WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

МОРГУНОВ ИГОРЬ ГРИГОРЬЕВИЧ

МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

У ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA – ПРОДУЦЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ

03.00.04 – Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Пущино - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научный консультант:                        доктор биологических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Татьяна Васильевна Финогенова

Официальные оппоненты:        доктор биологических наук, профессор  Миронова Галина Дмитриевна

       

доктор биологических наук, профессор  Звягильская Рената Александровна

доктор биологических наук, профессор Бурьянов Ярослав Иванович

Ведущая организация:                        Учреждение Российской академии наук

Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится  “ 26 ” ноября 2009 г. в  14 час 30 мин

на заседании диссертационного совета Д 002.121.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат  разослан “ ”  2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Последние годы характеризуются возрастанием интереса к исследованию неконвенционных дрожжей Yarrowia lipolytica, что обусловлено, с одной стороны, их отличием от хорошо изученных дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe в плане их филогенетической эволюции, физиологии и генетики (Barth and Gaillardin, 1996; 1997) и, с другой стороны, широким применением их в биотехнологии. Создан международный центр по координации исследований в данной области; международные конференции, посвященные изучению этих дрожжей, проводятся с 1995 г. каждые три года. Значительные успехи достигнуты в области молекулярной биологии и  генно-инженерной экспериментальной биологии Y. lipolytica; усилиями нескольких европейских научных коллективов к 2004 г. завершено изучение генома дрожжей, и составлена их генетическая карта (Dujon et al. 2004).

Российская группа, входящая в международный консорциум, на приоритетной основе проводит исследование уникальной особенности дрожжей Y. lipolytica синтезировать в значительных количествах органические кислоты, липиды и ферменты. Физиологические основы образования этих продуктов у Y. lipolytica изучены достаточно хорошо при использовании н-алканов в качестве источника углерода и энергии. Однако биохимические аспекты ассимиляции источников углерода (и особенно новых возобновляемых субстратов, таких как растительные масла и глицерин) и механизмы сверхсинтеза органических кислот на этих субстратах остаются малоизученными. Все энзиматические исследования по изучению процессов сверхсинтеза органических кислот - интермедиатов ЦТК - проводились на бесклеточных экстрактах дрожжей. Не были изучены физико-химические свойства ключевых ферментов, участвующих в ассимиляции субстратов и процессах сверхсинтеза, и механизмы их тонкой регуляции. Оставалось неизвестным влияние внутриклеточных концентраций метаболитов на регуляцию ферментов, обеспечивающих процесс сверхсинтеза  органических кислот. На момент начала работы еще не было доказанным, что в клетке ферменты одного метаболического пути функционируют не разрозненно, а взаимодействуют между собой и со структурными элементами клетки и создают надмолекулярные комплексы – метаболоны. Исследование ферментов, в условиях, максимально приближенных к тем, которые существуют внутри клетки, открывает новые перспективы в понимании механизмов регуляции метаболизма микроорганизмов.

Цель и задачи исследования. Целью данной  работы было изучение  структурно-функциональной организации путей ассимиляции триглицеридов и  глицерина у дрожжей Y. lipolytica и механизмов регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

  1. Изучение путей метаболизма триглицеридов растительных масел и  глицерина дрожжами Y. lipolytica.
  2. Исследование механизмов сверхсинтеза органических кислот дрожжами Y. lipolytica при различных физиологических условиях (в условиях лимитирования роста клеток тиамином или азотом) на разных субстратах.
  3. Выделение и характеристика ключевых ферментов метаболизма триглицеридов и  глицерина и сверхсинтеза органических кислот - липазы (КФ 3.1.1.3), глицеролкиназы (КФ 2.7.1.30), НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтазы (КФ 4.1.3.7).
  4. Изучение надмолекулярной организации ферментов ЦТК и механизмов  регуляции  у дрожжей. Создание новых представлений о механизмах сверхсинтеза органических кислот.

Научная новизна работы.  Впервые установлены пути метаболизма триглицеридов и продуктов их гидролиза у дрожжей Y. lipolytica. Первым этапом вовлечения триглицеридов в метаболизм является их гидролиз внеклеточными липазами. Продукты гидролиза триглицеридов - жирные кислоты и глицерин потребляются клетками одновременно. Показано, что вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы.

Ключевые ферменты ассимиляции метаболизма триглицеридов и глицерина – липаза (КФ 3.1.1.3) и глицеролкиназа (КФ 2.7.1.30) выделены, очищены  и охарактеризованы.

Изучены механизмы регуляции ключевых ферментов ЦТК, участвующих в процессах сверхсинтеза органических кислот. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтаза (КФ 4.1.3.7) из дрожжей Y. lipolytica выделены, очищены  и охарактеризованы. Исследованы механизмы регуляции этих ферментов интермедиатами ЦТК. Показано, что кинетические свойства цитратсинтазы Y. lipolytica в условиях in vitro и in situ существенно различаются. Фермент в условиях  in situ оказался значительно более устойчивым к ингибирующему воздействию цитрата и АТФ.

Установлены новые принципы метаболической организации дрожжей. Новизна предполагаемого подхода состоит в том, что ферменты одного метаболического пути впервые рассматриваются не в качестве отдельных функциональных единиц, а как элементы единого структурно-функционального комплекса. С использованием различных методологических подходов показано взаимодействие между двумя последовательными ферментами ЦТК  - цитратсинтазой и малатдегидрогеназой. Фермент-ферментный комплекс образует электростатический  субстратный канал для оксалоацетата.

Ферменты ЦТК способны связываться как между собой, так и с внутренней мембраной митохондрий, образуя надмолекулярные комплексы (метаболоны). Такая организация метаболического пути способствует 1) формированию субстратных каналов, при котором субстраты передаются от одного фермента к последующему без выхода в раствор; 2) созданию микроокружения, в котором концентрация субстратов существенно повышается и 3) эффективной и направленной регуляции клеточного метаболизма.

На примере пероксисомальной цитратсинтазы впервые показана важность третичной структуры  фермента для его функционирования в составе метаболона.

Практическая значимость работы. На основании изучения метаболической организации путей ассимиляции триглицеридов растительных масел и глицерина дрожжей Y. lipolytica созданы научные основы для разработки микробиологических способов получения пировиноградной и лимонной кислот. Процессы получения лимонной кислоты из рапсового масла и пировиноградной кислоты из глицерина были воспроизведены в полупромышленных масштабах на Опытно-технологической установке ИБФМ РАН.

Разработаны простые оригинальные методы очистки внеклеточной липазы, глицеролкиназы, цитратсинтазы и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы из Y. lipolytica. Глицеролкиназа может быть использована для определения глицерина в микробиологической и медицинской практике. Способ получения глицеролкиназы из дрожжей защищен авторским свидетельством № 1433980 (1988). Липаза из Y. lipolytica может применяться в технологических процессах получения ценных жирных кислот из отходов производства растительных масел, а также для замены каталитического метанолиза ферментативным при производстве биодизеля.

Материалы диссертационной работы используются в лекциях для профессорско-преподавательского состава ВУЗов РФ.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: на четырнадцатой  конференции "Транспорт и энергетика дрожжей" (Бонн, Германия, 1996), на третьей международной конференции по Y. lipolytica (Дрезден, Германия, 2002), на  первом и втором международных конгрессов федерации европейских микробиологов (Любляна, Словения, 2003 и Мадрид, Испания, 2006), на девятнадцатом международном симпозиуме, посвященном достижениям в микробной безопасности пищевых продуктов (Порторош, Словения, 2004), на втором греческом симпозиуме биотехнологов (Афины, Греция, 2005), на международных конференциях «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Минск-Раков, Беларусь, 2006, 2007), на ежегодных международных конференциях Института биотехнологии "Биохимия и биотехнология микроорганизмов – продуцентов органических кислот" (Авги-Салоники, Греция, 2006, 2007, 2008), а также на ежегодных Отчетных сессиях ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (1994-2008).

Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в 1985-2009 гг. в Лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН. На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования были поддержаны федеральной целевой научно-технической программой "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники на 2002-2006 гг.” (госконтракт № ИФ-15/02-2006), Российским фондом фундаментальных исследований, международным грантом CRDF RBO – 10305,  и договорами с ООО «Зеленые линии» и ООО «НТМ-ФАРМ».

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 54 печатные  работы, в том числе, 28 статьи (в их числе 3 обзора) из списка журналов ВАК, рекомендуемых для докторских диссертаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 329 страницах, содержит 44 таблицы и 51 рисунков. Список литературы включает 434  наименований, из них  330 –  публикации в иностранных изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В обзоре обсуждаются современные достижения в области изучения неконвенционных дрожжей Y. lipolytica, физиологические основы биосинтеза органических кислот – интермедиатов ЦТК, регуляция ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла у микроорганизмов, а также структурно-функциональная организация ферментов матрикса митохондрий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. Реактивы, используемые для приготовления минеральных сред, были аналитической чистоты («Реахим», СССР). В работе использовали коммерческие ферментные препараты и биохимические реактивы фирм «Roche» (Германия), «Sigma» (США), «P-L Biochemicals» (США), «Amersham», США), хроматографические материалы были получены от фирмы «Pharmacia» (Швеция).

Микроорганизмы. В работе использовали природные штаммы дрожжей Y. lipolytica из коллекции культур ИБФМ РАН и мутантные штаммы, полученные путем комбинированной обработки природного штамма Y. lipolytica 704 (ВКМ Y-2373) ультрафиолетовым облучением и N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ATCC 26108 (S288C) и бактерии Escherichia coli XL1-Blue, которые использовались для молекулярно-биологических исследований, были получены из коллекции Департамента биохимии Университета Далласа.

Методы культивирования. Дрожжи культивировали в колбах на качалке или в ферментере АНКУМ-2М (Россия) объемом 3 л (исходный объем среды 1,5 л) и объемом 10 л (исходный объем среды 5,0 л) общепринятыми методами в минерально-солевой среде Ридер. Источником углерода и энергии служили рапсовое и подсолнечное масла, глицерин, глюкоза, олеиновая кислота. В ряде случаев рост дрожжей лимитировали тиамином (в случае продукции кетокислот) или азотом (в случае продукции лимонных кислот).

Активность ферментов определяли на спектрофотометре UV-160 «Shimadzu» (Япония) в бесклеточных гомогенатах клеток, отобранных в разные фазы роста. Дезинтеграцию дрожжей проводили на планетарной мельнице с помощью «баллотини» или на прессе Френча. Методы измерения активности ферментов подробно изложены в диссертации. Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующего превращение одного мкмоль субстрата или образование одного мкмоль продукта в минуту (Ед.).

Очистку ферментов проводили с использованием носителей и колонок фирмы «Pharmacia» (Швеция). Молекулярную массу нативных препаратов ферментов определяли методом гель-фильтрации. Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц определяли электрофорезом в 10%-ном ПААГ в присутствии SDS по модифицированному методу Лэммли (Laemmli, 1970). Окрашивание препаратов белка проводилось Coomassie R-250.

Экстракция нуклеотидов. НАД и адениновые нуклеотиды экстрагировали кислотой, а НАДН щелочью. Для этого к 20 мл клеточной суспензии, отобранной непосредственно из ферментера, быстро добавляли по 7 мл 0,3 N HCl или 1 N NaOH. Суспензию инкубировали на водяной бане при 500 С в течение 10 мин при постоянном перемешивании, охлаждали и нейтрализовали до рН=7,0. Нейтрализованный экстракт центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин, и супернатант использовали для анализа нуклеотидов. Анализ адениннуклеотидов проводили люциферин-люциферазным методом на люминометре LKB 1261 (Швеция). АМФ и АДФ определяли после энзиматической конверсии в АТФ. Пиридиннуклеотиды определяли циклическим методом на спектрофотометре UV-160 «Shimadzu» (Япония).

Получение пермеабилизованых клеток. Пермеабилизацию Y. lipolytica проводили модифицированным методом Yoshina et al. (1979). 1 г (по сух. весу) клеток суспендировали в 4 мл 100 мМ калий-фосфатного буфера (pH=7,5), содержащего 40 мМ сорбитола. К суспензии клеток добавляли 15 мл толуола. Суспензия аккуратно перемешивалась при 37  0С в течение 5 мин и потом охлаждалась на льду. Клетки были собраны центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин, ресуспендированы и отмыты в 20 мМ какодилатном буфере (pH=7,1), содержащем 400 мМ сорбитола. Клетки, обработанные толуолом, суспендировали в вышеприведенном буфере в конечной концентрации 200 мг клеток/мл.

Связывание цитратсинтазы Y. lipolytica с внутренней мембраной митохондрий. Для выделения митохондрий клетки Y. lipolytica дважды промывали дистиллированной водой и суспендировали в среде, содержащей 0,9 М сахарозы, 20 мМ фосфатного буфера (pH=6,0), 1 мМ ЭДТА и 3% лиофилизированного желудочного сока виноградной улитки. Суспензию клеток инкубировали с перемешиванием при 29 0 С в течение 90 мин. Затем клетки дважды промывали средой того же состава без улиточного фермента и центрифугировали при 6000 g 20 мин. Отмытые клетки суспендировали в среде, содержащей 0,5 М манита, 10 мМ фосфатного буфера (pH=7,2), 0,5 мМ ЭДТА и 0,1 % БСА.

Суспензию клеток гомогенизировали при 14000 об./мин в течение 20 мин. Клетки центрифугировали при 3000 g 10 мин для удаления неразрушенных клеток и протопластов. Митохондрии осаждали при 7000 g 10 мин. Осадок митохондрий (10 мг/мл) хранили на льду.

Для удаления внешней мембраны и получения митопластов митохондрии обрабатывали 0,75% раствором дигитонина в течение 10 мин (Greenawalt, 1974). Cубмитохондриальные частицы (СМЧ) получали с помощью обработки митопластов ультразвуком (Hackenbrock and Hammon, 1975). Митопласты (50 мг по белку) суспендировали в 25 мл дистиллированной воды, центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин, ресуспендировали в 1 мл воды и обрабатывали ультразвуком (20 кГц/сек, 40 Ватт) на льду. Обработку повторяли 8 раз по 15 сек и последний раз - 30 сек. Полученный препарат центрифугировали (10000 g, 10 мин) для удаления больших “невывернутых”  везикул. СМЧ промывали 2 мМ HEPES буфером, рН=7,0 (буфер А) и собирали центрифугированием при 100 000 g в течение 1 ч.

Для электронного микроскопирования препараты мембран со связанными ферментами помещали на никелевые сетки.  После промывки буфером А с 2% альбумином, сетки инкубировали с первичными антителами для цитратсинтазы (30 мин, 4 0С), промывали и переносили в смесь  вторичных антител, коньюгированных с коллоидным золотом (Amersham, США), для мечения цитратсинтазы использовали частицы золота диаметром 15 нм. После инкубации (30 мин при 4 0C) и отмывки, препарат фиксировали в 2 % растворе глутарового альдегида, и сетки анализировали на электронном микроскопе  EM301 (Phillips, США).

Наличие субстратного канала оксалоацетата внутри комплекса ферментов цитрат-синтазы и малатдегидрогеназы было подтверждено с использованием 1) рекомбинантного дрожжевого белка цитрат-синтаза/малатдегидрогеназа и 2) коммерческих препаратов малатдегидрогеназы (митохондриальной и цитозольной) и цитратсинтазы фирмы Sigma методами Hummer-Dreyer хроматография и осаждением комплекса ферментов в полиэтиленгликоле (ПЭГ). Методы анализа подробно изложены в диссертации.

Метаболические эффекты дислокализации цитрат-синтазы определяли в клетках дрожжевых мутантов cit1 (cit1::LEU2) и cit1cit2 (cit1::LEU2 cit2::URA2), неспособных к росту на ацетате. Методы анализа подробно изложены в диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пути метаболизма глицерина и растительных масел у дрожжей Y. lipolytica. В настоящее время известно два основных пути метаболизма глицерина у дрожжей:

1) фосфорилирование  глицерина глицеролкиназой (КФ 2.7.1.30)  с образованием глицерол-3-фосфата и последующее дегидрирование до диоксиацетонфосфата ФАД-зависимой глицерол-3-фосфатдегидрогеназой (КФ1.1.99.5) и НАД-зависимой глицерол-3-фосфатдегидрогеназой (К.Ф. 1.1.1.8)  (фосфорилирующий путь);

2) окисление  глицерина глицеролдегидрогеназой (КФ 1.1.1.6) и фосфорилирование образовавшегося  диоксиацетона диоксиацетонкиназой (КФ 2.7.1.28) (окислительный путь).

Ранее фосфорилирование глицеролкиназой считалось единственным механизмом вовлечения глицерина в метаболизм дрожжей. Для ряда дрожжей описан окислительный путь, в котором глицерин окисляется до диоксиацетона, и последний фосфорилируется до диоксиацетонфосфата (May and Sloan, 1981).

Пути метаболизма глицерина у Y. lipolytica – продуцентов органических кислот  были изучены в сравнении с Candida valida (продуцентом цитохрома с). Результаты определения активности ферментов, катализирующих начальные этапы как фосфорилирующего, так и окислительного путей метаболизма глицерина, в бесклеточных экстрактах Y. lipolytica и C. valida представлены в табл. 1. Ферменты, катализирующие реакции окислительного пути НАД- и НАДФ-зависимая глицеролдегидрогеназа, диоксиацетонкиназа и глицерол-оксидаза не обнаружены в грубых экстрактах клеток Y. lipolytica. Высокие активности глицеролкиназы и НАД- и ФАД- глицерол-3-фосфатдегидрогеназ  и индуцибельный характер этих ферментов позволяет предположить, что у

Таблица 1.  Активности ферментов (моль/мин мг белка) метаболизма глицерина

Фермент

Y. lipolytica

C. valida

Глицерин

Глюкоза

Глицерин

Фосфорилирующий путь

Глицеролкиназа

0,105

0,047

0

Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (НАД+)

0,052

0,005

0

Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (ФАД+)

0,041

0,003

0

Окислительный путь

Глицеролдегидрогеназа (НАД+)

0

н.о.

0,300

Диоксиацетонкиназа

0

н.о.

0,081

Глицеролдегидрогеназа (НАДФ+)

0

н.о.

0

Глицеролоксидаза

0

н.о.

0

Y. lipolytica функционирует только фосфорилирующий путь метаболизма этого субстрата.

Функционирование глицеролдегидрогеназного пути метаболизма глицерина обнаружено у дрожжей C. valida. В экстрактах этих дрожжей обнаружены глицеролдегидрогеназа и диоксиацетонкиназа, а глицеролкиназа и глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы отсутствовали. Дрожжи C. valida обладают высокой активностью алкогольдегидрогеназы. Поскольку алкогольдегидрогеназа характеризуется широкой субстратной специфичностью, можно было бы предположить, что этот фермент катализирует НАД-зависимое окисление глицерина. Однако это предположение не подтвердилось.  С использованием гидрофобной хроматографии удалось четко разделить алкоголь- и глицеролдегидрогеназу. При этом алкогольдегидрогеназа не катализировала НАД-зависимое окисление глицерина, а глицеролдегидрогеназа, в свою очередь, не проявляла алкогольдегидрогеназной активности. Исходя из полученных результатов, можно полагать, что у дрожжей C. valida имеется фермент, специфичный для глицерина и катализирующий его окисление с НАД в качестве кофактора. НАДФ-зависимого окисления глицерина в экстракте изучаемых дрожжей не обнаружено, отсутствовала также и активность глицеролоксидазы.

Такие различия в путях метаболизма глицерина можно объяснить физиологическими особенностями исследуемых дрожжей: Y. lipolytica – строго аэробный организм, в то время как C. valida являются дрожжами бродильного типа. Побочным продуктом при брожении является глицерин. Образование глицерина происходит из-за избытка НАДН, появляющегося при ассимиляции сахара в биомассу (Hofmann, 1983). Глицеролдегидрогеназа способна катализировать реакцию восстановления диоксиацетона в глицерин при физиологических условиях. Следовательно, можно предположить, что у дрожжей, способных к брожению, в аэробных условиях глицероддегидрогеназа может отвечать за первый этап ассимиляции глицерина, а при анаэробной ферментации сахаров служить клапаном для сброса восстановительных эквивалентов, катализируя образование глицерина. Известно также, что дрожжи C. valida при росте на глюкозе в условиях дефицита фосфора способны накапливать в среде глицерин (Еремина, Финогенова, 1990), а Y. lipolytica экскретирует в среду не глицерин, а лимонную кислоту (Лозинов, 1974). Способность накапливать в среде глицерин у разных видов дрожжей может быть связана с наличием или отсутствием глицеролдегидрогеназы.

Для более детального изучения путей метаболизма глицерина у Y. lipolytica и выяснения механизмов его регуляции глицеролкиназа была выделена, очищена и охарактеризована.

Очистка и свойства глицеролкиназы. Для очистки глицеролкиназы из дрожжей Y. lipolytica была разработана оригинальная, высокоэффективная методика, на которую былао получено авторское свидетельство. Очистка состояла из трех стадий (табл. 2). На первой стадии прогреванием экстракта удаляются менее термостабильные белки. Глицеролкиназа является термостабильным ферментом и выдерживает нагревание до 60 оС в течение 10 мин практически без потери активности. В то же время, тепловая обработка позволила избавиться более чем от 50% всего количества балластных белков. После тепловой обработке препарат фермента подвергали дополнительной очистке с помощью ионно-обменной и гидрофобной хроматографии. В результате глицеролкиназа была очищена более чем в 300 раз с выходом 51% и имела удельную активность 17,8 мкмоль/мин на мг белка.

Изучение физико-химических и кинетических свойств глицеролкиназы дрожжей Y. lipolytica показало, что фермент имел молекулярную массу 200 кДа, проявлял максимальную активность при pH=10,0, являлся термостабильным, ингибировался 0,5 мМ АМФ на 50 % и, был нечувствителен к фруктозо-1,6-бисфосфату.

Субклеточная локализация ферментов метаболизма глицерина у

Y. lipolytica и физиологическая роль глицерол-3-фосфат-дегидрогеназ. Первый этап превращения глицерина – фосфорилирование – локализован в цитоплазме. Доказательством этого служит тот факт, что 93% активности глицеролкиназы обнаруживалось в растворимой фракции после дифференциального центрифугирования. Следующий этап ассимиляции глицерина – дегидрирование образовавшегося в глицеролкиназной реакции глицерол-3-фосфата – может катализироваться двумя различными

Таблица 2. Очистка глицеролкиназы Y. lipolytica

Стадия очистки

Общий белок (мг)

Общая активность (Ед.)

Удельная

активность

(мкмоль/мин

мг белка)

Выход

(%)

Степень очистки

Грубый экстракт

1320

77,9

0,059

100

1

Прогрев

510

77,5

0,152

99

2,6

ДЭАЭ-сефароза

32,4

48,6

1,5

62

25,4

Фенил-сефароза

2,3

40,9

17,8

51

301,3

оксидоредуктазами – ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой и НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой. ФАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа ассоциирована с фракцией мембранных органелл. Более 75% активности этого фермента при дифференциальном центрифугировании обнаружено во фракции частиц. При этих же условиях примерно 70% активности фумаразы, маркерного фермента митохондрий, определялось в той же фракции. Одинаковый характер распределения этих двух ферментов позволяет предположить, что они ассоциированы с одной субклеточной органеллой.

Более 55% НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы связано с фракцией частиц. Примерно также распределяются активности пероксисомальных ферментов (изоцитрат-лиазы и каталазы).

Теоретически можно предположить три метаболических функции для НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы: восстановление диокси- ацетонфосфата для биосинтеза триглицеридов, окисление глицерол-3-фосфата, образовавшегося при ассимиляции глицерина, и поддержание редокс-потенциала.

Литературные данные о метаболической роли глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы из различных источников немногочисленны и противоречивы. Участие в поддержании редокс-состояния предполагается для фермента из мышц курицы (Wait, Kaplan, 1972) и дрожжей, ассимилирующих н-алканы (Kawamoto et al. 1979); катаболическая роль – для ферментов из Escherichia coli (Kito, Pizer, 1968), печени курицы (Harding, 1975) и Neurospora crassa (Courtright, 1975). Биосинтетическая роль обсуждалась для ферментов из Saccharomyces cerevisiae (Hofmann, 1983) и E. coli (Kito, Pizer, 1968).

Десятикратное увеличение активности НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы наблюдалось в клетках Y. lipolytica, при росте на глицерине, по сравнению с клетками, выращенными на глюкозе (табл. 1). Казалось бы, что основная роль данного фермента в клетках заключается в дегидрировании глицерол-3-фосфата, образующегося в глицеролкиназной реакции. С другой стороны, японские исследователи предположили, что НАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа вовлечена в глицерол-3-фосфат-диоксиацетонфосфат-челночную систему, функционирующую в алкан-утилизирующих дрожжах. Данная система служит для транспорта восстановительных эквивалентов, образующихся в пероксисомах во время -окисления жирных кислот (Kawamoto et al., 1979).

Дрожжи Y. lipolytica, Trichosporon candida и Candida maltosa были выращены на глицерине и гексадекане, и в бесклеточных экстрактах дрожжей определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина. Активности этих же ферментов были определены у C. utilis,  не способных  ассимилировать н-алканы, и  у  метанольных  дрожжей C. boidinii, выращенных на глицерине. Также были определены активности ферментов начальных этапов ассимиляции гексадекана. Результаты представлены в табл. 3. Активность НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы в клетках дрожжей, выращенных на гексадекане, значительно выше,  чем на глицерине.

Таблица 3. Активности ферментов (моль/мин на мг белка) метаболизма глицерина и н-алканов у дрожжевых организмов

Фермент

Y. lipolytica

T. candida

C. maltosa

C. utilis

C.boidinii

глице-рин

гекса-декан

глице-рин

гекса-декан

глице-рин

гекса-декан

глицерин

гексадекан

Глицеролкиназа

0,105

0,021

0,121

0,065

0,095

0,029

0,172

0,073

Глицерол-3-Ф-дегидрогеназа (НАД+)

0,052

0,208

0,045

0,275

0,044

0,137

0

0

Глицерол-3-Ф-дегидрогеназа (ФАД+)

0,041

0,040

0,049

0,063

0,032

0,052

0,048

0,027

Цитохром Р-450

0,012

0,045

0,015

0,039

0,010

0,051

0

0

Оксидаза высших жирных спиртов

0,015

0,080

0,044

0,120

0,035

0,153

0

0

Дегидрогеназа высших альдегидов

0,034

0,096

0,075

0,180

0,064

0,179

н.о.

н.о.

Ацил-КоА-оксидаза

0,023

0,109

0,056

0,115

0,045

0,120

н.о.

н.о.

Изоцитрат-лиаза

0,030

0,089

0,039

0,123

0,042

0,122

н.о.

н.о.

н.о. – не определя

У дрожжей, не ассимилирующих н-алканы, этот фермент вообще не обнаружен. Активности ферментов, участвующих в метаболизме н-алканов (цитохром Р-450, оксидаза высших спиртов, дегидрогеназы высших альдегидов, ацил-КоА-оксидаза, изоцитрат-лиаза), у всех исследованных дрожжей были выше при росте на гексадекане. В тоже время активность ключевого фермента ассимиляции глицерина – глицеролкиназы – выше в клетках дрожжей, выращенных на глицерине. Активность ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы при выращивании дрожжей на глицерине и гексадекане изменялась незначительно. Эти результаты дают возможность предположить, что основная физиологическая роль НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы связана не с ассимиляцией глицерина, а с метаболизмом н-алканов. В окислении глицерол-3-фосфата, образующегося в глицеролкиназной реакции, основную роль, по-видимому, играет ФАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа.

Таким образом, у Y. lipolytica (рис. 1) вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацеионфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы.

       

Рис. 1. Окисление глицерина у Y. lipolyticа (1 - глицеролкиназа, 2 - глицерол-3-Ф-дегидрогеназа (ФАД), 3 – глицерол-3-Ф- дегидрогеназа (НАД), 4 – триозофосфат-изомераза).

Особенности ассимиляции триглицеридов растительных масел и продуктов их гидролиза у Y. lipolytica. Начальным этапом ассимиляции триглицеридов у дрожжей является их гидролиз с образованием глицерина и жирных кислот:

Гидролиз осуществляется внеклеточными липазами (Fickers et al., 2005). До настоящего времени не были определены механизмы ассимиляции продуктов гидролиза. Предполагалось, что могут быть реализованы два механизма потребления этих субстратов: одновременное потребление глицерина и жирных кислот или последовательное потребление вначале одного, потом другого метаболита (т.е. диауксия).

При выращивании дрожжей Y. lipolytica  в среде с рапсовым маслом в качестве единственного источника углерода, показано, что при потреблении масла на протяжении всего процесса культивирования содержание глицерина в среде сохранялось на одном уровне (0,059 – 0,125 г/л). В процессе культивирования не менялся также и качественный состав внеклеточных липидов (три-, ди-, моноглицеридов) и свободных жирных кислот в среде. Исходя из полученных результатов высказано предположение, что потребление глицерина и жирных кислот у Y. lipolytica происходит одновременно.

Дополнительным доводом в пользу этого предположения явилось сравнительное изучение активности ферментов в разные фазы роста Y. lipolytica на подсолнечном масле, глицерине и олеиновой кислоте (табл. 4). При ассимиляции масла с первых часов культивирования (6 ч) наблюдается индукция ключевого фермента метаболизма глицерина – глицеролкиназы, активность которой на 30% снижена в сравнении с активностью фермента у клеток, растущих на глицерине, но существенно выше активности фермента у клеток, растущих на олеиновой кислоте. Также у дрожжей при росте на масле с первых часов индуцировались и ферменты глиоксилатного цикла – изоцитрат-лиаза и малат-синтаза, участвующие в метаболизме жирных кислот. В клетках, растущих на олеиновой кислоте, активность изоцитрат-лиазы в 14,7 и малат-синтазы в 10 раз выше в сравнении с клетками, растущими на глицерине. В последующие часы культивирования (12 ч и 24 ч) активность глицеролкиназы у дрожжей при росте на масле поддерживалась на постоянно высоком уровне, что, по-видимому, связано с активным потреблением глицерина, непрерывно образуемого в ходе всего процесса ассимиляции масла.

Таблица 4. Активности ферментов (мкмоль/мин мг белка) ЦТК и глиоксилатного цикла  при росте Y. lipolytica на различных С-источниках

Источник углерода

Время (ч)

ГК

ЦТК

ГЦ

ЦС

АК

НАД-ИДГ

НАДФ-ИДГ

ИЛ

МС

Масло

6

0,254

2,04

0,92

0,06

0,058

0,089

0,054

12

0,254

2,44

1,02

0,06

0,068

0,109

0,064

24

0,254

1,96

0,87

0,058

0,068

0,093

0,035

Глицерин

6

0,363

0,82

0,33

0,105

0,120

0,009

0,012

12

0,360

0,90

0,43

0,115

0,132

0,009

0,014

24

0,300

0,84

0,42

0,117

0,152

0,01

0,010

Олеат

6

0,112

1,70

0,53

0,1

0,07

0,133

0,1

12

0,112

1,90

0,53

0,1

0,06

0,134

0,13

24

0,112

1,90

0,52

0,1

0,07

0,144

0,12

ГЦ – глиоксилатный цикл, ГК – глицеролкиназа, ЦС – цитрат-синтаза, АК – аконит-гидратаза, НАД-ИДГ – НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа, НАДФ-ИДГ – НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа, ИЛ – изоцитрат-лиаза, МЛ – малат-синтаза

Также активности изоцитрат-лиазы и малат-синтазы сохранялись на высоком уровне, что, обусловлено активным потреблением образуемых жирных кислот в ходе всего процесса.

Однако необходимо отметить, что одновременное потребление из среды двух субстратов не является типичным для микроорганизмов.  Традиционно считается, что микроорганизмы при росте на двух и более субстратах используют преимущественно углеводы, в сравнении с другими источниками углерода. Этот феномен, известный как катаболитная репрессия, позволяет микроорганизмам более эффективно использовать углеродные субстраты, присутствующие в среде. Модели, описывающие молекулярные механизмы катаболитной репрессии были разработаны для E. coli. Дрожжи S. cerevisiae также являются объектами изучения катаболитной репрессии (Gancedo, 1992; Entian and Shuller, 1997). Данный феномен у дрожжей Y. lipolytica не изучен.

Для Y. lipolytica  обнаружено, что при выращивании на среде, содержащей смесь двух субстратов (глицерин + олеиновая кислота) в течение всего процесса культивирования происходило одновременное потребление из среды и глицерина, и олеиновой кислоты. Ферменты глицеролкиназа, малат-синтаза и изоцитрат-лиаза индуцировались с первых часов роста и их активности сохранялись  высокими в течение всего культивирования.

Вместе с тем, на среде, содержащей одновременно глюкозу и олеиновую кислоту, в первые 12 ч роста наблюдалось потребление глюкозы, а уровень олеиновой кислоты практически не изменялся. После потребления глюкозы из среды начиналась ассимиляция олеиновой кислоты, сопровождающаяся резким приростом биомассы. Показано, что  первые часы роста активности изоцитрат-лиазы и малат-синтазы были очень низкими, т.е. ферменты репрессировались высокими концентрациями глюкозы в среде. Индукция ферментов, вовлеченных в метаболизм жирных кислот, отмечалась только после 12 ч роста, когда содержание глюкозы в среде снижалось до 2,5 г/л.

Дрожжевая изоцитрат-лиаза рассматривается как конститутивный фермент, подвергающийся катаболитной репрессии (Whitworth and Ratledge, 1975; Evans and Ratledge, 1985; Ermakova et al. 1986; Kubicek et al. 1988). Известно, что фосфоенолпируват является ингибитором изоцитрат-лиазы у ряда бактерий, грибов и водорослей, и значение Ki для этого соединения очень низкое – 0,13 – 0,20 мМ (Entian and Shuller, 1997; Holdsworth et al. 1988; Barth and Scheuber, 1993). Еще одним ингибитором изоцитрат-лиазы является пируват, значение Ki для этого соединения у С. guilliermondii равно 0,8 мМ, а у C. tropicalis – 0,5 мМ (Gancedo, 1992).

При выращивании Y. lipolytica на среде, содержащей глюкозу и гексадекан, также наблюдается двухфазность роста: в первые 14 ч роста происходило потребление глюкозы и  содержание гексадекана в среде не изменялось; после 14 ч следовал 4,5 ч лаг-период, когда не происходило потребления азота и гексадекана и далее с 18 ч культивирования накопление биомассы происходило только за счет потребления гексадекана. Как и в случае со средой, содержащей глюкозу и олеиновую кислоту, в первые часы роста активности изоцитрат-лиазы и малат-синтазы были низкими. Индукция ферментов отмечалась только после 14 ч роста культуры, и оставалась высокой на протяжении всего процесса культивирования. Можно заключить, что глюкоза или продукты ее окисления у Y. lipolytica репрессируют ферменты, ответственные за метаболизм других источников углерода, в то время как глицерин является нерепрессирующим субстратом.

Очистка и свойства липазы у Y. lipolytica. Таксономическим признаком Y. lipolytica является липолитическая активность (Lodder et al. 1972). Еще в 80-е годы в работах Института микробиологии РАН было выдвинуто предположение, что липаза дрожжей Candida lipolytica структурно связана с клеточной стенкой (Звягинцева, 1972; Рубан с соавт. 1976). В литературе обсуждается способность дрожжей продуцировать различные типы липаз и зависимость их продукции от состава среды и условий культивирования (Ota et al. 1982; Pereira-Meireles et al. 1997; Pereira-Meireles and Rocha Leao, 2000).

Для отбора продуцента липазы предварительно был проведен скрининг среди 29 штаммов Y. lipolytica в чашках с агаризованной средой Lodder (1952), содержащей говяжий жир и в среде Ридер с рапсовым маслом. Y.  lipolytica 704 отобран в качестве активного продуцента липазы с активностью 2760 Ед./мл (табл. 5). Кроме того, продуцент липазы характеризовался высокой кислотообразующей активностью, содержание лимонной кислоты на 6 сутки при культивировании в колбах составляло 12,7 г/л.

Установлено, что такие факторы, как фаза роста, pH среды, аэрация, концентрация масла, состав питательной среды оказывают существенное влияние на экскрецию липазы. Подобраны условия, обеспечивающие максимальную реализацию липазы в культуральную жидкость: источник углерода – рапсовое или подсолнечное масло, источник азота – смесь  пептона (3%) и  сульфата аммония (3%), оптимум pH=5,5-6,5, низкая аэрация среды (концентрация кислорода в среде 15-20% насыщения).

Таблица 5. Активность липазы и образование лимонных кислот у дрожжей Y. lipolytica

Штаммы

Липаза

ЛК

(г/л)

Штаммы

Липаза

ЛК

(г/л)

Метод А

Метод Б

Метод А

Метод Б

Y. lipolytica 47

++++

1956

3,1

Y. lipolytica 681

++

180

н.о.

Y. lipolyticaN15

++++

1836

10,0

Y. lipolytica 682

++++

840

5,1

Y .lipolytica 212

+++

600

2,7

Y. lipolytica 683

++++

1200

4,0

Y .lipolytica 217

+++

600

2,9

Y. lipolytica 694

+++

1200

2,8

Y. lipolytica 374

+++

396

2,5

Y .lipolytica 695

+++

396

1,7

Y. lipolytica 607

+++

900

3,8

Y.lipolytica 696

++

264

н.о.

Y .lipolytica 645

++++

756

2,9

Y. lipolytica 702

+++

396

3,8

Y. lipolytica 646

+

264

н.о.

Y. lipolytica 704

++++++

2760

12,7

Y. lipolytica 655

++

288

н.о.

Y. lipolytica 706

++++

798

4,1

Y. lipolytica 666

+

222

н.о.

Y. lipolytica 709

++++

420

4,1

Y. lipolytica 667

+++

516

2,7

Y. lipolytica 710

++++

840

5,3

Y. lipolytica 668

+++

798

4,0

Y. lipolytica 711

+++

600

5,1

Y. lipolytica 672

++++

120

н.о.

Y. lipolytica 716

+++

810

4,4

Y. lipolytica 674

++++

1680

3,2

Метод А – Липолитическую активность оценивали по зонам помутнения среды, связанным с появлением нерастворимых кальциевых солей жирных кислот, образуемых в ходе гидролиза жира. Метод Б – Активность липазы (Ед./мл) определяли титрометрическим методом у дрожжей при культивировании в жидкой среде Ридер с рапсовым маслом (20 г/л) в качестве источника углерода и энергии.

Метод очистки липазы состоит из трех стадий. Внеклеточная липаза из Y. lipolytica 704, при культивировании в среде с подсолнечным маслом была очищена за три стадии (табл. 6). На первой стадии в связи с отсутствием фермента в фильтрате культуральной жидкости клетки подвергали солюбилизации 0,2%-ным раствором Triton X-100 или обрабатывали ультразвуком.

На следующей стадии экстракт фракционировали сульфатом аммония (80% от насыщения). Полученный после высаливания осадок растворяли в  50 мМ калий-фосфатном буфере (pH=7,5) и наносили на колонку с фенил-сефарозой. Элюцию липазы проводили в градиете сульфата аммония (1 – 0 М). Фракции, содержащие активность фермента, объединяли и концентрировали на

Таблица 6. Очистка липазы из Y. lipolytica

Стадия очистки

Общий белок (мг)

Общая активность (Ед)

Активность

(мкмоль/

мин мг белка)

Выход

(%)

Степень очистки

Грубый экстракт + УЗ

25,0

4580,0

183,20

100

1

Осаждение (NH4)2SO4

6,6

1634,61

247,67

35,69

3,79

Фенил-сефароза

1,5

2025,0

1350,00

44,21

16,7

диализной ячейке. В результате внеклеточная липаза была очищена более чем в 16,7 раз с выходом 44,21 % и имела удельную активность 1350 моль/мин мг белка. Очищенная липаза была гомогенна при ультрацентрифугировании и электрофорезе.

Свойства липазы. Липаза из Y. lipolytica имела молекулярную массу порядка 38 кДа. Молекулярная масса липазы других штаммов Y. lipolytica составляет 32-39 кДа (Ota et al. 1982; Pereira-Meireles et al. 1997). Оптимум рН=8,0, стабильность препарата сохраняется в диапазоне рН=6,0-9,0. Фермент выдерживает инкубацию при 500 в течение 10 мин. Активность липазы ингибировалась ионами тяжелых металлов и активировалась ионами  Mn2+, Mg2+ и Ca2+.

2. Механизмы сверхсинтеза органических кислот у Y. lipolytica

Биосинтез кетокислот дрожжами Y. lipolytica при росте на глицерине и глюкозе. Определяющим условием сверхсинтеза кетокислот является лимитирование роста дрожжей тиамином при одновременном избыточном содержании в среде источников углерода, азота и других биогенных элементов (Ермакова, 1971; Лозинов, Финогенова, 1972).

17 штаммов дрожжей, относящихся к роду Candida были проверены на образование кетокислот при росте в среде с глицерином или глюкозой. Большинство из исследуемых дрожжей были способны синтезировать пировиноградную кислоту (ПВК) и -кетоглутаровую кислоту (КГК) как в среде с глицерином, так и в среде с глюкозой. При этом как абсолютное количество накапливаемых в среде кетокислот, так и их соотношение было различным. Для дальнейших исследований как наиболее активные кислотообразователи выбраны штаммы Y. lipolytica 374/4.

Дрожжи Y. lipolytica выращивали в среде с различными лимитирующими концентрациями тиамина. В качестве источника углерода использовали глюкозу или глицерин (рис. 2). Накопление биомассы на обоих субстратах было пропорционально количеству внесенного в среду тиамина, причем и на глюкозе и на глицерине этот прирост был практически одинаков. Однако при этом наблюдались различия в экскреции кетокислот. В среде с глюкозой при повышении концентрации тиамина в пределах исследуемых концентраций повышался выход КГК, в то время как выход пирувата падал. При концентрациях тиамина в среде 1-2,5 мкг/л накапливалась преимущественно ПВК, а при концентрациях 3-5 мкг/л соотношение менялось в пользу КГК. В среде с глицерином при всех исследованных концентрациях тиамина наблюдался преимущественный синтез ПВК, хотя соотношение пируват/2-оксоглутарат менялось в зависимости от концентрации тиамина.

Биосинтетическая активность Y. lipolytica была проверена в ферментере при концентрации тиамина в среде 8 мкг/л, которая обеспечивает накопление 10 г/л биомассы. Накопление кетокислот начинается в фазе замедленного роста и интенсивно продолжается в стационарной фазе. Как на глицерине, так и на глюкозе наблюдается преимущественный синтез ПВК, и на 78 ч в среде с

Рис. 2. Влияние концентрации тиамина в среде на кислотообразование у Y. lipolytica 374/4.

- Биомасса, - ПВК, – КГК

глицерином отмечалось накопление 61,3 г/л ПВК и 10 г/л КГК, а в среде с глюкозой -  41 г/л ПВК и 8 г/л КГК (рис. 3).

Для изучения путей биосинтеза кетокислот были определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина и глюкозы, ЦТК и анаплеротических путей. Клетки отбирались в фазу экспоненциального роста (нет кислот), в фазу замедленного роста (начало синтеза кислот) и в стационарную фазу (в период активного синтеза кетокислот) (табл. 7, 8).

Рис. 3. Сверхсинтез кетокислот у Y. lipolytica 374/4 в условиях дефицита тиамина (культивирование в ферментере). - Биомасса, - ПВК, - КГК

Как было отмечено выше, фосфорилирование глицерина до глицерол-3-фосфата с участием глицеролкиназы является единственным путем вовлечения глицерина в метаболизм у Y. lipolytica. Как видно из табл. 7, активность глицеролкиназы не изменяется в фазе замедления роста, когда начинается синтез кетокислот, и остается на высоком уровне в стационарной фазе. Активность НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы снижается в 2 раза в условиях дефицита тиамина и синтеза кетокислот. В то же время активность ФАД-зависимого фермента возрастает вдвое при замедлении роста культуры, что подтверждает предположение о ключевой роли данного фермента в окислении глицерол-3-фосфата. Активности ключевых ферментов, участвующих в превращении диоксиацетонфосфатата в пируват, – глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и пируваткиназы – при дефиците тиамина сохраняются на уровне, близком к таковому в период экспоненциального роста.

Таблица 7. Активность ферментов (моль/мин мг белка) путей метаболизма глицерина у

Y. lipolytica

ФЕРМЕНТЫ

Экспоненциальная

фаза

Фаза замедления роста

Стационарная фаза

I. Начальные этапы ассимиляции глицерина:

Глицеролкиназа

0,105

0,095

0,130

Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (НАД+)

0,052

0,026

0,023

Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (ФАД+)

0,041

0,085

0,082

II. Гликолиз

6-фосфофруктокиназа

0,07

0,06

0,05

Фруктозо-бис-фосфатальдолаза

0,105

0,105

0,100

Триозофосфатизомераза

0,200

0,170

0,165

Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа

0,120

0,098

0,130

Пируваткиназа

0,350

0,300

0,280

Пируватдегидрогеназа

0,120

0,06

0,03

0,120

0,10

0,09

III. ЦТК

Цитратсинтаза

0,9

0,885

0,825

Изоцитратдегидрогеназа (НАД+)

0,115

0,152

0,195

Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ+)

0,152

0,250

0,255

2-оксоглутаратдегидрогеназа

0,110

0,024

0,016

0,110

0,11

0,042

Малатдегидрогеназа

2,00

2,125

2,55

1V. Анаплеротические пути

Малатсинтетаза

0,014

0,012

0,016

Изоцитратлиаза

0,009

0,022

0,012

Пируваткарбоксилаза

0,014

0,028

0,053

Пируватдекарбоксилаза

0,008

0,013

0,0112

Жирным шрифтом приведены  активности ферментов, измеренные при внесении в реакционную смесь  тиаминпирофосфата.

Активность пируватдегидрогеназного комплекса снижается от 0,12 мкмоль/мин мг белка в экспоненциальной фазе до 0,06 мкмоль/мин мг белка в фазе замедления роста и 0,03 мкмоль/мин мг белка в стационарной фазе. При этом необходимо отметить, что синтез апофермента в условиях дефицита тиамина в клетке идет с высокой скоростью – активность пируватдегидрогеназы, измеренная при внесении в реакционную смесь пирофосфата, хотя и несколько ниже активности, обнаруживаемой при экспоненциальном росте, но значительно более высока, чем в отсутствии тиаминового кофактора. Активность ключевого фермента ЦТК цитратсинтазы незначительно снижается при переходе клеток в стадию синтеза кислот, а активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы даже несколько увеличивается. Наблюдается увеличение активности и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы. Высокой на всем протяжении культивирования остается активность малатдегидрогеназы. Дефицит тиамина вызывал резкое снижение активности 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (от 0,11 мкмоль/мин мг белка в экспоненциальной фазе до 0,016 мкмоль/мин мг белка при синтезе кетокислот). При добавлении в реакционную смесь тиаминпирофосфата активность 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса увеличивается незначительно (до 0,042 мкмоль/мин мг белка). Причиной этого может быть нарушение биосинтеза фермента, вызванное дефицитом тиамина, или протеолитическое расщепление фермента в отсутствии кофактора.

Окисление глюкозы протекало по механизму гликолиза и пентозофосфатного пути. Для A. niger показано, что пентозофосфатный путь доминирует над гликолизом в фазу роста (Rohr et al. 1987; Legisa and Kidric, 1989). Для Y. lipolytica характерны и  высокие активности гликолитических ферментов (гексокиназы, 6-фосфофруктокиназы, фруктозобисфосфат-альдолазы и пируваткиназы), и высокие активности ферментов пентозофосфатного пути (глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, фосфоглюконатдегидрогеназы и транскетолазы) в фазу роста (табл. 8). При недостатке тиамина в фазе замедления роста активность гексокиназы сохранялась на уровне активности в ростовой фазе и снижалась на 30% в стационарной фазе роста, активность 6-фосфофруктокиназы увеличивалась в 2 раза и удерживалась на этом уровне. Активность фруктозобисфосфат-альдолазы увеличивалась в 2 раза в фазе замедления роста культуры и достигала значения контроля в стационарной фазе роста. Активность пируваткиназы не изменялась в фазе замедления роста и уменьшалась в два раза в стационарной фазе роста, продолжая оставаться на высоком уровне. При дефиците тиамина постепенно снижалась активность глюкозо-6-фосфат- дегидрогеназы, достигая в стационарной фазе роста 50% от контроля. Активность фосфоглюконатдегидрогеназы практически не изменялась.

Активность тиаминового фермента – транскетолазы, резко снижалась, и в клетках стационарной фазы составляла только 10% от исходной.

Таблица 8. Активность ферментов (моль/мин мг белка) метаболизма глюкозы у Y. lipolytica

ФЕРМЕНТЫ

Экспоненциальная

фаза

Фаза замедления роста

Стационарная фаза

I. Пентозофосфатный путь:

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа

0,412

0,346

0,246

Фосфоглюконатдегидрогеназа

0,447

0,408

0,402

Транскетолаза

0,427

0,060

0,044

0,430

0,070

0,072

II. Гликолиз

Гексокиназа

0,359

0,334

0,224

6-фосфофруктокиназа

0,072

0,145

0,154

Фруктозобисфосфатальдолаза

0,058

0,099

0,055

Пируваткиназа

0,1

0,1

0,12

Пируватдегидрогеназа

0,151

0,158

0,083

0,151

0,110

0,076

III. ЦТК

Цитрат-синтаза

0,71

0,631

1,3

Изоцитратдегидрогеназа (НАД)

0,110

0,142

0,257

Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ)

0,136

0,142

0,360

2-оксоглутаратдегидрогеназа

0,110

0,042

0,010

0,110

0,042

0,012

Малатдегидрогеназа

2,500

4,70

7,000

1V. Анаплеротические пути

Малатсинтетаза

0,020

0,018

0,011

Изоцитратлиаза

0,014

0,016

0,014

Пируваткарбоксилаза

0,067

0,081

0,080

Пируватдекарбоксилаза

0,032

0,036

0,031

Жирным шрифтом приведены  активности ферментов, измеренные при внесении в реакционную смесь  тиаминпирофосфата.

Превращение пирувата в ацетил-КоА  осуществлялось двумя путями. С одной стороны, пируват декарбоксилировался до ацетил-КоА  при участии пируватдегидрогеназного комплекса, а с другой стороны, пируват декарбоксилировался до ацетальдегида пируватдекарбоксилазой, и ацетальдегид окислялся до ацетата альдегид-дегидрогеназой. Ацетил-КоА-синтетаза катализировала образование Ацетил-КоА из КоА и ацетата.

Удельная активность пируватдегидрогеназного комплекса в фазу роста составляла 0,151 мкмоль/мин мг белка, сохранялась на этом уровне в фазе замедления роста культуры и уменьшалась в 2 раза в стационарной фазе. Активности пируватдекарбоксилазы, альдегид-дегидрогеназы и ацетил-КоА-синтазы в экстрактах были значительно ниже активности пируватдегидрогеназного комплекса, но сохранялись на том же уровне в процессе синтеза кислот. В клетках стационарной фазы роста активности ферментов ЦТК - цитрат-синтазы, аконитазы, НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ и малатдегидрогеназы - увеличивались в 2-3 раза, по сравнению с экспоненциальной фазой роста. Недостаток тиамина вызывал резкое уменьшение активности 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса. Активность этого фермента практически не обнаруживалась в стационарной фазе роста. В экстрактах Y. lipolytica довольно высокой была активность пируваткарбоксилазы, которая несколько увеличивалась в условиях недостатка тиамина и синтеза кислот.

Полученные результаты позволяют предположить следующий механизм биосинтеза кетокислот (рис. 4). При лимитировании роста дрожжей тиамином происходит нарушение метаболического потока через тиамин-зависимые ферменты главных путей катаболизма глюкозы и глицерина. Блокирование пируватдегидрогеназного комплекса делает реакцию окислительного декарбоксилирования пирувата узким звеном метаболизма и приводит к экскреции пирувата. Однако, полного блокирования пируватдегидрогеназного комплекса не происходит, и реакция образования ацетил-КоА продолжает функционировать, хотя и с меньшей скоростью, обеспечивая синтез 2-оксоглутарата в ЦТК. Образовавшийся 2-оксоглутарат не окисляется в дальнейших реакциях ЦТК из-за повреждения 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, вызванного дефицитом тиамина. Результатом разомкнутости цикла на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы является экскреции в среду кетоглутарата.

Из-за нарущения метаболического потока на уровне трех ферментов, на наш взгляд, клетки испытывают недостаток в восстановительных эквивалентах, что сказывается на работе дыхательной цепи. То есть создается эффект “голодания” по углероду (состояние II по Чансу) (Мецлер, 1980). Для поддержания жизнедеятельности в этих условиях клетки вынуждены активизировать начальные этапы катаболизма глюкозы или глицерина, чтобы получить как можно больший выход энергии именно на этих этапах.  Об этом свидетельствуют данные об увеличении активности ряда ферментов первичного окисления глюкозы или глицерина и начальных этапов ЦТК при переходе клеток в фазу активного синтеза кетокислот.

Ресинтез оксалоацетата в этих условиях, вероятно, осуществляется посредством функционирования пируваткарбоксилазной реакции. Определение активности пируват- и ФЭП-карбоксилаз в клетках Y. lipolytica 704 в период роста на глюкозе показало, что ФЭП-карбоксилаза отсутствует, образование оксалоацетата путем гетеротрофной фиксации СО2 осуществляется только вследствие функционирования пируваткарбоксилазы. Активность этого фермента имеет определенную связь с активностью другого анаплеротического пути – глиоксилатного цикла.  Участие глиоксилатного цикла в этих процессах практически исключается, т.к. активность изоцитрат-лиазы была низкой. 

Рассмотренные выше данные позволяют сделать следующее заключение. Тиамин-ауксотрофные дрожжи Y. lipolytica являются перспективными продуцентами органических кислот – КГК и ПВК. Сверхсинтез кетокислот является результатом возникающего дисбаланса между продолжающимся в клетке активным катаболизмом источника углерода и резким падением активности пируватдегидрогеназы и 2-оксоглутаратдегидрогеназы, вызванным дефицитом доступного кофермента – тиаминдифосфата.

Биосинтез лимонной кислоты на разных источниках углерода. Ранее в работах сотрудников ИБФМ РАН показано, что условием сверхсинтеза лимонной кислоты (ЛК) является лимитирование роста дрожжей минеральными компонентами среды – азотом, фосфором, серой или магнием при одновременном содержании в среде избыточного количества источника углерода (Глазунова, 1977; Илларионова, 1977; Финогенова, 1982). Процесс образования ЛК является трехфазным процессом: в первой фазе происходит активный рост культуры и потребление лимитирующего компонента среды, в это время кислоты практически не образуются. Интенсивный синтез кислот начинается после cнижения содержания азота ниже порогового уровня (100 мг/л) и перехода культуры в фазу замедленного роста и далее – в стационарную фазу роста. Синтез кислот продолжается до тех пор, пока в среде присутствует источник углерода, и клетки продуцента остаются жизнеспособными и достаточно активными. Последнее определяется условиями культивирования: pH среды, температурой, аэрацией среды кислородом, составом макро- и микроэлементов. Из-за ауксотрофности Y. lipolytica по пиримидиновому компоненту молекулы тиамина в среду культивирования необходимо вводить избыточные количества тиамина (Мунтян, 1971).

Сравнительными опытами нами показана зависимость биосинтеза ЛК непосредственно от потребляемого источника углерода. Природный штамм Y. lipolytica 704 выращивали в идентичных условиях на средах с разными источниками углерода (этанол, подсолнечное масло, глюкоза и глицерин). Сводные данные представлены в табл. 9. Соотношение продуцируемых кислот ЛК и ее изоформы – трео-Ds-изолимонной кислоты (ИЛК) определяется потреблением С-источника: в средах с подсолнечным маслом и этанолом образуются примерно равные количества ЛК и ИЛК (соотношение ЛК:ИЛК = 1,1:1 – 1,24:1), в то время как в среде с глюкозой и глицерином накапливается преимущественно ЛК (соотношение ЛК:ИЛК = 4,9:1 – 7,7:1 для глицерина и глюкозы, соответственно).

Анализ активности ключевых ферментов биосинтеза ЛК и ее дальнейшего превращения представлен в табл. 10. При росте на всех источниках углерода активность цитратсинтазы значительно превышала активности последующих ферментов цикла: аконитатгидратазы, НАД-изоцитратдегидрогеназы, НАДФ-изоцитратдегидрогеназы. Очень высокая по сравнению с другими ферментами активность цитратсинтазы, по-видимому,

Таблица 9. Кислотообразование природного штамма Y. lipolytica 704 на разных источниках углерода

Источник углерода

Биомасса (г/л)

ЛК

(г/л)

ИЛК

(г/л)

Соотношение ЛК:ИЛК

Этанол

10,0

42,0

40,0

1,1:1

Подсолнечное масло

12,4

68,0

55,0

1,24:1

Глицерин

9,3

68,0

14,0

4,9:1

Глюкоза

9,6

56,9

7,4

7,7:1

Таблица 10. Активность ферментов (мкмоль/мин мг белка) у Y. lipolytica при росте  в среде с различными С-источниками в условиях лимитирования роста азотом

Ферменты

Глюкоза

Глицерин

Этанол

Масло

Рост

Синтез

Рост

Синтез

Рост

Синтез

Рост

Синтез

Цитратсинтаза

0,71

0,62

0,82

0,8

1,24

1,7

2,04

2,7

Аконитат-гидратаза

0,39

0,28

0,33

0,26

0,7

0,6

0,92

0,8

Изоцитратдегидрогеназа (НАД)

0,110

0,17

0,105

0,12

0,09

0,1

0,06

0,05

Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ)

0,250

0,26

0,12

0,125

0,3

0,3

0,06

0,05

Кетоглутаратдегидрогеназа

0,04

0,05

0,07

0,08

0,12

0,12

0,06

0,06

Малатдегидрогеназа

2,5

3,5

2,0

2,8

2,1

2,1

3,7

3,8

Изоцитратлиаза

0,028

0,028

0,009

0,01

0,098

0,1

0,089

0,12

Малатсинтаза

0,024

0,024

0,012

0,014

0,078

0,14

0,054

0,1

Пируваткарбоксилаза

0,067

0,12

0,047

0,049

0,05

0,05

0,07

0,1

может быть объяснена следующим: в экспоненциальной фазе роста избыточная активность цитратсинтазы компенсируется потребностями клеток в ацетил-КоА для биосинтетических целей. Когда же в условиях дефицита азота процессы биосинтеза снижаются, то процесс расщепления цитрата также тормозится и он экскретируется из клетки, т.к. не может быть полностью метаболизирован в ЦТК из-за сравнительно низких активностей последующих ферментов.  На всех субстратах активность -кетоглутаратдегидрогеназы резко понижена по сравнению с активностью предшествующих ферментов, что, очевидно, вызвано тем, что -кетоглутарат частично идет на биосинтез глютамата и для дегидрирования той его части, которая подвергается дальнейшему метаболизму в ЦТК, требуется гораздо меньшее количество фермента.

При росте Y. lipolytica на глюкозе и глицерине активно функционирует пируваткарбоксилаза. При ассимиляции этанола и подсолнечного масла анаплеротический ресинтез оксалоацетата осуществляется благодаря функционированию глиоксилатного цикла. На масле также обнаружена более высокая в сравнении с “глюкозными” и “глицериновыми” клетками активность цитратсинтазы. Увеличение активности цитратсинтазы при ассимиляции масла, очевидно, связано с дополнительным участием цитратсинтазной реакции в глиоксилатном цикле.

Соотношение накапливаемых кислот (ЛК и ИЛК) определяется, по-видимому, соотношением активностей ферментов цитратсинтазы, аконитат-гидратазы, НАД-изоцитратдегидрогеназы и изоцитрат-лиазы. Повышение активности цитратсинтазы и понижение активности аконитат-гидратазы в дрожжевой клетке приводит к преимущественному накоплению ЛК, в то время как высокая активность аконитатгидратазы при одновременно низкой активности изоцитратдегидрогеназы приводит к экскреции как ЛК, так и ИЛК. Изоцитрат-лиаза в период преимущественного сверхсинтеза ЛК должна быть высокой и обеспечивать ресинтез оксалоацетата. Роль аконитат-гидратазы и изоцитрат-лиазы в образовании лимонных кислот обсуждалась и в работах других исследователей (Akiyma et al. 1973; Matsuoka et al. 1980; Финогенова, 1982). Если наше представление относительно роли аконитат-гидратазы и изоцитрат-лиазы в синтезе кислот справедливо, то, создавая мутантные штаммы с подавленной активностью аконитат-гидратазы, но в то же время высокой активностью изоцитрат-лиазы, можно добиться преимущественного синтеза ЛК.

При комбинированном воздействии ультрафиолетового облучения и N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидина на клетки природного штамма Y. lipolytica 704 были получены 1500 колоний, из которых на селективных средах с цитратом (ослаблен рост), сукцинатом (есть рост) и малатом (есть рост) селекционированы мутанты, среди которых мутант N 15 с высокой активностью цитратсинтазы и низкой активностью аконитат-гидратазы. У мутанта изоцитрат-лиаза на всех субстратах была высокой и не репрессировалась глюкозой. Мутант изменял соотношение лимонных кислот в сторону преимущественного накопления ЛК на всех субстратах (табл. 11).

Таким образом, соотношения активностей основных ферментов ЦТК строго закономерны и определяются интенсивностью функционирования связанных с ним метаболических путей (в частности, глиоксилатного цикла) и скоростью использования интермедиатов цикла в анаболических реакциях. Регуляция соотношений активностей ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла происходит, по-видимому, главным образом, путем контроля синтеза ферментов и зависит от природы С-источника.

Исследование внутриклеточного содержания АТФ, АДФ, АМФ, НАД+ и НАДН в условиях лимитирования роста клеток азотом и сверхсинтеза ЛК показало, что в фазе активного роста дрожжей происходит резкое снижение содержания адениновых нуклеотидов и  НАД+ (табл. 12).        Содержание НАДН изменяется незначительно в течение всего процесса культивирования. Аналогичное снижение содержания адениновых нуклеотидов в период экспоненциального роста наблюдалось и в грибах Neorospora crassa (Slayman, 1973).

Таблица 11. Кислотообразование мутантного штамма Y. lipolytica 704 на разных источниках углерода

Источник углерода

Мутант N 15

Биомасса (г/л)

ЛК

(г/л)

ИЛК

(г/л)

Соотношение ЛК:ИЛК

Этанол

10,0

85,0

11

7,7:1

Подсолнечное масло

11,6

108,0

3,4

32:1

Глицерин

9,4

80,0

7,5

10,7:1

Глюкоза

9,9

66,0

5

13,2:1

Таблица 12. Концентрация нуклеотидов у Y. lipolytica в условиях лимитирования роста источником азота

Время культивирования (час)

Внутриклеточная концентрация нуклеотидов (мМ)

АТФ

АДФ

АМФ

НАДН

НАД

6

1,85

6,2

3,92

3,88

22,02

19

0,85

1,33

0,96

2,32

9,38

27

0,62

1,02

0,33

1,1

4,76

32

1,86

4,42

40

3,15

3,77

Дрожжи выращивали в минеральной среде Ридер, в качестве источника углерода использовали глюкозу (20 г/л). Расчет концентраций проводился на основе полученных результатов и литературных данных по содержанию внутриклеточной воды у дрожжей, согласно которым 1 мг сухого веса клеток соответствует 4 мкл воды (Botcham and Ratledge, 1979).

Снижение уровня АТФ может быть обусловлено тем, что активный рост клеток требует повышенных энергетических затрат на биосинтетические цели. Снижение уровней АТФ и АМФ может быть объяснено либо отставанием скорости синтеза этих соединений от скорости роста и деления клеток, либо наличием регуляторного механизма, направленного на поддержание энергетического гомеостаза клетки. Снижение уровня НАД+ по мере перехода культуры в фазу замедленного роста может быть обусловлено снижением окислительной активности клеток. Переход дрожжей в фазу замедленного роста, вызванный исчерпанием азота из среды культивирования, связан с замедлением биосинтетических процессов, а дальнейший выход в стационарную фазу – с их полной остановкой. Изменения в содержании адениновых нуклеотидов в период синтеза ЛК приводят к резкому увеличению соотношения АТФ/АМФ, которое играет важную регуляторную роль в клетках микроорганизмов (Atkinson, 1977; Knowles, 1977).

Очистка и свойства НАД+-зависимой изоцитратдегидрогеназы. Разработанная нами процедура очистки НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦДГ) состояла из четырех стадий. Как видно из табл. 13, после первых двух стадий удалось избавиться от значительного количества балластных белков (общий белок снизился более чем в 18 раз при 67% выходе НАД-ИЦДГ). В процессе  гидрофобной хроматографии НАД-ИЦДГ связывалась с октил-сефарозой при концентрации сульфата аммония 2 М. После промывки колонки и выхода несвязавшихся белков, фермент элюировали 1 М раствором сульфата аммония. На заключительном этапе фермент очищали с помощью гель-фильтрации на колонке с сефарозой-CL4B. В результате НАД-ИЦДГ была очищена в 129 раз с выходом 31%; гомогенный препарат фермента имел удельную активность 22 мкмоль/мин мг белка.

Свойства ИДГ. Молекулярный вес порядка  400 кДа. Фермент состоит из 8 идентичных по молекулярной массе. Октамерами являются и НАД-ИЦДГ из пекарских дрожжей (Barnes et al. 1972) и дрожжей Rhodosporidium toruloides (Evans, Ratledge, 1985).

Таблица 13. Очистка НАД+-зависимой изоцитратдегидрогеназы из Y. lipolytica

Стадия очистки

Общий белок (мг)

Общая активность (Е)

Удельная

активность

(моль/мин мг белка)

Выход

(%)

Бесклеточный  экстракт

760

129,2

0,17

100

Высаливание (NH4)2SO4

248

104,16

0,42

81

Осаждение кислотой

40,5

86,27

2,13

67

Октил-сефароза

12,3

62,12

5,05

48

Гель-фильтрация

1,82

40,05

22

31

Максимальную активность в 100 мМ калий-фосфатном буфере НАД-ИЦДГ проявляла при pH=7,2 -7,6. В глициновом буфере (100 мМ) pH-оптимум был сдвинут в щелочную область (8,5 – 9,0). Фермент термолабилен. При прогревании НАД-ИЦДГ в течение 10 мин при температуре выше 300 С происходила быстрая инактивация.

Для выявления возможных регуляторов НАД-ИЦДГ было проверено влияние ряда метаболитов на активность фермента. Ключевые интермедиаты ЦТК (оксалоацетат 10 мМ, цитрат 10 мМ, сукцинат 10 мМ, фумарат 10 мМ, малат 10 мМ, глиоксилат 10 мМ, 2-оксоглутарат 10 мМ, глутамат 10 мМ) оказывали слабое влияние на активность НАД-ИЦДГ. Примечательно отсутствие ингибирования фермента 2-оксоглутаратом.

Отсутствие ингибирования фермента промежуточными метаболитами выявило необходимость детального изучения регуляции НАД-ИЦДГ нуклеотидами, пулы которых, по нашим данным, претерпевают существенное изменение при культивировании Y. lipolytica в условиях сверхсинтеза органических кислот. Для изучения влияния нуклеотидов определяли кинетические параметры фермента. Расчет производился с помощью компьютерной программы.

Для определения параметров фермента по отношению к НАД+ измеряли активность фермента в зависимости от концентрации НАД+. Все остальные компоненты брались в избытке. Расчет производился по уравнению Хилла. Константа Михаэлиса для НАД+ составила 136 мкМ. Коэффициента Хилла равен 1,06, что говорит об отсутствии кооперативности при связывании субстрата реакции НАД+ с ферментом.

При определении кинетических параметров НАД-ИЦДГ по отношению ко второму субстрату – изоцитрату, необходимо учитывать возможное влияние АМФ на его связывание с ферментом. Корнбергом и Прайсом установлено, что НАД-ИЦДГ дрожжей обнаруживает абсолютную потребность в АМФ (Kornberg and Pricer, 1959). Дальнейшие исследования показали, что НАД-ИЦДГ содержит аллостерический центр для связывания АМФ и взаимодействие АМФ с этим центром повышает сродство фермента к изоцитрату (Evans and Ratledge, 1985; Gabriel and Plaut, 1990).

Нами было проведено измерение активности фермента в зависимости от концентрации изоцитрата при отсутствии и наличии АМФ (1 мМ и 0,025 мМ) в реакционной среде (рис. 5). Расчет производился по уравнению Уэбба, в котором заложена возможность анализа влияния эффектора на связывание субстрата с ферментом.

Константа Михаэлиса для изоцитрата в отсутствии АМФ равна 581 мкМ. АМФ усиливает сродство фермента к изоцитрату, не влияя на Vmax. НАД-ИЦДГ обладает низким сродством к эффектору АМФ (Kа = 995 мкМ). По нашему мнению, в условиях сверхсинтеза лимонных кислот, когда пул АМФ существенно снижается, это факт имеет принципиальное значение. Однако, необходимо учитывать полученные данные об отсутствии влияния АМФ на фермент при концентрациях изоцитрата более 1 мМ. Коэффициент Хилла для изоцитрата и АМФ равен 4,164 и 1,991, соответственно, что свидетельствует о высокой кооперативности при связывании изоцитрата и АМФ с ферментом.

Согласно литературным данным, сильным ингибитором НАД-ИЦДГ дрожжей (даже при насыщающих концентрациях АМФ и изоцитрата) является АТФ (Evans and Ratledge, 1985). При исследовании, проведенном ранее на частично очищенном ферменте из Y. lipolytica также было показано ингибирующее действие АТФ на НАД-ИЦДГ (Соколов с соавт. 1995). Однако в этой работе использовались концентрации АТФ (до 10 мМ), которые значительно превосходят физиологические концентрации АТФ (табл. 12), рассчитанные нами на основе экспериментальных данных для клеток Y. lipolytica. В наших исследованиях  сравнение кинетических параметров фермента в двух экспериментах (без АТФ и с добавлением АТФ) выявило отсутствие ингибирующего воздействия АТФ. Ингибирование не наблюдалось и в эксперименте по изучению зависимости активности НАД-ИЦДГ от концентрации АМФ при разных концентрациях АТФ. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что регуляция НАД-ИЦДГ у Y. lipolytica осуществляется in vivo не соотношением АТФ/АМФ, а уровнем АМФ в клетке.

В проводимых ранее исследованиях с дрожжами показано, что НАДН является важным регулятором активности НАД-ИЦДГ (Evans and Ratledge, 1985; Соколов с соавт. 1995). Ингибирование происходит из-за снижения скорости диссоциации комплекса фермент-НАДН что в свою очередь определяется соотношением НАД/НАДН в клетке. В случае с Y. lipolytica показано также, что НАДН является сильным ингибитором. Он уменьшает сродство фермента к НАД+, действуя как конкурентный ингибитор. Константа связывания для НАДН равна 63 мкМ, т.е. фермент обладает большим сродством к конечному продукту реакции, нежели к субстрату. На основании этого, очевидно, что регуляция НАД-ИЦДГ в клетках дрожжей может осуществляться изменением соотношения НАДН/НАД+. Увеличение этого соотношения  in vitro приводило к полному ингибированию фермента. 

Очистка и свойства цитратсинтазы. Метод очистки цитратсинтазы состоит из трех стадий: высаливания сульфатом аммония, гидрофобной и ионообменной хроматографии, процедура суммирована в табл. 14. На стадии высаливания происходит освобождение от значительного количества белка. Отмечено снижение содержания общего белка в 7 раз, выход фермента составляет 77%. В ходе гидрофобной хроматографии, где в качестве носителя использовалась октил-сефароза, основная часть балластного белка сходила острым пиком, когда элюция велась 0,5 М сульфатом аммония в 0,1 М калий-фосфатном буфере. Цитратсинтаза элюировалась 0,1 М калий-фосфатным буфером. Выход фермента после этой стадии составил 28%. Значительная очистка фермента достигалась на стадии ионообменной хроматографии. Используя ДЭАЭ-сефарозу в качестве носителя, удалось увеличить удельную активность цитрат-синтазы с 26,3 до 161,2 мкмоль/мин на 1 мг белка. Согласно литературным данным удельная активность цитратсинтазы, которую удалось достичь в ходе очистки цитратсинтазы из липидных дрожжей Candida 107 (Boulton and Ratledge, 1980), составляет 22,3 Ед./мг белка, выход – 56%, степень очистки 34. Сходная с полученной нами удельная активность очищенного фермента из пекарских дрожжей – 160 Ед./мг белка, при этом выход составляет 5,7% (Parvin and Atkinson, 1968).

Свойства цитратсинтазы. Выделенная нами цитратсинтаза имеет молекулярную массу порядка 70 кДа и состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой порядка 40 кДа. Сходную молекулярную массу имеет фермент из Penicillium spiculisporum (Mahlen, 1972). Молекулярная масса цитратсинтазы из Aspergillus niger  равна 80 кДа (Kubicek and Rohr, 1978).

Исследование термостабильных свойств цитратсинтазы показало, что фермент выдерживает инкубацию при 50 0С в течение 10 мин, сохраняя 90%

Таблица 14. Очистка цитратсинтазы из дрожжей Y. lipolytica

Стадии очистки

Объем

(мл)

Общий белок (мг)

Белок (мг/мл)

Активность

Выход

(%)

Степень очистки

удельная

(Ед./мг белка)

общая

(Ед.)

Грубый экстракт

200

2000

10

2,8

5600

100

1

Высаливание

(55-90%)

50

300

6

14,3

4290

77

5

Гидрофобная

хроматография

600

60

0,1

26,3

1578

28

9

Ионообменная хроматография

90

9

0,1

161,2

1451

26

57

активности, прогрев до 60 0С и более ведет практически к полной потере активности. Цитратсинтаза более активна при щелочных значениях pH. Максимальную активность фермент проявляет при pH=8,5. Такой же оптимум pH для фермента из A. niger  (Kubicek and Rohr, 1978). Цитратсинтаза из липидных дрожжей Candida 107 (Boulton and Ratledge, 1980) и из E. coli (Weitzman, 1969) максимально активна при pH = 8,0. Для цитратсинтазы из пекарских дрожжей отмечается широкий диапазон pH=7,0 – 8,0 (Parvin and Atkinson, 1968; Weitzman and Danson, 1976), в котором фермент проявляет высокую активность, со слабым максимумом при pH=7,5. Цитратсинтаза Y. lipolytica, как и фермент из других источников, обладает большим сродством к ЩУК, чем к ацетил-КоА (Km для ЩУК равна 5 мкМ, для ацетил-КоА – 10 мкМ). Несмотря на то, что, согласно Вейтзман и Дансон (Weitzman and Danson, 1976) у дрожжей не наблюдается ингибирования цитратсинтазы никотинамидными нуклеотидами, мы показали ингибирование фермента из Y. lipolytica  1 мМ НАДН на 10% и 1 мМ НАДФН на 45%. Также как и у традиционных продуцентов ЛК A. niger (Kubicek et al. 1995) АТФ ингибирует цитратсинтазу Y. lipolytica, а цитрат в концентрации 10-15 мМ ингибирует активность очищенного фермента на 50% и в концентрации 50 мМ – на 80%.

Биохимический механизм сверхсинтеза органических кислот у Y. lipolytica. Очевидно, что для процесса синтеза лимонных кислот из глюкозы важно обеспечение высокой концентрации глюкозы и создание потока углерода через гликолиз (рис. 6). Одна из ключевых реакций гликолиза катализируется 6-фосфофруктокиназой (ФФК) (К.Ф. 4.1.2.13). ФФК является ключевым регуляторным ферментом гликолиза практически у всех организмов, включая дрожжи (Salas et al. 1965), и увеличение концентрации цитрата по механизму отрицательной обратной связи ингибирует активность ФФК и, в целом, снижает скорость трансформации субстрата через гликолиз.

Проведенное нами исследование регуляторных свойств частично очищенной ФФК у Y. lipolytica – продуцентов лимонных кислот в сравнении с C. maltosa (дрожжами-непродуцентами) показало, что ФФК у Y. lipolytica была менее чувствительна к ингибированию цитратом по сравнению с дрожжами-непродуцентами. Подобная устойчивость ФФК к действию цитрата не отмечалась ни для традиционных продуцентов лимонных кислот A. niger, ни для липидных дрожжей (у которых цитрат является предшественником в биосинтезе липидов) (Habison et al. 1983; Evans and Ratledge, 1984). Ионы NH4+ (10 мМ) существенно повышали активность ФФК у  Y. lipolytica (в 3 раза) и эффективно противодействовали ингибирующему действию цитрата. АТФ в концентрации 5 мМ не оказывал ингибирующего действия на активность ФФК, однако при совместном действии с цитратом ингибирующий эффект высоких концентраций АТФ резко возрастал.

Однако понимание механизма синтеза ЛК у Y. lipolytica не может быть полностью сведено только к нерегулируемости ФФК цитратом. Факт активного синтеза лимонных кислот при росте на этаноле, н-алканах и маслах (исключающих участие ФФК) свидетельствует как раз о том, что механизм

сверхсинтеза лимонных кислот не может быть сведен только к особой регулируемости одного из ферментов гликолиза.

На основании полученных данных может быть предложен следующий механизм сверхсинтеза органических кислот у Y. lipolytica. В условиях лимитирования роста источником азота изменяется энергетическое состояние клеток - резко снижается уровень АМФ, АДФ и НАД, в результате чего происходит возрастание соотношений АТФ/АМФ и НАДН/НАД+, что приводит к накоплению в этих условиях энергетических и восстановительных эквивалентов. Такая ситуация, в первую очередь, приводит в блокировке ЦТК на уровне НАД-ИЦДГ. Первоначальным фактором, определяющим снижение активности этого фермента выступает падение содержания АМФ, который является аллостерическим активатором этого фермента и к которому НАД-ИЦДГ имеет низкое сродство. В условиях накопления изоцитрата этот эффект может нивелироваться. Однако в результате происходящего далее повышения соотношения НАДН/НАД+ происходит усиление ингибирования фермента. В результате этого образуются избыточные количества изоцитрата и, через аконитазное равновесие,цитрата и выделение этих метаболитов из клетки.

Напротив, в условиях лимитирования роста дрожжей тиамином клетки находятся в состоянии низкой обеспеченности энергетическими и восстановительными эквивалентами. НАД-ИЦДГ активна вследствие высокого содержания в клетках АМФ и низкого соотношения НАДН/НАД+, а также отсутствия ингибирующего воздействия 2-оксоглутарата. Блокирование метаболического потока осуществляется на уровне тиаминзависимых ферментов: 2-оксоглутаратдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы. Поэтому в среду культивирования выделяются пируват и 2-оксоглутарат.

3. Надмолекулярная организация ЦТК

После разрушения эукариотических клеток и последующего дифференциального центрифугирования ферменты обнаруживаются как в различных фракциях осадка, так  и в надосадочной жидкости. Надосадочная жидкость содержит так называемые "растворимые" ферменты, т.е. ферменты, которые могут быть  экстрагированы водными растворами в виде отдельных единиц, сохраняющих каталитическую активность. Относительная легкость выделения и кристаллизации сделала эти белки популярными объектами исследований, и большая часть наших сведений о структуре и функциях ферментов получена именно при изучении растворимых ферментов. 

Согласно современным представлениям, ферменты ЦТК внутри нативных митохондрий способны связываться между собой и с поверхностью мембран, образуя высокоорганизованные комплексы (Srere, 1985). Для обозначения комплексов, объединяющих ферменты одного метаболического пути, П. Шрере предложил термин метаболон (Srere, 1985; Robinson and Srere, 1985). Организация ферментов в метаболоны дает клетке некоторые  кинетические преимущества  в  сравнении с системой со свободными ферментами (Welch, 1977; Spivey, Merz, 1989). Одно из возможных преимуществ состоит в том, что непосредственная близость ферментов, ответственных за последовательные шаги метаболического пути, предотвращает выход интермедиата в раствор, где он может быть использован другими ферментами в других метаболических последовательностях.

Изучение регуляции цитратсинтазы Y. lipolytica в условиях in situ. Как показано в предыдущих разделах, дрожжи Y. lipolytica в условиях лимитированного роста могут накапливать в среде 100 г/л ЛК и более. Активный транспорт для цитрата у Y. lipolytica не обнаружен (Кулаковская с соавт., 1993; 1994). Если же цитрат транспортируется из клетки способом простой или облегченной диффузии, то в условиях сверхсинтеза внутриклеточная концентрация цитрата может достигать значительных величин. Это может ингибировать активности ферментов, участвующих в синтезе цитрата. В частности, нами показано, что цитрат в концентрации 10 - 15 мМ ингибирует активность очищенной цитратсинтазы (ЦС) на 50%, а в концентрации 50 мМ – на 80%. Если бы внутри клетки концентрация цитрата была такой же, как в среде культивирования, ЦС проявляла бы лишь небольшую часть от максимальной активности. В таких условиях эффективный синтез цитрата вряд ли был бы возможен. Также нами было показано ингибирование очищенного препарата ЦС из Y. lipolytica АТФ.

Очевидно, что внутри клетки существуют определенные защитные механизмы, предохраняющие ферменты от ингибирующего действия высоких концентраций метаболитов. Было сделано предположение о том, что внутриклеточное микроокружение ЦС делает ее менее чувствительной к ингибирующему влиянию интермедиатов ЦТК. Для проверки этого предположения было проведено сравнительное изучение кинетических свойств ЦС в условиях in vitro и in situ (с пермеабилизованными клетками).

Показано, что ЦС пермеабилизованных клеток менее чувствительна к ингибирующему влиянию цитрата и АТФ, по сравнению с ферментом в бесклеточном экстракте. В условиях in situ цитрат в концентрации 300 мМ ингибировал ЦС только на 50 % , в то время как в условиях in vitro цитрат в концентрации 50 мМ ингибировал ЦС на 80 %. Ингибирующий эффект АТФ на ЦС пермеабилизованных клеток был также менее выражен.

Подобные эффекты не могли быть объяснены изменениями кинетических свойств ЦС в условиях in situ. Км для ацетил-КоА очищенной ЦС и фермента в пермеабилизованных клетках составляла 5 и 7 мкмоль соответственно; Км для оксалоацетата в условиях in situ была в 4 раза выше, чем в очищенном препарате и составляла 40 мкмоль. Следовательно, в клетке возможно существование структурно-физиологической организации ферментов ЦТК по типу метаболона.

Связывание цитратсинтазы с внутренней мембраной митохондрий.

В данном разделе работы нами продемонстрирована способность ЦС, выделенной из Y. lipolytica, связываться с внутренней мембраной митохондрий этих дрожжей. Сорбция ЦС из раствора на “вывернутые” субмитохондриальные частицы СМЧ и митопласты оценивалась посредством измерения активности ЦС в указанных препаратах. После инкубации мембран с раствором ЦС, 61% ЦС  осаждалось  с препаратом СМЧ. Связывание фермента с СМЧ является специфичным, так как ЦС не взаимодействовала с интактными митопластами, т.е. с внешней стороной внутренней мембраны. На специфичность связывания ЦС с СМЧ указывало и то, что оно практически не изменялось с увеличением ионной силы и pH среды.

Кроме физико-химических подходов, для демонстрации связывания ЦС с СМЧ был использован иммунноцитохимический метод (рис. 7). СМЧ последовательно обрабатывали в растворе ЦС, в растворе первичных антител и вторичных антител, меченных коллоидным золотом. Метка коллоидного золота обнаруживалась на мембранах СМЧ, предварительно инкубированных с ЦС. В качестве контроля препараты мембран, не обработанные ЦС, инкубировали с антителами; на этих препаратах частицы коллоидного золота не обнаруживались.

Таким образом, полученные результаты показывают, что ЦС внутри митохондрий может находится не в свободной форме в растворе, а способна связываться с внутренней мембраной, сохраняя при этом свою специфическую активность.

Рис.7. Связывание ЦС с внутренней мембраной митохондрий.

А- схема мечения ЦС антителами с частицами коллоидного золота

Б – электронная микроскопия СМЧ с метками коллоидного золота

Фермент-ферментные взаимодействия между цитратсинтазой и малатдегидрогеназой в полиэтиленгликоле. Необходимо отметить, что существует ряд методологических проблем в демонстрации фермент-ферментных взаимодействий. Большинство этих взаимодействий очень слабо, и это часто приводит к разрушению метаболонов во время изоляции комплекса при  сильном разбавлении или изменениях в ионной силе буфера.

Целью данного раздела работы являлось изучение возможности образования комплекса между митохондриальными  ферментами ЦС и малат-дегидрогеназы (МДГ) в присутствии неионного детергента – полиэтиленгликоля (ПЭГ). Использование растворов неионных полимеров, таких как ПЭГ,  моделирует условия  митохондриального матрикса.  Для регистрации фермент-ферментного взаимодействия между ЦС и митохондриальным или цитоплазматическим изоферментами МДГ (мМДГ или цМДГ, соответственно) применяли метод фронтальной равновесной гель-фильтрации в ПЭГ. Колонка  Superdex S-200 была уравновешена 10 мM калий фосфатным буфером (pH=8,0), содержащим 10 % ПЭГ. На колонку наносили мМДГ, объем фронтальной элюции мМДГ составлял 15 мл (рис. 8). Затем колонку уравновешивали с тем же буфером, содержащим 0,2 мг/мл ЦС.  На колонке, уравновешенной ЦС, объем фронтальной элюции мМДГ понижался до 5 мл. То есть мМДГ элюировалась в объеме, соответствующем белку с большей молекулярной массой, чем молекулярная масса свободного фермента. Это позволяло предположить образование комплексов между молекулами ЦС и мМДГ. Аналогичные эксперименты были проведены с цМДГ, комплексов между ЦС и цМДГ не образовывалось, цМДГ элюировались в одном и том же

объеме вне зависимости от отсутствия или присутствия ЦС на колонке. Таким образом, снижение объема фронтальной элюции мМДГ в присутствие ЦС демонстрирует специфическое взаимодействие между мМДГ и ЦС. Необходимо отметить, что ферменты, по-видимому, формируют комплексы, состоящие из нескольких молекул. Объем элюции мМДГ в присутствие ЦС был меньше, чем объем элюции калибровочного белка с наибольшей молекулярной массой – тироглобулина (М.м.=669 кДа). 

Также было проведено изучение комплексов ЦС/МДГ в ПЭГ, образцы комплексов ЦС/МДГ (с концентрациями белков 2 мг/мл) инкубировали в средах с различными концентрациями ПЭГ (0-30%) и ионной силы (10 мМ KH2PO4 или 200 мМ KH2PO4) в течение 2 мин. После этого диссоциацию комплекса ЦС/МДГ оценивали как уменьшение плотности суспенции при 650 нм (рис. 9). Следует отметить, что комплексы ЦС/МДГ быстро диссоциируют при инкубации без добавления ПЭГ (ОП при 650 нм быстро понижается). Однако, когда твердо-фазную суспензию ЦС/МДГ инкубировали в присутствии 30% ПЭГ при низкой ионной силе (10 мМ KH2PO4) изменения в мутности суспензии не было обнаружено. Увеличение в ионной силе (200 мМ KH2PO4) при 30% ПЭГ вызывало диссоциацию комплекса ЦС/мМДГ.

Чтобы показать кинетические преимущества комплекса ЦС/МДГ,  ассоциированного в ПЭГ, мы использовали два фермента - “ловушки” – аспартат-аминотрансферазу (ААТ) и оксалоацетат-декарбоксилазу (OAДК). Общим субстратом для этих ферментов является оксалоацетат (ОАА), следовательно в сопряженных реакциях ААТ и ОАДК могут конкурировать за субстрат с ЦС.

Рис. 9. Влияние концентрации ПЭГ и ионной силы на диссоциацию комплексов между ЦС и мМДГ (А) и ЦС и цМДГ (В).

Схема конкурентных взаимоотношений МДГ/ЦС, ААТ и OAДК за ОАА представлена на схеме:

Концентрации ферментов – 0,2 Ед./мл ЦС, 0,4 Ед./мл мМДГ или цМДГ и 10 Ед./мл ААТ или OAДК. Начальная скорость сопряженной реакции в 20% ПЭГе была в 4 раза меньще по сравнению с реакционной смесью без ПЭГ (контроль). Концентрация ПЭГ, изоформы МДГ (мМДГ или цМДГ) и ионная сила показывали  различное кинетическое поведение сопряженных систем ЦС/мМДГ и ЦС/цМДГ с ААТ. В случае реакционной смеси без ПЭГ (т.е. когда не образуется фермент-ферментного комплекса МДГ/ЦС), скорость сопряженной реакции (т.е. образование коэнзима А), была снижена до 26 - 28%  от контроля в присутствии ААТ, что демонстрировало хорошее улавливание ОАА ферментом-ловушкой. В 30% ПЭГ, скорость сопряженной реакции снижалась только на  40% в присутствии ААТ для комплекса  ЦС/мМДГ, и только - на 78 % в комплексе ЦС/цМДГ (рис. 10).

Рис. 10. Влияние ААТ и ОАДК на сопряженную

реакцию, катализируемую  мМДГ или цМДГ.

Увеличение ионной силы (добавлением KН2PO4 до концентрации 200 мM) приводило к 3-х кратному снижению скорости сопряженной реакции с ААТ  в комплексе ЦС/мМДГ. При высокой ионной силе ОАА, образованный в маладегидрогеназной реакции, не передавался на активный центр ЦС, а выходил в раствор и превращался в реакции с ААТ. Это могло свидетельствовать о том, что субстратный канал для ОАА внутри комплекса ЦС/мМДГ имеет электростатическую природу. Подобные результаты были получены и с другим ферментом - “ловушкой” – OAДК.

Можно было предположить, что причина снижения чувствительности ЦС/мМДГ к ферментам – “ловушкам” заключается в том, что диффузия OAA из ферментных комплексов в ПЭГ затруднена. Однако мы показали, что твердо-фазный комплекс ЦС/цМДГ проявляет такую же чувствительность к AAT и ОАДК, как и свободные ферменты. Поэтому можно сделать вывод, что внутри комплекса, образуемого ЦС и мМДГ существует специфический субстратный канал, по которому ОАА передается с активного центра одного фермента на активный центр другого без выхода в раствор. Это может предоставлять клетке кинетические преимущества, так как субстрат одного метаболического пути не может быт захвачен ферментами другого пути и выведен из метаболического потока.

Субстратный канал для ОАА внутри слитого белка ЦС-МДГ. Возможность существования субстратного канала для ОАА между ЦС и МДГ была подтверждена нами при изучении слитого белка, содержащего два дрожжевых митохондриальных фермента ЦС и МДГ.

Был сконструирован рекомбинантный белок (рис. 11), в котором С-конец ЦС был слит с N-концом МДГ. Полученная плазмида pODC29/ЦС1/МДГ1 кодировала последовательность из шести гистидиновых остатков СS1, линкер (Gly-Ser-Gly) и MDH1. Для наработки фьюжн-протеина вектор pODC29/ЦС1/МДГ1 был трансформирован в E. coli BL21/DE3.

Рекомбинантный белок ЦС/МДГ был очищен с помощью  хроматографии на никель-агарозе и последующей гель-фильтрации.  Удельные активности в очищенном препарате составляли  71 мкмоль/мин мг белка для ЦС и 910 мкмоль/мин мг белка для МДГ.

Наличие пространственной близости между ЦС и МДГ в слитом белке позволяло предположить формирование комплекса между ферментами и, как следствие, возникновение внутри этого комплекса субстратного канала для ОАА.

Сопряженную реакцию проводили также, как в случае с комплексами ферментов в ПЭГ. Слитый белок был менее чувствителен к влиянию ААТ по сравнению со свободными ферментами (рис. 12). При проведении сопряженной реакции в условиях высокой ионной силы кривые зависимости скорости реакции от коцентрации ААТ были практически одинаковы как для слитого белка, так и для свободных ферментов. Полученные результаты могут служить подтверждением предположения о наличие электростатического канала для ОАА внутри комплекса, образуемого ЦС и МДГ.

Метаболические эффект дислокализации цитрат-синтазы в клетках дрожжей. В клетках млекопитающих ЦС, по-видимому, локализована исключительно в митохондриях. В клетках дрожжей и растений, второй изофермент, локализованный в пероксисомах, вовлечён в глиоксилатный цикл (ГЦ) - анаплеротический путь ЦТК.  В дрожжах Saccharomyces cerevisiae, активности митохондриальной и внемитохондриальной ЦС кодируются определёнными ядерными генами, CIT1 (Suissa, Sude, Schatz, 1984) и CIT2 (Kim, Rosenkrantz, Guarente, 1986; Rosenkrantz et al. 1990), соответственно. Пероксисомальная локализация Сit2p опосредована наличием С-терминального трипептида SKL (Lewin, Hines, Small, 1990; McCammon et al. 1990; Singh, Small, Lewin, 1992). Белок Cit1p, на 81%, идентичный по аминокислотному составу Cit2p, имеет на С-конце трипептид SKN, который определяет митохондриальную локализацию белка. Кроме того, показано, что третий ген СIT3 кодирует вторую митохондриальную изоформу ЦС у S. cerevisiae, но условия функционирования и экспрессии cit3p не были объяснены (Jia, Becam, Herbert, 1997). Мутант, с делецией гена CIT2 абсолютно жизнеспособен и не проявляет каких-либо особых фенотипических отличий от родительского типа. Мутант, лишенный CIT1 не растёт в среде с ацетатом в качестве единственного источника углерода.  Это представлялось неожиданным, поскольку внутренняя мембрана митохондрий обеспечена транспортёром цитрата (Chapell and Haaroff, 1967), который позволяет Cit2р заменить Cit1p.

Рис. 12. Влияние ААТ на сопряженную реакцию, катализируемую свободными ферментами  ЦС и МДГ и слитым белком ЦС/МДГ.

Целью данного раздела работы было дальнейшее изучение идеи о мультиферментном комплексе внутри ЦТК и оценка способности изоферментов, катализирующих одну и ту же реакцию, но имеющих структурное различие, функционировать в альтернативных клеточных компартментах и метаболических путях. Мы исследовали способность белка Сit1p, обычно обнаруживаемого в митохондриях, функционировать в цитозоле, и способность белка Сit2p, обычно обнаруживаемого в пероксисомах, функционировать в митохондриях. Более того, мы очистили белки Сit1p, Сit2p и Mdh1р с тем, чтобы проверить способность Сit1p и Сit2p взаимодействовать in vitro с митохондриальной малатдегидрогеназой (Mdh1р) в твердо-фазном комплексе в присутствии ПЭГ, как это было проведено с коммерческими ферментами в предыдущем разделе.

Дрожжевые null-мутанты cit1 и двойной мутант cit1cit2  были не способны расти в среде, содержащей ацетат в качестве единственного источника углерода. Путем трансформации в них встроены плазмиды: pRS-C-CIT1  кодирует нативный белок Cit1p; pRS-C-LSCIT1- белок Cit1p без SKN, ответственной за локализацию в митохондрии; pRS-Е-LSCIT1- мультикопийный Cit1 без SKN; pRS-C-LSCIT2SKL - белок Cit2p без SKL,

pRS-C-LSCIT2SKN -  белок Cit2p с SKN вместо SKL. 

       Селекцию трансформантов проводили в  синтетической полной среде с глюкозой без триптофана  и проверяли их на способность к росту в среде с ацетатом (рис. 13). Трансформант не восстанавливал способности к росту на ацетате при экспрессии CIT2, не способной проникать в митохондрии, 2) При экспрессии в мутантном штамме CIT2 с лидерной последовательностью способность к росту на ацетате восстанавливалась.

Рис. 13. Способность плазмид-несущих конструкций восстанавливать рост мутантных штаммов на среде с ацетатом.

Описанные выше результаты показали, что цитозольный белок Cit2p, когда локализован в митохондриях, способен метаболически подражать митохондриальному белку Cit1p. Согласно идеи мультиферментого комплекса ЦТК, эти данные позволяют предположить, что как Cit2p, так и Cit1p, могут встраиваться в этот комплекс.

Для проверки способности дрожжевых ферментов ЦС, митохондриальной (Cit1p) и цитозольной (Cit2p) локализации, взаимодействовать с дрожжевой митохондриальной МДГ (Mdh1p) в присутствии ПЭГ, кодирующие области генов CIT1, CIT2, и MDH1 клонировали в бактериальный вектор  pPROEX-1 (где они были встроены в рамку считывания с 5′ конца в последовательность, кодирующую шесть последовательных гистидиновых остатка). Все три гистидин-меченных белка были экспрессированы в  бактериях и очищены на никель-агарозе. Как показано на рис. 14, как Cit2p, так  и Cit1p, взаимодействовали с Mdh1p в присутствии 14% ПЭГ, и это даёт основание предположить, что пероксисомальная изоформа ЦС, при дислокации в митохондрии, может принимать участие в работе мультиферментного комплекса ЦТК.

Способность двух изоферментов ЦС замещать друг друга внутри пространственной структуры требует того, чтобы эти два белка проявляли высокое структурное сходство их внешней поверхности. На рис. 15 представлены молекулярные поверхности изоформ ЦС в трёх различных положениях. На этих моделях чётко видно, что два изофермента имеют высокое сходство в структуре внешней поверхности, так, что они почти неразличимы друг от друга. Существует подавляющее сходство между двумя электростатическими профилями этих двух изоферментов.

Рис.15. Структура поверхностей и электростатические заряды ЦС1 и ЦС2.

Красные области – положительно-заряженные участки; синие – отрицательно

Каждый белок представлен в трех ориентациях, полученных последовательным  вращением молекул на 90 0. Стрелка указывает на активный центр.

Одно из возможных преимуществ организации ферментов в метаболоны состоит в том, что непосредственная близость ферментов, ответственных за последовательные шаги метаболического пути, увеличивает утечку интермедиата именно через этот путь и предотвращает выход интермедиата в раствор, где он может быть использован другими ферментами в других метаболических путях.

ВЫВОДЫ

  1. Впервые установлены пути метаболизма триглицеридов и продуктов их гидролиза у дрожжей Y. lipolytica. Первым этапом вовлечения триглицеридов в метаболизм является их гидролиз внеклеточными липазами. Продукты гидролиза триглицеридов - жирные кислоты и глицерин потребляются клетками одновременно. Вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы.
  2. Изучены механизмы регуляции сверхсинтеза органических кислот у

Y.lipolytica. Ключевая роль отводится регуляции НАД- изоцитратдегидрогеназы уровнем АМФ и соотношением НАДН/НАД+. Лимитирование роста дрожжей азотом приводит к остановке биосинтеза азотсодержащих соединений и снижению их содержания в клетке. В результате этого происходит возрастание соотношений АТФ/АМФ и НАДН/ НАД+, что свидетельствует о повышенном обеспечении клеток энергетическими и восстановительными эквивалентами и блокировке изоцитратдегидрогеназы. В результате образуются значительные количества лимонных кислот в клетке и выделение этих метаболитов в культуральную жидкость. При лимитировании роста тиамином клетки находятся в состоянии низкой обеспеченности энергетическими и восстановительными эквивалентами. Блокирование метаболического потока осуществляется на уровне тиаминзависимых ферментов: 2-оксоглутарат-дегидрогеназы и пируватдегидрогеназы, в среду выделяются кетокислоты.

3. Липаза (КФ 3.1.1.3), глицеролкиназа (КФ 2.7.1.30), НАД+-зависимая изоцитратдегидрогеназа (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтаза (КФ 4.1.3.7) Y. lipolytica выделены, очищены и охарактеризованы. Исследованы механизмы регуляции этих ферментов интермедиатами ЦТК. Показано, что свойства цитратсинтазы в условиях in vitro и in situ существенно различаются; фермент in situ оказался более устойчивым к ингибирующему воздействию цитрата и АТФ.

  1. Установлены новые принципы метаболической организации дрожжей. Между ферментами существуют фермент-ферментные взаимодействия. Такие взаимодействия выявлены между двумя последовательными ферментами ЦТК - цитратсинтазой и малатдегидрогеназой. Фермент-ферментный комплекс образует электростатический  субстратный канал для оксалоацетата. На примере пероксисомальной цитрат-синтазы впервые показана важность третичной структуры  фермента для его функционирования в составе метаболона.
  2. Ферменты ЦТК способны связываться как между собой, так и с внутренней мембраной митохондрий, образуя надмолекулярные комплексы (метаболоны). Такая организация метаболического пути способствует 1) формированию субстратных каналов, при котором субстраты передаются от одного фермента к последующему без выхода в раствор; 2) созданию микроокружения, в котором концентрация субстратов существенно повышается и 3) эффективной и направленной регуляции клеточного метаболизма.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ  ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзоры

1. Anasstasiadis S., Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Finogenova T.V. Citric acid production patent review // Recent Patents on Biotechnology. 2008. V. 2. N 3. P. 103-120.

2. Anasstasiadis S., Kamzolova S.V., Morgunov I.G. and H.J. Rehm. Comparative study of the effect of iron on citrate-producing yeast growing on different substrates // In: Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. Eds. Antonio Mendez-Vilas. 2007.V. 1. P. 308-314.

3. Финогенова Т.В., Моргунов И.Г., Камзолова С.В., Чернявская О.Г. Перспективы производства органических кислот дрожжами Yarrowia lipolytica // Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т. 41. N 5. C. 478-486.

Статьи в рецензируемых журналах

  1. Ермакова И.Т., Моргунов И.Г. Пути метаболизма глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica // Микробиология. 1988. Т. 57. N 4. C. 533-537.
  2. Моргунов И.Г., Ермакова И.Т. Механизм биосинтеза пировиноградной кислоты из глицерина дрожжами Yarrowia lipolytica // Микробиология. 1989. Т. 58. N 1. С. 26-30.
  3. Моргунов И.Г., Ильченко А.П., Шарышев А.А. Ферменты метаболизма глицерина у дрожжей  Candida lipolytica // Биохимия. 1991. Т. 56. N 2. С. 258-266.
  4. Ильченко А.П., Фаусек Е.А., Моргунов И.Г., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В. Возможные пути окисления этанола в клетках дрожжей Candida lipolytica // Микробиология. 1994. Т. 63. N 3. С. 442-449.
  5. Моргунов И.Г., Шарышев А.А., Микулинская О.В., Соколов Д.М., Финогенова Т.В. Выделение. очистка и некоторые свойства цитрат-синтазы дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica – продуцентов лимонной кислоты // Биохимия 1994. Т. 59. N 9. С. 1320-1329.
  6. Моргунов И.Г., Ильченко А.П. Выделение, очистка и некоторые свойства глицеролдегидрогеназы // Биохимия. 1995. Т. 60. N 6. С. 883-891.
  7. Моргунов И.Г., Чернявская О.Г., Финогенова Т.В. О механизме биосинтеза 2-оксоглутаровой кислоты из этанола тиаминауксотрофными дрожжами Yarrowia lipolytica // Микробиология. 1995. Т. 64. N 4.  С. 442-445.
  8. Моргунов И.Г., Шарышев А.А., Пескова Е.Б., Финогенова Т.В. Митохондриальная альдегиддегидрогеназа этанол-ассимилирующих дрожжей Candida maltosa // Биохимия. 1996. Т. 61. N 1. С. 131-141.
  9. Белова Л.Л., Соколов А.П., Моргунов И.Г., Троценко Ю.А. Очистка и характеристика цитрат-синтазы из Methylobacterium extorguens – метилотрофного продуцента полигидроксибутирата // Биохимия. 1997. Т. 62. N 1. С. 71-76.
  10. Shatalin K., Morgunov I.,  Srere P.A. Electostatic channeling between citrate synthase and malate dehydrogenase fussion protein // FASEB J. 1997. V. 11. N 9. P. 928.
  11. Morgunov I., Srere P.A. Interactions between citrate synthase and malate dehydrogenase. Substrate channeling of oxaloacetate // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N 45. P. 29540-29544.
  12. Velot Ch., Lebreton S., Morgunov I., Usher K., Srere P. Metabolic studies on mislocalized mitochondrial and peroxisomal citrate synthase in yeast  Saccharomyces cerevisiae //Biochemistry. 1999. V. 38. P. 16195-16204.
  13. Finogenova T.V., Kamzolova S.V., Dedyukhina E.G., Shishkanova N.V., Il'chenko A.P., Morgunov I.G., Chernyavskaya O.G., Sokolov A.P. Biosynthesis of citric and isocitric acids from ethanol by mutant Yarrowia lipolytica N 1 under continuous cultivation //Appl Microbiol Biotechnol. 2002. V. 59. N 4-5. P. 493-500.
  14. Kamzolova S.V., Shishkanova N.V., Morgunov I.G. and Finogenova T.V. (2003) Oxygen requirements for growth and citric acid production of Yarrowia lipolytica // FEMS Yeast Research. 2003. V. 3. P. 217-222.
  15. Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Perevoznikova O.A., Shishkanova N.V., Finogenova T.V. Pyruvic acid production by a thiamine auxotroph of Yarrowia lipolytica // Process Biochemistry. 2004. V. 39. P. 1469-1474.
  16. Моргунов И.Г., Солодовникова Н.Ю., Шарышев А.А., Камзолова С.В., Финогенова Т.В. Регуляция НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы у цитрат-продуцирующих дрожжей Yarrowia lipolytica // Биохимия. 2004. Т. 69. N 12. С. 1391-1398.
  17. Моргунов И.Г., Камзолова С.В., Соколов А.П., Финогенова Т.В. Выделение. очистка и некоторые свойства НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы дрожжей Yarrowia lipolytica – продуцентов органических кислот // Микробиология. 2004. Т. 73. N 3. С. 300-306.
  18. Morgunov I.G., Kondrashova M.N., Kamzolova S.V., Sokolov A.P., Fedotcheva N.I., Finogenova T.V. Evidence of the glyoxylate cycle in the liver of newborn rats // Med. Sci. Monit. 2005. V. 1. P. 1-4.
  19. Kamzolova S.V., Morgunov I.G., Aurich A., Perevoznikova O.A., Shishkanova N.V., Stottmeister U., Finogenova T.V. Lipase secretion and citric acid production in Yarrowia lipolytica yeast grown on animal and vegetable fat // Food Technol. Biotechnol. 2005. V. 43. N 2. P. 113-122.
  20. Kondrashov F.A., Koonin E.V., Morgunov I.G., Finogenova T.V. and Kondrashova M.N. Evolution of glyoxylate cycle enzymes in Metazoa: evidence of multiple horizontal transfer events and pseudogene formation // Biology Direct. 2006. V. 1. P.1-31.
  21. Камзолова С.В., Финогенова Т.В., Лунина Ю.Н., Перевозникова О.А., Миначова Л.Н., Моргунов И.Г. Особенности роста на рапсовом масле и синтеза лимонной и изолимонной кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica // Микробиология. 2007. Т. 76. N 1. C. 26-32.
  22. Kamzolova S.V., Morgunov I.G., Finogenova T.V. Microbiological production of citric and isocitric acid from sunflower oil // Food Technol. Biotechnol. 2008. V. 46. N 1. P. 51-59.
  23. Финогенова Т.В., Пунтус И.Ф., Камзолова С.В., Лунина Ю.Н., Монастырская С.Е., Моргунов И.Г., Боронин А.М. Получение мутантных штаммов Yarrowia lipolytica – продуцентов лимонной кислоты из глюкозы // Прикл. биохим. микробиол. 2008. Т. 44. N 2. С. 197-202.
  24. Камзолова С.В., Фатыхова А.Р., Моргунов И.Г. Биосинтез лимонной кислоты дрожжевыми организмами из глицерин-содержащих продуктов // Биотехнология. 2008. N 5. C.1-7.
  25. Morgunov I.G., Kamzolova S.V. The binding of citrate synthase and malate dehydrogenase with the inner mitochondrial membrane // J. Biomol. Struct. Dyn. 2009. V. 26. N 6. P. 870-871.

Статьи в научных сборниках и других изданиях

  1. Моргунов И.Г. Метаболизм глицерина у дрожжей Candida lipolytica // Сборник “Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов”. Рига. 1987. C. 146.
  2. Моргунов И.Г., Ильченко А.П., Ермакова И.Т. Способ получения глицерол-киназы. Авт. Свид. N 1433980. 1988.
  3. Morgunov I.G. Regulation of citrate synthase of yeast Yarrowia lipolytica in situ and in vitro // Proceedings of the 14th Small Meeting on Yeast Transport and Energetics. Bonn, FRG. 1996. P. 62.
  4. Morgunov I.G. Organization and regulation of enzymes involved in organic acids biosynthesis by yeast Yarrowia lipolytica // Abstract Book of Third Yarrowia lipolytica International Meeting “Cell Biology and Biotechnology of a nonconventional yeast”. Dresden, Germany. 2002. P. 64.
  5. Morgunov I.G. Regulation of enzymes involved in organic acid biosynthesis by yeast Yarrowia lipolytica // Abstract Book of  1st FEMS Congress of European Microbiologists. Ljubljana, Slovenia. 2003. P. 342.
  6. Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Finogenova T.V. Biotechnological potential of the yeast Yarrowia lipolytica. Abstract Book of 2nd FEMS Congress of European Microbiologists. Madrid, Spain.  2006. P. 196.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.