WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ХОЖАЙ

ЛЮДМИЛА  ИВАНОВНА

КЛЕТОЧНЫЕ И ТКАНЕВЫЕ РЕАКЦИИ РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ

ГОЛОВНОГО МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА ВОЗДЕЙСТВИЯ

НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2008

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте эксперименталной медицины РАМН и в Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ  член-корреспондент РАМН,

  доктор медицинских наук, 

  профессор

  В.А.Отеллин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ  член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор

И.Н. Боголепова

доктор биологических наук,

профессор

О.С. Сотников

 

  доктор медицинских  наук, 

  профессор

  Э.И. Валькович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Военно-медицинская академия

  им.С.М.Кирова, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится  « » ________________2008 года

в____часов_____минут на заседании диссертационного совета по защите

диссертаций на соискание ученой степени доктора наук ( )  при

Институте Физиологии им. И.П.Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб.

Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии

им. И.П.Павлова РАН.

Автореферат разослан  «  » ______________2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук  Н.Э.Ордян

 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Исследования механизмов внутриутробного развития центральной нервной системы относятся к числу актуальных задач современной биологии и медицины. В период эмбриогенеза формируются основные структурно-функциональные характеристики дефинитивного головного мозга  и могут закладываться основы различных патологических состояний и нервно-психических заболеваний, проявляющихся после рождения. Высокий интерес исследователей к проблемам влияния неблагоприятных факторов среды (экологических факторов, гипоксий разного генеза, стрессов, различных фармакологических препаратов, курения, употребления алкоголя, наркотиков и т.д.) на развивающийся организм обусловлен постоянным повышением частоты  неврологических нарушений у новорожденных и детей разных возрастных групп.

Актуальность изучения этой проблемы обусловлена еще и тем, что при всех усилиях, направленных на лечение и реабилитацию этих детей к пубертатному возрасту среди них регистрируется значительное число инвалидов. По данным статистики различные отклонения нервно-психического развития, обусловленные пренатальной патологией, диагноcцируются в разных областях России примерно у 27-44%  детей в возрасте до 15 лет (Володин Н.Н. и др. 2001).

В последние годы особое внимание исследователей привлекает  изучение последствий влияния  стресса матери на формирование поведенческих реакций, обучения, памяти, выявлению  физиологических отклонений у потомства. В специальной литературе имеются свидетельства того, что различные стрессовые воздействия, связанные с эмоциональными нагрузками или воздействиями неблагоприятных факторов среды во время беременности, вызывают отклонения в строении отделов головного мозга,  сопровождающиеся функциональными расстройствами ЦНС в постнатальном периоде развития. Как известно, стресс матери повышает ее гормональную активность, нарушает регуляцию  функций гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы и значительно усиливает секрецию кортикоидов.

Воздействие на плод высокого уровня материнских эндогенных глюкокортикоидных гормонов при стрессе приводит, как показывают наблюдения у человека и экспериментальные исследования на животных, к снижению внимания и способности к обучению, склонности к депрессии, изменению в мотивационно-эмоциональной сфере, к нарушениям моторной активности, низкому порогу раздражительности, повышению страха и тревожности и т.д. (Weinstock M., 1997; Weinstock M.,  2001; Lemaire V., Koehl M., Le Moal., 2000).

Не менее важным  является  исследование влияния повышенного  уровня глюкокортикоидов  на развивающийся мозг, возникающий после введения их синтетических аналогов. В настоящее время в акушерской практике синтетические глюкокортикоиды (дексаметазон, бетаметазон, дексазон и др.) имеют достаточно широкое терапевтическое применение. Они используются как иммуносупрессоры, противовоспалительные средства, а также  для ускорения развития легких у плода при угрозе преждевременных родов. Иногда дексаметазон применяется на протяжении почти всей беременности при риске врожденной почечной гиперплазии. Результаты недавних исследований показали, что воздействие синтетических глюкокортикоидов  в пренатальный период приводит к нарушению развития  некоторых отделов мозга, сокращению количества синапсов, а также вызывает задержку созревания нейронов, уменьшение массы всего мозга у потомства крыс (Muneoka K., Mikuni M., Ogava T. et al., 1997; Young N.A., Teskey G.C., Henry L.C., et al., 2006). Эффекты  воздействий глюкокортикоидов на плод человека до сих пор  недостаточно изучены. Однако известно, что у детей, пренатально подвергавшихся действию дексаметазона,  наблюдается изменение познавательной способности, эмоционального и социального поведения, задержка психомоторного развития (Trautman P.D. et al., 1995; Lajic S., Wedell A. et al., 1998). Наблюдения у человека и  данные, полученные в экспериментах на грызунах, свидетельствуют о том, что воздействие повышенного уровня глюкокортикоидов (экзогенного происхождения или эндогенного кортизола в ответ на  стресс матери во время беременности) приводят к неблагоприятным эффектам, включающим нейроэндокринные и поведенческие расстройства, которые конечно необходимо изучать. Однако одним из актуальных и особо значимых направлений  исследований  в этой области на современном этапе должны быть исследования механизмов  структурных  изменений отделов головного мозга плода, новорожденного и индивидуума в постнатальном периоде развития. Данные о клеточных механизмах и структурных основах функциональных нарушений ЦНС в формациях головного мозга в настоящее время  отсутствуют.

Механизмы перечисленных выше эффектов стресса в той или иной мере связаны как с глюкокортикоидами, так и с моноаминами. Острый и хронический стресс вызывает в разной мере выраженное в отдельных структурах мозга изменение уровня серотонина, числа пре- и постсинаптических серотониновых рецепторов, особенно в участках мозга связанных с контролем страха и тревожности (Aldridge J.E. et al., 2003; Janusonis et al., 2004). Эти факты свидетельствуют о том, что  серотонинергическая система является мишенью  воздействия гормонов стресса, особенно кортикоидов. В ответные реакции эмбрионов и плодов на воздействие материнского стресса вовлекается развивающаяся серотонинергическая система. Однако как влияет изменение  уровня содержания серотонина и  его метаболизма на ключевых стадиях морфогенеза на эмбриональное развитие и, в том числе, формирование структур головного мозга млекопитающих  остается  не известным. 

Одним из значимых повреждающих агентов влияющих на развитие  головного мозга  является гипоксия различной этиологии (внешняя среда, заболевания матери и т.д.). Развивающийся мозг человека и млекопитающих  чувствителен к гипоксии.  Ее воздействие в пренатальный период, по мнению клиницистов, вызывает наибольшее число отклонений в развитии нервной системы, составляющих большую гетерогенную группу нейропатологий. Экспериментальные исследования на животных показали, что пренатальная гипоксия, как и материнский стресс,  приводит к  нарушениям формирования поведенческих реакций, развитию двигательной активности, ослаблению способности к обучению, снижению массы тела (Tashima L. еt al., 2001; Vexler Z., Ferriero D., 2001; Pascual J., Koenigsberger M., 2003). Влияние различных форм гипоксии на строение и функции систем и органов достаточно хорошо изучено у взрослых животных, однако реакции клеток различных отделов развивающегося мозга в период раннего нейрогенеза на повреждающее действие гипоксии, а также структурные изменения формаций  мозга у потомства в постнатальный период не исследованы.

  Изучение этих проблем требует проведения модельных экспериментов на животных,  основное направление которых должно быть связано с исследованием  влияния повреждающих факторов: повышенного уровня глюкокортикоидных гормонов,  влекущего за собой изменение уровней содержания и метаболизма моноаминов, а также острой пренатальной гипоксии на развитие структур головного мозга, во время  раннего  постимплантационного  периода, когда формируются закладки формаций головного мозга, и на стадиях их активного роста. Необходимо проследить последствия пренатальных  воздействий неблагоприятных факторов в постнатальный период развития, и  выявить конкретные клеточные и тканевые механизмы, приводящие к формированию аномалий развития ЦНС. Широкое использование  в клинике синтетических аналогов глюкокортикоидных гормонов для терапии беременных, о влиянии которых на развитие потомства известно крайне мало, указывает на острую необходимость фундаментальных исследований побочных эффектов этих препаратов.  Получение данных такого рода представляется  необходимым для установления механизмов морфогенеза эмбрионального мозга, а также для более глубокого понимания основ формирования врожденных патологий ЦНС.

ЦЕЛЬ  И  ЗАДАЧИ  ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучение клеточных механизмов эмбрионального развития и реакций таких полифункциональных формаций головного мозга млекопитающих как неокортекс, гиппокамп, стволовые моноаминергические ядра в ответ на различные стрессовые воздействия  в пренатальный период и их эффекты в последующем онтогенезе.

Для этого поставлены следующие ЗАДАЧИ:

  1. Изучить влияние повреждающих факторов (повышенного уровня глюкокортикоидных гормонов, как эндогенных  после хронического материнского стресса, так и экзогенных  после введения синтетического кортикоида дексаметазона; сниженного  уровня серотонина и острой пренатальной нормобарической гипоксии)  на развитие исследуемых отделов эмбрионального мозга лабораторных млекопитающих.
  2. Проследить непосредственные реакции нейральных эмбриональных  клеток развивающегося головного мозга  на воздействия повреждающих факторов.

3.  Выявить отдаленные последствия пренатальных воздействий

  повреждающих факторов, определив динамику изменения структурных

  характеристик формаций мозга на разных этапах постнатального

  периода развития  (препубертатном, пубертатном и у половозрелых

  животных).

НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.  Впервые получены данные о динамике развития клеточных и тканевых реакций в отделах развивающегося головного мозга грызунов в ответ на воздействия повреждающих факторов. В зависимости от глубины и характера изменений выявлены адаптивные и деструктивные реакции, являющиеся структурной основой формирования пренатальной патологии ЦНС.

Впервые установлено, что избыточный уровень глюкокортикоидов  (как следствие материнского стресса, так и  введения синтетических аналогов) во время беременности, вызывает непосредственные реакции нейральных клеток развивающегося мозга, приводящие  к быстрой апоптотической гибели части  из них, нарушает базисные гистогенетические процессы развития и оставляет  длительный след в виде структурных изменений в формациях головного мозга у потомков в постнатальном периоде и достигших половозрелого возраста. Избыток глюкокортикоидов  в ранние периоды формирования мозга  и его функций приводит  к  тяжелым аномалиям развития неокортекса, гиппокампа и стволовых моноаминергических ядер, проявляющихся в недоразвитии и истончении слоев, сокращении количества клеток в структурах, изменении соотношения разных типов клеток, отсроченной гибели нейронов.  Показано, что серотонин функционально активен на протяжении всего  пренатального периода. Он необходим для нормального развития эмбриона как в доимплантационный, так и постимплантационный периоды развития млекопитающих. Дефицит серотонина на доимплантационных стадиях приводит к гибели дробящихся зародышей, а в постимплантационный период  вызывает  задержку развития и дифференциации нейральных и глиальных клеток в отделах развивающегося мозга, нарушает формирование ряда структур головного мозга, в том числе, серотонинергического центра мозга - дорсального ядра шва, что приводит к вторичному дефициту эндогенного нейронального серотонина и может инициировать развитие новых патологических процессов. Получены новые сведения о влиянии острой пренатальной гипоксии на развитие неокортекса и структур гиппокампа. Показано, что гипоксия вызывает  непосредственную выраженную реакцию эмбриональных нейральных клеток, приводящую значительную  их часть к апоптотической гибели,  и оставляет след в постнатальном периоде развития, представленный недоразвитем кортикальных структур и формаций гиппокампа. Впервые морфологически показано, что клетки развивающихся различных отделов гиппокампа имеют разную чувствительность к гипоксии. Выявлено, что  повреждающее действие гипоксии на эмбриональный мозг имеет стадиоспецифический эффект.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ  И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.  Результаты данной работы являются существенным вкладом в понимание клеточных механизмов формирования структурных основ врожденных патологий ЦНС, проявляющихся после рождения. Установленные непосредственные клеточные  реакции и модификации базисных гистогенетических процессов во время формирования отделов головного мозга, в том числе стволовых  моноаминергических ядер, в ответ на воздействия стрессовых факторов в пренатальный период, расширяют представления о патогенезе нейродегенеративных заболеваний в постнатальном онтогенезе. Выявлен существенный факт, что во время эмбриогенеза биологически активные вещества (гормоны, моноамины), запускающие и регулирующие клеточные и тканевые процессы генетической программы развития мозга, даже при  непродолжительном воздействии эпигенетических факторов, могут искажать эту программу, приводя к формированию отклонений в строении отделов мозга, которые сохраняются в течение всего последующего онтогенеза. Материалы данного исследования определяют круг экспериментальных моделей для изучения возникновения разнообразных нарушений поведенческих реакций, памяти, обучения, депрессии, врожденных психопатологий. Представленные данные могут служить основой для создания моделей медикаментозной коррекции  врожденных нарушений, а также привлечь широкое внимание к профилактике последствий неблагоприятных воздействий во время беременности, особенно в период основного органогенеза у эмбрионов, наиболее чувствительного и опасного для жизни и здоровья потомства.

Полученные данные могут быть использованы в преподавании морфологических дисциплин в процессе подготовки гистологов, эмбриологов, неонатологов, детских неврологов и усовершенствовании врачей. 

ОСНОВНЫЕ  ПОЛОЖЕНИЯ,  ВЫНОСИМЫЕ  НА  ЗАЩИТУ

  1. Воздействия использованных повреждающих факторов среды на развивающийся мозг вызывают  модификации базисных гистогенетических процессов – пролиферации, миграции и дифференциации нервных клеток. Это приводит к формированию однотипных структурных отклонений в строении отделов головного мозга, которые сохраняются в течение всего последующего онтогенеза.
  2. Избыточный уровень глюкокортикоидов  и пониженный уровень серотонина в эмбриональный период существенно влияют на развитие фетального мозга, изменяя процессы нейро-, глиогенеза и дифференциации нейронов. Структурные изменения  и клеточная гибель в  отделах головного мозга формируются в пренатальный период и сохраняются  после рождения.
  3. Пренатальный период развития млекопитающих высоко чувствителен к низкому уровню серотонина. Серотонин играет важную роль в механизмах морфогенеза, начиная с ранних доимплантационных стадий. Его дефицит приводит к нарушению нейро- и глиогенеза, лежащих в основе аномалий развития  структур головного мозга. Серотонин является авторегулятором развития  серотонинергического центра мозга - nucleus raphe dorsalis. Снижение уровня серотонина  на ранних этапах эмбриогенеза приводит к структурным изменениям в  nucleus raphe dorsalis, уменьшению количества серотонинсинтезирую- щих нейронов, что может вызывать его вторичный дефицит.
  4. Повреждающее действие острой пренатальной гипоксии имеет стадиоспецифический эффект.  Наибольшая степень выраженности структурных изменений в  отделах мозга регистрируется при воздействии гипоксии  на более ранних постимплантационных стадиях, во время, когда активны процессы пролиферации, миграции и дифференцировки нервных клеток, обеспечивающих формирование структур мозга и их клеточный состав.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА. Фрагменты диссертации-онной работы представлены на XXIV Конгрессе “Psychoneuroendocrine aspects of life phases: Psychoactive agent and the foetal/embryonic development, IBPN (Taoraine, Italy, 1993), научной конференции «Гистогенез и регенера- ция тканей» (ВМА, СПб, 1995), на симпозиуме «Современные представления о структурно-функциональной организации мозга» к 100-летию акад. С.А.Саркисова (Москва, 1995), на VI Европейском конгрессе нейропаталогии (Barcelona, 1999), на Всероссийской Конференции «Актуальные проблемы экспериментальной клинической фармакологии» (НИИЭМ РАМН, СПб, 1999), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвящ. 150-летию И.П.Павлову, СПб, 1999, научной конференции «Механизмы структурной, функциональной  и нейрохимической пластичности мозга» (НИИ мозга РАМН, Москва, 1999),  научной конференции «Механизмы адаптивного поведения» (Институт физиологии им. И.П.Павлова, РАН, СПб,1999),  29 Annual Meeting Society for Neuroscience (Miami Beach, USA, 1999), научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины» посвящ. 110-летию НИИЭМ (СПб,2000), 30  Annual Meeting Society for Neuroscience (New Orleans, 2000), 31  Annual Meeting Society for Neuroscience  (San Diego,USA, 2001), XII Международном Совещании по эволюционной физиологии, посвященном памяти акад. Л.А.Орбели (НИИ им. И.М.Сеченова РАН, СПб, 2001), XVIII съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2001),  конференции “Changing views of Cajal’s neuron”, CSIC (Madrid, Spain, 2001), IV Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения» (НИИ Физиологии РАН, СПб, 2002), научной конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2002), 33 Annual Meeting Society for Neuroscience (New Orleans, 2003), Российской конференции с международным участием «Организм и окружающая среда – адаптация к экстремальным условиям» (Институт медико-биологических проблем РАН, Москва, 2003), Всероссийской конференции «Пластичность  и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга» (НИИ мозга РАМН, Москва, 2003), 8-th Multidisciplinary International conference of Biological Psyhiatry “Stress and behavior” (St.Petersburg, 2004), International Congress “Progress in Fundamental and Applied Sciences for Human Health” (Sudak, Crimea, Ukraina,2004), научной конференции «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004), 19-ом Съезде физиологов (Екатеринбург,2004), 8-th Regional Meeting European Neuropsychopharmacolo- gy (2004), 35 Annual Meeting Society for Neuroscience (2005),  1-ом Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, Дагомыс, 2005), кнференции «Фундаментальные науки - медицине» РАН (Москва, 2006), XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии, посвященных памяти акад. Л.А.Орбели и 50-летию Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН (СПб, 2006), научной конференции «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности ассметрии и пластичности мозга» (НИИ мозга РАМН, Москва, 2006),  V Международной конференции по функциональной нейроморфологии, «Колосовские чтения», РАН (СПб, 2006).

ПУБЛИКАЦИИ

Полученные результаты диссертационного исследования опубликованы в 54 работах. Из них: 1 обзор, 2 монографии  и 25 статей в ведущих отечественных и зарубежных  журналах, включенных в список ВАК.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материал и методы», четырех глав результатов собственных исследований и их  обсуждения, выводов, заключения и списка литературы. Диссертация изложена на 300 страницах, иллюстрирована 124 рисунками, включающими 215 микрофотографий, 9 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования.  Работа выполнена на мышах гибридах F1 (C57BL/CBA), мышах линии  C57BL  и лабораторных крысах линии Wistar. Было исследовано  75 зародышей, находящихся на разных стадиях дробления (от стадии 2-х бластомеров до стадии бластоцисты);  126 эмбрионов на ранних постимплантационных стадиях развития (с 6-7  до 16 эмбриональных суток);  238 плодов на поздних постимплантационных стадиях развития (с 17 до 19 эмбриональных суток); 376  животных на разных стадиях постнатального развития  (новорожденных, особей раннего постнатального периода, препубертатного, пубертатного периодов и  животных, достигших половозрелого возраста).

Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Эмбрионы различных стадий пренатального развития и животные разных постнатальных этапов онтогенеза в работе использовались для изучения:

1. Роли серотонина в процессах дробления. Были использованы доимплантационные дробящиеся зародыши со стадии 2-х бластомеров до стадии бластоцисты.  Оценивали скорость дробления, сопоставляя количество бластомеров в зародыше в опыте и контроле на определенных стадиях. 

  2. Воздействий неблагоприятных факторов среды  (повышенного уровня глюкокортикоидов,  гипоксии) на развитие разных отделов развивающегося головного мозга. Исследование  закладок неокортекса, среднего, заднего и продолговатого мозга у постимплантационных эмбрионов и плодов  проводили на 13, 14,  16, 17, и 19, 20 эмбриональные сутки, т.е. в периоды активных процессов пролиферации, миграции и начальной дифференциации нейронов. Определяли наличие клеток с признаками пикноза, либо апоптотической гибели, а также целостность ядра и цитоплазмы.

  3. Отдаленных последствий пренатальных воздействий повреждающих факторов среды (повышенного уровня глюкокортикоидов, пониженного уровня серотонина, гипоксии). В разные сроки постнатального периода исследовали различные отделы головного мозга, отличающиеся по происхождению, строению и реализации высших нервных функций:  neocortex (слои II – VI); структуры, входящие в состав  лимбической системы: area cingularis (передняя и задняя подобласти лимбической коры); hippocampus  (поля СА1, СА3,  СА4 и fascia dentata); моноаминергические ядра - substantia nigra и  nucleus raphe dorsalis.

  Cравнительный анализ состояния структур головного мозга после различных воздействий и в контроле проводили в стандартизированных условиях на одних уровнях. При этом использовался стереотаксический атлас мозга крысы (Paxinos G., Watson C.  The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, 1998); и стереотаксический  атлас мозга мыши (Slotnick B. M., Leonard C.M. A Stereotaxic Atlas of the albino mouse forebrain, 1995).

Материал обрабатывали по общепринятой гистологической методике. Готовили серийные фронтальные срезы целого мозга. Морфологическому анализу подвергали каждый 5-й срез разных отделов мозга.

Были исследованы следующие отделы головного мозга: neocortex- фронтальная (area frontalis); теменная (area parietalis); височная (area temporalis); затылочная кора (area occipitalis); лимбическая кора (area сingularis), формации hippocampus (поля СА1, СА2, СА3, СА4 и fascia dentata);  substantia nigra  и nucleus raphe dorsalis. Оценивали размер нейронов, их форму, целостность ядра и цитоплазмы, наличие клеток с признаками пикноза или цитолизиса, вакуолизации цитоплазмы, а также оценивали плотность расположения нейронов в каждой структуре.

Выбранные  для исследования структуры мозга выполняют жизненно важные функции, принимают участие в построении и регуляции многочисленных и разнообразных функций ЦНС, участвуют в ответе на стрессовые ситуации, достаточно обильно иннервируются серотонинергическими  волокнами.

Методы исследования. 

Проведено несколько серий экспериментов:

  1. Изучение воздействия повышенного уровня глюкокортикоидов, возникающего после стресса матери на развивающийся мозг крыс.

Изучались как непосредственные реакции развивающейся нервной ткани в ответ на материнский стресс, так и отдаленные его последствия. Самки подвергались процедуре хронического иммобилизационного стресса  в течении 30 минут дважды в день  на 16, 17, 18, 19, 20  и 21 сутки беременности.  Исследование непосредственных реакций эмбриональной нервной ткани  в ответ на стресс матери проводили через  3 часа и 1 сутки после однократного воздействия материнского стресса на эмбрионы 16 суток развития. Для изучения отдаленных последствий хронического  материнского стресса мозг потомства  фиксировали  на 25, 40-45 и 90 сутки постнатального развития.  В качестве контроля исследовали мозг потомков  аналогичных стадий развития, полученных от интактных матерей.

  1. Изучение воздействия повышенного уровня глюкокортикоидов,  возникающего у беременных самок крыс после введения синтетического аналога дексаметазона на развивающийся мозг потомства.

Изучали как непосредственные реакции  развивающейся нервной ткани на воздействие дексаметазона в пренатальный период развития, так и отдаленные его последствия. В исследовании использовали фармакологический синтетический препарат – дексаметазон-фосфат (КРКА, Словения) в дозах 1 мг/кг  и 3 мг/кг. Выбор дозы: 1мг/кг - приближена к средне терапевтической, используемой в акушерской практике; 3 мг/кг -  широко используется в известной литературе в экспериментах на животных для более выраженного эффекта  воздействия повышенного уровня кортикоидов на функции мозга. Препарат вводили однократно внутрибрюшинно на 13, 16 и 19 сутки внутриутробного развития, когда наиболее активно осуществляются процессы пролиферации нейральных клеток-предшественников и их начальная дифференцировка. Для исследования непосредственных реакций эмбриональной нервной ткани на воздействие дексаметазона  мозг плодов крыс линии Wistar фиксировали через  3 часа и 1 сутки после введения препарата. Для изучения отдаленных последствий  пренатального воздействия дексаметазона мозг потомков фиксировали на  60 сутки  постнатального развития, когда отчетливо выявляются модификации основных гистогенетических процессов. В качестве контроля исследовали мозг  потомков аналогичных стадий развития, полученных от интактных  матерей, и матерей, получавших однократную внутрибрюшинную инъекцию физиологического раствора.

  1. Изучение роли серотонина в развитии и фомировании головного мозга

у подопытных животных.

Для исследования участия серотонина в развитии головного мозга и формирования патологий при его дефиците в пренатальном периоде использовался метод ингибирования ключевого фермента его синтеза – триптофангидроксилазы парахлорфенилаланином (пХФА). Работа выполнялась на мышах гибридах F1(C57Bl/CBA),  на мышах линии C57Bl и крысах линии Wistar. Беременным самкам мышей (на 8 эмбриональные сутки) и крыс (на 9 эмбриональные сутки) вводили пХФА однократно внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг. Доза была выбрана с учетом литературных данных, свидетельствующих о том, что пХФА в дозе 300-400 мг/кг как у взрослых животных, так и у их плодов вызывает длительное снижение уровня содержания серотонина (до 50-80%). Снижение уровня серотонина происходит постепенно, достигает максимума через 3-е суток и сохраняется пониженным в течение 5-6 суток (Науменко, Е.В., 1971; Попова Н.К. и др., 1975; Keller H.H., 1972; Lauder J.M. et al., 1985)

Метод определения уровня серотонина. Уровень содержания серотонина в тканях мозга эмбрионов определяли методом высокоаффинной жидкостной хроматографии в лаб. Биохимии НИИ Акушерства и гинекологии им. С.Е. Отта. Количество серотонина измеряли в нг/1мг белка эмбриональной нервной ткани.  Было установлено, что в пробах, полученных от интактных эмбрионов, количество серотонина составляло 0,137±0,01 нг/мг белка, а через 3 суток после введения  пХФА в дозе 400 мг/кг его количество равнялось 0,05±0,006 нг/мг белка эмбриональной нервной ткани, т.е. снижалось на 63,3%.

  Для изучения влияния дефицита серотонина на развитие доимплантационных  и ранних постимплантационых зародышей препарат вводили на 1 и 2 сутки беременности. Эмбрионы исследовали на 3, 4, 5, 7 и 8 эмбриональные сутки развития.

Для изучения роли серотонина в развитии головного мозга  пХФА вводили самкам мышей на  8 сутки, а самкам крыс на 9 сутки беременности. Эта стадия эмбрионального развития была выбрана из расчета, что значительное снижение уровня серотонина происходило через 3 суток (см. выше) после введения (т.е. на 11-12 эмбриональные сутки, в период когда формируются отделы мозга) и остается пониженным до 16-18 эмбриональных суток (т.е. на протяжении всего периода активного морфогенеза: процессов пролиферации, миграции и начальной дифференцировки нейронов). Исследование головного мозга у животных проводили в постнатальный период на 1, 5 ,10, 25, 40 и 90 (П1, П5, П10,  П25, П40 и П90) постнатальные сутки. В качестве контроля использовали мозг потомков соответствующих стадий развития, полученных от интактных матерей, и матерей которым вводили физиологический раствор на соответственных сроках беременности.

  Для изучения влияния  пренатального материнского стресса  на формирование отделов мозга у эмбрионов, развивающихся на фоне дефицита серотонина,  использовали одновременное  сочетание метода пренатального ингибирования синтеза серотонина и пренатального иммобилизационного стресса. Этот фрагмент работы выполнен на крысах линии Wistar. В качестве контроля служили самки, которым однократно внутрибрюшинно на соответствующей стадии вводили физиологический раствор. Исследование отделов головного мозга у  потомства как контрольных самок, так и самок, подвергавшихся воздействиям проводили на 25, 40 и 90 постнатальные сутки.

  Морфометрические параметры клеток измерялись в разных слоях  neocortex и hippocampus.  Определяли количество клеток,  их среднюю площадь, процент площади, занимаемой клетками внутри выделенного квадрата, вертикальные и горизонтальные размеры, углы наклона клеток или угол отклонения апикального дендрита от вертикали при нарушении ориентации нейронов. Количественную оценку наблюдаемых изменений проводили с помощью компьютерной  программы анализа изображений Matrox Inspector (Канада). Изображения структур с гистологических срезов мозга животных вводили в компьютер с помощью  цветной цифровой видеокамеры Leica DIC-E 300F (Leica, Germany), смонтированной на световой микроскоп Н605Т (увеличение х40;  Image size 1300x1030 пикселей; Color depth: 8 bit). Сравнение количественных данных проводили с использованием параметрического критерия t.

Статистическая обработка количественных оценок и измерений проводилась при помощи компъютерной программы  PhotoM121.

Для электронномикроскопического исследования участки neocortex  фиксировали методом погружения в 2,5% растворе глутаральдегида на фосфатном буфере, затем отмывали в буфере и использовали дополнительную фиксацию 1%  четырехокисью осмия на 0, 05М какодилатном буфере, обезвоживали в спиртах и заливали в эпон. Изготавливали полутонкие срезы, проводили прицельную заточку блока на уровни различных слоев neocortex. Ультратонкие срезы исследовали под электронным микроскопом Jem-100 B.

  1. Влияние острой пренатальной гипоксии на развитие мозга крыс.

Исследование проведено на крысах линии Wistar.  Беременных крыс помещали в барокамеру СВК-150 объемом 14 литров. Барокамера оснащена устройствами для автоматического обогрева до заданной температуры, постоянной смены газовой смеси и определения скорости потока газа. Во время экспериментов использовали аппаратуру для определения: содержания О  и СО - газоанализатор CF-101 (SPHAJA, Франция), скорости газового потока через камеру – волюметр (VEB-MLW, Германия), давления в камере – манометр с ценой деления 1 кг/см  (Россия), температуры среды в камере – электротермометр и чернильный самописец КСП -6 (Россия). Азотно-кислородную смесь приготавливали  с помощью газоаналитической и газосмесительной установки фирмы “Laorg” (Франция). Беременных самок  помещали в барокамеру и содержали в ней 1 час, в течение которого ее продували азотно-кислородной смесью со скоростью 2,5 л/мин. Во время экспериментов использовали следующие параметры среды: содержание кислорода – 7,56 – 7,8%;  содержание углекислого газа 0,16 – 0,21%; температура – 21,3 – 23,0С; общее давление – нормальное. Воздействие гипоксии  осуществляли на 13, 16 и 19 сутки эмбрионального развития. Гистологическое исследование мозга крысят проводили на 1, 5 и 10 постнатальные сутки. Мозг фиксировали в жидкости Буэна и по общепринятой методике заливали в парафин, готовили фронтальные срезы толщиной 5-7 мкм и окрашивали по Нисслю. 

Материал для световой микроскопии обрабатывался общепринятыми гистологическими методами.  Гистологические препараты исследовали под световым микроскопом фирмы  Leiсa (Германия).

Иммуноцитохимические методы исследования.

Метод выявления GFAP. Изучение дифференцировки астроцитарных элементов в разных кортикальных структурах проводили с использованием иммуноцитохимического метода выявления  белка промежуточных филаментов астроцитов – специфического глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), что позволило  судить о начале, объеме и темпах их дифференцировки. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 1 часа или смеси 80% этанола и 0,5%  параформальдегида в течение 24 часов.  GFAP выявляли с помощью поликлональных антител (DАКО, Дания) и вторичных антител, конъюгированных с полимером и пероксидазой (En Vision+, DAKO, Дания). Визуализацию связанных первичных  антител производили при помощи хромогена DAB+ (DAKO, Дания).

Метод выявления серотонина. Для выявления серотонинергических  нейронов nucleus raphe dorsalis использовали иммуноцитохимический метод выявления серотонина. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,01М фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) в течение 24 часов. Фиксированный материал обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике. Иммуноцитохимическая реакция на серотонин осуществлялась с использованием  поликлональных кроличьих антител к серотонину фирмы Novocastra (NCL-SERTp, разведение 1: 200) и набора  LSAB -2 (DAKO, Дания). Визуализацию связанных первичных  антител производили при помощи хромогена DAB+ (DAKO, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали толуидиновым синим по Нисслю.

Метод выявления тирозингидроксилазы. Для изучения локализации тирозингидроксилазы, использовали иммуноцитохимический метод ее выявления. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,01М фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) в течение 24 часов. Фиксированный материал обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике. Иммуноцитохимическая реакция на тирозингидроксилазу осуществлялась с использованием моноклональных антител (клон ТОН А1, разведение 1: 500)  фирмы BD Pharmingen и набора  LSAB -2 (DAKO, Дания).  Визуализацию связанных первичных  антител производили при помощи хромогена DAB+ (DAKO, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали толуидиновым синим по Нисслю (Коржевский Д.Э. и др., 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние иммобилизационного стресса матери на  развитие отделов головного  мозга  крыс.

Уровень стероидных гормонов (глюкокортикоидов и половых)  в крови матери имеет существенное значение для нормального развития плодов. Изменение гормонального баланса в ту или другую сторону,  возникающего при воздействии разного рода стрессов на мать, как правило, приводит к существенным нарушениям различных функциональных систем ее потомков.

В развитии стресса существенная роль принадлежит глюкокортикоидам и серотонину, которые соответственно называют гормоном и медиатором стресса и уровень которых при этом значительно меняется. Результатом пренатального стресса является, в частности, изменение уровня  серотонина и снижение его оборота в ряде структур головного мозга (Poland R.E., et al., 1995; Muneoka K. et al, 1997). Серотонин является одним из главных модуляторов гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, как матери, так  и плода,  участвующей в ответе на стресс. Попытка в настоящей работе изучить влияние дисбаланса кортикоидов и серотонина, возникающего при материнском стрессе, на развитие отделов головного мозга млекопитающих объясняется отсутствием в доступной нам литературе  данных о клеточных механизмах, характере и тканевых характеристиках нарушений развития мозга. 

Материнский стресс во время формирования отделов головного мозга вызывает  каскад структурно-функциональных реакций, при этом выявляются непосредственные реакции эмбриональной нервной ткани на стресс и отдаленные его последствия, представленные структурными изменениями во всех исследованных формациях головного мозга и сохраняющиеся в постнатальном онтогенезе.

Непосредственные реакции эмбриональной нервной ткани в ответ  на

стресс матери.

Однократная процедура стрессирования матери на 16 сутки беременности достаточно быстро (через 3 часа и 1 сутки) вызывает  реакцию развивающейся нервной ткани на стресс, которая приводит к апоптотической гибели часть клеток. В основном,  гибель нейробластов  регистрируется в развивающихся неокортексе, среднем и продолговатом мозге.  Утрата части нейробластов  в популяциях клеток последних,  несомненно,  будет сказываться на формировании и развитии структур этих отделов мозга и их клеточном составе.

Отдаленные последствия воздействия стресса  матери в структурной организации отделов головного мозга у потомства крыс.

Аномальное развитие  neocortex  выявлено у животных, пренатально переживших материнский стресс,  на 25, 40 и 90 постнатальные сутки,  при этом характерными нарушениями цитоархитектоники во  всех изученных областях коры (area frontalis, area parietalis, area temporalis, area occipitalis) было:  истончение и разреженность всех слоев, особенно глубоких (V  и VI), снижение в них количества клеток,  в том числе, больших пирамидных нейронов, недоразвитие нейропиля, нарушение ядерно-цитоплазматического соотношения в нейронах,  а также присутствие  диффузной единичной гибели клеток во всех слоях neocortex. У животных, достигших половозрелого возраста (90  постнатальные сутки), все структурные изменения в neocortex, отмеченные в препубертатный и пубертатный периоды,  сохраняются, более того к этому сроку происходит утрата больших пирамидных нейронов в слое V и появление нейронов с вакуолизированной цитоплазмой. Материнский стресс у животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина, приводит к аналогичным изменениям в кортикальных структурах.

Значительные  нарушения  выявлены в аrea cingularis. У потомков всех возрастов, пренатально перенесших материнский стресс, в передней и задней подобластях лимбической коры присутствуют аналогичные изменения характерные для  neocortex (истончение и разреженность как слоев верхнего комплекса (II-III-IV), так глубоких слоев (V и VI), снижение количества клеток в слоях, уменьшение размеров клеточных тел и объема цитоплазмы). В задней лимбической подобласти эти нарушения  более выражены. У крыс, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и пренатально перенесших материнский стресс, в аrea cingularis наряду со сходными нарушениями, по мере увеличения постнатального возраста (в пубертатный период и у половозрелых животных), в верхних слоях (II-III-IV) задней лимбической подобласти  происходит еще большее снижение количества нейронов, уменьшение размеров клеток и изменение их формы, часто приобретающей неправильные очертания.

Хронический стресс матери приводит у потомков к изменению структуры всех формаций hippocampus. В полях СА1, СА3 и СА4 слои пирамидных нейронов истончены. Единичные диффузно  рассеянные погибшие пирамидные нейроны и клетки гранулярного слоя fascia dentata  встречаются на протяжении всего постнатального периода, а также у животных, достигших половозрелого возраста. Такая отсроченная постепенная гибель клеток в результате приводит к утрате значительной части нейронов  в формациях hippocampus у взрослых животных. Достаточно высокую чувствительность клеток hippocampus к кортикоидам,  обнаруженную в нашем исследовании, по-видимому,  можно объяснить содержанием самой высокой плотности  глюкокортикоидных рецепторов нейронами всех формаций hippocampus  по сравнению с клетками других структур головного мозга (Wan S.L.,  Liao M.Y., Sun K., 2002; Weinstock, 2005). Более того, их количество в лимбических областях  еще более повышается после иммобилизационного стресса матери (Kanitz E., Otten W., Tuchscherer M., et al., 2003). Результатом этого может быть изменение функционального состояния нейронов в отделах hippocampus. Обнаруженные нами структурные изменения и дегенеративные процессы  в формациях hippocampus могут быть одной из основных причин нарушения физиологических и поведенческих реакций у животных. Отмечено, что разного рода психические расстройства и неврологические заболевания:  шизофрения, депрессия, эпилепсия, болезнь Альцгеймера и т.д., сопровождаются изменениями в структуре отделов hippocampus (Fujioka A., Fujioka T., Ishida Y., et al., 2006; Fenoglio K.A., Brunson K.L., Baram T.Z., 2006; Dhikav V., Anand K.S., 2007). 

  Отмеченное нами снижение количества пирамидных нейронов в формациях hippocampus следует расценивать как результат остановки пролиферации клеток во всех полях  и fascia dentata  hippocampus после пренатального стресса, вызывающей резкое уменьшение его объема (Isgor C., Kabbaj M., Akil H., 2004;  Yu I.T., Lee S.H., LeeY.S., Son H., 2004). Наряду с этим выявлен факт присутствия в пубертатный период  значительного количества незрелых клеток в hippocampus (Liu H., Kaur J., Dashtipour K., et al., 2003), который дает основание предположить, что после стрессового воздействия основная масса клеток не способна осуществить дифференцировку должным образом и остается в незрелом состоянии. Вероятно, последствием этого может быть отсроченная гибель клеток в этих структурах.

Показано, что у животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и переживших пренатальный  стресс, структурные изменения в формациях  hippocampus более выражены. Во всех полях и, особенно, fascia dentata слои  нейронов истончены, присутствуют диффузно  рассеянные погибшие, как пирамидные нейроны, так и клетки гранулярного слоя. Взаимные контролирующие влияния серотонина и кортикоидов в нейрогенезе в период пренатального развития крайне мало изучены. Известно лишь то, что у пренатально стрессированных крыс происходит снижение уровня серотонина в hippocampus за счет подавления избыточным кортикостероном серотонинергической трансмиссии путем снижения экспрессии 5-НТА1 рецепторов. С другой стороны, серотонин через 5-НТ7 рецепторы вызывает  транскрипцию mRNA глюкокортикоидных рецепторов в hippocampus (Andrews M.H., Kostaki A., Setiawan E., 2004),  недостаток кортикостероидов нарушает развитие серотонинергической иннервации в hippocampus  и neocortex (Leret M.L., Peinado  V., Suarez  L.M., et al., 2004). Как видно, существуют достаточно  сложные механизмы тесного взаимодействия  уровней серотонина и глюкокортикоидных гормонов,  необходимых для нормального нейрогенеза и созревания мозга, нарушение корреляции уровней которых при материнском стрессе может приводить к аномалиям развития отделов мозга, что еще раз подтверждается результатами настоящего исследования. 

  Впервые показано, что  материнский стресс сказывается на морфо- функциональном состоянии нейронов моноаминергических ядер substantia nigra и  nucleus raphe dorsalis. Структурные изменения и гибель клеток в них регистрируются в пренатальный и постнатальный (препубертатный, пубертатный) периоды, а также сохраняются  у  животных, достигших половозрелого возраста.

  У 25 суточных крысят после пренатального стрессирования в substantia nigra zona compacta обнаружено снижение количества клеток,  присутствие  нейронов с вакуолизированной цитоплазмой (рис.1). С увеличением постнатального возраста (в пубертатный период и у половозрелых животных) происходит усиление дегенеративных процессов при этом возрастает количество нейронов, имеющих тяжелые изменения и погибших клеток, одновременно происходит  сокращение общего количества нейронов, составляющих структуру. Оказалось, что у подопытных животных в пубертатный период количество дофаминсинтезирующих нейронов сокращается почти в 2 раза, вероятно, результатом этого будет снижение объема синтеза дофамина и его оборота в организме.

Рис. 1.  Мозг крысы, фрагмент substantia nigra zona compacta на 25 постнатальные сутки, (а) контроль, (б) после пренатального стрессирования; вакуолизация цитоплазмы нейронов (стрелка). Окраска по Нисслю. Увел. ок.х 10, об.х 40.

  Более выраженные структурные изменения в substantia nigra zona compacta были выявлены в пубертатном периоде и у взрослых  животных,  развивавшихся на фоне дефицита серотонина и пренатально перенесших материнский стресс. Значительное сокращение количества нейронов, соответствующих норме, и увеличение клеток с тяжелыми изменениями ядра и цитоплазмы, а также погибших нейронов (рис.2) могут быть результатом  нарушения формирования самой серотонинергической  системы и снижения синтеза серотонина, мишенью которого являются дофаминергические нейроны, их развитие и дифференцировка, а, следовательно, и формирование substantia nigra в целом.

Регулирующие влияния дофамина в эмбриогенезе достаточно известны. Дифференцировка дофаминергических нейронов  в substantia nigra zona compacta и становление проекций к развивающимся отделам мозга в норме происходит довольно рано (Hu Z., Cooper M., Crockett D.P., et al., 2004; Van Kampen J.M., Robertson  H.A., 2005; Deng  D.R., Djalali S., Holtje M., et al. 2007). Нарушение развития и интеграции дофаминергических  проекций в  конечный  мозг,  изменение становления 

 

кортикостриатных и кортиколимбических путей, нарушение дофаминергической иннервации hippocampus  после пренатального стресса (Berger M.A., Barros V.G., Sarchi M.I., et al, 2004; Scott S.A., Diaz N.M., Ahmad S.O., 2007) может, отчасти, объяснять  обнаруженные в данном исследовании нарушения развития кортикальных структур и  hippocampus.

В развитии дофаминергической системы принимает участие большое количество  активных факторов (различные типы ростовых факторов, нейротрофины, представители семейства TGF-beta, IGFs, стероидные гормоны и т.д.), которые включаются в регуляцию развития и дифференцировки клеток этой нейральной системы. Механизмы, лежащие в основе этих процессов сложны, комплексны и включают взаимодействия с другими факторами, стимулирующими эти процессы, а также требуют активации ненейральных клеток, таких как астроциты. Одной из мишеней  глиального нейротрофического фактора (GDNF) являются дофаминергические нейроны. Этот, один из самых мощных трофических факторов, способствует нормальной  функции дофаминергических нейронов и их выживанию, однако эта специфическая его функция утрачивается в пубертатный период (Kholodilov N., Yarygina O., Oo T.F., et al., 2004; (.Li L., Su Y., Zhao C., et al., 2006; Kipp M., Karakay S., Pawlak J., et al., 2006). Не исключено, что обнаруженное в нашем исследовании нарушение глиогенеза после пренатального стресса, может вносить свой вклад в изменение структуры substantia nigra zona compacta  и недостаточное поддержание жизнеспособности дофаминергических нейронов. Транскрипционные факторы, недавно выделенных генов (HNF3alpha, synaptotagmin 1 и Ebf3),  экспрессия которых обнаружена в вентральном среднем мозге, являются необходимыми для постмитотической дифференцировки и выживания дофаминэргических нейронов. При этом их экспрессия продолжается до периода полового созревания (Thuret S., Bhatt L., OLeary D.D., et al., 2004). Не исключено, что избыточный уровень кортикоидов, являющихся ядернотропными гормонами и воздействующими на плод после пренатального стрессирования, могут влиять на экспрессию этих генов, оказывая непрямое влияние на дифференцировку дофаминергических нейронов и их выживание. Обнаруженное в настоящем исследовании уменьшение размеров нейронов и их отсроченная гибель вполне могут быть результатом нарушения процесса дифференцировки нейронов. Более того, как видно из установленных фактов, экспрессия некоторых генов  и функциональная активность нейротрофических факторов в развитии имеют место только до периода полового созревания. Учитывая, с одной стороны, прекращение функциональной активности некоторых нейротрофических факторов, а с другой, изменение  гормонального фона, пубертатный период можно считать критическим для проявления и усугубления пренатально сформированных аномалий, что и подтверждают представленные нами данные.

Ранимость дофаминергической системы достаточно известна. Атрофию дофаминергических нейронов у взрослых могут вызвать воздействия таких повреждающих факторов как гипоксия, применение лекарственных препаратов (нейролептиков),  воздействие химических веществ и т.д., а также возрастные изменения. Несмотря на большое число исследований, изучающих механизмы, лежащие в основе этих явлений, и  использование различных моделей на животных,  фундаментальный вопрос: когда происходят первичные нарушения, приводящие к атрофии дофаминергические нейроны, в  раннем периоде развития, последующем онтогенезе или они связанны с возрастными изменениями, остается открытым. Однако  существует мнение, что дегенеративные процессы в substantia nigra zona compacta  у взрослых индивидуумов и в пожилом возрасте являются следствием патологических процессов, происходивших в более раннем онтогенезе (Lang A.E., 2007). Последствия материнского стресса в пренатальный период развития потомства могут являться первоначальной причиной, вызывающей нарушения белкового обмена, оксидативный стресс, увеличение содержания железа,  измененние гомеостаза Са+, т.е. выявленные факторы, приводящие к ускоренной утрате нейронов в substantia nigra zona compacta и нигростриатной дегенерации (Lang A.E., 2007). Причиной дофаминергической нейродегенерации в substantia nigra zona compactа может быть также окислительное повреждение нуклеиновых кислот (цитоплазматической RNA и митохондриальной DNA). Не исключено, что частичное распыление или полная утрата вещества Ниссля, а также вакуолизация цитоплазмы у части нейронов substantia nigra zona compacta, выявленные в настоящем исследовании после пренатального стрессирования, являются результатом окислительного повреждения нуклеиновых кислот, следствием которого, в свою очередь, является нарушение синтетических процессов. Важно отметить, что значительное количество  общего продукта окисления нуклеиновых кислот (8-hydroxyguanosine) присутствует в цитоплазме нейронов  substantia nigra zona compacta и соответствует распределению нейродегенерации у пациентов с болезнью Паркинсона  (Zhang J., Perry G., Smith M.A., et al., 1999).

Хронический пренатальный стресс является причиной значительного повреждения  структуры nucleus raphe dorsalis. Обнаружены характерные нарушения: уменьшение размеров nucleus raphe dorsalis, снижение общего количества клеток, изменение соотношения разных типов нейронов. У животных в препубертатный период присутствуют клетки с вакуолизированной цитоплазмой, а также диффузная единичная гибель нейронов (рис.3). С увеличением постнатального возраста (в пубертатный период и у половозрелых животных) сокращается количество нейронов соответствующих норме, снижается число серотонинсинтезирующих нейронов и увеличивается число клеток, имеющих тяжелые изменения ядра и цитоплазмы, а также погибших. У животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и пренатально перенесших материнский стресс,  подобные нарушения более выражены, при этом в nucleus raphe dorsalis резко снижается число клеток синтезирующих серотонин. По мере увеличения постнатального возраста (90 суток)  наблюдается усиление дегенеративных процессов, следствием которых является резкое уменьшение размеров nucleus raphe dorsalis ядра,  количества в нем нейронов и, часто, его полное разрушение (рис.4).  По-видимому, широко участвуя в механизмах стресса, сама серотонинергическая система является объектом воздействия гормонов стресса. 

Влияние синтетического глюкокортикоида  дексаметазона на развитие отделов головного мозга крыс.

  Широкий спектр морфофункциональных  нарушений в отделах головного мозга крыс обнаружен после пренатального введения синтетичес-кого глюкокортикоида дексаметазона. Очевидным был как дозозависимый, так и стадиоспецифический эффект воздействия дексаметазона.

Наибольшие структурные нарушения в neocortex, а именно, истончение и разряжение слоев, снижение в них количества клеток, уменьшение размеров клеточных тел и объема цитоплазмы, гибель нейронов, выявлены при введении  дексаметазона в обеих используемых дозах (1мг/кг и 3мг/кг)  на более ранних и поздних постимплантационных  стадиях (13 и 19 эмбриональные сутки), при этом чувствительность развивающегося neocortex к глюкокортикоидам на поздних сроках пренатального развития оказалась более высокой.

Значительные изменения  в аrea cingularis обнаружены при введении дексаметазона в обеих  дозах и на всех исследованных стадиях  (13, 16 и 19 эмбриональные сутки). Полученные данные выявили отличия в степени повреждения подобластей лимбической коры, из которых задняя подобласть имеет более выраженные нарушения (истончение и разряжение всех слоев  II-VI,  резкое снижение в них количества клеток, уменьшение

размеров клеточных тел и объема цитоплазмы). Наши данные интересно сопоставить в результатами, полученными другими авторами и показавшими, что пренатальное введение синтетических  глюкокортикоидов  (дексаметазона и бетаметазона) в дозах более низких, чем используются в клинике или эквивалентных им, имеет отдаленные эффекты и также приводит у крыс к уменьшению числа и размеров нейронов в неокортексе, нарушению пролиферации в субвентрикулярной зоне и гиппокампе ( Kreider M.L., Tate C.A., Cousins M.M., et al., 2006;  Bruschettini M., van den Hove D.L., Gazzolo D., et al., 2006). Вероятно, нарушение или задержка процессов пролиферации клеток-предшественников после пренатального введения дексаметазона является причиной обнаруженных нами изменений в развитии формаций hippocampus. Об этом свидетельствует и значительное истончение слоев пирамидных нейронов в полях СА1, СА2, СА3, СА4 и fascia dentatа (рис.5,6). Известно, что эндогенные и синтетические глюкокортикоиды и серотонин влияют на экспрессию глюкокортикоидных рецепторов во время развития формаций hippocampus. Значительное снижение экспрессии mRNA глюкокортикоидных рецепторов в нейронах hippocampus при введении дексаметазона влечет за собой подъем уровней экспрессии 5-НТ1а и 5-НТ2 рецепторов к серотонину в neocortex и hippocampus (Slotkin T.A., Kreider M.L., Tate C.A., 2006;  Erdeljan  P., Andrews M.H., McDonald J.F., et al., 2005). При этом в гиппокампе  существенно снижаются концентрации глиального белка S100-beta (Bruschettini M., van den Hove D.L., Gazzolo D., et al., 2005), через который осуществляется непрямое действие серотонина на пролиферацию и дифференцировку нейронов этих структур. Можно предположить, что обнаруженные нами нарушения развития формаций hippocampus могут быть связаны с дисбалансом глюкокортикоидных гормонов и серотонина, которые оказывают существенное влияние на развитие neocortex и формации hippocampus, что еще раз подтверждают представленные данные.

Исследование характера изменений в substantia nigra после пренатального  введения дексаметазона выявило существование в развитии этой структуры различных периодов чувствительности нейронов к дексаметазону. Как оказалось, введение дексаметазона на более ранних и более поздних стадиях пренатального развития (13 и 19 эмбриональные сутки) вызывает глубокие повреждения, включающие изменение соотношения разных типов клеток, уменьшение размеров клеточных тел, появление нейронов, имеющих тяжелые изменения ядра и цитоплазмы. Воздействие дексаметазона в середине пренатального периода (16 эмбриональные сутки) не оказывает значительных изменений в структуре substantia nigra zona compacta.

Рис. 5. Гиппокамп крысы на 60 постнатальные сутки, поле СА1: А - контроль; Б- после пренатального введения дексаметазона в дозе 3 мг/кг на 16 эмбриональный день. Окраска по Нисслю.Увел.ок.х 10; об. х 40.

  Рис.6. Гиппокамп крысы на 60 постнатальные сутки, поле СА3: А-контроль; Б- после пренатального введения дексаметазона в дозе 3 мг/кг на 16 эмбриональный день.Окраска по Нисслю.Увел.:ок.х 10; об. х 40.

Особого внимания заслуживают изменения в nucleus raphe dorsalis, выявленные  после пренатального введения дексаметазона. Значительные структурные нарушения (снижение количества нейронов, уменьшение размеров клеток, вакуолизация цитоплазмы и гибель части нейронов) имеют место при воздействии препарата в обеих используемых дозах на  всех исследованных сроках развития, при этом поздние сроки пренатального развития (19 эмбриональные сутки) оказываются гораздо чувствительнее к глюкокортикоидам. Введение препарата в это время приводит к значительной отсроченной гибели нейронов и клеточному опустошению nucleus raphe dorsalis, и, часто, к его разрушению. Это может быть связано с определенными особенностями и темпами развития структуры, хотя в целом причина остается неизвестной. 

Таким образом, показано, что развивающийся мозг млекопитающих является высоко чувствительным к повышенному уровню глюкокортикоидных гормонов  как эндогенных, высвобождающихся при стрессе матери во время беременности, так и экзогенных, при введении их синтетических аналогов. Повреждающий эффект избыточного уровня глюкокортикоидов значительно выражен в  исследованных структурах головного мозга. При этом, вероятно, нарушается синтез и взаимодействие нейротрансмиттеров таких как серотонин и дофамин, вследствие чего, возможно возникновение их вторичного дефицита, который будет сказываться непосредственно на развитии и созревании мозга. К тому же гибель клеток в neocortex, лимбических структурах и моноаминергических ядрах в постнатальный период может свидетельствовать о том, что повышенный уровень глюкокортикоидных гормонов и дефицит нейротрансмиттеров изменяют процессы дифференцировки нейронов. В результате значительная часть нейронов разных отделов мозга к концу пренатального периода  развития не способна осуществить полноценную, соответствующую данной стадии развития, дифференциацию, что, в последующем, может  приводить их к отсроченной гибели. Вероятно, этим объясняется  то, что  аномалии развития, выявленные в препубертатный период, сохраняются в течение дальнейшего постнатального онтогенеза, а также у животных, достигших половозрелого возраста. Нарушения морфогенетических процессов в сочетании с гибелью клеток в центральных отделах головного мозга,  усиливающейся с увеличением постнатального возраста, приводит к значительному сокращению количества нейронов в структурах мозга у взрослых индивидуумов. Повышенный уровень глюкокортикоидных гормонов во время эмбрионального периода может изменять программу развития мозга плода, повышая возможность возникновения нейропатологий после рождения.

Влияние дефицита серотонина на пренатальное развитие млекопитающих.

  На основании экспериментальных данных, полученных в настоящей работе при исследовании участия серотонина в эмбриогенезе млекопитающих, можно предположить, что ему принадлежит важная роль в морфогенетических процессах. Его дефицит  на самых начальных этапах развития  приводит либо к отсутствию цитокинеза на стадии зиготы, либо к резкому снижению темпа дробления у зародышей мышей, вплоть до полной его остановки. Это согласуется с существующим мнением о том, что моноамины могут участвовать в запуске и регуляции первых делений дробления (Бузников Г.А., 1987; Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер Д.М., 1997). Подтверждением морфогенетических свойств серотонина является нарушение процесса  формирования бластоцист при его дефиците. Несмотря на то, что кавитация  осуществляется в то же время, что и в норме, бластоцисты состоят из небольшого числа достаточно крупных бластомеров. Для таких бластоцист характерно нечеткое разделение на трофобласт и внутреннюю клеточную массу. Такие зародыши способны индуцировать децидуальную реакцию и завершать процесс имплантации, однако они погибают либо сразу после имплантации, либо пройдя стадию «яйцевого цилиндра». Более того, пренатальная деплеция серотонина в период активной пролиферации  и органогенеза у мышей (12-17 эмбриональные сутки) приводит  к различным врожденным аномалиям развития, спектр которых достаточно обширен:  образование мозговых и пупочных грыж, укорочение нижней челюсти и конечностей, микрофтальмия, расщелина твердого неба. К анатомическим аномалиям  присоединяются нарушения развития  кровеносной системы, которые могут быть связаны с нарушениями серотонинергической иннервации сосудов, их проницаемости, тонуса и кровотока. Об этом свидетельствуют обширные подкожные гематомы на голове, спине, конечностях и брюшной стороне тела плодов. Кровоизлияния обнаруживались в  различных структурах мозга, желудочках, сосудистом сплетении. Характерным было расширение и стаз кровеносных сосудов в головном и спинном мозге, внутренних органах и конечностях. Представленные  результаты косвенно подтверждают  данные других авторов о существовании у эмбрионов мест захвата, аккумуляции или синтеза серотонина (Kirby M.L., Gilmore S.A., 1972; Allan I.J., Newgreen D.F., 1977; Wallace J.A., 1982), поскольку выявленные нами аномалии развития различных эмбриональных структур при снижении уровня серотонина в пренатальный период соответствуют структурам, в которых во время развития обнаружен его синтез и аккумуляция.

  Изменение развития структур головного мозга (neocortex, hippocampus, nucleus raphe dorsalis) после пренатальной деплеции серотонина было выявлено у крыс в ранний постнатальный период. Оказалось, что имеет место задержка дифференцировки нейронов  и, как следствие, задержка формирования neocortex, которая отчетливо выявляется на 5 постнатальные сутки. Нарушение цитоархитектоники neocortex выражалось в истончении слоев, снижение в них количества клеток, в том числе, больших пирамидных нейронов, недоразвитии нейропиля,  задержке дифференцировки нейронов, изменении их формы и размеров, сокращении количества вещества Ниссля, частом нарушении ориентации дендритных отростков нейронов.  По мере увеличения постнатального возраста (10 постнатальные сутки) все обнаруженные ранее нарушения развития не только сохраняются, но усугубляются. В верхних слоях появляюся клетки с признаками хроматолиза, в глубоких, наряду с их истончением, происходит изменение клеточного состава (в слое V): уменьшается количество больших пирамидных нейронов, в основном, присутствуют клетки среднего и малого размера.  Появляется единичная диффузная гибель клеток во всех исследованных структурах (neocortex, hippocampus, nucleus raphe dorsalis).

Наличие внутриклеточной деструкции подтвердило электронномикроско- пическое исследование, которое  выявило ряд ультраструктурных изменений в нейронах и глиальных клетках  neocortex. Следует отметить, что в разных кортикальных слоях эти нарушения  выражены не одинаково, в частности, в глубоких слоях (V и VI) коры повреждения нейронов выражены значительнее. Кариоплазма ядер нейронов содержит вакуоли и миелиноподобные телеца, образованные концентрическими мембранами, при чем по мере увеличения постнатального возраста животных размер и количество миелиноподобных телец в ядрах увеличивается. Степень вакуолизации может быть значительной, в этих случаях вакуоли могут занимать до 1/3 объема ядра. Наряду с этим появляются инвагинации ядерной оболочки, как в  цитоплазму, так и кариоплазму. Ультраструктурные изменения органоидов цитоплазмы такие как  расширение цистерн эндоплаз- матического ретикулума, увеличение везикулярного компонента комплекса Гольджи и повреждение митохондрий (появление в них мембранных включений, образование многокамерных вакуолей,  трансформация частей митохондрий в мембранные структуры)  свидетельствуют о деструктивных внутриклеточных процессах, имеющих место у части нейронов на 30 постнатальные сутки. Вероятно, это может объяснять отсроченную постепенную гибель нейронов в исследованных областях головного мозга. Ультраструктурные изменения в астроцитах, а именно  вакуолизация цитоплазмы клеток и их отростков, отек отростков, могут лежать в основе нарушений структурно-функциональных характеристик периваскулярной глии. С увеличением количества погибающих нейронов, увеличивается число клеток микроглии, их трансформация в макрофаги, а также повышается фагоцитарная активность глиальных макрофагов.

Особенности нейроногенеза в различных слоях коры выявило морфометрическое исследование, проведенное на крысах после пренатальной деплеции серотонина.  По мере увеличения постнатального возраста (с 3 по 10 сутки)  площадь клеток в neocortex в верхних слоях (II-IV) в контроле увеличивается в 2, а в глубоких (V-VI) в 1,5 раза. После пренатальной деплеции серотонина в верхних слоях (II-III) и слое V происходит незначительное увеличение площади клеток, а в IV и VI слоях  площадь клеток практически не увеличивается. Эти данные  косвенно подтверждают задержку процессов развития и дифференцировки нейронов neocortex при  снижении уровня серотонина во время эмбрионального развития. 

Серотонин участвует не только в нейрогенезе, но и глиогенезе, в частности, развитии элементов астроцитарного ряда. Известно, что астроциты имеют различное происхождение. Клетки радиальной глии трансформируются в астроциты белого вещества и глубоких слоев V и VI neocortex, а астроциты верхних кортикальных слоев происходят из астроглиальных предшественников, которые мигрируют из поздней герминативной зоны после окончания миграции нейронов. Существует большое число факторов способных препятствовать процессам трансформации клеток радиальной глии в астроциты или прерывать коридоры миграции поздней астроглии, что может приводить к нарушению глиогенеза и, как следствие, приводить к изменению цитоархитектоники neocortex  и иметь долгосрочные последствия (Evrard P., Marret S., Gressens F., 1997). 

В связи с этим особого внимания заслуживают полученные в настоящей работе данные о том, что у животных, развивающихся на фоне дефицита серотонина, имеет место задержка формирования и дифференцировки астроцитарной глии, которая отчетливо выявляется на 10 постнатальные сутки. Показано, что в neocortex  выявляется значительно меньшее число GFAP-положительных клеток и их отростков, чем у контрольных животных, а особенно в белом веществе на всех изученных сроках постнатального развития. В связи с этим есть основание высказать несколько предположений относительно причин наблюдаемого явления: либо пренатальная блокада синтеза серотонина приводит к нарушению процессов трансформации и путей миграции клеток радиальной глии, что в дальнейшем может отражаться на дифференцировке нейронов и цитоархитектонике neocortex в целом; либо нарушает пролиферацию глиальных предшественников, вследствие чего не возникает определенной серотонин-зависимой популяции глиоцитов и их формируется меньше. Возможно, снижение уровня серотонина изменяет темпы дифференцировки астроцитов, в результате чего нарушается экспрессия GFAP; не исключено что имеет место изменение уровня функциональной активности формирующейся глии. Обнаруженное, после пренатальной деплеции серотонина, снижение количества глиальных клеток и изменение их активности, может влиять на развитие neocortex.  Доказательством этого предположения служат данные, показавшие, что нейрогенетическое действие серотонина на нейроны-мишени может быть как прямым, так и опосредованным через рецепторы астроцитов (Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер Д.М., 1997).

Участие серотонина в формировании серотонинергического центра мозга – nucleus raphe dorsalis выявленное нами служит  еще одним подтверждением предположения, что серотонин является авторегулятором дифференцировки серотонинергических нейронов  как у беспозвоночных животных, так и у млекопитающих (Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер Д.М., 1997; Lauder J.M., 1990; Whitaker-Azmitia P.M., Shemer A.V., Caruso J. et al., 1990; Whitaker-Azmitia P.M., Druse M., Walker P., Lauder J.M., 1995). При этом снижение уровня эндогенного серотонина в пренатальный период приводит к структурным нарушениям в nucleus raphe dorsalis, которые касались прежде всего изменения соотношения типов клеток, уменьшения размеров клеточных тел, объема цитоплазмы и вещества Ниссля, уменьшения общего количества серотонинсинтезирующих нейронов. Результатом этих изменений будет, вероятно, уменьшение объема синтеза  серотонина и возникновение вторичного дефицита эндогенного нейронального серотонина, следствием которого может быть задержка пролиферации и дифференцировки нервных клеток в отделах головного мозга – серотонинергических мишениях иннервации. Все это может создавать новые субстраты для формирования структурно-функциональных основ пренатальной патологии, проявляющейся  после рождения.

Суммируя данные раздела по исследованию отдаленных последствий пренатальной деплеции серотонина следует отметить, что  аномалии развития,  выявленные на более ранних этапах, а именно, нарушение формирования кортикальных слоев, развития и дифференцировки нейронов, изменения их формы, размеров и ориентации, соотношения разных типов клеток в структурах, недоразвитие нейропиля, а также структурные изменения формаций, входящих в лимбическую систему и моноаминергических ядер, сохраняются на протяжении всего последующего онтогенеза.

  Аномальное развитие neocortex  после пренатальной деплеции серотонина обнаруженное нами согласуется с существующими  представлениями о влиянии классических нейротрансмиттеров на процессы нейрогенеза (Бузников Г.А., 1987; Lauder J.M., 1988, 1990; Lauder J.M., Tamir H., Sadler T.W., 1988; Aldridge J., Seidler F.J., Meyer A. et al., 2003). Важно отметить, что  к структурным нарушениям в коре, по мере увеличения постнатального возраста, присоединяются нейродегенеративные процессы, о чем свидетельствует диффузная гибель клеток во всех слоях neocortex уже в пубертатный период, в дальнейшем выявляется тенденция к ее увеличению. 

К числу заслуживающих внимания относится факт обнаружения структурных изменений в лимбических формациях, hippocampus и area cingularis.  Пренатальное снижение уровня серотонина, вероятно, нарушает серотонинергическую иннервацию развивающихся формаций hippocampus,  что  является драматическим событием, так как серотонин это один из важных факторов, контролирующий пролиферацию клеток-предшественников в формациях hippocampus, влияющий на их миграцию, дифференцировку, синаптогенез и выживаемость  (Brezun J.M., Daszula A., 20007), осуществляющий свои влияния через экспрессирующиеся  различные подтипы рецепторов к серотонину (5-НТ1А, 5-НТ7,  5-НТ4 и т.д.) (Compan V., Daszula A., Salin P et al., 1996;  Daszula A.,  Ban M.S., Soumier A., 2005). Нарушение всех этих процессов, вызванное пренатальным дефицитом серотонина, приводит к сокращению численности нейронов в структурах hippocampus, задержке, а может быть, и снижению степени дифференцировки нейронов. Не исключено, что отсроченная гибель клеток в формациях hippocampus в постнатальный период  вызвана функциональной нагрузкой непомерной для нейронов, не осуществивших достаточную  дифференцировку, соответствующую данному этапу развития. Это предположение является наиболее вероятным, так как известно, что hippocampus осуществляет функции, которые еще незрелы у новорожденного животного,  для их  функционального развития необходимо активное взаимодействие организма с окружающей средой. Период завершения структурного и биохимического становления hippocampus совпадает у млекопитающих с критическим периодом постнатального онтогенеза – временем перехода к активным контактам организма и среды и включения всех  анализаторов  (Никитина Г.,  Юсова О.Б., 1965; Виноградова О.С., 1975; Altman J., Das G.D., 1965).

  Структурные нарушения в моноаминергических ядрах после пренатальной деплеции серотонина относятся к одному из новых фактов выявленных нами.

Все обнаруженные изменения  в substantia nigra zona compacta усугубляются у крысят в пубертатный период, при этом наблюдается увеличение гибели нейронов. У животных, более старшего возраста, результатом отсроченной гибели клеток является  снижение общего количества нейронов в структуре, в том числе, дофаминсинтезирующих. При этом сохраняется измененное соотношение разных типов клеток, меньшие размеры нейронов и объема цитоплазмы, косвенно свидетельствующих о нарушении процессов дифференцировки. Представленные данные подтверждают гипотезу о том, что серотонин участвует в регуляции процессов развития substantia nigra.

Оказалось, что пренатальное снижение уровня серотонина приводит к долгосрочным изменениям в структуре серотонинергического центра мозга - nucleus raphe dorsalis. Важно отметить, что обнаруженные  нарушения на ранних постнатальных сроках, касающиеся изменения соотношения разных типов нейронов, уменьшения размеров нейронов,  сокращения общего количества клеток, в том числе серотонинсинтезирующих нейронов, регистрируются на протяжении всего постнатального онтогенеза. Однако с увеличением возраста характерно появление нейронов с тяжелыми изменениями ядра и цитоплазмы сокращение количества серотонинсинтезирующих нейронов, следствием чего может являться снижение объема синтеза серотонина,  приводящее к его  вторичному дефициту. Особенности развития nucleus raphe dorsalis в эмбриогенезе свидетельствуют о том, что клетки-предшественники сначала развиваются как билатеральные структуры и после завершения деления нейрональных клеток молодые серотонинергические нейроны проходят два этапа миграции:  первичную миграцию, передвигаясь из вентрикулярной зоны  вдоль срединной линии, и вторичную миграцию, результатом которой является слияние в рострально-каудальном направлении билатеральных групп нейронов в единую структуру по срединной линии(Levitt P., Moore R.Y., 1978; Diaz-Cintra S., Cintra L., Kemper T. et al., 1981). 

  В связи с этим, полученные нами данные не только подтверждают гипотезу о том, что серотонин является авторегулятором дифференцировки серотонинергических нейронов у млекопитающих (Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер Д.М., 1997), но и могут свидетельствовать в пользу того, что серотонин может контролировать как деление серотониновых клеток-предшественников, так и оба этапа их миграции.  В наших эскпериментах эти  процессы осуществляются  в период, когда был зарегистрирован самый низкий уровень содержания серотонина. Можно предположить, что нарушение темпов деления клеток-предшественников и миграционных процессов, вызванных дефицитом серотонина, лежит в основе уменьшения как количества клеток, так и уменьшения размера самого nucleus raphe dorsalis. 

Использование поведенческих моделей тревожности и тестирования тонической боли в наших совместных с физиологами экспериментах  показало, что выявленные нами аномалии развития мозга у животных после пренатальной деплеции серотонина сопровождаются нарушением формирования исследовательской реакции, резким изменением уровня двигательной активности, которая является одним из независимых компонентов поведения животных, изменением формирования  механизмов торможения, при этом с увеличением возраста проявляется тенденция к усилению торможения, а также нарушением развития систем болевой чувствительности (Буткевич И.П., Хожай Л.И., Михайленко В.А., Отеллин В.А., 2003; Butkevich I.P., Khozhai L.I.,et al, 2003; Буткевич И.П., Михайленко В.А., Хожай Л.И.,  Отеллин В.А., 2005; Butkevich I.P., Mikhailenko V.A. et al, 2005; Butkevich I.P., Khozhai L.I. et all, 2005;  Ватаева Л.А., Хожай Л.И. и др., 2007).

  Таким образом, пренатальный период развития млекопитающих является высоко чувствительным к низкому уровню серотонина. Серотонин играет важную роль в механизмах морфогенеза, начиная с ранних стадий дробления. Дефицит серотонина на постимплантационных стадиях приводит к нарушению нейро- и глиогенеза, аномалиям развития центральных структур мозга - неокортекса, лимбических структур, моноаминергических ядер (nucleus raphe dorsalis и substancia nigra). Серотонин является авторегулятором дифференцировки серотонинергических нейронов. Его дефицит во время пренатального развития приводит к структурным нарушениям в центральном звене серотонинергической системы - nucleus raphe dorsalis и, тем самым, вызывает вторичный дефицит серотонина в развивающемся мозге, что, в свою очередь, также способствует формированию новых структурных основ пренатальной патологии. Обнаруженные нарушения развития исследованных структур головного мозга на ранних постнатальных стадиях выявляются в последующем онтогенезе, с усилением деструктивных процессов в период полового созревания, и сохраняются вплоть до достижения животными половозрелого возраста.

Влияние острой пренатальной гипоксии на развитие отделов головного  мозга  млекопитающих.

Чрезвычайную чувствительность развивающего мозга млекопитающих к гипоксии еще раз подтвердили и полученные нами данные.  Повреждающий эффект острой гипоксии зависит от стадии развития эмбриона на  момент  ее воздействия, что свидетельствует о разной чувствительности  нейральных клеток развивающегося мозга к дефициту кислорода, находящихся на различных стадиях развития. Впервые выявлено, что гипоксия вызывает непосредственную реакцию эмбриональных нейральных клеток, которая развивается достаточно быстро и приводит к значительному увеличению числа нейробластов с признаками апоптотической гибели. Следует подчеркнуть, что непосредственная реакция  клеток в ответ на гипоксию выявляется только на ранних постимплантационных стадиях (13 и 16 эмбриональные сутки). В развивающемся неокортексе и среднем мозге, как правило, в зоне миграции нейробластов, уже через 1 час после воздействия гипоксии обнаруживается значительная гибель клеток. В последующие  3 суток гибель клеток продолжается, о чем свидетельствуют диффузно рассеянные небольшие группы апоптотических телец. На более поздних сроках пренатального развития (19 эмбриональные сутки) воздействие гипоксии  не вызывает заметной реакции клеток. 

  Острая гипоксия, перенесенная  в пренатальный период развития,  имеет отдаленные последствия, оставляя след в структурной организации отделов головного мозга в постнатальном онтогенезе. Обращает на себя внимание тот факт, что аномалии развития отделов головного мозга  наиболее выражены у животных, подвергавшихся острой гипоксии на более ранних сроках эмбриогенеза (13 и 16 эмбриональные сутки). Структурные изменения в коре, обнаруженные на ранних стадиях, с увеличением постнатального возраста сохраняются.

Воздействие гипоксии на более поздней стадии пренатального развития (19 эмбриональные сутки) приводит к менее выраженным повреждениям в neocortex. У животных к 1 постнатальным суткам  формируются все слои коры, однако они имеют заметное  отставание в развитии. Истонченность верхних слоев, замедление темпов нейроногенеза, задержка дифференцировки клеток, недоразвитие нейропиля являются характерными для ранних сроков постнатального периода. С увеличением постнатального возраста  отставание в развитии слоев коры уменьшается. Однако достаточно продолжительное время может сохраняться меньшая степень дифференцировки нейронов, о чем свидетельствует их веретеновидная форма, меньший размер и меньший объем цитоплазмы. Недостаточная зрелость части нейронов и глии, вероятно, может являться причиной отсроченной гибели клеток в постнатальный период.

  Нами проведен цикл работ по определению морфометрических параметров нейронов в  слоях neocortex у  крыс, подвергавшихся острой пренатальной гипоксии и  контрольных животных, результаты которых полностью подтвердили наши морфологические наблюдения. По мере увеличения постнатального возраста (с 5 до 10 суток) у животных в контроле  число клеток в слоях коры на единицу площади  уменьшается в 2 раза, а площадь клеток значительно увеличивается (также в 2 раза). После острой  пренатальной гипоксии, независимо от сроков  воздействия, на начальных этапах постнатального периода развития (1 и 5 постнатальные сутки),  во всех слоях коры число клеток на единицу площади значительно превосходит их число в контроле, а площадь клеток значительно ниже таковой в контроле. Однако с увеличением постнатального возраста (10 постнатальные сутки) при воздействии гипоксии на более ранних сроках эмбрионального развития число клеток во всех слоях коры незначительно превышает  контрольные значения, при этом площадь клеток остается  в 2 раза меньше, чем в контроле. После действия гипоксии на более поздних сроках развития выявляются отличительные послойные особенности развития. Так, численность клеток в верхних слоях и глубоком слое VI остается более высокой,  а в слое V соответствует их числу в контроле. При этом во всех слоях коры к 10 постнатальным суткам площадь клеток приближается к контрольным значениям.

  Используя  тесты «открытого поля», в совместном исследовании с физиологами, проведенном на аналогичном материале, было показано, что выявленные аномалии развития исследованных структур головного мозга сочетались с нарушением поведенческих реакций, при этом обнаружена корреляция изменения поведения и стадии эмбрионального развития в момент воздействия гипоксии. Обнаружены половые особенности нарушения поведенческих реакций. Так, у самок крыс, подвергавшихся воздействию гипоксии на 16 сутки эмбрионального развития, снижается активность в тестах «открытого поля», а у самцов имеет место противоположная тенденция: горизонтальная активность у них повышается. Более того, имеет место половая инверсия: в тестах «открытого поля» самки демонстрируют паттерны поведения, типичные для интактных самцов. В свою очередь, поведение самцов больше похоже на поведение самок. После действия гипоксии на 19 сутки эмбрионального развития у крыс обоего пола возникают однонаправленные изменения поведения - уровень горизонтальной активности и у самок и у самцов снижается (Ватаева Л.А., Косткин В.Б., Хожай Л.И. и др., 2001).

В работе получен неизвестный ранее факт повреждающего действия острой гипоксии на развитие и становление формаций hippocampus, при этом выявлена зависимость степени повреждения разных его отделов от стадии развития эмбриона в момент воздействия гипоксии.

Нарушение развития поля СА1 выявляется после действия гипоксии как на ранних, так и поздних постимплантационных сроках, при этом значительное отставание в развитии этой структуры от таковой в контроле сохраняется на последующих изученных этапах постнатального онтогенеза.

Изменение развития поля СА2 после воздействия пренатальной гипоксии менее выражены, чем СА1. Гипоксия на ранних сроках эмбриогенеза (13 и 16 эмбриональные сутки) и более поздних (19 эмбриональные сутки) вызывает незначительные отклонения, которые нивелируются с увеличением постнатального возраста.

  Существенные отличия выявлены в развитии поля СА3. Воздействие пренатальной гипоксии  на ранней и более поздней стадии пренатального развития (13 и 19 эмбриональные сутки соответственно) вызывает значительную задержку  развития этой формации hippocampus, которая сохраняется  в постнатальном онтогенезе. В середине пренатального периода развития (16 эмбриональные сутки) гипоксия  практически не вызывает структурных изменений в поле СА3.

  Выраженные нарушения развития поля СА4 имеют место при действии гипоксии на более ранних сроках эмбриогенеза, при этом они сохраняются с увеличением постнатального возраста. Воздействие гипоксии на более поздних сроках эмбрионального развития приводит к значительной задержке развития нейронов выявляемой в первые постнатальные дни, однако с увеличением постнатального возраста отличия пропадают.

Изменения в слое гранулярных клеток в fascia dentatа значительно выражены при воздействии гипоксии на более ранних сроках эмбрионального развития. Уменьшение размеров гранулярных клеток и более плотное их расположение, выявленные  в первые  дни после рождения, сохраняются  с увеличением постнатального возраста.  Воздействие  гипоксии на поздних сроках пренатального развития  приводит к  задержке развития этой структуры, которая обнаруживается в первые постнатальные сутки и сохраняется с увеличением возраста. Наше исследование с очевидностью показало, что формации hippocampus имеют отличительные особенности  развития  и разную чувствительность к гипоксии. Это может объясняться разным временем генерации разных популяций клеток, формирующих отделы hippocampus  и осуществляющих в разное время процессы дифференцировки, и выполняющих, впоследствии, различные функции. 

Таким образом, острая пренатальная гипоксия оказывает повреждающее действие на развитие мозга млекопитающих. Чувствительность развивающихся структур мозга зависит от стадии развития эмбриона в момент  воздействия гипокии. Установлены непосредственные реакции эмбриональных нервных клеток в ответ на гипоксию и ее отдаленные последствия. Непродолжительная эмбриональная гипоксия приводит к нарушению развития слоев неокортекса, при этом тяжесть повреждения кортикальных структур имеет стадиозависимый  характер. Повреждения проявляются разными эффектами – избирательной гибелью клеточных элементов эмбриональной ткани, нарушением  миграции, изменением темпов развития и дифференцировки, значительной задержкой развития нейропиля, что в свою очередь сказывается на строении формирующегося неокортекса и приводит к необратимым последствиям.  Пренатальная гипоксия вызывает нарушение развития и становления формаций гиппокампа, которые имеют разную чувствительность к действию гипоксии. Нейральные клетки, формирующихся  полей СА1, СА4 и гранулярные клетки  fascia dentatа  проявляют высокую чувствительность к гипоксии  на ранних постимплантационных стадиях развития, которая снижается к концу эмбриогенеза. В поле СА2 эмбриональные клетки оказываются менее чувствительными к гипоксии на протяжении  всех исследованных стадий пренатального развития. В формирующемся поле СА3 существует два срока высокой чувствительности клеток к гипоксии – самые ранние постимплантационные стадии  и поздние стадии пренатального развития. Пренатальная гипоксия приводит к долгосрочным последствиям в постнатальном периоде жизни, так как, вероятно, достаточно долго сохраняется незрелость нейронов во всех исследованных областях головного мозга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, настоящая работа открывает новое направление исследований клеточных механизмов формирования структурных нарушений в эмбриональном мозге после воздействия стрессовых факторов, определяющих основы врожденных патологий ЦНС, и изучения морфофункциональных проявлений этих нарушений в разные периоды постнатального онтогенеза. Получены новые приоритетные данные, касающиеся процессов развития нервной ткани, динамики формирования отделов головного мозга на фоне воздействия неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды организма. Прослежены и подробно описаны тканевые и клеточные реакции разных отделов  развивающегося головного мозга на воздействие различных повреждающих факторов, при этом выявлено, что немаловажное значение имеет стадия развития эмбриона на момент воздействия стрессового фактора, от которой зависит интенсивность реакции эмбриональных клеток. Показано, что даже непродолжительное воздействие повреждающих факторов в определенные периоды пренатального развития вызывает быстрые модификации гистогенетических процессов и оставляет длительный след в структурной  и функциональной организации мозга на протяжении  последующего онтогенеза. Выявлены непосредственные реакции и отдаленные последствия повреждающих воздействий в разные сроки эмбрионального периода на структурно-функциональные характеристики развивающегося и дефинитивного головного мозга. Независимо от природы стрессового фактора (иммобилизационного стресса, изменения уровня серотонина, введения синтетических кортикоидов, острой гипоксии)  выявлена общая направленность деструктивных процессов, приводящая к формированию абнормальных структур.  Более того, показано, что такие разные по своей природе повреждающие факторы вызывают однотипные структурные нарушения в мозге, связанные с модификацией основных процессов гистогенеза (пролиферации, миграции и дифференцировки), и в результате формируют сходные аномалии развития. 

Существенным является обнаруженный факт, что в течение эмбриогенеза существуют периоды, когда развивающийся мозг особенно чувствителен к действию как биологически активных веществ, запускающих и регулирующих клеточные и тканевые процессы генетической программы развития, так и неблагоприятных факторов среды, изменяющих эту программу. Все приведенные в настоящем исследовании данные, в целом, открывают новые пути для исследования механизмов патогенеза внутриутробно формирующейся нейропатологии.

 

ВЫВОДЫ

1. Развивающийся мозг млекопитающих является высокочувствительным к стрессу матери. Его воздействие в пренатальный период вызывает непосредственную ответную реакцию эмбриональных нейральных клеток, приводящую часть из них к быстрой апоптотической гибели, а также модифицирует основные гистогенетические процессы и оставляет долгосрочные последствия в структурных характеристиках мозга, сохраняющихся после рождения.

2.  Материнский стресс во время беременности вызывает структурные изменения в neocortex, характерными из которых являются истончение и разреженность слоев, снижение в них количества клеток, в том числе, больших пирамидных нейронов, уменьшение размеров клеточных тел и объема цитоплазмы, нарушение глиогенеза,  задержка развития нейропиля и диффузная гибель  клеток.  Нарушения  развития кортикальных структур сохраняются в  препубертатном, пубертатном периодах, и у  животных, достигших половозрелого возраста.

3.  Хронический стресс матери во время беременности приводит к значительным структурным нарушениям в отделах мозга, входящих в лимбическую систему. В  лимбической коре и всех формациях гиппокампа  стресс вызывает истончение и разреженность  слоев,  уменьшение количества и размеров нейронов и объема цитоплазмы. Аномалии развития, сформированные на ранних этапах развития, сохраняются на протяжении препубертатного,  пубертатного периодов и у взрослых животных.

4.  Хронический стресс матери в период беременности сказывается на морфофункциональном состоянии моноаминергических ядер: substantia nigra и nucleus raphe dorsalis.  Стресс приводит к сокращению размеров этих структур, снижению в них количества клеток, изменению соотношения разных типов клеток, сокращению объема цитоплазмы в нейронах. По мере увеличения постнатального возраста увеличивается количество нейронов, имеющих тяжелые необратимые изменения и погибших клеток. Снижается число дофамин- и серотонинсинтезирующих нейронов, что может приводить в дальнейшем к сокращению  объема синтеза этих нейротрансмиттеров.

5.  Взаимодействию кортикоидов и серотонина в пренатальный период принадлежит существенная роль в эмбриональном развитии головного мозга. Сочетанное воздействие повышенного уровня глюкокортикоидных гормонов  и  пониженного уровня серотонина во время беременности, возникающих при стрессовых воздействиях,  приводит к более выраженным нарушениям развития всех исследованных структур головного мозга.

6. Воздействие синтетического глюкокортикоида (дексаметазона) в пренатальный период развития млекопитающих приводит к широкому спектру морфологических нарушений в исследованных отделах головного мозга, которые сохраняются на протяжении всего последующего онтогенеза. Действие дексаметазона имеет дозозависимый и стадиоспецифический характер, который определяет тяжесть повреждения. Аномалии развития  кортикальных отделов представлены недоразвитием слоев, нарушением нейро- и глиогенеза. Имеет место выраженное изменение структуры моноаминергических ядер: substantia nigra и  nucleus raphe dorsalis – нарушение соотношения разных типов клеток, уменьшение количества и размеров нейронов, отсроченная гибель клеток. Эти данные являются основанием для пересмотра показаний к клиническому использованию глюкокортикоидов в акушерской практике.

7.  Cеротонин функционально активен на протяжении всего пренатального периода развития млекопитающих. Серотонин необходим для осуществления делений дробления, формирования бластоцисты и имплантации. Снижение уровня серотонина на ранних этапах развития приводит к нарушениям нейро- и глиогенеза, аномалиям развития центральных структур мозга (неокортекса, лимбических структур, моноаминергических ядер). Серотонин является авторегулятором  развития и дифференцировки  серотонинергических нейронов nucleus raphe dorsalis. Снижение его уровня в эмбриогенезе приводит к структурным нарушениям в nucleus raphe dorsalis, уменьшению числа серотонинсинтезирующих клеток, что в свою очередь, может вторично способствовать развитию врожденных патологий развития ЦНС. Аномалии развития структур головного мозга, связанные с дефицитом серотонина в эмбриональном периоде, формируются на ранних этапах развития, сохраняются в препубертатном, пубертатном периодах и у взрослых животных. В пубертатный период усиливаются нейродегенеративные процессы  в гиппокампе и моноаминергических ядрах.

8. Воздействие острой гипоксии в пренатальный период имеет выраженный стадиоспецифический эффект. Развивающийся головной мозг млекопитающих наиболее чувствителен к гипоксии на ранних постимплантационных стадиях развития. В эти сроки значительно выражена  непосредственная  реакция эмбриональных нейральных клеток в ответ на гипоксию, приводящая  значительную их часть к апоптотической  гибели.  Нарушения гистогенетических процессов, вызваные пренатальной гипоксией, имеют отдаленные последствия. Аномалии развития неокортекса, формаций гиппокампа, сформированные на ранних этапах развития, сохраняются в постнатальном онтогенезе.

9. Выявленные аномалии развития отделов головного мозга после пренатальных стрессовых воздействий сопровождаются изменением поведенческих реакций.  Комплексные физиологические исследования на идентичном материале установили, что имеют место нарушения формирования исследовательской реакции, резкое изменение уровня двигательной активности, изменение формирования механизмов торможения, усиливающегося по мере увеличения возраста, а также нарушение развития систем болевой чувствительности, при этом обнаружена корреляция изменения поведения и стадии эмбрионального развития в момент воздействия повреждающего фактора.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хожай Л.И. Роль серотонина в процессах формирования сосудистых сплетений головного мозга у млекопитающих // Науч. Конф. «Гистогенез и регенерация тканей», ВМА, СПб, 1995, c. 67.

2. Khozhai L.I., Otellin V.A., Puchkov V.F. Role of serotonin in early mammalian embryogenesis // Psychoneuroendocrine aspects of life phases: Psychoactive agent and the fetal/embryonic development. IBPN; XXIV Congres, Taoraine (Italy), 1995, p.118

3. Хожай Л.И., Отеллин В.А. Изучение роли серотонина в процессах формирования сосудистых сплетений головного мозга у млекопитающих  // 3-и научные чтения  им. Акад. АМН С.А.Саркисова и симпозиум «Современные представления о структурно-функциональной организации мозга. Москва, 1995, c.14.

4. Хожай Л.И., Пучков В.Ф., Отеллин В.А. Влияние дефицита серотонина на эмбриональное развитие млекопитающих //Онтогенез, 1995, т.26, № 5, с.350-356

5. Ватаева Л.А., Хожай Л.И., Отеллин В.А., Кассиль В.Г., Косткин В.Б., Коржевский Д.Э. Гипоксия в раннем постнатальном онтогенезе крысы: развитие мозга и формирование поведения // Доклады Академии Наук, т.363, № 3, 1998, c. 409-411.

6. Otellin V.A., Khozhai L.I  Development of mammalian neocortex during  serotonin  deficiency.  // VI European Congress of Neuropathology, Barcelona, 1999, p. 68.

7. Vataeva L.A.,  Khozhai L.I,  Otellin V.A, Kassil V.G., Kostkin V.B., Korzhevskii D.E. Effect of hypoxia on early postnatal ontogenesis of rats: brain development and formation of behavioral  // Dokl. Arad. Nauk., v.363, N 3, 1998, p. 409-411.

8. Хожай Л.И. Серотонин как регулятор дифференцировки пирамидных нейронов  глубоких слоев коры мозга эмбрионов мыши  // Всерос. Конф. с междунар. участием, посв. 150-летию И.П.Павлова, СПб, 1999, С. 314-315.

10. Otellin V.A., Vataeva L.A.,  Khozhai L.I, Kostkin V.B. The cerebral and behavioral vulnerability to hypoxia in neonatal and adult rats.  // Conf. “Mechanisms of adaptive behavior”, St.Petersburg, 1999, p. 134.

11. Otellin V.A.,  Khozhai L.I. Serotonin deficiency affects development of mammalian neocortex  // 29 Annual Meeting Society  for  Neuroscience, Miami Beach, USA, 1999, v. 15, p. 1035.

12. Otellin V.A.,  Khozhai L.I. Role of serotonin in formation of astroglial elements in the brain of development  // 30  Annual Meeting Society  for  Neuroscience, New Orleans, 2000, v. 30, part 2, p. 1601.

13.  Кассиль В.Г., Отеллин В.А., Хожай Л.И., Косткин В.Б. Критические периоды развития неокортекса млекопитающих (обзор). Рос. Физиол. Журнал им. И.М.Сеченова, т. 86, № 11, 2000, c. 1418-1425.

14. Хожай Л.И., Отеллин В.А. Начальные стадии дифференцировки пирамидных нейронов глубоких слоев неокортекса у мыши в пренатальном периоде развития. Морфология, №5, 2000, c. 7-11.

15. Otellin V.A.,  Khozhai L.I  Effect of hypoxia on brain structures formation during “critical periods” of prenatal and postnatal ontogenesis //  31 Annual Meeting Society  for  Neuroscience, San Diego, USA, 2001, v.30, part 1, p. 1346.

16. Хожай Л.И., Отеллин В.А., Леонтьев В.Г., Белостоцкая Г.Б. Роль серотонина в формировании неокортекса у млекопитающих  // 12 Междунар. Совещание по эволюционной физиологии, посвящ. Памяти Л.А.Орбели, СПб, 2001, c. 46.

17. Ватаева Л.А., Хожай Л.И., Косткин И.Б., Макухина Г.В., Отеллин В.А. Поведение в «открытом поле» у самцов и самок крыс, подвергшихся действию гипоксии в различные сроки пренатального периода развития // Доклады Акад. Наук, 2001, т.380, №1, c. 125-127.

18. Otellin V.A.,  Khozhai L.I, Gilerovich E.G. All cellular types differentiation in neocortical layer I precedes formation of cortical plate // Abstr. Conf. “Changing views of Cajal’s neuron”, CSIC Madrid, Spain. 2001, p. 37.

19.  Vataeva L.A.,  Khozhai L.I, Kostkin V.B, Makukhina G.V., Otellin V.A. Effect of the time of prenatal hypoxia in the openfild behavior in the male and female rats // Dokl. Biol. Sci., 2001,  v. 380, p. 410-411.

20. Хожай Л.И., Неокесарийский А.А. Участие серотонина в регуляции развития головного мозга в пренатальном периоде у млекопитающих // IV Междунар. Конф. По функциональной нейроморфологии, НИИ Физиологии РАН, СПб, 2002, c. 158.

21. Отеллин В.А., Хожай Л.И., Гилерович Е.Г., Коржевский Д.Э., Изучение нейрогенетических последствий пренатальных гипоксических воздействий  // Науч. Конф. «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям», Москва, Пущино, 2002, c. 107.

22. Хожай Л.И.,Отеллин В.А. Роль серотонина в пренатальном развитии головного мозга и его патологии у млекопитающих  // В сб.: Теоретические и прикладные аспекты эмбрионального гистогенеза, СПб, Гос.Педиатр. Мед. Акад., 2002, c. 25-32

23. Отеллин В.А., Хожай Л.И.,  Коржевский Д.Э., Косткин В.Б., Белостоцкая Г.Б.  Повреждающие воздействия в критические периоды пренатального онтогенеза как фактор, модифицирующий структурное развитие и поведенческие реакции после рождения  // Ж. Вестник РАМН, 2002,  №12, c. 32-35.

24. Хожай Л.И , Отеллин В.А., Косткин В.Б. Формирование неокортекса у крыс после пренатальной гипоксии // Морфология, 2002,  т.122,  № 5, c.34-38.

25. Butkevich I.P.,  Khozhai L.I., Mikhailenko V.A., Otellin V.A. Embryonal deficiency of serotonin changes the effect of prenatal stress on formalin-induced pain in juvenile rats: morphological behavioral data // 33 Annual Meeting of Society for Neuroscience, New Orleans, 2003 , p. 384.

26. Буткевич И.П., Михайленко В.А., Хожай Л.И., Отеллин В.А. Поведенческий ответ на ноцицептивный продолжительный раздражитель у крысят после пренатальной деплеции серотонина  //Рос. Конф.«Организм и окружающая среда - адаптация к экстремальным условиям», Москва, Ин-т медико-биол. проблем РАН, 2003, c. 69-71.

27. Буткевич И.П., Михайленко В.А., Хожай Л.И., Отеллин В.А. Пренатальная деплеция серотонина изменяет поведенческий ответ в ноцицептивном формалиновом тесте у крысы // Доклады РАН, 2003, т. 390, № 4, С.562-564.

28. Butkevich I.P., Khozhai L.I., Mikhailenko V.A., Otellin V.A. Behavioral and morphological investigation of long-term effects of prenatal serotonin depletion and stress in adult rats in the formalin test  // 8-th Multidisciplinary International conference of Biological Psychiatry “Stress and Behavior”, ST.Petersburg, 2004, P.18.

29. Otellin V.A., Khozhai L.I., Korzhevskii D.E., Grigorev I.P., Kostkin V.B. Reactive changes of rat brain  astrocytes after ischemia and hypoxia // International Congress “Progress in Fundamental and Applied  Sciences for Human Health”, Sudak, Crimea, Ukraina, 2004, p. 53.

30. Хожай Л.И., Отеллин В.А., Буткевич И.П., Михайленко В.А., Григорьев И.П., Шишко Т.Т. Влияние пренатальной деплеции серотонина и стресса на формирование структур мозга и болевую чувствительность у крыс // Науч. Конф. «Механизмы синаптической передачи». В сб.: «Структурно-функциональные основы организации мозга в норме и патологии», Моcква, 2004, c. 73-75.

31.  Буткевич И.П., Хожай Л.И., Михайленко В.А., Отеллин В.А.,  Леонтьева М.Н.  Возрастные изменения болевой чувствительности у крыс с пренатальной деплецией серотонина: поведенческий и морфологический аспекты // 19 Съезд физиологов, Екатеринбург, 2004, c. 156.

32. Ватаева Л.А., Косткин В.Б., Макухина Г.В., Хожай Л.И., Отеллин В.А. Условнорефлекторная реакция пассивного избегания у самок и самцов крыс, подвергшихся воздействию гипоксии в различные сроки пренатального периода развития // Журнал эвол. биохимии и физиологии, 2004, т.40, № 3, c. 250-253.

33. Буткевич И.П., Хожай Л.И., Михайленко В.А., Отеллин В.А. Влияние пренатальных деплеции серотонина и стресса на болевую чувствительность в препубертатном периоде развития крысы //  Журнал эвол. биохимии и физиологии, 2005, т.41, № 2, С. 129-133.

34. Otellin V.A., Khozhai L.I., Korzhevskii D.E., Grigorev I.P. Impact of prenatal stress and dexamethasone administration on the structure of neocortex and hippocampus //8-th  ECNP Regional Meeting, European Neuropsychopharmacology (The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology), 2005, p. 253.

35. Хожай Л.И., Отеллин В.А. Формирование неокортекса у мышей, развивавшихся в условиях пренатального дефицита серотонина  // Морфология, 2005, т. 127, № 3, c. 17-21.

36. Ватаева Л.А., Тюлькова Е.И., Самойлов М.О., Хожай Л.И., Отеллин В.А. Обучение в водном лабиринте Морриса самок и самцов крыс, повергавшихся воздействию гипоксии в различные сроки пренатального периода развития // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2005, т. 41, № 6, c. 530-533.

37. Butkevich I.P., Khozhai L.I., Mikhailenko V.A., Otellin V.A. Perinatal Programming Early life determinas of adult health and disease. Section IV. Pain Sensitivity during ontogeny and long-term effects of prenatal noxious events. Ed. By D. Hodgson, Ch. Coe. (Глава в монографии) // Taylor and Francis Books, Abingdon, Oxon, U. K., USA, 2005, p. 211-225.

38. Butkevich I.P., Khozhai L.I., Mikhailenko V.A., Grigorev I.P., Otellin V.A. Reduced serotonin synthesis during  early embryogeny changes effect of subsequent prenatal stress on persistent pain in the formation test in adult male and female rat // Brain Research., 2005, v. 1042, N 2, p. 144-159.

39. Хожай Л.И. Роль серотонина в дифференцировке нейронов и глии в неокортексе  млекопитающих в пренатальный период // 1Съезд физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», Сочи, Дагомыс, 2005, т. 2, c. 54.

40. Хожай Л.И. Формирование астроглии в неокортексе мыши после пренатального временного блокирования синтеза серотонина // Морфология, 2005, т. 127, № 1, С. 17-21.

41. Хожай Л.И., Неокесарийский А.А. Динамика формирования астроцитов и их ультраструктура в неокортексе мыши после пренатального блокирования синтеза серотонина  // Морфология, 2006, т. 129, № 2, c. 99.

42. Khozhai L.I., Otellin V.A. Formation of the neocortex in mice developing in conditions of prenatal serotonin deficiency // Neurosci. Behav. Physiol., 2006, v. 36, N 5, p. 513-517.

47.  Хожай Л.И., Неокесарийский А.А. Изучение  динамики формирования астроцитов и их ультраструктуры в неокортексе мыши после пренатальной деплеции серотонина. // V Международная конф. по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения», РАН, СПб, 2006, c. 47.

43. Отеллин В.А., Хожай Л.И., Коржевский Д.Э., Павлова Н.Г. и др. Структурные основы плацентарных механизмов пренатальной гипоксии развивающихся эмбрионов // Морфология, 2006, т. 129, № 2, c. 69.

44. Отеллин В.А., Хожай Л.И., Ордян Н.Э. Пренатальное стрессирование и развивающийся мозг. Адаптивные механизмы, непосредственные и отсроченные эффекты (Монография) // Издательство «Десятка», СПб, 2007, c. 265.

45. Хожай Л.И., Отеллин В.А., Неокесарийский А.А. Постнатальные изменения морфологии нейральных и глиальных клеток в неокортексе мышей, развивавшихся на фоне дефицита серотонина // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2007, т. 43, № 3, c. 293-298.

46. Ватаева Л.А., Макухина Г.В., Хожай Л.И., Отеллин В.А. Поведение самок и самцов мышей, подвергавшихся воздействию пара-хлорфенилаланина в пренатальном онтогенезе //  Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2007, т. 43, № 4, c. 324-330.

47. Хожай Л.И.,  Григорьев И. П. Влияние уровня серотонина и глюкокортикоидных гормонов на пренатальное развитие гиппокампа и зубчатой фасции // ХХ Съезд физиологического общества России, Москва, 2007, c. 101.

48. Хожай Л.И., Шишко Т.Т., Косткин В.Б., Отеллин В.А. Морфологические изменения в фетальной части аллантоисной плаценты крыс после действия острой гипоксии. // Морфология, 2007, т. 132,  №  6, c. 61-64.

49. Хожай Л.И., Шишко Т.Т. Влияние синтетических глюкокортикоидов на развитие гиппокампа. // Съезд морфологов, Москва, 2007, c. 72.

 

 

 






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.