WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

СТАРОВЕРОВ
Сергей Александрович

Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных

03.00.04 – биохимия

16.00.04 – ветеринарная фармакология с токсикологией

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук

Саратов – 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научный консультант

доктор биологических наук

Дыкман Лев Абрамович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

старший научный сотрудник

Соколов Олег Игоревич

доктор ветеринарных наук, доцент

Домницкий Иван Юрьевич

доктор ветеринарных наук, профессор

Жолобова Инна Сергеевна

Ведущая организация:

ФГУ Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных

Защита состоится «23» декабря 2009 г. в 13.00  на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13, Тел./факс (8452)970383).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК.

Автореферат разослан «___» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. В последнее время большое внимание исследователей в различных отраслях знаний уделяется оценкам новых возможностей, возникающих в связи с бурным развитием нанотехнологий. В том числе, это касается биохимии и фармакологии, где уникальные свойства наноструктурированных объектов создают весьма благоприятную основу для конструирования новых типов диагностических систем и лекарственных форм.

В литературе отмечается все больше сведений о применении носителей нанометрового диапазона в качестве средств доставки антигенных и лекарственных веществ к иммунокомпетентным клеткам и пораженным органам макроорганизма. Эти результаты позволяют надеяться, что с помощью подобных систем можно значительно снизить токсичность и повысить эффективность действия традиционно используемых лекарственных препаратов. Весьма перспективным, в частности, оказывается применение наночастиц в качестве составных частей потенциальных лекарственных форм для конструирования противоопухолевых, противогрибковых, бактерицидных и антивирусных препаратов. Кроме того, в последнее время активно развиваются исследования, имеющие целью разработку вакцинных препаратов на основе нанометровых носителей и их применение в медицине и ветеринарии (Han et al., 2007).

В качестве корпускулярных носителей для биологически активных веществ используются такие структуры, как фуллерены и дендримеры, липосомы, полиакрилатные частицы, мицеллы, коллоидное золото (КЗ) и др. Известно, в частности, что инъекционное введение лабораторным животным КЗ может приводить к его накоплению в ретикулярных клетках лимфоидной ткани, активации клеточного и гуморального иммунного ответа (Дыкман, Богатырев, 2007). Кроме того, КЗ применяют как вектор для непосредственного внесения лекарственных веществ в очаги воспаления и в пораженные органы макроорганизма (Kattumuri et al., 2007).

Была показана возможность применения КЗ для терапевтического воздействия на злокачественные новообразования (Paciotti, 2004; El-Sayed, 2005). Исследователи наносили на поверхность коллоидной частицы фактор некроза опухолей и вводили полученный конъюгат пораженным опухолями мышам. В итоге было установлено, что комплекс КЗ с фактором некроза менее токсичен и более эффективен в терапевтическом воздействии на опухоль по сравнению с нативным фактором, несмотря на то, что конъюгированный с золотыми наночастицами фактор вводился в организм в меньшей дозе. Однако биодинамика золотых частиц, вводимых в организм, изучена недостаточно. В известных работах авторы отмечают (Eisler, 2004; Li et al., 2007), что частицы КЗ захватываются гепатоцитами, секретируются желчью и выводятся из организма с каловыми массами.

Конструирование терапевтических препаратов на основе мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ) также находит все более широкое применение в современной ветеринарной медицине (You et al., 2007; Lo et al., 2007). Это связано с тем, что данная корпускулярная система позволяет использовать лекарственные субстанции, обладающие ярко выраженными гидрофобными свойствами.

Введение активного вещества в эту систему в ряде случаев приводит к повышению биодоступности лекарственной формы, что способствует более высокой терапевтической активности и снижению дозировки препарата. Поэтому препараты, сконструированные на данной основе, обладают меньшей токсичностью.

Таким образом, приведенное выше краткое резюме результатов проведенного нами анализа литературных данных свидетельствует об актуальности темы данной диссертации. Этот анализ позволяет также констатировать, что ко времени начала наших исследований в этой области наблюдался дефицит сведении по:

а) молекулярным и клеточным механизмам иммуномодулирующего действия наночастиц в составе комплексов с широким спектром разнообразных антигенов и примерам их использования для получения in vivo поликлональных антител к низкомолекулярным веществам (гаптенам);

б) эффектам взаимодействий коньюгатов КЗ с антигенами (низкомолекулярными и высокомолекулярными) с имунокомпетентными клетками, а также аналогичным данным при использовании в качестве наноструктурированных носителей антигенов мицеллярных структур;

в) примерам конструирования препаратов на мицеллярной и мицеллярно-гелевой основе и их применению в ветеринарной медицине.

Целью нашей работы было изучение механизмов взаимодействия высоко- и низкомолекулярных антигенов, ассоциированных с корпускулярными носителями (коллоидное золото и мицеллы), с клетками ретикулоэндотелиальной системы, разработка основ конструирования фармацевтических композиций с применением данных наноструктур и изучение их фармакодинамических свойств.

В соответствии с данной целью, в работе решались следующие основные задачи:

  1. С использованием золотых наночастиц в качестве носителя антигенов и адъюванта получить поликлональные антитела против ряда лекарственных веществ (ивермектин, кленбутерол, диминазен) для их детектирования и анализа фармакодинамики в биологических жидкостях животных.
  2. Исследовать особенности взаимодействий коньюгатов коллоидного золота с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценить эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов.
  3. Исследовать особенности взаимодействий комплексов мицеллярных структур с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценить эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов.
  4. Разработать физико-химические основы получения новой мицеллярной инъекционной лекарственной формы диминазена с применением неионогенного поверхностно-активного вещества, оценить его фармакологические характеристики и терапевтические свойства.
  5. Разработать физико-химические основы получения новой мицеллярно-гелевой формы ивермектина для наружного применения, оценить его фармакологические характеристики и терапевтические свойства.

В ходе реализации этой цели и задач были получены результаты, научная новизна которых заключается в следующем:

- впервые с применением коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта получены поликлональные антитела к низкомолекулярным веществам (ивермектин, диминазен и кленбутерол), использованные для определения и анализа ивермектина и диминазена в биологических жидкостях животных;

- впервые получены экспериментальные результаты, характеризующие взаимодействие низко- и высокомолекулярных веществ, коньюгированных с золотыми наночастицами, либо ассоциированных с мицеллами ПАВ, с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценены эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов;

- разработана новая мицеллярная инъекционная лекарственная форма на основе диминазена, проведено изучение ее фармакологических и фармакодинамических свойств;

- сконструирована новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма для наружного применения на основе ивермектина, проведено изучение ее фармакологических и фармакодинамических свойств.

Полученные результаты имеют также определенную практическую значимость. Прежде всего, это касается данных об особенностях взаимодействий комплексов антигенов с использованными наночастицами с иммунокомпетентными клетками, позволяющих судить о возможных механизмах их иммуномодулирующих свойств. Это делает более эффективным решение задач получения iv vivo поликлональных антител к слабоиммуногенным антигенам, а также открывает перспективу разработке вакцин нового поколения. В частности, нами были разработаны и защищены патентами РФ адъювант для вакцин на основе мицеллярных структур и адъювант на основе КЗ. Кроме того, на основе сконструированной и защищенной патентом РФ лекарственной формы разработана фармацевтическая композиция для лечения заболеваний микробной и паразитарной этиологии. На основе данной композиции создано два препарата, прошедшие регистрацию и допущенные к производству как противопаразитарные и антимаститные гели. Был разработан и защищен патентом РФ препарат для лечения заболеваний кровепаразитарной этиологии. Данный инъекционный препарат прошел регистрацию и допущен к производству. Результаты работы были представлены на Втором саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций, 2006 г., ряде российских и региональных выставок.

На защиту выносятся следующие основные положения:

  1. Использование коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта обеспечивает получение in vivo поликлональных антител против лекарственных веществ ивермектина, кленбутерола и диминазена, которые могут быть использованы для определения данных соединений в биологических жидкостях животных.
  2. Взаимодействие конъюгатов золотых наночастиц с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в фагоцитирующие клетки и вызывает стимулирование дыхательной активности макрофагов. Накопление низкомолекулярных веществ в фагоцитирующих клетках в присутствии наночастиц золота происходит более интенсивно. При этом само коллоидное золото вызывает повышение дыхательной активности макрофагов.
  3. Взаимодействие комплексов мицелл, полученных на основе неионогенных ПАВ, с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в фагоцитирующие клетки и вызывает стимулирование дыхательной активности макрофагов. Накопление низкомолекулярных веществ в фагоцитирующих клетках в присутствии мицеллярных наночастиц происходит более интенсивно. При этом сами неионогенные ПАВ активно проникают через мембраны клеток в цитоплазматическое пространство.
  4. Разработанная новая инъекционная мицеллярная лекарственная форма диминазена (Неозидин М) является стабильной и обладает высокой терапевтической эффективностью.
  5. Разработанная новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма ивермектина для наружного применения (Ивермек-гель) является стабильной и обладает высокой терапевтической эффективностью.

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: “Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений” , научный руководитель д.х.н. профессор С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 01890017743; “Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями”, научный руководитель д.х.н. профессор С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 01200606177.

Частично настоящая работа получила финансовую поддержку РФФИ (гранты №№ 04-04-48224-а; 07-04-00301-а; 07-04-00302-а); МНТЦ (проект № 2426); Федерального агентства по науке и инновациям (гос. контракт № 02.513.11.3028); Президиума РАН (проект в рамках программы фундаментальных исследований “Фундаментальные науки – медицине”).

Часть работы была выполнена на базе научно-исследовательского отдела ЗАО “Нита-Фарм” и Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с д.б.н. Дыкманом Л.А.. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору данной диссертации и в получении которых роль автора была определяющей.

В исследованиях также принимали участие сотрудники группы иммунотехнологии лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН аспиранты Видяшева И.В., Зайцева И.С. и Пристенский Д.В. А также сотрудники ЗАО “Нита-Фарм” Аксиненко Н.М., Василенко О.А., Габалов К.П., Ермилов Д.Н., Жемеричкин Д.А., Сазонов А.А., Семенов С.В., Сидоркин В.А., Сынкин С.Ю., Шведова О.В. и Улизко М.А. Всем им автор выражает глубокую благодарность.

Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы д.х.н. профессора С.Ю. Щеголева (ИБФРМ РАН) за интересное и полезное обсуждение результатов на всех ее этапах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлялись, докладывались и обсуждались на: межд. науч. конф. “Биотехнология на рубеже двух тысячелетий”, Саранск, 2001; VIII Всеросс. съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2002; I и III межрег. конф. молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой”, Саратов, 2002, 2006; 6, 7 и 8 John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, Pushchino, Russia, 2002, 2005, 2007; 1 и 5 межд. конгр. “Биотехнология – состояние и перспективы развития”, Москва, 2002, 2009; VIII Int. Conf. “The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology”, Saratov, Russia, 2003; науч. конф. “Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями”, Москва, 2003, 2004, 2005; межд. науч.-практ. конф. “Актуальные проблемы инвазионной, инфекционной и незаразной патологии животных”, Ставрополь, 2003; межд. конф. “Основные достижения и перспективы развития паразитологии”, Москва, 2004; межд. науч.-практич. конф. “Современные проблемы иммуногенеза, теории и практики борьбы с паразитарными и инфекционными болезнями сельскохозяйственных животных”, Уфа, 2004; X Всеросс. конф. “Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов”, Саратов, 2004; 9 межд. школе-конф. молодых ученых “Биология – наука XXI века”, Пущино, 2005; Всеросс. конф. “Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты”, Саратов, 2005; Saratov Fall Meeting, Workshop on Nanobiophotonics I, II, III, IV, Saratov, Russia, 2005, 2006, 2007, 2008; межд. науч.-практ. конф. “Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных”, Ульяновск, 2006; межрег. науч. конф., посвященной 119-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, Саратов, 2006; межд. науч. конф. “Микробные биотехнологии”, Одесса, Украина, 2006; VI Всеросс. конф. молодых ученых “Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии”, Саратов, 2007; 15 межд. науч. конф. “Высокие технологии в биологии, медицине и геоэкологии”, Новороссийск, 2007; 10 Analytical Russia-German-Ukrainian Symp., Saratov, Russia, 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 83 печатные работы, в том числе 4 патента, 23 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, 16 статей в отечественных и зарубежных сборниках научных трудов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей три главы, заключения и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 303 страницах, иллюстрирована 71 рисунком и включает 71 таблицу. Список использованных литературных источников содержит 440 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 представляет собой литературный обзор, в котором рассмотрены и проанализированы современные сведения об иммунной системе. Подробно обсуждены свойства и применение в медицине и биологии конъюгатов золотых наночастиц. Приведены данные о самоорганизующихся системах на основе поверхностно активных веществ, их физико-химических и биологических свойствах. Особое внимание уделено анализу современных аспектов конструирования лекарственных средств на основе воднодисперсных и мицеллярно-гелевых структур, их применению в ветеринарии и медицине.

Сведения об использованных материалах и методах изложены во второй главе. Кроме того, некоторые оригинальные методики представлены в соответствующих разделах третьей главы. Во второй главе подробно описаны процедуры получения перитонеальных макрофагов и лимфоцитов периферической крови и их использование для изучения иммунного ответа in vitro. Приведены методики иммунизации животных и получения антител in vivo с применением в качестве носителя антигенов наночастиц золота и in vitro – путем селекции специфичных клонов из комбинаторных фаговых библиотек миниантител. Подробно изложена методология иммуноцитохимического анализа с использованием флуоресцентной микроскопии. Большое внимание уделено количественному определению лекарственных веществ хроматографическим (ВЭЖХ) и спектроскопическими (УФ, ИК) методами. Отдельно описаны процедуры синтеза золотых наночастиц и получения на их основе конъюгатов с гаптенами. Кроме того, приведены методики конъюгации гаптенов с белками-носителями. Оценка изменения дыхательной активности клеток проводилась по способности клеток восстанавливать нитротетразолевый синий бромид до формазана (МТТ-тест) по общепринятому методу (Bernas, Dobrucki, 2000) с небольшими модификациями.

Оригинальные методики получения мицеллярных растворов лекарственных веществ и определения их остаточного уровня в биологических жидкостях животных изложены во второй главе диссертации в виде подробных протоколов.

Глава 3. Результаты и обсуждение собственных исследований

3.1. Получение поликлональных антител к ивермектину и его детекция в биологических жидкостях животных

Ивермектин – макроциклический дисахарид противопаразитарного действия, представляет собой дигидропроизводное авермектинов В1а и В1в, вырабатываемых грибами Streptomyces avermitilis. Препараты, содержащие в качестве активного вещества ивермектин, широко распространены как в растениеводстве, так и в ветеринарии из-за их широкого спектра действия на вредителей растений и паразитов животных (Li et al., 1997; Fink, 1988).

С момента появления лекарственных форм ивермектина стали активно разрабатываться методы его выявления в органах и тканях, сыворотке крови и молоке. Однако многие из этих методов не удовлетворяют исследователей из-за своей сложности, малой чувствительности или трудности в адаптации к современной материально-технической базе. Поэтому мы оценили возможность получения антител к ивермектину при использовании различных корпускулярных носителей для решения задач его определения в сыворотке крови животных и в продуктах ветеринарно-санитарного надзора после применения различных лекарственных средств на его основе.

В начальной стадии наших исследований мы столкнулись со сложностью детекции ивермектина в биологических жидкостях животных при использовании ВЭЖХ. Хроматографические методы определения ивермектина, описанные в литературе (Rabel et al., 1993; Fink et al., 1996; Cerkvenik et al., 2001; Anastasio et al., 2002), основаны на очистке биологического образца путем жидкостной и/или твердофазной экстракции, дериватизации экстрагированного ивермектина в неводном растворителе для получения флуоресцентного производного и ВЭЖХ анализе с флуориметрическим детектированием при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 нм и 470 нм соответственно. Для улучшения метрологических характеристик метода применяется внутренний стандарт – абамектин. Однако мы не смогли в нашей лаборатории непосредственно воспроизвести указанные методы по причине присутствия на хроматограммах холостых образцов (образцов, не содержащих ивермектин) хроматографического пика, совпадающего по Rf с флуоресцентным производным ивермектина (компонент В1а). Присутствие такого пика, свидетельствующего о наличии примеси, делает невозможным определение концентрации ивермектина ниже 50 нг/мл.

Для решения этой проблемы нами был подобран растворитель (метилтретбутиловый эфир), в котором растворимы 1-метил-имидазол, трифторуксусный ангидрид, ивермектин, абамектин, а также флуоресцентные производные ивермектина и абамектина, но не растворима примесь. Для учета количества ивермектина, связанного с эритроцитами, в нашем варианте абамектин добавляют непосредственно в кровь, а анализируется не сыворотка, а плазма.

Разработанный нами протокол был использован для определения ивермектина в образцах крови и молока крупного рогатого скота после применения ивермектин-содержащих препаратов. Диапазон обнаружения ивермектина в сыворотке крови данным методом составляет от 1 до 200 нг/см3, что соответствует имеющимся литературным данным (Bernal et al., 1994; Hsieh et al., 2003).

Усовершенствовав хроматографический метод детекции ивермектина, мы провели иммунизацию животных различными конъюгатами ивермектина с целью получения антител. Поликлональные антитела, полученные иммунизацией кроликов конъюгатами ивермектина с КЗ и белком, были протестированы методом иммуно-дот анализа. Установлено, что все полученные антисыворотки взаимодействовали с гомологичными антигенами и имели высокую специфичность. Чувствительность полученных сывороток в дот-анализе составила 0.3 нг. Методом иммуноферментного анализа был определен титр полученных сывороток. При обоих вариантах иммунизации титр сывороток оказался примерно одинаковым и составил 1:256.

В литературе встречаются работы по получению антител к ивермектину. Так, Crooks с соавт. (1998) проводили детекцию ивермектина в печени крупного рогатого скота с использованием иммуноферментного анализа. Для получения антител авторы готовили конъюгаты ивермектина с апо-трансферином. Полученным конъюгатом, смешанным с полным адъювантом Фрейнда, проводили иммунизацию кроликов. Авторы отмечают высокое качество полученных антител, а так же большую чувствительность разработанного метода. Однако необходимо отметить сложность приготовления конъюгата ивермектин/белок. В нашей работе из-за гидрофобности ивермектина реакцию проводили не в буферной системе, а в органическом растворителе, что влекло за собой денатурацию белковой фракции конъюгата.

В работах (Mitsui et al., 1996; Samsonova et al., 2002; Li et al., 1997) антитела также получены при использовании конъюгатов ивермектина с белковым носителем. Чувствительность выявления антигена в этих методах колебалась от 0.3 до 10 нг/мл, что соответствует полученным нами данным. Однако, при использовании нами конъюгата ивермектин-КЗ значительно упрощаются процедуры иммунизации и исключается этап очистки полученных сывороток от сопутствующих антител против эпитопов белка-носителя.

Полученные сыворотки были использованы нами для детекции ивермектина в крови и молоке коров, которым препарат вводился однократно в терапевтической дозе. Исследуемые биологические жидкости (плазму крови и молоко) наносили непосредственно на ПВДФ мембрану. В качестве отрицательного контроля использовали плазму крови и молоко животных контрольной группы (препарат не вводился). Параллельно с иммуноанализом пробы исследовали методом ВЭЖХ.

На рис. 1 представлен график изменения концентрации ивермектина в образцах крови, полученный методом ВЭЖХ. Концентрация ивермектина в пробах крови, отобранных через 2, 4, 8, 24 и 75 ч составила 60, 161, 104, 92 и 30 нг/мл соответственно. Результаты иммуно-дот анализа проб плазмы крови оказались сопоставимы с хроматографическим методом. Необходимо отметить, что хроматографический и иммунологический методы обладают сравнимой чувствительностью и диапазоном определяемых концентраций.

К+(1) К+(2)  60 нг  161 нг 104нг 92 нг  30 нг  К-(1) К-(2)

Рис. 1. Изменение концентрации ивермектина в крови после его внутримышечного введения животным.

После проведения работы по обнаружению ивермектина в плазме крови мы провели аналогичные исследования по детекции ивермектина в молоке (рис. 2). Измерение препарата в молоке проводили через 1, 3, 6, 24, 48 и 72 ч после введения препарата. Концентрация ивермектина составила 33, 45, 56, 112, 109 и 66 нг/мл соответственно. Таким образом, также как и в плазме крови, ивермектин выявляется в молоке как хроматографическим, так и иммунологическим методом.

       

К- 33 нг 45 нг 56 нг 112 нг 109 нг 66 нг К+(1) К+(2)

Рис. 2. Изменение концентрации ивермектина в молоке после его внутримышечного введения животным.

Несмотря на то, что дот-анализ позволяет зарегистрировать лишь присутствие определяемого препарата в пробе и относительное изменение его концентрации (по интенсивности окраски дота), данный метод отличает экспрессность, простота пробоподготовки, доступность используемого оборудования и материалов.

На следующем этапе мы расширили эти исследования на другие низкомолекулярные вещества, обладающие иными физико-химическими свойствами.

3.2. Получение поликлональных антител к диминазену

Среди многочисленных лекарственных субстанций несомненный интерес представляют препараты, воздействующие на возбудителей кровепаразитарных болезней, вызываемых как жгутиковыми простейшими (трипаносомы), так и представителями класса Piroplasmida (бабезии, тейлерии, цитоксзооны) у различных видов домашних и диких животных, поскольку данные возбудители являются внутриклеточными паразитами. Для этих целей наиболее часто используются препараты, относящиеся к группе ароматических диамидинов. Наиболее распространенным ветеринарным препаратом, используемым для борьбы с данными возбудителями, является диминазен ацетурат – 4, 4/ бензинодиазоаминодиамидин диацетурат (Brodersen et al., 1958; Homer et al., 2000) и его лекарственная форма в смеси с антипирином – беренил.

Получение антител к диминазену связано с преодолением довольно большой сложности получения конъюгатов на данное активное вещество. В последнее время в литературе встречаются работы по получению конъюгатов диминазена на основе липидной матрицы (Olbrich et al., 2002, 2004). В этих работах авторы рассматривали комплекс гидрофильного лекарственного вещества (в данном случае диминазена) и наночастицы на основе липидной матрицы. Рассматривалась также биодинамика и токсичность данного комплекса.

В нашей лаборатории мы не смогли получить устойчивых конъюгатов диминазена с КЗ. Поэтому сначала мы конъюгировали диминазен с бычьим сывороточным альбумином (БСА), а затем получили конъюгат диминазен-белкового комплекса с КЗ, что значительно снизило дозировку при иммунизации. После иммунизации кроликов вышеописанным конъюгатом нами были получены специфические сыворотки, которые были проверены в иммуно-дот методе и иммуноферментном анализе. Чувствительность полученной сыворотки составила 0.6 мкг при титре 1:512.

Получив специфические к диминазену сыворотки, мы проводили с их помощью анализ динамики содержания диминазена в плазме крови телят. В качестве эталонного метода мы использовали ВЭЖХ метод определения диминазена со спектрофотометрическим детектированием. Животных для проведения исследований подбирали по принципу аналогов. Препарат вводили внутримышечно в терапевтической дозе согласно наставлению (3.5 мг/кг). Кровь у животных отбирали через 0.17, 0.35, 0.74 ч, а также через 2, 4, 6, 8 и 9 ч. Иммунологический метод дублировали хроматографическим.

В результате было установлено, что диминазен достигает своей максимальной концентрации в сыворотке крови в течение первого часа после инъекции и составляет 4.33 мкг/мл. В дальнейшем мы наблюдали его постепенное снижение, и к 9 ч его концентрация составляла 0.93 мкг/мл (рис. 3).

1.75 мкг  4 мкг 4.3 мкг  3.5 мкг 2.4 мкг 1.6 мкг 1.2 мкг 1 мкг К+(1) К+(2) К-

Рис. 3. Кинетика содержания диминазена в плазме крови телят.

Полученные нами результаты определения диминазена методом ВЭЖХ частично совпадают с аналогичными данными по кинетике содержания деминазена, приведенными в работах (Aliu et al., 1993; Rampal, Chaudhary, 2000). Однако пик максимума диминазена в данных работах был немного выше, что, по-видимому, связано с видовыми и климатическими (работы проводились в ЮАР и Индии) особенностями.

При сравнении хроматографических данных по фармакокинетике с данными иммуно-дот метода можно отметить, что наиболее четкая детекция диминазена наблюдается в диапазоне от 3.55 до 0.90 мкг/мл (рис. 4), в больших концентрациях наблюдается слияние окраски пятен, что приводит к сложности определения больших концентраций диминазена в образцах.

3.3. Получение поликлональных антител к кленбутеролу

Кленбутерол (4-амино-(t-бутиламино) метил)-3,5-дихлоробензил алкоголь гидрохлорид) относится к группе лекарств, воздействующих на β2-адренорецепторы (Авакян, 1988), и используется как бронхорасширяющий препарат в медицине и ветеринарии (Ramos et al., 2003). В нетерапевтических дозах эти препараты могут быть рассмотрены как допинг-агенты в спорте. Повышенная доза этого лекарства имеет липолитический и анаболический эффект. Фактически β2-агонисты могут незаконно использоваться как стимуляторы роста в животноводстве (Cojmerac et al., 2000; Schiavone et al., 2004). Остатки таких препаратов могут накапливаться в больших количествах в ливере и мясе, что может делать эти продукты токсичными для человека (Vela et al., 2001; Traynor et al., 2003).

Детекцию кленбутерола в настоящее время осуществляют при помощи газовой хроматографии (Batjoens et al., 1996), капиллярного электрофореза (Vela et al., 2001), высокоэффективной жидкостной хроматографии (Bazylak, Nagels, 2002). Имеются также данные по разработке иммуноферментных и иммунохроматографических тест-систем к кленбутеролу (Shelver, Smith, 2000; Zhao et al. 2004; Liu, 2004; Zhang et al., 2006).

Хотя в отношении кленбутерола имеется довольно большое количество методов детектирования, методы с использованием антител, все-таки, обладают определенной привлекательностью для исследователей. Поэтому мы поставили перед собой задачу изучить возможность применения конъюгатов кленбутерола с КЗ для получения антител и исследовать их специфичность.

Мы провели конъюгирование кленбутерола с КЗ (кленбутерол-КЗ) и бычьим сывороточным альбумином (кленбутерол-БСА) и иммунизировали полученными конъюгатами кроликов. После иммунизации кроликов конъюгатами титр антител в полученной сыворотке составил, как для кленбутерол-БСА, так и для кленбутерол-КЗ 1:1024 (рис. 4).

После определения титра антител в полученной сыворотке, проверили их специфичность. Одним из методов определения специфичности антител к кленбутеролу и его аналогам является метод иммуно-дот анализа с использованием конъюгата антикроличьих иммуноглобулинов с КЗ (рис. 5, 6).

Рис. 4. Титр специфических антител в сыворотке кроликов, иммунизированных кленбутеролом, конъюгированным с различными носителями.

Рис. 5. Специфичность сыворотки, полученной от кроликов, иммунизированных кленбутеролом, конъюгированным с КЗ (1 – кленбутерол, 2 – тербуталин, 3 – фенотерол, 4 – сальбутамол).

Рис. 6. Специфичность сыворотки, полученной от кроликов, иммунизированных кленбутеролом, конъюгированным с БСА (1 – кленбутерол, 2 – тербуталин, 3 – фенотерол, 4 – сальбутамол).

По результатам иммуно-дот анализа видно, что сыворотка, полученная от кролика, иммунизированного конъюгатом КБ-КЗ, более специфична, так как она дает перекрест только с тербуталином, в отличие от сыворотки, полученной от кроликов, иммунизированных конъюгатом КБ-БСА, которая показала перекрест со всеми аналогами кленбутерола.

Таким образом, можно констатировать, что конъюгаты кленбутерола с КЗ вызывают синтез высокоспецифичных антител у кроликов при иммунизации. При этом антитела, полученные данным способом, не уступают по титру антителам, полученным на конъюгаты кленбутерола с белком, но превосходят их по специфичности.

3.4. Изучение взаимодействия конъюгатов гаптен-КЗ с клетками ретикулоэндотелиальной системы

Проведя исследования по получению антител на гаптены, конъюгированные с КЗ, мы поставили перед собой вопросы: как происходит формирование иммунного ответа на КЗ-гаптен на уровне клетки и как происходит взаимодействие конъюгата КЗ-гаптен с клетками ретикулоэндотелиальной системы? Поэтому целью нашей работы на данном этапе было сравнительное исследование накопления лекарственного препарата, иммобилизованного отмеченным выше коллоидным носителем, в лейкоцитах животных.

В результате проведенных экспериментов было установлено следующее. При использовании ивермектина, конъюгированного с КЗ, наибольшая концентрация препарата определялась в перитонеальных макрофагах крыс. Для лимфоцитов цельной крови телят наблюдалось существенное снижение количества препарата в клеточной популяции (табл. 1).

Таблица 1. Концентрация ивермектина в клетках при использовании КЗ как носителя

Вид конъюгата / вид клеток

Внесено ивермектина, мкг

Найдено ивермектина,

мкг 108/л

Конъюгат ивермектин+КЗ / перитонеальные макрофаги

45.45

37.13

Конъюгат ивермектин+КЗ / лимфоциты цельной крови

45.45

0.63

Раствор ивермектина / перитонеальные макрофаги

45.45

2.254

Раствор ивермектина / лимфоциты цельной крови

45.45

0.2





Наибольшая концентрация ивермектина была обнаружена при использовании КЗ как носителя низкомолекулярного вещества, что говорит о более эффективном проникновении данного комплекса во внутриклеточное пространство. Кроме того, снижение количества препарата внутри клеточной популяции лимфоцитов, выделенных из цельной крови телят, по-видимому, указывает на фагоцитарный способ проникновения носителей с адсорбированным на нем низкомолекулярным веществом.

Определив концентрацию низкомолекулярного вещества в клеточной популяции, мы поставили перед собой вопросы: как данное вещество распределено в клеточном пространстве? Остается ли данная структура на поверхности клеточной мембраны или проникает во внутриклеточное пространство? Для ответа на эти вопросы были проведены цитохимические исследования препаратов, приготовленных из перитонеальных макрофагов, культивируемых в присутствии КЗ. После культивирования клеток с КЗ в них при помощи миниантител выявляли накопившийся ивермектин. Чтобы определить локализацию исследуемых веществ в клетках, мазки перед окраской обрабатывали холодным ацетоном 2-3 минуты для разрушения липидного слоя клеточных мембран. Тот факт, что при обработке исследуемого объекта ацетоном не происходит снижение интенсивности свечения клеток, выявляемого в люминесцентной микроскопии, может указывать на способность низкомолекулярного вещества, конъюгированного с коллоидным носителем, проникать во внутриклеточное пространство.

Следующим этапом нашей работы стало определение влияния самого КЗ на функциональную активность клеток перитонеальной полости. В эксперименте проводили смешивание конъюгатов КЗ с перитонеальными клетками крыс. Конечное количество клеток в пробе составило 1.0109/л.

В результате проведенных исследований нами были получены следующие данные. Наибольшее восстановление формазана в МТТ-тесте клетками произошло при их культивировании с КЗ и составило 0.250±0.05 мг/мл. В клетках, культивированных без него, количество восстановленного формазана было значительно ниже и составило 0.062±0.01 мг/мл, соответственно.

Исходя из приведенных выше результатов, можно отметить, что, по-видимому, КЗ способствует повышению дыхательной активности клеток ретикулоэндотелиальной системы и, тем самым, увеличивает фагоцитирующую активность клеток.

Способность наночастиц проникать во внутриклеточное пространство широко комментируется в современной литературе. Так, Borm и Mller-Schulte (2006) в своем обзоре рассматривали применение наночастиц в конструирование инъекционных лекарственных средств и связанные с этим риски. Отмечается зависимость размера частиц от способа их поглощения. При этом для КЗ с размером частиц меньше 39 нм при помощи активного переноса отмечается проникновение через мембрану, что, в принципе, подтверждается нашими результатами, так как обнаружение ивермектина во внутриклеточном пространстве в большем количестве отмечалось в клетках, культивируемых с конъюгатами ивермектина с КЗ. Merchant (1998) рассматривал в своем обзоре роль металлического золота в конструировании жидких лекарственных препаратов. Он высказал предположение о возможности перехода золота из его металлического состояния в форму соли, при том, что влияние этих соединений на стимуляцию физиологических реакций животных организмов известно. О способности КЗ служить носителем лекарственных веществ и, тем самым, способствовать их проникновению в клетки-мишени сообщается в работе (Paciotti et al., 2006). Проведя исследования в данном направлении, мы подтвердили имеющиеся данные, а также установили саму роль коллоидной частицы в способности гаптена накапливаться во внутриклеточном пространстве.

3.5. КЗ как носитель высокомолекулярных антигенов при иммунизации

Следующий этап нашей работы был связан с использованием КЗ как носителя высокомолекулярных антигенов при иммунизации. Для проведения исследований нами были выделены различные антигенные детерминанты из S. thyphymurium (штамм любезно предоставлен нам сотрудниками кафедры ветеринарной микробиологии Саратовского аграрного университета). После проведения электрофореза антигенов и определения их биохимических параметров проводили конъюгацию антигенов с КЗ.

Наиболее оптимальный конъюгат, который удовлетворял определенным экспериментальным требованиям, был получен с ДМСО (диметилсульфоксид)-антигеном (антигенный экстракт, выделенный с использованием ДМСО). Перед конъюгированием с золотом антиген метили флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).

Рис. 7. Клетки, культивированные с антигеном, меченным ФИТЦ, конъюгированным с КЗ

На рис. 7 показаны перитонеальные клетки, культивированные в присутствии антигенов, конъюгированных с КЗ. Зеленое свечение в цитоплазме клеток указывает на проникновение в клеточное пространство антигена, меченного ФИТЦ.

После получения данных результатов, мы сочли целесообразным оценить влияние конъюгатов КЗ с антигеном на функциональную активность ретикулоэндотелиальных клеток. А именно, на возможность активации митохондриального дыхания перитонеальных клеток in vitro. В эксперименте проводили смешивание конъюгатов КЗ с антигенами с перитонеальными клетками крыс. Конечное количество клеток в пробе составило 1.0109/л.

Рис. 8. Изменение количества восстановленного формазана в культуре перитонеальных клеток in vitro в зависимости от культивирования с конъюгатами КЗ и нативными антигенами.

В результате проведенных исследований нами были получены следующие результаты (рис. 8). Наибольшее восстановление формазана клетками произошло при их культивировании с коньюгатами КЗ+антиген и просто с КЗ и составило 0.263±0.05 мг/мл и 0.250±0.05 мг/мл, соответственно. В клетках, культивированных в присутствии нативного антигена и без него, количество восстановленного формазана было значительно ниже и составило 0.151±0.03 и 0.062±0.01 мг/мл, соответственно.

Подобные эксперименты были проведены также на белых лабораторных нелинейных мышах. Девять мышей были распределены по группам, в каждой по три животных. Первой группе мышей был введен конъюгат антигена с КЗ. Второй группе мышей был введен антиген, разведенный дистиллированной водой, в той же концентрации, что и в конъюгате с КЗ. Третья группа мышей была контрольной. Антиген вводился внутрибрюшинно в концентрации 100 мкг на животное, перед введением проводили взвешивание (масса мыши ~20 г). Через неделю все группы мышей были проиммунизированы повторно соответствующими растворами антигена, а еще через 6 дней у них были взяты перитонеальные макрофаги.

В результате проведенных исследований были получены следующие результаты (рис. 9): при введении антигена, конъюгированного с КЗ, наблюдалась наибольшая активность макрофагов, и количество восстановленного формазана составило 0.258±0.03 мкг/мл. Введение мышам не конъюгированного антигена приводит к некоторому снижению макрофагальной активности, которая составила 0.234±0.015 мкг/мл. У контрольной группы активность макрофагов составила 0.153±0.03мкг/мл. Таким образом, КЗ вызывало заметное стимулирование дыхательной активности макрофагов.

Рис. 9. Количество восстановленного формазана в перитонеальных клетках крыс после иммунизации животных антигеном и его конъюгатом с КЗ.

3.6. Мицеллярные системы на основе неионогенных поверхностно активных веществ и их применение в конструирование лекарств

Несмотря на то, что история исследований мицеллярных структур насчитывает около ста лет, их до сих пор принято считать своеобразными объектами физической химии. Интерес к воднодисперсным (и обращенным) мицеллам заметно возрос в последние годы в связи с применением их в качестве носителей разнообразных биологически активных соединений (Nandi, Basumallick, 1993; Armstrong et al., 1993; Aral, Akbuga, 2003) и конструированием на их основе лекарственных препаратов (Логинова, Полозов, 2003).

Оценка возможностей применения системы мицелла-активное вещество в современной ветеринарии и медицине является весьма актуальной задачей. Это связано с перспективами их использования для приготовления инъекционных лекарственных средств, содержащих гидрофобные вещества в качестве активного компонента (Woodburn, Kessel, 1994; Munshi et al., 1997). Однако биологические свойства мицелл мало изучены. В особенности вопросы, связанные с биодинамикой данных систем и их способностью реагировать с клеточными структурами. Исходя их этого, в данной части нашей работы были исследованы эффекты взаимодействия мицелл с различными системами организма лабораторных животных.

Вначале оценивалось воздействие мицеллярных систем на клетки ретикулоэндотелиальной системы. Опыты проводили на 4-5 месячных кроликах породы шиншилла, подобранных по принципу аналогов. Всех животных разделили на четыре группы по три головы в каждой. Препараты вводили внутримышечно в область внутренней поверхности бедра в дозе по 0.1 мл/голову, что соответствовало 20 мг белка. Кроликам первой группы вводили БСА, растворенный в мицеллярной системе (кремофор EL) с добавлением витаминов (А, Е, С), второй группы – БСА, растворенный в мицеллярной системе без витаминов, третьей группы – БСА, эмульгированный в полном адъюванте Фрейда (ПАФ), а для четвертой группы БСА растворяли в физиологическом растворе. Концентрация БСА составляла 200 мг/мл. Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в 2 недели. Через 7 дней после второй иммунизации проводилась реиммунизация.

Пробы крови отбирали из ушной вены через неделю после каждой иммунизации. Количество (титр) антител определяли в реакции гемагглютинации (РГА) по общепринятой методике. Ферментативную активность лимфоидных клеток крови (щелочную и кислую фосфатазу) определяли методами Кеплоу и Берстона. Фагоцитарную активность определяли по содержанию катионного белка методом Шубича и МТТ-тестом по Парку.

В результате проведенных исследований установлено, что через неделю после первой иммунизации титр антител в контрольной и опытной группах находился на одном уровне и составлял 1:128 (табл.2).

Таблица 2. Титры антител в сыворотке крови кроликов

Состав раствора для иммунизации

Первая иммунизация

Вторая иммунизация

Реиммунизация

Мицеллы (Е, А, С) + БСА

1:128

1:5120

1:10240

Мицеллы + БСА

1:128

1:2560

1:5120

ПАФ + БСА

1:128

1:2560

1:5120

Физ. р-р + БСА

1:128

1:1280

1:2560

Анализ изменений ферментативной активности клеток лимфоидного ряда кроликов при иммунизации их антигенами, вводимыми с различными адъювантами, показал незначительное увеличение активности кислой и щелочной фосфатазы в лимфоидных клетках, как при введении антигена, растворенного в физиологическом растворе, так и при иммунизации антигеном, растворенным в ПАФ и мицеллярными растворителями (табл. 3).

Полученные результаты оценок ферментативной активности лимфоидных клеток свидетельствуют о способности мицеллярного раствора с витамином Е стимулировать образование антител при иммунизации антигенами, на что указывает повышение активности, как катионных белков клеток нейтрофильного ряда, так и повышенная активность данных клеток в восстановлении зерен формазана при проведении НСТ-теста. ПАФ и водный раствор мицелл в данном случае проявляет аналогичную или даже более низкую реакцию. Что наблюдается так же и при иммунизации антигеном, растворенным в физиологическом растворе (табл. 4).

Таблица 3. Ферментативная активность клеток лимфоидного ряда

Название препарата

1-я иммунизация

2-я иммунизация

реиммунизация

КФ ед.)

ЩФ (ед.)

КФ (ед.)

ЩФ (ед.)

КФ (ед.)

ЩФ (ед.)

Кремофор EL, витамин Е+БСА

263±2

106±1

222±1

157±1.2

220±2

140±1

ПАФ+БСА

271±2

178±1

239±1

160±1

225±2

150±1

Физ.р-р+БСА

250±3

90±1

235±1

161±1

222±2

150±1

Контроль

90±2

100±1

87±1

100±1

90±2

95±1

Таблица 4. Результаты НСТ-теста

Название препарата

1 иммунизация

2 иммунизация

3 иммунизация

Катионный
белок

НСТ

Катионный
белок

НСТ

Катионный
белок

НСТ

Кремофор, витамин Е+ БСА

234±0.5

309±1

291±0.5

118±1

300±0.6

110±1

ПАФ+БСА

195±0.5

86±2

175±0.5

113±1

160±0.6

113±1

Физ.р-р+БСА

120±0.6

230±2

175±0.5

144±1

230±0.7

130±1

контроль

110±1

50±1

115±1

50±1

115±1

49±1

На следующем этапе работы мы провели изучение взаимодействия перитонеальных клеток крыс с твин-80, меченным ФИТЦ. На рис. 10 показаны клетки, культивируемые в присутствии твина-80, меченного ФИТЦ. По-видимому, твин, проходя через клеточную стенку, попадает в цитоплазму клетки (на это указывает зеленое свечение на оболочке клетки и в ее цитоплазме). Ядра клеток окрашены желтым цветом. Красным светится ядро мертвой клетки.

Рис. 10. Перитонеальные клетки крыс, культивированные с мицеллами, меченными ФИТЦ (зеленое свечение).

Исследование пролиферативной активности проводили с использованием солей тетразолия бромида, которые применяются для характеристики функционального состояния клеток при пролиферации. Это основывается на теории активации митохондриального дыхания клеток. По количеству восстановленного формазана судят о степени активации клеток этого типа. Хотя кислородный взрыв может и не быть основным механизмом лизиса поглощенных фагоцитами клеток, была получена положительная корреляция между количеством формазана и цитотоксической активностью в культуре полиморфноядерных клеток человека.

Из рис. 11 видно, что внесение ПАВ в клеточную культуру приводит к увеличению накопления восстановленного формазана в клетках на 73%. Анализируя полученные данные, следует отметить, что, по-видимому, сам ПАВ, воздействуя на систему мембран клеток, повышает их пролиферативную активность за счет стимуляции клеточного дыхания. Таким образом, можно предположить, что ПАВ за счет проникновения во внутреннее пространство перитонеальных клеток способен вызывать стимуляцию их фагоцитарной активности. Это может в дальнейшем способствовать повышению их иммунопрезентирующих свойств.

Рис. 11. Изменение концентрации восстановленного формазана в клетках при использовании ПАВ.

Проведя исследования на модельном объекте, мы продолжили работу с микробным антигеном. Использовали антигенный комплекс, выделенный из S. thyphimurium посредством экстракции биомассы трихлоруксусной кислотой (ТХУ). После выделения антиген содержал 27.7 мкг/мл белка и 202 мкг/мл полисахаридов. При проведении электрофореза наблюдалась белоксодержащая доминанта с молекулярной массой примерно 5-7 кДа. Полученный белковый антиген был конъюгирован с ФИТЦ и в дальнейшем использовался в наших экспериментах.

При инкубировании клеток в присутствии антигена, заключенного в мицеллы, мы зафиксировали его внутриклеточное проникновение (рис. 12). Установив способность антигена проникать внутрь перитонеальных клеток, а также способность мицеллярного носителя стимулировать это проникновение, мы предположили, что данная коллоидная система может стимулировать бактерицидную способность клеток лейкоцитарного ряда. Поэтому далее было проанализировано влияние антигенов и корпускулярных носителей на фагоцитарную активность перитонеальных клеток крыс (рис. 13).

Из рис. 13 видно, что внесение ПАВ в клеточную культуру приводит к увеличению восстановленного формазана в клетках до 0.175 мкг; внесение смеси ПАВ-антиген приводит к еще большему усилению выработки формазана (0.222 мкг), что указывает на совместное действия антигена и ПАВ на клетки.

Рис. 12. Перитонеальные клетки крыс, культивированные с антигеном, заключенным в мицеллы (антиген – зеленое свечение).

Рис. 13. Изменение концентрации восстановленного формазана в клетках при использовании антигена, заключенного в ПАВ.

Анализируя полученные данные, следует отметить, что, по-видимому, сам ПАВ, воздействуя на систему мембран клеток, повышает их бактерицидную активность за счет стимуляции клеточного дыхания. Можно предположить, что ПАВ за счет проникновения во внутреннее пространство перитонеальных клеток способен вызывать стимуляцию их фагоцитарной активности. Это может в дальнейшем способствовать повышению их иммунопрезентирующих свойств.

Далее мы проводили иммунизацию кроликов антигеном, ассоциированным с неионогенным поверхностно активным веществом. Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в 10 дней. Забор крови проводили через десять дней после второй иммунизации. Количество антигена на одно введение составляло 250 мкг. При определении титра антител нами было установлено, что наиболее высокий титр наблюдается при применении конъюгатов антиген-ПАВ, он составляет 1:1024. При применении антигена, растворенного в физиологическом растворе, титр сыворотки получился ниже и составил 1:128. Что в принципе может указывать на роль ПАВ как стимулятора антителообразования.

В литературе встречаются данные по использованию корпускулярных структур, полученных на основе полоксамеров. К примеру, Moghimi и Hunter (2000) в своем обзоре рассматривали свойства полоксамерных наноструктур и отметили их большое влияние на различные составляющие иммунной системы организма. В частности, они отмечают повышение Т-хелперной активности лимфоцитов и рекомендуют использовать данные структуры для конструирования вакцинных формул. Jackson и соавторы (2000) готовили полимерные микросферы на основе плуроников и отметили их действие на индуцирование нейтрофильного ответа. Что, в принципе, подтверждается нашими данными, так как мы тоже отметили повышение макрофагальной активности при применении нашей корпускулярной системы, как с антигеном, так и без него.

Можно отметить, что, по видимому, свойства корпускулярных носителей проникать во внутриклеточное пространство способствует накоплению антигенов в тканях органах и, тем самым, улучшает их терапевтические свойства. Это, в принципе, согласуется с данными, полученными при изучении корпускулярных носителей на основе полоксамеров и липосом (Shiffelers et al., 1999; Wasan et al., 2003).

На следующем этапе оценивалось, как мицелла-носитель влияет на биодинамику низкомолекулярного вещества в клетках крови. В качестве низкомолекулярного вещества нами был использован диминазен. В результате проведенных исследований было установлено, что при культивировании клеток в присутствии мицеллярной лекарственной формы диминазен накапливался в лимфоцитах в количестве 3.9 мкг/мл, а в эритроцитах – 100 мкг/мл. При культивировании клеток в присутствии водного раствора диминазена его накопление в эритроцитах и лимфоцитах происходило с практически вдвое меньшей интенсивностью и составило соответственно 2 и 50 мкг/мл, соответственно (рис. 14, 15).

Рис. 14. Накопление диминазена в лимфоцитах.

Рис. 15. Накопление диминазена в эритроцитах.

Таким образом, при применении мицеллярной лекарственной формы проникновение действующего вещества в клетки крови увеличивается примерно вдвое по сравнению с традиционно применяемой лекарственной формой диминазена.

С учетом приведенных выше данных, нам представляется резонным вопрос о том, как происходит проникновение препарата во внутреннюю среду клеток – посредством диффузии или активного переноса? В связи с этим мы провели ряд экспериментов, в которых определяли накопление водорастворимой, мицеллярной и липосомальной форм диминазена в живых и убитых антибиотиком А23187 перитонеальных макрофагах (рис. 16, 17).

Рис. 16. Накопление диминазена в живых и убитых перитонеальных макрофагах при использование водного раствора диминазена.

Рис. 17. Накопление диминазена в живых и убитых перитонеальных макрофагах при использовании мицеллярного раствора диминазена

В результате проведенных исследований было установлено, что:

  • при культивировании клеток в присутствии мицеллярного диминазена препарат накапливался в макрофагах до концентрации 2.07±0.16 мкг/мл. Однако при обработке клеток антибиотиком А23187 (за 30 мин до введения препарата) накопление диминазена было менее интенсивное и составило 0.97±0.09 мкг/мл;
  • при культивировании клеток в присутствии водного раствора диминазена препарат накапливался в макрофагах до концентрации 0.7±0.027 мкг/мл. Обработка клеток антибиотиком А23187 не вызвала изменения в концентрации накопившегося препарата, которая составила 0.91±0.06 мкг/мл;
  • липосомальный препарат диминазена внутри перитонеальных макрофагов не накапливался, что, скорее всего, связано с агрегацией липосом при культивировании.

В опытах с животными было отмечено, что диминазен из липосомной формы склонен накапливаться в макрофагах и в меньшей степени – в печени и почках. Накопление его в селезенке, сыворотке крови и в легких было относительно низким. При этом диминазен из мицеллярной формы значительно накапливался в печени и перитонеальных макрофагах. Заметное его количество обнаруживается и в почках. Диминазен же водной формы присутствовал, главным образом, в почках, концентрировался в печени, относительно мало накапливаясь в селезенке.

Резюмируя приведенные выше данные можно отметить, что мицеллы (как и КЗ) могут использоваться в качестве эффективных носителей для лекарственных веществ и антигенов. При этом мицелла обладает более пластичным строением, а наличие поверхностно активного вещества улучшает способность коньюгированного с ней антигена проникать в мишени через мембраны клеток. Однако мицеллу сложно назвать полноценной наночастицей из-за статистического характера структуры мицеллообразующих систем. Что, судя по всему, не оказывает существенного влияние на биологические свойства данных комплексов.

Опираясь на эти исследования, мы провели разработку инъекционной мицеллярной лекарственной формы на основе диминазена и мицеллярной гелевой формы на основе ивермектина для наружного применения.

3.7. Разработка инъекционной лекарственной формы на основе диминазена и изучение ее фармакологических свойств

В ветеринарии препараты диминазена встречаются в форме порошков, которые растворяют в воде перед применением. Это связано с их низкой стабильности в водной среде (Karvonen et al., 1985; Campbell et al., 2004). В связи с тем, что диминазен ацетурат имеет в водном растворе крайне низкую стабильность, мы получили гидрофобную соль диминазена, чтобы в дальнейшем разработать на ее основе стабильный мицеллярный инъекционный препарат.

Была разработана методика получения диминазена ди- и моно - бензоата из диминазена ацетурата и бензоата натрия. По мере проведения реакции в реакционной смеси могут образовываться две соли диминазена – диминазен дибензоат и диминазен монобензоат (рис. 18, 19).

Dm(Az)2 + 2BzNa → Dm(Bz)2 + 2AzNa

Рис. 18. Структурная формула и реакция получения диминазена дибензоата.

Dm(Az)2 + BzNa DmBz + Na(Az)2

Рис. 19. Структурная формула и реакция получения диминазена монобензоата.

У полученных нами солей диминазена была измерена температура плавления и проверена их растворимость в органических растворителях. У диминазена монобензоата температура плавления оказалась ниже, чем у диминазена ацетурата, и составляет 208±1°С. Так как диминазен дибензоат содержит в своем составе две молекулы бензойной кислоты, это повышает его температуру плавления, и она составляет 228±1°С.

Одним из основных требований, предъявляемых к активному веществу, входящему в состав инъекционного лекарственного препарата, является его способность растворяться в фармакопейных органических растворителях. Поэтому следующим этапом нашей работы была проверка полученных нами солей на их способность растворятся в фармацевтических растворителях.

Наилучшая растворимость у диминазена монобензоата наблюдается в пропиленгликоле и составляет 6.22%. В остальных растворителях он растворяется хуже и его растворимость составляет в метаноле 1.9%, в этаноле 1.72%, в диметилацетамиде 3.14%. У диминазена дибензоата мы наблюдали лучшую растворимость, и она составила в метаноле 3.06%, в этаноле 3.34%, в диметилацетамиде 5.3%, а в пропиленгликоле 5.44%.

Принимая во внимание эти данные, мы провели конструирование инъекционной лекарственной формы на основе диминазена как активного вещества. В качестве растворителя нами был выбран диметилацетамид, так как он обладает небольшой токсичностью и сравнительно низкой себестоимостью.

Сначала мы провели конструирование лекарственной формы диминазена на водноорганической основе. В табл. 5 приведена рецептура данной композиции.

Таблица 5. Фармацевтическая композиция инъекционной лекарственной формы на основе диминазена

Функциональное назначение компонента

Пример компонента

Концентрация компонентов, масс. %

Активнодействующее вещество (а.д.в.)

Диминазен бензоат

7

Органический растворитель

Диметилацетамид

50

Дополнительное АДВ/стабилизатор

Феназон

7

Консервант

Бензиловый спирт

1

Дополнительный растворитель

Дистиллированная вода

до 100

Однако полученный нами раствор показал низкую стабильность – диминазен выпал в осадок. Поэтому для повышения стабилизации лекарственной формы в препарат был внесен колидон 12PF в 7% концентрации. Однако данный раствор так же не обладал высокой стабильностью. Поэтому мы поставили перед собой задачу изучить возможность заключения диминазена в мицеллярную систему.

В табл. 6 приведена рецептура мицеллярной композиции диминазена с применением неионогенного поверхностно активного вещества Твин-80 в качестве мицеллообразующего агента. Приготовление лекарственной формы осуществляли в следующей последовательности. Готовили навеску органического растворителя, диметилацетамида, после чего растворяли в ней диминазен при постоянном перемешивании. К полученному раствору добавляли солюбилизатор Твин-80 и бензиловый спирт в качестве консерванта. Композицию перемешивали до полного растворения. К полученному раствору добавляли при постоянном перемешивании стабилизатор Колидон 12PF и феназон, предварительно растворенные в необходимом объеме воды. Готовый препарат фильтровали. В данной рецептуре приводятся

Таблица 6. Фармацевтическая композиция инъекционной лекарственной формы на основе диминазена

Функциональное назначение компонента

Пример компонента

Концентрация компонентов, масс. %

Активнодействующее вещество (а.д.в.)

Диминазен бензоат

7

Органический растворитель

Диметилацетамид

50

Солюбилизатор

Твин-80

20

Стабилизатор

Коллидон 12PF

7

Дополнительное а.д.в./стабилизатор

Феназон

7

Консервант

Бензиловый спирт

1

Дополнительный растворитель

Дистиллированная вода

до 100

оптимальные концентрации мицеллообразующего агента в препарате, повышение и понижение данного компонента в лекарственной форме приводит к снижению стабильности препарата.

Получив предварительную лекарственную форму диминазена, мы проверили ее терапевтическую активность на ограниченном поголовье при различных паразитарных заболеваниях.

Опыты по предварительному изучению антипаразитарной эффективности препарата Неозидин М (7% раствор, рабочее название «Диминазен 70») при бабезиозе крупного рогатого скота провели в апреле-мае 2002 г. на базе ААПЗ «Губский» Мостовского района Краснодарского края. В первом опыте на 20 коровах, спонтанно инвазированных B. bigemina, провели изучение эффективности новой лекарственной формы диминазена при его одно- и двукратном введении в стандартных дозировках – 1 мл на 20 кг массы тела животного (3.5 мг/кг по действующему веществу (д.в.)). В результате исследований установлено, что более 95% животных (19 из 20) выздоровело уже после его однократного введения и 5% остальных животных (1 корова) после повторной инъекции с интервалом в 24 ч после первой.

У животных после первой инъекции резко падала температура тела (до уровня физиологической нормы), появлялся аппетит, жвачка, резко улучшалось общее состояние. Случаев вынужденного убоя животных зарегистрировано не было. Побочных явлений и осложнений при применении Неозидина М не отмечали. Во второй серии опыта на 30 спонтанно инвазированных животных молодняка крупного рогатого скота провели сравнительное изучение эффективности Неозидина М и порошковых препаратов на основе диминазена: Неозидин и Беренил. В результате эксперимента установлены сходные данные от применения препаратов Неозидин и Беренил (табл. 7). При лечении животных сконструированной нами новой мицеллярной лекарственной формой диминазена (даже без дополнительного применения жаропонижающих средств) были отмечены наиболее хорошие результаты. Препарат в 100% случаев применяли однократно. Побочного действия препарата на организм животных не отмечали.

Таким образом, эффективность Неозидина М при бабезиозе крупного рогатого скота, вызванном B. bigemina несколько выше таковой у базовых препаратов, а дозу 3.5 мг/кг массы тела животного можно считать терапевтической.

Таблица 7. Сравнительная эффективность разных препаратов на основе диминазена

№гр

Кол-во животных

Препарат

Доза препарата по д.в., мг/кг

Терапевтическая эффективность, %

После 1-й инъекции

После 2-х инъекций

1

10

«Неозидин М»

3.5 в/м

100

2

10

«Неозидин»

3.5 в/м

80

100

3

10

«Беренил»

3.5 в/м

80

100

В связи с тем, что в предварительных экспериментах Неозидин М показал более высокую эффективность по сравнению с водными растворами порошкообразных лекарственных форм диминазена, мы провели титрацию терапевтической дозы сконструированной нами новой лекарственной формы диминазена.

Испытания по титрации терапевтических доз Неозидин М (в виде 7% лекарственной формы диминазена) провели в период летней вспышки (июнь-июль 2003 г.) бабезиоза, вызванного В. bigemina, на базе районной ветеринарной лечебницы Левокумского района Ставропольского края, стационарно неблагополучного по кровепаразитарным болезням. Всего в исследованиях было задействовано 30 голов крупного рогатого скота, спонтанно инвазированных В. bigemina. Диагноз на пироплазмоз ставили комплексно: учитывали эпизоотологические, клинические данные, данные ксенодиагностики и результаты лабораторного исследования мазков периферической крови. Неозидин М вводили однократно внутримышечно по следующей схеме: животным первой группы (n = 10) в стандартной для всех препаратов диминазена дозе 1.0 мл/20 кг массы тела (3.5 мг на 1 кг по д.в.); коровам второй группы (n = 15) – в дозе 1 мл/30 кг массы тела (2.5 мг на 1 кг по д.в.). Еще 5 головам коров третьей группы применили препарат в дозе 1 мл/40 кг массы тела (1.75 мг на 1 кг по д.в.). При необходимости инъекции повторяли с интервалом 24 ч.

Во всех случаях параллельно проводили симптоматическое лечение: внутривенно борглюконат кальция с глюкозой, подкожно кофеин бензоат натрия, вещества стимулирующие работу преджелудков. Эффективность терапии учитывали по исчезновению клинических признаков заболевания и результатам лабораторных исследований (отсутствие бабезий в мазках из периферической крови). Кроме того, проводили общие гематологические исследования как до, так и через 3 и 10 дней после начала лечения.

В результате исследований установлена 100%-ная эффективность двух из исследованных доз Неозидина М (2.5 и 3.5 мг/кг) при пироплазмозе крупного рогатого скота (табл. 8). У животных после инъекции наблюдали следующее: резко падала температура тела (до уровня физиологической нормы), появлялся аппетит, жвачка, резко улучшалось общее состояние. Возбудителя заболевания в мазках периферической крови не обнаруживали уже через 1-2 дня после начала лечения. Полное выздоровление животных наступало через 3±0.3 дня.

При применении дозы 1.75 мг/кг массы тела по д.в. во всех случаях приходилось проводить двукратную инъекцию препарата, а одному животному (в связи с ухудшением общего состояния) пришлось применять третий раз, уже в дозе 3.5 мг/кг массы тела. Побочного действия препарата на организм животных не отмечали, осложнений не выявляли.

Таблица 8. Данные по титрации терапевтических доз 7% мицеллярного раствора Неозидин М

№ гр.

Кол-во животных

Доза препарата по д.в., мг/кг

Терапевтическая эффективность, %

После 1-й инъекции

После 2-х инъекций

После 3-х инъекций

1

10

3,5

100

2

15

2,5

100

3

5

1,75

80

100

Аналогичные результаты были получены для бабезиоза, вызванного В. divergens.

Таким образом, какой-либо разницы в антипаразитарной активности разных доз применения Неозидина М не зарегистрировано, и дозу 2.5 мг/кг массы тела животного по д.в. можно считать терапевтической при бабезиозе крупного рогатого скота.

Проведя наши исследования, мы пришли к выводу о возможности сокращения количества активнодействующего вещества в основной рецептуре препарата. Поэтому в дальнейшем была проведена ее доработка.

В табл. 9 приведена рецептура лекарственной формы диминазена, содержащей сниженное количество активнодействующего вещества. Приготовление лекарственной формы осуществляли в следующей последовательности. Готовили навеску органического растворителя, диметилацетамида, после чего растворяли в ней диминазен при постоянном перемешивании. К полученному раствору добавляли солюбилизатор Твин-80 и бензиловый спирт в качестве консерванта. Композицию перемешивали до полного растворения. К полученному раствору добавляли при постоянном перемешивании стабилизатор Колидон 12PF и феназон, предварительно растворенные в необходимом объеме воды. Готовый препарат фильтровали.

Таблица 9. Фармацевтическая композиция инъекционной лекарственной формы на основе диминазена

Функциональное назначение компонента

Пример компонента

Концентрация компонентов, масс. %

Активнодействующее вещество (а.д.в.)

Диминазен бензоат

5

Органический растворитель

Диметилацетамид

50

Солюбилизатор

Твин-80

20

Стабилизатор

Колидон 12PF

7

Дополнительное а.д.в./стабилизатор

Феназон

5

Консервант

Бензиловый спирт

1

Дополнительный растворитель

Дистиллированная вода

до 100

В данной рецептуре приводятся оптимальные концентрации активнодействующего вещества в препарате. Понижение данного компонента в лекарственной форме приводит к снижению эффективности препарата. В дальнейшем нами были проведены работы по изучению физико-химических и фармакологических свойств разработанного нами препарата.

Для любого фармакологического вещества необходимо определение его токсикологических характеристик, а также распределения и метаболизма в организме животных. Без знания этих параметров и степени влияния вещества на организм животного невозможна дальнейшая работа по изучению его терапевтической эффективности.

В связи с тем, что Неозидин М представляет собой новую лекарственную форму, нами, кроме определения острой токсичности на лабораторных животных (белые мыши), было проведено изучение его субхронической токсичности на разных видах продуктивных животных (собаки, телята и ягнята) и хронической токсичности на лабораторных животных (крысы).

Изучение параметров острой токсичности Неозидина М в форме 7% мицеллярного раствора проводили на основании «Методических рекомендаций по изучению общетоксического действия фармакологических веществ», утвержденных Минздравом РФ 29 декабря 1997 г. Острая токсичность определялась на белых мышах методом пробит-анализа, предложенного Литчфилдом и Уилкоксоном в модификации З. Рота с определением ЛД0, ЛД16, ЛД50, ЛД84 и ЛД100. Для опыта было взято 30 нелинейных белых мышей (самцы, масса 19-21 г). Исходный раствор препарата вводили внутрибрюшинно в различных дозах от 1.43 до 2.49 мл/кг массы тела или 100-175 мг/кг по а.д.в. (диминазену). Каждую из 5-ти доз препарата вводили однократно группе из 6 животных (растворитель дистиллированная вода).

Наблюдение за общим состоянием животных, состоянием шерстного покрова, подвижностью и чувствительностью к внешним раздражителям проводили до и в течение 5 дней после введения препарата. Клинические признаки токсического действия: резкое снижение двигательной активности, атаксия, тремор, угнетение дыхания. Гибель животных наступала в течение нескольких первых часов после введения препарата. ЛД50 для новой лекарственной формы диминазена (7% мицеллярный раствор) при его внутрибрюшинном введении и ее стандартная ошибка составили 142±7 мг/кг веса мыши, что в 39 раз превышает терапевтическую дозу.

Таким образом, на основании существующих правил по степени острой токсичности Неозидин М относится к группе малоопасных веществ (4 класс опасности согласно ГОСТ 121.007-76).

Затем мы определяли хроническую токсичность Неозидина М. Для чего препарат вводили внутрибрюшинно крысам-самцам трех групп с первоначальной массой тела 110-120 г. Неозидин М применяли в форме раствора с Твин-80 в течение 4 месяцев в различных дозах. Крысам первой группы вводили рабочий раствор (в пересчете на Неозидин М) в дозе 0.08 мл/кг/день (1/250 от ЛД50 0.6 мг/кг/день по диминазену); 2-ой группы 0.0016 мл/кг/день (1/500 от ЛД50 0.3 мг/кг/день по диминазену), 3-ей группы 0.00016 мл/кг/день (1/5000 от ЛД50 0.03 мг/кг/день по диминазену). В контрольную группу включали крыс-самцов такого же возраста и массы. Контрольные животные ежедневно получали равный объем стерильного физиологического раствора. В течение всего опыта вели наблюдение за состоянием и поведением животных, динамикой роста массы тела, регулярно проводили исследования по оценке функционального состояния печени, почек и изучали влияние препарата на гематологические показатели. Статистическую обработку полученных данных проводили по Стьюденту-Фишеру.

Результаты исследований показали, что в течение опыта (125 суток) не отмечалось гибели животных ни в одной из подопытных групп по причине действия препарата. Неозидин М во всех испытанных дозах не оказал отрицательного влияния на внешний вид, физиологическое состояние и поведение крыс.

Изучение местно-раздражающего действия Неозидина М проводили на базе СПК «Белокаменский» Старополтавского района Волгоградской области. Препарат вводили в/м в дозе 1 мл на 20 кг массы тела животного. Препарат вводили 10 телятам, 2 группы по 5 голов на каждую пропись (в виде 7 и 5% растворов), инъецировали препарат в область крупа. Ягнятам вводили с внутренней стороны бедра, 2 группы по 5 голов на каждую пропись. В результате проведенных исследований показано, что Неозидин М не обладает местно-раздражающим действием, а припухлость в месте инъекции объясняется большим количеством вводимого раствора.

На сегодняшний день известно, что многие препараты не только в обычных (терапевтических) дозировках, но и в минимальных дозах вызывают различные аллергические реакции организма. Определение сенсибилизирующих (аллергизирующих) свойств Неозидина М проводили на морских свинках по целому ряду методик: в реакции непрямой дегрануляции тучных клеток по методу Фрадкина, в иммунологических тестах для выявления реакции клеток крови на аллерген in vitro: реакция специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ) и реакция специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Из результатов проведенных исследований можно сделать вывод, что Неозидин М практически не обладает сенсибилизирующим действием.

Иммунотоксичность Неозидина М определяли по характеру влияния препарата на Т- и В-клеточные звенья иммунной системы организма животных. Оценку Т-клеточного звена иммунитета проводили по выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и аутологичным розеткообразующим клеткам (ауто-РОК). Было показано, что Неозидин М не оказывает выраженного отрицательного действия на Т-клеточное звено иммунитета. Оценку В-клеточного звена иммунной системы проводили путем определения антителообразующих клеток (АОК), кинетики В-лимфоцитов и титров гемагглютининов в сыворотке крови мышей. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что Неозидин М, введенный интрамускулярно однократно, незначительно снижает иммунный ответ в течение 5-ти дней после его применения.

Для определения титров гемагглютининов животных обеих групп внутрибрюшинно иммунизировали 10%-ной суспензией ЭБ. На 7-й день все мыши были убиты и у них были определены титры общих антител и антител классов M и G (табл. 10). Из данных таблицы следует, что титры общих антител (АТ) у подопытных животных несколько ниже, чем таковой у контрольных, а разница в их содержании статистически недостоверна.

Таблица 10. Результаты исследования титров антител

гр.

Препарат

Доза

Титры антител

Индекс иммуносупрессии

IgM

IgG

общие АТ

1

«Неозидин М»

1 мл/ 20 кг

0.92±0.4

2.4±0.5

3.4±0.3

0.9

2

Контроль

1.2±0.1

2.9±0.5

4.1±0.3

Примечание: разница показателей относительно контроля статистически недостоверна (Р > 0.05).

Таким образом, Неозидин М практически не угнетает Т- и В- клеточное звено иммунитета и обладаем сравнительно мягким иммуносупрессивным действием.

Исследование фармакокинетических параметров препарата Неозидин М проводили на телятах черно-пестрой породы (6 голов) подобранных по принципу «аналогов» (вес, питание, содержание). Возраст 3-4 мес, средний вес 132±12 кг. Животные были здоровыми (определялась температура тела, пульс, величина зрачка, внешний вид и поведение). Животных разбили на 2 группы по 3 головы. Первой группе вводили 5% Неозидин М. Второй группе вводили беренил в виде 7% водного раствора. Препараты вводили однократно, внутримышечно в максимальной дозе, согласно инструкциям по применению (1 мл на 20 кг живой массы).

На рис. 20 показана динамика концентрации диминазена в плазме крови телят после введения Неозидина М и беренила. При применении беренила отмечается резкое повышение концентрации (4.3±0.4 мкг/мл) диминазена в плазме крови в течение первых двух часов и его последующее снижение, которое выходит на плато через 72 ч и составляет 0.06±0.01 мкг/мл. После этого концентрация диминазена в плазме медленно снижается, и он обнаруживается вплоть до 192 ч после введения.

При применении Неозидина М постепенное повышение концентрации диминазена до 1.1±0.1 мкг/мл в плазме наблюдалось в течение четырех часов с момента введения. Затем отмечено его постепенное снижение, которое выходит на плато через 72 ч и составляет 0.06±0.01 мкг/мл. После этого концентрация диминазена в плазме медленно снижается, и он обнаруживается вплоть до 192 ч после введения.

Рис. 20. Динамика концентрации диминазена в плазме телят

Более низкая концентрация диминазена в плазме крови после применения Неозидина М объясняется более высокой степенью ее накопления в клетках крови по сравнению с водными растворами аналогов.

Анализ проб молока, полученного от животных после однократной внутримышечной инъекции Неозидина М, показал отсутствие диминазена в молоке в определимых концентрациях во всех пробах. На основании полученных результатов можно утверждать, что молоко от коров, обработанных Неозидином М, можно употреблять без ограничений.

В современной литературе имеется большое количество данных по применению и эффективности препаратов на основе диминазена. Но все эти работы посвящены порошку диминазена, растворяемому в воде перед инъекцией (Mdachi et al., 1995; Jacobson et al., 1996; Tuntasuvan et al., 2003). Однако работа с препаратом диминазена ацетурата связана с рядом трудностей. Во-первых, сам препарат выпускается в больших фасовках и поэтому перед применением приходится готовить навески, что снижает стерильность используемого вещества. Во-вторых, в растворенном виде препарат хранится не более 1-2 дней при +4°С, что повышает стоимость лечения. Поэтому при проведении широких производственных испытаний мы стали акцентировать внимание на эффективности и безопасности разработанного нами препарата.

В связи с тем, что в экспериментах по титрации терапевтических доз Неозидина М было установлено, что при двух наиболее распространенных бабезиозах крупного рогатого скота, вызываемым B. bigemina и B. divergens, терапевтической дозой сконструированной нами новой лекарственной формы диминазена является 2.5 мг д.в./кг массы тела животного, и с целью снижения себестоимости лекарственного средства в дальнейшем широкие испытания пироплазмицидной эффективности проводили только с 5% вариантом препарата. Новую лекарственную форму диминазена всем животным водили в дозе 1 мл на 20 кг массы тела или 2.5 мг/кг по диминазену (активно действующему веществу).

Работу по изучению эффективности препарата при бабезиозах крупного рогатого скота проводили в разных регионах России. Всего в процессе работы было задействовано 754 головы крупного рогатого скота разных половозрастных групп (быки-производители, коровы, молодняк старше года) и пород (черно-пестрая, симментальская, красно-пестрая, калмыцкая, айрширская, герефорд), спонтанно инвазированных бабезиозом в различной степени интенсивности. В результате проведенных исследований установлена 97-100% эффективность однократного применения 5% лекарственной формы мицеллярного Неозидина М при всех бабезиозах крупного рогатого скота (табл. 11).

При двукратном же применении препарата в тяжелых запущенных случаях препарат проявлял 100% активность против B. bigemina, B. bovis и B. divergens. Какой-либо разницы в эффективности препарата в зависимости от половозрастных групп или породы крупного рогатого скота нами не выявлено.

Таким образом, наши предварительные исследования полностью подтвердились результатами широких испытаний, проведенных на значительном поголовье крупного рогатого скота в разных природно-климатических и социально-экономических зонах России. Аналогичные результаты были получены при бабезиозах овец и лошадей.

Таблица 11. Результаты широких испытаний активности 5% формы Неозидина М при бабезиозах крупного рогатого скота

№ п/п

Заболевание

Половозрастная группа

Количество голов

Эффективность, %

1

Пироплазмоз

Быки-производители

65

99

Коровы

103

100

Молодняк старше года

199

99

2

Бабезиоз

Быки-производители

16

100

Коровы

73

99

Молодняк старше года

67

100

3

Франсаиеллез

Быки-производители

29

100

Коровы

98

97

Молодняк старше года

104

99

Все вышеперечисленное позволяет отнести сконструированную нами лекарственную форму диминазена к высокоперспективным препаратам, который заслуживает дальнейшего широкого внедрения в ветеринарную паразитологическую практику.

В заключение данного раздела можно отметить, что перевод соли диминазена из гидрофильного в гидрофобное состояние позволил получить его воднодисперсную форму, обладающую лучшими фармакодинамическими свойствами. Способность поверхностно-активного вещества улучшать проникновение лекарства в эритроциты приводит к повышению терапевтической эффективности самой лекарственной формы. Тогда как снижение дозы вводимого препарата приводит к уменьшению его токсического эффекта. Наш опыт позволяет также предположить возможность конструирования более широкого спектра ветеринарных препаратов на основе водных дисперсий ПАВ.

3.8. Разработка ветеринарного препарата наружного применения на основе мицеллярно-гелевой формы ивермектина

Препараты наружного применения широко используются в ветеринарии и медицине. Поэтому нами также решалась задача разработки эффективной лекарственной системы для борьбы с наружными паразитами животных на основе мицеллярно-гелевой системы. В качестве активного противопаразитарного вещества нами был взят ивермектин препарат, обладающий высокой противопаразитарной активностью, но слабой растворимостью.

Для определения степени влияния различных формообразующих вспомогательных компонентов, входящих в состав гелевой формы (лутрол, кремофор, глицерин), на ее физико-химические свойства были проведены оценки вязкости различных рецептур гелевых систем. На основании полученных данных нами была проведена разработка и оптимизация лекарственной формы препарата Ивермек-гель. Препарат «Ивермек-гель» представляет собой опалесцирующий прозрачный гель желтоватого цвета. Номенклатура сырья для приготовления 10 г препарата указаны в табл. 12.

Таблица 12. Номенклатура и квалификация сырья

Наименование компонента

НТД

Количество, г

Ивермектин

ВР 2000, v. 1, p. 900

0.010

Лидокаин гидрохлорид

ВР 2000, v. 1, p. 940 или ВФС 42-2080-91

0.500

Пантенол

ВР 2000, v.1, p. 340

0.150

Гидрогенизированное полиоксиэтилированное рициновое масло

ВР 2000, v.1, p. 304

1.150

Полоксамер 407

BP 2000, v.1, p. 553

0.950

Глицерин, ч.д.а.

ГОСТ 6259-75

2.150

Бутилокситолуол

ТУ 38-101459-76

0.020

Спирт бензиловый

ГОСТ 8751-72

0.200

Кислота лимонная

ГОСТ 3652-69

0.072

Натрий фосфорнокислый

двузамещенный 12-водный

ГОСТ 4172-76

0.404

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-72

до 10.00 г

Изучение влияния препарата «Ивермек-гель» на организм собак провели на базе питомника «Военный завод № 9» г. Энгельса Саратовской области. В опытах было задействовано 6 собак, подобранных по принципу аналогов: 3-м животным ежедневно в течение 14 дней препарат наносили на выстриженные участи кожи (S = 10 см3) в дозе 1.0 см3 на животное, 3-м другим собакам в течение того же срока и в той же дозе на внутреннюю поверхность ушной раковины. Контролем служили 3 клинически здоровых животных, которым ничего не вводили. Подопытные животные подвергались тщательному клиническому осмотру с определением общего состояния организма, упитанности, состояния видимых слизистых оболочек. Для определения влияния препарата «Ивермек-гель» на гематологические и биохимические показатели, у собак из подкожной вены голени отбирали кровь как до, так и через 5, 10 и 20 суток после начала применения препарата. Из гематологических показателей определяли количество эритроцитов, лейкоцитов и выводили лейкоцитарную формулу.

Для изучения гепатотоксического действия препарата определяли ферменты переаминирования, а именно АсАТ и АлАТ. Кроме того, определяли содержание в крови общего белка.

Результаты исследований показывают, что гематологическая картина после субхронического применения препарата у подопытных собак существенно не изменялась. Что касается ферментов переаминирования, то у животных отмечалось некоторое увеличение активности АсАТ и незначительные колебания активности АлАТ как через 5, 10 и 20 суток после дачи препарата «Ивермек-гель». Однако разница между этими значениями была статистически недостоверна, что дает основание констатировать отсутствие гепатотоксического действия у препарата. Содержание общего белка находилось в пределах физиологической нормы, а снижение его уровня с 59±0.6 г/л до 58±0.4 г/л (на 5 день) было статистически недостоверным (табл. 13, 14).

Таким образом, ежедневное применение препарата «Ивермек-гель» в течение 14 дней не оказывает влияние на гомеостаз организма и препарат не обладает токсическим воздействием.

Определение сенсибилизирующих (аллергизирующих) свойств препарата «Ивермек-гель» проводили на кроликах и морских свинках по целому ряду методик (см. выше). Из результатов проведенных исследований можно сделать вывод, что препарат «Ивермек-гель» не обладает сенсибилизирующим действием.

Таблица 13. Влияние препарата «Ивермек-гель» на гематологические биохимические показатели собак (P>0.05)

Показатели

До дачи

препарата

В день дачи препарата

Через

5 суток

10 суток

20 суток

Эритроциты, (х1012/л)

6.1±0.04

6.8±0.03

6.5±0.4

6.2±0.6

6.9±0.6

Лейкоциты, (х109/л)

11.4±0.2

11.2±0.1

11.0±0.2

11.2±0.3

11.5±0.4

Лимфоциты, (%)

15±3

16±6

14±4

12±4

15±3

Нейтрофилы, (%)

73±1

73.8±0.4

76.4±0.3

77±1

73.8±0.5

Эозинофилы, (%)

4.4±0.2

4.0±0.4

4.6±0.2

5±1

4.2+0.4

Моноциты, (%)

4.6±0.02

3.8±0.01

4.1±0.2

4.8±0.01

5±1

Активность АсАТ, (ME)

24±1

26.3±0.6

27.4±0.4

26.2±0.4

25±1

Активность АлАТ, (ME)

26±1

28.4±0.4

30±1

28.8±0.6

27±1

Общий белок, г/л

58.9±0.6

59.6±0.4

59.3±0.8

58.1±0.4

60.0±0.6

Таблица 14. Показатели крови подопытных и контрольных собак

Группа

Доза

вещества

Время

исследования

Er, 1012/л

L, 109/л

Hb, г/л

Контроль

До введения

5.9±0.2

11.9±0.1

155±2

Через 5суток

6.1±0.4

11.8±0.3

151±1

Через 10 суток

6.4±0.2

12.0±0.1

157±2

Через 20 суток

6±1

11.5±0.1

154±1

Опыт

3,5 мг/кг

До введения

6.1±0.04

11.4±0.2

158±1

Через 5 суток

6.5±0.4

12.0±0.2

154±1

Через 10 суток

6.2±0.6

11.8±0.3

161±0.4

Через 20 суток

6.9±0.6

11.2±0.4

162±1

Испытание местно-раздражающих свойств препарата «Ивермек-гель» проводили на 4 собаках (возраст 2 года, вес 15 кг). Трем собакам на кожу наносили препарат в дозе 1 см3 на животное, четвертая служила контролем, ей наносился физиологический раствор в тех же дозах. Перед применением участки кожи предварительно выстригались ножницами и выбривались, площадь участка 10 см2. После 7 ежедневных аппликаций препарат в той же дозе однократно наносили на другой участок кожи, расположенный с противоположной стороны, который также предварительно выстригался и выбривался. Животных осматривали после каждого нанесения через 0.5, 3 и 5 ч. В результате осмотра собак установили, что аллергических реакций на нанесение препарата в виде покраснения, припухлости и зуда не наблюдали ни через 30 мин, ни через 3 и 5 ч после каждого нанесения. После этого тем же животным препарат вводили в ухо в дозе 1 мл, видимых изменений со стороны ушных раковин у подопытных и контрольных животных не отмечали.

Таким образом, по полученным результатам проведенных исследований на собаках препарат «Ивермек-гель» не обладает местно-раздражающими свойствами.

Затем мы проводили анализ остаточных количеств ивермектина в сыворотке крови и его фармакокинетики при наружном применении собакам, кошкам и кроликам.

Исследования проводили на базе вивария СГАУ им. Н.И. Вавилова и питомника собак Военного завода № 9 г. Энгельса.

При нанесении препарата на кожу нами были получены следующие результаты (табл. 15, 16), пик концентрации в плазме составил 1.3 нг/мл, период полураспада препарата (Т1/2) 2.7 ч; площадь под кривой концентрация/время (AUC) 13.2. При внутриушном введении пик концентрации в плазме 1.3 нг/мл; Т1/2 2.4 ч; площадь под кривой концентрация/время 4.02.

Таблица 15. Фармакокинетика ивермектина после внутриушного и накожного применения препарата «Ивермек-гель»

Время, ч

Концентрация ивермектина в крови, нг/мл

Применение препарата

«Ивермек-гель» на кожу

Применение препарата

«Ивермек-гель» в ухо

1

1.3±0.05

2

1.29±0.04

3

0.53±0.02

0.51±0.01

4

0.35±0.01

0.45±0.02

6

0.34±0.01

0.41±0.01

Таблица 16. Фармакологические параметры выделения ивермектина из плазмы собак при внутриушном и накожном применении препарата «Ивермек-гель»

Параметры

Применение

в ухо

Накожное

применение

Период полувыведения лекарственного средства, ч-1

2.426386

2.698598

Константа скорости выведения

0.28561

0.2568

Максимальная концентрация препарата, нг

1.29

1.3

Объем распределения, мл

871080.1

295333.7

Время достижения максимальной концентрации, ч

1.8

1

Клиренс мл/ч

248789.2

290560

Площадь, ограниченная кривой, нг/(мл ч)

4.019467

5.2

Сходные результаты были получены при изучении фармакокинетики ивермектина на кроликах и кошках.

Эксперименты по определению остаточных количеств ивермектина после применения препарата «Ивермек-гель» проводили на кроликах породы шиншилла 6 месячного возраста, подобранных по принципу «аналогов» (вес, питание, содержание). Средний вес животных 2,6±0,2 кг, количество 16 голов. Животные были здоровыми (определялась температура тела, пульс, величина зрачка, внешний вид и поведение), препаратами ивермектина не обрабатывались. Перед началом эксперимента проводили капрологический анализ на наличие яиц и личинок гельминтов (заражение гельминтозами не обнаружено) и обследование на акарозы (клещей не обнаружено). Ивермек-гель вводили внутрь ушной раковины в дозе 2,0 мл на животное, дважды с интервалом 3 дня. Для исследования отбирали образцы печени, мышц и жировой ткани в количестве 50-70 г после забоя каждого животного. Пробы замораживали до 10-18 С и транспортировали в лабораторию.

Определение остаточных количеств ивермектина проводили для каждого животного в отдельности, в табл. 17 показаны усредненные данные. Показаны средние значения количества ивермектина и стандартное отклонение.

Таблица 17. Средние значения количества ивермектина в тканях и органах кроликов

Время после

введения, ч

Среднее количество ивермектина в нг/г ткани

(разброс значений по животным в группе)

Мышцы

Печень

Ухо (место введения)

0

0

0

0

6

1.5±0.04

1.0±0.03

1.5±0.07

12

0.8±0.02

2.2±0.09

0.7±0.02

24

0.5

0.9±0.01

0.5

36

0

0.5

0

48

0

0

0

72

0

0

0

Из таблицы видно, что ко 2-му дню (через 36 ч) ивермектин полностью элиминируется из мышечных тканей и ушной раковины кроликов (место введения), к этому сроку в печени обнаруживаются только следы (на грани чувствительности метода). Полностью из организма кроликов он элиминируется через 2 суток после применения препарата. Таким образом, сроки предубойной выдержки препарата у кроликов составляют 3 суток после последнего применения препарата «Ивермек-гель».

В результате проведенных исследований установлена 100%-ная эффективность применения препарата «Ивермек-гель» против Psoroptes cuniculi у кроликов разных пород и половозрастных групп при его одно- или двукратном нанесении на пораженные участки ушных раковин в дозе 0,5-2 мл с интервалом 5-7 дней. Живых клещей в соскобах кожи с внутренней поверхности ушной раковины не обнаружили уже после первого применения препарата (100% выздоровление).

Сходные результаты получены при применении растворов синтетических пиретроидов (неостомазан или бутокс). При применении терпентинного масла эффективность была ниже на 16%. Кроме того, срок выздоровления животных при применении препарата «Ивермек-гель» по сравнению с другими препаратами и способами лечения сокращался в среднем на 4.5-12 дней.

Таким образом, препарат «Ивермек-гель» является эффективным средством при псороптозе кроликов, проявляющих высокую акарицидную активность против P. cuniculi. Не менее эффективным оказалось применение разработанного препарата против клещей родов Otodectes, Sarcoptes, Demodex, Notoedres.

Заключение и выводы

На протяжении последних лет биология и медицина существенно обогатились рядом новых достижений, связанных с применением наноматериалов. Однако многие вопросы данного направления до сих пор являются недостаточно проработанными. Так, при ярко выраженных плюсах применения наноносителей, конъюгированных с различными веществами, остается во многом открытым вопрос о механизмах взаимодействия данных комплексов с различными функциональными системами организма.

В данной работе мы рассмотрели ряд проблем, связанных с конструированием терапевтических средств на основе корпускулярных носителей и изучением их взаимодействий с иммунокомпетентными клетками для их использования в терапевтических и профилактических целях. Мы полагаем также, что эти данные могут способствовать развитию представлений о молекулярных и клеточных механизмах иммуномодулирующего действия наночастиц в составе их комплексов с антигенами.

В том числе, было проведено изучение взаимодействия низкомолекулярных веществ, ассоциированных с КЗ, с клетками ретикулоэндотелиальной системы. Было установлено, что иммунизация лабораторных животных данными комплексами приводит к образованию поликлональных антител на низкомолекулярные вещества (ивермектин, диминазен и кленбутерол). При изучении взаимодействия комплексов низкомолекулярных веществ и КЗ с перитонеальными клетками нам удалось определить локализацию данных веществ в цитоплазматическом пространстве, а так же установить участие КЗ в более интенсивном накоплении низкомолекулярных веществ в клетках.

С помощью метода иммунозолотого дот-анализа и полученных нами поликлональных антител мы исследовали биодинамику низкомолекулярных веществ (диминазена и ивермектина) в биологических жидкостях животных, и провели сравнение данного метода с высокоэффективной жидкостной хроматографией. Последнее показало сопоставимость чувствительности определения антигенов обоими методами при существенно большей простоте иммуноанализа.

Проведенное нами изучение взаимодействия высокомолекулярных веществ, ассоциированных с КЗ, с клетками ретикулоэндотелиальной системы показало, что данный антиген проникает в перитонеальные клетки животных и повышает их митохондриальное дыхание. Введение самого КЗ в популяцию перитонеальных клеток также приводило к повышению их ферментативной активности. Получив эти результаты, мы предположили, что золото обладает адъювантными свойствами. Для подтверждения этого предположения были проведены эксперименты с введением данного препарата в организм лабораторных животных. В ходе этих исследований мы установили, что комплекс КЗ с антигеном не только усиливает активность фагоцитирующих клеток, но и повышает титр антител к вводимому антигену, что косвенно может указывать на стимуляцию КЗ клеток лимфоидного ряда.

Аналогичные результаты мы получили и при использовании в качестве корпускулярных носителей мицелл, полученных при помощи неионогенных поверхностно активных веществ. В этой части работы мы исходили из того, что внесение в данную систему высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ должно обеспечивать получение препаратов, обладающих более высокой терапевтической эффективностью за счет повышения биодоступности активного вещества.

Мы установили, что поверхностно активные вещества проникают через мембрану перитонеальных клеток и накапливаются в их цитоплазме. При этом активные вещества вместе с мицеллообразующим агентом также проникают и накапливаются во внутриклеточном пространстве.

Кроме низкомолекулярных веществ, мы рассмотрели и действие высокомолекулярных соединений, заключенных в мицеллы. Установлено, что введение высокомолекулярного вещества в организм лабораторного животного повышает активность как неспецифических, так и специфических факторов иммунитета. Что может указывать на адъювантные свойства данного комплекса.

В качестве одного из низкомолекулярных активных веществ нами использовался диминазен. Это соединение (относящееся к группе ароматических диамидинов) известно как один из самых распространенных препаратов, применяемых в ветеринарии для борьбы с кровопаразитарными заболеваниями. Было показано, что разработанная нами новая мицеллярная инъекционная лекарственная форма на основе диминазена (Неозидин М) обладает более высокой терапевтической эффективностью по сравнению с исходной формой, что позволило нам снизить дозу применяемого препарата и тем самым уменьшить его токсичность.

На завершающем этапе нашей работы было установлено, что внесение мицеллярной системы в лутрольную основу может привести к формированию геля, содержащего в качестве активного вещества ивермектин и обладающего уникальными свойствами. Препарат, приготовленный на этой основе, показал хорошие терапевтические свойства при лечении ряда паразитарных заболеваний.

Полученные в настоящей работе результаты были нацелены как на пополнение фундаментальных знаний в областях биохимии и фармакологии, так и на их практическое использование. В этой связи отметим, что в настоящее время в нашей стране выпускается большое количество различных ветеринарных препаратов. Но в большинстве своем это аналоги зарубежных разработок. Поэтому предложенные нами новые лекарственные формы на основе наноструктур можно рассматривать как развитие эффективных подходов к улучшению свойств уже имеющихся биологически активных веществ. Мы выражаем надежду, что это может послужить стимулом к разработке целой группы новых сравнительно недорогих лекарственных препаратов в ветеринарной медицине.

Исходя из результатов работы, можно сформулировать следующие выводы:

  1. Установлено, что иммунизация лабораторных животных конъюгатами ивермектина, диминазена и кленбутерола с золотыми наночастицами приводит к образованию поликлональных антител на данные низкомолекулярные вещества, обеспечивающих их применение для определения ивермектина и диминазена в биологических жидкостях животных с чувствительностью, сопоставимой с результатами метода ВЭЖХ.
  2. Показано, что при взаимодействии с перитонеальными клетками коньюгатов низкомолекулярных веществ с золотыми наночастицами данные вещества локализуются в цитоплазматическом пространстве. При этом в присутствии коллоидного золота накопление низкомолекулярных веществ в клетках происходит более интенсивно.
  3. Обнаружено, что при взаимодействии с клетками ретикулоэндотелиальной системы высокомолекулярных веществ, конъюгированных с золотыми наночастицами, данные антигены проникают в перитонеальные клетки и усиливают их митохондриальное дыхание. При этом введение самого коллоидного золота в популяцию перитонеальных клеток также приводит к повышению их ферментативной активности. Введение комплекса наночастиц золота с антигеном в организм подопытного животного не только повышает активность фагоцитирующих клеток, но и увеличивает титр антител, полученных к вводимому антигену.
  4. При использовании в качестве корпускулярных носителей низко- и высокомолекулярных антигенов мицелл, полученных с использованием неионогенных ПАВ, отмечено проникновение антигенов через мембрану перитонеальных клеток и накопление в цитоплазме.
  5. При введении мицеллярного комплекса высокомолекулярного вещества в организм лабораторного животного установлено повышение активности как неспецифических, так и специфических факторов иммунитета, что указывает на адъювантные свойства также и данного комплекса.
  6. Разработана новая мицеллярная инъекционная лекарственная форма на основе диминазена (Неозидин М). Установлено, что она является стабильной и обладает более высокой терапевтической эффективностью по сравнению с исходной лекарственной формой, что позволяет снизить дозу применяемого препарата и уменьшить его токсичность.
  7. Сконструирована новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма для наружного применения на основе ивермектина (Ивермек-гель), оказавшаяся стабильной и обладающей высокой терапевтической эффективностью. Приготовленный на ее основе препарат показал хорошие терапевтические свойства при лечении ряда паразитарных заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Даугалиева Э.Х., Сидоркин В.А., Семенов С.В., Жемеричкин Д.А., Староверов С.А. Сенсибилизирующие свойства препарата “Ивермек” // Ветеринария. - 2000. - № 11. - С. 26-28.
  2. Даугалиева Э.Х., Сидоркин В.А., Семенов С.А., Жемеричкин Д.А., Староверов С.А. Влияние ивермека на показатели иммунного ответа у животных // Ветеринария. - 2000. - № 12. - С. 29-31.
  3. Дыкман Л.А., Сумарока М.В., Зайцева И.С., Богатырев В.А., Староверов С.А. Использование частиц коллоидного золота в качестве носителя при получении антител in vivo // Межд. науч. конф. “Биотехнология на рубеже двух тысячелетий”. - Саранск, 2001. - С. 19-21.
  4. Дыкман Л.А., Семенов С.В., Староверов С.А., Щербаков А.А., Ермилов Д.Н. Применение метода дот-иммуноанализа и конъюгатов коллоидного золота для идентификации Y. pseudotuberculosis // Матер. VIII Всеросс. съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Сб. статей в 4 томах, - Т. 3. - М.: ООО “Росинэкс”, 2002. - С. 256-257.
  5. Староверов С.А., Семенов С.В., Ермилов Д.Н., Щербаков А.А., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. Использование коллоидного золота в качестве адъюванта для получения антител к белкам Yersinia pseudotuberculosis // 1-я рег. конф. молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой”. - Саратов, 2002. - С. 37-38.
  6. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Staroverov S.A., Yermilov D.N., Shchyogolev S.Yu. The adjuvanticity of colloidal gold // 6-th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “Molecular Basis of the Immune Response”. - Pushchino, Russia, 2002. - P. 25-26.
  7. Staroverov S.A., Pristensky D.V., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Use of colloidal gold to produce antibodies to aminoglycoside antibiotics // Ibid. - P. 133.
  8. Староверов С.А., Пристенский Д.В., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. Использование коллоидного золота для получения антител к антибиотикам аминогликозидной группы // 1 межд. конгр. “Биотехнология состояние и перспективы развития”. - Москва, 2002. - С. 52.
  9. Ермилов Д.Н., Дыкман Л.А., Староверов С.А. Изучение влияния коллоидного золота на функциональную активность перитонеальных макрофагов // Там же. - С. 53.
  10. Ермилов Д.Н., Дыкман Л.А., Староверов С.А. Изучение влияния коллоидного золота на культуру лимфоидных клеток в реакции бласттрансформации // Там же. - С. 53-54.
  11. Староверов С.А., Семенов С.В., Сидоркин В.А. Адъювантные свойства водорастворимых комплексов липофильных витаминов // Там же. - С. 169.
  12. Староверов С.А., Семенов С.В., Сидоркин В.А. Реакция бласттрансформации лимфоцитов в присутствии водных дисперсий липофильных витаминов // Там же. - С. 169.
  13. Сидоркин В.А., Староверов С.А., Новикова С.В., Жемеричкин Д.А. Терапевтическая эффективность дитрима // Ветеринария. - 2003. - № 3. - С. 7-8.
  14. Сидоркин В.А., Староверов С.А., Улизко М.А., Балалаев А.Ф. Эффективность ивермека при нематодозах верблюдов // Ветеринария. - 2003. - № 4. - С. 11-12.
  15. Староверов С.А., Сидоркин В.А., Семенов С.А. Влияние поверхностно активных веществ и витаминов на формирование иммунного ответа // Ветеринария. - 2003. - № 4. - С. 38-40.
  16. Староверов С.А., Сидоркин В.А., Пристенский Д.В. Лечение кроликов при псороптозе // Ветеринария. - 2003. - № 8. - С. 11-12.
  17. Староверов С.А., Семенов С.А., Сидоркин В.А. Адъювантные свойства воднодисперсных растворов неионогенных поверхностно активных веществ и витаминов // Ветеринария. - 2003. - № 10. - С. 30-31.
  18. Староверов С.А., Ермилов Д.Н., Щербаков А.А., Семенов С.В., Щеголев C.Ю., Дыкман Л.А. Получение антител к антигенам Yersinia pseudotuberculosis с использованием в качестве адъюванта частиц коллоидного золота // ЖМЭИ. - 2003. - № 3. - C. 54-57.
  19. Staroverov S.A., Pristensky D.V., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Use of colloidal gold to produce antibodies to indole-3-acetic acid // VIII Int. Conf. “The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology”. - Saratov, Russia, 2003. - P. 300-301.
  20. Улизко М.А., Староверов С.А., Сидоркин С.В. Оробец В.А. Предварительные данные по эффективности мицеллярного диминазена при пироплазмозе крупного рогатого скота // Мат. науч. конф. “Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями”. - Москва, 2003. - С. 450.
  21. Улизко М.А., Староверов С.А., Сидоркин С.В. Изучение токсико-аллергических реакций на введение воднодисперсных форм на основе диминазена // Там же. - С. 453.
  22. Улизко М.А., Староверов С.А., Сидоркин С.В. Изучение эффективности ивермектина при нематодозах верблюдов // Там же. - С. 456.
  23. Староверов С.А., Сидоркин С.В. Эффективность новой лекарственной мицеллярной формы диминазена при пироплазмозе собак // Мат. межд. науч.-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения профессора С.Н. Никольского “Актуальные проблемы инвазионной, инфекционной и незаразной патологии животных”. - Ставрополь, 2003. - С. 112.
  24. Сидоркин С.В., Староверов С.А., Хапцев З.Ю. Перспективы применения потенцированных сульфаниламидов для лечения бактериальных инфекций собак // Там же. - С. 203.
  25. Староверов С.А., Сидоркин С.В., Улизко М.А. Конструирование и изучение фармакокинетических параметров воднодисперсных лекарственных форм диминазена // Там же. - С. 344.
  26. Григорьев А.В., Семенов С.В., Пристенский Д.В., Староверов С.А., Сидоркин В.А. Разработка метода определения ивермектина в сыворотке крови и молоке крупного рогатого скота и изучение кинетических параметров его различных лекарственных форм // Труды ВИГИС. - 2004. - Т. 4. - С. 85-93.
  27. Дыкман Л.А., Сумарока М.В., Староверов С.А., Зайцева И.С., Богатырев В.А. Иммуногенные свойства коллоидного золота // Известия АН, Сер. биол. - 2004. - Т. 31. - C. 86-91.
  28. Сидоркин В.А., Староверов С.А. Эффективность мастомицина при мастите коров // Ветеринария. - 2004. - № 8. - С. 11-13.
  29. Пристенский Д.В., Староверов С.А., Сидоркин В.А., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. Получение антител к ивермектину и изучение фармакокинетики препарата “Ивермек” иммуно-дот методом // В сб. науч. тр. “Основные достижения и перспективы развития паразитологии”. - М.: Институт паразитологии РАН, 2004. - С. 242-243.
  30. Пристенский Д.В., Щеголев С.Ю., Староверов С.А., Ермилов Д.Н., Сидоркин С.В. Изучение внутриклеточного проникновения ивермектина при использовании мицеллярных структур // Там же. - С. 244-245.
  31. Староверов С.А., Сидоркин С.В., Ермилов Д.Н., Улизко М.А. Некоторые аспекты изучения фармакодинамических свойств новой лекарственной формы на основе диминазена // Мат. междунар. науч.-практ. конф. “Современные проблемы иммуногенеза, теории и практики борьбы с паразитарными и инфекционными болезнями сельскохозяйственных животных”. - Уфа, 2004. С. 258-261.
  32. Староверов С.А., Сидоркин С.В., Пристенский Д.В., Василенко О.А. Ивермек-гель: опыт лечения псораптоза кроликов // Там же. С. 261-263.
  33. Староверов С.А., Сидоркин С.В., Улизко М.А., Василенко О.А. Перспективы применения новой лекарственной формы ивермектина “Ивермек-гель” для борьбы с акарозами плотоядных // Там же. С. 263-265.
  34. Сидоркин С.В., Староверов С.А. Эффективность альвет-суспензии при некоторых нематодозах овец // Мат. науч. конф. “Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями”. - Москва, 2004. - С. 371.
  35. Сидоркин С.В., Староверов С.А., Грицай О.С., Кудашев Р.А. Эффективность альвет-суспензии при нематодозах лошадей // Там же. - С. 372-374.
  36. Староверов С.А., Сидоркин С.В., Ермилов Д.Н., Василенко О.А., Улизко М.А. Изучение внутриклеточного проникновения диминазена при использовании мицеллярных структур // Там же. - С. 388-390.
  37. Пристенский Д.В., Григорьев А.Ю., Староверов С.А., Щеголев С.Ю. Синтез метилового эфира [5-(пропилсульфинил) -1Н-бензимидазол-2-ил] карбаминовой кислоты и создание лекарственной формы на его основе // X Всеросс. конф. “Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов”. - Саратов, 2004. - С. 232.
  38. Староверов С.А., Пристенский Д.В., Сидоркин В.А., Семенов С.В., Василенко О.А., Шинкаренко А.Н. Ивермек-гель при лечении мелких домашних животных // Ветеринария. - 2005. - № 1. - С. 55-57.
  39. Староверов С.А., Сидоркин В.А., Ермилов Д.Н., Василенко О.А., Улизко М.А. Фармакодинамика новой лекарственной формы диминазена // Ветеринария. - 2005. - № 5. - С. 49-51.
  40. Староверов С.А., Пристенский Д.В., Сидоркин В.А., Рейсбих Е. Фармакокинетика ивермек-геля при наружном применении кроликам // Ветеринария. - 2005. - № 8. - С. 57-58.
  41. Староверов С.А., Габалов К.П., Сазонов А.А., Гавриш В.Г., Сидоркин В.А. Мастомицин новый противомаститный препарат // Ветеринария. - 2005. - № 12. - С. 34-36.
  42. Пристенский Д.В., Староверов С.А., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. Использование миниантител для изучения взаимодействия конъюгата ивермектинколлоидное золото с иммунокомпетентными клетками // В межвуз. сб. науч. тр.: “Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии”. - Саратов: Изд-во “Научная книга”, 2005. - С. 310-312.
  43. Ермилов Д.Н., Габалов К.П., Пристенский Д.В., Сынкин С.Ю., Староверов С.А. Определение гистамина в биологических жидкостях методом ВЭЖХ // Там же. - С. 118-119.
  44. Саурина М.И., Сидоркин С.В., Староверов С.А., Оробец В.А. Эффективность альвет-суспензии при монезиозе овец // Мат. науч. конф. “Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями”. - Москва, 2005. - С. 322-323.
  45. Сидоркин С.В., Староверов С.А., Оробец В.А., Сапунов А.Я., Щербонос Н.А. Изучение новой отечественной суспензии альбендозола при некоторых гельминтозах крупного рогатого скота // Там же. - С. 339-341.
  46. Пристенский Д.В., Староверов С.А., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. Изучение взаимодействия конъюгатов гаптенколлоидное золото с иммунокомпетентными клетками // 9-я межд. Пущинская школа-конф. молодых ученых “Биология наука XXI века”. - Пущино, 2005. - С. 165.
  47. Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Староверов С.А., Пристенский Д.В., Щеголев С.Ю. Коллоидное золото в биохимических и микробиологических исследованиях // Всеросс. конф. “Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты”. - Саратов, 2005. - С. 70-72.
  48. Pristensky D.V., Staroverov S.A., Shchyogolev S.Yu., Sumaroka M.V., Dykman L.A. Study of the interaction of haptencolloidal gold conjugates with immunocompetent cells // 7-th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “The Interface between Immunology and Medicine”. - Pushchino, Russia, 2005. - P. 39.
  49. Staroverov S.A., Pristensky D.V., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Obtaining polyclonal antibodies to nortestosterone with the use of colloidal gold as a carrier // Ibid. - P. 50.
  50. Vasilenko O.A., Staroverov S.A., Pristensky D.V., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Obtaining miniantibodies to clenbuterol and their use in an immunodot assay // Ibid. - P. 57.
  51. Yermilov D.N., Synkin S.Yu., Staroverov S.A., Pristensky D.V., Shcherbakov A.A., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Study of the interaction of microbial antigens conjugated with colloidal gold with rat peritoneal macrophages // Ibid. - P. 62.
  52. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Staroverov S.A., Pristensky D.V., Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G. Gold nanoparticles in biomedical studies // Saratov Fall Meeting, Workshop on Nanostructures and Nanoparticles: Fabrication, Properties, and Applications. - Saratov, Russia, 2005. http://optics.sgu.ru/SFM/2005/?abstract=942.
  53. Staroverov S.A., Pristensky D.V., Yermilov D.N., Gabalov K.P., Zhemerichkin D.A., Sidorkin V.A., Shcherbakov A.A., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. The effectivity analysis of accumulation of liposomal, micellar, and water-soluble forms of diminazene in cells and in organs // Drug Deliv. - 2006. - V. 13. - P. 351-355.
  54. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Staroverov S.A., Pristensky D.V., Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G. The adjuvanticity of gold nanoparticles // In: “Coherent Optics of Ordered and Random Media VI”, Proc. SPIE, - V. 6164 / Eds. Zimnyakov D.A., Khlebtsov N.G. - Bellingham: SPIE Press, 2006. - P. 616404-1 616404-7.
  55. Федотова Е.С., Староверов С.А., Щербаков А.А., Дыкман Л.А. Получение миниантител к хлорамфениколу и его выявление в иммунодот методе // В матер. межд. науч.-практ. конф. “Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных”. - Ульяновск, 2006. - С. 155-157.
  56. Федотова Е.С., Василенко О.А., Староверов С.А., Щербаков А.А., Сидоркин В.А., Дыкман Л.А. Различные способы получения антител к левомицетину // Там же. - С. 158-160.
  57. Федотова Е.С., Щербаков А.А., Староверов С.А., Дыкман Л.А. Получение антител различными способами к левомицетину // “Вавиловские чтения 2006” / Матер. конф., посвященной 119-й годовщине со дня рождения академика Николая Ивановича Вавилова. - Саратов: Изд-во СГАУ, 2006. - С. 108-111.
  58. Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Староверов С.А., Пристенский Д.В., Щеголев С.Ю. Золотые наночастицы в микробиологических и иммунологических исследованиях // Межд. науч. конф. “Микробные биотехнологии”. - Одесса, Украина, 2006. - С. 122.
  59. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Staroverov S.A., Pristensky D.V., Aksinenko N.M., Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G. Nanoparticles as carriers for intracellular antigens and drug delivery // Saratov Fall Meeting, Workshop on Nanostructures and Nanoparticles: Fabrication, Properties, and Applications II. - Saratov, Russia, 2006. http://optics.sgu.ru/SFM/2006/report/252.
  60. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Staroverov S.A., Khlebtsov B.N., Lisina D.I., Dyagilev V.L., Verin D.A., Khlebtsov N.G. Gold nanorods as cationic markers of living cells for dark-field light microscopy // Ibid. http://optics.sgu.ru/SFM/2006/report/259.
  61. Федотова Е.С., Староверов С.А., Щербаков А.А., Дыкман Л.А. Получение антител различными способами к левомицетину // III межрег. конф. молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой”. - Саратов, 2006. - С. 35.
  62. Федотова Е.С., Староверов С.А., Щербаков А.А., Дыкман Л.А. Получение миниантител к хлорамфениколу и его выявление в иммунодот методе // Там же. - С. 36.
  63. Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Староверов С.А. Разработка методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний с использованием наночастиц коллоидного золота и фаговых миниантител // В сборн. “Второй саратовский салон изобретений, инноваций и инвестиций”. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. - Ч. 1. - С. 39.
  64. Пристенский Д.В., Староверов С.А., Ермилов Д.Н., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. Анализ эффективности внутриклеточного проникновения ивермектина, иммобилизованного корпускулярными носителями // Биомедицинская химия. - 2007. - Т. 53. - С. 57-64.
  65. Федотова Е.С., Щербаков А.А., Сидоркин В.А., Староверов С.А., Дыкман Л.А., Василенко О.А. Разработка способа определения хлорамфеникола в биологических средах // Ветеринария. - 2007. - № 6. - C. 57-58.
  66. Староверов С.А., Пристенский Д.В., Ермилов Д.Н., Семенов С.В., Аксиненко Н.М., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. Получение поликлональных антител на ивермектин и его детекция в биологических жидкостях животных // Биотехнология. - 2007. - № 6. - С. 76-81.
  67. Vasilenko O.A., Staroverov S.A., Yermilov D.N., Pristensky D.V., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Obtainment of polyclonal antibodies to clenbuterol with the use of colloidal gold // Immunopharmacol. Immunotoxicol. - 2007. - V. 29. - P. 563-568.
  68. Сынкин С.Ю., Ермилов Д.Н., Пристенский Д.В., Староверов С.А., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. Взаимодействие микробных антигенов, ассоциированных с мицеллярным носителем, с иммунокомпетентными клетками // Медлайн.Ру: Российский биомедицинский журнал. - 2007. - Т. 8. - С. 67-75.
  69. Аксиненко Н.М., Сынкин С.Ю., Староверов С.А., Пристенский Д.В., Ермилов Д.Н., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. Изучение влияния конъюгатов высокомолекулярных антигенов с коллоидным золотом на перитонеальные клетки мышей // В межвуз. сб. науч. тр.: “Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии”. - Саратов: Изд-во “Научная книга”, 2007. - С. 56-58.
  70. Пристенский Д.В., Сынкин С.Ю., Староверов С.А., Аксиненко Н.М., Ермилов Д.Н., Щеголев С.Ю., Дыкман Л.А. Изучение влияния антигенов, конъюгированных с золотыми наночастицами, на дыхательную активность перитонеальных макрофагов // Там же. - С. 136-138.
  71. Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Староверов С.А., Пристенский Д.В., Аксиненко Н.М., Щеголев С.Ю. Использование наночастиц золота для внутриклеточной доставки антигенов и лекарственных веществ // В: “Высокие технологии в биологии, медицине и геоэкологии” / Под ред. Привалова В.Е. - Новороссийск, 2007. - С. 110-113.
  72. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Staroverov S.A., Pristensky D.V., Aksinenko N.M., Shchyogolev S.Yu. Gold nanoparticles as carriers for intracellular antigens and for drug delivery // In: Proc. 10-th Analytical Russia-German-Ukrainian Symp. (ARGUS2007 Nanoanalytics) / Ed. Shtykov S.N. - Saratov: Nauchnaya Kniga, 2007. - P. 136-139.
  73. Staroverov S.A., Pristensky D.V., Vasilenko O.A., Aksinenko N.M., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Interaction of ivermectin-colloidal gold conjugates with peritoneal macrophages // 8-th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “Immunology and Viral Infection”. - Pushchino, Russia, 2007.
  74. Pristensky D.V., Staroverov S.A., Synkin S.Yu., Aksinenko N.M., Yermilov D.N., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Studying the influence of microbial antigen-colloidal gold conjugates on the respiratory activity of peritoneal macrophages // Ibid.
  75. Aksinenko N.M., Staroverov S.A., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Gold nanoparticles as carriers for intracellular antigens delivery // Saratov Fall Meeting, Workshop on Nanobiophotonics III. - Saratov, Russia, 2007. http://optics.sgu.ru/SFM/2007/report/520.
  76. Staroverov S.A., Vasilenko O.A., Gabalov K.P., Pristensky D.V., Yermilov D.N., Aksinenko N.M., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Preparation of polyclonal antibodies to diminazene and its detection in animal blood plasma // Int. Immunofarmacol. - 2008. - V. 8. - P. 1418-1422.
  77. Vidyasheva I.V., Vasilenko O.A., Staroverov S.A., Dykman L.A. Obtaining of antibodies to tuberculin with use gold nanoparticles // Saratov Fall Meeting, Workshop on Nanobiophotonics IV. - Saratov, Russia, 2008. http://optics.sgu.ru/SFM/2008/report/705.
  78. Staroverov S.A., Aksinenko N.M., Gabalov K.P., Vasilenko O.A., Vidyasheva I.V., Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Effect of gold nanoparticles on the respiratory activity of peritoneal macrophages // Gold Bull. - 2009. - V. 40. - P. 153-156.
  79. Дыкман Л.А., Староверов С.А., Богатырев В.А., Видяшева И.В., Щеголев С.Ю. Иммуногенные свойства наночастиц золота // Матер. 5-го московского межд. конгр. “Биотехнология: состояние и перспективы развития”. - М.: ЗАО “Экспо-биохим-технологии”. - 2009. - С. 58.
  80. Патент РФ № 2214278 Адъювант для биопрепаратов / Староверов С.А., Семенов С.В.; 2003.
  81. Патент РФ № 2218937 Адъювант / Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Староверов С.А., Семенов С.В.; 2003.
  82. Патент РФ № 2273480 Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний микробной и паразитарной этиологии // Семенов С.В., Староверов С.А., Григорьев А.В., Сазонов А.А.; 2006.
  83. Патент РФ № 2296568 Инъекционная лекарственная форма для лечения и профилактики кровепаразитарных и инвазионных заболеваний // Семенов С.В., Староверов С.А., Сидоркин В.А., Пристенский Д.В., Ермилов Д.Н.; 2007.

Подписано к печати 09.09.09. Гарнитура Times New Roman 9.

Формат 60×84 1/16. Объем 2 усл. печ. л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ИБФРМ РАН

410049 Саратов, пр. Энтузиастов 13.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.