WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Шаповалова Елена Михайловна

МЕХАНИЗМЫ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ СДВИГОВ ПРИ ОТСУТСТВИИ, ДЕФИЦИТЕ И ИЗБЫТКЕ ВИТАМИНОВ С АНТИОКСИДАНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ В РАЦИОНЕ ПИТАНИЯ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Челябинск - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Бышевский Анатолий Шулимович

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Захаров Юрий Михайлович доктор биологических наук Лунева Светлана Николаевна доктор биологических наук, профессор Фатеева Надежда Михайловна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Москва

Защита состоится «30» апреля 2010 года в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.295.03 при ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» по адресу: 454080, г. Челябинск, проспект В.И.

Ленина, д. 69.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет», г. Челябинск.

Автореферат разослан «____»____________2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Ефимова Н.В.

Общая характеристика работы

. Витамины рассматривают не только как соединения, дефицит которых ведет к специфическим нарушениям; важные функции организма, в их числе и свободнорадикальное окисление, зависят от обеспеченности витаминами (М.И.Смирнов, 1974; П.Н.Шараев, 2004; А.Ш.Бышевский и др., 2007; J.K.Campbell e.a., 2004; A.Opperhuizen e.a., 2005; С.Weiss e.a., 2005;

A.K.Shirakawa, 2008). Рано сформировавшиеся представления о связях витамина С с метаболизмом (С.Д.Певзнер, 1940) относят ко всем витаминам (В.В.Ефремов, 1969; М.И.Смирнов, 1974; C.Weiss e.a., 2005; A.K.Shirakawa, 2008). Взгляд на них как на средства профилактики и лечения гиповитаминозов сменился представлением как о соединениях, определяющих за счет неспецифических свойств характер метаболизма и устойчивость организма (Б.А.Лавров 1957), и это расширило область их применения.

К заболеваниям, в лечении которых используют витамины, относят и протекающие с нарушениями гемостаза, некоторые из них эффективны и при заболеваниях с явлениями гипероксидации (A.Opperhuizen, 2008), особенно витамины с антиоксидантными свойствами (В.П.Мищенко, 1981, 2005; А.Ш.Бышевский и др., 2003, 2009; M.P.Iqbal e.a., 2005; M.R. BiaginiH e.a., 2006; Y.Nadir e.a., 2007). В поH следние годы выявлено их влияние не только на отдельные прокоагулянты, но и на уровень маркеров гемостаза, отражающий наклонность к кровоточивости или тромбофилии. Появились и первые оценки интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК) в связи с витаминной обеспеченностью, выявлены связи между уровнем маркеров НВСК с липидпероксидацией (ЛПО) (А.Ш.Бышевский и др., 2005; В.П.Мищенко и др., 2005). Утвердилось представление о том, что физиологический процесс НВСК, усиливаясь, может перерасти в диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови (Д.М.Зубаиров, 1978, 1989, 2000; А.Ш.Бышевский и др., 1990). Появились основания выстроить в зависимости от скорости НВСК ряд, который отражает его связь с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием. Полагают, что сдвиги НВСК, оцениваемые по уровню его маркеров, позволяют выявить наклонность к внутрисосудистому тромбообразованию, как к следствию усиленного тромбиногенеза (З.С.Баркаган, 1998; И.Н.Бокарев, 2002; M.Lomtadze e.a., 2005; H.W.Park e.a., 2005). Обращает на себя внимание ещё и следующее: в лечении заболеваний с нарушениями гемостаза чаще других используют витамины А, Е, ВB B, ВB B и С; при 5 изучении связи витамины-гемостаз не оценивался исходный уровень обеспеченности витаминами организма подопытных животных, и редко использовались рационы, сбалансированные по нутриентам; не всегда учитывается витаминная обеспеченность организма пациентов, что позволяет критически оценивать выводы о дозазависимости эффекта витаминов на гемостаз, так как эффекты от введения витамина, зависят от его исходного уровня в организме (А.Ш.Бышевский и др., 2006; K.HGroenbaek e.a., 2006); до 80 гг. эффекты витаминов на гемостаз опиH сывали без учета их антиоксидантных свойств; влияние витаминов на интегральный показатель состояния гемостаза (толерантность к тромбину), отражающий ответ организма на гипертромбинемию, не изучали, единичны и сведения об их влиянии на интенсивность НВСК - величину, обратную толерантности к тромбину (Р.Г.Алборов и др., 2005; A.Sh.Byshevsky e.a., 2008); результаты изучения отдельных про- и антикоагулянтов, компонентов плазминовой системы в силу их противоречивости не позволяют оценить эффекты на гемостаз отсутствия, дефицита или избытка витаминов; экспериментаторы крайне редко изучали обеспеченность организма витаминами, использовали рационы питания, в которых баланс нутриентов, в их числе и витаминов, не учитывали.

Всё это обосновывает актуальность дальнейших исследований для решения вопроса, возникшего в ХХ столетии - целесообразно ли использовать витамины А, Е, ВB B, ВB, С и особенно их комбинации для коррекции гемостатических сдвиB 5 гов при заболеваниях, протекающих с гиперкоагуляцией.

Цель исследования – экспериментально установить закономерности изменения интегральных показателей состояния гемостаза (непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантности к тромбину), липидпероксидации и антиоксидантного потенциала тромбоцитов в отсутствии, при дефиците или избытке витаминов А, Е, ВB, ВB и С, а также при избытке их сочетаний.

B B 5 Предполагалось, что анализ влияния на гемостаз намеченных нами к изучению и широко используемых в медицинской практике витаминов А, Е, ВB, ВB и B B 5 С углубит представления о связи и механизмах их действия на систему свертывание крови, одна из значимых физиологических функций которой - защитная реакция организма на гипертромбинемию.

Задачи исследования 1. Установить, как изменяется в плазме крови уровень факторов РB, РB, фибриB B 3 ногена, продуктов деградации фибрина, растворимых комплексов мономерного фибрина и D-димеров, интенсивность липидпероксидации, антиоксидантный потенциал тромбоцитов и толерантность к тромбину в отсутствии витамина А, его дефиците и избытке в пищевом рационе, сбалансированном по остальным макро- и микронутриентам.

2. Изучить, как изменяются эти величины в отсутствии, при дефиците и избытке витаминов Е, ВB, ВB, С в аналогичных экспериментальных условиях.

B B 5 3. Изучить активность фибринолиза в эуглобулиновой фракции плазмы, а также активированное время рекальцификации и активированное частичное тромбопластиновое время, как показателей общей свертываемости крови.

4. Изучить физиологические эффекты сочетанного введения тех же витаминов при их избыточном поступлении с пищевым рационом.

В экспериментах мы сочли необходимым применять в качестве авитаминного рациона такой, в котором отсутствует только один из изучающихся в отдельном опыте витамин; как модель дефицита витамина применять пищевой рацион, содержащий исследуемый витамин в количестве, равном 25, 50 или 75% от суточной потребности; как модель избытка - рацион с двух-, четырёх-, восьми- и 16кратным избытком витамина относительно суточной потребности в нём.

Дизайн экспериментов Оценить фибринолиз, уровни маркеров НВСК, интенсивность ЛПО и АОП при питании крыс рационом, в состав которого не включен витамин А, Е, ВB, ВB B 5 или витамин С:

1. При питании рационом, не содержащим витаминов А, Е, ВB, ВB (крысы) или B B 5 витамина С (морские свинки).

2. На фоне прооксиданта или антиоксиданта.

B 3. При длительном введении избытка витаминов А, Е, ВB B и ВB (крысы).

5 4. При внутривенном введении избытка витамина РB B (однократно и повторно, крысы) 5. При введении избытка витаминов А, Е, ВB, ВB B и С в сочетаниях по 2, 3, 4 и 5.

B 5 Научная новизна - Экспериментально доказано, что отсутствие витамина А, Е, ВB илиB ВB в раB B B 5 ционе аскорбатнезависимых (крысы) и витамина С в рационе аскорбатзависимых животных (морские свинки) активирует липидпероксидацию, снижает антиоксидантный потенциал тромбоцитов, ускоряет непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и ослабляет защитную реакцию организма на гипертромбинемию.

- Впервые определено, что у животных содержащихся на моноавитаминном рационе питания, сдвиги в гемостазе причинно связаны с отсутствием данного витамина - введение в рацион витамина А, Е, ВB B или ВB B в дозах, равных 25, 5 или 75% суточной потребности, ослабляет сдвиги (от 1,2 до 1,8 раза соответственно, р < 0,05), в дозах, превышающих потребность в 2 раза, предупреждает их появление, а в дозах 4-х, 8-и и 16-кратных - достоверно тормозит липидпероксидацию, повышает антиоксидантный потенциал, снижает коагулоактивность тромбоцитовB и уровень маркеров непрерывного внутрисосудистого B свертывания крови, одновременно увеличивая толерантность к тромбину (р < 0,05).

- Найдено, что отсутствие и избыток витамина А, Е, ВB B или ВB B сопровож5 дается сдвигами интегральных показателей состояния гемостаза за счет антиоксидантных свойств.

- Обнаружено, что связи между сдвигами непрерывного внутрисосудистого свертывания крови в отсутствии в рационе одного из витаминов ассоциированы со сдвигами липидпероксидации положительно, с изменениями АОП - отрицательно; что эти связи более выражены в эффектах витаминов А, Е и ВB (rB = 0,82), и менее выразительны (rB = 0.48) в эффектах витаминов ВB B и С, B B B 12 s s что избыток витамина А, Е, ВB, или ВB B в количествах, эквивалентных лечебB 5 ным дозам, замедляет непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, ускоряет фибринолиз в эуглобулиновой фракции плазмы и повышает толерантность к тромбину.

- Выявлена высокая индивидуальная вариабельность сдвигов в отсутствии и избытке ниацина в рационе и что его внутривенное введение быстро и дозазависимо повышает общую свертываемость крови, сменяющуюся вскоре гипокоагуляцией, и что при повторных внутривенных введениях этот ответ ослабляется.

- Впервые показано, что отсутствие витамина С в рационе аскорбатзависимых животных активирует липидпероксидацию и снижает антиоксидантный потенциал в тромбоцитах уже через 2 недели, усиливая высвобождение факторов РB B и РB, и что при длительном (свыше шести недель) С-авитаминном питаB 3 нии уровень этих факторов в плазме снижается на 12,5 и 16,6% соответственно относительно контроля (р < 0.05).

- Впервые установлена фазность влияния С-авитаминного питания и введения витамина С в избытке на липидпероксидацию в тромбоцитах и на сдвиги в гемостазе аскорбатзависимых и аскорбатнезависимых животных.

Теоретическая и практическая значимость. На основании анализа изменения показателей, характеризующих коагулоактивность тромбоцитов, непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, ф.XIIа-зависимый фибринолиз и толерантность к тромбину у животных, содержавшихся на сбалансированном рационе питания, из которого исключали один из витаминов - А, Е, ВB, ВB, С B B 5 (последний у аскорбатзависимых и аскорбатнезависимых животных) или получавших эти витамины в избытке, эквивалентном лечебным дозам, установлено следующее.

Отсутствие витамина А, Е, ВB Bили ВB B в рационе, сбалансированном по ос5 тальным нутриентам, ускоряет ЛПО и снижает АОП в тромбоцитах - клетках, участвующих в поддержании ЛПО на физиологическом уровне. Показано, что синхронно с этим ускоряется НВСК, снижается фибринолиз и защитная реакция организма на гипертромбинемию, следовательно, и на появление в кровотоке микромицелл - фрагментов клеточных мембран. Доказано, что сдвиги в гемостазе, возникающие при содержании животных на рационе питания, из которого исключен витамин А, Е, ВB Bили ВB, реализуются за счет ускорения B 6 ЛПО и снижения АОП тромбоцитов, так как при введении в моноавитаминный рацион отсутствующего витамина в дозах ниже потребности, сдвиги ЛПО и гемостаза ослабляются, а при дозе, в 2 раза превышающей суточную потребность, не возникают.

Новыми являются данные, указывающие, что избыток одного из этих витаминов в рационе угнетает пропорционально дозе и длительности введения ЛПО в тромбоцитах и повышает их АОП, активирует ф.ХIIа-зависимый фибринолиз, замедляет высвобождение факторов РB, РB и непрерывно протекаюB B 3 щее с малой интенсивностью внутрисосудистое свертывание и, как следствие, увеличивает способность организма реагировать на гипертромбинемию. Получено и дополнительное свидетельство того, что эффект этих витаминов на гемостаз реализуется через их антиоксидантные свойства - эффект каждого из витаминов на ЛПО, АОП и гемостаз поддерживается введением антиоксиданта невитаминной природы и подавляется введением прооксиданта.

Данные, полученные при изучении эффекта избытка одного из четырёх витаминов (А, Е, ВB B или ВB ) в дозах, эквивалентных лечебным, замедляют B 5 НВСК, ускоряют фибринолиз и увеличивают ТкТР, что указывает на перспективность их применения для коррекции тромбофилических сдвигов при заболеваниях, которые сопровождаются оксидативным стрессом.

Важным является и установление того факта, что эффекты ниацина на НВСК и ТкТР вариабельнее, чем эффекты остальных исследованных витаминов, и что при его внутривенном введении влияние на гемостаз двухфазно: рост общей свертываемости сменяется снижением из-за компенсаторной активации фибринолиза.

Найдено, что отсутствие витамина С в рационе аскорбатзависимых животных ускоряет ЛПО и снижает АОП тромбоцитов, но усиливает (в отличие от других витаминов высвобождение фф. РB B и РB, а при длительном С-авитаB 3 минном питании (8 недель) уровень фф. РB B и РB B снижается, замедляется фиб3 ринолиз и падает ТкТР. Эти сдвиги ослабляются при наличии в рационе аскорбата в дозе, равной 25, 50 или 75% потребности, и не возникают при введении в рацион удвоенной против потребности дозы. Особенно важно, что при потреблении с рационом аскорбата в дозах, эквивалентных лечебным, сдвиги, вызываемые его дефицитом или отсутствием в питании, не выявляются до 6-й недели, но при дозах, превышающих потребность в 4, 8 и 16 раз, после шести недель ускоряется ЛПО и снижается АОП тромбоцитов, ускоряется НВСК и растет толерантность к тромбину, обусловленная активацией фибринолиза.

Существенное значение имеют данные о том, что введение аскорбата аскорбатнезависимым животным в дозе, превышающей потребность в 8 раз, антиоксидантный эффект проявляется в первые две недели, а позднее ЛПО ускоряется, а рост АОП сменяется снижением при одновременном ускорении НВСК.

При введении шестнадцатикратной дозы аскорбата кратковременно длящийся антиоксидантный эффект сменяется прооксидантным, сопровождаясь ускорением НВСК. Это доказательно свидетельствует о связи эффекта аскорбата на гемостаз с его влиянием на скорость липидпероксидации.

Экспериментально обнаружено, что сдвиги НВСК при исключении из рациона одного из витаминов (А, Е, С, ВB B или ВB ) положительно ассоциироваB 5 ны с изменениями ЛПО, и отрицательно - с изменениями АОП, что связи эти тесны (rB > 0.9) в эффектах, вызываемых витаминами А, Е и ВB,B и менее тесны B B B s в эффектах витаминов ВB B и С (rB B < 0.7). Установлено, что по степени сдвигов 5 s при авитаминозе интегрального показателя (ТкТР) витамины практически равноценны (лишь менее, чем у остальных выражен эффект отсутствия в питании витамина ВB ), а по степени влияния избытка витаминов на толерантB ность к тромбину и по скорости развития эффекта они располагаются в последовательности А > Е > ВB B > С > ВB.

B 12 Математический анализ выявил, что сдвиги НВСК при всех исследованных нами авитаминных рационах питания отрицательно ассоциированы с изменениями толерантности к тромбину - тесная связь эффекта витаминов А, Е (rB > 0.9) и менее тесная - витаминов ВB, ВB B и С (rB < 0.7); изменения толерантB B B s 12 5 s ности к тромбину положительно ассоциированы с фибринолизом.

Доказано экспериментально, что введение всех возможных сочетаний витаминов по два (А-Е, А-ВB, А-ВB Е-ВB, Е-ВB, ВB -ВB )B повышает степень B B B B B B B 5 12, 5 12 5 прироста ТкТР, при всех сочетаниях по три это заметнее, и ещё заметнее при сочетаниях по четыре, показано что наибольший эффект свойственен сочетанию, включающему все пять витаминов (если доза аскорбата не проявляет прооксидантных свойств, т.е ниже четырёхкратной относительно суточной потребности).

Внедрение в практику. Совместно с Тюменским отделением Всероссийского физиологического Общества им. И.П.Павлова, с сотрудниками кафедр биологической химии, акушерства и гинекологии ТГМА разработаны и внедрены для использования в лечебных учреждениях г. Тюмени (ГЛПУ ТО ОКБ № 2, ГЛПУ ТО ОКБ № 1) и области (МУЗ «ЦРБ» г. Надым, ГУЗ «СОКБ» г. Салехард) методические рекомендации, оформленные актами: «Эффекторы свертывания крови из сапропеля: влияние на плазмокоагуляцию, тромбоцитарный гемостаз и некоторые жизненные функции лабораторных животных», «Внутрисосудистое свертывание крови, толерантность к тромбину, активность тромбоцитов и интенсивность ЛПО при гипер- и гипотиреозе» и «Непрерывное внутрисосудистое свертывание крови при отсутствии и избытке в рационе витамина ВB ».

B Основные материалы работы обсуждены на российских и международных конференциях: конференции «Теория и методология современного научного исследования Тюменского региона» – Тюмень. - 2003 (2 сообщения), на 2-й региональной научно-практической конференции «Экологическое образование и здоровый образ жизни». - Сургут. - 2006, 3-й научной международной конференции «Актуальные проблемы науки и образования». - Варадеро, Куба.

- 2008, IV Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии». - Москва. - 2009, Материалы Российской конф. «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии». - Челябинск: ЧГМА, Объединение биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, Южно-Уральский научный центр РАМН. - 2009 (3 сообщения).

Результаты, полученные при выполнении работы, используются в обучении студентов и клинических ординаторов по курсам «Нормальная физиология», «Биохимия» и «Клиническая фармакология».

Положения, выносимые на защиту 1. Исключение из сбалансированного рациона питания витамина А, Е, ВB, B ВB B или С (последний у аскорбатзависимых животных) сопровождается ускорением липидпероксидации, снижением антиоксидантного потенциала тромбоцитов, ростом их коагулоактивности, ускорением НВСК и снижением толерантности к тромбину.

2. Избыточное введение с рационом питания витаминов А, Е, или ВB B в до зах, эквивалентных лечебным, угнетает липидпероксидацию, повышает антиоксидантный потенциал тромбоцитов, снижает их коагулоактивность, замедляя НВСК и повышая толерантность к тромбину.

3. При внутривенном введении витамина ВB (500, 1000, 2000 или 40B мкг/кг) через 5, 15 и 30 мин наблюдается значительная активация фибринолиза, исчезающая к 60-й мин, которая является реакцией на повышение общей свертывающей активности крови, развивающейся через 5-й мин после инъекции.

4. При введении значительного избытка витамина С (44,0 и 88,0 мг/кг массы тела) или длительном (6-8 недель) введении небольших, но превышающих потребность доз (4,125, 11,0 и 22,0 мг/кг массы тела) наблюдается угнетение (первые две недели), а затем ускорение липидпероксидации. Эти сдвиги сопровождаются фазными изменениями НВСК и толерантности к тромбину (вначале увеличение и затем снижение).

5. Липидпероксидация (ЛПО) и антиоксидантный потенциал (АОП) отрицательно ассоциированы (rB, = -0,92), ЛПО и НВСК с одной стороны, толеB s рантность к тромбину с другой - ассоциированы отрицательно в опытах с витаминами А, Е и ВB B (rB, = -0.95) и менее тесно (rB, = -0.75) - в опытах с витамиB B 12 s s нами ВB B и С.

6. Эффекты изучавшихся витаминов на толерантность к тромбину при сочетанном введении характеризуются неполной суммацией, особенно, если в сочетании содержится аскорбиновая кислота, ведущая себя в дозах восьми- и шестнадцатикратно превышающих потребность (44,0 и 88,0 мг/кг) как прооксидант.

Апробация. Основные положения диссертации доложены на 5-й Всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром.» (М., 2000); 6-й национальной конференции «Атеротромбоз, артериальная гипертензия» (М., 2001); III Российской конференции с международным участием в НЦ ССХ им.

Бакулева (М., 2001), Всероссийской конф. “Тромбозы, геморрагии, ДВСсиндром. Проблемы лечения». М., 2001, на сессии (с международным участием) Всероссийской ассоциации тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. А.А.Шмидта-Б.А.Кудряшова (М., 2003); конференции «Актуальные вопросы экспресс-диагностики в хирургии» (М., РНЦХ РАМН, 2003); конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Греция, 2003); 2-й конф. РАЕ «Гомеостаз и эндоэкология» (Египет, 2004); конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья (Оренбург, 2003); на 14 конгрессе Дунайской ассоциации гемостазиологов (С.-Петербург, 2004), на международном симпозиуме «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (Дубай, 2006), 2-й региональной научно-практической конференции «Экологическое образование и здоровый образ жизни» (Сургут, 2006), Международной конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (ОАЭ, Лутраки, 2006), на III научной международной конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Куба, Варадеро, 2008), на IV Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (М.: РНЦХ РАМН, 2009), на заочных электронных конференциях «Экологические проблемы внутренних болезней, перинатологии и педиатрии». - 2007. 6., «Экологические проблемы внутренних болезней, перинатологии и педиатрии». - 2007. 6, «Химический анализ». - 2007. 2., «Фундаментальные исследования». - 2008. 2. (3 работы); на ежегодных заседаниях регионального отделения РАЕ (Тюмень, 2005-2009), на ежегодных заседаниях Тюменского отделения ВБО (2006-2009), на совместном заседании профессорскопреподавательского состава кафедр нормальной физиологии, биохимии и гигиены с основами экологии, общей фармакологии ТГМА (2006, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 62 статьи, из них 12 в журналах рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций, 28 - в других медико-биологических журналах, опубликованы 1 монография (Москва: Медицинская книга - 2009. - 112 с) и 4 главы в монографиях (М.: Медицина - 2006; Х-Мансийск: Издат. центр Х-МГМИ, филиал ЮУНЦ РАМН - 2007).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 238 страницах, содержит 26 таблиц и 21 рисунок, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, результаты исследований, их обсуждение, выводы, и список использованной литературы (273 отечественных и 345 зарубежных источников).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Выбор животных. Опыты с витаминами А, Е, ВB B и ВB B провели на нели5 нейных белых крысах-самцах (864 особи, 175±15 г). Для них разработан пищевой рацион, содержащий белок, липиды, углеводы, витамины и минералы согласно суточной потребности. В связи с зависимостью гемостаза от метеофакторов и сезонных ритмов (В.П.Балуда и др., 1978; А.Ш.Бышевский и др., 1986) во все опыты включали контрольную группу. Опыты с витамином С проведены на аскорбатзависимых морских свинках-самцах (294, 272±27 г) - корректном объекте для моделирования С-гипо - и С-авитаминоза (Б.А.Лавров, 1963).

Крысы получали сбалансированный рацион, разработанный институтом питания АМН СССР, включающий маисовый крахмал, казеин, подсолнечное масло, солевую смесь и витамины по прописи (О.Я.Курцинь, 1952), а также витамины ВB, ВB, инозит и викасол (Б.А.Лавров и др., 1963). Рацион в готовом B B 12 с виде - вязкая кашица, в которой равномерно распределяются добавки. Суточная порция содержала витамины в соответствие с суточной потребностью, а также солевую смесь (Б.А.Лавров и др., 1963). Готовую смесь (100 г/кг массы тела) помещали в кормушки. Рацион этот эффективнее стандартов Дональдсона для «идеальных» крыс, получающих обычный смешанный корм (P.W.Hawk, B.L.Ozer, 1954), что подтверждено работами института питания АМН СССР и УССР, НИИ витаминологии и ряда кафедр биохимии мединститутов страны СССР. Е-авитаминный рацион содержал растительное масло без токоферола (ТФ) (А.И.Штенберг, 1960).

Морских свинок содержали на рационе, обеспечивающем нормальный прирост массы и приплод - сено, свёкла, овес, морковь, печеный хлеб, молоко, дрожжи и вода (К.Л.Ковалевский, 1949). Содержание аскорбата в суточной порции - 5.5 мг/кг массы тела. С-авитаминный рацион содержит те же продукты после обработки, устраняющей витамин С (рекомендации Всесоюзной конференции по витаминам, М.). С-гиповитаминный рацион – это С-авитаминный с добавкой аскорбиновой кислоты (АК) в дозах, составляющих 25, или 75% от потребности (т.е. от 5.5 мг/кг/сут). Морковь, молоко и сено - источники ретинола и каротина, не разрушающегося при использованной обработке (Б.Г.Савинов, 1948).

Суточную потребность в витаминах группы В обеспечивали высушенные на свету дрожжи (0.4 г/кг). Источник витамина Е - овес (П.Х. Попандопуло, 1949). Сходные рационы использованы ранее и при изучении гемостаза (Б.А.Кудряшов, 1975; Б.А.Лавров и др., 1963; С.В. Шидин, 2006). Аскорбино вую кислоту (АК) -5.5 мг/кг/сут - получали контрольные группы.

Приемы и методы. Пробы крови брали по правилам гемостазиологии (З.С.Баркаган, 1998) из v. jugularis у наркотизированных животных. Рану закрывали 2-3 швами. В плазме определяли уровень маркеров НВСК (З.С.Баркаган и др., 1998; Д.М.Зубаиров, 2000; M.Levi и др., 2004): 1. Продукты деградации фибрина (ПДФ) - маркеры НВСК и фибринолиза (H.Wada e.a., 2003) - по описанию (А.Ш.Бышевский и др., 1991); 2. Растворимые комплексы мономерного фибрина (РКМФ) - их прирост сопровождает гиперкоагуляцию - фенантролиновым тестом (А.П.Момот и др., 1999); 3. D-димеры - маркеры фибринации и фибринолиза (Е.Г.Соболева и др. 2003; P.de Moerloose e.a., 2003) – с помощью моноклональных антител, используя «D-dimer test”, Roche; 4. Уровень фф. РB B и РB в плазме определяли по описанию (В.П.Балуда и др., 1980).

B 3 Эти факторы - косвенные маркеры НВСК - их уровень в плазме пропорционален тромбинемии, а тромбин ускоряет реакцию высвобождения (А.С.Шитикова, 2000); 5. Концентрацию в плазме ф. I - её снижение признак активации НВСК (I.Wada e.a., 2003) - определяли спектрофотометрически (А.Ш.Бышевский и др., 1969); 6. Ф.XIIа-зависимый фибринолиз оценивали по З.С.Баркагану и др. [1998]; 7. Активированное время рекальцификации (АВР) и активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) - по описанию (Г.Н.Детинкина и др. 1984); 8. Толерантность к тромбину - запатентованным (А.Ш.Бышевский и др., 2003) и апробированным приемом (М.К.Умутбаева, 2005; Р.Г.Алборов, 2006; С.В.Шидин, 2007). Специфичность результатов при использовании способа обусловлена тем, что ф. I - субстрат тромбина, снижение уровня которого зависит от состояния физиологических систем, обеспечивающих выживание (Д.М.Зубаиров, 2000).

ЛПО и АОП в тромбоцитах оценивали, определяя уровень диеновых конъюгат (ДК), уровень ТБК-продуктов, период индукции (ПИ), скорость индуцированного окисления (СО). Тромбоциты изолировали по описанию (А.Б.Самаль и др., 1990). Величины ЛПО и АОП in vivo изменяли, вводя с рационом прооксидант (ацетат свинца, 50 мг/кг массы) или антиоксидант (димефосфон, 1 г/кг/сут). Свинец ускоряет ЛПО и снижает АОП, не нарушая обмена порфиринов (А.А.Мкртумян, 1994), так как всасывается в кишечнике лишь около 5% свинца (Материалы ВОЗ: Свинец, 1980). Димефосфон (1,1диметил-3-оксибутирилфосфоновая кислота) – синтетический антиоксидант, усиливающий эффект физиологических антиоксидантов, не изменяя гемостаза (А.А.Мкртумян, 1994). В использованной дозе димефосфон умеренно повышает АОП, что позволяет выявлять эффекты других антиоксидантов (М.К.Умутбаева, 2003).

Статистическую обработку числовых данных проводили с помощью медико-биологической программы Biostat 4.03 (С.А.Гланц, 1998) методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений, вычисляя среднюю арифметическую (М), её среднюю ошибку (m) и среднеквадратическое отклонение (). Оценивали достоверность отличий по доверительному коэффициенту Стьюдента (t) и степени вероятности (р). Интенсивные показатели сравнивали приемом альтернативного варьирования, вычисляя те же величины. Связи переменных анализировали методом ранговой корреляции Спирмена. Различия считали достоверными при величине р < 0.05. Графический анализ проводили в Microsoft Graf (приложение MS Word 2000), корректность трендов оценивали P по коэффициентам аппроксимации (RP ). Сопоставляя результаты действия двух и более факторов, дифференцировали суммацию, синергизм или антагонизм (М.Диксон и Э.Уэббу, 1966).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Эффекты рациона питания без витамина А и с его возрастающим количеством. Крысы получали стандартный рацион: 1-я группа (контроль) – ретинол 200 МЕ/кг (суточная потребность); 2-я - А-авитаминный рацион; 3-я, 4-я и 5-я – ретинол 50, 100 и 150 МЕ/кг; 6-я, 7-я и 8-я - в 2, 4 и 6 раза выше потребности (400, 800, 1600, 3200 МЕ/кг); 9-я - 2 400 МЕ/кг ретинола (в 2 раза выше эквивалента высокой лечебной дозы). Пробы брали через 2, 4, 6, 8 и недель.

Оказалось (табл. 1), что при содержании крыс на рационе без ретинола (Аавитаминный рацион питания) нарастают уровни ДК, ТБК и снижается АОП.

Прирост уровня липидпероксидов ДК и ТБК и соответственно снижение АОП менее значительны при дозе ретинола в 25, 50% и особенно 75% от суточной потребности. При дозах, превышающих потребность, замедлялась ЛПО, и увеличивался АОП пропорционально дозе и длительности введения ретинола.

Таблица 1.

Изменения ЛПО и АОП в тромбоцитах крыс, не получавших витамин А, получавших его в дозе, равной суточной потребности, в дозах, ниже потребности и в превышающих потребность в 2, 4, 6 и 12 раз Контроль, Животные (n – 5 на каждом этапе) получали ретинол (МЕ/кг массы тела) в дозах:

n=Показатели 200 0.0 50 100 150 400 800 1600 320.057±0.004 0.050±0.003 0.047±0.004 0.052±0.003 0.046±0.003* 0.042±0.004* 0.024±0.002* 0.014±0.001* ДК, 0.051±0.00.063±0.002* 0.061±0.002* 0.057±0.002* 0.055±0.002 0.044±0.002* 0.035±0.007* 0.014±0.004* 0.010±0.002* А/мг ЛП 0.072±0.002* 0.067±0.002* 0.062±0.002* 0.059±0.002* 0.038±0.003* 0.032±0.003* 0.011±0.003* 0.009±0.003* 0.081±0.002* 0.071±0.002* 0.057±0.002* 0.058±0.002* 0.038±0.003* 0.031±0.004* 0.012±0.002* 0.008±0.004* 0.81±0.03 0.80±0.02 0.77±0.02 0.76±0.03 0.69±0.03* 0.65±0.03* 0.44±0.04* 0.40±0.04* ТБК, 0.76±0.0.91±0.04* 0.87±0.03* 0.84±0.02* 0.74±0.02 0.64±0.05* 0.60±0.04* 0.35±0.03* 0.35±0.02* ед./мг ЛП 0.99±0.05* 0.95±0.04* 0.91±0.03* 0.81±0.04* 0.55±0.03* 0.51±0.02* 0.24±0.04* 0.18±0.03* 1.22±0.005* 1.10±0.005* 1.01±0.006* 0.09±0.004* 0.57±0.03* 0.044±0.01* 0.22±0.03* 0.17±0.05* 46.0±1.6 46.3±1.7 46.7±1.6 45.7±1.4 46.1±1.7 50.4±1.1* 63.7±1.2* 63.9±1.2* ПИ, 45.7±1.43.8±1.2 44.9±1.3 44.0±1.1 45.0±1.2 56.0±1.3* 60.9±1.7* 68.9±1.6* 69.9±1.6* мин/мл 35.7±1.4* 36.8±1.3* 38.6±1.3* 39.2±1.2* 62.6±1.9* 67.6±1.5* 78.2±1.7* 83.2±197* 28.1±1.1* 31.0±1.0* 34.0±1.2* 40.1±1.4* 64.8±1.9* 69.7±1.9* 79.9±1.7* 91.6±1.8* 0.77±0.05 0.73±0.05 0.71±0.06 0.71±0.06 0.77±0.03 0.63±0.04* 0.42±0.02* 0.40±0.03* СО, 0.75±0.0.81±0.04 0.80±0.043 0.77±0.04 0.77±0.04 0.67±0.02* 0.54±0.03* 0.31±0.02* 0.27±0.03* P ммP /мл/мин 0.92±0.04* 0.84±0.03* 0.72±0.03* 0.72±0.03* 0.59±0.04* 0.48±0.04* 0.23±0.04* 0.20±0.04* 0.99±0.003* 0.92±0.003* 0.83±0.003* 0.83±0.003* 0.55±0.04* 0.47±0.02* 0.21±0.03* 0.17±0.03* Обозначения (здесь и в следующих таблицах): ДК - диеновые конъюгаты, ЛП - липид, ТБК - продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой, ПИ - период индукции, СО - скорость окисления; знак * - достоверное отличие от контроля (жирным выделены все достоверно отличающиеся от контроля величины);

строки 1,2, 3 и 4 - соответственно после 2, 4, 6 и 8 недель от начала опыта Таблица 2.

Содержание маркеров НВСК в плазме и ТкТР у крыс, не получавших витамин А, получавших его в дозе, равной суточной потребности, дозах ниже потребности и выше неё в 2, 4, 6 и 12 раз Контроль, Показатели n=12 Животные (n = 6 на каждом этапе) получали ретинол (МЕ/кг массы тела) в дозах:

200 0.0 50 100 150 400 800 1200 2487.5±1.2 87.0±1.3 87.4±1.3 87.9±1.2 85.1±1.3 82.3±1.6* 78.3±1.4* 74.0±13* Ф. РB,% B 89.0±1.3 91.4±1.3 91.1±1.2 89.4±1.5 90.7±1.6 82.4±1.2* 78.2±1.4* 64.2±1.3* 61.2±1.4* 97.2±1.1* 95.7±1.2 95.1±1.0* 92.2±1.4 76.0±132* 68.9±1.6* 60.1±1.6* 60.0±1.2* 99.5±1.6* 96.9±1.6* 93.2±1.0* 92.9±1.0* 75.1±1.3* 64.1±1.7* 57.4±1.6* 57.4±1.6* 3.5±0.03 3.4±0.05 3.5±0.03 3.5±0.04 3.2±0.03 2.9±0.04* 2.1±0.02* 2.0±0.02* Ф. РB B с 3.4±0.4, 3.6±0.05 3.6±0.07 3.4±0.03 3.7±0.09 3.0±0.02* 2.5±0.05* 1.9±0.02* 1.6±0.02* 3.8±0.02* 3.7±0.02* 3.7±0.02* 3.8±0.02* 2.7±0.02* 2.1±0.03* 1.7±0.01* 1.5±0.02* 4.3±0.03* 4.1±0.03* 4.0±0.05* 4.0±0.03* 2.7±0.02* 1.7±0.02* 1.4±0.01* 1.2±0.01* 2.2±0.09 2.2±0.11 2.2±0.09 2.1±0.08 2.1±0.08 2.4±0.06 2.1±0.04 2.1±0.ФГ, г/л 2.3±0.2.1±0.11 2.2±0.17 2.1±0.11 2.2±0.10 2.1±0.09 2.2±0.07 2.1±0.14 2.2±0.2.2±0.08 2.1±0.06 2.2±0.08 2.2±0.08 2.2±0.07 2.2±0.07 2.5±0.08* 2.6±0.04* 1.5±0.05* 1.7±0.02* 1.9±0.05* 2.2±0.04 2.1±0.08 2.5±0.07 2.6±0.08* 2.5±0.05* 15.5±1.1 15.0±1.1 15.3±1.0 15.3±1.0 14.6±1.5 12.1±1.0* 11.0±1.9 11.0±1.ПДФ, мг% 15.1±1.16.0±1.3 16.2±1.2 16.1±1.4 16.1±1.4 14.8±0.6 11.0±0.7* 10.1±0.9* 10.2±0.8* 19.3±1.0* 18.0±1.0* 17.0±1.* 18.4±1.0* 9.7±0.5* 8.8±0.9* 8.7±0.5* 8.5±0.4* 22.3±1.1* 20.1±1.0* 18.9±1.1* 17.7±1.1* 8.1±0.3* 7.6±0.02* 6.4±0.01* 6.2±0.01* 22.6±1.2 23.5 ±1.1 22.9±1.2 22.9±1.2 21.8±0.9 17.4±1.0* 15.3±0.7* 15.0±0.7* РКМФ, мкг/мл 24.1±0.25.0±0.9 25.1±0.8 25.0±0.8 24.0±0.8 18.1±0.9* 14.2±0.6* 12.4±1.1* 11.3±1.0* 28.1±0.9* 27.9±1.2 26.8±0.9* 25.1±0.9 15.9±0.7* 13.1±0.5* 11.9±0.4* 10.5±0.5* 32.9±0.9* 30.1±0.9* 25.4±0.8* 24.5±0.7 14.0±0.01* 11.3±0.02* 10.0±0.01* 9.1±0.02* 0.18±0.012 0.19±0.013 0.19±0.012 0.19±0.012 0.18±0.011 0.17±0.011* 0.16±0.010* 0.15±0.010* 0.20±0.00.18±0.011 0.18±0.014 0.19±0.011 0.20±0.011 0.15±0.013* 0.13±0.010* 0.15±0.009* 0.13±0.008* D-Д, мкг/мл 0.22±0.008* 0.22±0.009 0.20±0.008* 0.21±0.008 0.13±0.009* 0.09±0.009* 0.07±0.004* 0.06±0.005* 0.25±0.009* 0.23±0.006* 0.19±0.011* 0.20±0.009* 012.0±0.03* 0.08±0.01* 0.06±0.01* 0.05±0.02* 90.1±1.4 87.3±1.4 86.3±1.5 97. ±1.6 107±2.1 114±1.7* 123±2.1* 129±2.1* 85.1±1.3* 89.4±1.5* 91.9±1.2* 95.1±1.3 113±2.2 125±2.2* 135±2.1* 139±2.1* 100±1.ТкТР, % 78.6±1.2* 87.6±1.1* 93.1±1.1* 98.6±1.2 127±2.1* 130±2.3* 138±2.5* 141±2.5* 65.0±1.4* 78.9±1.3* 91.8±1.3* 87.9±1.4* 131±1.5* 148±2.0* 154±2.3* 156±2.0* Обозначения здесь и далее: Ф. - фактор, ФГ - фибриноген, ПДФ - продукты деградации фибрина, РКМФ - растворимые комплексы мономерного фибрина, D-Д - D-димеры; ТкТР - толерантность к тромбину; * - достоверное отличие от контроля (полужирным шрифтом для удобства восприятия выделены достоверно отличающиеся от контроля величины); строки в ячейках 1,2, 3 и 4 - соответственно после 2, 4, 6 и 8 недель от начала опыта Из данных табл. 2 следует, что уровень маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК) в отсутствии ретинола становился выше с увеличением длительности опыта, а толерантность к тромбину (ТкТР) снижалась.

При введении ретинола в долях потребности показатели уровня маркеров НВСК приближались к контрольным величинам.

При дозах ретинола, превышающих потребность в 2, 4, 8 и 16 раз, уровень маркеров НВСК, напротив, опускался ниже контрольных значений, а толерантность к тромбину увеличивались – т.е. А-авитаминное питание ускорило липидпероксидацию и снизило антиоксидантный потенциал. Непрерывное внутрисосудистое свертывание крови при этом ускорилось, чему сопутствовало снижение ТкТР.

Так как ретинол в дозах, превышающих потребность в 8 и 16 раз (1600 и 32МЕ/кг), снижал, а при продолжительном введении увеличивал уровень ПДФ, Dдимеров (А.В Пустынников, 2007) и активировал фибринолиз, провели опыты с бльшей из этих доз (2400 МЕ/кг) и с удвоенной дозой (4800 МЕ/кг), увеличив длительность опыта до 12 недель, контролируя ещё и фибринолиз.

В табл. 3 видно, что при содержании крыс на А-авитаминном рационе питания уровень фф. РB B и РB B снизился значительнее, чем за 8 недель (сравнить с табл.

3 2), а уровень фибриногена не менялся. Уровень РКМФ, снизившись за 10 недель, таким же остался и через 12 недель. Уровень ПДФ при дозе 3200 МЕ/кг вырос за 10, и заметнее - за 12 недель, особенно при дозе 4800 МЕ/кг. Уровень D-димеров при обеих дозах уже за 10 и 12 недель стал выше, чем на 8-й неделе. Фибринолиз замедлялся при А-авитаминном питании с 8-й недели. При избытке ретинола активность фибринолиза росла при всех дозах.

Эффекты А-авитаминного питания на фоне про- или антиоксиданта. Возможно ретинол влияет на гемостаз не как антиоксидант, а иным путем и его эффект может не зависеть от исходного состояния ЛПО. Чтобы выяснить это, крысы ежедневно получали ретинол одновременно со свинцом или димефосфоном (про- или антиоксидантом соответственно). В отсутствии ретинола (табл. 4) воспроизвелись сдвиги, найденные ранее: ускорение ЛПО, НВСК и снижение АОП. Свинец при А-авитаминном питании усилил сдвиги в том же направлении (группа 3), и при введении свинца и ретинола (группа 4) сдвиги ослаблены. Димефосфон без ретинола (группа 5) ограничил эти сдвиги.

Таблица 3. НВСК, коагулоактивность тромбоцитов, ф.XIIа-зависимый фибринолиз и ТкТР у крыс, неполучавших ретинола, получавших его в суточной потребности, или в дозах, выше потребности в 6, 12 и 24 раза (верхняя строка - 10, нижняя - 12 недель) Показатели Крысы получали ретинол Крысы (n на этапе = 5) получали ретинол (МЕ/кг) (200 МЕ/кг), в дозах:

n на этапе = 10 (контроль) 0.0 1200 2400 4889.8±1.9* 61.9±1.3* 52.4±1.3* 55.6±1.3* Ф. РB,% B 3 80.6±1.92.5±1.3* 63.2±1.2* 48.9±1.5* 51.9±1.5* 3.9±0.04* 2.1±0.04* 1.5±0.03* 1.4±0.03* Ф. РB B с 4, 3.4±0.02 1.8.03* 4.1±0.04* 1.1±0.04* 1.0±0.04* 2.0±0.05 2.1±0.03 2.1±0.04 2.3±0.ФГ, г/л 2.2±0.2.4±0.06 2.0±0.06 1.8±0.06 1.9±0.04* ПДФ, 18.9±1.1* 18.3±1.4* 22.7±1.7* 23.9±0.07* мг% 15.7±0.19.6±0.4* 21.9±1.2* 27.4±1.9* 29.1±0.04* РКМФ, мкг/мл 30.5±1.1* 14.6±0.5* 12.7±0.9* 12.9±0.03* 25.2±0.29.9±1.2* 13.9±1.1* 10.9±1.1* 11.4±0.04* D-Д, 0.24±0.008* 0.31±0.013* 0.37±0.014* 0.40±0.03* мкг/мл 0.20±0.00.25±0.003* 0.34±0.013* 0.39±0.015* 0.43±0.04* Ф.XIIа- 8.4±0.03 8.4±0.05 6.1±0.07* 5.8±0.03* зависимый 9.5±0.07* 7.9±0.06 5.9±0.06* 6.1±0.04* фибринолиз, 8.1±0.11.0±0.04* 6.4±0.05* 5.5±0.04* 4.9±0.03* мин 13.1±0.06* 6.0±0.04* 5.0±0.05* 4.6±0.04* 90.3±1.4 125±2.1* 129±2.1* 129±2.1* 100±4.ТкТР,% 85.4±1.3* 134±2.3* 139±2.1* 139±2.1* 79.1±1.2* 139±2.6* 141±2.5* 141±2.5* 66.1±1.4* 153±2.1* 156±2.2* 156±3.Знак * - достоверные отличия от контроля; фибринолиз и ТкТР - за 6, 8, 10 12 недель Таблица 4. Изменения ЛПО, АОП и НВСК при введении свинца или димефосфона с Аавитаминным рационом и рационом с ретинолом в количестве, равном суточной потребности; 1-я строка - через 6, 2-я - через 8 недель от начала опыта, Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 Группа (без ретинола (200 МЕ/кг (без ретинола (200 МЕ/кг (без ретинола (200 МЕ/кг Показатели ретинола) + свинец) ретинола+ +димефосфон) ретинола+ дисвинец) мефосфон) » ДК, P 0.071±0.003 0.051±0.002* 0.088±0.004P 0.057±0.002+ 0.061±0.002^ 0.050±0.004# » А/мг ЛП P 0.081±0.004 0.054±0.005* 0.093±0.006P 0.060±0.005+ 0.072±0.005^ 0.047±0.003# ТБК, P 0.99±0.05 0.76±0.07* 1.34±0.07» P 0.80±0.06+ 0.88±0.06^ 0.70±0.04# » ед./мг ЛП P 1.23±0.004 0.74±0.04* 1.51±0.009P 0.85±0.08+ 0.97±0.005^ 0.65±0.04# » ПИ, P 35.4±1.3 45.6±1.3* 28.4±1.6P 35.9±1.4+ 37.1±0.7^ 41.4±1.3# » мин/мл P 28.3±1.2 45.3±1.1* 24.4±1.9P 41.3±1.1+ 34.2±1.0^ 53.6±1.2# » СО, P 0.90±0.04 0.75±0.03* 1.20±0.07P 0.86±0.06+ 0.81±0.05^ 0.70±0.02# » P ммP /мл/мин P 0.98±0.002 0.75±0.03* 1.38±0.009P 0.94±0.03+ 0.88±0.004^ 0.68±0.02# » Ф. РB,% P B 3 97.4±1.1 89.1±1.2* 107±1.6P 96.1±1.2+ 94.0±1.1^ 85.0±1.0# » P 99.7±1.5 89.4±1.1* 120±2.0P 99.8±1.1+ 96.1±1.3^ 83.3±1.2# » P 3.7±0.03 3.5±0.03* 4.1±0.06P 3.8±0.04+ 3.6±0.01 3.1±0.02# » Ф. РB B с P 4, 4.4±0.03 3.3±0.04* 4.9±0.08P 4.3±0.03+ 4.0±0.02^ 3.0±0.03# » P 2.3±0.06 2.2 ±0.04* 1.7±0.04P 2.0 ±0.03 2.2±0.04 2.2 ±0.» ФГ, г/л P 1.6±0.04 2.1±0.03* 1.4±0.03P 2.1±0.01 1.7±0.06 2.2±0.» ПДФ, P 19.2±1.1 15.3±0.9* 23.0±1.2P 20.0±0.8+ 18.0±0.5^ 14.1±0.6# » мг% P 22.2±1.3 15.0±1.2* 27.4±1.6P 23.0±1.1+ 20.1±0.2^ 13.6±0.5# РКМФ, мкг/мл P 28.4±0.7 23.1±0.9* 32.9±0.8» P 27.2±0.7+ 26.5±0.7^ 20.1±0.7# » P 33.0±0.8 22.8±0.7* 37.3±0.9P 28.9±0.7+ 30.3±0.6^ 19.9±0.5# » D-Д, P 0.22±0.006 0.19±0.009* 0.25±0.008P 0.24±0.003+ 0.21±0.004 0.18±0.0» мкг/мл P 0.25±0.007 0.19±0.007* 0.29±0.006P 0.27±0.002+ 0.23±0.006^ 0.17±0.003# » ТкТР, % 78.1±1.1 67.2±1.4P P 86.1±1.0^ 100±1.6* 80.3±1.4+ 111±1.4# » 65.3±1.1 60.7±1.0P P 76.4±0.9^ 100±1.6* 71.8±1.7+ 118±1.7# Обозначения: * - достоверные отличия от величин, найденных в те же сроки в группе 2-й от » P-P P P 1-й, P в группеP 3-й от 1-й, + - в группе 4-й от 2-й, ^ - в группе 5-й от 1-й, # - в группе 6-й от 2-й.

Димефосфон на фоне ретинола (группа 6) замедлил НВСК, ЛПО и повысил АОП.

Видимо, эффекты ретинола на гемостаз реализуются за счет его антиоксидантных свойств - прооксидант усиливает, а антиоксидант ограничивает эффекты ретинола на ЛПО, АОП и соответственно на гемостаз.

Оценим связи между маркерами НВСК (по величие РКМФ), ЛПО (по величине ДК), АОП (по величине СО) и толерантности к тромбину в условиях моноавитаминного рациона. На рис. 1 видно следующее:

- при продолжительном А-авитаминном питании ускоряется ЛПО и НВСК, снижается АОП и ТкТР;

- достоверность аппроксимации трендов близка к единице, что говорит о линейности изменения этих величин во времени;

- коэффициенты ранговой корреляции (rB ) пары ДК и ПИ (rB = - 0.9) указывают B B s s на их тесную отрицательную связь, для пары ДК и РКМФ – на тесную положительную связь (rB = 0.8), для пар ДК и ТкТР, РКМФ и ТкТР – на тесную отрицаB s тельную связь (rB = -1.0 и - 0.9 соответственно).

B s ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (ПИ) Линейный (ТкТР) Линейный (РКМФ) R2 = 0,96R2 = 0,92--R2 = 0,93R2 = 0,93-2 нед.4 нед.6 нед.8 нед.

Рисунок 1. Сдвиги (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, значений РКМФ и ТкТР в отсутствии ретинола в рационе (тонкие линии – графики; жирные – тренды, сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) Следовательно, при содержании крыс на А-авитаминном рационе питания ТкТР отрицательно и тесно ассоциирована с интенсивностью ЛПО и НВСК, тесно положительно - с АОП. Это подтверждается ещё и тем, что ретинол в долях суточной потребности, уменьшает степень сдвигов каждого показателя.

Анализ эффектов разных доз ретинола (рис. 2) позволяет констатировать что:

1. Двукратный избыток витамина А замедляет ЛПО и повышает АОП, чему сопутствует замедление НВСК и рост ТкТР;

2. Четырёхкратный избыток вызывает более сильные сдвиги, усугубляющиеся при восьмикратном избытке (при шестнадцатикратном избытке сдвиги ЛПО, АОП и НВСК равны найденным при восьмикратном избытке);

3. Зависимости между сдвигами ЛПО, АОП, НВСК и ТкТР одинаковы при разных дозах ретинола (в пределах суточной потребности);

4. Характер связей в парах ДК-ПИ, ДК-РКМФ, ДК-ТкТР, РКМФ-ТкТР сохраняется прежним - тесная отрицательная, тесная положительная, тесная отрицательная и тесная отрицательная связь соответственно. Поэтому можно считать, что отсутствие ретинола в рационе, сбалансированном по другим нутриентам, ускоряет ЛПО и НВСК, снижает АОП, сопровождаясь снижением ТкТР. Это согласуется с наличием прямой связи между скоростью ЛПО и гиперкоагуляционными сдвигами, возникающими при воздействиях, ускоряющих ЛПО [С.Л.Галян и др., 1998; С.В.Шидин, 2007; K.M.HColleranH e.a., 2003; I.Haszon e.a., 2003].

ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (РКМФ) Линейный (ТкТР) Линейный (ПИ) 1R2 = 0,R2 = 0,----R2 = 0,-R2 = 0,2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед.

Дозы, МЕ/кг: 400 800 1200 24Рисунок 2. Изменения (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, уровня РКМФ и ТкТР при избытке ретинола; тонкие линии – графики, жирные – тренды (сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) Сравнивая сдвиги ПДФ и D-димеров при высоких дозах ретинола, нашли, что рост их концентрации пропорционален длительности введения, тогда как при введении меньших доз и в более короткие сроки их уровень падал, что служит признаком замедления НВСК, подтверждаемого снижением уровня РКМФ, фф. РB B и РB. Так как уровень фф. РB B и РB B продолжает падать и при больших дозах ретиноB 4 3 ла, нет оснований отрицать его способности замедлять НВСК.

Рост уровня ПДФ и D-димеров объясняется активацией фибринолиза, ускорившегося за 10 и 12 недель при дозе ретинола в 1200 МЕ/кг на 21 и 30%, при дозе 2400 МЕ/кг - на 32 и 38%, при дозе 4800 МЕ/кг - на 39 и 43% (р < 0.05). Объяснение правомерно ещё и потому, что толерантность к тромбину, увеличившаяся при замедлении НВСК (рис. 3), продолжает расти и с повышением дозы ретинола в рационе.

ПДФ D-димеры Фиб-з ТкТР 1155 1185 155 56 39 39 41 55 ---30 --38 --10 12 10 12 10 нед. нед. нед. нед. нед. нед.

Дозы, МЕ/кг: 1200 2400 48Рисунок 3. Изменения (в % к контролю) уровня ПДФ, D-димеров, фибринолиза и ТкТР при избытке ретинола в рационе.

Следовательно, избыток ретинола в дозах, эквивалентных лечебным для человека, замедляет НВСК, ускоряет фибринолиз и увеличивают ТкТР.

НВСК, фибринолиз, ТкТР, ЛПО и АОП при рационе питания без токоферола и с его возрастающим количеством. Схема опыта: группа контроля добавок не получала, подопытные группы получали с рационом токоферол (ТФ) в дозах 3.0, 6.0, 12 и 24 мг/кг массы.

В пробах крови определяли кроме этого активность фибринолиза, так как выявилась роль его сдвигов в парадоксальной динамике уровня ПДФ, D-димеров и фибринолиза, активность которого, как известно, в одних случаях растет, в других - снижается (R.Vibo, 2007; A.Blinc e.a., 2007).

Как и в условиях А-авитаминного питания, при содержании на рационе без витамина Е, ускорялась ЛПО и падал АОП уже за две первые недели. Степень изменений уменьшало введение токоферола в дозах, составляющих 25, 50% и 75% от потребности. При 2-кратной против потребности дозе токоферола за 4 недели ЛПО замедлялась. Ещё быстрее это произошло при больших дозах ТФ (как это находили и в рассмотренных выше опытах с ретинолом).

Отсутствие токоферола в рационе ускорило НВСК за 6, и заметнее за 8 недель.

Толерантность к тромбину (ТкТР) падала уже за 4, и сильнее за 6 и за 8 недель, как и в опытах с ретинолом. При дозах токоферола меньших потребности, ограничивались все эти сдвиги, не устраняясь полностью. С увеличением доз токоферола происходило то же, что при введении средних или больших доз ретинола.

Принципиальное сходство сдвигов ЛПО, АОП и показателей состояния гемостаза во всех вариантах опытов со сдвигами, найденными при изучении эффектов ретинола, отраженных в таблицах 1-4, позволяют не усложнять изложения приведением абсолютных значений, полученных в экспериментах, так как направленность и степень сдвигов практически идентичны в опытах с ретинолом и токоферолом. Поэтому мы приводим ниже результаты графического анализа этих экспериментов и результаты оценки ранговой корреляции.

ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (ПИ) Линейный (ТкТР) Линейный (РКМФ) R2 = 0,R2 = 0,-R2 = 0,-R2 = 0,-2 нед.4 нед.6 нед.8 нед.

Рисунок 4. Сдвиги (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, значений РКМФ и ТкТР в отсутствии токоферола в рационе (тонкие линии – графики; жирные – тренды, сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) Здесь видно, что при содержании крыс на Е-авитаминном рационе питания толерантность к тромбину (ТкТР) отрицательно и тесно ассоциирована с интенсивностью липидпероксидации (ЛПО) и непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК), и тесно положительно - с антиоксидантным потенциалом (АОП).

Анализ эффектов возрастающих доз токоферола (рис. 5) позволяет видеть, что двукратный его избыток замедляет липидпероксидацию и повышает антиоксидантный потенциал, чему сопутствует замедление непрерывного внутрисосу дистого свертывания крови (НВСК) и рост толерантности к тромбину (ТкТР). Четырёхкратный избыток вызывает более сильные сдвиги, которые становятся ещё значительнее при восьмикратном избытке, сохраняясь примерно такими же и при шестнадцатикратном избытке токоферола.

ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (РКМФ) Линейный (ТкТР) Линейный (ПИ) 1R2 = 0,R2 = 0,----R2 = 0,-R2 = 0,2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед.

Дозы, мг/кг: 3,0 6,0 12,0 24,Рисунок 5. Изменения (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, уровня РКМФ и ТкТР при избытке токоферола; тонкие линии – графики, жирные – тренды (сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) В целом зависимости НВСК, ЛПО, АОП и ТкТР от количества в рационе токоферола таковы: величина rB B (-0.86) для пары ДК-ПИ указывает на их тесную s отрицательную связь, для пары ДК-РКМФ (rB = 0.66) - на слабую положительную, B s для пар ДК-ТкТР и ДК-ПИ (rB = -0.54, -0.51 соответственно) на слабую отрицаB s тельную связь, для пары РКМФ-ТкТР (rB = -0.9) на тесную отрицательную связь.

B s Фибринолиз при Е-авитаминном рационе замедляется, будучи тесно положительно ассоциирован с ТкТР, и отрицательно - с ПИ (rB = 0.88 и -0.89).

B s Выявлены сходные зависимости НВСК, ЛПО, АОП и ТкТР от количества в рационе ТФ: величина rB B (-0.86) для пары ДК-ПИ указывает на их тесную отрицаs тельную связь, для пары ДК-РКМФ (rB = 0.66) - на слабую положительную, для B s B пар ДК-ТкТР и ДК-ПИ (rB = -0.54, -0.51) на слабую отрицательную связь и для паs ры РКМФ-ТкТР (rB = -0.9) на тесную отрицательную связь. Фибринолиз при ЕB s авитаминном рационе замедляется, будучи тесно положительно ассоциирован с ТкТР, и отрицательно - с ПИ (rB = 0.88 и -0.89).

B s Следовательно, при Е-авитаминозе ТкТР находится в тесной отрицательной связи со скоростью ЛПО и НВСК, и в прямой - с АОП и фибринолизом. Это подтверждается ещё и тем, что с увеличением дозы ТФ (в пределах потребности) степень сдвигов падает. При избытке ТФ сдвиги этих величин сохраняют направленность: увеличение длительности опыта с избытком ТФ замедляет ЛПО и увеличивает АОП, замедляет НВСК, повышает фибринолиз и ТкТР.

Усредненные графики данных из опытов с токоферолом, близки к приведенным на рис. 3 для ретинола. Величина rB B для пары ЛПО-НВСК (0,72), отражает s положительную связь с относительно невысокой теснотой. Связь между ЛПО и АОП тесная отрицательная (rB = -0.87), что вообще характерно для отношения B s ЛПО/АОП в тромбоцитах при экстремальных воздействиях или заболеваниях [Г.А.Сулкарнаева, 2004; Р.Г.Алборов, 2006]. Связь НВСК-ТкТР умеренно тесная отрицательная (rB = -0.79), как и при эффектах, вызываемых отсутствием ТФ.

B s Связь фибринолиз-РФМК слабая отрицательная (rB = -0.48).

B s Если учесть, что уровень РФМК растет при ускорении фибринолиза [З.С.Баркаган, 1998], что нами и было найдено, то уровень РФМК должен был бы возрастать. Однако у крыс при избытке токоферола уровень РФМК падал, т.е. связь РФМК-фибринолиз отсутствует, а фибринолиз и толерантность к тромбину связаны тесно положительно (rB = 0.80). Таким образом, избыток ТФ ведет к сдвигам, B s обратным тем, которые возникают при его дефиците или отсутствии - замедление ЛПО и НВСК, рост АОП и ускорение фибринолиза. Главное, что все это сопровождается ростом толерантности к тромбину (ТкТР).

Следовательно, при Е-авитаминозе ТкТР находится в тесной отрицательной связи со скоростью ЛПО и НВСК, и в прямой - с АОП и фибринолизом. Это подтверждается ещё и тем, что с увеличением дозы ТФ (в пределах потребности) степень сдвигов падает. При избытке ТФ сдвиги этих величин сохраняют направленность: увеличение длительности опыта с избытком ТФ замедляет ЛПО и увеличивает АОП, замедляет НВСК, повышает фибринолиз и ТкТР.

Усредненные графики данных полученных в опытах с ТФ, близки к приведенным на рис. 3 для ретинола. Величина rB B для пары ЛПО-НВСК (0,72), отражает s положительную связь с относительно невысокой теснотой. Связь между ЛПО и АОП тесная отрицательная (rB = -0.87), что вообще характерно для отношения B s ЛПО к АОП в тромбоцитах при экстремальных воздействиях и заболеваниях [Г.А.Сулкарнаева, 2004; Р.Г.Алборов, 2006]. Связь между НВСК и ТкТР умеренно тесная отрицательная (rB = -0.79), как и при эффектах, вызываемых отсутствием B s токоферола. Связь фибринолиз-РФМК слабая отрицательная (rB = -0.48).

B s Если учесть, что уровень РФМК растет при ускорении фибринолиза [З.С.Бар каган, 1998], что нами и было найдено при введении высоких доз ТФ, то уровень РФМК должен был бы возрастать. Однако у крыс при избытке ТФ уровень РФМК падал, т.е. связь РФМК-фибринолиз отсутствует, а фибринолиз и толерантность к тромбину (ТкТР) связаны тесно положительно (rB = 0.80).

B s Таким образом, избыток токоферола ведет к сдвигам, обратным тем, которые возникают при его дефиците или отсутствии - замедление липидпероксидации и непрерывного внутрисосудистого свертывания крови, рост антиоксидантного потенциала и ускорение фибринолиза. Главное, что все это сопровождается ростом толерантности к тромбину.

Зависимости между сдвигами ЛПО, АОП, НВСК и ТкТР одинаковы при разных избыточных дозах токоферола (в том числе, и в дозах, недостигающих суточной потребности, которые не приведены на графике).

Касаясь характера связей в парах ДК-ПИ, ДК-РКМФ, ДК-ТкТР, РКМФ-ТкТР, отметим, что он таков же, как и при отсутствии или дефиците ретинола: тесная отрицательная, тесная положительная, тесная отрицательная и тесная отрицательная связь соответственно. Поэтому, как и в случае с ретинолом, отсутствие токоферола в сбалансированном по другим нутриентам рационе, ускоряет ЛПО и НВСК, снижает АОП, и ТкТР.

На рис. 6 представлены соотношения сдвигов ПДФ, D-димеров, фибринолиза и ТкТР при избытке токоферола в рационе.

ПДФ D-димеры Фиб-з ТкТР 1111185 76 56 45 41 -----38 --10 12 10 12 10 нед. нед. нед. нед. нед. нед.

Дозы, мг/кг: 12,0 24,0 48,Рисунок 6. Изменения (в % к контролю) уровня ПДФ, D-димеров, фибринолиза и ТкТР при избытке токоферола в рационе.

При рассмотрении диаграмм видно, что растет уровень ПДФ и D-димеров при избытке ТФ, и объясняется это (как и при избытке ретинола), активацией фибринолиза, ускорившегося за 10 и 12 недель при дозе токоферола в 24 мг/кг на 32 и 38%, при дозе 48 мг/кг - на 39 и 43%, (р < 0.05). Толерантность к тромбину, уве личившаяся при замедлении НВСК, продолжает расти и при повышении в рационе дозы токоферола. Этим объясняется упоминавшаяся выше парадоксальность - рост уровня ПДФ и D-димеров при одновременном замедлении НВСК. Связано это с тем, что уровень ПДФ и D-димеров растет за счет ускорения фибринолиза, а не только в результате ускорения НВСК. Следовательно, в отсутствии или избытке токоферола в рационе сдвиги таковы же, как в отсутствии или избытке ретинола. Для уточнения возможной роли антиоксидантных свойств ТФ во влиянии на гемостаз мы провели опыты с его введением вместе с прооксидантом или антиоксидантом (табл. 5).

Таблица 5. Сдвиги ЛПО, АОП, уровня маркеров НВСК, фибринолиза и ТкТР при введении прооксиданта (свинца) или антиоксиданта (димефосфона) на фоне Е-авитаминного рацио- на и рациона, содержащего витамин Е в соответствии с суточной потребностью (верхняя строка - через 6, нижняя - через 8 недель от начала опыта) Показатели Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 Группа (без ТФ), (1,5 мг/кг (без ТФ+ (1,5 мг/кг (без ТФ+ДМ), (1,5 мг/кг n=12 ТФ), свинец) ТФ+свинец), n=6 ТФ+ДМ),n=n=6 n=6 n=» ДК, P 0.069±0.001* 0.053±0.004* 0.089±0.003P 0.059±0.003+ 0.060±0.003^ 0.051±0.006# » А/мг ЛП P 0.075±0.002* 0.054±0.003* 0.099±0.008P 0.061±0.004+ 0.068±0.005^ 0.046±0.003# » ТБК, P 0.85±0.02* 0.73±0.04* 1.41±0.07P 0.81±0.05+ 0.88±0.07^ 0.70±0.04# » ед./мг ЛП P 0.95±0.03* 0.74±0.05* 1.55±0.09P 0.84±0.09+ 0.94±0.006^ 0.69±0.04# » ПИ, P 38.0±1.0* 45.8±1.2* 26.7±1.4P 35.6±1.5+ 37.3±0.7^ 41.4±1.3# » мин/мл P 33.7±1.4* 45.4±1.0* 23.5±1.7P 41.9±1.4+ 35.0±1.1^ 48.4±1.4# » СО, P 0.90±0.03* 0.73±0.04* 1.22±0.09P 0.85±0.07+ 0.80±0.05^ 0.70±0.02# » P ммP /мл/мин P 0.95±0.04* 0.74±0.03* 1.48±0.005P 0.95±0.04+ 0.87±0.006^ 0.69±0.03# » Ф. РB,% P B 99.9±1.2* 88.9±1.1* 111±1.6P 102±1.2+ 94.1±1.2^ 85.2±1.2# » P 104±1.9* 89.2±1.2* 128±2.1P 110±1.5+ 95.8±1.3^ 83.4±1.0# » P 4.5±0.03* 3.5±0.02* 4.8±0.06P 3.9±0.03+ 3.7±0.01 3.0±0.01# » Ф. РB B с P 4, 5.5±0.04* 3.2±0.06* 5.8±0.09P 4.6±0.04+ 4.4±0.03^ 2.9±0.02# » P 1.9±0.06 2.1 ±0.03* 1.7±0.03P 2.1 ±0.03 2.2±0.04 2.1 ±0.» ФГ, г/л P 1.3±0.08* 2.0±0.05* 1.1±0.02P 2.0±0.02 1.6±0.03 2.0±0.» ПДФ, P 21.4±1.2* 15.7±0.8* 23.5±1.4P 22.1±0.6+ 18.1±0.4^ 14.0±0.6# » мг% P 25.6±1.3* 15.1±1.1* 28.6±1.7P 23.2±1.3+ 19.2±0.2^ 13.5±0.4# » РКМФ, P 34.2±0.8* 22.8±0.9* 35.0±0.6P 27.8±0.9+ 28.5±0.6^ 20.0±0.8# » мкг/мл P 38.9±0.9* 22.4±0.8* 40.4±0.8P 29.2±0.7+ 33.4±0.4^ 19.7±0.4# D-Д, P 0.31±0.009* 0.20±0.008* 0.35±0.008» P 0.26±0.004+ 0.25±0.005 0.19±0.0» мкг/мл P 0.35±0.007* 0.21±0.005* 0.39±0.005P 0.29±0.002+ 0.27±0.004^ 0.18±0.002# Ф.XIIа- зависи- мый фибри- 14.6±0.06* 8.2±0.05* 15.8±0.06* 13.2±0.06* 13.2±0.08* 9.5±0.04* нолиз, мин 18.0±0.05* 8.0±0.06* 16.9±0.05* 14.3±0.07* 15.4±0.05* 8.9±0.01* ТкТР, % 73.1±1.2* 66.9±1.1» P 72.1±1.1^ P 100±1.8* 70.1±1.5+ 112±1.7# » 58.1±1.1* 53.4±1.0P P 66.4±0.7^ 100±1.5* 65.8±1.6+ 121±1.5# Обозначения: как в табл. 1; * - достоверные отличия от величин, найденных в соответст» P-P P P вующие сроки в группе 2-й от группы 1-й,P в группеP 3-й от группы 1-й, + - в группе 4-й от группы 2-й, ^ - в группе 5-й от группы 1-й, # - в группе 6-й от группы 2-й.

Сопоставляя данные, полученные при введении токоферола одновременно с про- или антиоксидантом невитаминной природы (табл. 5), нашли, что воспроизвелись результаты аналогичного опыта с ретинолом - Е-авитаминоз ускоряет липидпероксидацию, непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, снижает антиоксидантный потенциал, подавляет фибринолиз и толерантность к тромбину (ТкТР). Так, сравнение величин в столбцах 4 и 3 показывает, что если свинец вводится с рационом, содержащим ТФ в дозе, равной потребности, эффект прооксиданта ограничивается - сдвиги имеют ту же направленность, но менее выражены у крыс, получавших свинец и токоферол, чем у крыс, получавших только ТФ.

Антиоксидант ослабил сдвиги у крыс, получавших Е-авитаминный рацион питания (столбцы 5 и 1), повысил АОП, замедлил ЛПО и НВСК (столбцы 6 и 2), ограничил угнетение фибринолиза и повысил толерантность к тромбину. Следовательно, действие токоферола на гемостаз действительно реализуется благодаря его антиоксидантным свойствам.

Эффекты отсутствия кобаламина (КБ), его дефицита или избытка. Схема опытов не отличается от уже использованной. Сходны и полученные данные, которые мы в связи с этим приводим в графическом изображении.

ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (ПИ) Линейный (ТкТР) Линейный (РКМФ) R2 = 0,R2 = 0,--R2 = 0,R2 = 0,-2 нед.4 нед.6 нед.8 нед.

Рисунок 7. Сдвиги (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, значений РКМФ и ТкТР в отсутствии кобаламина в рационе (тонкие линии – графики; жирные – тренды, сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) На рис. 7 видно, что в отсутствии в рационе кобаламина ускоряется ЛПО и снижается АОП, начиная с 4-й недели (рост уровня ДК и ТБК, увеличение СО и удлинение ПИ). При введении кобаламина в дозах, составляющих 25, 50 и 75% потребности сдвиги ослабевают, не исчезая полностью, сохраняя прежнюю зависимость - чем ближе доза к суточной потребности, чем менее выражены последствия дефицита витамина.

На рис. 8 видно, что двукратная против потребности доза предупреждала сдвиги, а через 6 и 8 недель ограничивала ЛПО, скорость окисления (СО) и удлиняла ПИ.

ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (РКМФ) Линейный (ТкТР) Линейный (ПИ) R2 = 0,R2 = 0,-R2 = 0,R2 = 0,---2 4 6 8 2 4 6 8 2 4 6 8 2 4 6 нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед.

Дозы, мкг/кг: 2,0 4,0 8,0 16,Рисунок 8. Изменения (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, уровня РКМФ и ТкТР при избытке кобаламина; тонкие линии – графики, жирные – тренды (сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) Вместе с тем, эффекты более высоких доз кобаламина, подчиняясь в общих чертах уже установленной закономерности во влиянии на липидпероксидацию и антиоксидантный потенциал тромбоцитов, не были строго пропорциональны дозе и длительности введения кобаламина, отличаясь в этом отношении по эффекту от ретинола и токоферола. Однако толерантность к тромбину более строго «соблюдала» пропорциональность, увеличиваясь с повышением дозы и длительности введения кобаламина. Об этом свидетельствует и характер трендов - величины P коэффициентов аппроксимации (RP ), близкие к единице, т.е. свидетельствующие о корректности аппроксимации, обнаруживаются здесь только для трендов, характеризующих динамику уровня в тромбоцитах диеновых конъюгат и динамику периода индукции, в остальных случаях эти величины далеки от единицы.

Влияние на ЛПО, АОП, НВСК, фибринолиз и ТкТР рационов без ниацина (НЦ) и с его возрастающим количеством. Схема опытов этой серии не отличалась от предыдущих. Диаграммы рис. 9 свидетельствуют, что у крыс, не получавших витамина ВB, ускорение липидпероксидации и снижение антиокB сидантного потенциала выявляется через 6 недель от начала опыта, и это становится ещё более выразительным после 8 недель.

Пробы взяты:

через 2 недели через 4 недели через 6 недель через 8 недель ДК ТБК ПИ СО 35 20 1716 15 11 11 11 9 6 6 6 5 4 4 0000 0000 0000 0000 0 0 0 0 0 -5 ----6 ---8 -8 ------Рисунок 9. Изменения (в % от контроля) уровня ДК, ТБК, длительности ПИ и скорости окисления (СО) в тромбоцитах при содержании крыс на рационе без ниацина и с ниацином в дозах, составляющих 25, 50 и 75% от суточной потребности. Знаки 0 на графике означают отсутствие сдвига (периоды отбора проб приведены над рисунком) У крыс, получавших ниацин в количестве, составляющем 25, 50 и 75% от суточной потребности (соответственно 62.5, 125.0 и 187.5 мкг/кг), степень сдвигов интенсивности липидпероксидации и антиоксидантного потенциала, возникающих в его отсутствии, после 6 и 8 недель от начала опыта, уменьшается с увеличением дозы. Однако и при наибольшей из этих доз величины, характеризующие состояние перекисного окисления липидов ещё отличаются от контроля, хотя и в небольшой, но достоверной степени (р < 0,05). Следовательно, ускорение ЛПО и снижение АОП у крыс, получавших ниацин в дозах, не достигающих суточной потребности, менее выражены в сравнении с обнаруженным при ВB -авитаминном рационе, однако, не исчезает полностью и к B концу опыта.

0% 0% 0% 0% 25% 50% 75% 25% 50% 75% 25% 50% 75% 25% 50% 75% При введения избытка витамина ВB B (рис. 10, где рассмотрены в качестве показателей состояния ЛПО и АОП уровень ДК и период индукции - ПИ, состояния НВСК – изменения РКМФ) с увеличением длительности эксперимента снижается интенсивность липидпероксидации (убыль уровня ДК) и растет АОП (удлинение ПИ), замедляется НВСК (снижение уровня РКМФ), активируется фибринолиз (укорочение времени лизиса сгустка фибрина), а также повышается толерантность к тромбину (ТкТР).

ДК ПИ РКМФ Фиб-лиз ТкТР Линейный (ТкТР) Линейный (Фиб-лиз) Линейный (ПИ) Линейный (ДК) Линейный (РКМФ) 114 11R2 = 0,27183 79 32 R2 = 0,0531 31 R2 = 0,20 0 0 0 0 -R2 = 0,23----16 -----30 --35 R2 = 0,3----39 -----Дозы ниацина: 1000 мг/кг 2000 мг/кг 4000 мг/кг Рисунок 10. Изменения (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, уровня РКМФ, активности фибринолиза и толерантности к тромбину (ТкТР) при избытке ниацина в рационе крыс (тренды сверху вниз: ПИ, фибринолиз, ТкТР, РКМФ и ДК) Сдвиги уровня ДК (показатель скорости липидпероксидации) ассоциированы с изменениями антиоксидантного потенциала (по значениям ПИ) достаточно тесной отрицательной связью (rB = -0.87), с уровнем РКМФ - тесной положительной B s связью (rB B= 0.83), как это находили и при изучении витаминов А, Е и ВB. Тесная B s положительная связь выявлена также между активностью фибринолиза и толерантностью к тромбину (rB = 0.91).

B s 2 нед.

8 нед.

2 нед.

4 нед.

6 нед.

4 нед.

6 нед.

8 нед.

2 нед.

4 нед.

6 нед.

8 нед.

При дозе ниацина в 2, 4, 8 и 16 превосходящей потребность, липидпероксидация протекала медленнее, чем в контроле, а антиоксидантный потенциал увеличивался. Степень сдвигов, как видно по характеру диаграмм, менялась непропорционально дозе, начиная с восьмикратной.

Особенностью влияния ВB -авитаминного рациона питания, не представленной B на диаграмме, является то, что за 6 и особенно за 8 недель замедлилось высвобождение фф. РB, РB, Непрерывное свертывание крови (НВСК) замедлилось и упала B B 3 активность фибринолиза, снизилась ТкТР. При введении ниацина в дозах меньших, чем потребность, эти сдвиги, как и сдвиги в процессах перекисного окисления липидов, уменьшались, но не исчезали. Фибринолиз, будучи замедленным в отсутствии НЦ, активировался параллельно приросту дозы НЦ. Сниженная при ВB -авитаминозе толерантность к тромбину, увеличивалась с введением ниацина B пропорционально его дозе.

При двукратной против потребности дозе ниацина (500 мкг/кг) через 2 недели интенсивность НВСК была такой же, как у крыс, получавших ниацин в соответствии с потребностью. Активность фибринолиза за 8 недель стала выше контрольной, как и ТкТР (на 123%). Введение НЦ в четырёхкратной дозе влияло на НВСК аналогичным образом, активность же фибринолиза повышалась, начиная со 2-й недели и за 8 недель превысила контроль на 40,7%. Толерантность к тромбину (ТкТР) уже через 2 недели была выше контроля, а за 8 недель превысила его на 131%. Степень ускорения фибринолиза и роста ТкТР относительно контроля оставалась такой же, как и при четырёхкратной дозе. При введении шестнадцатрикратной дозы НЦ сдвиги по времени появления, направленности и степени не отличаются от найденных при введении ниацина в восьмикратной дозе.

Влияние внутривенного введения ниацина на ЛПО, АОП, НВСК, фибринолиз и ТкТР. Так как эффекты ниацина на гемостаз зависят от пути введения (Г.Х.Довгялло и др., 1967; J.A.Pires, 2007), мы провели опыты с его внутривенными инъекциями. Инъекция растворителя («слепой» опыт) не меняла показателей. После инъекций ниацина нашли, что его введение в дву- и четырёхкратной дозе изменений ЛПО и АОП в течение 1 ч не вызывала, а при восьмикратной дозе через 1 ч наблюдалось замедление ЛПО и рост АОП.

При шестнадцатикратной дозе это выявилось уже через 0.5 ч, усилившись через 1 ч. Судя по значениям m индивидуальные колебания выше, чем у крыс, получавших ниацин с пищей.

При введении двукратной дозы ниацина через 30 и 60 мин в одинаковой степени снижена фибриногенемия и ускорено НВСК. Фибринолиз ускорился через 15 и 30 мин, а ТкТР увеличилась. При четырёхкратной дозе гипофибриногенемия усугубилась, ускорилось НВСК (на 15-й и 60-й мин), заметнее активировался фибринолиз (начиная с 15-й мин и до конца опыта) и увеличилась ТкТР (начиная с 5-й мин).

При 8-кратной дозе за 30 и 60 мин увеличился уровень фф. РB B и РB, усугубиB 3 лась гипофибриногенемия. Ускорение НВСК выявлялось уже через 15 мин, усиливаясь к концу опыта. Скорость фибринолиза была выше, чем в контроле, как и при четырёхкратной дозе, и сравнялась с контролем к концу опытов. ТкТР при этой дозе на 5-й и 15-й мин выше, чем при четырёхкратной, а к 60-й минуте упала ниже контроля.

После введения ниацина в шестнадцатикратной дозе уровень фф. РB B и РB B ос3 тался таким же, как и при восьмикратной, гипофибриногенемия усугубилась.

Скорость НВСК изменялась, как и при восьмикратной дозе. Заметнее ускорился фибринолиз, сравнявшись к 60-й мин с контролем. ТкТР на 5-й и 15-й мин выше, чем при 8-кратной дозой, на 30-й минуте снизилась, и через 60 мин стала ниже контрольной.

В целом эффекты введения ниацина в вену свидетельствуют, что скорость НВСК после инъекции растет с увеличением дозы. Растет при этом и уровень РФМК, постепенно снижаясь к концу опыта. Параллельно ускоряется фибринолиз и растет ТкТР, и это также через 1 ч сменяется снижением.

Эта фазность сдвигов при введении НЦ в вену потребовала изучить показатели общей свертываемости крови - АВР и АЧТВ. В эксперименте мы нашли, что через 5 и заметнее через 15 мин, но слабее через 30 мин после инъекции ниацина дозазависимо сокращается АВР и АЧТВ, нормализуясь через 60 мин.

После введения НЦ в 4-, 8- и 16-кратной дозе через 30 мин АВР и АЧТВ удлинены в степени, возрастающей с увеличением дозы.

Принимая во внимание данные об изменении ответа на повторные внутривенные инъекции НЦ [Е.В.Шаповалова, 1967; G.J. Kato e.a., 2008], мы провели опы ты с ежедневным введением ниацина в вену хвоста в дозах, эквивалентных лечебным, отбирая пробы крови через 5, 15, 30 и 60 мин. После 5-й инъекции (5мкг/кг ежедневно) укорочение АВР и АЧТВ наблюдали лишь через 30 мин, степень укороченния становилась менее заметной через 60 мин. Активность фибринолиза повышалась в малой мере лишь через 60 мин, а ТкТР не изменялась.

При бльших дозах ниацина повторное введение не сказывалось на значении АВР, АЧТВ, фибринолиза и ТкТР в период наблюдений. После 10-й и 20-й ежедневной инъекции ниацина изменения протекали с такой же динамикой.

ЛПО и гемостаз у морских свинок при питании рационом без витамина С и с его избытком также выполнены по общей схеме.

В отсутствии АК (рис. 11) через 2 недели плавно ускоряется ЛПО, и позже снижается АОП.

ДК ПИ РКМФ ПДФ D-димеры Фиб-лиз ТкТР Линейный (ДК) Линейный (ПИ) Линейный (РКМФ) Линейный (Фиб-лиз) Линейный (ТкТР) Линейный (ПДФ) Линейный (D-димеры) R2 = 0,00 00 0 00 R2 = 0,-10 --10 R2 = 0,-R2 = 0,5--R2 = 0,--R2 = 0,R2 = 0,--Рисунок 11. Изменения (в % к контролю) ДК, ПИ, РКМФ, ПДФ, фибринолиза и ТкТР в отсутствии АК в рационе морских свинок. Примечания: линии трендов (сверху вниз) - динамика ДК, РКМФ, ПДФ, D-димеров, ПИ, фибринолиза и ТкТР; рядом с трендами располоP жены значения RP ; знаки 0 на рисунке означают отсутствие отклонений от контроля При дозе АК, составляющей 25% потребности, сдвиги ЛПО менее выражены. При дозе АК, составляющей 50% или 75% от потребности, ускорение ЛПО ещё менее значительно. При двукратной против потребности дозе уже за 4 недели замедляется ЛПО и растет АОП. Через 6 и 8 недель сдвиги усилены. При четырёхкратной дозе до 6-й недели сдвигов не было, а через 8 недель ЛПО ускорилась, а АОП упал. При восьмикратной дозе ускорение ЛПО и падение АОП выявились через 6 недель, то же нашли и при шестнадцатикратной дозе АК.

.

.

.

.

д д д д е е е е н н н н Способность витамина С повышать общую коагулоактивность тромбоцитов согласуется с его свойством поддерживать активность энзимов-антиоксидантов [T.W.Stief e.a. 2000; S.A.Raghavan e.a., 2003], а снижение АОП при С-авитаминном рационе пиания свидетельствует, что оксидативный стресс является одним из проявлений дефицита аскорбата.

То, что прооксидантный эффект АК заметнее проявляется у аскорбатзависимых животных, согласуется с понятием «степень насыщения организма витамином С»:

потребность в АК определяется её количеством в организме, превышение которого в рационе уже не изменяет «насыщенности» крови аскорбатом в связи с ускоренным его выведением с мочой (В.В.Ефремов, 1964, 1969; П.Н.Шараев, 2004) Графический анализ выявил у аскорбатзависимых животных то, что на рационе без АК динамика исследуемых величин отличается от найденной при изучении эффекта P рационов без ретинола, токоферола или кобаламина: RP трендов, описывающих сдвиги РКМФ, ПИ и фибринолиза, заметно ниже единицы потому, что в ранние сроки эти величины не менялись.

Однако ряд показателей изменялся пропорционально протяженности опытов. Так, P коэффициенты RP близки к единице: в паре ДК-ПИ (здесь найдена тесная отрицательP ная связь _ rB = -0.92), пара ДК и ТкТР ассоциированы такой же связью (rB B = -0.83), как P B s s и ДК-фибринолиз (хотя теснота во втором случае ниже - rB B = -0.65). Связи между s РКМФ и ПДФ, РКМФ и D-димерами, ПДФ и D-димерами положительны, но малозначимы (rB от 0.34 до 0.41) из-за разной величины сдвигов на отдельных этапах наблюB s дений. Вместе с тем связь этих сдвигов с отсутствием АК несомненна, так как даже в дозах меньших, чем потребность, аскорбат ограничивает эти сдвиги, хотя и не устраняет их полностью.

Следовательно, отсутствие аскорбата в рационе аскорбатзависимых животных снижает коагулоактивность тромбоцитов, изменяет скорость НВСК, что не наблюдалось при авитаминозах А, Е, ВB B и ВB.

B 5 Снижение уровня фф. РB B и РB не связано со сдвигами ЛПО и АОП. Более вероятно, B 3 что снижение высвобождающей способности тромбоцитов сопряжено с торможением фибринолиза при С-авитаминозе. Видимо, ускорение ЛПО в этом случае сказывается на активности фибринолитического процесса, сопровождаясь снижением толерантности к тромбину.

То, что С-авитаминоз сопровождается снижением способности тромбоцитов высвобождать фф. РB B и РB, раскрывает механизм уменьшения «тромбопластической B 3 активности» кровяных пластинок, обнаруженного ещё в то время, когда представления о реакции высвобождения только начали формироваться [Г.В.Андреенко и др., 1958, 1959, 1960].

Влияние всех возможных сочетаний из пяти витаминов на ЛПО, АОП, НВСК, фибринолиз и ТкТР. Рассмотренные выше опыты не выявили равно выраженной зависимости между эффектами отсутствия, дефицита или избытка каждого из этих витаминов на ЛПО, АОП, НВСК или фибринолиз. Вместе с тем, близкими были изменения ТкТР при всех рассмотренных видах авитаминоза (лишь при ВB -авитамиB нозе ТкТР снижена в меньшей мере, чем в других случаях). По влиянию избытка витаминов на ТкТР они ранжированы так: А > Е > ВB B > С = ВB.

B 12 Так как толерантность к тромбину - это результирующая взаимодействия многих физиологических систем, ответственных за реакцию организма на гипертромбинемию, при постановке очередных опытов, мы ориентировались на сдвиг ТкТР, роль которой в жизнеобеспечении детально изучена лабораторией физиологии гемостаза МГУ [Б.А.Кудряшов, 1975] и подтверждена во многих экспериментальных и клинических ситуациях (А.Ш.Бышевский и др., 1963, 1964, 2005, 2007; В.А.Полякова, 1994;

Е.А.Матейкович, 2006; Р.Г.Алборов, 2006; Э.В.Багумян и др., 2007).

Из всех возможных сочетаний мы начали с сочетания по 2 из 5, используя дозы, эквивалентные лечебным (четырёх- и восьмикратные против потребности). Вводили эти сочетания 8 недель с тем, чтобы сопоставить их эффекты при максимальном сдвиге ТкТР. Результаты опытов (табл. 6) свидетельствуют, что при всех сочетаниях растет степень их влияния на ТкТР в сравнении с эффектом тех же витаминов, вводимых порознь.

Таблица 6. Влияние на ТкТР (в % к контролю, принятому в среднем за 100%) сочетаний витаминов А, Е, С, ВB, и ВB BB по 2 (4- и 8-кратный избыток каждого) в рационе в течение 4 и B B 5 недель (1-я и 2-я цифра в строке соответственно) Крысы (n = 5 на каждом этапе) получали витамины, обозначенСочетания витаминов по два ные в столбце 1-м 4-кратный избыток 8-кратный избыток Е+С 125±2.4*; 140±2.7* 125±2.3*; 129±2.1* Е+РР 125±2.7*; 127±2.3* 126±2.4* 139±2.7* Е+А 140±2.1*; 147±2.4* 150±2.8*; 174±3.1* 138±2.2*; 154±2.9* Е+ВB B 127±2.2*; 135±2.7* С+РР 120±2.6; 132±1.8 130±3.4*; 137±3.1* С+А 131±2.8*; 140±3.7* 139±4.1*; 148±2.7* С+ВB B 115±2.2*; 118±1.3* 120±3.2*; 128±2.9* РР+А 143±3.2*; 162±4.5* 152±3.6*; 165±4.1* РР+ВB B 129±2.1*: 137±2.6* 133±3.1*; 154±4.7* А + ВB B 134±2.1*; 140±2.6* 152±3.4*; 159±4.3* Знак * - достоверное отличие от контроля Изучили также влияние на ТкТР сочетаний по 3, 4 и 5 витаминов. По данным табл. 7 сочетания по три эффективнее, чем по два, ещё эффективнее сочетания по четыре, и максимальны – сочетание всех пяти.

Оказалось, что все сочетания усиливают влияние витаминов на ТкТР, повышающееся с увеличением длительности введения (как и при их исследовании порознь). Прирост ТкТР при сочетании из пяти относительно невелик.

Чтобы выяснить не связано ли это с прооксидантными свойствами высоких доз АК, сопоставили эффект на ТкТР сочетания из пяти витаминов, вводя АК в дозе, проявляющей антиоксидантную активность (в 4-хкратной против потребности). В этом случае ТкТР увеличилась со 100 до 232±5.1% (на 132%), т.е. сильнее, чем при введении того же сочетания с 8-кратной дозой АК, когда ТкТР выросла только на 98±4.8%.

Итак, снижение (при сочетании из пяти) дозы АК с 8- до 4-кратной усилило влияние на ТкТР. Следовательно, ограничение эффекта при восьмикратной дозе АК в составе сочетания обусловлено тем, что четырёхкратная доза не проявляет столь выраженной прооксидантной активности.

Таблица 7.

Влияние на ТкТР сочетаний витаминов А, Е, С, ВB, и ВB BB Bпо 3, 4 и 5 (4- и 8- кратный изB 5 быток каждого) в рационе в течение 4 и 8 недель (1-я и 2-я цифра в строке соответственно) Перечень сочета- Крысы (n = 5 на этапе) получали в избытке ний витаминов по 3, витамины, обозначенные в первом столбце 4 и 4-кратный избыток 8-кратный избыток Е+С+ВB B 129±2.2*; 136±2.1* 129±2.1*; 146±2.8* Е+С+А 157±3.1*; 179±4.1* 150±2.8*; 198±5.1* Е+С+ВB B 140±3.3*; 167±2.9* 162±4.5*; 189±5.2* С+ВB +А 143±3.2*; 159±4.1* 166±3.7*; 176±5.2* B С+ВB +ВB B B 125±2.3; 145±2.7 133±3.4; 148±3.5 ВB +А+ВB B 145±3.0*; 150±3.2* 161±3.6*; 165±4.2* B 5 Е+С+ВB +ВB B B 149±4.0*; 171±4.3* 157±3.8*; 178±4.3* 5 Е+С+ВB +А B 153±3.5*; 175±4.6* 160±3.9*; 181±4.4* С+ВB +ВB +А B B 160±3.5*; 173±4.7* 163±4.2*; 178±4.7* 5 Е+С+ВB +ВB +А B B 157±3.6*; 193±4.6* 166±4.5*; 198±4.8* 5 Знак * - достоверное отличие от контроля При всех исследованных нами видах авитаминоза однонаправлено изменяется ТкТР. Степень её сдвигов (в сравнении с найденными при введении витаминов порознь), позволяет судить о характере кооперации эффектов, вызываемых сочетаниями.

В табл. 8 видно, что при введении сочетаний по два эффекты суммируются не полностью (расчет по Диксону и Уэббу), и это признак реализации их влияния за счет одинакового механизма действия каждого витамина из изученных пар на ЛПО или на фибринолиз.

Таблица 8. Сдвиги (в % к контролю) ТкТР (выделены полужирным шрифтом) при введении витаминов А, Е, ВB, ВB B и С порознь, и в сочетаниях по 2, 3, 4 и 5 в течение B 12 недель Сдвиг ТкТР, % Сдвиг ТкТР и характер взаимо- Сдвиг ТкТР и характер взаимопри введении витами- действия при попарном введении ви- действия при введении витаминов в нов порознь таминов сочетаниях по 2, 3, 4 и 74 (А+Е - неполная суммация) 46 (Е+С+ВB B - антагонизм) 54 (А) 59 (А+ВB ) - неполная суммация 98 (Е+С+А - антагонизм) B 65 (А+ВB ) - неполная суммация) 89 (Е+С+ВB B - антагонизм) B 5 42 (Е) B 48 (А+С - антагонизм) 76 (С+ВB +А - антагонизм) 54 (Е+ВB B - неполная суммация) 48 (С+ВB +ВB B - антагонизм) B 12 5 28 (ВB ) B 39 (Е+ВB B - неполная суммация) 65 (ВB +А+ВB B - неполная суммация) B 5 5 40 (Е+С - отсутствие суммации) 78 (Е+С+ВB +ВB B - антагонизм) B 5 33 (ВB ) B 5 (ВB +ВB неполная суммация) 81 (Е+С+ВB +А - антагонизм) B B B 12 5 - 2 (ВB +С - антагонизм) 78 (С+ВB +ВB +А - антагонизм) B B B 12 5 12 (С) 37 (ВB +С - антагонизм) 98 (Е+С+ВB +ВB +А - антагонизм) B B B 5 5 Примечания: доза витаминов восьмикратна относительно потребности; в столбцах после чисел, выделенных полужирным шрифтом, в скобках указан эффект сочетания витаминов и характер их взаимодействия, рассчитанный по М.Диксон, Э.Уэбб [1966].

Высказанное допущение корректно, так как витамины А, Е, ВB B и ВB B однона5 правлено влияют на оба процесса, замедляя первый и ускоряя второй из них. Во всех сочетаниях, содержащих АК, найден антагонизм. Опыты с сочетаниями из пяти витаминов, подтвердили предположение, так как - 2-кратное снижение дозы АК в этой комбинации усилило её влияние на ТкТР на 34,5% (р < 0.02).

ВЫВОДЫ 1. Отсутствие или дефицит витамина А, Е или ВB в сбалансированном по B остальным нутриентам пищевом рационе пропорционально длительности воздействия (от 2 до 12 недель) снижает антиоксидантный потенциал и ускоряет липидпероксидацию в тромбоцитах, интенсифицируют непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и уменьшают толерантность к тромбину.

2. Избыток в рационе витамина А, Е или ВB в количестве, эквивалентном B лечебным дозам, замедляет (р < 0.05) липидпероксидацию, уменьшает интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (р < 0.05), ускоряет ф.XIIа-зависимый фибринолиз и увеличивает толерантность к тромбину (р < 0.05).

3. Интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови в отсутствии и при избытке витамина А, Е или ВB ассоциирована тесно отрицаB тельно с интенсивностью липидпероксидации, с толерантностью к тромбину и с ф.XIIа-зависимым фибринолизом (rB B > -0,9).

s 4. Отсутствие витамина ВB B в рационе замедляет (р < 0.05) высвобождение факторов РB, РB, снижает (р<0.05) интенсивность непрерывного внутрисосудиB B 3 стого свертывания крови, фибринолитическую активность и толерантность к тромбину; наличие витамина ВB B в количествах, составляющих часть суточной потребности, достоверно ограничивает эти сдвиги, в количестве, превышающем потребность в два раза, предупреждает их и ускоряет фибринолиз, а в количествах, эквивалентных лечебным, достоверно замедляет непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, ускоряет фибринолиз и повышает толерантность к тромбину.

5. Внутривенное введение витамина ВB B в дозах, эквивалентных лечебным, вызывает кратковременную гиперкоагуляцию (р < 0.05), повышает коагулоактивность тромбоцитов, ускоряет непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, снижает толерантность к тромбину, ускоряет в последующем фибринолиз, что сопровождается вторичной гипокоагуляцией (р < 0.05).

6. Отсутствие витамина С в рационе аскорбатзависимых животных ведет к нарастающему ускорению липидпероксидации и увеличению коагулоактивности тромбоцитов (на 15-25% в разные сроки), интенсифицирует непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, сменяющееся его замедлением; витамин С в количествах, составляющих часть суточной потребности, ограничи вает эти сдвиги, отодвигая сроки их наступления, а 2-кратный избыток предупреждает их появление.

7. У аскорбатзависимых животных витамин С в количествах, эквивалентных лечебным, дозазависимо снижает антиоксидантный потенциал, ускоряет липидпероксидацию и непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, фибринолиз и повышает (р < 0.05) толерантность к тромбину (р<0.05). У аскорбатнезависимых животных витамин С в малых дозах действует на тромбоциты как антиоксидант, в больших (и при длительном введении - 8 недель) - как прооксидант, что повышает (р < 0.05) их коагулоактивность 8. Отсутствие в рационе витаминов А, Е, ВB, ВB B и С практически в равной B 5 мере влияет на толерантность к тромбину, а по степени влияния их избытка на толерантность к тромбину витамины располагаются так: А > Е > ВB B > С > ВB.

B 12 9. Изменения интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания крови при А- или Е-авитаминном питании ассоциированы со сдвигами толерантности к тромбину тесно отрицательно (rB > -0,97) и менее тесно (rB B > -0,72) B s s – при питании ВB -, ВB - или С-авитаминными рационами; изменения толерантB B 5 ности к тромбину положительно ассоциированы с фибринолизом.

10. При всех сочетаниях витаминов А, Е, ВB B, ВB B и С (по два, по три, по че5 тыре и по пяти, в дозах, эквивалентных лечебным) их влияние на толерантность к тромбину, на интенсивность липидпероксидации и фибринолиз является результатом неполной суммации эффектов, вызываемых их введением порознь; в сочетаниях, содержащих витамин С, полнота суммации ниже из-за прооксидантной активности высоких доз аскорбата, в частности, уменьшение дозы витамина С в составе сочетания из пяти витаминов усиливает влияние на толерантность к тромбину на 34,5% (р < 0.02).

11. Интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови при А- или Е-авитаминном рационе, дефиците или избытке этих витаминов в рационе тесно отрицательно (rB B> -0,91) ассоциирована со сдвигами толерантs ности к тромбину, и менее тесно (rB

……….

B Таким образом, отсутствие, дефицит или избыток витаминов А, Е, ВB B или ВB, 5 обладающих антиоксидантными свойствами (а витамин С – и прооксидантными), модифицирует липидпероксидацию в тромбоцитах – клетках, синтезирующих (и депонирующих) ряд факторов, способных инициировать гиперкоагулемию, ускорять внутрисосудистое свертывание крови и снижать способность организма реагировать на тромбин и на воздействия, ускоряющие тромбиногенез.

Следовательно, сохраняется необходимость продолжать изучение связи между витаминной обеспеченностью организма и гемостазом, обращая внимание также на эффекты комбинированных гиповитаминозов - состояний, характерных для многих заболеваний, протекающих с наклонностью к тромбофилии или кровоточивости. Особенно важно это при лечении тех заболеваний, в лечебный комплекс которых включают исследовавшиеся нами витамины и их сочетания.

Практические рекомендации 1. Применение витаминов А, Е, ВB, ВB B С и их сочетаний в комплексе лекарстB 5 12, венной терапии заболеваний, заведомо протекающих с нарушениями гемостаза и изменениями интенсивности процессов липидпероксидации (артериальная гипертензия, атеросклеротические изменения, воспалительные процессы, нарушения питания и многие другие), рекомендуется предварять оценкой степени обеспеченности организма больного витаминами, в частности (и в особенности) аскорбиновой кислотой (в этом случае важно устанавливать степень насыщенности организма витамином С, используя известный и апробированный на протяжении ряда десятилетий прием) [С.Г.Аптекарь, С.Г.Лорие, 1959].

2. Перед назначением витаминов и в процессе их применения в лечебных целях (особенно высоких доз) рекомендуется контролировать интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови, оценивая плазменный уровень маркеров гипертромбинемии - растворимых комплексов мономерного фибрина (РКМФ), продуктов его деградации (ПДФ), D-димеров, общую коагулоак тивность тромбоцитов и их высвобождающую способность, а также ф.ХIIазависимый фибринолиз. При невозможности выполнения всех анализов можно ограничиться оценкой уровня РКМФ, активированного времени рекальцификации, активированного частичного тромбопластинового времени, протромбинового отношения, международного нормализованного отношения и ф.XIIa-зависимого фибринолиза с помощью стандартных диагностикумов (например, реагентов-диагностикумов фирмы «Технология–Стандарт», Барнаул или других).

В минимальном варианте можно ориентироваться по плазменному уровню РКМФ и активности ф.XIIа-зависимого фибринолиза (1-й тест характеризует интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания, 2-й - состояние фибринолиза, зависимого от скорости образования ф. XIIа).

Ещё эффективнее – определение степени тромбинемии с помощью специфического окрашенного субстрата тромбина.

3. Важными направлениями в дальнейших экспериментальных исследованиях являются:

- изучение влияния на гемостаз сочетанных авитаминозов, вызываемых исключением из рационов витаминов-антиоксидантов, - изучение дозазависимости влияния на гемостаз сочетания витаминов в дозах, эквивалентных лечебным (особенно это касается сочетаний, включающих витамин С).

4. Необходимо продолжать изучение эффекта сочетаний витаминов-антиоксидантов на гемостаз в клинике при заболеваниях, которым свойственна наклонность к гипертромбинемии, сопровождающейся оксидативным стрессом. Результаты таких наблюдений позволят определить оптимальные сочетания витаминов и соотношения доз, корригирующих гемостатические сдвиги.

Всего опубликовано по теме диссертационных исследований 62 работы, наиболее значимые из их числа (45) представлены ниже:

В журналах, рекомендованных ВАК РФ 1.Шаповалова Е.М. Влияние ингибиторов превращения арахидоновой кислоты в тромбоцитах на взаимодействие тромбин-фибриноген и толерантность к тромбину / Е.М.Шаповалова, А.Ю. Рудзевич // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2007. - 144. - 10. - С. - 408-42.Полякова В.А. Использование витаминов-антиоксидантов для коррекции нарушений гемостаза при лапароскопических гинекологических операциях / В.А.Полякова, Е.М.Шаповалова, Е.А.Винокурова и др. / Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2007. - 6. -1. - С.24-3.Бышевский А.Ш. Маркеры взаимодействия тромбина с фибриногеном в плазме крови как показатель толерантности к тромбину / А.Ш.Бышевский, Е.М.Шаповалова, С.Л.Галян, А.Ю.Рудзевич // Казанский медицинский журнал – 2008. - 89. -. - С.21-4. Бышевский А.Ш. Интенсивность взаимодействия тромбин-фибриноген, липидпероксидация и толерантность к тромбину при дефиците витамина С / А.Ш.Бышевский, Е.М.Шаповалова, А.Ю.Рудзевич // Гематология и трансфузиология. - 2008. - 53. - 4. С.41-5.Бышевский А.Ш. Гемостаз и обеспеченность организма витамином С / А.Ш.Бышевский, С.И.Матаев, Е.М.Шаповалова и др. // Вопросы питания. - 2008. - 77.- 3. - С.21-6. Шаповалова Е.М. Непрерывное внутрисосудистое свертывание крови у беременных с артериальной гипертензией / Е.М.Шаповалова, А.Ю.Рудзевич // Вестник Волгоградского ГМУ, 2008. - 2(26). - С. 71-7.Шаповалова Е.М. Витамины с антиоксидантными свойствами и гемостаз /Е.М.Шаповалова, А.Ш.Бышевский и др. // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2009. – 2(25). – С.109 -18. Бышевский А.Ш. Влияние сочетаний витаминов-антиоксидантов на толерантность к тромбину /А.Ш. Бышевский, Е.М. Шаповалова // Вестник ЮжноУральского государственного университета – 2009. - 27 (160). – С.77-9.Алборов Р.Г. Витамин С (аскорбиновая кислота) и гемостаз (обзор) /Р.Г.Алборов, Л.А.Васильев, Е.М.Шаповалова и др. // Медицинская наука и образование Урала. – 2009. – 2(58). – С.143-110.Галушко М.Г. Гемостаз при гипертиреозе и тиреотоксикозе (обзор) / М.Г.Галушко, Р.Г.Алборов, Е.М.Шаповалова и др. // Медицинская наука и образование Урала. – 2009. – 2(58). – С. 147-111.Бышевский А.Ш. Гемостаз при отсутствии, дефиците и избытке кобаламина у крыс, содержащихся на сбалансированном пищевом рационе / А.Ш.Бышевский, П.Я.Шаповалов, Е.М.Шаповалова // Известия Самарского научного центра Российской Академии Наук. – 2009. - 1 (4). - Том 11. – С.752-712.Шаповалова Е.М. Липидпероксидация и гемостаз у аскорбатзависимых животных при их содержании на рационе без аскорбата, с его дефицитом и избытком / Е.М.Шаповалова // Известия Самарского научного центра Российской Академии Наук. – 2009. - 1 (4). - 11. – С.758-7В других медико-биологических журналах (отечественных и зарубежных) 13.Сулкарнаева Г.А. Влияние тироксина на эффекты ингибитора превращения арахидоновой кислоты на уровне фосфолипазы АB B при изменении липидпероксидации в тромбоцитах // Г.А.Сулкарнаева, Е.М.Шаповалова, А.Ю.Рудзевич / Фундаментальные исследования – 2006. – 11. – С.63-14.Шаповалова Е.М. Влияние аспирина на тромбоциты при активации или угнетении липидпероксидации / Е.М.Шаповалова, Г.А.Сулкарнаева, А.Ю.Рудзевич // Фундаментальные исследования. - 2006. -11. - С.52-15.HБышевскийH А.Ш. Влияние витаминов А, Е, С, Р, вводимых порознь и одновременно, на внутрисосудистое свертывание крови / А.Ш.HБышевскийH, С.Л.Галян, H Е.М.Шаповалова и др. // Современные наукоёмкие технологии. - 2007. - 1. - С.

H 24-16.Пустынников А.В. Взаимодействие тромбин-фибриноген, толерантность к тромбину и липидпероксидация зависят от обеспеченности витамином Е / А.В.Пустынников, Е.М Шаповалова., М.К.Умутбаева //H Современные наукоёмкие технологии. – 2007H.- 11. – С. 98-17. Бышевский А.Ш. Состояние системы гемостаза и перекисного окисления липидов у декомпенсированных больных сахарным диабетом 1 типа / А.Ш.Бышевский, Е.М.Шаповалова, С.Л.Галян, Б.И.Кузник и др. // Тромбоз, гемостаз и реология (Москва). - 2007. - 1. - С. 19-18.Бышевский А.Ш. Коагуляционная активность надмолекулярных частиц, циркулирующих в кровотоке, свертываемость артериальной и венозной крови, интенсивность липидпероксидации и толерантность к тромбину / А.Ш.Бышевский, Б.И.Кузник, Е.М Шаповалова и др. // Тромбоз, гемостаз и реология (Москва). - 2007.- 4.- С.33-19.Шаповалова Е.М. Витамин С, липидпероксидация и непрерывное внутрисосудистое свертывание крови / Е.М.Шаповалова, А.В.Пустынников, А.Ю.РудзевичH // Современные наукоёмкие технологии. – 2007. -11. – С. 99-1H 20.Бышевский А.Ш. Связь кобаламина с гемостазом / А.Ш.Бышевский, Е.В.Забара, Е.М.Шаповалова и др. / Медицинская наука и образование Урала, 2007. - 6. - С.9-12 Витамин РР: влияние на гемостаз (обзор литературы) / Е.М.Шаповалова, Е.В.Забара, И.В.Зверева и др. // Медицинская наука и образование Урала, 2008. - 3. С.189-121. Бышевский А.Ш. Маркеры взаимодействия тромбин-фибриноген, коагулоактивность тромбоцитов, фибринолиз, толерантность к тромбину и состояние ЛПО при содержании крыс на сбалансированном рационе без витамина ВB и с его B избытком / А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, Е.М.Шаповалова и др. // Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - 4. - С.32-22.Шаповалова Е.М. Влияние токоферола на ф.XIIа-зависимый фибринолиз и толерантность к тромбину / Е.М.Шаповалова, П.Я.Шаповалов, А.В.Шидин // Медицинская наука и образование Урала. - 2007. - 3. - С.86-23.Шаповалова Е.М. Эффекты эстрогенов и гестагенов на гемостаз / Е.М.Шаповалова, А.В.Пустынников, Г.А.Сулкарнаева и др. / Медицинская наука и образование Урала. - 2007. - 4. - С.81-24.Бышевский А.Ш. Тканевой фактор, его место в свертывании крови / А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, Е.М.Шаповалова и др. // Медицинская наука и образование Урала. - 2007. - 4. - С.78-25.Шаповалова Е.М. Эффекты ретинола на гемостаз, липидпероксидацию при H одновременном введении с прооксидантомH / Е.М.Шаповалова, А.В. Пустынников, А.Ю.Рудзевич // Современные наукоёмкие технологии. - 2007. 11. - С. 98-26.Бышевский А.Ш. Состояние иммунитета, гемостаза, процессов ПОЛ и лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии при диффузном токсическом зобе / А.Ш.Бышевский, Е.М.Шаповалова, С.Л.Галян и др. // Тромбоз, гемостаз и реология (Москва). - 2008. - 2. - С. 27-27.HБышевскийH А.Ш. Неспецифическая коррекция изменений гемостаза при заболеваниях, протекающих с гиперкоагуляцией /А.Ш.HБышевскийH, С.Л.Галян, В.А.

Полякова Е.М.Шаповалова и др. // Фундаментальные исследования. – 2008. - 2H.

H – С.29-28. Шаповалова Е.М.HГемостаз при избытке и отсутствии витамина С в рационе питанияH / Е.М.Шаповалова // Фундаментальные исследования. – 2008. – 3. – H С.93-94 H 29.HБышевский H А.Ш. Липидпероксидация, антиоксидантный потенциал и неH прерывное внутрисосудистое свертывание крови при действии кобаламинаH / А.Ш.HБышевский, Е.В.Забара, Е.М. Шаповалова и др.H // Фундаментальные исH следования. – 2008. – 3. – С.91-91H 30. Бышевский H А.Ш. Гемостаз при неразвивающейся беременности, влияние H H антиоксиданта селмевитаH /А.Ш.HБышевский, В.А.Полякова, Е.М.Шаповалова //H H Успехи современного естествознания. – 2008. 5H. С.83 - 31.HБышевскийTH А.Ш. Эффект кобаламина на гемостаза / А.Ш.HБышевскийT, T TH HT T H И.В.Зверева, Е.М.Шаповалова и др. // Современные наукоёмкие технологии. – TH 2008. – 2. – С.T153-1H 32. Шаповалова Е.М.Эффекты кобаламина на липидпероксидацию, уровень маркеров взаимодействия тромбин-фибриноген и толерантность к тромбину на фоне атерогенного рациона / Е.М.Шаповалова, Е.В.Забара, И.В.Зверева // Ака демический журнал Западной Сибири, 2008. - 3.- С.72-33. Bishevsky A.Sh. The connection between lipid peroxidation and thrombinfibrinogen interaction / A.Sh Bishevsky., E.M.Shapovalova, A.V.Shidin e.a. // European journal of natural history, 2007. - 2. - P.43-34. Bishevsky A.Sh. Influence of ethinylestradiol and levonorgestrel on thrombinfibrinogen interaction and thrombin tolerance / A.Sh.Bishevsky, E.M.Shapovalova, S.L.Galyan e.a. // European journal of natural history, 2007. - 5. - P.53-35.Bishevsky A.Sh. Plasmatic level of thrombin-fibrinogen interaction markers is connected with lipid peroxidation in thrombocytes, leucocytes and erythrocytes / A.Sh.Bishevsky, E.M.Shapovalova, S.L.Galyan e.a. / / International J. of experimental education. - 2008. - 3. - P.22-36.Алборов Р.Г. Маркеры непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантность к тромбину при гипертромбинемии /Р.Г.Алборов, Л.А.Васильев, Е.М.Шаповалова и др. // Медицинская наука и образование Урала. – 2009. – 2 (58). – С. 49-37.Бышевский А.Ш. Влияние разных доз витамина С на толерантность к тромбину у несинтезирующих его животных /А.Ш.Бышевский, Р.Г.Алборов, Е.М.Шаповалова и др. // Медицинская наука и образование Урала. – 2009. – 2 (58). – С.55-38. Bishevsky A.Sh. Antioxidant complex selmevit in hemostasis correction at some uterine surgeries / A.Sh.Bishevsky, S.L.Galyan, E.M.Shapovalova e.a./ European J. of natural history. - 2008. - 3. - P.10-39. Bishevsky A.Sh. Plasmatic level of thrombin-fibrinogen interaction markers is connected with lipid peroxidation in thrombocytes and erythrocytes /A.Sh.Bishevsky, S.L.Galyan, E.M.Shapovalova, e.a. // European J. of natural history. - 2008. - 3. - P.6240. Bishevsky A.Sh. The connection between lipid peroxidation and thrombinfibrinogen interaction / A.Sh. Bishevsky, A.Y.Rudzevich E.M.Shapovalova e.a. // The fundamental researches. - 2009. - 3. - P.4-Монографии (и главы в них) 41. Шаповалова Е.М., Шаповалов П.Я., Ткаленко И.А.и др. Влияние на гемокоагуляцию донатора метильных групп витамина ВB B (пангамата) // в монографии «Витамины, внутрисосудистое свертывание крови и липидпероксидация». - Москва: Медицина. - 2006. - С.51-42.Соловьев В.Г., Шаповалова Е.М., Зверева И.В. Вторичный (коагуляционный) гемостаз / / в монографии «О перспективах коррекции природными цеолитами гемостатических сдвигов». - Ханты-Мансийск: Издательский центр Х МГМИ, филиал ЮУНЦ РАМН, ТГМИ. - 2007. - С.27-43.Шаповалова Е.М. Перекисное окисление липидов и его роль в регуляции гемостаза // в монографи «О перспективах коррекции природными цеолитами гемостатических сдвигов». - Ханты-Мансийск: Издательский центр Х-МГМИ, филиал ЮУНЦ РАМН, ТГМИ. - 2007. - С.43-44.Шаповалова Е.М., Рудзевич А.Ю., Шидин А.В.и др. Влияние аскорбиновой кислоты на липидпероксидацию и внутрисосудистое свертывание крови при гипероксидации / / в монографии «Зависимость гемостаза от С-витаминной обеспеченности организма» - Москва: Медицинская книга. - 2007. – С.40-45.Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Шаповалов П.Я., Шаповалова Е.М. // монография «Влияние важнейших витаминов-антиоксидантов на непрерывное внутрисосудистое свертывание толерантность к тромбину». - Москва: Медицинская книга - 2009. - 112 с Используемые сокращения АВР Активированное время рекальцификации АК Аскорбиновая кислота АЧТВ Активированное частичное тромбопластиновое время ВТФ Взаимодействие тромбин-фибриноген ГЦ Гомоцистеин ГГЦ Гипергомоцистеинемия ДВС Диссеминированное внутрисосудистое свертывание (крови) ДК Диеновые конъюгаты КБ Кобаламин ЛПО Липидпероксидация (перекисное окисление липидов) НВСК Непрерывное внутрисосудистое свертывание крови НК Никотиновая кислота НЦ Ниацин ТБК Продукты, взаимодействующие с тиобарбитуровой кислотой ТкТР Толерантность к тромбину ТФ Токферол (витамин Е) РКМФ Растворимые комплексы мономерного фибрина ПДФ Продукты деградации фибрина ПИ Период индукции СО Скорость индуцированного окисления Ф. фф. Фактор (факторы) Шаповалова Елена Михайловна МЕХАНИЗМЫ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ СДВИГОВ ПРИ ОТСУТСТВИИ, ДЕФИЦИТЕ И ИЗБЫТКЕ ВИТАМИНОВ С АНТИОКСИДАНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ В РАЦИОНЕ ПИТАНИЯ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук 03.03.01 - Физиология Отпечатано в типографии «…….» Лицензия № … от …. 6250… Тюмень, ул. ………., д. № …. Тел. (3452) ……






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.