WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

ГОНЧАРОВ Николай Васильевич

МЕХАНИЗМЫ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФТОРАЦЕТАТА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ ОСТРЫХ ОТРАВЛЕНИЙ

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

г. Пущино 2008 г.

Работа выполнена в лаборатории общей токсикологии и гигиенического нормирования НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека Федерального медико-биологического агентства Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович доктор медицинских наук Радилов Андрей Станиславович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Маевский Евгений Ильич доктор биологических наук, профессор Завьялова Наталья Васильевна доктор биологических наук Морозов Владимир Игоревич

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

Защита состоится 02 октября 2008 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская обл., г.Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

Автореферат разослан _____ сентября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Т.И. Смолихина - 1 Посвящаю родителям

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы Несмотря на высокий уровень знаний о молекулярных основах жизнедеятельности клеток, существует большой разрыв в понимании взаимосвязи между первичным биохимическим действием вещества и конечным физиологическим ответом организма. С этим связана проблема физиолого-биохимической диагностики и направленного поиска эффективной терапии в медицине и токсикологии. К высокотоксичным соединениям, для которых имеющиеся средства диагностики и терапии недостаточно эффективны, относятся фторорганические соединения. Эти соединения привлекли к себе пристальное внимание в 1940-х годах, когда среди большого класса биологически инертных веществ была выявлена группа соединений c общей формулой СН2FCOOR, объединенных названием «фторацетат» (ФА). Действие ФА проявляется не сразу, но спустя латентный период, составляющий для человека и других млекопитающих от получаса до нескольких часов, даже при отравлении летальными дозами. Наиболее известным представителем ФА является фторацетат натрия (ФАН). Это соединение использовалось в ряде стран для контроля численности популяций некоторых позвоночных. Уровень ФА в некоторых австралийских растениях достигает 5 г/кг сухого веса и при однократном или повторном употреблении домашними животными служит причиной их гибели. Кроме того, существует ряд фторсодержащих соединений, метаболизм которых в организме протекает с образованием ФА в качестве промежуточного продукта: это противоопухолевые препараты (5-фторурацил и изомеры фторэтилнитрозомочевины), N-(2-фторэтил)-производные наркотических анальгетиков нормеперидина и норметазоцина, пестициды (1,3-дифтор–2-пропанол и фторацетамид, ФАА), 1-(ди)гало-2-фторэтаны и фторэтанол [Reifenrath et al., 1980; Tisdale, Brennan, 1985; Feldwick et al., 1998 и др.]. В промышленных регионах ФА можно обнаружить в составе капель дождя и тумана [Rompp et al., 2001]. Актуальность проблемы существенно возросла в связи с возникновением новой опасности – международного терроризма [Holstege et al., 2007]. Физикохимические особенности, отсутствие вкусовых или обонятельных признаков наличия вещества, отставленное проявление токсичности, схожесть клинических признаков отравления с рядом естественных недомоганий, – все это обусловливает повышенный интерес к всестороннему изучению физиолого-биохимических механизмов действия ФА и поиску эффективных средств терапии интоксикаций.

Механизм токсического действия ФА широко известен под названием “летальный синтез” [Peters, 1952], суть которого заключается в превращении в клетках организма нетоксичного самого по себе ФА в токсичный фторцитрат (ФЦ), ингибирующий аконитазу и работу цикла Кребса. Собственно токсикантом является 4-гидрокси-транс-аконитат, дериват фторцитрата, не - 2 содержащий фтора [Kent et al., 1985], а ФЦ получил название «суицидный субстрат» [Clarke, 1991]. В результате блокады аконитазы происходит накопление цитрата в органах и тканях организма, истощаются энергетические запасы, отмечен внутриклеточный дисбаланс ионов и осмотический дисбаланс. Изучению механизма токсического действия и поиску средств терапии было посвящено большое количество работ [Chenoweth, 1949; Rammel et al., 1985 и др.]. Однако существующие пробелы в понимании взаимосвязи между молекулярными первопричинами и ответом целого организма не позволяет исследователям разработать эффективные средства терапии. Выявленные признаки интоксикации недостаточно проанализированы с точки зрения биохимической адаптации к токсическому воздействию, не предложены альтернативные подходы к терапии с учетом метаболических особенностей различных тканей и органов, поэтому до сих пор не удалось в полной мере подавить метаболизм ФА, ускорить его выведение из организма, нейтрализовать вызываемые им изменения. Этиловый спирт, предложенный еще в 1940-х годах, но главным образом симптоматическая терапия являются на сегодняшний день единственно приемлемыми средствами медицинской помощи [Proudfoot et al., 2006].

Кроме того, решение данной проблемы имеет важное теоретическое и прикладное значение для разработки новых антигипоксантов, поскольку для токсического действия ФА, многих других ядов и критических состояний характерно отсутствие строгой специфики и особенности патогенеза во многом связаны с развитием тканевой гипоксии.

Цель и задачи исследования Цель настоящей работы заключалась в комплексном изучении биохимических, физиологических, клинико-токсикологических механизмов действия фторацетата и разработка эффективного средства терапии острых отравлений фторацетатом. Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1) Исследовать клинические признаки острого отравления, физиологические и морфофункциональные особенности действия фторацетата на примере фторацетата натрия и фторацетамида.

2) Исследовать биохимические особенности действия фторацетата на митохондрии, клетки и организм экспериментальных животных, исследовать взаимодействие энергопродуцирующих и сигнальных систем при воздействии фторацетата.

3) Теоретически и экспериментально обосновать принципы биохимической адаптации клеток и тканей при действии фторацетата; определить основные направления для разработки эффективной терапии острых отравлений фторацетатом.

4) Разработать терапию острых отравлений фторацетатом и в экспериментах на животных продемонстрировать ее эффективность.

- 3 Положения диссертации, выносимые на защиту 1. Острая интоксикация фторацетатом сопровождается развитием комплекса клинических, морфофизиологических и биохимических показателей, свидетельствующих о первичном и преимущественном поражении нервной системы экспериментальных животных.

2. Биохимическая адаптация при интоксикации фторацетатом состоит в перестройке метаболических путей и утилизации альтернативных энергетических субстратов с целью поддержания биологического окисления; биохимическая адаптация отражает сопряжение внутриклеточной сигнализации и биологического окисления.

3. Физиолого-биохимической основой острого токсического действия фторацетата является разобщение процессов внутриклеточной сигнализации и биологического окисления, что выражается в необратимом снижении уровня восстановленных пиридиновых нуклеотидов, подавлении дыхания митохондрий, нарушении баланса внутриклеточного кальция, потере чувствительности или гибели клеток-мишеней.

4. Основные направления для фармакологической коррекции при острой интоксикации фторацетатом: конкуренция за коэнзим А, конкуренция за митохондриальную аконитазу, активация альтернативных метаболических путей, утилизация накапливающегося цитрата.

5. Комплекс веществ, включающий в себя искусственный акцептор электронов, источник восстановительных эквивалентов, донор окиси азота и источник ацетатных групп обладает высоким терапевтическим эффектом при использовании в ранние сроки острой интоксикации фторацетатом и способствует коррекции ряда биохимических и физиологических показателей у экспериментальных животных.

Научная новизна С использованием ФАН, ФАА и ФЦ впервые проведено комплексное изучение физиолого-биохимических, морфофункциональных, клеточных и субклеточных (митохондриальных) механизмов действия ФА и его токсического метаболита ФЦ. Предложено теоретическое объяснение и экспериментальное обоснование динамики ряда биохимических показателей в органах и тканях животных при воздействии ФА. Изложены представления о сопряжении и разобщении процессов внутриклеточной сигнализации и биологического окисления. Впервые использована методология изучения кинетических параметров агрегации тромбоцитов для определения характера интоксикации, механизма действия и апробации средств терапии. Обнаружено явление гиперчувствительности тромбоцитов с последующим переходом клеток в рефрактерное (нечувствительное) состояние. Предложена концепция причинно-следственных связей на молекулярно-клеточном уровне при блокаде цикла Кребса на уровне митохондриальной аконитазы. Обоснованы принципы биохимической адаптации и фармакологической коррекции при острой интоксикации фторацетатом. Разработан и - 4 теоретически обоснован эффективный терапевтический комплекс «Метис»: введенный в ранние сроки интоксикации ФА, этот комплекс спасает от гибели экспериментальных животных с коэффициентом эффективности до 4,3 (по ЛД50). В экспериментальную токсикологию и фармакологию введен метод биохимической коррекции, основанный на принципе управляемого и целевого воздействия на ход метаболических процессов.

Теоретическое и практическое значение работы Проведенные исследования расширяют представления о механизмах нарушения гомеостаза при острой интоксикации ФА и позволяют лучше понять взаимосвязь специфических и неспецифических проявлений интоксикации. Знание биохимических механизмов, лежащих в основе адаптации клеток и тканей при воздействии токсического агента, дает возможность эффективно скорректировать нарушенный гомеостаз. Разработанные и теоретически обоснованные средства терапии острых отравлений ФА углубляют наши знания о взаимодействии сигнальных и энергопродуцирующих систем, о путях биохимической адаптации, о биохимической основе физиологических ритмов. Новый терапевтический комплекс после проведения доклинических испытаний в кратчайшие сроки может быть внедрен в клиническую практику, поскольку его компоненты отличаются дешевизной и доступностью.

Использование методологии малоуглового светорассеяния для изучения морфофункциональных характеристик клеток крови свидетельствует о высокой ее эффективности для определения характера интоксикации, а также для разработки средств терапии, что является несомненным вкладом в методическое обеспечение физиолого-биохимических и токсикологофармакологических исследований. Проанализирована не только научная литература по разным аспектам действия ФА, но также проведен анализ ряда смежных областей биохимии и клеточной биологии. Полученные в работе практические результаты и теоретические обобщения могут быть использованы в лекционных курсах по биохимии, токсикологии и фармакологии.

Апробация работы Результаты исследований доложены: на конференции «Кровообращение в условиях высокогорной и экспериментальной гипоксии» (Фрунзе, 1986), II Всесоюзной конференции «Биоантиоксидант» (Черноголовка, 1986), Всероссийской конференции «Проблемы стандартизации в здравоохранении» (Москва, 2001), научно-практической конференции, посвященной 40-летию НИИГПЭЧ (Санкт-Петербург, 2002), Международном симпозиуме по антитерроризму (Волгоград, 2002), на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005, 2007), международном симпозиуме «Медицинские и биологические проблемы, связанные с уничтожением химического оружия» (Волгоград, 2003), 2-м съезде токсикологов России (Москва, 2003), Российской научной конференции «Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности» (Санкт - 5 Петербург, 2004), на 8-м и 9-м международных симпозиумах по защите от химического и биологического оружия (Гетеборг, 2004, 2007), 3-м Всемирном конгрессе по химическому, биологическому и радиационному терроризму (Дубровник, 2005), I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), Обществе токсикологов США (Сан-Диего, 2006; Шарлотт, 2007), на Питтсбургской конференции (Орландо, 2006), 16-й Северной конференции по судебной медицине (Турку, 2006), 3-й Международной научно-практической конференции «Новые технологии создания инновационных лекарств» (Химки, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 45-летию НИИГПЭЧ (Санкт-Петербург, 2007), на конференции, посвященной 50летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007), 10-й международной конференции по химическому разоружению (Брюссель, 2007), на обзорной конференции программы BII Госдепартамента США (Пущино, 2007).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 352 страницах машинописного текста, содержит 90 таблиц и 168 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 6 экспериментальных разделов с дополнительным анализом литературы, обсуждением и частными выводами, заключения и общих выводов. Библиография включает 72 отечественных и 687 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Лабораторные животные и общие токсикологические методы. Для экспериментальных исследований использовали крыс, кроликов и мышей. Содержание экспериментальных животных соответствовало «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденных МЗ СССР 06.07.73 г. и Приказом МЗ СССР №755 от 12.08.77 г. Параметры токсичности оценивали методом пробитанализа [Беленький, 1959; Finney, 1980]. Для оценки влияния ФА на потребление кислорода применяли аппарат Миропольского. Определение парциального давления кислорода и рН крови проводили методом Аструпа [Andersen et al., 1960]. Ориентировочно-исследовательскую активность животных изучали по методике «открытое поле» [Буреш и др., 1991].

Электрофизиологические исследования. Электрофизиологические исследования ЭКГ и параметров внешнего дыхания проведены при техническом и научном содействии д.б.н.

С.В.Кузнецова, руководителя лаборатории развития нервной деятельности животных в онтогенезе Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН. У животных осуществляли одновременную регистрацию ЭКГ и частоты дыхательных движений (ЧДД). Расчет частотно-временных показателей ЭКГ и ЧДД проводили с применением специально разработанных в среде LabView оригинальных программ и пакета анализа данных Origin 7. Спектральный анализ ЭКГ осуществляли по алгоритму быстрого преобразования Фурье - 6 с использованием окна Уолша (Welch). Для оценки вагосимпатического баланса проводили анализ вариабельности сердечного ритма (ВСР).

Трансмиссионная электронная микроскопия. Морфологические исследования проведены при техническом и научном содействии Н.М.Парамоновой, научного сотрудника института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Изготавливали полутонкие (1 мкм) срезы на ультратоме LKB V (Швеция). Морфологический анализ ткани с микрофотосъемкой выполняли на фотомикроскопе фирмы «OPTON» (ФРГ). Ультратонкие срезы толщиной 40-60 нм наносили на сеточки и окрашивали методом тройного контрастирования по Рейнолдсу [Уикли, 1975]. Просмотр и фотосъемку производили на электронных микроскопах JEM 100CX и Hitachi-300. Для морфологического анализа использовали фотографические отпечатки электронограмм с увеличением на негативах от 3000 до 100000.

Химическая идентификация фторацетамида и фторацетата натрия, определение фторацетата в плазме крови, гомогенатах органов и моче животных. Фторацетат натрия (ФАН) и фторацетамид (ФАА) были синтезированы в НИИ ГПЭЧ ФМБА России. Химический анализ проведен под руководством к.х.н. Е.И.Савельевой, ведущего научного сотрудника НИИГПЭЧ. В режиме статического парофазного анализа установлено, что препарат ФАА состоит из двух компонентов: собственно фторацетамида (около 95%) и о-ксилола (не более 5%).

Данные элементного анализа показали, что препарат ФАН содержит не менее 98% фторацетата натрия. В биологических тканях и жидкостях ФА определяли в виде этилового эфира методом твердофазной микроэкстракции в сочетании с газовой хроматографией – масс-спектрометрией (ГХМС) в режиме мониторинга избранных ионов с использованием 2-х внутренних стандартов:

четыреххлористого углерода (RT 5,1 мин) и толуола (RT 7,4 мин.).

Определение аминокислот в плазме крови и органах методом газовой хроматографии. Для исследования динамики свободных аминокислот в биологических тканях была использована классическая двухстадийная процедура, основанная на последовательном N(O,S)изобутоксикарбонилировании аминогрупп изобутилхлорформиатом и метилировании карбоксильных групп диазометаном. Анализ проводили по процедуре, описанной в работе Мatsumura et al. [1996] c использованием ряда модификаций.

Потенциометрическое определение фторид-иона в тканях животных. Метод представляет собой модификацию известного метода с использованием электродной системы, состоящей из измерительного селективного фторидного электрода типа ЭF-VI и вспомогательного хлорсеребряного электрода типа ЭВЛ-1М [Новиков и др., 1990; Hall et al., 1972]. Потенциал фторидного электрода измеряли высокоомным ионометром типа ЭВ-74.

Определение нитрит-иона в плазме и органах животных осуществлялось спектрофотометрическим методом с помощью реактива Грисса при длине волны 532 нм [Бабко и др., 1974].

- 7 Изучение функциональных характеристик митохондрий. Изучение действия ФЦ проводили на изолированных митохондриях, полученных из клеток печени крыс по методу Schneider [1948]. Дыхательные характеристики изолированных митохондрий определяли, используя полярографический метод регистрации концентрации кислорода в водных растворах [Франк и др., 1973]. Для изучения состояния пиридиновых нуклеотидов (ПН) исследовали флуоресценцию NAD(P)Н с использованием спектрофлуориметра Hitachi F4000 при длине волны возбуждения 340 нМ и длине волны испускания 460 нМ.

Выделение и культивирование эндотелиальных клеток кровеносных сосудов. Разработка методов выделения, культивирования и защиты эндотелиальных клеток кровеносных сосудов человека и животных проводилась с участием автора в 1980-е годы в лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии ВКНЦ АМН СССР, Москва [Гончаров, Алдашев, 1986; Музыкантов и др., 1986; Гончаров и др., 1987]. В рамках исследований токсического действия ФА и ФЦ для выделения клеток эндотелия аорты использовали крыс линии Wistar массой 200-250 г. Все эксперименты проводились на клетках между пассажами 3 и 6.

Выделение кардиомиоцитов. Кардиомиоциты выделяли из крыс линии Wistar массой 150-1грамм с коллагеназой в растворе, содержащем соли и глюкозу [Powel et al., 1980]. Суспензию кардиомиоцитов помещали в чашку Петри, покрытую коллагеном и через 60 минут смывали неприкрепившиеся клетки. Прикрепившиеся клетки использовали для экспериментов.

Измерение цитозольного кальция [Ca2+]i и митохондриального потенциала (-m) методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Для измерения [Ca2+]i клетки эндотелия или кардиомиоциты инкубировали 40 минут при 370С с 5мкМ Fluo4-AM и 0,005% Pluronic в HBSS. Для одновременного измерения [Ca2+]i и -m в последние 15 минут инкубации к клеткам добавляли 20 нМ TMRM - флуоресцентный зонд на -m. Клетки отмывали и чашку Петри помещали на предметный столик лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 510 Carl Zeiss. Измерения проводили с помощью воздушноиммерсионного объектива Zeiss PlanNeofluar х20 и водоиммерсионного объектива Zeiss PlanNeofluar х63. Для возбуждения флуоресценции Fluo4 использовали аргоновый лазер с длинной волны 488 нм и регистрировали флуоресценцию с использованием запирающего фильтра BP500-550 нм. Для регистрации изменений митохондриального потенциала использовали гелий/неоновый лазер 543 нм и регистрировали с использованием пропускающего фильтра LP560 нм. Обработку и анализ изображения проводили с использованием программ Kinetic Imaging software (Liverpool, UK) и OriginPro 7.0.





Изолирование и исследование клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ). Клетки АКЭ выделяли на 7-й или 8-й день после внутрибрюшинной трансплантации мышам NMRI/BLB [Arslan et al., 1985]. Клетки (20-50 млн/мл) инкубировали с 2 мкM зонда Indo1AM и 0,005% Pluronic. Для изучения изменений [Ca2+] в цитоплазме клетки в - 8 концентрации 5х106 /мл помещали в термостатируемую (280С) кювету спектрофлуориметра с магнитной мешалкой в растворе Хэнкса. Длина волны возбуждения 365 нм, эмиссию измеряли при длинах волн 405/490 нм. Флуоресценцию эндогенного NAD(P)Н измеряли при длине волны возбуждения 365 нм и эмиссии 465 нм. Са2+-чувствительный краситель хлортетрациклин использовали для регистрации изменений [Cа2+] в эндоплазматическом ретикулуме, длины возбуждения и эмиссии 405 и 530 нм, соответственно.

Выделение макрофагов и исследования окислительного взрыва. Для изучения влияния ФАН на NADPН-оксидазную систему были использованы перитонеальные макрофаги мышей [Гамалей и др., 1988, 1995]. Активацию окислительного взрыва осуществляли хемотаксическим пептидом fMLP. Динамику окислительного взрыва фиксировали с одиночных клеток с помощью флуоресцирующего зонда DCF. Запись сигнала передаётся на компьютер через АЦП L-154 с помощью оригинальных программ MGraph и ROMan.

Исследование внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в тромбоцитах.

Исследование внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в тромбоцитах кролика в норме и при действии фактора активации тромбоцитов (ФАТ) проводили с помощью красителя квин-2АМ [Авдонин, Алтухова, 1985] на спектрофлуориметре Aminco SLM-8000.

Метод оценки функциональной активности тромбоцитов. Функциональную активность тромбоцитов исследовали методом малоуглового светорассеяния, позволяющим оценить все стадии трансформации тромбоцитов [Деркачев и др., 1998; Mindukshev et al., 2005a, 2005b].

Методология малоуглового светорассеяния разрабатывалась в институтах РАН (ИЭФБ им.

И.М.Сеченова, Санкт-Петербург; ИБК, Пущино) и ФМБА России (НИИ ГПЭЧ) с участием автора. Регистрациию малоуглового светорассеяния проводили на приборах «Лайт-Скан» или «ЛаСка-2К» (НПФ «Люмекс», Санкт-Петербург). Регистрация интенсивности светорассеяния осуществляется фотодиодами, сигналы регистрируются в программе "Etongue" и обрабатываются методами вариационной статистики с использованием программы MS Exсel 97.

Исследование апоптоза нейтрофилов, лимфоцитов и тимоцитов. Исследование апоптоза проведено при техническом и научном содействии д.б.н. М.Г.Винокурова в институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Нейтрофилы и лимфоциты выделяли из периферической крови здоровых доноров с помощью метода дифференциального центрифугирования на 2-слойном градиенте фиколла-верографина (1,119 и 1,077). Тимоциты получали из крыс линии Wistar. Для регистрации апоптоза использовали флуоресцентный зонд Hoechst-33258 [Afanasyev et al., 1993]. Рисунки оформлены в программе Sigma Plot.

Изучение эндотелий-зависимой релаксации кровеносных сосудов. Работа проведена при техническом и научном содействии д.б.н. П.В.Авдонина, руководителя лаборатории физиологии Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. Были использованы активаторы Argвазопрессин, 5-гидрокситриптамин, карбохолин, артеренол, ангиотензин II. Для экспериментов - 9 была собрана установка с тензодатчиками “Minebea Co. Ltd”, микроманипуляторами “Narishiga”, усилителем, самописцами. Эксперименты проводили на изолированных колечках, вырезанных из грудного отдела аорты крыс-самцов линии Wistar весом 200-300 г. Измерение силы сокращения при действии вазоактивных гормонов и нейротрансмиттеров в изометрическом режиме по методу Мульвани [Mulvany, Halpern, 1977; Angus et al., 1988].

Методы лабораторной и клинической биохимии. В таблице 1 представлен реестр методов клинической биохимии, использованных в наших экспериментах.

Таблица 1. Биохимические показатели и методы их определения Биохимические Объект Единицы измерения Методы показатели Лактат кровь мМ Hohorst, 1965;

ткань мкмоль/г Прохорова, 19Пируват кровь мМ Bucher et al., 1965;

Прохорова, 19ткань мкмоль/г Глутамат ткань мкмоль/г Bernt, Bergmeyer, 1963;

Прохорова, 19Глутатион восст. ткань мг% Patterson, Lazarow, 1955;

Прохорова, 19Цитрат кровь мкмоль/мл Natelson et al., 19ткань мкмоль/г Гликоген ткань мг/г Lo et al., 19Глюкоза кровь мМ Trinder, 1969;

ткань мг% Биотест «REANAL» Триглицериды кровь мМ McGowan et al., 1983;

Биотест «АБРИС+» Свободные жирные кровь мкМ Novak M., 19кислоты (СЖК) Белок ткань мкг/мл Bradford, 19Креатинкиназа ткань мкм/мин мг белка Szasz et al., 1976;

(КФ 2.7.3.2) Биотест ««Ольвекс Диагностикум» Глутаматдегидрогеназа ткань мкмоль/мин/мг белка Frieden, 1965;

(ГлДГ, КФ 1.4.1.3) Прохорова, 19Лактатдегидрогеназа ткань мкмоль/мин/мг белка Weisshaar et al., 1975;

(ЛДГ, КФ 1.1.1.27 кровь ммоль/мин/л Прохорова, 19Сукцинатдегидрогеназа ткань нмоль/мин/мг белка Arrigoni, Singer, 1962;

(СДГ, КФ 1.3.99.1) Прохорова, 19Глюкозо-6-фосфат ткань нмоль/мин/мг белка Zaheer et al., 1967;

дегидрогеназа (Г6ФДГ, Прохорова, 19КФ 1.1.1.49) Малатдегидрогеназа ткань нмоль/мин/мг белка Noyes et al., 1974;

(МДГ, КФ 1.1.1.37) Прохорова, 19Аланинаминотрансфе- ткань нмоль/мин/мг белка Bellamy, Leonard, 1964;

раза (АлТ, КФ 2.6.1.2.) Прохорова, 19кровь мкмоль/л/сек Bergmeyer et al., 1978;

Биотест «Ольвекс Диагностикум» Аспартатаминотрансфе- ткань нмоль/мин/мг белка Bergmeyer et al., 1978;

раза (АсТ, КФ 2.6.1.1.) Биотест «Ольвекс Диагностикум» - 10 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Клинико-токсикологические и физиологические исследования действия ФАА и ФАН Для крыс после однократного воздействия ФАА в дозе ЛД50 и выше латентный период составляет 45-75 мин, затем наблюдается значительное снижение двигательной активности, прекращение потребления корма и воды, отмечается сначала учащенное дыхание, затем более редкое, крысы собираются в группы. Через 2-4 часа после отравления эта стадия сменяется резким возбуждением продолжительностью 4-5 секунд, переходящим, как правило, в клоникотонические судороги. Достоверное снижение температуры тела отмечено уже через 1 час после отравления и достигало минимальных значений через 6 ч или 1 сутки, в зависимости от дозы.

Через 8 часов наблюдается некоторое уменьшение, а через сутки происходит уже двукратное снижение потребления кислорода. Токсичность ФАН выше по сравнению с токсичностью ФАА в 9-10 раз для крыс и в 3 раза для кроликов. Принципиальных отличий в симптомах отравления животных равноэффективными дозами ФАН и ФАА нет, однако при интоксикации ФАН гибель животных наступает раньше и в более сжатые сроки. Различия объясняются особенностями метаболизма ФАА, которому необходимо пройти стадию дезамидирования [Tecle, Casida, 1989].

Электрофизиологические исследования показали, что в первые часы интоксикации ФАА происходит увеличение амплитуд всех компонентов ЭКГ. Особенно значимо растет амплитуда зубцов P и R. У части животных наблюдается смещение сегмента ST ниже изолинии и снижение амплитуды зубца Т, что свидетельствует о развитии ишемических нарушений. У отравленных крыс происходит замедление проводимости: увеличиваются длительности всех зубцов и интервалов ЭКГ. Наблюдается прогрессирующее снижение ЧСС, достигающее наибольшей степени к 24 ч и сохраняющееся на низком уровне вплоть до 7-го дня. Падение амплитуд предсердного и желудочкового комплекса ЭКГ, наступающее через 3-24 часа, может быть связано с нарушением энергетического метаболизма сердца. Значительное снижение систолического показателя через 24 часа после отравления также свидетельствует о нарушении сократительной способности миокарда. Вместе с тем, наличие практически всех описанных нарушений ЭКГ соответствует симптомам при поражении ЦНС, а также при гипотермии [Stewart et al., 1970; Mallet, 2002]. Анализ вариабельности сердечного ритма (ВСР) свидетельствует об общем увеличении мощности спектра у крыс в течение 3 часов после введения ФАА или ФАН. Наблюдается тенденция постепенного смещения ведущей роли в регуляции деятельности сердечно-сосудистой системы к парасимпатической системе. Имеется кратковременный период, когда в регуляции сердечной деятельности возрастает роль гуморально-метаболических факторов. Мы выявили многообразный и отчасти противоречивый характер изменений спектра дыхательных движений у крыс при интоксикации ФА: это возрастание амплитуды основного дыхательного ритма, вспышки дыхательной тахиаритмии, наличие двух разноамплитудных дыхательных компонентов, «развал» дыхания, «размыв» - 11 спектра ЧДД, возникновение высокоамплитудных судорожных вдохов, возникающих в довольно правильном декасекундном ритме. Отметим, что практически все эти отклонения наблюдаются при различных травмах головного мозга [Угрюмов, 1974]. Пестрая картина дыхательных расстройств при интоксикации ФА обусловлена, по-видимому, наложением факторов центрального происхождения (подавление функционального состояния глии ретротрапезоидного ядра, повышение кислотности межклеточного пространства, активация диафрагмального нерва, снижение порога чувствительности к СО2) и влиянием на периферический кровоток и функциональную активность дыхательных мышц [Johnson, Reid, 1988; Erlichman et al., 1998;

Holleran et al., 2001]. При интоксикации ФА кроликов мы не обнаружили у них значимых патологических нарушений формы ЭКГ. Отмечено постепенное и устойчивое снижение ЧДД.

Развитие патологии дыхания может служить главной причиной гибели животных. Амплитудная модуляция ЭКГ, навязанная ритмом дыхания, обусловлена усилением вагусных влияний на сердце. Анализ ВСР свидетельствует о развитии у кроликов неустойчивого равновесия вагосимпатического баланса. В целом, если доля парасимпатических влияний в общей мощности спектра имела тенденцию к относительному росту, то симпатические влияния были более лабильны и их колебания обусловили маятникообразный характер вагосимпатического баланса.

Биохимические исследования животных при интоксикации ФАА и ФАН Максимальное повышение ФА отмечено в плазме и мозге животных через 1 час после отравления. Уровень фторид-иона в крови крыс увеличивается в два раза в течение 1 часа и держится примерно на одном уровне до 6 часа, а через сутки снижается до уровня контроля.

Концентрация цитрата в плазме крови и органах начинает повышаться уже через час (рис.1).

Наиболее значительное повышение цитрата выявлено через сутки после отравления в почках и в сердце (в 12 и 10 раз, соответственно), но при этом в сердце наблюдается максимальный абсолютный уровень цитрата (6,3 мкмоль/г). Далее по степени прироста цитрата следуют мозг, печень и плазма. Мы не обнаружили отклонений в уровне глюкозы в плазме крови во все сроки исследований, тогда как в печени, почках, сердце и мозге уровень глюкозы достоверно повышается. При этом уровень гликогена печени, сердца и мозга достоверно снижается. Уровень триглицеридов плазмы крови снижается, а концентрация СЖК повышается в первые часы после отравления, с последующим значительным снижением через сутки и особенно 3 суток. Отметим две фазы повышения глюкозы в печени: первое повышение через час происходит при отсутствии изменений гликогена, но при некотором повышении уровня СЖК в плазме крови. Это очевидно отражает первичную реакцию клеток печени на снижение обмена и потребности в глюкозе, а также свидетельствует об ингибирующем влиянии СЖК на транспорт и фосфорилирование глюкозы [Boden et al., 1994]. Вторая фаза повышения глюкозы наблюдается на фоне значительного снижения гликогена, что может быть связано с его повышенной утилизацией в - 12 пентозном цикле, по сравнению с глюкозой [Magnusson et al., 1988]. Кроме того, в печени повышается активность ГлДГ, наряду с повышением активности трансаминаз, что свидетельствует об усилении использования глутамата и других аминокислот в качестве альтернативного энергетического источника. Повышение активности ЛДГ в печени через сутки и 3 суток после отравления, возможно, отражает снятие неконкурентного ингибирования ЛДГ пируватом [Van Noorden et al., 1989], что может свидетельствовать о повышенном использовании пирувата в трансаминазной реакции; это предположение подтверждается синхронным повышением активности АлТ в печени. В то же время, достоверное повышение активности МДГ в печени через 3 суток сопряжено, по-видимому, с предшествующим повышением активности АсТ и малат/аспартатного шунта.

Рис. 1. Динамика цитрата в плазме крови и органах крыс при интоксикации ФАА, 1/2ЛД50.

Обращает на себя внимание факт значительного снижения уровня глутамата в сердце отравленных крыс во все сроки исследования, начиная с первого часа. Также в первые часы интоксикации значительно повышается активность АсТ. Такая компенсаторная реакция, очевидно, не может поддерживать уровень макроэргов: креатинфосфат сердца снижается в первые часы. Но уже через сутки уровень креатинфосфата не отличается от уровня контроля, при этом структура компенсаторных реакций в сердце меняется: активность АсТ у отравленных крыс снижается до уровня контроля, в то время как существенное повышение активности ГлДГ в сердце через 1 и 3 суток после отравления свидетельствует о включении этого метаболического пути в ответ на энергетическую блокаду. Уровень лактата в сердце достоверно снижается, но, по сравнению с глутаматом, в меньшей степени и в более поздние сроки. Синхронно с повышением глюкозы снижается уровень гликогена в сердце к шестому часу, через сутки достигая минимума, а через 3 суток остается достоверно ниже уровня контроля. Динамика энергетических субстратов в сердце крыс свидетельствует о том, что при блокаде гликолиза цитратом лактат компенсирует глюкозу и способствует удержанию гликогена, но при повышении потребности в лактате и - 13 пирувате для нужд окислительного метаболизма, а также при активизации симпатической стимуляции сердца уровень гликогена снижается.

Из биохимических показателей мозга наиболее значительные изменения, помимо цитрата, отмечены в динамике глюкозы: уровень глюкозы нарастает уже в первые часы после отравления (1-6 часов), но снижается до уровня контроля через сутки. Отметим достоверное снижение гликогена через 3 суток, а также снижение лактата через 3 часа и 3 суток. Динамика лактата в мозге крысы обусловлена, очевидно, снижением его синтеза из субстратов глиального ЦТК вследствие блокады последнего [Hassel et al., 1995b], снижением уровня NAD(P)H и/или повышенной утилизацией лактата нейронами при взаимодействии циклов лактата-аланина и глутамата-глутамина [Waagepetersen et al., 2000; Bak et al., 2006]. Уровень восстановленного глутатиона в мозге повышается на 20% через 3 суток, что совпадает по времени с понижением уровня гликогена и обусловлено повышенной утилизацией гликогена в астроглии для синтеза NADPН [Rahman et al., 2000].

Данные биохимического анализа подтверждают описание клинической картины:

интоксикация ФАН протекает интенсивнее и в более сжатые сроки, по сравнению с ФАА. Так, уровень лактата в сердце снижается на 38% через 3 часа (против 25% через 6 часов при интоксикации ФАА), уровень глюкозы повышается в 2 раза через 3 часа (против 67% через часов). Отметим более выраженное снижение (почти в 2 раза) триглицеридов в плазме через 1-часов после отравления. Максимум цитрата в крови и органах приходится на 6 часов (против ч при интоксикации ФАА), хотя относительные изменения менее выражены. Cнижение уровня мочевины в плазме может свидетельствовать об относительной слабости отравления, при котором почки сохраняют функциональную активность, в то время как синтез мочевины снижен из-за повышенной утилизации глутамина/глутамата тканями с нейтрализацией ацидоза аммиаком. О сохранении функциональной активности почек свидетельствует нормальный уровень креатинина. Можно было бы с уверенностью утверждать, что сердце крыс является первичной и главной мишенью при отравлении ФАН, если судить исключительно по масштабу наблюдаемых изменений. Однако лишь уровень цитрата в сердце достоверно меняется через час, тогда как достоверные изменения других исследованных нами биохимических параметров начинаются с 3 часов после отравления. Но уровень цитрата и в других органах и даже в плазме крови повышается также через час. При этом через час в плазме достоверно меняется уровень триглицеридов и мочевины, в печени – гликоген, АлТ и ГлДГ, в мозге – гликоген.

Определение аминокислот в плазме крови и гомогенатах органов животных позволило выявить интересную динамику. Отметим однонаправленность изменений уровня исследуемых аминокислот в плазме крови кроликов – уменьшение через 3 часа и восстановление (частичное или полное) через сутки после отравления. Особенно выражена динамика глутамина и глутамата: не обнаружено даже следовых количеств глутамина через 3 часа, но через сутки его - 14 уровень в плазме кроликов восстанавливается; снижение глутамата в 3,5 раза через 3 часа, но даже через сутки уровень глутамата у кроликов остается пониженным почти в 2 раза. Уровень других аминокислот снижается в 2-3 раза и восстанавливается через сутки после отравления.

Значительное снижение уровня аминокислот через 3 часа после отравления можно объяснить незначительным распадом белка скелетных мышц, что подтверждается отсутствием снижения веса тела кроликов и снижением уровня тирозина в плазме крови (тирозин ни синтезируется, ни утилизируется в скелетных мышцах, поэтому является индикатором распада белка [Chang, Goldberg, 1978]). При этом очевидно имеет место энергетический дефицит других тканей и внутренних органов. У крыс динамика уровня аминокислот плазмы не столь однозначна. Но что характерно: в плазме крыс через 3 часа также не определяется глутамин, через сутки его уровень восстанавливается, но снижается уровень глутамата. Уровень других аминокислот через 3 часа либо не меняется (аспартат, глутамат, тирозин), либо повышается (аланин, лейцин, лизин).

Известно, что разветвленные аминокислоты стимулируют производство аланина и глутамина в скелетных мышцах за счет передачи аминогрупп в реакциях трансаминирования с кетоглутаратом (КГ). Глюкоза – основной источник пирувата в синтезе аланина, а также ингибитор распада белка и утилизации разветвленных аминокислот [Chang, Goldberg, 1978].

Повышенный уровень лейцина, тирозина и глюкозы свидетельствует об умеренном распаде белка в мышцах в первые часы интоксикации, а резкое снижение уровня глутамина в плазме означает о его утилизацию эндотелием сосудов, почками, другими тканями и органами.

Максимальное снижение уровня нитрита совпадает с максимальным снижением уровня глутамина в плазме крови крыс и кроликов. Мы не располагаем данными о динамике аргинина – главном источнике окиси азота – в органах и тканях экспериментальных животных при интоксикации ФА. Но важно заметить, что аргинин может восполнять субстраты цикла Кребса через глутамат. Усиленный катаболизм аминокислот вообще и аргинина в частности ведет к дефициту субстрата для NO-синтазы (NOS). Кроме того, для синтеза 1 молекулы NO требуется 1,5 молекулы NADPH [Bian, Murad, 2003], дефицит которого предполагается. Наконец, синтез аргинина в цикле мочевины требует больших энергетических затрат (4 высокоэнергетические фосфатные связи на 1 молекулу мочевины) и глутамат для синтеза N-ацетилглутамата. В связи с этим отметим отсутствие достоверных изменений уровня мочевины в плазме кроликов, и даже достоверное снижение в плазме крыс через 1 и 3 часа после отравления. Однако при отравлении сублетальными дозами происходит восстановление уровня аминокислот и, очевидно, NADPH (последний может нарастать за счет утилизации глюкозы через пентозный шунт и/или цитрата через цитоплазматическую аконитазу и изоцитратдегидрогеназу). В результате адаптационной перестройки метаболических путей снижение уровня нитрит иона в плазме крови сменяется его повышением: у кроликов раньше (и у них более ранняя утилизация большинства аминокислот), у крыс позже (более поздняя утилизация аминокислот, отличных от глутамина).

- 15 В мозге крыс снижается через 3 ч, но повышается через сутки уровень аминокислот глутаминовой группы – глутамата, глутамина и аспартата (рис.2). Такая же динамика у лейцина, менее выраженная – у лизина и тирозина. Однако уровень аланина в мозге стабильно нарастает через 3 ч (в 2 раза) и через сутки (в 6 раз). Это объясняется преимущественным переаминированием глутамата в нейронах через АлТ. Отсюда уменьшение аспартата, глутаминаза нейронов способствует уменьшению глутамина.

Уровень лактата в мозге крыс при интоксикации ФАН понижается на 23% через 3 часа и на 37% через 6 часов, через сутки восстанавливается до уровня контроля. Это означает снижение гликолиза и уровня NAD(Р)Н в астроцитах, повышение утилизации лактата и пирувата в нейронах, а также снижение образования пирувата из аланина вследствие снижения уровня КГ в астроцитах (но не в нейронах!). В мозге крыс и кроликов наблюдается некоторое повышение уровня КГ, что также свидетельствует о переаминировании глутамата с пируватом и генерации аланина в нейронах. Существует и другой источник аланина – скелетные мышцы, однако транспорт аланина из сосудов в паренхиму мозга в норме незначителен [Oldendorf, Szabo, 1976; Smith, 2000]; данных об активизации систем транспорта глюкогенных аминокислот при нарушении утилизации глюкозы клетками мозга мы не обнаружили, хотя принципиальная возможность стимуляции глюконеогенеза в клетках мозга была показана [Bhattacharya, Datta, 1993].

Уровень аспартата в мозге крыс через сутки увеличивается в 3,7 раза, при этом несколько повышается уровень малата и снижается уровень КГ. В условиях энергетического дефицита и токсического поражения астроцитов это означает повышение утилизации глутамата в нейронах на энергетические нужды, при этом аспартат, вероятно, высвобождается и может быть активно захвачен астроцитами, где он накапливается вследствие дефицита КГ и отсутствия митохондриального аспартат/глутаматного обменника [Erecinska et al., 1993;

Bender et al., 1997; Xu et al., 2007].

Рис. 2. Динамика 7уровня некоторых аминокислот в мозге 6крыс при интоксикации ФАН, 51/2ЛД4контроль 3 часа 24 часа 321Аланин Лейцин Аспартат Глутамат Глутамин Лизин Тирозин % - 16 В почках крыс снижается уровень всех исследованных аминокислот, за исключением глутамина. Динамика уровня глутамина и глутамата в почках свидетельствует о характерной для ацидоза неспецифической адаптации, когда почкам удается компенсировать физиологические изменения биохимической перестройкой за счет захвата значительного количества глутамина из системного кровообращения. В печени уровень глутамина также не меняется, что объясняется усилением захвата глутамина при кратковременном голодании и стабильным синтезом этой аминокислоты перивенозными гепатоцитами в условиях голодания и метаболического ацидоза [Watford, 2000].

Влияние ФА/ФЦ на биоэнергетические и сигнальные процессы митохондрий (МХ) и клеток Действие токсического метаболита ФА – фторцитрата (ФЦ) мы изучали на митохондриях печени крысы (рис.3). Скорость защелачивания среды при добавлении AДФ существенно ниже в присутствии ФЦ, что свидетельствует об угнетении синтеза АТФ. Амплитуда защелачивания также уменьшена, что может быть обусловлено неполным синтезом АТФ, дополнительным трансмембранным перераспределением ионов Н+ или изменением константы связывания АДФ в присутствии ФЦ. ФЦ вызывает выход Са2+ из митохондрий, что соответствует наблюдаемому угнетению эндогенного потребления кислорода. Добавление субстратов окисления вызывает реаккумуляцию Са2+ в митохондрии. В присутствии ФЦ митохондрии только частично поглощают добавленный Са2+, после чего начинается его спонтанный выход. Это может быть связано с влиянием ФЦ либо на систему потребления кислорода, либо с непосредственным влиянием на систему Н+/Са2+ обмена. Для разрешения этой альтернативы была измерена скорость выхода Са2+ из МХ путем электронейтрального 2Н+/Са2+ обмена в присутствии ингибитора электрогенного транспорта Са2+ рутениевого красного. ФЦ активирует электронейтральный выход Са2+ при К1/2=10 мкМ. Это действие может быть связано с изменением состояния пиридиновых нуклеотидов (ПН), регулирующих активность Н+/Са2+ обмена [Leninger et al., 1978]. Таким образом, ФЦ оказывает влияние как на систему переноса электронов, так и на трансмембранный перенос ионов в митохондриях клеток печени.

Наблюдаемые эффекты при воздействии ФАН развивались при гораздо более высоких концентрациях (от 4 мМ) по сравнению с ФЦ и в значительной степени зависели от субстратов дыхания. Время окислительного фосфорилирования (ОФ) и уровень окисления NADH линейно увеличиваются при увеличении концентрации ФАН в среде инкубации, если в качестве субстрата служит пируват (рис.4). При использовании в качестве субстратов дыхания сукцината, но особенно глутамата, ФАН не оказывал влияния на ОФ митохондрий в таких высоких концентрациях как 8 мМ (рис.5А) и даже 16 мМ. Кроме того, эффект ФА при использовании пирувата можно предотвратить инкубацией МХ с циклоспорином А, ингибитором митохондриальной транзиторной поры (рис.5В). Это означает, что при воздействии ФАН - 17 возможно развитие митоптоза и апоптоза, открытие поры имеет обратимый характер, и предотвращение окисления и/или утечки NADH из МХ возвращает их в нормальное функциональное состояние.

Рис.3. Ингибирование дыхания митохондрий Рис. 4. Влияние фторацетата (ФА) на печени фторцитратом. Субстрат окисления – окислительное фосфорилирование (кружки) и пируват. Зависимости скоростей дыхания редокс-состояние ПН (квадраты) при активированного AДФ (V3), транспортом использовании пирувата в качестве кальция (VCa) и протонофором СССР (Vcccp) дыхательного субстрата.

от концентрации фторцитрата (FC).

Рис.5. Влияние ФАН (FA) на редокс-состояние ПН и окислительное фосфорилирование МХ печени крысы с глутаматом в качестве дыхательного субстрата (A) и предотвращение эффекта циклоспорином А (CsA) в случае использования пирувата (B). Добавки: (A) - 8 мМ ФАН (точки); непрерывная кривая – контрольный эксперимент; AДФ – 120 мкM; FCCP – 1 мкM. (B) - 10 мM ФАН; штрихи – без CsA, непрерывная линия – с 1 мкM CsA.

- 18 Эксперименты на МХ давали основания предполагать, что действие ФA на клетки будет в первую очередь связано с действием на мембранный потенциал МХ, уровень NAD(P)H и баланс внутриклеточного Са2+. Измерения флуоресценции NAD(P)H в контрольных клетках АКЭ и клетках, инкубированных с ФАН, показали медленное снижение флуоресценция под действием ФАН. Ингибирование ОФ олигомицином лишь незначительно восстанавливает в них NAD(P)H по сравнению с контрольными клетками, что свидетельствует о предшествующем ингибировании ОФ и уменьшении мембранного потенциала МХ. Введение небольшого количества FCCP (5 нМ) приводит к частичному окислению NAD(P)H, при этом относительный уровень окисления выше в присутствии ФAН, что также указывает на предшествующее ингибирование дыхательной цепи МХ. Полное окисление митохондриального NAD(P)H при действии FCCP с последующим восстановлением с помощью ротенона выявило общее уменьшение пула митохондриального NAD(P)H в клетках, инкубированных с ФАН. Это свидетельствует об окислении или утечке ПН из МХ, изменении в балансе митохондриального и цитозольного NAD(P)H. По сравнению с контрольными клетками, исходный уровень [Ca2+]i был несколько выше в клетках, инкубированных с 10 мМ ФАН. Уровень плато после импульсного подъема Ca2+ также повышен. ФАН, вероятно, приводит к истощению внутриклеточных Ca2+депо и активации входа внеклеточного Ca2+ через депо-зависимые каналы. Существование других кальциевых каналов, таких как TRPV5 и TRPV6 [Hoenderop et al., 2003; van de Graaf et al., 2006], которые остаются инактивированными при увеличении [Ca2+]i и, наоборот, активируются при понижении [Ca2+]i, побудило нас к измерениям уровня кальция в ретикулярных структурах клетки с помощью хлортетрациклина (ХТ). Измерив [Ca2+] в ЭР, можно получить информацию об активности P2Y и(или) IP3-рецепторов (по скорости уменьшения флуоресценции ХТ), о количестве Ca2+, выходящего из ЭР (по амплитуде понижения сигнала), а также о скорости и времени возвращения кальция в ЭР (по скорости увеличения сигнала к исходному уровню). ФЦ не действует на скорость выхода Ca2+ из ЭР (рис.6); т.о., система передачи сигнала от P2Yрецептора через G-белок не ингибируется в клетках АКЭ при действии ФЦ. Однако ФЦ незначительно увеличивает амплитуду выхода Ca2+ и скорость его закачки обратно в ЭР.

Следует отметить довольно большой период обратного входа кальция в ЭР (8-10 мин). Это свидетельствует о том, что после мобилизации внутриклеточного Са2+ и его выхода из ЭР в цитозоль Са-АТФаза плазматической мембраны быстро выкачивает ионы кальция из клеток, значительно уменьшая [Ca2+]i, при которой ионы кальция транспортируются обратно в ЭР. Ранее было показано [Zinchenko et al., 2001], что скорость обратного транспорта Са2+ в ЭР после его мобилизации зависит от активности кальциевых каналов плазматической мембраны. Т.о., наши данные свидетельствуют о том, что ФА (или ФЦ) индуцирует вход Са2+ в клетки АКЭ через депо-зависимые каналы.

- 19 Рис.6. Изменения [Са2+] в эндоплазматическом ретикулуме клеток АКЭ в ответ на действие АТФ (4,5 мкМ) в присутствии ФЦ, полученные с помощью хлортетрациклина. А: 1 - контроль, 2 - на фоне 10 мкМ ФЦ, 3 - на фоне 20 мкM ФЦ; Б - зависимость скорости обратного входа Са2+ в ЭР от концентрации ФЦ; повышение скорости возврата Са2+ при действии ФЦ имеет дозозависимый характер.

В экспериментах с эндотелиальными клетками в культуре мы показали, что ФА в милимолярных концентрациях вызывает медленное падение мембранного потенциала МХ и рост [Са2+]i. Снижение мембранного потенциала в присутствии нитроэфира DNPG (донор NO) значительно меньше, чем в его отсутствии, что свидетельствует о проявлении защитных свойств NO к действию ФА на эндотелий. В то же время, ФA вызывает увеличение базальной [Ca2+]i и стимуляцию функциональной активности кардиомиоцитов: наблюдается появление кальциевых волн, распространяющихся по поверхности саркоплазматического ретикулума, или же значительное усиление уже существующих волн и скорость их распространения. Одновременно наблюдали медленное увеличение мембранного потенциала МХ. Вероятно, повышение [Ca2+]i обусловливает его транспорт в MХ с последующим ингибированием протонной АТФaзы, что приводит к увеличению мембранного потенциала. Механизм этого явления объясняется действием Са2+-зависимого белка, ингибирующего Н+-АТФaзу [Hubbard, McHugh, 1996;

Евтодиенко и др., 2000].

Морфофункциональные признаки интоксикации фторацетатом Наиболее остро на воздействие ФАН в коре головного мозга (сенсомоторная область) отреагировала система кровеносных капилляров: за 3 часа произошло повреждение гематоэнцефалического барьера, особенно клеточных элементов сосудистой стенки (рис.7);

через сутки развилось нарушение микроциркуляции крови в виде капилляростаза и агрегации клеточных элементов крови (сладжи эритроцитов, адгезия тромбоцитов на стенках капилляров) (рис.8). Это свидетельствует об изменениях системного характера (гиповолемия) и (или) непосредственное воздействие ФА на те клетки крови, активность которых зависит от - 20 окислительного метаболизма МХ (напр., тромбоциты). Предполагается развитие диапедеза, воспалительных реакций вокруг поврежденных участков капиллярной сети, ишемия мозга.

Периваскулярная разновидность астроглии, составная часть ГЭБ, остро реагирует на состояние сосудистой стенки отеком ножек своих отростков (рис.7). Ранняя реакция нейронов на ФА не однозначна. Через 3 часа в некоторых нейронах активизировались синтетические процессы, о чем свидетельствует гиперплазия органелл и нарастание гиперхромности цитоплазмы. Другие подверглись протеолизу собственных лизосомальных ферментов, в результате в нормохромных клетках образовались очаговые просветления матрикса. Через сутки часть гиперхромных клеток в результате частичного восстановления трофики вернулись в нормальное состояние, благодаря образованию прямых контактов нейронов с сосудистой стенкой (рис.8). Среди субклеточных структур более выражено реагировали на интоксикацию ФА митохондрии. Через 3 ч отмечены патологические изменения синаптических специализаций, особенно в пресинаптических терминалях. Через 24 ч отмечено снижение числа синапсов и морфологические признаки нарушения проводимости нервных импульсов. Можно предположить реорганизацию синапсов и образование щелевых контактов, дублирующих несостоятельные синаптические контакты в качестве компенсаторной меры как эволюционно более ранние и энергетически более выгодные, хотя и менее специфичные – т.н. прямая трансмиссия [Connors, Long, 2004; Meier, Dermietzel, 2006]. Такое взаимодействие обеспечивает синхронизацию пороговой чувствительности и спайковой активности между кластерами нейронов, что имеет функциональное значение как в норме, так и в патологии, обусловливая соответствующие физиологические ритмы мозга при судорогах и эпилептогенезе [Perez-Velazquez, Carlen, 2000].

Рис.7. Кора головного мозга крыс, 3 ч после Рис.8. Кора головного мозга крыс, 24 ч после введения ФАН, ЛД50. Видны нарушения введения ФАН, ЛД50. Сладжи эритроцитов ГЭБ, поражен эндотелий микрососуда. х7000 в просвете капилляра. Нейрон контактирует с капилляром. х80 - 21 Морфологические свидетельства поражения ГЭБ и нарушения мозгового кровообращения, полученные нами данные о влиянии ФА на мембранный потенциал и динамику кальция в эндотелиальных клетках в культуре и о снижении нитрит-иона у животных в первые часы после отравления, а также данные других исследователей о нарушении сократимости сосудов при интоксикации ФА [Cremer-Lacuara et al., 1980; Johnson, Reid, 1988 и др.] давали основания предположить ослабление эндотелий-зависимых функций. Мы исследовали эндотелий-зависимую релаксацию сосудов аорты крыс при интоксикации ФАН.

Однако все использованные вещества оказывали качественно одинаковое воздействие на сократимость изолированной аорты контрольных и экспериментальных животных и через 3 часа, и через сутки после отравления. Очевидно, поражение эндотелия при интоксикации ФАН носит вторичный характер и является реакцией на системные нарушения метаболизма.

Рис.9. Изменения кинетических параметров агрегации тромбоцитов крыс при интоксикации ФАН, 1/2ЛД50.

* Р0.05; ** Р0. Для оценки кинетических параметров агрегации тромбоцитов в опытах с ФАН in vitro тромбоциты крыс преинкубировали с 0,1-10 мМ ФАН в течение 1-5 минут. Агрегацию тромбоцитов инициировали с помощью AДФ в диапазоне концентраций 10-100 нM. Рассчитаны среднеэффективные концентрации АДФ для клеток, проинкубированных с ФАН в концентрации 10 мM (ЕС50 = 25,24 нМ) и 5 мM (ЕС50 = 35,13 нМ). Величины ЕС50 характеризуют статус тромбоцитов, проинкубированных с ФАН, как гиперчувствительный к АДФ. Затем была проведена оценка кинетических параметров агрегации тромбоцитов крыс при интоксикации ФАН (рис.9). После получения плазмы отравленных животных часто наблюдалась спонтанная агрегация тромбоцитов, что соответствует данным о переходе тромбоцитов в гиперчувствительное состояние. Однако клетки, избежавшие агрегации, демонстрировали чрезвычайно высокий уровень десенситизации, или рефрактерность. В некоторых экспериментах АДФ не мог индуцировать агрегацию тромбоцитов в сверхвысоких (нефизиологических) концентрациях порядка 10 мкМ. Исследование динамики [Са2+]i в тромбоцитах кролика при - 22 интоксикации ФАА показало, что потеря чувствительности связана со снижением мобилизации кальция и объясняется уменьшением количества и/или снижением аффинности рецепторов.

В опытах in vivo и in vitro мы исследовали клетки иммунной системы. Тимус у животных через 18 часов после введения ФАН заметно уменьшен, выявлено значительное уменьшение общего количества тимоцитов и увеличение уровня апоптоза в свежевыделенных тимоцитах.

ФАН также вызывает ускорение апоптоза контрольных и дексаметазон-обработанных лимфоцитов человека. Однако ФАН in vitro ингибировал спонтанный апоптоз нейтрофилов.

Кроме того, ФАН практически не влиял на продукцию АФК перитонеальных макрофагов in vitro. Можно предположить, что ингибирующее действие ФАН на апоптоз нейтрофилов реализуется с участием АФК. В то же время, усиление апоптоза и угнетение активности клеток иммунной системы является, по-видимому, неспецифической реакцией на интоксикацию ФА и отражает общее снижение и перераспределение энергетических ресурсов организма при действии токсических веществ или стресса [Куценко, 2004; Мамучишвили, 2006].

Разработка терапии острых отравлений ФА и проверка ее эффективности. Представления о сопряжении и разобщении сигнализации и биологического окисления.

Анализируя научную литературу и проводя собственные эксперименты, мы убедились в том, что существует теоретическая и практическая основа для разработки эффективной терапии.

Прежде всего, мы предлагаем рассматривать метаболизм клетки как сопряжение сигнальных и окислительно-восстановительных процессов. Вообще под метаболизмом подразумевают обмен веществ, или совокупность катаболических и анаболических процессов, а понятие сопряжения обычно используется применительно к взаимосвязи дыхания и окислительного фосфорилирования. Мы полагаем, что и анаболические, и катаболические процессы в норме есть результат согласованного взаимодействия (сопряжения) информационных процессов (сигнализация) и процессов производства/потребления/диссипации энергии (биологическое окисление, частным случаем которого является дыхание). И катаболические, и анаболические процессы могут быть разобщены. Данное определение метаболизма помогает понять биологический смысл процессов, происходящих при интоксикации ФА, сформулировать концепцию причинно-следственных связей, принципы биохимической адаптации и фармакологической коррекции. Первичное снижение уровня NAD(Р)H приводит к угнетению митохондриального дыхания в клетках-мишенях, повышению [Са2+]i и повышению чувствительности клеток к активаторам; биологический смысл первой фазы интоксикации состоит в мобилизации альтернативных метаболических путей для поддержания дыхания клеток, и это возможно благодаря сопряжению сигнализации и биологического окисления.

Дефицит альтернативных субстратов и/или чрезмерное повышение уровня цитрата приводят к разобщению сигнальных и окислительных процессов: дальнейшее снижение уровня - 23 пиридиновых нуклеотидов, подавление аэробного дыхания, ингибирование гликолиза, хелатирование ионов кальция, десенситизацию клеток или их гибель; биологический смысл второй фазы ответа – снижение потребности клеток и тканей в энергии. Функциональная специфика первичных мишеней обусловливает динамику физиолого-биохимических реакций на уровне организма. Интегральная характеристика метаболизма как информационноэнергетического состояния - это редокс-потенциал клетки. Составляющие редокс-потенциала - это пиридиновые нуклеотиды, мембранный потенциал, макроэргические соединения и тепловая (энтропийная) компонента. Клетка, будучи открытой и неравновесной системой, существует благодаря сбалансированным во времени потокам вещества (источники восстановительных эквивалентов и акцепторы электронов), энергии (производство АТФ и обязательно тепла как важнейшего источника порядка в неравновесных условиях) и информации (сигнальные молекулы, ионы). Такое разделение в известной степени условно, эти потоки взаимосвязаны и взаимообусловлены: так, АТФ может служить источником энергии, а может выступать в качестве сигнальной молекулы; тепловая энергия может служить показателем эффективности функционирования митохондрий, а может рассматриваться как информационная (негэнтропийная) составляющая, обеспечивающая протекание биохимических процессов с оптимальной скоростью. Необходимо различать митохондриальные и цитоплазматические источники редокс-потенциала: это метаболические реакции, которые сбалансированы между собой, внеклеточными и внутриклеточными сигналами, в частности динамическими изменениями концентрации ионов кальция. Снижение уровня NADH в митохондриях обусловливает снижение уровня АТФ, что, в свою очередь, обусловливает адаптационное повышение [Ca2+]i (за счет снижения активности Са-АТФаз и депозависимого входа Са2+) с целью активации митохондриальных дегидрогеназ (ИЦДГ, КГДГ, ПДГ). Если дегидроненазы не активируются (нет субстратов или заблокирован путь утилизации продуктов), происходит генерация NADPH в цитоплазме и активация NADPH- и (или) Са-зависимых цитоплазматических процессов, например, генерация NO и (или) супероксид-аниона для «уборки» кальция в ретикулум посредством активации гуанилатциклазы или для «мягкого» разобщения дыхательной цепи и сброса восстановительных эквивалентов на 3-й участок дыхательной цепи; при этом NADPH может быть использован для синтеза глутатиона, который бы модулировал уровень АФК. Такое переключение биохимических процессов может принять неуправляемый, несбалансированный характер и привести к десенситизации или гибели клетки - это результат разобщения сигнализации и биологического окисления. Задача фармакологической коррекции состоит в поддержке сопряженного состояния сигнальных и окислительновосстановительных процессов, в осуществлении сбалансированного переключения на альтернативные метаболические пути.

- 24 Мы обозначили несколько основных направлений для биохимического воздействия при острой интоксикации ФА и предложили соответствующие препараты с целью разработки эффективной терапии: 1) конкурентное ингибирование взаимодействия ФА с КоА астроцитов;

2) конкурентное ингибирование ФЦ с аконитазой; 3) восстановление работы ЦТК дистальнее м-аконитазы; 4) утилизация накапливающегося цитрата. «Метис» – кодированное название комбинаций нескольких веществ, среди которых: метиленовый синий (МС), глутамат, нитроэфир и этанол. Учитывался плейотропный характер действия компонентов, что позволяет решать задачи «вспомогательного» характера: этанол - источник ацетата и NADH, пенетрант, влияет на аффинность NMDA и ГАМК рецепторов в ЦНС [Santhakumar et al., 2007], способствует перераспределению метаболической нагрузки между мозгом, печенью и мышцами;

глутамат - субстрат для глутаминсинтазы и N-ацетилглутаматсинтазы, естественный антиагрегант вследствие особого механизма воздействия на NMDA-рецепторы тромбоцитов, повышающий уровень цАМФ и снижающий синтез тромбоксана В2 [Franconi et al., 1996, 1998];

нитроэфиры способствуют смещению равновесия в NAD(P)Н-генерирующих реакциях, модулируют тканевое дыхание [Brown, Borutaite, 1999]; МС смещает равновесие NAD(P)Hгенерирующих реакций и модулирует действие NO, препятствует образованию супероксиданиона и пероксинитрита, оказывает центральное анксиолитическое действие и обратимо ингибирует моноаминоксидазу в ЦНС, модулирует терморегуляцию и теплопродукцию, «мягкий» разобщитель дыхательной цепи МХ [Шарова, Векшин, 2000; Гришина и др., 2000; Ryle et al., 1985; DeOliveira, Guimaraes, 1999; Riedel, Maulik, 1999; Ramsay et al., 2007]. Вещества и условия их применения были протестированы на экспериментальных животных. Варианты комплекса Метис представляют собой различные комбинации от двух до четырех соединений с максимальным коэффициентом эффективности 4,3 (табл. 2).

Табл. 2. Оценка эффективности терапии острых отравлений крыс Терапия Коэффициент эффективности (ЛД50 + леч. / ЛД50 без леч.) Этанол, n=42 1,Метис-1, n=48 2,Mетис-2, n=92 3,Mетис-4, n=39 4, Мы исследовали ряд физиологических и биохимических показателей при интоксикации ФАА и ФАН с применением терапии. У крыс, получавших терапию, отмечено улучшение динамики температуры тела и потребления кислорода, вес тела не уменьшается. Лечебный эффект комплексов проявляется в изменении динамики цитрата в мозге, почках и крови, коррекции параметров агрегации тромбоцитов. Результаты сравнительного анализа содержания - 25 ФА в гомогенатах органов, плазме крови и моче крыс при интоксикации без применения и с применением терапии показали, что комплексы «Метис» обусловливают значительное повышение уровня ФА (в 1,5-2 раза) в плазме крови и снижение этого уровня в 2 раза в ткани мозга крыс в первые часы после отравления, что свидетельствует о замедлении утилизации ФА в организме и прежде всего в клетках мозга. При этом следует отметить незначительное изменение динамики цитрата и ФА в сердце крыс по сравнению с мозгом при использовании комплексов «Метис», что является еще одним свидетельством первичности поражения и определяющей роли нервной системы в патогенезе интоксикации ФА.

ВЫВОДЫ 1. В основе патогенеза острой интоксикации фторацетатом у исследованных животных лежит поражение нервной системы. В связи с этим в выявлении факта интоксикации фторацетатом ключевую роль играют следующие клинические и морфофизиологические характеристики: у крыс это снижение двигательной активности с периодами гиперактивации и судорогами, отказ от корма и воды, снижение температуры тела, ишемические поражения мозга и миокарда, развитие дисфункции дыхательной системы, возникновение вегетативного дисбаланса с постепенным усилением влияния парасимпатической нервной системы.

2. Биохимические признаки интоксикации фторацетатом отражают метаболизм фторацетата, снижение интенсивности аэробного дыхания, переориентацию путей метаболизма клеток и утилизацию альтернативных энергетических субстратов. Наиболее ранние и выраженные изменения биохимических показателей отмечены в головном мозге отравленных крыс: это повышение концентрации фторацетата, фторид-иона, цитрата, аланина, глюкозы, снижение уровней гликогена, лактата, глутамата, глутамина, лейцина. В периферической крови наиболее выражены в первые часы интоксикации следующие отклонения: полное отсутствие глутамина, снижение уровня нитрит-иона, повышение концентраций фторацетата и цитрата.

3. На уровне изолированных клеток и митохондрий фторацетат или его метаболит фторцитрат подавляют сопряженное и разобщенное дыхание митохондрий, снижают уровень восстановленных пиридиновых нуклеотидов, способствуют повышению базального и индуцированного уровня цитоплазматического кальция, изменению мембранного потенциала митохондрий. В свою очередь, эти изменения могут стать причиной изменения чувствительности и функциональной активности клеток, влиять на развитие апоптоза и способствовать нарушению микроциркуляции.

4. Сформулирована концепция причинно-следственных связей при воздействии фторацетата на клетки, которая основана на понимании метаболизма клетки как сопряженного взаимодействия сигнальных и окислительно-восстановительных процессов. Согласно предложенной концепции, первичные метаболические изменения носят адаптационный характер - 26 и отражают сопряжение внутриклеточной сигнализации и биологического окисления.

Необратимое снижение редокс-потенциала клеток, десенситизация клеток или их гибель обусловлены разобщением сигнализации и биологического окисления. Задача фармакологической коррекции состоит в поддержке сопряжения сигнальных и окислительновосстановительных процессов, в осуществлении сбалансированного переключения на альтернативные метаболические пути.

5. Проведенный анализ метаболических сдвигов позволил определить основные направления для разработки эффективной терапии при острой интоксикации фторацетатом:

ингибирование взаимодействия фторацетата с коэнзимом А, ингибирование взаимодействия фторцитрата с аконитазой, восстановления протока в цикле Кребса дистальнее аконитазы и утилизация накапливающегося цитрата. В соответствии с этим, были разработаны комплексы серии «Метис», в состав которых входят: метиленовый синий, глутамат, нитроэфир и этанол.

Наибольшая терапевтическая эффективность показана для комплекса «Метис-4» - коэффициент эффективности 4,3 по ЛД50. Комплексы серии «Метис» нормализуют дыхание, температуру, вес тела и физическую активность животных, снижают утилизацию фторацетата и уровень цитрата в мозге крыс.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ В реферируемых журналах Музыкантов В.Р., Сахаров Д.В., Домогатский С.П., Гончаров Н.В., Данилов С.М., Смирнов В.Н. Защита эндотелиальных клеток от цитотоксического действия перекиси водорода посредством иммуноэритроцитов // Доклады АН СССР – 1986 - т.288 - №3 - с.748-750.

Гончаров Н.В., Сахаров И.Ю., Данилов С.М., Саканделидзе О.Г. Использование коллагеназы из гепатопанкреаса камчатского краба для выделения и культивирования эндотелиальных клеток крупных сосудов человека. // Бюлл. экспер. биол. мед.– 1987.– Т.103.- №9.- с.376-378.

V.R.Muzykantov, D.V.Sakharov, S.P.Domogatsky, N.V.Goncharov, S.M.Danilov. Directed targeting of immunoerythrocytes provides local protection of endothelial cells from damage by hydrogen peroxide. // Amer. J. Pathol. - 1987.- V.128.- №2.- p.276-285.

V.R.Muzykantov, D.V.Sakharov, V.V.Sinitsyn, S.P.Domogatsky, N.V.Goncharov, S.M.Danilov. Specific killing of human endothelial cells by antibody-conjugated glucose oxidase. // Analytical Biochemistry.- 1988.- V.169.- Р.383-389.

Григорян Г.Ю., Мирзапоязова Т.Ю., Никашин А.В., Гончаров Н.В., Данилов С.М.

Идентификация и характеристика -адренергических рецепторов в мембранах культивируемых клеток эндотелия легочной артерии человека // Проблемы эндокринологии. – 1989. – Т.35. - №4.

– 212-216.

Зерниченко А.Н., Гончаров Н.В. Мотивационный процесс, структура личности и трансформация энергии потребностей. // Вопросы психологии. – 1989. - №2. - с.73-81.

Сергеенко Н.Г., Глашкина Л.М., Гончаров Н.В. О механизме токсического действия Т-токсина // Гигиена и санитария. – 1992. – №5-6.- с.45-47.

Теплова В.В., Евтодиенко Ю.В., Холмухамедов Э.Л., Сергеенко Н.Г., Гончаров Н.В.

Влияние фторцитрата на потребление кислорода и транспорт Са2+ в митохондриях клеток печени // Цитология. – 1992.- т.34.- №11/12.- с.69-73.

Кузнецов С.В., Гончаров Н.В., Глашкина Л.М. Изменение параметров функционирования сердечно-сосудистой и дыхательной систем у крыс разного возраста под - 27 воздействием малых доз ингибитора холинэстераз фосфакола // Ж-л эволюционной биохимии и физиологии. – 2005. - т.41. - №2. - с.160-167.

Гончаров Н.В., Кузнецов А.В., Радилов А.С. Современные представления о токсикологии фторацетата. // Токсикологический вестник – 2005. - №5. – с.31-44.

Goncharov N.V., Jenkins R.O., Radilov A.S. Toxicology of fluoroacetate: a review, with possible directions for therapy research. // J. Appl. Toxicol. – 2006. – V.26. - #2. – P.148-161.

Mindukshev I.V., Jahatspanian I.E., Goncharov N.V., Jenkins R.O., Krivchenko A.I. A new method for studying platelets, based upon the low-angle light scattering technique. 1. Theoretical and experimental foundations of the method. // Spectroscopy Int. J. – 2005. – V.19. - #5-6. – P.235-246.

Mindukshev I.V., E.E.Ermolaeva, E.V.Vivulanets, E.Yu. Shabanova, N.N. Petrishchev, N.V.Goncharov, R.O. Jenkins, A.I. Krivchenko. A new method for studying platelets, based upon the low-angle light scattering technique. 2. Application of the method in experimental toxicology and clinical pathology. // Spectroscopy Int. J. – 2005. – V.19. - #5-6. – P.247-257.

Mindukshev I.V., Goncharov N.V., Shabanova E.Yu., Ermolaeva E.E., Mironova M.O., Radilov A.S., Jenkins R.O., Krivchenko A.I.. A new method for studying platelets, based upon the lowangle light scattering technique. 3. Aggregation hypersensitivity of platelets (ADP agonist) and search for corrective agents. // Spectroscopy Int. J. – 2006. – V.20. - #2. – P.57-66.

Zinchenko V.P., Lee V.V., Berezhnov A.V., Mindukshev I.V., Jenkins R.O., Goncharov N.V.

Application of a low-angle light scattering technique to cell volume and cell signaling studies on Ehrlich ascite tumor cells. // Spectroscopy Int. J. – 2006. – V.20. - #2. – P.45-55.

Goncharov N., A. Kuznetsov, L. Glashkina, A. Radilov. Fluoroacetate: Search for effective therapy // The Toxicologist. – 2006. – V.90. - #1. - p.479.

Koryagina N.L., Savelieva E.I., Khlebnikova N.S., Goncharov N.V., Jenkins R.O., Radilov A.S. Determination of fluoroacetic acid in water and biological samples by GC-FID and GC-MS in combination with solid-phase microextraction. // Analytical Bioanalytical Chemistry. – 2006. – V.386. - #5. – P.1395-400.

Цимбал Ф.А., Цимбал М.В., Субботина С.Н., Гончаров Н.В., Глашкина Л.М.

Исследование порога чувствительности метода пупиллометрии при интоксикации фосфорорганическими соединениями // Токсикологический Вестник – 2007 - №1 – с.26-29.

Корягина Н.Л., Савельева Е.И., Гончаров Н.В., Хлебникова Н.С., Радилов А.С.

Применение метода газовой хроматографии с ионизационно-пламенным и масс-селективным детектированием для определения содержания фторацетата натрия в воде и биомедицинских пробах // Токсикологический Вестник – 2007 - №1 – с.29-35.

Kuznetsov S.V., Jenkins R.O., Goncharov N.V. Electrophysiological study of infant and adult rats under acute intoxication with fluoroacetamide // J. Appl. Toxicol. – 2007. – V.27. - #6. – P.538550.

Mindukshev I.V., V.V. Krivoshlyk, E.E. Ermolaeva, I.A. Dobrylko, E.V. Senchenkov, N.V.Goncharov, R.O. Jenkins and A.I. Krivchenko. Necrotic and apoptotic volume changes of red blood cells investigated by low-angle light scattering technique // Spectroscopy Int. J. – 2007. – V.21. - #2. – P.105-120.

Zinchenko V.P., N.V. Goncharov, V.V. Teplova, V.A. Kasymov, O.I. Petrova, A.V.

Berezhnov, E.V. Senchenkov, I.V. Mindukshev, R.O. Jenkins, A.S. Radilov. Polarographic and spectroscopic studies of the effects of fluoroacetate/fluorocitrate on cells and mitochondria // Spectroscopy Int. J. – 2007. – V.21. - #2. – P.121-134.

Goncharov N., A. Kuznetsov, L. Glashkina, A. Radilov. New therapy to treating acute intoxications with fluoroacetate and other poisons // The Toxicologist. – 2007. – V.96. -#1 – P.208.

Mindukshev I., N. Goncharov, E. Ermolaeva, I. Dobrylko, E. Senchenkova, M. Mironova, R.

Jenkins, A. Radilov, A. Krivchenko. A new method for studying platelets, based upon the low-angle light scattering technique, and its application in experimental toxicology // The Toxicologist. – 2007. – V.96. - #1. - P.437.

Радилов А.С., Нагорный С.В., Рембовский В.Р., Ермолаева Е.Е., Савельева Е.И., Гончаров Н.В., Корягина Н.Л., Цибульская Е.А., Хлебникова Н.С., Цимбал Ф.А. Токсикологогигиеническая оценка опасности отходов бывших предприятий по производству и использованию отравляющих веществ // Рос. хим. журнал. – 2007. – т.LI. - №2.- с.77-82.

- 28 Зинченко В.П., Н.В. Гончаров, В.В. Теплова, В.А. Касымов, О.И. Петрова, А.В.

Бережнов, Е.В. Сенченков, И.В. Миндукшев, Р.О. Дженкинс, А.С. Радилов. Изучение взаимосвязи внутриклеточных сигнальных и метаболических путей при ингибировании митохондриальной аконитазы фторацетатом // Цитология – 2007. -– Т.49. - №12. – с.1023-1031.

Материалы научных конференций Никашин А.В., Мирзапоязова Т.Ю., Гончаров Н.В., Данилов С.М., Григорян Г.Ю.

Гормональная регуляция уровня циклических нуклеотидов в культуре пассируемого эндотелия легочной артерии и пупочной вены человека. // Тез. конф. «Кровообращение в условиях высокогорной и экспериментальной гипоксии». - 1986. – г.Фрунзе - с.124-125.

Музыкантов В.Р., Сахаров Д.В., Домогатский С.П., Гончаров Н.В., Данилов С.М.

Применение коньюгатов каталазы и глюкозооксидазы с антителами для иммуно-селективного воздействия на эндотелиальные клетки в культуре. // Тез. II Всесоюз. Конференции «Биоантиоксидант». - 1986. –Черноголовка. - с.139.

Гончаров Н.В., Глашкина Л.М., Кузнецов А.В., Радилов А.С. Новые антидоты или универсальные антигипоксанты? // Проблемы стандартизации в здравоохранении.– 2001.- №1.- С.141.

Гончаров Н.В., Миндукшев И.В., Радилов А.С., Кузнецов А.В., Добрылко И.А. Влияние малых доз VX на тромбоцитарное звено гемостаза крыс в хроническом эксперименте. // Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности. Материалы Российской научной конференции.- ВМА, СПб.- 2001.- С.281-284.

Гончаров Н.В., Сергеенко Н.Г., Кузнецов А.В., Глашкина Л.М. Фторацетаты: механизм токсического действия и разработка терапии острых отравлений. // Труды научно-практической конференции, посвященной 40-летию НИИ ГПЭЧ. - СПб, 2002. - с.165-174.

Гончаров Н.В., Глашкина Л.М., Кузнецов А.В., Радилов А.С. Токсическое действие фторацетатов и разработка эффективных средств терапии // Материалы международного симпозиума по антитерроризму.- Волгоград, 2002 г., с.49-51.

Goncharov N.V., Radilov A.S., Mindukshev I.V., Yermolayeva Ye.Ye., Kuznetsov S.V., Glashkina L.M., Dobrylko I.A., Kuznetsov A.V. Effects of RVX Low Dose Chronic Exposure on Rat Platelet Aggregation and Physiology of Nerve Fibres. // In: Economy, Logistic, and Ecology in Armed Forces III. International Scientific Conference in Brno, 2003. P.63-70.

Гончаров Н.В., Глашкина Л.М., Кузнецов А.В., Радилов А.С. Действие фторацетата на кальциевый баланс и сигнальное сопряжение в тромбоцитах. // В сб.: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Труды международной конференции. – Пущино, 16-18 июня 2003. – С. 54-56.

Гончаров Н.В., Л.М.Глашкина, А.В.Кузнецов, А.С.Радилов. Токсическое действие фторацетатов и разработка эффективных средств терапии. // 2-й съезд токсикологов России.

Москва, 10-13 ноября 2003 г. Тезисы докладов. С.330-331.

Goncharov N., A. Radilov, E. Ermolaeva, L. Glashkina, I. Mindukshev, S. Kuznetsov, A.

Khatkevich, P. Avdonin, and A. Kuznetsov. On pathogenesis of delayed effects of RVX and other organophosphates low-dose chronic exposure // Proceedings of the 8th International Symposium on Protection against Chemical and Biological Warfare Agents (including bioterrorism) Gothenburg, Sweden 2-6 June 2004. P.32.

Гончаров Н.В., А.С.Радилов, Е.Е.Ермолаева, Л.М.Глашкина, А.Н.Хаткевич, П.В.Авдонин, И.В.Миндукшев, С.В.Кузнецов, И.А.Гамалей, К.М.Кирпичникова, А.В.Кузнецов.

Экспериментальное изучение патогенеза при хроническом действии малых доз фосфорорганических соединений // Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности. Материалы Российской научной конференции.- ВМА, СПб.- 2004.- С.32.

Гончаров Н.В., Л.М.Глашкина, В.П.Зинченко, В.В.Теплова, С.В.Кузнецов, А.В.Кузнецов, А.С.Радилов. Фторацетат: биоэнергетика, сигнализация и терапия острых отравлений. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» 6-9 июня 2005 - Пущино. - С.235-2 Глашкина Л.М., Н.В.Гончаров, Е.И.Савельева, Н.Л.Корягина, Т.А.Кузнецова, А.И.Николаев, М.О.Миронова, А.С.Радилов. Биохимические механизмы адаптации при блокаде - 29 цикла Кребса фторацетатом // Научные труды I съезда физиологов СНГ.- Под ред.Р.И.Сепиашвили.- т.1.- М:Медицина-Здоровье, 2005.- с.12.

Гончаров Н.В., С.В.Кузнецов, В.П.Зинченко, В.В.Теплова, Л.М.Глашкина, Е.Е.Ермолаева, М.О.Миронова, А.В.Кузнецов, А.С.Радилов. Механизмы развития тканевой гипоксии при действии фторацетата и поиск эффективных антигипоксантов. // Научные труды I съезда физиологов СНГ.- Под ред.Р.И.Сепиашвили.- т.1.- М:Медицина-Здоровье, 2005.- с.171.

Radilov A., N. Goncharov, L. Glashkina, A. Kuznetsov, E. Ermolaeva, M. Mironova.

Fluoroacetate: New Therapy for Old Poison. // CBMTS Industry IV. The Third World Congress on Chemical, Biological and Radiological Terrorism. – Dubrovnic, Croatia, 17-23 September 2005. #58, p.40-41.

Savelieva E., N. Goncharov, N. Koryagina, A. Radilov. New Method for Fluoroacetate Identification and Quantitative Determination in Biological Samples. // Pittcon-2006, Orlando, 12-March 2006. - 1520-13P.

Goncharov N., Glashkina L., Kuznetsova T., Ermolaeva E., Mironova M., Paramonova N., Kuznetsov S., Shabanova E., Vinokurov M., Avdonin P., Mindukshev I., Radilov A. Fluoroacetate:

Physiological, Biochemical and Morphological Signs of Intoxication in Laboratory Experiments // 16th Nordic Conference on Forensic Medicine, Turku, 15-17 June 2006. Proceedings, Abst. O18, p.22.

Savelyeva E., Koryagina N., Goncharov N., Radilov A. A New Sensitive Method for Fluoroacetate Identification in Animal Tissues. // 16th Nordic Conference on Forensic Medicine, Turku, 15-17 June 2006. Proceedings, Abstract O19, p.22.

Гончаров Н.В., А.В. Кузнецов, Л.М. Глашкина, А.С.Радилов. Разработка новой неспецифической терапии для лечения острых отравлений фторацетатами и другими ядами // 3-я Международная научно-практическая конференция «Новые технологии создания инновационных лекарств. От достижений «постгеномной эры» к национальным фармацевтическим брендам». 01.12.2006, Химки. Сборник трудов, с.12.

Гончаров Н.В., Зинченко В.П., Теплова В.В., Миндукшев И.В., Винокуров М.Г., Авдонин П.В., Петрова О.И., Бережнов А.В., Глашкина Л.М., Радилов А.С. О механизмах адаптации клеток и тканей при ингибировании митохондриальной аконитазы фторацетатом // Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 5-7 июня 2007 г., с.291-295.

Goncharov N.V., Jenkins R.O., Radilov A.S. Fundamental and Applied Research on Fluoroacetate. // Proceedings BII Program Review conference. – Pushchino.- 20-22 Oct 2007.– P.17.

Mindukshev I.V., Krivoshlyk V.V., Ermolaeva E.E., Jenkins R.O., Goncharov N.V. Low-Angle Light Scattering Technique in Clinical Pathology and Experimental Toxicology. // Proceedings BII Program Review conference. – Pushchino. - 20-22 Oct 2007. – P.24-25.

Авторские свидетельства и права Смирнов М.Д., Самохин Г.П., Данилов Ю.Н., Данилов С.М., Алликметс Е.Ю., Мартынов А.В., Гончаров Н.В. Способ выделения клеток эндотелия из суспензии клеток животного происхождения // Авторское свидетельство №1341771 от 01.06.1987.

Рудин А.В., Данилов С.М., Попов Н.В., Гончаров Н.В., Мартынов А.В., Домогатский С.П. Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, используемый для получения моноклональных антител к поверхности эндотелиальных клеток пупочной вены человека // Авторское свидетельство №1362746 от 01.09.1987.

Goncharov N.V., Kuznetsov A.V., Glashkina L.M., Radilov A.S. Compositions and methods for treating intoxications // PCT 23.03.2007 - Steptoe & Johnson LLP (USA), Ref. 14940.0006 - Gorodissky & Partners (Russia), Ref. 2420-300868RU/0






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.