
  60. Boronina L.G. Aetiology of community-acguired pneumonia in children / L.G. Boronina // Abstracts of the 6 th  Europen Congres  of Сhemotherapy and Infectioun. -Paris, France. -1-4.12.2004. – Р. 81.
  61. Боронина Л.Г. Микробиологические аспекты нозокомиальных инфекций у детей в реанимационном отделении /Л.Г. Боронина, С.С.Устюгова, Л.А.Уфимцева, С.М.Блинова //Актуальные проблемы профилактики нозокомиальных инфекций в учреждениях родовспоможения и детства» // Материалы 1-й Региональной  научно-практической конференции 18 ноября 2003 г., Екатеринбург – 2004. – С. 11-17.
  62. Одегова Т.Ф. Поиск противомикробных лекарственных средств  среди продуктов органического синтеза / Т.Ф. Одегова, Л.Г. Боронина, М.В. Томилов, С.С. Швецова, В.В. Новикова, Е.В. Буканова // Сборник трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. - Выпуск 60. – Пятигорск, 2005. – С. 400-401.
  63. Боронина Л.Г. О роли резистентных бактерий в обострении бронхолёгочных заболеваний у детей с обструктивным синдромом / Л.Г. Боронина // АСТМА. - 2004. - том 5. - №1. – С. 113.
  64. Boronina L.G. Central nervous system bacterial infection aetiology / L.G. Boronina // Abstract of 23 rd annual meeting of the European Society for Peadiatric Infectious Diseases.-Valencia, Spain.- 18-20.05.2005. – Р. 116.
  65. Боронина Л.Г. Изучение назофарингеального носительства Haemophilus influenzae у детей Среднего Урала / М.П. Кукушкина, Л.Г.Боронина // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2005. – Т.7.-№2. - прил.1. - С. 39.
  66. Боронина Л.Г. Антибиотикорезистентность штаммов Haemophilus influenzae, выделенных от детей с хроническими воспалительными заболеваниями бронхов и лёгких / С.М. Блинова,Л.Г. Боронина /// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2005. – Т.7.-№2 - прил.1.- С. 15.
  67. Boronina L.G. Resistence of bacteria isolated from children with chronic bronchopulmonery diseases / L.G. Boronina // Abstract of 2 nd  the International «Resistant gram-positive infections». - Berlin, Germany. - 10-12.12.2004. – P. 208.
  68. Боронина Л.Г. Диагностические критерии исследования спинномозговой жидкости и этиология бактериальных осложнений этапного шунтирующего лечения гидроцефалии у детей / Л.Г. Боронина, В.Б. Чудаков, Т.А. Шумихина, Т.И. Лахно // Уральский медицинский журнал.- 2005. - №6 (16). – С. 26-29.
  69. Боронина Л.Г. Этиологическая диагностика гнойных  бактериальных менингитов на Среднем Урале у детей / Л.Г. Боронина // Эпидемиология и инфекционные болезни.-2005. - №3. - С. 18-23.
  70. Boronina L.G. Microbiology of meningitis in hospitalised patients of Ural region, Russia: 7-year surveillance / L.G. Boronina // abstract book of the15th Europen Congress of Clinical Microbiology and infectious Diseases. - Copenhagen. - 2-5.04.2005. - P. 1676.
  71. Боронина Л.Г. Состояние микрофлоры зева и носа у детей с острым лимфобластным лейкозом / Л.Г. Боронина, С.М. Блинова, Л.Г. Фечина // Сборник научных трудов «Cпециализированная помощь детям Екатеринбурга и области». – Екатеринбург, 2005. – С. 118-120.
  72. Boronina L.G. New original compounds as perspective remedies of infections chemotherapy / L.G. Boronina, M.V. Tomilov, T.F. Odegova // Материалы международной научно-практической конференции «Фармация и здоровье» - Пермь, 2005. – С. 275.
  73. Боронина Л.Г. Гнойно-септические и раневые инфекции. Гемофильная палочка / Л.Г. Боронина // Руководство по военной микробиологии / Под ред. В.Б. Сбойчакова, К.К. Раевского, В.М. Добрынина.- М.: Военное издательство, 2005.- С. 106-107.
  74. Боронина Л.Г. Этиология бактериальных менингитов в Екатеринбурге и области / Л.Г. Боронина // Сборник научных трудов «Cпециализированная помощь детям г. Екатеринбурга и области». – Екатеринбург, 2005. – С. 116-118.
  75. Одегова Н.М. Новые оригинальные соединения как перспективные средства химиотерапии инфекций / Н.М. Одегова, Л.Г.Боронина, Т.Ф. Игидов, В.В. Новикова, М.В. Томилов // Тезисы докладов  «2-го Всероссийского съезда фармацевтических работников», Сочи «Дагомыс»,  4-8.06.2005 г. – С. 117.
  76. Одегова Н.М.  Новые оригинальные соединения в химиотерапии  грамотрицательных инфекций / Т.Ф. Одегова, Л.Г. Боронина, М.В. Томилов, Б.Я. Сыропятов, В.В. Новикова // «Современные  проблемы фармакологии  и фармации» материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Новосибирск, 2005. – С. 197-198.
  77. Боронина Л.Г. Антибиотикорезистентность пневмотропных бактерий, обнаруженных при бронхоскопии у детей с воспалительными заболеваниями бронхов и лёгких нетуберкулёзной этиологии / Л.Г. Боронина, Т.Ф. Одегова, В.В. Новикова // Материалы международной научно-практической конференции «Фармация и здоровье», Пермь, 2005. – С. 166.
  78. Боронина Л.Г. Эпидемиологические особенности штаммов  H.influenzae «b», вызвавших гнойный менингит у детей в Екатеринбурге / Л.Г. Боронина, С.В. Пинженина // Вестник Уральской Государственной медицинской академии.- Екатеринбург. – Выпуск 6. – 2006.- С. 50-53.
  79. Боронина Л.Г. Инфекция орбиты глаза, вызванная H. influenzae / Л.Г. Боронина //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2006. – том 1, прил. 1. – С. 12.
  80. Боронина Л.Г. Антибиотикорезистентность штаммов H. influenzae, выделенных от детей с хроническими воспалительными заболеваниями бронхов и легких / Л.Г. Боронина, С.М. Блинова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2006. – том 2, №3. – С. 55.
  81. Боронина Л.Г. Характеристика возбудителей нейроинфекций у детей Свердловской области / Л.Г. Боронина // Уральский медицинский журнал. – 2006. - №1 (20). – С. 12-19.
  82. Боронина Л.Г. Этиология сепсиса и бактериальных менингитов у детей в отделении реанимации и интенсивной терапии / Л.Г. Боронина, М.П. Кукушкина, С.С. Устюгова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2006. – Т.2, №3. – С. 12-14.
  83. Боронина Л.Г. Микробиологический мониторинг СМЖ при этапном шунтирующем лечении постгеморрагической гидроцефалии / Л.Г. Боронина, В.Б. Чудаков, Т.А. Шумихина // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2006. – Т.2, №3. - С. 17.
  84. Боронина Л.Г. Haemophilus influenzae в патологии беременных и новорожденных / Л.Г. Боронина, Л.Я. Козлова, Н.В. Мурунова // Уральский медицинский журнал. – 2006. - №2. – С. 31-34.
  85. Боронина Л.Г. Инфекции, вызванные H.influenzae, у детей Екатеринбурга и Свердловской области / Л.Г. Боронина, Л.Я. Козлова, Г.Д. Рухтаева // «Актуальные проблемы эпидемиологии, профилактики инфекционных болезней» тезисы доклада Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, Самара, 23-26.05.2006. – С. 15.
  86. Боронина Л.Г. H. influenzae «b» - менингиты в структуре бактериальных менингитов у детей Среднего Урала / Л.Г. Боронина, Н.В. Мурунова, А.И. Груздев // «Актуальные проблемы эпидемиологии, профилактики инфекционных болезней» тезисы доклада Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, Самара, 23-26.05.2006. – С. 17.
  87. Боронина Л.Г. Популяционный иммунитет к Haemophilus influenzae  у детей Свердловской области /Л.Г. Боронина //Журнал иммунологов Урала ( материалы 5-й конференции иммунологов Урала, Оренбург, 30.10-01.11.2006.) - 2006. -№1.(5). - С.42-43.
  88. Цвиренко С.В Лабораторная диагностика в практике врача-педиатра и терапевта / С.В. Цвиренко, В.В. Базарный Л.Г. Боронина // Подростковая медицина / Руководство для врачей под ред. А.М. Чередниченко, член-корр. РАМН А.П. Ястребова. – Екатеринбург, УГМА, 2006 – С. 730-749.
  89. Боронина Л.Г. Характеристика специфического иммунитета к Haemophilus influenzae, и уровня назофарингеального носительство у детей / Л.Г. Боронина // Уральский медицинский журнал. – 2006. - №5. С. 27-33.
  90. Боронина Л.Г. Молекулярно-генетические и фенотипические особенности штаммов H.influenzae, вызвавших менингит / Л.Г. Боронина, А.Е. Платонов, К.О. Миронов // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2006 - № 3.- С.47-52.
  91. Боронина Л.Г. Тестирование к антибиотикам  возбудителей инфекций – необходимое условие адекватной антибактериальной терапии / Л.Г. Боронина, С.М. Блинова // Уральский медицинский журнал. – 2006. – спец. выпуск. - №2. - С. 101-105.
  92. Боронина Л.Г. Лабораторные методы выделения, идентификации и определения резистентности к антибиотикам Haemophilus influenzae / Л.Г. Боронина // 2-e дополненное, издание УГМА – 2007 - 17c.
  93. Боронина Л.Г. Бактериальные менингиты, вызванные Haemophilus influenzae «b» в Екатеринбурге / Л.Г. Боронина // Уральский медицинский журнал. – 2007 - №1. - С. 86-89.
  94. Боронина Л.Г. Инвазивные инфекции, вызванные Haemophilus influenzae, в Екатеринбурге: 15-летнее исследование / Л.Г. Боронина // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2007. - Т. 9.- №2, приложение (в печати).
  95. Боронина Л.Г. Haemophilus influenzae-инфекция у детей / Сбойчаков В.Б., Боронина Л.Г., Владимирова Н.Г. // Клинико-лабораторный консилиум. – 2007. - № 14. - С. 43-46.
  96. Боронина Л.Г. Антибиотикорезистентность штаммов H. influenzae, выделенных от детей с инфекционными заболеваниями в Екатеринбурге / Л.Г. Боронина, С.М.Блинова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2007. - Т.9 - №2 (в печати).
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.