WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ _____________________________________________________________________________

На правах рукописи

ШАРОЙКО Владимир Владимирович

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ И СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ СЕКРЕЦИЮ ИНСУЛИНА -КЛЕТКАМИ ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, И ИХ РОЛЬ В НОРМЕ И ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

Специальность 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург – 2011

Работа выполнена на базе следующих научно-исследовательских учреждений: лаборатория экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны СО РАН (г. Якутск, РФ), Центр исследований диабета и эндокринологии им. Рольфа Люфта Каролинского медицинского университета (г.

Стокгольм, Швеция), лаборатория молекулярного метаболизма Центра исследований диабета Лундского университета (г. Лунд, г. Мальмо, Швеция).

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Шишкин Сергей Сергеевич Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, лаборатория биомедицинских исследований, г. Москва.

доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич Институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, лаборатория общей патологии, г. Санкт-Петербург.

доктор биологических наук, профессор Кудрявцев Борис Николаевич Институт цитологии РАН, лаборатория клеточной патологии, г. Санкт-Петербург.

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им.

И.М. Сеченова РАН, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится «20» октября 2011 г. в 16 часов на заседании совета Д 212.232.по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете (СПбГУ) по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького СПбГУ.

Автореферат разослан « » мая 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 212.232.09, кандидат биологических наук Л.С. Курилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По определению Международной Диабетической Федерации, сахарный диабет (СД) характеризуется как эпидемия. Предполагаемый показатель распространенности этого заболевания к 2025 году может составить около 3миллионов человек (Diabetes Atlas IDF, 2006). Уже сегодня СД является большой медицинской и социально-экономической проблемой общества (Zimmet, et al., 2001). Около 10-15% от общего числа больных СД составляют люди, страдающие СД первого типа (СД1), тогда как остальная часть приходится на СД второго типа (СД2; Diabetes Atlas IDF, 2006). СД1 связан с прогрессивной деструкцией -клеток в результате аутоиммунных процессов в островках Лангерганса поджелудочной железы, индуцированных макрофагами и Т-лимфоцитами (Chandra et al., 2001; Mandrup-Poulsen et al., 2003). Провоспалительные цитокины, в особенности интерлейкин-1 (ИЛ-1), фактор некроза опухоли- (ФНО-) и интерферон- (ИФ-), играют важную роль в патогенезе СД1, вызывая некротическую или апоптотическую гибель -клеток островков Лангерганса (Mandrup-Poulsen et al., 2001).

СД2 является метаболическим заболеванием, в патогенезе которого выделяют два главных компонента: инсулинорезистентность периферических тканей и снижение секреции инсулина -клетками островков Лангерганса поджелудочной железы (Yki-Jarvinen et al., 1994; Polonsky et al., 1996). Согласно последней этиологической классификации нарушений гликемии, СД2 может быть с преобладанием дефектов секреции инсулина или преобладанием инсулинорезистентности (Report of WHO Consultation, 1999). Установлено, что генетические факторы и факторы внешней среды вовлечены в патогенез СД2 (Gloyn et al., 2001). При действии этих факторов -клетки островков Лангерганса не способны компенсировать повышение концентрации глюкозы в крови адекватным увеличением секреции инсулина (Muoio et al., 2006), приводя к развитию гипергликемии и других метаболических нарушений. Подавление инсулиносекреторной функции -клеток является признаком СД2 и рассматривается как один из вероятных механизмов снижения толерантности инсулинозависимых тканей к глюкозе (Groop, 2000; LeRoith, 2002; Del Prato et al., 2004; Ahren, 2005). При СД гипергликемия и воздействие провоспалительных цитокинов вызывают дефицит инсулина как минимум по двум механизмам: нарушение секреции инсулина и уменьшение популяции -клеток в результате индукции апоптоза (Cnop et al., 2005). В связи с этим, разработка стратегии протекции -клеток в отношении цитотоксического пролонгированного действия глюкозы в повышенной концентрации и провоспалительных цитокинов заслуживает особого внимания.

Глюкоза – главный физиологический стимул секреции инсулина -клетками. В норме, повышение е концентрации в крови приводит к активации транспорта глюкозы в -клетки.

Последующий метаболизм глюкозы генерирует метаболические и сигнальные каскады реакций, которые вызывают секрецию инсулина по двум основным механизмам:

инициирующий и амплифицирующий (Henquin, 2009). Первый из них запускается путем закрытия АТФ-зависимых К+-каналов вследствие увеличения отношения [АТФ] к [АДФ] в результате метаболизма глюкозы. При закрытии К+-каналов клеточная мембрана деполяризуется, приводя к открытию потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа.

Последующее увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ запускает экзоцитоз инсулина. Инициирующий механизм изучен достаточно хорошо (Ashcroft et al., 1984), тогда как амплифицирующий механизм секреции инсулина изучен недостаточно. Более того, остаются до конца невыясненными особенности генной и метаболической регуляции секреции инсулина, а также роль полиморфных модификаций генов, изменение уровней метаболитов, вторичных посредников, активности трансляционных и транскрипционных факторов в этом процессе.

Для лечения пациентов с СД2 используется широкий спектр фармакологических препаратов с различным механизмом действия, направленных на улучшение гомеостаза глюкозы. В течение многих лет препараты сульфонилмочевины, мишенью воздействия которых являются -клетки, доминируют на фармацевтическом рынке (Krentz et al., 1994, Aquilante, 2010; Polakof, 2010). Недостатком препаратов этого класса являются эпизоды гипогликемий (Ferner et al., 1988; Shorr et al., 1997) и стимуляция апоптоза -клеток (Maedler et al., 2005). Кроме того, большинство пациентов, получающих лечение производными сульфонилмочевины в течение 3-10 лет, становятся нечувствительными к данному классу препаратов (Groop et al., 1992). В этой связи представляют интерес новые классы соединений, синтезированные химическим путем или биологически активные соединения природного происхождения, обладающие глюкозонормализующим эффектом и пониженной токсичностью.

Таким образом, независимо от инициирующих факторов, на начальных и последующих этапах развития СД, в островках Лангерганса наблюдается деструкция и прогрессирующее уменьшение количества -клеток вплоть до полного их исчезновения и развития абсолютной инсулиновой недостаточности (Bonora, 2008; Meier, 2008; Eizirik, 2009), поэтому перспективным направлением в лечении СД1 является разработка методов сохранения имеющихся -клеток на ранней стадии заболевания, а при СД2 – на всех стадиях заболевания. В данной работе обобщены результаты цикла исследований, направленных на выяснение физиолого-биохимических механизмов функционирования клеток в норме и при патологии, результаты которых могут быть использованы при разработке фармакологических и молекуярно-генетических методов протекции -клеток не только для предотвращения развития СД, но и уже при развившемся СД.

Цели и задачи исследования Цель работы. Изучение метаболических и сигнальных путей, участвующих в секреции инсулина -клетками островков Лангерганса в норме и при патологии с целью разработки стратегии воздействия на эти пути с помощью фармакологических и молекулярно-генетических методов для нормализации функциональной активности этих клеток.

В ходе исследования решались следующие основные задачи 1. Разработать экспериментальную модель для исследования механизмов секреции инсулина -клетками в условиях in vitro.

2. Используя разработанную модель, изучить особенности метаболизма в -клетках с нормальной и сниженной секрецией инсулина.

3. Изучить эффект глюкозы в повышенной концентрации и цитокинов на метаболизм и секрецию инсулина в -клетках.

4. Исследовать изменение профиля метаболитов и сигнальных молекул в -клетках при стимуляции их глюкозой.

5. Выявить полиморфизм генов, связанных с функционированием митохондрий в клетках и риском развития СД2.

6. Изучить сигнальные пути инсулинотропного действия некоторых имидазолиновых соединений и некоторых классов биологически активных соединений природного происхождения в -клетках.

7. Исследовать протективные свойства некоторых имидазолиновых соединений и супрессора цитокинового сигнального пути-1 в отношении цитотоксического действия провоспалительных цитокинов на -клетки.

8. Изучить роль в секреции инсулина ряда белковых молекул, которые в -клетках ранее не исследовались.

Научная новизна исследования Проведенное исследование впервые показало, что одним из механизмов снижения чувствительности к глюкозе клональных -клеток является стабилизация (т.е. индукция транскрипционной активности) транскрипционного фактора HIF-1 (индуцированного гипоксией фактора-1). В этих клетках HIF-1 вызывает нарушение метаболизма глюкозы за счет разобщения гликолиза и метаболизма пирувата в митохондриях, которое приводит к подавлению глюкозостимулированной секреции инсулина.

Известно, что при СД2 наблюдается гипергликемия и повышение в крови концентрации ФНО-, которые участвуют в развитии осложнений СД2 и в том числе снижают инсулиносекреторную активность -клеток. Впервые на модели клональных клеток in vitro установлено, что пролонгированное воздействие глюкозы или ФНО- в повышенной концентрации приводит к стабилизации HIF-1 и, соответственно, к снижению глюкозостимулированной секреции инсулина. При этом обнаружено HIF-1контролируемое ингибирование метаболизма пирувата в реакциях пируватдегидрогеназного комплекса и активация анаэробного гликолиза. Полученные данные имеют существенное значение для понимания механизмов снижения чувствительности -клеток к глюкозе при прогрессировании СД2.

При пролонгированном действии глюкозы в повышенной концентрации на -клетки возрастает экспрессия гена-мишени HIF-1 – Pdk1 и его белкового продукта – киназы-пируватдегидрогеназы (PDK1). Показано, что выключение PDK1 усиливает глюкозостимулированную секрецию инсулина клональными -клетками за счет увеличения митохондриального метаболизма пирувата, дыхания и продукции АТФ митохондриями.

Установлено, что пентозофосфатный цикл участвует в амплифицирующем механизме секреции инсулина -клетками за счет синтеза NADPH, выступающего в этом процессе в качестве сигнальной молекулы, играющей важную роль в экзоцитозе инсулина.

Используя базу данных GWAS (a genome-wide association study) установлено, что полиморфизм гена (rs950994; GA) фактора трансляции митохондрии В1 (TFB1М;

митохондриальная S-аденозилметионин-6-N,N-аденозил(рРНК)диметилтрансфераза-1) ассоциируется со снижением секреции инсулина, повышением постпрандиального уровня глюкозы и риском развития СД2. Установлен механизм, посредством которого ослабление трансляции за счет снижения диметилирования 12S рРНК в митохондриях -клеток приводит к снижению продукции АТФ в митохондриях и подавлению секреции инсулина.

Изучены некоторые биохимические механизмы действия имидазолинового соединения BL11282, обладающего выраженным инсулинотропным эффектом. BL112потенцирует секрецию инсулина путем воздействия на сигнальный путь: АТФ цАМФ+GEFII·Rim2 (GEFII·Rim2 - цАМФ-активируемый белковый комплекс, участвующий в экзоцитозе инсулина) цАМФ-GEFII·Rim2, контролируемый аденилатциклазой и сигнальный путь: фосфолипид арахидоновая кислота эпоксиэйкозатриеновая кислота, контролируемый кальций-независимой фосфолипазой А2 (iPLA2) и цитохромом Р450.

Обнаружены протективные свойства имидазолина RX871024 (уменьшение продукции NO) и SOCS-1 (снижение активности каспаз и апоптоза), частично снижающие цитотоксическое действие провоспалительных цитокинов на -клетки.

Идентифицированы белок GAS6 и его рецептор AXL в -клетках и показана их функциональная роль в -клетках, заключающаяся в контроле секреции инсулина и синтеза ФНО-. Установлен один из механизмов внутриклеточной передачи сигнала в -клетках при действии GAS6: GAS6 аутофосфорилирование AXL фосфорилирование PI3киназы фосфорилирование Akt ...... фосфорилирование GAPDH и GRP78...... эффекторные системы.

Усовершенствована модель субстратно-энзиматических и сигнальных процессов, объясняющая регуляцию секреции инсулина -клетками.

Научно-практическое значение работы Данное исследование относится к разряду фундаментально-прикладных работ.

Применяя вышеперечисленные подходы (модели) нам удалось получить новую информацию о некоторых механизмах функционирования -клеток в норме и патологии, выявить новые белки, являющиеся потенциальными мишенями для фармакологического или молекулярно-генетического воздействия, а также предложить способы коррекции функциональных нарушений -клеток при СД. Полученные результаты углубляют представления о фундаментальных молекулярных механизмах, лежащих в основе регуляции секреции инсулина под действием глюкозы, инсулинотропных соединений класса имидазолинов (на примере BL11282 и RX871024) и биологически активных веществах растительного происхождения (на примере экстракта из слоевищ лишайника рода Cladonia). Данная информация может быть полезна при разработке новых способов управления функциональной активностью -клеток и коррекции метаболических нарушений при СД2. На использование экстракта из слоевищ лишайника рода Cladonia (препарат “Ягель”) в коррекции метаболических нарушений при СД2 подана заявка на патент РФ.

Изучение имидазолиновых соединений продемонстрировало возможность использования имидазолинов в качестве инструмента для изучения путей передачи сигнала в -клетках островков поджелудочной железы, и перспективность дальнейшего комплексного исследования имидазолинов с целью разработки фармацевтических препаратов для лечения СД2.

Ингибирование PDK1 усиливает глюкозостимулированную секрецию инсулина в клетках, поэтому создание селективных ингибиторов данного фермента может рассматриваться как одно из направлений фармакологической терапии СД2 при секреторной дисфункции -клеток.

Результаты исследования имеют важное практическое значение в плане выявления молекулярных основ этиологии и патогенеза СД2, а также в создании новых подходов для диагностики. Исследование ведущей роли трансляционного фактора TFB1М в механизме секреции инсулина показало, что он является важным компонентом в патогенезе СД2, связанным с нарушением функционирования митохондрий.

Генотипирование полиморфизма (rs950994) гена TFB1М внедрено в панель геновриска для диагностики предрасположенности к развитию СД2. Полученная информация позволяет проводить анализ нарушений отдельных звеньев в механизме секреции инсулина, связанных с дисфункцией митохондрий.

В качестве in vitro модели для изучения механизмов секреции инсулина в норме и при патологии предложены постоянные клеточные линии глюкозочувствительных и глюкозонечувствительных -клеток.

Показано, что экстракт из слоевищ лишайника рода Cladonia (препарат “Ягель”) стимулирует глюкозозависимую секрецию инсулина in vitro и обладает глюкозонормализующим действием у пациентов, страдающих СД2.

Результаты исследований используются автором при чтении лекций для студентов биологических и медицинских специальностей.

Личный вклад автора. Работа выполнена на базе следующих научноисследовательских учреждений: Лаборатория Экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны СО РАН (г. Якутск, РФ), Центр исследований диабета и эндокринологии им. Рольфа Люфта Каролинского медицинского университета (г. Стокгольм, Швеция), Лаборатория молекулярного метаболизма центра исследований диабета Лундского университета (г.

Лунд, г. Мальмо, Швеция). Экспериментальные данные получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии. Планирование и проведение экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов и написание статей осуществлялось самим автором, либо при его активном участии. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Метаболомный анализ -клеток проводился совместно с Петером Шпегелем и Хиндриком Мульдером. Протеомный анализ островков и -клеток проводилась в тесном взаимодействии с Томасом Коком и Терезой Ягербринк. LS/MS-MS и MALDI-trap анализ пептидов выполнялся в центре протеомных исследований Лундского университета. Генотипирование производилось в лаборатории центра секвенирования Лундского университета. Анализ данных из GWAS проводился совместно с Валерией Лысенко и Шарлот Линг. Исследование апоптоза осуществлялось совместно с Ириной Зайцевой, Иохимом Сторлингом и Сергеем Зайцевым. Отдельные этапы работы проводились совместно с Борисом Кершенгольцем.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Разобщение аэробного гликолиза и митохондриального метаболизма пирувата играет ведущую роль в прогрессировании инсулиносекреторной дисфункции -клеток.

2. Пролонгированное действие глюкозы в повышенной концентрации и фактора некроза опухоли- (ФНО-) на -клетки вызывают стабилизацию фактора, индуцированного гипоксией-1 (HIF-1), приводя к снижению чувствительности -клеток к глюкозе.

3. Пентозофосфатный цикл, в ходе которого генерируется НАДФН, вовлечен в амплифицирующий механизм секреции инсулина -клетками.

4. Полиморфизм гена фактора трансляции митохондрии В1 (tfb1m; rs950994, GA) ассоциируется с дефектом секреции инсулина и с риском развития СД2.

5. Инсулинотропное действие имидазолинового соединения BL11282 опосредовано цАМФ-зависимым механизмом, взаимодействием цАМФ с комплексом GEFII•Rim2 и метаболизмом арахидоновой кислоты в эпоксиэйкозатриеновые кислоты. Кроме того, BL11282 повышает чувствительность -клеток к глюкозе.

6. Имидазолиновое соединение RX871024 и ингибитор внутриклеточной передачи сигнала цитокинов-1 (SOCS-1) снижают цитотоксическое действие провоспалительных цитокинов.

7. Белок “growth arrest-specific protein” (GAS6) и его рецептор AXL продуцируются в клетках. Подавление синтеза рецептора AXL снижает секрецию инсулина.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах кафедры биологической химии Северо-Восточного федерального университета им. М.К. Аммосова (г. Якутск), Лаборатории экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, Лаборатории молекулярного метаболизма Лундского университета (г. Лунд, г. Мальмо, Швеция), Лаборатории диабета и эндокринологии Каролинского медицинского университета (г. Стокгольм, Швеция).

Отдельные аспекты работы были представлены на следующих международных конференциях: “European Association for the Study of Diabetes” (Rom, Italy, 2008; Vienna, Austria, 2009; Stockholm, Sweden, 2010); ”Gordon Research Conferences: Molecular & Cellular Bioenergetics” (Andover, USA, 2009); “What’s next” (Malm, Sweden, 2009); “Islet Study Group”, (Steinschaler Drfl, Austria, 2009); ”World Diabetes Congress, IDF” (Montreal, Canada 2009); “Scandinavian Society for the Study of Diabetes” (Malm, Sweden, 2010).

Публикации. Основные результаты исследования, выводы и положения диссертации опубликованы в 30 печатных работах в отечественной и зарубежной печати, из них работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Благодарности. Я выражаю искреннюю благодарность моим прежним и настоящим коллегам вышеуказанных лабораторий, в которых была выполнена диссертационная работа, за сотрудничество, общение, понимание и поддержку. Выражаю особую признательность моим учителям, профессорам Борису Моисеевичу Кершенгольцу и Алле Николаевне Журавской (ИБПК СО РАН, г. Якутск).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, глав “Обзор литературы” (глава 1), “Материалы и методы” (глава 2), изложения полученных результатов (главы 3-10), обсуждения результатов (глава 11), выводов, списка литературы, включающего 290 источников, и 4 приложений. Диссертация изложена на 300 страницах текста и включает 8 таблиц и 112 рисунков.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (РФ), программы Президиума РАН “Фундаментальные науки - медицине”, фармацевтической компании Ново Нордиск (Дания), Шведского Совета по исследованиям (Швеция).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методология исследования Материалы. В работе использовались островки или кластеры -клеток, изолированные из поджелудочных желез крыс линии Вистар, диабетических крыс ГотоКакизаки, мышей С57BL/6J, NMRI, SOCS-1 Tg, ob/ob, SUR1 (-/-), Tfb1m (+/-) и -Tfb1m (-/-) и донорские островки человека. Эксперименты с животными были выполнены в соответствии с международными правилами обращения с экспериментальными животными и одобрены локальными этическими комитетами. Островки Лангерганса из поджелудочных желез человека были получены при аутопсии лиц контрольной группы (n=55; возраст 56,7±9,лет; ИМТ 25,9±3,6 кг/м2; HbA1c 5,7 ± 0,8 %) и больных СД2 (n=9; возраст 57,0 ± 13,1 лет, ИМТ 28,5 ± 4,7 кг/м2, HbA1c 7,3 ± 1,2 %); в обеих выборках соотношение доноров мужского и женского полов составляло примерно 1:1.

Изолирование островков Лангерганса у грызунов проводилось путем введения коллагеназы (Roche, 0,8 мг/мл) в поджелудочную железу через желчный проток (Gregory et al., 2007) или путем экстирпации поджелудочной железы с последующей ее диссоциацией коллагеназой (0,8 мг/мл) в среде Хенкса (Lacy and Kostianovsky, 1967). Изолированные островки грызунов инкубировались при 37°С и концентрации СО2 в инкубаторе 5% в среде RPMI1640 (Sigma), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина сульфата (Sigma). Островки человека инкубировались при 37°С и концентрации СО2 в инкубаторе 5% в среде CMRL1066 (ICN Biomedicals) с добавлением 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина (Sigma), 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл фунгизона, 20 мкг/мл ципрофлоксацина и 10 мМ никотинамида (Invitrogen). Затем островки использовали для проведения экспериментов. Кластеры клеток получали путем диссоциации островков в среде, не содержащей ионов Са2+ и Mg2+ (Lernmark, 1974). Кроме того, в процессе исследования были использованы культуры клеток инсулиномы мыши – MIN6, инсулиномы крысы – INS-1 832/13 и INS-1 832/2.

Клетки линии MIN6 и INS-1 культивировались в средах DMEM и RPMI1640, соответственно. Все использованные реактивы были аналитической степени чистоты (марки ЧДА).

Методология исследования. Основной экспериментальный подход в данной работе заключался в моделировании диабетических условий при действии высоких концентраций глюкозы, цитокинов, siRNA, в использовании нокаутных мышей, глюкозочувствительных и глюкозонечувствительных культивируемых -клеток и в однократном введении стрептозотоцина мышам интраперитонеально (75 мг/кг).

Для измерения секреции инсулина в статических условиях в присутствии глюкозы, ингибиторов и стимуляторов секреции инсулина, островки Лангерганса и клональные клетки инкубировались в буфере Кребса (114 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ KH2PO4, 1,мМ MgSO4, 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота, 2,5 мМ CaCl2, 25,5 мМ NaHCO3, 0,2% БСА, pH 7,2; Sharoyko et al., 2007). Для изучения секреции инсулина в динамических условиях -клетки в количестве 3106 помещались в 4 перфузионные камеры, через которые инфузировался буфер со скоростью 1мл/мин. Пробы отбирались каждые 2 мин (Straub et al., 1996). Концентрация инсулина и общее содержание инсулина измерялось радиоиммунным (Coat-A-Count, Siemens) или иммуноферментным (Ultrasensitive Mercodia) методами с использованием крысиного или человеческого инсулина в качестве стандарта (Malmgren et al., 2009). Высвобождение арахидоновой кислоты в островках измерялось методом радиометрических индикаторов (Simonsson et al., 1998), с использованием островков преинкубированных с [5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15-3H]арахидоновой кислотой (удельная активность 180-240 Ci/ммоль; PerkinElmer Life Sciences).

Концентрация гликозилированного гемоглобина, фракция HbA1c, в крови доноров определялась методом ионно-обменной хроматографии, используя Mono-S протокол (Jeppsson et al., 2002). Выделение митохондрий из -клеток проводилось методом дифференциального центрифугирования (Rabilloud at al., 2008). Активности комплексов I, II, III, и IV цепи транспорта электронов в изолированных митохондриях регистрировали в присутствии субстратов НАДН/убихинона1, 2,6-дихлорфенолиндофенола/убихинона1, цитохрома С(III)/убихинола1 и цитохрома С(II), соответственно (Birch-Machin et al., 2001).

Активность АТФсинтазы определялась путем измерения количества фосфат-анионов, образовавшихся в результате обратной АТФазной реакции, используя набор реактивов фирмы Novus (Zeqiraj et al., 2009). Измерялись также некоторые параметры метаболизма в островках и -клетках. Скорость потребления кислорода -клетками регистрировалась на приборе Seahorse Extracellular Flux Analyzer XF24, оборудованном кислородчувствительным флуоресцентным зондом (Malmgren et al., 2009). Скорость утилизации глюкозы измерялась методом радиометрических индикаторов по продукции 3H2О из [5-3H]глюкозы (удельная активность 19,63 Ci/ммоль; PerkinElmer Life Sciences; Hirose et al., 1996). Концентрация лактата измерялась энзимологическим методом в присутствии НАД+, 1-метокси-5-метилфетазин метилсульфата и тетранитротетразолиевого синего (Biovision).

Активность цитратсинтазы регистрировалась с использованием в качестве индикаторной реакции превращение 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоты в 5-тио-2-нитробензойную кислоту (Sigma). Концентрация и кинетика синтеза АТФ измерялась в нашей модификации люминометрическим методом с использованием люциферазы светляков (Malmgren et al., 2009). Концентрации NADPH и NADP+ измерялись энзимологическим методом с использованием циклической реакции с участием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и индикаторной реакции с участием глюконатдегидрогеназы (Passonneau and Lowry, 1993). Активность окислительного декарбоксилирования пирувата измерялась спектрофотометрически при длине волны 450 нм в экстракте митохондрий клеток с использованием иммобилизованных антител к пируватдегидрогеназе и индикаторной реакции с участием 1-метокси-5-метилфетазин метилсульфата и тетранитротетразолиевого синего (Mitosciences Inc.).

Молекулярно-биологическая часть работы проводилась с использованием методов генной инженерии, клонирования, бактериальной трансформации, изоляции нуклеиновых кислот (DNA/RNAeasy DNA/RNA purification kit; Qiagen), обратной транскрипции (RevertAidTM First-Strand cDNA synthesis kit; Fermentas), амплификации специфичных последовательностей методом полимеразной цепной реакции, секвенирование нуклеотидных последовательностей (набор реактивов от Applied Biosystems), ДНКмикрочипирования (TaqMan LDAs; Applied Biosystems) для анализа экспрессии генов, кодирующих ферменты метаболизма, ДНК-микрочипирования (Affymetrix Inc) для анализа глобальной экспрессии генов в островках человека. Генотипирование проводили, используя Affimetrix 500K микрочип или MALDI-TOF масс-спектрометрию. Содержание митохондриальной ДНК (мтДНК) измерялось методом ПЦР, используя соотношение числа копий -глобина (кодируется ядерной ДНК) к числу копий ND1 (кодируется мтДНК), primer-extension assay для определения активности TFB1M.

Бридинг мышей с Tfb1m (+/-) осуществлялся путем скрещивания Tfb1m (+/-) с С57BL/6J (-/-) мышами. Генерация мышей с полным нокаутом Tfb1m в -клетках (-Tfb1m ) проводилась с использованием rip-cre-loxP системы.

Методы клеточной биологии включали трансфекцию плазмид (pRcCMVi.EGFP, pRcCMVi.Rhes, pB.rIns1.EGFP, pB.rIns1.Rhes-antisense, мутант pSR-cAMP-GEFII (G114E, G422D) и мутант CMV-HA-Rim2A (193-830) с использованием трансфекционного реагента LipofectAMINE 2000 (Invitrogen), трансфекцию малых интерферирующих РНК - siРНК с использованием трансфекционного реагента DharmaFECT® 1 (Dharmacon), измерение активности каспаз-3, -8 (Oncoge) и -9 (R&D), апоптоза (TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling; TUNEL; Roche) и выживаемости (реагент - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5(3-карбосиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий; Promega) -клеток, обработанных смесью провоспалительных цитокинов ИЛ-1 (Calbiochem), ФНО- (Sigma, Peprotech), ИФ- (Life Technologies). Оптимизированные нами условия десенситизации ответа островков Лангерганса к имидазолиновым соединениям и трансфекция плазмид использовалась как метод для изучения механизма действия имидазолиновых соединений.

Концентрация NO2--анионов в экспериментах по обработке островков цитокинами и/или имидазолиновыми соединениями определялась реагентом Гриса (Alexis Corporation).

Конфокальная микроскопия проводилась на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS-NT (Leica Microsystems) и Carl Zeiss Laser Scanning System LSM PASCAL (Carl Zeiss GmbH). PMPI и метиловый эфир тетраметилродамина использовались для измерения плазматического и митохондриального потенциалов, соответственно.

Протеомные исследования включали SILAC (stable isotope labeling with amino acids in cell culture) использованием 12С614N1 Leu и 13С615N1 Leu, иммуноблоттинг с использованием моно- и поликлональных антител для идентификации белков: ND5, ND6, NDUFB8, SDHB, core2, V-, COX1, ATPA, QCR2, Cytb (Mitosciences), фосфо-JNK1/2, фосфо-p38, фосфоERK1/2 (Cell Signaling), PDK1, LDHA (Cell Signalling), HIF-1 (R&D), TFB1М, -тубулин (Santa Cruz); 1-D и 2-D полиакриламидный гель-электрофорез и жидкостную хроматографию с тандемной масс-спектрометрией (MALDI-trap, LS/MS/MS).

Идентификация белков проводилась с помощью базы данных MASCOT MS/MS Ion Search.

Фосфотрансферазная активность c субстратами GST-c-jun, GST-Elk-1 (Calbiochem), Hsp(Stressgen) проводилась в клеточных лизатах методом in vitro с использованием [P]ATP (3000 Ки/ммоль; Amersham). Концентрация общего белка измерялась бицинхониновым методом (Pierce).

Профиль низкомолекулярных метаболитов в -клетках измерялся на газовом хроматографе Agilent 689N (Agilent), соединенном с масс-спектрометром Leco Pegasus III TOFMS (Leco Corp.). Для анализа метаболиты экстрагировались смесью хлороформ/вода (1:1, об/об) с последующей дериватизацией метоксиамин гидрохлоридом в среде сухого пиридина (Fluka). Анализ первичных данных, идентификация пиков и нормирование, проводились с использованием внутренних стандартов, содержащих стабильный изотоп C. Метаболиты идентифицировались по их масс-спектрам и индексам удерживания, с использованием базы NIST или путем сопоставления их со стандартными соединениями.

Физиологические методы включали интраперитонеальный тест толерантности к глюкозе, который выполнялся на мышах предварительно голодающих в течение 5 часов (Fex et al., 2007). Образцы крови получали у анестезированных мышей (мидазолам 0,мг/мышь, в комбинации с флуанизоном 0,9 мг/мышь и фентанилом 0,02 мг/мышь) ретроорбитально через 0, 10, 30, 60 и 120 минут после введения глюкозы (2 г/кг массы тела). Концентрации глюкозы и инсулина плазмы крови определялись с использованием наборов реагентов Infinity Glucose Oxidase Liquid Stable Reagent и Ultrasensitive Mercodia, соответственно.

Cтатистическая обработка данных проводилась с использованием параметрического tкритерия Стьюдента, непараметрического U-критерия Манна-Уитни и коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Сравнение нескольких независимых выборок выполнялось с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA c поправкой Бонферони. В случае нормального распределения измерений величин результаты представлены как среднее ± доверительный интервал среднего для указанного числа экспериментов. В случае отклонения от нормального распределения измерений величин результаты представлены как медиана и интерквартильный размах – нижний 25%-ный и верхний 75%-ный интервалы (указаны в подписи к рисункам). Достоверность полученных результатов оценивали с использованием соответствующих статистических коэффициентов при уровне значимости тестируемой гипотезы р < 0,05. Метод главных компонент и дискриминационный анализ с регрессией на латентные структуры применялись для выявления различий в профиле метаболитов анализируемых образцов. Количественный анализ пептидов проводился с использованием программного обеспечения MaxQuant, опция ”significant-outlier strategy”.

Вклад различных генотипов в риск развития CД2 определялся с помощью критерия “odds ratio” (OR).

РЕЗУЛЬТАТЫ A.

1. Метаболизм глюкозы и его роль в 2### секреции инсулина глюкозо2чувствительными и глюкозоне22,8 mM glucose чувствительными клональными 116,7 mM glucose клетками крысы и островками 1125 ** Лангерганса человека 1*** && На первом этапе исследования клеток изучались те метаболические процессы, которые вовлечены в механизм 832/13 832/2 832/13 832/2 регуляции глюкозостимулированной 35 mM KCl + 250 mM diazoxide секреции инсулина. Предметом изучения были две клональные -клеточные линии B.

INS-1, которые являются глюкозо4чувствительными (832/13; модель 3### “здоровых” клеток) и 3глюкозонечувствительными (832/2;

*** 2модель “диабетических” клеток), 2соответственно. Данные клоны были получены из одного родительского клона 1инсулиномы крысы INS-1.

100 ** Секреция инсулина. In vitro глюкозочувствительные клетки INS1 832/13 секретировали инсулин в 11,832/13 832/раза больше (p<0,01) при высокой концентрации глюкозы (16,7 мМ), чем при C. низкой (2,8 мМ), а глюкозонечувствитель2ные клетки INS-1 832/2 не увеличивали 1секрецию инсулина при повышении 1концентрации глюкозы в инкубационной среде (рис. 1А). Следует отметить, что в 1условиях in vitro для -клеток 2,8 мМ 1концентрация глюкозы считается оптимальной для поддержания базального уровня секреции инсулина, а 16,7 мМ – оптимальной для стимуляции секреции not detected инсулина. Активация КАТР-независимого 832/13 832/механизма в -клетках 832/13 приводила к увеличению базальной (при действии 2,мМ глюкозы) секреции инсулина в 9,Рис. 1. А. Cекреция инсулина клональными раза (p<0,001). Добавление 16,7 мМ клетками, независимая и зависимая (KCl+ глюкозы при этих же условиях далее диазоксид) от активности КАТФ-каналов, n=3.

**p<0,01, ***p<0,001 относительно 2,8 мМ глюкозы увеличивало секрецию инсулина в клетках ### в клетках 832/13, p<0,001 относительно 16,7 мМ 832/13. В клетках 832/2 активация КАТР&& глюкозы в клетках 832/13, p<0,01, ¤¤p<0,независисмого механизма приводила к относительно 2,8 мМ глюкозы в клетках 832/2, увеличению базальной секреции инсулина ¤¤p<0,01 относительно 16,7 мМ глюкозы в клетках в 4,2 раза (р<0,01), а добавление высокой 832/2. В. Утилизация глюкозы, n=7. **p<0,01, концентрации глюкозы не приводило к ***p<0,001 относительно 2,8 мМ глюкозы в клетках дальнейшему увеличении секреции ### 832/13, p<0,001 относительно 16,7 мМ глюкозы в инсулина (рис. 1А). Смесь 35 мМ КСl и клетках 832/13. С. Продукция лактата, n=7.

Insulin secretion, ng/h/mg protein Glucose utilization, nmol/h/mg protein Lactate, nmol/h/mg protein 250 мкМ диазоксида независимо от концентрации глюкозы в среде увеличивала секрецию инсулина в клетках 832/2 с 10 дo 60 нг/мг белка/ч, что свидетельствует об интактности экзоцитотического аппарата при деполяризации плазматической мембраны.

Утилизация глюкозы. Интенсивность гликолиза оценивали по скорости продукции [3H]OH из D-[5-3H]-глюкозы; одна молекула [3H]OH образуется при превращении 2фосфоглицерата в фосфоенолпируват под действием енолазы. Примечательно, что базальная скорость утилизации D-[5-3H]-глюкозы (2,8 мМ глюкозы) в клетках 832/2 была a priori в 11,6 раза больше, чем в 832/13 (рис. 2B; p<0,001). Более того, в отличие от клеток 832/13, скорость утилизации глюкозы в клетках 832/2 при увеличении концентрации глюкозы в среде не возрастала. При 16,7 мМ глюкозы 832/13 клетки использовали в 3,8 раза больше глюкозы, чем при 2,8 мМ (рис. 1B). Высокая скорость гликолиза в 832/2 клетках, требующая регенерации НАД+ для поддержания гликолиза (то есть превращения глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-бифосфоглицерат), сопровождается восстановлением пирувата в лактат, катализируемым лактатдегидрогеназой (ЛДГ).

Продукция лактата. Действительно, наблюдалось образование лактата, который высвобождался в инкубационную среду в клетках 832/2, но не детектировался в клетках 832/13 (рис. 1C). В клетках 832/2 продукция лактата отражает скорость утилизации глюкозы и, соответственно, активность анаэробного гликолиза в этих клетках.

Скорость потребления кислорода. Исследование скорости потребления кислорода показало е прогрессирующее нарастание в клетках 832/13 после добавления 16,7 мМ глюкозы по сравнению с базальной скоростью при 2,8 мМ глюкозы. Это свидетельствует об увеличении доступности субстратов, образовавшихся в ходе гликолиза, для цикла Кребса и стимуляции окислительного фосфорилирования (рис. 2А; р<0,05). С другой стороны, клетки 832/2 демонстрировали повышение базальной скорости клеточного дыхания в 1,раза по сравнению с клетками 832/13 (p<0,05), а увеличения скорости потребления кислорода не наблюдалось при повышении концентрации глюкозы до 16,7 мМ (рис. 2В).

2,8 mM glucose А. В.

FCCP 16,7 mM glucose FCCP 45 glucose time, min vs Col oligomycin time, min vs Col oligomycin rotenone rotenone glucose * * * * * * * * * 0 20 40 60 80 100 120 140 10 20 40 60 80 100 120 140 1time, min time, min Рис. 2. Скорость поглощения кислорода в -клетках A. 832/13, n=4. B. 832/2, n=4. *p<0,05. OCR - скорость потребления кислорода. FCCP - карбонил цианид-п-трифторметоксифенилгидразон.

Скорость продукции АТФ в митохондриях. АТФ – ключевой компонент в механизме секреции инсулина. Для оценки способности клеток 832/13 и 832/синтезировать АТФ была измерена скорость е митохондриальной продукции в пермебиализованных дигитонином клональных -клетках в присутствии смеси глутамата и сукцината. При таких условиях не учитывается респираторные ограничения в виду лимитирующих концентраций субстратов. Оказалось, что скорость синтеза АТФ в глюкозочувствительных клетках 832/13 была в 2,5 раза выше, чем в глюкозонечувствительных клетках 832/2 (p<0,05).

Активность комплексов ЭТС. Для выяснения причины различий в скоростях митохондриальной продукции АТФ была измерена активность комплексов I, III и IV электронотранспортной системы в изолированных митохондриях. Снижение OCR, nmol/min/mg protein OCR, nmol/min/mg protein респираторного ответа при повышении концентрации глюкозы в глюкозонечувствительных клетках 832/2 коррелировало со снижением активности исследованных комплексов в 2,7-, 3,0- и 2,9-раза по сравнению с глюкозочувствительными клетками 832/13 (p<0,05, p<0,001, p<0,01, соответственно).

Синтез субъединиц комплексов ЭТС. Для дальнейшего изучения нарушений работы митохондрий в глюкозонечувствительных клетках 832/2 был измерен уровень синтеза некоторых субъединиц комплексов электронотранспортной системы в сравнении с клетками 832/13: кодируемые мтДНК ND6 (комплекс I) и COX I (комплекс IV) субъединицы, кодируемые яДНК Core 2 (комплекс III) и V- (комплекс V) субъединицы.

Экспрессия субъединиц ND6, Core 2, COX I и V- в клетках 832/2 была в 3,4-, 1,4-, 2,5-, и 1,4-раза ниже, чем в клетках 832/13 (p<0,01, p<0,05, p<0,01, p<0,05, соответственно).

Анализ экспрессии генов энергетического метаболизма в -клетках. С целью выяснения причин пониженной секреции инсулина клетками 832/2 мы провели сравнительный анализ экспрессии мРНК генов, участвующих в энергетическом метаболизме клетки (гликолиз, цикл Кребса, электронотранспортная система) в клетках 832/13 и 832/2. Экспрессия 26 генов из 46 проанализированных различалась в клетках 832/13 и 832/2. Уровень мРНК 16 генов был снижен, а шести генов повышен в клетках 832/по сравнению с клетками 832/13. Следует отметить значительное снижение экспрессии гена Slc2a2, кодирующего белок транспорта глюкозы GLUT2 и глюкозо-фосфорилирующего фермента с высокой константой Михаэлиса-Ментен (Кm) глюкокиназы. С другой стороны, ген фермента с низкой Кm – гексокиназа I – экспрессировался в клетках 832/2 и не детектировался в клетках 832/13. Также ген фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ-А) экспрессировался в клоне 832/2, но не был детектирован в клетках 832/13. Таким образом, было выявлено, что отсутствие глюкозостимулированной секреции инсулина в клетках 832/2 коррелировало с увеличением экспрессии генов гликолиза и снижением экспрессии генов, участвующих в функционировании митохондрий. В научной литературе отмечается, что при моделировании СД2 у крыс в островках Лангерганса повышался уровень экспрессии ЛДГ-А, гексокиназы I и снижался уровень экспрессии транспортера глюкозы GLUT2, глюкокиназы, что сопровождалось снижением продукции АТФ и глюкозостимулированной секреции инсулина (Jonas et al., 1999; Laybutt, et al., 2002). Далее мы попытались ответить на вопрос: ”происходят ли подобные изменения в профиле экспрессии генов в островках Лангерганса человека, обнаруженные в глюкозонечувствительных клональных -клетках?” Взаимосвязь экспрессии генов энергетического метаболизма в островках 13L 13H 2L 2H 13L 13H 2L 2H Лангерганса здоровых людей с уровнем ***/* */** ***/* */** ***/*** **/*** ***/*** **/*** гликозилированного гемоглобина. Был проведен */*/*/*/корреляционный анализ экспрессии некоторых ***/* ***/* ***/*** ***/*** генов, участвующих в энергетическом ***/** ***/** **/** **/** ***/* ***/* метаболизме островков Лангерганса человека с ***/*** ***/*** уровнем HbA1c (гликозилированный гемоглобин) плазмы крови. Уровень HbA1c – отражает гипергликемию, имевшую место на протяжении периода жизни эритроцитов; широко используется в клинической практике. Нами была установлена отрицательная корреляция между уровнем HbA1c плазмы крови и величиной Рис. 3. Метаболиты цикла Кребса в - глюкозостимулированной секрецией инсулина клетках 832/13 и 832/2, n=20. – 832/13, (отношение секреции инсулина при 16,7 мМ 2,8 мМ глюкозы; – 832/13, 16,7 мМ глюкозы к секреции при 2,8 мМ глюкозы) глюкозы; – 832/2, 2,8 мМ глюкозы; – островков Лангерганса в условиях in vitro 832/2, 16,7 мМ глюкозы.

(r =-0,64; p <0,01; n=23). В островках Ланрегранса Relative mean Relative mean l l t t i i c c o o G G a a c c c c C C K K M M u u A A Fum Fum A A S S человека уровень экспрессии генов Slc2a2 (транспортер глюкозы), декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (r=-0,59; p<0,01) и митохондриальной глицерол-3фосфатдегидрогеназы (r =-0,48; p <0,05) отрицательно коррелировали с уровнем HbA1c (r=-0,63, p<0,01) и был также снижен в клетках 832/2 по сравнению с клетками 832/13.

Уровень экспрессии генов, таких, как гексокиназы I (r=0,40, p<0,05) триозофосфат изомеразы-1 (r=0,43, p<0,05) и ЛДГ-А (r=0,64, p<0,01) положительно коррелировали с показателем HbA1c и был повышен в клетках 832/2 по сравнению с клетками 832/13. Таким образом, установлен сходный характер экспрессии генов ферментов гликолиза и митохондриального метаболизма, а также снижение инсулиносекреторного ответа в глюкозонечувствительных клональных -клетках и островках Лангерганса доноров с более высоким уровнем HbA1c.

Метаболомикс. На следующем этапе был проведен анализ метаболитов (метаболомикс) в -клетках. Метод газовой хроматографии в комбинации с массспектрометрией (ГХ/МС) является информативным и более чувствительным инструментом для одновременной детекции большого числа метаболитов в одном анализируемом образце по сравнению с измерением концентрации каждого метаболита в отдельности классическими энзимологическими методами. Наиболее интересным представляется сравнение профиля метаболитов клеток, секретирующих инсулин при повышении концентрации глюкозы (832/13), и клеток, не отвечающих на стимуляцию глюкозой (832/2).

При сравнении этих клеток было детектировано 164 низкомолекулярных метаболита, из которых было идентифицировано 44. Были найдены существенные отличия в профиле метаболитов; в частности промежуточных и конечных стадий гликолиза и цикла Кребса (рис. 3). Концентрации метаболитов цикла Кребса (цитрат, аконитат, -кетоглутарат, сукцинат, фумарат и малат) в клетках 832/13 увеличивались с повышением концентрации глюкозы в среде; обратный эффект наблюдался в клетках 832/2. Как упоминалось выше, в клетках 832/2 снижена экспрессия глюкокиназы и экспрессируется гексокиназа I, фермент с низкой Кm, вследствие чего концентрация глюкозо-6-фосфата повышена в клетках 832/2 по сравнению с клетками 832/13 при базальной концентрации глюкозы в среде. Из данных анализа метаболитов видно, что гликолиз в клетках 832/2 нарушен между стадиями, катализируемыми фосфоглицераткиназой, фосфоглицератмутазой, фосфопируватгидратазой и пируваткиназой. При увеличении концентрации глюкозы в инкубационной среде возрастания уровня метаболитов не происходило, т.е. можно предположить, что активность вышеуказанных ферментов максимальна уже при базальной концентрации глюкозы. Следствием этого является недостаточный перенос цитозольных метаболитов (малата и глицерол 3-фосфата) в митохондрии клеток 832/2, что подтверждается снижением экспрессии переносчиков этих метаболитов – митохондриальных малатдегидрогеназы и глицерол-3-фосфатдегидрогеназы. Ситуацию также усугубляет увеличение продукции лактата. Эти наблюдения согласуются со значительно сниженной экспрессией пируваткарбоксилазы (в 3,5±0,4 раза; р<0,001) в глюкозонечувствительных клетках 832/2 и более низкой скоростью пируватного цикла (Lu et al., 2002). Метаболомикс также показал активацию полиольного шунта в глюкозонечувствительных клетках 832/2. Для проверки факта нарушения входа метаболитов гликолиза в митохондрии в глюкозонечувствительных клетках 832/2 была измерена скорость потребления кислорода и секреция инсулина в ответ на действие субстратов, которые метаболизируются в гликолизе (на примере глюкозы) или минуют стадию гликолиза и их метаболизм происходит непосредственно в цикле Кребса (на примере лейцина и глутамина). Лейцин и глутамин увеличивали скорость потребления кислорода и секрецию инсулина, что указывает на функционально активные митохондрии в -клетках 832/2, тогда как введение глюкозы не влияло на эти параметры. Эти наблюдения свидетельствуют о недостаточной эффективности сопряжения гликолиза и митохондриального метаболизма в -клетках линии 832/2, которое и приводит к их неспособности усиливать секрецию инсулина в ответ на повышение концентрации глюкозы. Таким образом, необходимым условием глюкозостимулированной секреции инсулина -клетками является синтез АТФ в их митохондриях. В совокупности наши данные показывают, что в глюкозонечувствительных клетках 832/2 митохондрии не повреждены, но синтез АТФ в них лимитирован вследствие снижения притока восстановительных эквивалентов для дыхательной цепи. Снижение притока субстратов для дыхательной цепи вызвано нарушениями утилизации глюкозы и функционирования челночных систем. Использование субстратов, отличных от глюкозы, нормализует инсулиносекреторную функцию клеток 832/2 за счет активации митохондриального дыхания и образования АТФ.

Стабилизация HIF-1. В совокупности, вышеописанные наблюдения и тот факт, что исследуемые клональные -клетки являются инсулиномами, т.е. имеют опухолевое происхождение, позволяют предположить участие в вышеупомянутых процессах транскрипционного фактора-1, индуцируемого гипоксией (HIF-1). Стабилизация (т.е. ингибирование протеосомальной деградации) HIF-1, приводящая к активации его транскрипционной активности, обеспечивает переключение клеточного метаболизма в Рис. 4. Иммуноблоттинг HIF-1 в зависимость от анаэробного гликолиза и, клональных -клетках 832/13 и соответственно, повышение продукции лактата. В 832/2, n=2.

данном случае имеет место так называемый эффект Варбурга (Warburg, 1956), присущий опухолевым клеткам. Для проверки этой возможности был проведен иммуноблоттинг белка HIF-1. В глюкозонечувствительных клетках клетках 832/2 происходит стабилизация HIF-1 путем дегидроксилирования его остатков пролина (рис. 4), который активирует экспрессию генов гликолиза и подавляет экспрессию PDK1, контролирующей вход пирувата в цикл Кребса. В то время как в -клетках 832/стабилизация HIF-1 практически не происходит (рис. 4). Из литературных данных известно, что отношение концентраций -кетоглутарата к сукцинату контролирует стабилизацию HIF-1 (Mole et al., 2003; MacKenzie et al., 2007). При [кетоглутарат]/[сукцинат] >1 (в клетках 832/13) HIF-1 гидроксилируется пролилгидроксилазой и подвергается протеосомальной деградации с участием белка фон Хиппель-Линдау (VHL); при [-кетоглутарат]/[сукцинат]<1 (в клетках 832/2) пролилгидроксилаза ингибируется избытком сукцината, тем самым HIF-1 стабилизируется и транслоцируется в ядро клетки. В ядре HIF-1 образует димер с ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) и связывается с промоторной областью генов-мишеней и транскрипционным коактиватором р300, необходимым для запуска транскрипции генов, кодирующих ферменты гликолиза (Carroll et al., 2005).

При ингибировании ЛДГ-А, экспрессия которой контролируется HIF-1, оксаматом натрия (500мкМ) в -клетках 832/2 происходило частичное восстановление секреции инсулина, стимулированное глюкозой, с 18,7±4,8 (контроль) до 38,2±2,6 (оксамат натрия) (нг инсулина)/(мг белка/час) (p<0,05, n=3). В норме при стимуляции глюкозой -клетки 832/13 секретировали 102,1±15,4 (нг инсулина)/(мг белка/час). Вероятно, это вызвано увеличением концентрации пирувата и его последующим метаболизмом в митохондриях.

Результаты сравнительного анализа глюкозочувствительных и глюкозонечувствительных -клеток обобщены в виде схемы, представленной на рис. 5.

Различие в ответе на стимуляцию глюкозой в близкородственных клонах 832/13 и 832/позволяет их использовать в качестве модели нормальных и диабетических -клеток.

Изучение различий между такими клетками дает возможность получить информацию о молекуярных механизмах регуляции секреции инсулина -клетками при моделировании нормальных и патологических условий. Существенным недостатком разработанной модели является канцероподобный фенотип изученных линий -клеток, поэтому они не могут быть использованы для исследования механизмов апоптоза и пролиферации -клеток в условиях in vitro.

Рис. 5. Схема, иллюстрирующая метаболические и сигнальные пути в глюкозочувствительных (832/13) и глюкозонечувствительных (832/2) -клетках.

VHL-белок фон Хиппель-Линдау; [-KG]/[Suc]-соотношение концентраций -кетоглутарата и сукцината; К+АТФ-АТФ-чувствительные калиевые каналы; Са2+-потенциалзависимые кальциевые каналы L-типа.

2. Изменение профиля метаболитов и роль пентозофосфатного цикла в контроле секреции инсулина при стимуляции глюкозой клональных -клеток 832/13 и островков Лангерганса человека Секреция инсулина тесно сопряжена с динамическими изменениями метаболизма в клетках. Метаболическая регуляция секреции инсулина является сложным процессом, вовлекающим гликолиз, цикл Кребса, метаболизм аминокислот и жирных кислот и (Prentki et al., 1992). В данной части работы нами было проведено комплексное исследование профиля метаболитов в -клетках 832/13 в комбинации с динамическим анализом секреции инсулина в ходе стимуляции -клеток глюкозой.

Перфузия -клеток. Перфузия -клеток 2,8 мМ глюкозы 120проводилась в присутствии 2,8 мМ глюкозы, затем на 16,7 мМ глюкозы 12 минуте уровень глюкозы был повышен до 16,100мМ. Пик секреции инсулина наблюдался через 80мин (рис. 6) после повышения концентрации глюкозы 60до 16,7 мМ в перфузионной камере. Таким образом, 40были определены временные рамки (0-15 мин после 2000 добавления 16,7 мМ глюкозы) для более детального динамического анализа метаболизма, контролирующего глюкозостимулированную 0 10 20 30 40 секрецию инсулина в -клетках 832/13 in vitro.

Time (min) Митохондриальное дыхание. Исходя из Рис. 6. Секреция инсулина в ходе полученных результатов, для секреции инсулина перфузии клональных -клеток важен уровень митохондриального дыхания.

832/13, n=7.

Действительно, через 15 мин после повышения концентрации глюкозы (с 2,8 до 16,7 мМ) наблюдалось повышение дыхания на 30% по сравнению с базальным уровнем (р<0,001).

(pg/chamber/min) Insulin secretion IRI Метаболомикс. Метаболомный анализ показал, что значительные изменения профиля метаболитов происходят в первые 15 минут после стимуляции -клеток глюкозой (16,мМ) и этот промежуток времени практически совпадает с пиком секреции инсулина.

Методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии было обнаружено 195 метаболитов, из них 61 был идентифицирован. На рис. 7A представлен score plot, показывающий кластеризацию метаболитов через 0, 3, 6, 10 и 15 мин от начала стимуляции -клеток глюкозой (Y-вектор показывает время от начала стимуляции), а на рис. 7В – loading plot, демонстрирующий снижение концентрации длинноцепочечных жирных кислот и аминокислот и повышение концентрации интермедиатов гликолиза и цикла Кребса.

(A) (A) Рис. 7. А. Score plot, показывающий кластеризацию метаболитов через 0 (), 3(), 6(), 10() и 15() мин от начала стимуляции -клеток глюкозой. В. Loading plot, демонстрирующий снижение уровня длинноцепочечных жирных кислот и аминокислот и повышение уровня интермедиатов гликолиза и цикла Кребса в клетках 832/13.

NADPH/(NADPH+NADP+) Ribose 5-phosphate 1.1.(B) (B) 0.0.0.0 5 10 15 Tim e (min) Рис. 8. Изменения концентрации рибозо-5фосфата и соотношения концентраций [NADPH]/([NAPDH]+[NADH+]) в ходе стимуляции клональных -клеток 832/глюкозой (16,7мМ), n=4.

Особого внимания заслуживает идентификация метаболита пентозофосфатного цикла – рибозо 5-фосфата. Концентрация рибозо 5-фосфата достигает максимума через 6 мин после стимуляции -клеток глюкозой (увеличивается в 2,5 раза по сравнению с базальным уровнем; p<0,001) и возвращается к исходному уровню на 15 мин (рис. 8). В связи с этим, можно предположить, что пентозофосфатный цикл участвует в амплифицирующем механизме секреции инсулина путем синтеза NADPH, который известен как сопрягающий фактор в механизме секреции инсулина (Reinbothe et al., 2009). Интересно, что изменение концентрации рибозо 5-фосфата имело тот же параболический характер, что и соотношение [NADPH]/( [NAPDH]+[NADH+], которое увеличивается в 8 раз по сравнению с базальным уровнем (p<0,001; рис. 8). Причем изменение концентрации других идентифицированных метаболитов не имело такой параболической формы.

Из данных литературы известно, что активность пентозофосфатного цикла в -клетках ингибируется через 30 мин от начала стимуляции -клеток глюкозой в результате увеличения [NADPH] в реакции, катализируемой декарбоксилирующей малатдегидрогеназой (Shuit et al., 1997). В связи с этим, роль пентозофосфатного цикла в секреции инсулина отрицалась (Schuit et al., 1997). В других исследованиях было установлено, что подавление активности цикла Кребса в -клетках сопровождается Intensity увеличением скорости пентозофосфатного цикла (MacDonald, 1993). Тем не менее, совокупность этих фактов доказывает ключевую роль NADPH во взаиморегуляции митохондриального метаболизма и пентозофосфатного цикла в -клетках.

В пентозофосфатном цикле NADPH является продуктом реакций, катализируемых глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой и 6-фосфоглюконатдегидрогеназой. При использовании ингибитора глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы – дегидроэпиандростерона (100 мкМ) – наблюдалось подавление глюкозостимулированной секреции инсулина -клетками 832/на 20% (t=15 мин; n=4). Подобный эффект наблюдался при проведении эксперимента с островками Лангерганса человека, где глюкозостимулированная секреция инсулина при действии дегидроэпиандростерона ингибировалась на 30% (t=15 мин; n=4). Максимумы концентраций рибозо 5-фосфата и NADPH предшествовали пику секреции инсулина, что свидетельствует о важной роли пентозофосфатного цикла в ранней фазе секреции инсулина.

3. Пролонгированный эффект повышенной концентрации глюкозы и ФНО- на клональные -клетки 832/Известно, что при СД2 наблюдается гипергликемия и повышение в крови концентраций ФНО- (Майоров, 2007). Для выяснения механизмов действия глюкозы и ФНО- в повышенных концентрациях на -клетки, мы провели моделирование условий, имитирующих СД2, т.е. присутствие 16,7 мМ глюкозы или 25 нг/мл ФНО- в культуральной среде, где находятся -клетки 832/13. После инкубации -клеток в присутствии глюкозы или ФНО- наблюдалось снижение глюкозостимулированной секреции инсулина на 75 и 50%, соответственно. Интересно отметить, что после воздействия глюкозы и ФНО- на -клетки, культуральная среда приобретала желтоватый оттенок в результате накопления лактата. Действительно, концентрация лактата возрастала с 5,0±0,05 нмоль/(мг белка/24 ч) в контроле до 44,55±3,4 мкмоль/(мг белка/24 ч) в присутствии 16,7 мМ глюкозы и 52,65±4,02 мкмоль/(мг белка/24 ч) в присутствии 25 нг/мл ФНО-. Вероятно, повышение активности ЛДГ-А вызвано повышением экспрессии этого фермента. Более того, активность пируватдегидрогеназного комплекса (ПДК) снижалась в 2,9±0,6 раза после инкубации -клеток с 16,7 мМ глюкозы и 2,3±0,4 раза после инкубации с 25 нг/мл ФНО-, соответственно. Из данных литературы известно, что увеличение экспрессии ЛДГ-A и PDK1 (ингибирует ПДК путем фосфорилирования) контролируется транскрипционным фактором HIF-1 (Semenza et al., 1994). В предыдущем разделе было показано, что в -клетках 832/13 HIF-1 практически не детектируется, поэтому транскрипционно неактивен (рис. 4). Эти наблюдения позволили предположить, что при действии на -клетки глюкозы и ФНО- в повышенных концентрациях происходит стабилизация HIF-1, запускающая транскрипцию его генов-мишеней. Методом иммуноблоттинга, регистрировалась стабилизация HIF-1 в присутствии глюкозы или ФНО-. Полученные результаты позволили выявить HIF-1 – важнейших молекулярный компонент, участвующий в развитии инсулиносекреторной дисфункции -клеток. HIF-1 стабилизируется при эпизодах гипергликемии и/или при действии ФНО-. Это состояние можно назвать псевдогипоксия или химическая гипоксия под действием глюкозы или ФНО. Данные факты еще раз демонстрируют необходимость строгого контроля уровня глюкозы в крови у больных СД2, а также роль повышенного уровня ФНО- не только в развитии инсулинорезистентности при СД2 (Hotamisligil et. al., 1999), но и инсулиносекреторной дисфункции -клеток. Примечательно, что характер экспрессии некоторых мРНК клональных -клеток 832/13, инкубированных в присутствии глюкозы в повышенной концентрации, совпадает с таковым для островков Лангерганса контрольной группы и с СД2. В островках Лангерганса человека уровень экспрессии некоторых геновмишеней HIF-1: ЛДГ-А, гексокиназы 2, фосфофруктокиназы В3 – был достоверно выше в группе с СД2 по сравнению с контрольной группой (рис. 9).

4. Подавление экспрессии PDK1 и активность пируватдегидрогеназы в клональных -клетках 832/Более детальному исследованию мы подвергли одну из мишеней для HIF-1 - PDK1. При воздействии глюкозы в повышенной концентрации на -клетки повышалась экспрессия гена pdk1 и его белкового продукта PDK1. Можно предположить, что увеличение экспрессии PDK1, сопровождающееся снижением глюкозостимулированной секреции инсулина, происходит при длительных эпизодах гипергликемии. Действительно, PDK1, фосфорилируя субъединицу Е1 по Рис. 9. Экспрессия мРНК генов-мишеней HIFостатку Ser232, ингибирует активность ПДК, 1 в островках Лангерганса контрольной а значит метаболизм пирувата, что в группы, n=55 и больных СД2, n=9. *р<0,05, конечном итоге подавляет секрецию **р<0,01, U-критерий Манна-Уитни. Mедианы инсулина. Роль PDK1 в – экспрессия мРНК, прямоугольники – глюкозостимулированной секреции была интерквартильные интервалы (25-75%), отрезки исследована с использованием малых – минимальные и максимальные значения.

интерферирующих РНК - siРНК.

Трансфекция siPDK1 приводила к 80% уменьшению экспрессии мРНК PDK1 (рис. 10А) и к уменьшению экспрессии PDK1 на 40 % на уровне белка (рис. 10В). Соответственно, активность ПДК повышалась (рис. 10С).

Секреция инсулина после подавления экспрессии PDK1. Выключение PDK1 не влияло на базальную секрецию инсулина, но увеличивало глюкозостимулированную секрецию в 5 раз по сравнению с базальным уровнем секреции (рис.

211). При этом секреция инсулина, 2стимулированная лейцином и диметилсукцинатом, ** 150 веществами, которые метаболизируются в митохондрии без участия ПДК, не различалась в 1контрольных и siPDK1 клетках (рис. 11).

Профиль метаболитов. В клетках, 0 трансфецированных siPDK1, методом ГХ/МС siNC siPDKбыло выявлено повышение уровня интермедиатов Рис. 10. Выключение PDK1 в цикла Кребса – малата, фумарата и клональных -клетках 832/13. А.

кетоглутарата, а также глицерол 3-фосфата. При Экспрессия мРНК PDK1. B.

этом в -клетках, трансфецированных siPDK1, Иммуноблоттинг PDK1. С. Активность уровень -гидроксибутирата был ниже, чем в ПДК, n=4. **p<0,01, ***p<0,001, HPRT контроле. Подобный результат можно – гипоксантингуанинфосфорибозилинтерпретировать как возрастание синтеза цитрата трансфераза (housekeeping gene).

при конденсации ацетил-КоА, который синтезируется в реакциях ПДК, и оксалоацетата. В результате уровень ацетил-КоА, как предшественника -гидроксибутирата, уменьшается. Наблюдая повышения концентраций интермедиатов цикла Кребса можно предположить, что активность цикла Кребса увеличивается в результате частичного выключения PDK1. Повышение концентрации Activity, % to siNC глицерол 3-фосфата, субстрата для глицерофосфатного переносчика, вызывает увеличение потока восстановительных эквивалентов для окислительного фосфорилирования.

Скорость потребления кислорода.

Измерение скорости потребления Опоказало, что интактные -клетки 832/увеличивают потребление О2 в среднем до 7,33±0,13 нмоль О2 /мин/мг белка при стимуляции глюкозой, по сравнению с базальной концентрацией глюкозы (5,03±0,10 нмоль О2 /мин/мг белка). В Рис. 11. Секреция инсулина клональными трансфецированных клетках скорость клетками 832/13 (белые столбцы – потребления О2 возрастала до 8,08±0,siКонтроль, черные столбцы – siPDK1), n=8нмоль О2/мин/мг белка (р<0,05; n=5).

15. **p<0,01, относительно 16,7 мМ глюкозы Полученные данные можно обобщить в в контроле.

виде схемы представленной на рис. 12.

Рис. 12. Схема, иллюстрирующая метаболические изменения, приводящие к повышению секреции инсулина при выключении PDK1 в -клетках.

PDK1-киназа 1 пируватдегидрогеназы; ПДКпируватдегидрогеназный комплекс; ЕТСэлектронотранспортная система; ОКСФОСокислительное фосфорилирование.

Подавление экспрессии PDK1 снижает фосфорилирование сайта 3 (остаток Ser232) субъединицы Е1 ПДК, тем самым повышая активность ПДК, способствует увеличению входа ацетил-КоА в цикл Кребса, накоплению восстановительных эквивалентов НАДН и ФАДН2 и, как следствие, увеличение скорости окислительного фосфорилирования и дыхания. Результатом перечисленных событий является повышение митохондриальной продукции АТФ, необходимой для секреции инсулина.

5. Фактор трансляции митохондрии В1 в островках Лангерганса человека и мышей и клональных -клетках 832/13 и его роль в патогенезе СДНедавно было показано, что TFB1М играет ведущую роль в трансляционном контроле митохондриальных белков, в особенности белков электронотранспортной системы, обладая диметилтрансферазной активностью (Metodiev et al., 2009). В свете важной роли митохондриальной продукции АТФ митохондриями в метаболическом гомеостазе мы проанализировали, ассоциируются ли полиморфизмы генов системы окислительного фосфорилирования, транскрипционного и трансляционного аппарата мтДНК с дисфункцией -клеток и развитием СД2? С этой целью мы изучили базу данных геномассоциированных исследований (a genome-wide association study; GWAS), the Diabetes Genetics Initiative (DGI) (Saxena et al., 2007). Нами был идентифицирован полиморфизм rs950994 гена Tfb1m, кодирующего фактор трансляции митохондрии В1 – TFB1М (рис.

13А). TFB1М является митохондриальной S-аденозилметионин-6-N,Nаденозил(рРНК)диметилтрансферазой-1, диметилирующей два консервативных соседних аденина на 3'-конце 12S рРНК; играет важную роль в процессе трансляции в митохондрии.

Ковалентная модификация (метилирование) 12S рРНК необходима для поддержания целостности малой митохондриальной рибосомной субъединицы и ее функциональной активности (Metodiev et al., 2009). Нами было установлено, что полиморфизм rs950994 гена Tfb1m ассоциируется со сниженной секрецией инсулина в ответ на действие глюкозы, повышением уровнем глюкозы в ходе теста толерантности к глюкозе, повышенным риском развития СД2 (OR = 1,12 (p=0,002) и сниженной экспрессией TFB1M в островках Лангерганса поджелудочной железы человека на уровне мРНК (рис. 13B) и белка (рис.

13C), соответственно. TFB1M контролирует трансляцию 13 субъединиц цепи транспорта электронов и АТФ-синтазы митохондрий, а также 2 rРНК и 22 tРНК, кодируемых мтДНК (Scarpulla et al., 2008). Как видно из рис. 13Е, уровень экспрессии субъединиц цепи транспорта электронов ND1 и ND5 (комплекс I), кодируемых мтДНК, был снижен (рис.

13E); их трансляция контролируется TFB1M. Присутствие риск-аллеля А вместо G в rs950994 нарушает несколько потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов в интроне 2 гена Tfb1m, которые предположительно могут влиять на экспрессию TFB1M. Эти результаты показывают, что снижение экспрессии TFB1M на уровне мРНК и белка в человеческих островках ассоциируется со значительным снижением экспрессии других белков комплекса I, кодируемых мтДНК. При потере или снижении экспрессии субъединицы ND1 происходит нарушение процесса модульной сборки комплекса I, поскольку NDиграет решающую роль именно на ранних стадиях формирования молекулярного ансамбля комплекса I (Cardol et al., 2002; Chomyn, 2001;

Perales-Clemente et al.). Далее мы продолжили исследование на мышах, гетерозиготных по Tfb1m (рис. 14А) с целью моделирования ситуации, наблюдаемой в человеческом Рис. 13. TFB1M в островках Лангерганса человека. А.

организме. На Tfb1m+/- мышах был Карта гена Tfb1m человека. В. Экспрессия мРНК проведен интраперитонеальный тест TFB1M, носители А-аллеля, n=24; носители G/G, n=26.

толерантности к глюкозе (IPGTT) для *p<0,05, U-критерий Манна-Уитни. Mедианы – исследования толерантности к экспрессия мРНК, прямоугольники – интерглюкозе и секреции инсулина in vivo.

квартильные интервалы (25-75%), отрезки – Как видно из рис.14В, уровень минимальные и максимальные значения. С.

глюкозы плазмы был выше у Tfb1m+/- Иммуноблоттинг TFB1M, n=4. D. Иммуноблоттинг мышей после введения глюкозы белков электронотранспортной системы, n=4. Е.

Денситометрический анализ экспрессии белков (16,10,7 против 18,70,7 мМ электронотранспортной системы, n=4. *р<0,глюкозы, t=10 мин, р<0,05; 16,51,относительно G/G.

против 19,50,8 мМ глюкозы, t=min, р<0,05; 14,20,6 против 16,20,6 мМ глюкозы, t=60 min, р<0,05; 175465 усл.ед.

против 198470 усл. ед, площадь под кривой (glcAUC), р<0,05). При этом секреция инсулина была в группе Tfb1m+/- мышей практически не отличалась от секреции в группе Tfb1m+/+ мышей (рис. 14С). Вместе с тем, когда общая секреция инсулина (insAUC-площадь под кривой) в течение глюкозной нагрузки была поделена на участки возрастания глюкозы (glcAUC-площадь под кривой), было обнаружено, что инсулина недостаточно для компенсации возросшего уровня глюкозы у Tfb1m+/- мышей (44,53,0 против 32,54,1, p<0,05; рис. 14D).

Эти данные свидетельствуют о том, что дефицит TFB1M ассоциируется с инсулинорезистентностью и интолерантностью к глюкозе у Tfb1m+/- мышей. Если бы у Tfb1m+/- мышей была бы необходимая секреторная емкость островков Лангерганса, то они бы могли эффективно компенсировать инсулинорезистентность путем повышения секреции инсулина. Для более детального ответа на вопрос, вызваны ли эти нарушения дисфункцией островков, мы выделили островки из генетически модифицированных мышей. Было обнаружено, что секреция инсулина в ответ на действие глюкозы снижается в островках Tfb1m+/- мышей (1,360,19 против 0,870,14 нг инсулина/островок/ч, р<0,05; рис. 14Е).

Рис. 14. TFB1M в островках Лангерганса мышей С57BL/6J. А. Иммуноблоттинг экспрессии белка TFB1M, n=4. В. Глюкоза плазмы и C. Уровень инсулина плазмы у Tfb1m+/+ (n=10) and Tfb1m+/(n=11) мышей в ходе интраперитонеального теста толерантности к глюкозе. D. Соотношение площадей под кривой для инсулина и глюкозы. Е. Секреция инсулина в ходе статической инкубации островков, n=4. F. Денситометрический анализ экспрессии ND5, n=4. G. Продукция АТФ митохондриями, n=6. *р<0,01, **р<0,001 относительно Tfb1m+/+.

Более того, секреция инсулина при действии -кетоизокапроновой кислоты (-KIC), вещества, которое непосредственно стимулирует митохондрии, также была снижена (2,280,32 против 1,070,13 нг инсулина/островок/ч, р<0,01; рис. 14Е). Эти данные позволяют предположить, что снижение секреции инсулина в островках Tfb1m+/- мышей вызвано нарушением функции митохондрий. Для подтверждения этого факта, был измерен уровень экспрессии в островках субъединицы комплекса I, ND5, которая кодируется мтДНК и поэтому ее биосинтез контролируется TFB1М. Иммуноблоттинг-анализ показал, что уровень ND5 был ниже в митохондриях Tfb1m+/- мышей (рис. 14F). Была также измерена кинетика продукции АТФ, конечного продукта митохондриального метаболизма, который контролирует секрецию инсулина, закрывая АТФ-чувствительные К+-каналы.

Действительно, скорость продукции АТФ в изолированных пермеабилизованных островках в ответ на действие митохондриальных метаболических субстратов (глутамата и сукцината) была снижена в островках Tfb1m+/- мышей по сравнению с контролем Tfb1m+/+ (34,12,против 25,40,9 пмоль ATФ/мин/островок, р<0,05; рис. 14G). Нами была также использована модель мышей с кондиционным нокаутом Tfb1m в -клетках (-Tfb1m (-/-)). В первые 1,5-3,5 месяца жизни нокаутные и контрольные мыши имеют одинаковый базальный уровень глюкозы, однако, в ходе исследования толерантности к глюкозе у нокаутных мышей была выявлена интолерантность к глюкозе, которая значительно выше, чем у мышей, гетерозиготных по Tfb1m. В возрасте 4-х месяцев у этих животных наблюдалась гипергликемия, уровень глюкозы плазмы крови был у контрольных 8,3±0,(+/+) (-/-) мМ (-Tfb1m ) и трансгенных мышей19,6±1,9 мМ (-Tfb1m ), соответственно (р<0,001).

Для моделирования ситуации в островках Лангерганса человека и мышей мы провели выключение TFB1M в глюкозочувствительных -клетках 832/13, используя siРНК. Это позволило нам выявить механизмы, при которых снижение TFB1M вызывает нарушение функции митохондрий и секрецию инсулина. Аналогично с островками человека и мыши, дефицит TFB1M в -клетках приводил к подавлению глюкозостимулированной секреции инсулина (181,55,5 против 110,05,2 нг/мг белка/час, р<0,001). Также наблюдалось существенное снижение секреции инсулина в ответ на действие -KIC (116,09,3 против 55,05,2 нг/мг белка /час, р<0,001). Экспрессии субъединиц комплекса I - ND5 и NDUFB8, комплекса III - Cyt b и комплекса IV - COX1 были значительно снижены в клетках с дефицитом TFB1М. Негативная роль дефицита TFB1М также сказывалась на снижении активности комплексов I, III и IV электронотранспортной системы. Активность комплекса I была наиболее снижена при выключении TFB1М (3,980,26 против 1,730,мкмоль/мин/мг белка, р<0,001). Это сопровождалось уменьшением скорости потребления кислорода и синтеза АТФ. Потеря кодируемой мтДНК субъединицы ND5 и кодируемой яДНК субъединицы NDUFB8 комплекса I в -клетках в результате дефицита TFB1M объясняется нарушением модульной сборки комплекса I. Из литературных данных известно, что сборка комплекса I контролируется именно субъединицами, кодируемыми мтДНК, которые выполняют ключевую роль в формировании молекулярного ансамбля комплекса I (Cardol et al., 2002; Chomyn, 2001; Perales-Clemente et al., 2010). Метаболомный анализ -клеток, трансфецированных siTFB1М также выявил накопление метаболитов гликолиза и лактата. Это согласуется с предыдущими результатами о накоплении лактата в глюкозонечувствительных -клетках. Вышеприведенные результаты можно представить в виде модели, описывающей роль TFB1М в патогенезе СД2 (рис. 15).

Рис. 15. Схема, иллюстрирующая роль TFB1М в развитии СД2.

TFB1М-фактор трансляции митохондрии В1;

ОКФОС-окислительное фосфорилирование.

6. Эффект имидазолинового соединения BL11282 на секрецию инсулина островками Лангерганса крыс Вистар и клональными -клетками MIN6 и механизм его инсулинотропной активности Следующая глава раздела “Результаты” посвящена изучению механизмов инсулинотропной активности имидазолиновых соединений. Этот класс соединений, с одной стороны, является перспективным с точки зрения разработки новых препаратов для лечения СД2, с другой, – инструментом для изучения в -клетках сигнальных путей, участвующих в секреции инсулина. Производные сульфонилмочевины широко применяются для лечения СД2. Механизм их действия заключается в блокировании субъединицы SUR1 АТФчувствительных К+-каналов, которое приводит к их закрытию и деполяризации мембран клеток. Это вызывает открытие Са2+-каналов и быстрое поступление ионов Са2+ внутрь клеток, стимулируя тем самым секрецию инсулина. Побочным эффектом производных сульфонилмочевины могут быть эпизоды гипогликемии, поскольку эти производные способны потенцировать секрецию инсулина и при нормальной концентрации глюкозы в крови из-за высокой аффиности сульфонилмочевины к субъединице К+-канала SUR1. В связи с этим представляет интерес новое имидазолиновое производное 5-хлор-3-(4,5дигидро-1H-имидазол-2-ил)-2-метилиндол (BL11282), которое, в отличие от производных сульфонилмочевины, потенцирует секрецию инсулина только при повышенной концентрации глюкозы, и следовательно, минимизирует риск развития гипогликемии.

Следует отметить, что, в отличие от других имидазолинов, BL11282 не взаимодействует с 2-адренорецепторами, поэтому не влияет на уровень артериального давления.

Эффект BL11282 на секрецию инсулина. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе эффекта BL11282 на секрецию инсулина, осложняется отсутствием селективного антагониста этого соединения. Поэтому, создание экспериментальных условий, при которых BL11282 не обладает инсулинотропной активностью и сопоставление их с условиями, при которых BL11282 стимулирует секрецию инсулина, может пролить свет на возможный механизм действия BL11282. В данном исследовании был использован подход, включающий десенситизацию -клеток к инсулиностимулирующему действию BL11282 после 18-24 ч инкубации с этим же соединением (рис. 16). Например, был проведен сравнительный анализ десенситизационных эффектов двух имидазолиновых соединений BL11282 и эфароксана (2-[2-(2-этил-2,3-дигидробензофуранил)]-2-имидазол гидрохлорид). Эфароксан является имидазолиновым соединением первого поколения (Efendic et al., 2002), который стимулирует секрецию инсулина в островках по двум механизмам: по KATP-зависимому, блокируя субъединицу Kir6.2 KATP канала (Jonas et al., 1992) и, 1control culture with 50 M BL112как позже было показано, по KATP-независимому 1механизму, влияя на дистальные компоненты 120 ### экзоцитотического аппарата (Chan et al., 2001).

1### Результаты наших исследований показали, что ### BL11282 и эфароксан десенситизируют островки по *** 60 альтернативным путям и стимулируют секрецию 45 инсулина по различным KATP-независимым механизмам.

Протеомный анализ островков Лангерганса после пролонгированного воздействия BL11282.

3,3 mM glucose 16,7 mM glucose Анализ секреции инсулина показал, что после 16,7 mM glucose + 50 M BL112инкубации островков в течение 18-24 ч с BL112наблюдалалось увеличение секреции инсулина при Рис. 16. Эффект пролонгированной стимуляции этих островков глюкозой по сравнению с инкубации островков Лангерганса островками, инкубированными без BL11282 (рис. 16).

крыс Вистар с BL11282 на глюкозо- и BL11282-стимулированную Это увеличение глюкозостимулированной секреции секрецию инсулина, n=4. ***р<0,001 и инсулина, позволяет предположить, что BL11282по сравнению с 3,3 мМ глюкозы;

индуцированная десенситизация не приводит к # ### р<0,05 и р<0,001 по сравнению с истощению секретируемых запасов инсулина.

16,7 мМ глюкозы.

Островки Лангерганса крыс Вистар, преинкубированные с BL11282, были в состоянии секретировать больше инсулина даже при действии других агентов, стимулирующих секрецию инсулина, как это было установлено нами на примере глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1). В наших экспериментах было показано, что в отличие от BL11282, предварительная инкубация Insulin secretion, U/islet/h островков с эфароксаном даже имеет тенденцию к уменьшению секреторного ответа при добавлении глюкозы. Для ответа на вопрос, почему островки, предварительно инкубированные с BL11282, становятся более чувствительными к последующему воздействию стимулирующей концентрации глюкозы, мы провели их протеомный анализ. Увеличение глюкозостимулированной секреции инсулина после длительной инкубации с BL11282 можно объяснить изменением в экспрессии ряда белков. Нами было проведено сравнение белкового спектра методом 2D-полиакриламидного гельэлектрофореза контрольных островков и островков, инкубированных с BL11282.

Рис. 17. Пример 2D-гель электофореза лизатов островков Лангерганса крыс Вистар (n=6). Белки, уровень экспрессии которых повышен после обработки BL112обозначены окружностью, уровень которых снижен – квадратом. Обе группы приведены в Таблице 1.

Разделение и идентификация пептидов после воздействия трипсина на белки проводилась методом жидкостной хроматографии и тандемной массспектрометрии. Изображения гелей анализировались с помощью программного обеспечения PDQuest TM. В среднем на каждом геле было обнаружено около 600 индивидуальных белков, из них 53 имели различный уровень экспрессии: 30 имели повышенный уровень экспрессии (более чем в 1,5 раза) в островках, инкубированных с BL11282, и 23 имели пониженный уровень экспрессии. Из них 22 белка было идентифицировано (рис. 17, таблица 1). Из этих белков три, участвующие в фолдинге белков, имели повышенный уровень экспрессии в островках, обработанных BL11282:

Hsp60 (рис. 17, пятна 6 и 7), calreticulin (рис. 17, пятно 5) и протеин дисульфид изомераза (пятна 2 и 3). Идентифицированы четыре Са2+-связывающих белка: кальциклин (рис. 17, пятно 14), аннексин 1 (рис. 17, пятно 11), кальретикулин (рис. 17, пятно 5) и кальциззарин (рис. 17, пятно 4). Данные белки участвуют в секреции инсулина. Также было обнаружено повышение уровня ферментов, контролирующих метаболизм глюкозы: пируват киназа (рис.

16, пятно 9), -енолаза (пятно 8), изоцитратдегидрогеназа (рис. 17, пятно 16), транскетолаза (рис. 16, пятно 15). Белки внутриклеточной сигнализации: RhoA (рис. 17, пятно 19) и ингибитор 1 протеин киназы С (PKC; рис. 17, пятно 21).

Мишени воздействия BL11282. В данном разделе работы была изучена роль ранее известных мишеней для имидазолинов (КАТР-каналы, 2-adreno- и I1-имидазолиновые рецепторы, мономерный G-белок Rhes) в секреции инсулина, стимулированной BL11282.

Инсулинотропные свойства имидазолинового соединения BL11282 не связаны с активацией KATP-каналов (Efanov et al., 2001). Для дополнительной проверки этого факта, была использована модель мышей с удаленной SUR1 субъединицей КАТР-каналов (Shiota et al., 2002). Удаление субъединицы SUR1 блокирует трансформацию комплекса с субъединицей Kir6.2 в функционально активный К+-канал и транспорт его из эндоплазматического ретикулума (Zerangue et al., 1999, Seghers et al., 2000). Нами было установлено, что BL112увеличивал секрецию инсулина в островках контрольных NMRI и SUR1(-/-) нокаутных мышей по сравнению с островками NMRI и SUR1(-/-) мышей, инкубированными в присутствии 16,7 мМ глюкозы (рис. 18). Таким образом, полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что инсулинотропный эффект BL11282 не опосредуется через его воздействие на КАТР-каналы.

Таблица 1. Эффект BL11282*) на экспрессию некоторых белков в островках Лангерганса крыс Вистар BL11282/ Accession Расчетные Пятно Белок LC MS/MS сиквенс контроль number Mw/pI 1 1.84 Гликопротеин GC1QBP O35796 23596/4.39 204–22 2.75 Протеин дисульфид изомераза P04785 54983/4.77 455–463, 427–43 2.47 Протеин дисульфид изомераза P04785 54983/4.77 319–328, 378–3Кальциззарин (Calgizzarin; S14 2.27 кальций-связывающий белок Q6B345 11065/5.60 32–A11) 5 2.61 Кальретикулин (Calreticulin) P18418 46348/4.33 112–120, 74–6 2.13 Белок теплового шока 60 (Hsp60) P63039 57926/5.35 345–352, 406–47 1.68 Белок теплового шока 60 (Hsp60) P63039 57926/5.35 143–156, 293–18 1.77 -енолаза P04764 46997/6.16 71–79, 412–419, 406–49 1.61 Пируват киназа M1/M2 P11980 57687/6.69 106–114, 141–110 1.62 Глицинамидинотрансфераза P50442 44183/6.15 370–381, 190–111 1.83 Аннексин A1 P07150 38698/7.13 113–123, 166–112 1.66 Глутамат дегидрогеназа 1 P10860 55948/6.71 536–545, 163–171, 192– 200, 172–183, 152–1536–545, 192–200, 172– 13 1.46 Глутамат дегидрогеназа 1 P10860 55948/6.183, 152–114 1.72 Кальциклин (Calcyclin) P05964 10035/5.30 2–15 2.38 Транскетолаза P50137 67644/7.22 472–493, 187–215 2.38 Гетерогенный ядерный рибо- Q7TP47 59711/8.86 82–нуклеопротеин Q (hnRNP-Q) 16 1.72 3-Кетоацил-КoA тиолаза P13437 41871/8.09 26–38, 159–116 1.72 Изоцитратдегидрогеназа P56574 50967/8.88 51–67, 250–260, 362–3Б 17 0.65 Кератин тип 2, кератин Q10758 53854/5.82 252–263, 264–272, 285– цитоскелета тип 8 294, 316–324, 372–318 0.61 Ретинолсвязывающий белок P02696 15703/5.11 69–19 0.66 Трансформирующий белок RhoA P61589 21443/5.83 85–Протеосомная субъединица 20 0.58 P40112 22965/6.15 71–тип 20 0.58 40S Рибосомальный белок SA P38983 32693/4.80 120–127, 89–121 0.50 Ингибитор протеин киназы С 1 P62959 13660/6.65 7–20, 30–Протеосомная субъединица 22 0.62 P60901 27399/6.35 31–тип *) Белки, уровень экспрессии которых увеличен (А) или снижен (Б). Локализация белков на 2D-геле представлена на рис. 17. Молекулярный вес (Mw) и изоэлектрические точки (pI) даны в таблице и соответствуют исходному белку. Номера в колонке LC MS/MS сиквенс показывают стартовые и конечные позиции сиквенсов идентифицированных пептидов, соответствующих исходному белку.

Антагонизм 2-адренорецепторов является одним из механизмов действия соединения фентоламина, относящегося к классу имидазолинов (Robertson et al., 1973, Efendic et al., 1975). Для выяснения, обладает ли BL11282 2-адренергической активностью, использовался 2-адренергический антагонист иохимбин (метиловый эфир 16-карбокси17-гидроксииохимбана). Было показано, что иохимбин в комбинации с BL11282 не влияли на секрецию инсулина, что свидетельствует об отсутствии у BL11282 2-адренергической активности. Некоторые имидазолины могут взаимодействовать с I1-имидазолиновыми рецепторами, активируя фосфатидитхолин-специфическую фосфолипазу С (PC-PLC;

Separovic et al., 1997). Это наблюдение основывалось на том, что моксонидин, селективный агонист I1-имидазолиновых рецепторов, увеличивал концентрацию диацилглицерола и фосфохолина в нейронах и PC12 клетках (Separovic et al., 1996), а D609 (трициклодекан-9ил ксантат), ингибитор PC-PLC, блокировал эффект моксонидина и, соответственно, повышал концентрацию диациглицерола (Separovic et al., 1996). Для проверки, задействует ли BL11282 сигнальный путь, связанный с активацией I1-имидазолиновых рецепторов и PCPLC, был использован селективный антагонист AGN192403 (2-эндо-амино-3-exoизопропилбицикло[2.2.1]-гептан гидрохлорид; Munk et al., 1996) и ингибитор PC-PLC – D609 (Efanov et al., 2001). Полученные результаты показали, что ингибирование I1- рецептора с помощью AGN192403 и фермента PC-PLC с помощью D609 не влияет на секрецию инсулина, стимулированную BL11282. Полученные данные не подтвердили роль I1- рецептор/PC-PLC сигнального пути в эффекте BL11282 на секрецию инсулина.

Ранее сообщалось, что 80 мономерный G-белок Rhes # (гуанидинсвязывающий G-белок, & находящийся в corpus striatum, гомолог белка Ras) является ** имидазолин-регулируемым белком ## (Chan et al., 2002) и вовлечен в КАТР*** канал независимый путь секреции инсулина имидазолиновым + + - - - 3.3 mM glucose производным эфароксаном. Для - - + + + + 16.7 mM glucose - - - - + + 10 M BL112проверки гипотезы, вовлечен ли белок Rhes в регуляцию секреции инсулина Рис. 18. BL11282 потенцирует глюкозо- другим имидазолиновым соединением стимулированную секрецию инсулина в островках – BL11282, было проведено измерение Лангерганса контрольных мышей NMRI (черные уровня экспрессии мРНК Rhes после столбцы) и SUR1(-/-) мышей (белые столбцы), n=3.

воздействия BL11282, трансфекция ** *** р<0,01 и р<0,001 по сравнению с NMRI при 3,клеток плазмидами, кодирующими # ## мМ глюкозы; р<0,05 и р<0,01 по сравнению с Rhes и antiRhes и секреции инсулина.

NMRI при 16,7 мМ глюкозы,&р<0,05 по сравнению с При этом не было обнаружено SUR1(-/-) при 16,7 мМ глюкозы.

изменений уровня экспрессии мРНК Rhes в островках, инкубированных с BL11282, а также трансфекция плазмид с Rhes и antiRhes не влияла на BL11282-стимулированную секрецию инсулина. Таким образом, полученные результаты не подтвердили предположение, что Rhes является имидазолинрегулируемым белком и не соответствуют предположению, что белок Rhes отвечает за экзоцитоз инсулина в присутствии BL11282.

BL11282 и сигнальный путь глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1).

Имидазолиновое соединение BL11282 было синтезировано с целью имитации глюкозозависимого инсулинотропного действия пептида ГПП-1. Поэтому на данном этапе работы мы, используя метод десенситизации ответа островков к BL11282, выяснили, имеют ли эти два соединения сходный механизм действия. цАМФ играет ключевую роль в механизме глюкозозависимой инсулинотропной активности ГПП-1. ГПП-1 является пептидом, который взаимодействуя с G-белок связанным с рецептором, активирует Gsаденилатциклаза-цАМФ сигнальный путь (Gromada et al., 1998, MacDonald et al., 2002). Это приводит к накоплению цАМФ и, как следствие, к активации РКА и цАМФ-GEFII-Rim2зависимых сигнальных путей, вовлеченных в экзоцитоз инсулина (Seino et al., 2005, Doyle et al., 2007). Поэтому было важным проверить, пересекаются ли сигнальные пути известного пептида ГПП-1 и BL11282? Десенситизация островков к BL11282 не снижала способность ГПП-1 потенцировать глюкозостимулированную секрецию инсулина при условиях, когда пептид добавлялся в отсутствии или присутствии BL11282. При этом десенситизация островков к BL11282 уменьшала в два раза эффект потенцирования Insulin, U/islet/h глюкозостимулированной секреции инсулина в присутствии ГПП-1. Это значит, что BL11282 задействует внтутриклеточный путь передачи сигнала пептидом ГПП-1 и пролонгированная инкубация с имидазолином приводит к снижению активности этого сигнального пути. Экспрессия мутантных белков цАМР-GEFII (G114E, G422D) и Rim2A в -клетках MIN6 приводила к снижению секреции инсулина в присутствии BL11282 на 22% и 42%, соответственно, по сравнению c контролем (трансфекция рCMV-EGFP).

BL11282 и сигнальный путь арахидоновой кислоты. Было показано, что BL112стимулирует экзоцитоз инсулина через сигнальные пути, не сопровождающиеся увеличением внутриклеточной концентрации – [Са2+]i (Efanov et al., 2001). Также есть сообщения о том, что арахидоновая кислота и ее метаболиты вовлечены в механизм регуляции секреции инсулина в -клетках, который активируется без увеличения [Са2+]i (Nowatzke et al., 1998). Эти пути включают как саму арахидоновую кислоту, так и ее биологически активные метаболиты – эпоксиэйкозотриеновые кислоты, генерируемые цитохромом Р450 (Needleman et al., 1986, Jones et al., 1993). В островках арахидоновая кислота высвобождается из мембранных фосфолипидов при активации фосфолипазы А(PLА2; Chakraborti et al., 2003, Balsinde et al., 2002). Применяя фармакологические ингибиторы, был изучен сигнальный путь арахидоновой кислоты в эффекте BL11282 на секрецию инсулина. Для изучения эффекта BL11282 на секрецию инсулина, была исследована роль [Ca2+]i-независимой изоформы PLA2, которая экспрессируется в островках и участвует в процессе секреции инсулина -клетками (Ramanadham et al., 2003).

Нами было установлено снижение уровня экспрессии iPLA2 в островках диабетических крыс Гото-Какизаки в сравнении с островками контрольных крыс Вистар, что согласуется с данными о снижении инсулинового ответа в островках крыс Гото-Какизаки (Efanov et al., 2002). Поэтому данный факт свидетельствует об участии iPLA2 в процессе секреции инсулина и снижение ее экспрессии может быть одной из причин снижения секреции инсулина при СД. Используя специфический ингибитор PLA2, BEL (бромоеноллактон), было показано, что BEL ингибирует BL11282-стимулированную секрецию инсулина при нормальных и деполяризованных условиях, т.е. когда [Ca2+]i постоянна. Таким образом, генерация арахидоновой кислоты через активацию iPLA2 является одним из механизмов инсулинотропного действия BL11282. Действительно, нами было показано, что BL112стимулировал высвобождение [3Н]-арахидоновой кислоты в островках в присутствии глюкозы и этот эффект полностью блокировался BEL.

Цитохром Р450, генерирующий эпоксиэйкозатриеновые кислоты, вовлечен в механизм глюкозостимулированной секреции инсулина (Falck et al., 1983). Нами было оценено влияние ингибитора цитохрома Р450 MB-1-ABT (метилбензил-1-аминобензотриазол; Falck et al., 1983) на секрецию инсулина в присутствии глюкозы и BL11282. Инкубация с MB-1ABT частично снижала глюкозоиндуцированную секрецию инсулина. Кроме того, ингибитор полностью блокировал имидазолин-потенцированную секрецию инсулина в присутствии глюкозы. Наши данные указывают на то, что метаболизм арахидоновой кислоты через цитохром Р450, приводящий к образованию эпоксиэйкозатриеновых кислот, участвует в механизме глюкозостимулированной секреции инсулина BL11282. Полученные результаты свидетельствуют о том, что потенцирование глюкозостимулированной секреции инсулина при действии BL11282, независимо от изменений [Ca2+]i, включает стадии высвобождения арахидоновой кислоты при участии iPLA2 и е превращение в эпоксиэйкозатриеновые кислоты при участии цитохрома Р450. Результаты исследования молекулярных механизмов инсулинотропной активности BL11282 обобщены на рис. 19.

7. Эффект экстракта из слоевищ лишайника рода Cladonia на секрецию инсулина Лишайник рода Cladonia давно применяется в традиционной медицине; известны его антиоксидантные, антимикробные и детоксикационные свойства. В состав Cladonia входят широкий спектр соединений, такие как амино--поли- и -олигосахариды, усниновые, орселиновые, леканоровые, гирофоровые и хиастовые кислоты, гидроксинафтохиноны гидроксиантрахиноновые и другие ароматические пигменты, депсидоны, антранорины, полиненасыщенные жирные кислоты и т.д. (Телятьев, 1987).

Рис. 19. Схема, иллюстрирующая метаболические и сигнальные пути, вовлеченные в механизм инсулинотропной активности имидазолинового соединения BL11282 в -клетках.

Kir6.2 и SUR1-субъеденицы ATФ-чувствительных K+ каналов; 2-адренорецепторы второго типа; I1-имидазолиновые рецепторы 1 типа; Rhes, мономерный G-белок, гомолог Ras; AC-аденилат циклаза; GLP-1 R-рецептор для глюкагоноподобного пептида 1; GEFII, cAMФ-регулируемый фактор обмена гуаниновых нуклеотидов типа II; Rim2-молекула, взаимодействующая с белком Rab3; iPLA2-Ca2+-кальций независимая фосфолипаза A2; PL-фосфолипиды; LPL-лизофосфолипиды;

AA-арахидоновая кислота; EEA-эпоксиэйкозатреновые кислоты; P450-цитохром P-450.

Нами были изучена способность водноспиртового экстракта (этанол: вода=1:1, об/об) Cladonia улучшать инсулиносекреторную функцию -клеток. В эксперименте клональные -клетки 832/13 культивировались в стандартной среде RPMI1640 в присутствии экстракта (разведение 1:100) в течение 1-30 дней. После инкубации клональных -клеток с экстрактом измерялась секреция инсулина в присутствии 16,7 мМ глюкозы, которая увеличивалась с 120,2±5,9 нг/ч/мг белка (контроль) до 230,1±15,6 нг/ч/мг белка (экстракт). При этом отмечалось повышение общего уровня АТФ в клональных -клетках, инкубированных с экстрактом, в ходе 1 ч стимуляции с 16,7 мМ глюкозы (111,3±5,4 и 149,3±7,5 нмоль/ч/мг белка, соответственно; р<0,01). Общее содержание АТФ в присутствии 40 мкМ FCCP и мкг/мл олигомицина не отличалось в контрольных -клетках и -клетках, культивированных с экстрактом (25,9±2,0 и 23,8±1,9 нмоль/ч/мг белка, соответственно). Это свидетельствует о том, что разница в содержании АТФ обусловлена повышением митохондриальной продукции АТФ в клональных -клетках 832/13, культивированных с экстрактом.

8. Снижение цитотоксического действия провоспалительных цитокинов на -клетки островков Лангерганса мышей Воздействие цитокинов и/или RX871024 на -клетки. Ранее было установлено, что имидазолиновое соединение RX871024 снижает ИЛ-1-стимулированную активацию iNOS (NO-синтаза) и соответственно ИЛ-1-индуцированный апоптоз -клеток (Zaitsev et al., 2001). Поэтому в данном исследовании было изучено, предотвращают ли имидазолиновые соединения RX871024 и эфароксан гибель -клеток островков Лангерганса мышей в условиях, моделирующих воспаление при СД1, т.е. в присутствии комбинации провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ФНО- и ИФ-? Последнее является более близким аналогом условий in vivo, чем присутствие только одного ИЛ-1. Имидазолиновое соединение RX871024 потенцирует глюкозостимулированную секрецию инсулина и не обладают 2-адренергической активностью (Zaitsev et al., 1999).

Проведенные эксперименты показали, что имидазолиновое соединение RX871024 не модулирует цитокин-индуцированную гибель -клеток. Было установлено, что RX8710ингибирует продукцию NO в островках и -клетках в присутствии цитокинов; данный эффект сопровождался снижением фосфорилирования митогенактивированной протеинкиназы р38. В совокупности, проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что комбинация провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ФНО- и ИФ-, т.е. условия, имеющие место при развитии СД1, индуцируют NO-независимую гибель -клеток, и данный процесс происходит независимо от присутствия имидазолиновых соединений (рис.

20), т.е. последние не влияют на цитокин-стимулированную гибель -клеток.

SOCS-1 в механизме повышения устойчивости -клеток к воспалению. На примере трансгенных мышей мы изучили эффект увеличения экспрессии супрессора цитокинового сигналлинга 1 (SOCS-1) на гибель -клеток в присутствии смеси провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ФНО- и ИФ-. Было установлено, что повышение экспрессии SOCS-1 не воздействует на продукцию NO и глюкозостимулированную секрецию инсулина в присутствии смеси ИЛ-1, ФНО- и ИФ-. Тем не менее, SOCS-снижал активность каспаз-3, -8 и -9, что сопровождалось ингибированием апоптоза клеток. Полученные результаты позволяют предположить, что увеличение экспрессии SOCS-1 не достаточно для снижения биологической активности ИФ- в -клетках и существует другой путь передачи сигнала, не зависимый от JAK/STAT сигнального пути (рис. 21).

Рис. 20. Схема, иллюстрирующая механизм снижения цитокининдуцированной продукции NO в клетках в присутствии имидазолинового соединения RX871024.

iNO-синтаза-индуцибельная NOсинтаза.

Рис. 21. Схема, иллюстрирующая механизм снижения цитокининдуцированного апоптоза -клеток в островках Лангерганса SOCS-трансгенных мышей.

JAK – тирозинкиназа Янус-симейства;

NFB – ядерный фактор транскрипции B; SOCS1 – супрессор цитокинового пути передачи сигнала; STAT1 – переносчик сигнала и активатор транскрипции.

9. Белок GAS6 и его рецептор AXL: экспрессия и механизм действия в клональных -клетках 832/13 и в островках Лангерганса человека Белок GAS6 известен как активатор роста гладкомышечных клеток, в англоязычной литераторе он называется как “growth arrest-specific protein 6”. GAS6 принадлежит к группе витамин К-зависимых -карбоксилированных белков. GAS6 является лигандом для рецептора AXL, принадлежащим к семейству рецепторов класса тирозинкиназ. На примере других типов клеток было показано, что система GAS6/AXL участвует в процессах воспаления, иммунного ответа, апоптоза, клеточного деления и продукции цитокинов.

Однако ранее не сообщалось о GAS6 или его рецепторе AXL в островках поджелудочной железы. Учитывая широкий спектр вышеперечисленных процессов, в которые вовлечена система GAS6/AXL, является перспективным изучение ее роли в островках Лангерганса поджелудочной железы.

Экспрессия GAS6/AXL. Используя различные методы детекции (ПЦР, иммуноблоттинг и иммуноцитохимия) нами была обнаружена экспрессия белка GAS6 (кД) и его рецептора AXL (140 кД) в островках Лангерганса человека, крысы и мыши, а также в клональных -клетках 832/13. На рис. 22 приведен пример детекции GAS6 и AXL методом иммуноблоттинга в клетках 832/13 и островках Лангерганса человека.

GAS6-индуцированная передача сигнала в -клетках. Добавление экзогенного GAS6 к клональным -клеткам 832/13 приводило к активации аутофосфорилирования рецептора AXL (через 5, 30 и 60 мин), которое измерялось методом иммуноблоттинга, используя антитела к pY779 (рис. 23А). GAS6-индуцированное аутофосфорилирование AXL снижалось в присутствии избытка растворимой формы рецептора AXL (рис. 23А).

Полученные данные доказывают наличие функционально активного рецептора AXL в клетках.

Рис. 22. Иммуноблоттинг белка GAS6 и его рецептора AXL (hrGAS6 – человеческий рекомбинантный белок GAS6, позитивный контроль; AXL-ED – экстрацеллюлярный домен, растворимая форма рецептора AXL). А. Экспрессия белка GAS6 в -клетках 832/13. В.

Экспрессия рецептора AXL в островках Лангерганса человека.

Одним из возможных путей передачи сигнала в результате аутофосфорилирования AXL является активация сигнального пути PI3-киназа/Akt. Используя фосфосеринспецифические антитела к Akt (pS473), было обнаружено фосфорилирование Akt, которое блокировалось в присутствии вортманина (рис. 23В). Для выявления фосфорилирования других белков при стимуляции -клеток GAS6 был выполнен протеомный анализ. Анализ фосфорилирования белков по остатку тирозина показал наличие 23 модифицированных белков. Методом жидкостной хроматографии и массспектрометрического секвенирования пептидов было доказано фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и глюкозо-регулируемого белка (GRP78/BiP). Из результатов, полученных другими авторами, известно, что GAPDH, являясь ключевым гликолитическим ферментом, при его ковалентной модификации (фосфорилирование, нитрование, окисление) может также проявлять другие свойства, например, транскрипционного фактора, регулятора апоптоза, участвовать в слиянии клеточных мембран и т.д. (Tatton et al., 2000; Tisdale et al., 2001).

А. В.

Рис. 23. GAS6 индуцирует сигнальный путь в -клетках 832/13 через AXL/PI3-киназу/Akt/РКВ А. Аутофосфорилирование рецептора AXL в присутствии 400 нг/мл GAS6. Присутствие растворимой формы 400 мкг/мл AXL снижает аутофосфорилирование рецептора AXL.

В. Фосфорилирование Akt/PKB. Добавление 100 нМ вортманина (ингибитор PI3-киназы) блокирует GAS6-стимулированное фосфорилирование Akt/PKB.

Фосфорилирование AXL/PI3-киназы/Akt предшествует фосфорилированию остатков тирозина белков GAPDH и GRP78/BiP и является одним из направлений ответа -клеток при стимуляции их GAS6.

Эффект GAS6/AXL на -клетки. Для выяснения участия GAS6/AXL в секреции инсулина в -клетках было проведено частичное подавление экспрессии рецептора AXL с использованием siРНК. Нокаутирование рецептора AXL вызывало частичное ингибирование глюкозостимулированной секреции инсулина в -клетках (рис. 24).

А. В.

Рис. 24. Роль рецептора AXL в глюкозостимулированной секреции инсулина в -клетках 832/13.

А. Экспрессия рецептора AXL (siAXL 60 нМ), n=3. *р<0,05 по сравнению с контролем.

В. Глюкозостимулированная секреция инсулина, n=3. *р<0,05, **р<0,01 по сравнению с контролем.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 1. На модели клональных -клеток, чувствительных и нечувствительных к глюкозе показано, что в глюкозочувствительных -клетках секрецию инсулина обеспечивает тесное сопряжение гликолиза и митохондриального метаболизма пирувата. Это сопряжение проявляется в усилении митохондриального дыхания и ограничении гликолиза и продукции лактата. Установлен сходный характер экспрессии генов ферментов гликолиза и митохондриального метаболизма в клональных -клетках и островках Лангерганса человека. При этом повышение уровня глюкозы крови может нарушать координированную экспрессию генов гликолиза и митохондриального метаболизма в островках Лангерганса человека, которая необходима для глюкозостимулированной секреции инсулина.

2. Установлено, что пролонгированное действие глюкозы и фактора некроза опухоли- в повышенных концентрациях на -клетки вызывает стабилизацию индуцированного гипоксией транскрипционного фактора-1. Это подавляет глюкозостимулированную секрецию инсулина и открывает возможность целенаправленно ингибировать стабилизацию индуцированного гипоксией транскрипционного фактор-1 в -клетках для поддержания их инсулиносекреторной функции при сахарном диабете 2 типа.

3. Показано, что концентрация NADPH достигает максимума через 6 мин после начала стимуляции -клеток глюкозой и предшествует пику секреции инсулина. Так как NADPH, генерируемый в пентозофосфатном цикле, является необходимым сопрягающим фактором в амплифицирующем механизме секреции инсулина -клетками, это позволило пересмотреть роль пентозофосфатного цикла в -клетках, участие которого в механизме секреции инсулина ранее недооценивалось.

4. Установлено, что вариант полиморфизма гена фактора трансляции митохондрии Вrs950994 (GA) ассоциируется со снижением его экспрессии в -клетках островков Лангерганса человека. Это приводит к ограничению трансляции субъединиц системы окислительного фосфорилирования и уменьшению продукции АТФ, что является одной из причин снижения секреции инсулина и увеличения риска развития сахарного диабета типа. На основании этого анализ полиморфизма гена tfb1m рекомендован к внедрению в клиническую практику для выявления предрасположенности к развитию сахарного диабета 2 типа.

5. Изучен механизм инсулинотропной активности нового имидазолинового соединения BL11282. Установлено, что инсулинотропная активность BL11282 не опосредована его влиянием на АТФ-чувствителные К+-каналы, белок Rhes, 2-адрено- и имидазолиновые I1-рецепторы. Предложен механизм инсулинотропного действия BL112через цАМФ-зависимый сигнальный путь и комплекс GEFII·Rim2 и сигнальный путь арахидоновой кислоты, активируемый кальцийнезависимой фосфолипазой А2 и ее последующий метаболизм цитохромом Р450 до эпоксиэйкозатриеновый кислоты. Также показано, что пролонгированное воздействие BL11282 на -клетки увеличивает их чувствительность к последующей стимуляции глюкозой, что сопровождается повышением экспрессии белков, участвующих в фолдинге, связывании ионов Са2+, метаболизме и снижением уровня экспрессии ингибитора протеин киназы С. Полученная информация о сигнальных путях инсулинотропного действия BL11282, которые активируются только при повышении концентрации глюкозы, позволяет разрабатывать принципиально новые препараты глюкозозависимого действия для лечения сахарного диабета 2 типа.

6. При моделировании воспаления при сахарном диабете 1 типа показано, что цитотоксическое действие комбинации провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ФНО- и ИФ- на -клетки островков Лангерганса частично снижается при действии имидазолинового соединения RX871024 или повышении экспрессии супрессора цитокинового пути передачи сигнала-1 в -клетках. При этом RX871024 или повышенная экспрессия супрессора цитокинового пути передачи сигнала-1 не предотвращали цитокининдуцированное подавление глюкозостимулированной секреции инсулина. Это дает основания предполагать, что в -клетках существует JAK/STAT-независимый сигнальный путь цитотоксического действия ИФ-.

7. Изучен биологически активный комплекс веществ из слоевищ лишайника Cladonia, улучшающий инсулиносекреторную функцию -клеток за счет увеличения митохондриальной продукции АТФ. Использование комплекса веществ из слоевищ лишайника Cladonia может рассматриваться как один из дополнительных способов поддержания нормогликемии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа.

8. Впервые в -клетках идентифицированы белок GAS6 и его рецептор AXL.

Определен один из механизмов GAS6-стимулированной внутриклеточной передачи сигнала в -клетках, включающий фосфорилирование AXL/PI3-киназы/Akt/(GAPDH и GRP78) и ингибирование секреции инсулина при нокаутировании AXL рецептора. Полученные новые данные о синтезе и сигнальных путях системы ”GAS6-AXL” позволяют приступить к более глубокому изучению их роли в функционировании -клеток островков Лангерганса.

9. Предложены белки-мишени, которые могут представлять интерес для фармакологического воздействия с целью нормализации функциональной активности клеток при сахарном диабете.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах ВАК 1. Vladimir V. Sharoyko, Irina I. Zaitseva, Mark Varsanyi, Neil Portwood, Barbara Leibiger, Ingo Leibiger, PerOlof Berggren, Suad Efendi and Sergei V. Zaitsev. Monomeric G-protein, Rhes, is not an imidazoline-regulated protein in pancreatic -cells. Biochem Biophys Res Commun. 338(3): 1455-1459, 2005.

2. Irina I. Zaitseva, Vladimir V. Sharoyko, Joachim Strling, Suad Efendi, Christopher Guerin, Thomas MandrupPoulsen, Pierluigi Nicotera, Per-Olof Berggren and Sergei V. Zaitsev. RX871024 reduces NO production but does not protect against pancreatic -cell death induced by proinflammatory cytokines. Biochem Biophys Res Commun.

347(4): 1121-1128, 2006.

3. Theres Jgerbrink, Helena Lexander, Carina Palmberg, Jawed Shafqat, Vladimir V. Sharoyko, Per-Olof Berggren, Suad Efendi, Sergei V. Zaitsev and Hans Jrnvall. Differential protein expression in pancreatic islets after treatment with an imidazoline compound. Cellular and Molecular Life Sciences. 64(10): 1310-1316, 2007.

4. Vladimir V. Sharoyko, Irina I. Zaitseva, Barbara Leibiger, Suad Efendi, Per-Olof Berggren and Sergei V.

Zaitsev. Arachidonic acid signaling is involved in the mechanism of imidazoline-induced KATP channelindependent stimulation of insulin secretion. Cellular and Molecular Life Sciences. 64: 2985-2993, 2007.

5. Irina I. Zaitseva, Monica Hultcrantz, Vladimir V. Sharoyko, Malin Flodstrm-Tullberg, Sergei V. Zaitsev, PerOlof Berggren. Supressor of cytokine signalling-1 inhibits caspase activation and protects from cytokine-induced -cell death. Cellular and Molecular Life Sciences. 66(23):3787-3795, 206. Siri Malmgren, David G. Nicholls, Jalal Taneera, Karl Bacos, Ashkan Tamaddon, Rolf Vibom, Leif Groop, Charlotte Ling Hindrik Mulder, Vladimir V. Sharoyko. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal -cells is required for robust insulin secretion. Journal of Biological Chemistry.

284(47):32395-32404, 2009.

7. Thomas Koeck, Anders H Olsson, Vladimir V. Sharoyko, Marloes Dekker Nitert, Claes Ladenvall, Olga Kotova, Erwin Reiling, Tina Rnn, Hemang Parikh, Jalal Taneera, Johan G Eriksson, Holger Luthman, Alena Stancakova, Johanna Kuusisto, Markku Laakso, Pernille Poulsen, Allan Vaag, Leif Groop, Valeriya Lyssenko, Hindrik Mulder, Charlotte Ling. A common variant in TFB1M is associated with reduced insulin secretion and increased future risk of type 2 diabetes. Cell metabolism. 13(1):80-91, 2011.

8. В. Шаройко, Б. Кершенгольц. Экспрессия некоторых генов энергетического метаболизма в панкреатических островках человека коррелирует с уровнем гликозилированного гемоглобина.

Дальневосточный медицинский журнал. 4: 32-37, 2009.

9. В. Шаройко, В. Чуркин, Б. Кершенгольц. цАМФ-GEFII-Rim2 путь в К+-канал-независимом механизме инсулинотропной активности нового имидазолинового соединения. Сибирский медицинский журнал. 3:

48-51, 2010.

10. В. Шаройко, В. Чуркин, Б. Кершенгольц. Усиление гликолиза и подавление митохондриального метаболизма приводит к утрате глюкозостимулированной секреции инсулина в -клетках. Сибирский медицинский журнал. 5: 90-92, 2010.

11. Ulrika Bryborn, Olga Kotova, Peter Spgel, Vladimir V. Sharoyko, Elna Hallgard, Anna Vedin, Thomas Moritz, Mary C. Sugden, Thomas Kck, Hindrik Mulder. Pyruvate dehydrogenase kinase 1 controls mitochondrial metabolism and insulin secretion in INS-1 832/13 clonal -cells. Biochemical journal. 429, 1: 205-213, 2010.

12. В. Шаройко, Е. Ляшенко, Е. Чуркина, В. Чуркин. Физиолого-биохимические механизмы инсулинсекреторной дисфункции -клеток островков поджелудочной железы. Медицинский академический журнал. №5. Том 10:69, 2010.

13. Е. Ляшенко, Е. Чуркина, В. Шаройко. Кальций-зависимые изоформы диациглицерол киназ и их роль в секреции инсулина -клетками островков поджелудочной железы. Медицинский академический журнал.

№5. Том 10:58, 2010.

14. Peter Spgel, Siri Malmgren, Vladimir V. Sharoyko, Philip Nesholme, Hindrik Mulder. Glucose-responsive (832/13) and -unresponsive (832/2) -cell lines exhibit profound differences in glycolitic and tricarboxylic acid cycle metabolism. Biochemical journal, 435(1):277-284, 2011.

15. Е. Чуркина, Б. Кершенгольц, В. Шаройко. Эффект препарата «Ягель» из слоевищ лишайника рода Cladonia на секрецию инсулина. Дальневосточный медицинский журнал. 2: 30-34, 2011.

16. Peter Spgel, Andrs P.H. Danielsson1, Vladimir V. Sharoyko, Siri Malmgren, Cecilia Nagorny, Isabel Goehring, G.W.S. Sharp, S. Straub, Tomas Koeck and Hindrik Mulder. Time-resolved metabolomics analysys of insulinproducing clonal -cells implicates the pentose phosphate pathway in control of insulin release. FASEB, 2011, 296(54):15396-15408.

Публикации в других изданиях 17. Б. Кершенгольц, П. Ремигайло, Е. Хлебный, В. Шаройко, А. Шеин, М. Шашурин, Г. Филиппова, А.

Журавская, В. Аньшакова. Биоактивные добавки из природного сырья Якутии. Материалы выездного заседания Ученого Совета РАМН ”Проблемы питания населения Арктики”. Якутск. С. 79-91, 2010.

18. Б. Кершенгольц, П. Ремигайло, Е. Хлебный, В. Шаройко, А. Шеин, М. Шашурин, Г. Филиппова, А.

Журавская, В. Аньшакова. Зачем нужны и что могут дать биотехнологии российскому Северу. Наука из первых рук. Новосибирск. № 1. С. 48-60, 2011.

Тезисы конференций 19. Vladimir V. Sharoyko, Karl Bacos, Avinash Abhynkar, Cecilia L. F. Nagorny, Hindrik Mulder. A metabolic comparison of glucose-responsive INS-1 832/13 and glucose- nonresponsive INS-1 832/2 -cells. European Association for the Study of Diabetes, 44th Annual Meeting, Rom, Italy, 51: 203-204, 2008.

20. Vladimir V. Sharoyko, Carl Ekman, Nils Wierup Frank Sundler, Bjrn Dahlbck, Hindrik Mulder. Protein GAS6 and its receptor Axl are expressed and operate in pancreatic -cells. European Association for the Study of Diabetes, 45th Annual Meeting, Vienna, Austria, 52:448, 2009.

21. В. Шаройко. Метаболический и генетический сравнительный анализ -клеток поджелудочной железы, чувствительных и нечувствительных к повышению концентрации глюкозы: новая модель для изучения патогенеза сахарного диабета 2 типа. Конференция молодых ученых: Лаврентьевские чтения, Якутск, Россия. 13:56, 2009.

22. Vladimir V. Sharoyko, Siri Malmgren, David G. Nicholls, Karl Bacos, Ashkan Tamaddon, Rolf Wibom, Charlotte Ling, Hindrik Mulder. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal -cells is required for robust insulin secretion. Gordon Research Conference: Molecular & Cellular Bioenergetics, Andover, USA. 15:22-23, 2009.

23. Siri Malmgren, Vladimir V. Sharoyko, David G. Nicholls, Cecilia Nagorny, Peter Spgel, Charlotte Ling, Hindrik Mulder. Swimming with lipids: A liptoxicity model in the INS-1 -cells: the physiological and epigenetic alterations induced by it. Scientific Symposium: “What’s next”, Malm, Sweden. 1:15-16, 2009.

24. Siri Malmgren, Vladimir V. Sharoyko, David G. Nicholls, Karl Bacos, Charlotte Ling, Hindrik Mulder.

Differences in metabolic regulation between two sister clonal rat -cell line INS-1 832 decides their -cell functionality. 20th World Diabetes Congress, IDF, Montreal, Canada. 52:454, 2009.

25. Vladimir V. Sharoyko, Tomas Koeck, Carl Ekman, Nils Wierup, Frank Sundler, Bjrn Dahlbck, Hindrik Mulder. Protein GAS6 and its receptors AXL, TYRO3 and MER are expressed and operate in pancreatic -cells.

Scandinavian Society for the Study of Diabetes, 45th Annual Meeting, Malm, Sweden. 45:45-46, 2010.

26. Jelena A. Stamenkovich, Cecilia LF Nagorny, Charlotte Ling, Albert Salehi, Vladimir V. Sharoyko, Hindrik Mulder. Melatonin effects on insulin secretion and clock genes expression. European Association for the Study of Diabetes, 46th Annual Meeting, Stockholm, Sweden, 53:93, 2010.

27. Vladimir V. Sharoyko, Tomas Koeck, Carl Ekman, Nils Wierup, Frank Sundler, Bjrn Dahlbck, Hindrik Mulder. Growth arrest specific protein 6 (GAS6) and its receptors expression and signalling in -cells. European Association for the Study of Diabetes, 46th Annual Meeting, Stockholm, Sweden, 53:530, 2010.

28. Thomas Koeck, Peter Spegel, Vladimir V. Sharoyko, Charlotte Ling, Hindrik Mulder. Oxdative phosphorylation-dependent insulin secretion in pancreatic -cells: New insights by disrupting TFB1m. European Association for the Study of Diabetes, 46th Annual Meeting, Stockholm, Sweden. 53:491, 2010.

29. Siri Malmgren, Vladimir V. Sharoyko, David G. Nicholls, Cecilia Nagorny, Peter Spegel, Marloes Dekker Nitert, Hindrik Mulder, Charlotte Ling. A lipotoxity model in the INS-1 832/13 -cells lines and the epigenetic alterations induced by it. Scandinavian Society for the Study of Diabetes, 45th Annual Meeting, Malm, Sweden, 53:348, 2010.

30. Peter Spgel, Anders P.H. Danielsson, Vladimir V. Sharoyko, Cecilia Nagorny, Geoffrey Sharp, Susan Straub, Hindrik Mulder. Metabolite profiling of clonal INS-1 832/13 -cells after glucose stimulation. Scandinavian Society for the Study of Diabetes, 45th Annual Meeting, Malm, Sweden. 45:31-32, 2010.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.