WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

ЧЕТИНА Елена Васильевна

КЛЕТОЧНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗРУШЕНИЯ СУСТАВНОГО ХРЯЩА ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте ревматологии РАМН

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Макарова Ольга Васильевна Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН, Москва доктор биологических наук, член-корреспондент РАМН, профессор Ярыгин Константин Никитич Российский государственный медицинский университет им.

Н.И.Пирогова, Москва доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

Ведущая организация: Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Защита состоится «17» мая 2011 г. в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу:

119991, Москва, Воробьевы горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «____» ___________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы Остеоартроз (ОА) - это наиболее распространенное заболевание лиц пожилого возраста. Основным проявлением этого заболевания является эрозия суставного хряща, которая развивается вследствие повреждения и резорбции внеклеточного матрикса (ВКМ), окружающего хондроциты. ВКМ состоит преимущественно из коллагена второго типа и протеогликана аггрекана [Poole,2005]. В разрушении ВКМ принимают участие коллагеназы, в частности, коллагеназа 3 (ММР-13) и другие металлопротеиназы матрикса (ММР). Разрушение хряща при ОА сопровождается воспалительным процессом и характеризуется повышением экспрессии цитокинов, таких как интерлейкины (IL)-1 / и фактор некроза опухолей (TNF), которые, как предполагается, активируют металлопротеиназы [Sandell et al.,2001]. В настоящее время считается, что разрушение хряща при ОА инициируется повышенной активностью цитокинов [Pelletier et al.,2006].

Вместе с тем при ОА в хряще также активируются анаболические процессы, которые могут быть причиной фенотипических изменений хондроцитов. В частности, такие фенотипические изменения могут включать элементы терминальной дифференцировки хондроцитов, характеризующейся повышением экспрессии коллагена 10 типа, признаки ранних фаз дифференцировки хондроцитов, о чем свидетельствует появление в матриксе коллагена 2А типа и де-дифференцировки клеток хрящевой ткани, что сопровождается экспрессией коллагенов 1 и 3 типов [Aigner et al.,2002].

Следует отметить, что изменения в клетках суставного хряща при ОА, в частности, очаги пролиферации хондроцитов с образованием клонов отдельных клеток, а также экспрессия генов коллагена типа, аннексинов, щелочной фосфатазы и белка, родственного паратироидному гормону (PTHrP), кальцификация матрикса и гибель клеток посредством апоптоза, включая ускоренное расщепление коллагена 2 типа посредством ММР-13, также наблюдаются в гипертрофных хондроцитах ростковой пластинки при эмбриональном развитии [Szuts et al., 1998].

В настоящее время не существует эффективных лекарственных препаратов, способных восстановить хрящевую ткань. Лечение заболевания проводится противовоспалительными и болеутоляющими средствами, которые могут вызвать осложнения [Poole,2005].

В связи с этим существует настоятельная необходимость поиска других подходов к лечению ОА, основанных на понимании клеточных и молекулярных механизмов этого заболевания.

Гипотеза: Поскольку в онтогенезе происходит резорбция хряща при замене его костью, мы предположили, что разрушение коллагенового матрикса при остеоартрозе может регулироваться механизмами, сходными с теми, которые ответственны за терминальную дифференцировку хондроцитов и резорбцию внеклеточного матрикса при развитии скелета.

Цель настоящей работы:

Исследовать роль клеточных и молекулярных механизмов в разрушении коллагенового матрикса суставного хряща при остеоартрозе.

Задачи исследования:

1. Определить маркерные гены, ответственные за процессы пролиферации и гипертрофии хондроцитов ростковой пластинки.

2. Сопоставить уровень активности расщепления коллагена 2 типа и характер экспрессии генов, отвечающих за дифференцировку хондроцитов, при развитии ранних фокальных повреждений хряща, подобных наблюдаемым при остеоартрозе у лиц пожилого возраста.

3. Изучить особенности экспрессии генов при дифференцировке хондроцитов здорового зрелого суставного хряща, при стимуляции расщепления коллагена.

4. Разработать способы подавления разрушения хряща путем подавления расщепление коллагена 2 типа, используя факторы, замедляющие процессы перехода хондроцитов к гипертрофии.

Научная новизна Обосновано новое понимание механизма развития остеоартроза, дополняющее общепринятое представление о разрушении хряща при развитии заболевания, вследствие повышенной активности коллагеназ, индуцированных цитокинами.

Разрушение хряща при ОА происходит в результате изменений метаболизма суставных хондроцитов, сходных с теми, что наблюдаются при гипертрофии хондроцитов ростковой пластинки при морфогенезе и сопровождаются разрушением ВКМ. Наряду с процессом пролиферации, ранее описанным как клонирование хондроцитов в хряще больных ОА, они переходят в состояние сходное с состоянием фетальных хондроцитов из зоны гипертрофии, а именно экспрессируют коллаген 10 типа, ростовые факторы TGFи Indian hedgehog (Ihh), металлопротеиназы, включая коллагеназы.

Именно коллагеназы, индуцированные гипертрофными изменениями суставных хондроцитов, разрушают коллаген внеклеточного матрикса, что приводит к деградации хрящевой ткани. На начальном этапе этот процесс может проходить при отсутствии воспаления.

1. В связи с этим впервые показано, что в относительно здоровых хрящах пожилых людей образование ранних ОА-подобных повреждений связано с усилением расщепления коллагена, что сопровождается повышением экспрессии генов гипертрофной фазы дифференцировки хондроцитов ростковой пластинки.

2. Впервые показано, что в случае искусственной стимуляции расщепления коллагена 2 типа в здоровом хряще также происходит усиление экспрессии генов и синтеза белков, свойственных гипертрофной фазе дифференцировки хондроцитов.

3. Впервые показано, что в культурах эксплантатов хрящей больных ОА на поздней стадии заболевания можно подавить расщепление коллагена 2 типа с одновременным ингибированием экспрессии генов, ответственных за гипертрофию фетальных хондроцитов, а также индукторов воспаления – цитокинов, в присутствии TGF2 или при низких концентрациях простагландина Е2 (PGE2).

4. Впервые установлено, что в зрелых хондроцитах суставного хряща при ОА процессы расщепления коллагена 2 типа и экспрессия гипертрофного фенотипа взаимообуславливают друг друга и механизм деградации ВКМ в суставном хряще при ОА идентичен процессу разрушения внеклеточного матрикса хондроцитов ростковой пластинки при морфогенезе.

Научно-практическая значимость работы Поскольку в основе повреждения коллагена 2 типа, а следовательно, разрушения хрящевой ткани при ОА лежат механизмы, сходные с теми, что наблюдаются при гипертрофии хондроцитов, регуляция гипертрофии может быть одним из перспективных направлений в терапии разрушения суставного хряща при ОА.

В частности, повышение уровня TGF2 и поддержание низких уровней PGE2 в суставной сумке будет способствовать подавлению расщепления коллагена и разрушению хрящевой ткани при ОА.

Предложенная в данной работе новая интерпретация механизма возникновения ОА позволит определить новые фармакологические мишени для лечения заболевания или предотвращения его развития на самой ранней стадии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Хондроциты суставного хряща способны возобновить процесс дифференцировки, сходный с таковым у фетальных хондроцитов ростковой пластинки, и этот процесс лежит в основе резорбции хряща при остеоартрозе.

2. Дифференцировку хондроцитов суставного хряща можно инициировать in vitro агентами, стимулирующими первичное расщепление коллагена коллагеназой.

3. Дифференцировка хондроцитов лежит в основе разрушения хряща при возрастных изменениях, сходных с остеоартрозными, причем начинается она до изменений хряща, регистрируемых гистологически, и проявляется в повышении экспрессии генов, которые активны в зонах пролиферации и гипертрофии ростковой пластинки.

4. Разрушение матрикса суставного хряща больных остеоартрозом можно остановить действием ростовых факторов, которые способны блокировать дифференцировку хондроцитов ростковой пластинки. Это сопровождается ингибированием маркерных генов дифференцировки хондроцитов и подавлением активности расщепления коллагена коллагеназой.

Конкретное участие автора заключалось в планировании исследования, составлении программы, методики проведения работы, разработке методологии и анализе полученных результатов. Сбор и обработка первичного материала, получение научных результатов, статистическая обработка данных, формулировка научных положений и выводов на основании данных, собранных в Детской больнице Шрайнерсов при МакГилльском Университете г. Монреаль, Канада и Научно-исследовательском институте ревматологии РАМН, включенных в исследование, проводились диссертантом самостоятельно.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены на III Российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека» (Санкт-Петербург, 2010); X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); VIII конгрессе Российского Артроскопического Общества (Москва, 2009);

на Российском конгрессе ASAMI (Курган, 2009); на Всемирном конгрессе общества по иcследованю кости и минерала (American Society for Bone and Mineral Research) (Сиэтл, 2004; Сан Антонио, 2002); Всемирном конгрессе Американского общества ревматологов (American College of Rheumatology) (Новый Орлеан, 2002; Сан Франциско, 2001; Филадельфия, 2000); Всемирном конгрессе общества ортопедов (Orthopaedic Research Society) (San-Francisco, 2001; Даллас, 2002); Всемирном конгрессе по остеоартрозу (OARSI) (Берлин, 2003); Конференции Канадской лиги по исследованию артрита (Canadian Arthritis Network) (Монреаль, 2003); Канадской конференции по соединительной ткани (Canadian Connective Tissue Conference) (Монреаль, 2003; 1999; Шербрук, 2002; Торонто, 2001;

Квебек, 2000; Лондон, 1998).

Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании Ученого совета Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института ревматологии РАМН 16 марта 2010 г.

Публикации По теме диссертации опубликовано 47 печатных работ: журнальных статей (из них 12 статей в зарубежных журналах) и тезисов (в том числе 23 - на зарубежных симпозиумах).

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, основных результатов исследования ростковой пластинки, здорового суставного хряща быка и человека и поврежденного суставного хряща больных остеоартрозом, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 55 рисунками и 5 таблицами. Библиография включает 465 публикаций, в том числе 27 отечественных и 438 зарубежных авторов.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте ревматологии РАМН, Москва. Сбор материала производился в отделе суставных заболеваний Детской больницы Шрайнерсов при МакГильском Университете (г.Монреаль, Канада) (заведующий – профессор А.Р. Пул (Poole A.R., DSc, PhD) и хирургическом отделении Научно-исследовательского института ревматологии РАМН (директор – академик РАМН, профессор Е.Л.Насонов).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Структура выборки (n=147). В работе проанализированы образцов ткани фетальной ростковой пластинки теленка в возрасте гестации 120-240 дней, а также 16 образцов хряща фалангометакарпальных суставов быков в возрасте 18-24 месяцев, полученных на мясокомбинате г. Монреаль.

Исследовано также 37 аутопсийных образцов хряща здоровых лиц. Среди них было 27 мужчин, средний возраст 57.1 г. (от 26 до г.) и 10 женщин, средний возраст 61.6 г. (от 51 до 69 лет). Пациенты погибли в результате несчастного случая или скончались скоропостижно. Ни один из пациентов не подвергался химиотерапии, не имел сахарного диабета, врожденной дисплазии, или сосудистой недостаточности нижних конечностей, а также заболеваний опорнодвигательного аппарата.

Кроме того, в работе было использовано 76 образцов хрящей коленного сустава больных идиопатичеким остеоартрозом, диагностированным в соответствии с критериями Американской Коллегии по Ревматологии. Хрящ был получен после артропластической операции, проведенной в Общей или Еврейской больницах г. Монреаля (Канада) и хирургическом отделении НИИ ревматологии РАМН (Москва, Россия). Среди пациентов были мужчин, средний возраст 72.9 г. (от 55 до 82 лет) и 48 женщин, средний возраст 75.4 г. (от 50 до 90 лет).

Пoдготовка фетальных тканей теленка. Препараты ростковой пластинки получали, как описано ранее Tchetina et al., [2003].

Подготовка суставного хряща, имеющего фокальные повреждения. Суставной хрящ человека снимали при вскрытии (не более, чем через 12 час после смерти пациента) с дистальной поверхности мыщелка бедренной кости коленного сустава, сочлененного с коленной чашечкой.

При гистологическом исследовании препаратов хряща патологические изменения в них соответствовали 1 по шкале Манкина или в них выявлялись очень ранние фокальные поражения с показателями 3 или 4 по Манкину. Прободения хряща до кости не наблюдалось. Хрящ срезали полностью до субхондральной кости в виде полосок 3мм шириной и 20мм длиной каждая, от центральной к латеральной части мыщелка (Рис.1). Хрящевые полоски разрезали поперек на фрагменты 2мм х 3мм и анализировали по отдельности гистологически (e и g), на активность расщепления коллагена (30-мг хряща по сырому весу - c, f и i) и экспрессию генов (100-200 мг сырого веса хряща оставшихся фрагментов). Все фрагменты хряща Рис.1. Схема изъятия материала для исследования ранних повреждений хряща при старении.

оценивали гистологически на степень разрушения, используя систему Манкина, модифицированную для хрящей, отделенных от субхондральной кости, в которой более низкие показатели соответствуют более здоровому хрящу.

Подготовка суставного хряща больных ОА. Суставной хрящ дистальной части бедренной кости человека получали после полного удаления коленного сустава для замены его на искусственный.

Заболевание ОА было предварительно диагностировано в соответствии с критериями Американской Коллегии по Ревматологии. Подготовку хряща для культивирования проводили в соответствии с методикой Billinghurst et al. [2000].

Подготовка суставного хряща взрослого быка. Суставные хрящи фаланго-метакарпальных суставов срезали непосредственно после получения материала. Подготовку хряща для культивирования проводили в соответствии с методикой Mwale et al. [2000].

Культивирование хрящевых эксплантатов. Среду меняли через 48 ч. (и считали это началом опыта: день 0), а затем – через каждые дня. Смесь ростовых факторов добавляли в конечной концентрации 10нг/мл TGF (трансформирующий ростовой фактор) 2 (R&D Systems), 10нг/мл FGF (ростовой фактор фибробластов)-2 (R&D Systems) и 100нг/мл инсулина (Sigma) в соответствии с ранее проведенными исследованиями фетальных хондроцитов Szuts et al.

[1998].

Смесь бром-циановых (CNBr) фрагментов, обогащенный фрагмент коллагена СВ12, или синтетические пептиды СВдобавляли в среду также при каждой ее смене в концентрации мкМ. В контрольные образцы не добавляли ни фрагментов коллагена, ни его пептидов.

Культивирование суставных хондроцитов в виде осадочных культур. Отмытые фрагменты суставного хряща взрослого быка после переваривания осаждали и культивировали в конических пробирках, как описано Wu et al. [2002].

Фракционирование и культивирование фетальных хондроцитов. Бычьи фетальные хондроциты из ростковых пластинок выделяли, фракционировали и культивировали, как описано в работе Alini et al. [1994], используя градиент перкола и получали субпопуляции A (верхняя фракция – хондроциты резервной зоны), B, C, D (нижняя фракция - гипертрофные хондроциты).

Определение активности расщепление коллагена типа коллагеназой с использованием фермент-зависимого иммуносорбентного метода (ELISA). Метод определяет содержание нео-эпитопа, генерируемого коллагеназами на СООНконце фрагмента при раскручивании тройной спирали коллагена типа этими ферментами и подробно изложен в статье Dahlberg et al.

[2000].

Определение минерализации матрикса, используя включение кальция (45Са2+), проводили, как описано ранее Alini et al. [1994].

Биосинтез коллагена и общий оборот белка. Для оценки биосинтеза коллагена использовали включение 3Н-пролина [Wu et al., 2002]. Общий синтез белка и белок, освобожденный в культуральную среду, определяли в присутствии 35S-метионина [Wu et al., 2002].

Определение содержания общего количества коллагена 2 типа или степени его денатурации. Общее содержание коллагена 2 типа измеряли по количеству внутреннего эпитопа, который экспонируется только после раскручивании структуры тройной спирали коллагена, как описано в статье Billinghurst et al. [1997].

Определение содержания свободных протеогликанов.

Протеогликаны тестировали колориметрическим методом Farndale et al. [1986].

Определение содержания общего кальция и фосфата. Кальций измеряли методом, описанным Ames, [1966]. Концентрацию Pi определяли, используя метод Baginsky et al. [1973].

Количественное определение секреции простагландина (PG) Е2.

Количество PGE2 оценивали, используя набор для конкурентного фермент-зависимого иммуносорбентного определения, в соответствии с инструкциями производителя (Cayman Chemical Company).

Очистка коллагена 2 типа и синтез его производных пептидов.

Коллаген 2 типа очищали из бычьего фетального эпифизарного хряща по методу Miller et al. [1971]. Фракции коллагена денатурировали при 56оС 30мин. Готовили бром-циановые фрагменты (СNВr) бычьего коллагена 2 типа, а затем отделяли пептид СВ12 от других СВ-фрагментов посредством высоко эффективной хроматографии в жидкой фазе (НРLС). Идентичность полученных белков СВ12 подтверждали секвенированием аминотерминальных последовательностей.

В соответствии с опубликованной первичной последовательностью и известными пост- трансляционными модификациями бычьего коллагена 2 типа, 4 перекрывающихся пептида СВ12 были синтезированы на 0.25 ммол шкале с использованием стандартной 9-фторенилметоксикарбоновой (Fmoc) химии на твердофазном синтезаторе белков модели 431А (Applied Biosystems).

Электрофорез и иммуноблоттинг. Для Вестерн блотов 500мкл культуральной среды хондроцитов осаждали 2 объемами 100% этанола. Белки разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях по стандартной методике.

Иммуногистохимические методы Подготовка криосрезов хряща. Фрагменты хряща быка или человека в конце культивирования замораживали в ОСТ-реагенте и готовили срезы толщиной 7.5мкм с использованием криостата. Срезы фиксировали 5мин в растворе 4% параформальдегида и обрабатывали, как описано в работе Tchetina et al. [2007).

Выявление локализации коллагенов 10 и 2 типов. Срезы инкубировали 30 мин при комнатной температуре во влажной камере с добавлением по 50мкл на срез разведенного раствора антител. Для визуализации коллагенов 10 и 2 типов использовали моноклональные антитела домена NC1 коллагена 10 типа (асцитная жидкость, разведенная 1/100) или раствор моноклональных антител С2С к неоэпитопу, образуемому при расщеплении коллагена 2 типа коллагеназой как описано в работе Tchetina et al. [2007).

Определение пролиферативной активности. Для оценки пролиферативной активности использовали моноклональные мышиные антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA) (DakoCytomation) или моноклональные мышиные антитела к кроличьему антигену Ki67, как описано в работе Tchetina et al. [2007).

Выявление апоптозных клеток. Для выявления апоптозных клеток использовали систему TUNEL (Roche Diagnostics) в соответствие с инструкциями производителя.

Ядра окрашивали бромистым этидием. Процент клеток, ядра которых оказались мечеными флуоресцеином (апоптозных) к общему числу клеток, ядра которых были окрашены бромистым этидием, определяли подсчетом числа тех и других клеток в 10 полях зрения (увеличение 200) микроскопа для каждой экспериментальной группы.

Каждое поле зрения содержало 200-400 клеток.

Гистологический анализ клеточных культур хондроцитов Клеточные культуры хондроцитов фиксировали 2% глютаральдегидом в 0.1М какодилате натрия, рН 7.2 в течение ночи при 4оС. Ткани дегидратировали в восходящих концентрациях этанола и заключали в смолу Spurr (Polysciences, Inc., Washington, PA USA). Срезы толщиной 1-2мкм окрашивали реагентом Von Kossa или толуидиновым голубым.

Выявление пептида СВ12-2 в суставном хряще человека Экспонирование пептида СВ12-2 в разрушенном коллагене 2 типа хряща больных ОА оценивали с помощью кроличьей антисыворотки к данному пептиду путем его ковалентного связывания с овальбумином [Wu et al., 2002].

Выделение общей РНК. Суммарную РНК выделяли из эксплантатов хрящей больных ОА после их культивирования в течение 6-48 час, используя раствор D по стандартной методике.

Дальнейшую очистку РНК проводили, используя набор RNeasy (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Обратная транскрипция (ОТ). В реакции использовали SuperScript TMIIH OT и суммарную РНК хряща. Реакцию проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя (Invitrogen).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В работе использовали олигонуклеотидные последовательности праймеров для амплификации 27 генов. ПЦР проводили, используя АmpliTaq ДНКполимеразу в соответствии с рекомендациями производителя (Perkin Elmer). Результаты анализировали, используя программное обеспечение NIH 1.60.

Количественный анализ экспрессии генов посредством ПЦР в режиме реального времени. Праймеры и зонды для TaqMan анализа образцов хряща быка и человека изготавливали на заказ (Аpplied Biosystems). Количественный анализ уровня экспрессии мРНК проводили с использованием системы ПЦР в реальном времени 75в соответствии с рекомендациями изготовителя (Applied Biosystems).

Относительную экспрессию мРНК рассчитывали c использованием метода вторичной производной (ddCT) в соответствии с рекомендациями производителя (Applied Biosystems).

Статистический анализ. Данные количественных экспериментов представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение. Анализы проводили по меньшей мере в трех повторностях. Для статистической обработки результатов использовали тесты Ман-Уитни и парный тест Стьюдента (t–тест).

Значения вероятности менее 0.05 считались достоверными.

Достоверно отличающиеся от контроля показатели обозначены на рисунках звездочкой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Координация экспрессии генов и белков в хондроцитах пролиферативной и гипертрофной зон ростковой пластинки Используя микроаналитический метод, при помощи которого в ОТПЦР анализировали кДНК, 12 последовательных поперечных срезов первичной ростковой пластинки большой берцовой кости плода теленка, представляющих зоны гипертрофии (А-С), созревания (D-F), а также нижнюю и верхнюю зоны пролиферации (G-L) (Рис.2).

На Рис. 3. представлены профили экспрессии генов, полученной в ОТ-ПЦР. Интенсивную экспрессию гена COL10A1, маркера гипертрофии, наблюдали в срезе С, что определяет верхнюю границу Резервная зона _______________ Пролиферативная зона ______________ Гипертрофная зона Рис. 2. Схема строения ростковой пластинки плода быка гипертрофной зоны. По отношению к GAPDH экспрессия этого гена еще более увеличивалась в срезах В и А. На срезе A COL10A1 ко- экспрессировался с остеокальцином, который обычно экспрессируется в наиболее зрелых гипертрофных хондроцитах, а также в остеобластах первичной губчатой кости. Следовательно, зона гипертрофии соответствует срезам А, В и С. Экспрессия остеокальцина, в отсутствие COL10A1, не связанная с гипертрофией, наблюдалась также на срезе L, вблизи зоны экспрессии циклина Вна срезе J.

В отличие от COL10A1 экспрессия COL2A1 обнаружена во всех образцах. Между тем, когда в ПЦР использовали серийные разведения кДНК, наблюдали три пика экспрессии COL2A1, а именно в срезах K, D и А. Следует отметить, что пик экспрессии в срезе D соседствовал с пиком экспрессии COL10A1. Это сопровождалось пиками экспрессии транскрипционного активатора этого коллагена – Sox 9.

Пик экспрессии Cbfa1 обнаружен только в гипертрофной зоне, где этот транскрипционный фактор коэкспрессировался с Sox 9, COL2A1, COL10A1, Ihh и MMP-13. При этом имелся промежуточный пик экспрессии Cbfa1, одновременно с ММР-9 на срезе Е по соседству с гипертрофной зоной.

Пролиферативная Гипертрофная Пролиферативная Гипертрофная Зоны Зоны COL10AЦиклин ВОстеокальцин ОстеокальЦиклин цин ВCOL2AСрезы Срезы Рис. 3. Экспрессия генов ростовых факторов в ассоциации с экспрессией генов матрикса в ростковой пластинке плода быка Коллагеназа ММР-13 слабо экспрессировалась в зоне пролиферации и созревания хондроцитов, хотя как и COL2A1 и Sox 9, фермент имел слабый пик экспрессии в верхней пролиферативной области (срез К). Его экспрессия постепенно увеличивалась к зоне гипертрофии, где наблюдалось значительное повышение экспрессии COL2A1, COL10A1 и Cbfa1. Кроме того, экспрессия этого фермента на низком уровне наблюдалась во всех зонах ростковой пластинки.

Эти результаты также подтверждают сообщения о существовании раннего пика активности расщепления коллагена коллагеназой в пролиферативной зоне в дополнение к значительному увеличению этой активности в гипертрофной зоне [Alvarez et al., 2005].

Напротив, ММР-9 (желатиназа В) экспрессировалась в прегипертрофных и в гипертрофных хондроцитах и не обнаружена в пролиферативной зоне. Как указывалось выше, этот фермент коэкспрессировался с Cbfa1.

В ростковой пластинке теленка мы наблюдали несколько пиков экспрессии циклина В2, а именно в срезах J, H, D и А. Поскольку циклин В2 экспрессируется не только хондроцитами, максимумы его экспрессии, вероятно, указывают на пролиферативные процессы в разных клетках, присутствующих в каждом срезе. К таким клеткам могут относиться, например, эндотелиальные клетки кровеносных сосудов ростковой пластинки. Поскольку врастание кровеносных сосудов происходит из зоны кости, оно может приводить к увеличению экспрессии циклина В2 в срезах А, С и D. Напротив, увеличение экспрессии циклина В2 в пробах J и Н скорее всего обусловлено пролиферацией хондроцитов. Кроме того, увеличение экспрессии циклина В2 в пробах J и Н сопровождалось уменьшением экспрессии COL2A1 и фактора его транскрипции Sox 9 в срезах Н и J.

Это может свидетельствовать о сокращении активной сборки коллагена, что благоприятствует клеточному делению.

Известно, что процесс роста и перестройки ростковой зоны регулируется ростовыми факторами [Poole,1991]. Профили экспрессии генов, кодирующих некоторые из этих регуляторных молекул, также показаны на Рис. 3. Кратковременные пики экспрессии FGF-2, PTHrP и TGF2 обнаружены в срезе К. Экспрессия FGF-2 и PTHrP постепенно уменьшалась в соседних срезах, тогда как экспрессия TGF2 снова увеличивалась в срезе G, а также в срезе С гипертрофной зоны. Следующий пик экспрессии этого ростового фактора наблюдали в срезе А, примыкающем к зоне первичной губчатой кости и сайту экспрессии остеокальцина.

В ростковой пластинке быка мы наблюдали понижение экспрессии PTHrP с повышением экспрессии циклина В2 (в верхней пролиферативной зоне), которое также сопровождалось уменьшением экспрессии TGF2 и FGF-2.

Экспрессию TGF2 мы наблюдали как в зоне кальцификации, так и в пролиферативной и гипертрофной зонах ростковой пластинки, в виде локальных максимумов в этих зонах. Напротив, пик экспрессии TGF1 мы обнаружили исключительно в гипертрофной зоне (срез С), что согласуется с мнением о том, что этот ростовой фактор является продуктом гипертофных хондроцитов [Horner et al., 1998].

Экспрессия Ihh также ограничивалась гипертрофной зоной (срезы С и В), где также экспрессировался COL10A1.

Таким образом, наши оригинальные исследования экспрессии в серийных срезах ростковой пластинки быка позволили выявить гены, которые специфически экспрессируются либо пролиферативной, либо в гипертрофной зонах.

Признаки дифференцировки и гипертрофии хондроцитов при формировании ранних повреждений хряща у лиц пожилого возраста Поскольку замещение хрящевой ткани на костную в гипертрофной зоне ростковой пластинки в эмбриогенезе происходит также при участии коллагеназ, разрушающих ВКМ и продуцируемых хондроцитами, экспрессирующими маркеры гипертрофии, мы предположили, что разрушение коллагенового матрикса при раннем ОА может включать те же клеточные и регуляторные механизмы, которые управляют нормальной терминальной дифференцировкой и резорбцией ВКМ при развитии скелета.

Нами были проанализированы образцы ранних повреждений хряща 37 пациентов. Наиболее типичные результаты исследования ранних повреждений хряща трех пациентов представлены ниже.

Ранним повреждением хряща считался участок на дистальной поверхности мыщелка бедренной кости, сочлененной с коленной чашечкой, где наблюдалась повышенная коллагеназная активность по сравнению с окружающей тканью, которая сопровождалась разрушением ткани не ниже 3 по Манкину. Участок здорового хряща (более 2 полосок от повреждения) служил контролем по отношению к месту повреждения.

Образец поврежденного хряща бедренной кости мужчины в возрасте 71 г. (Рис. 4) гистологически не отличался от здорового хряща (степень 1 по Манкину, за исключением полоски 3, локализованной в срединной части, где наблюдались ранние признаки дегенерации (степень 3 по Манкину). Усиленное расщепление коллагена 2 типа посредством коллагеназы наблюдали только в полосках 3 и 4, имеющих наибольшее значение деструкции ткани по Манкину. В области повреждения (полоски 3 и 4) проведенное тестирование выявило экспрессию генов ремоделирования ВКМ, а именно коллагена 2 типа (преимущественно в полоске 4) и аггрекана (полоска 4), а также коллагеназ ММР-13, ММР-1, а также ММР-3 и ADAMTS-(аггреканаза 2) в полоске 4, где сохранялась нормальная гистология хряща, но активность расщепления коллагена коллагеназой была усилена. Пик экспрессии МТ1-ММР обнаружен в полоске 1, т.е. в области, примыкающей к повреждению, где также наблюдалась экспрессия ММР-13, ММР-1 и ММР-3. Катепсин К очень слабо экспрессировался в сайте повреждения и в его непосредственной близости (полоски 2 и 3). Процесс деградации ВКМ и его ремоделирования также сопровождался экспрессией геноврегуляторов дифференцировки хондроцитов. Так, экспрессия генов, ассоциированных с пролиферацией хондроцитов в ростковой пластинке, а именно РТНrР (полоски 1-4) и FGF-2 (преимущественно в полоске 1 и незначительно в полосках 2 и 4) наблюдалась как внутри повреждения, так и вблизи него (полоски 1-4), а также менее выражено - вдали от повреждения (полоски 8 и 9 для PTHrP и полоска 9 для FGF-2), тогда как ММР, коллаген 2 типа и аггрекан обычно экспрессировались в обоих сайтах. Экспрессия FGF-2 не обнаружена в полосках 5, 6 и 7. Ген ММР-9, связанный с терминальной дифференцировкой хондроцитов, незначительно экспрессировался внутри повреждения, хотя его экспрессия была выражена вблизи повреждения (полоска 1). Гены, которые наиболее активно экспрессировались как в пролиферативной, так и в гипертрофной зонах бычьей ростковой пластинки, а именно TGF2 и MMP-13, экспрессировались внутри повреждения и вблизи него (полоски 1 и 2), а также вдали от повреждения (полоски 7,8). Хотя коллаген 10 типа и TGF1 экспрессировались только в гипертрофной зоне ростковой пластинки, в процессе образования повреждения гиалинового хряща их экспрессия обнаружена как внутри (полоска 4) и вблизи (полоска 1), так и в более отдаленных от повреждения участках хряща (полоска 9). Напротив, экспрессия Sox9 наблюдалась в полоске 5 вблизи повреждения и в полоске 8 вдали от него, где также выявлялась экспрессия СOL2A1. Экспрессия гена каспазы 3, которая указывает на готовность клеток к апоптозу [Aigner et al., Степень разрушения по Манкину Больной, 71 г.

Активность коллагеназы КаспазаКаспаза Циклин ВЦиклин ВАггрекан Полоски Полоски Рис. 4. Активность расщепления коллагена и экспрессия генов в области раннего повреждения хряща у мужчины в возрасте 71 г.

2002], наблюдалась только внутри повреждения (полоски 3 и 4).

Слабая экспрессия циклина В2 видна в полосках 6 и 9. Слабая экспрессия цитокинов IL-1 и TNF наблюдалась внутри повреждения и вблизи него (полоски 1-4), а экспрессия IL-1 очень слабо была выражена вблизи повреждения в полоске 2.

В зоне наибольшего разрушения коллагена (полоска 3, степень 3 по Манкину) и наиболее высокой коллагеназной активности, мы не наблюдали высокой экспрессии генов, связанных с дифференцировкой хондроцитов по сравнению с полоской 4, расположенной в непосредственной близости от повреждения и имеющей высокую экспрессию генов и коллагеназную активность при низкой ( = 1) степени разрушения по Манкину. Поскольку эти образцы хряща имели одинаковую экспрессию конститутивного гена домашнего хозяйства (GAPDH) и поэтому не отличались по количеству мРНК, полученные данные свидетельствуют о действительных различиях в экспрессии исследованных генов в зоне ранного повреждения хряща данного пациента. При этом следует отметить, что пролиферация и гипертрофия cуставных хондроцитов, выявляемая по экспрессии соответствующих генов, вероятно, являются кратковременными процессами, которые предшествуют расщеплению коллагена, который связан с процессом терминальной дифференцировки хондроцитов в гипертрофной зоне ростковой пластинки.

Частота экспрессии генов (%) Рис. 5. Частоты распределения экспрессии генов во фрагментах суставного хряща из зоны сочленения с коленной чашечкой, разделеных в соответствии с «фоновым» (черные столбики) или «повышенным» (серые столбики) уровнем коллагеназной активности При рассмотрении экспрессии генов во всех полосках исследуемых пациентов, где активность коллагеназы находилась на «фоновом» уровне или была «повышена» по сравнению с фоновой, оказалось, что более высокая экспрессия генов, связанных с гипертрофией хондроцитов более часто наблюдалась в полосках, где коллагеназная активность повышена (Рис. 5). Например, каспаза экспрессировалась только в полосках с активной коллагеназой.

Экспрессия СOL10A1, MMP-1, ADAMTS-5, IL-1/ также была выше при повышенной активности коллагеназы. Напротив, экспрессия Sox9, TGF1/2, TNF и аггрекана была ниже при повышении коллагеназной активности.

Следовательно, усиление расщепления коллагена в локусах образования ранних повреждений хряща сопровождается не только усилением экспрессии генов, ответственных за разрушение матрикса, но и генов, связанных с конечной дифференцировкой хондроцитов, подобно той, что наблюдается в гипертрофной зоне ростковой пластинки. Поэтому, вероятно, дифференцировка хондроцитов тесно связана с очень ранним повреждением хряща, которое происходит при ОА.

Способность фрагмента коллагена 2 типа индуцировать расщепление коллагена и гипертрофию суставных хондроцитов в здоровом хряще быка и человека Если механизмы резорбции ВКМ в ходе дифференцировки хондроцитов в ростковой пластинке лежат в основе последующего разрушения гиалинового хряща, то дифференцировка хондроцитов должна предшествовать разрушению коллагена в нормальном хряще при воздействии агентов, способных стимулировать расщепление коллагена.

Одним из таких агентов является обнаруженный нами пептид, производное коллагена 2 типа - CB12-2. Этот фрагмент коллагена типа оказался способным стимулировать экспрессию ММР-13 и опосредованное коллагеназой расщепление коллагена 2 типа [Yasuda et al., 2006].

Количественное определение экспрессии генов посредством ПЦР в режиме реального времени показало, что экспрессия ММР-значительно повышалась в присутствии пептида СВ12-2 на 1-е и 4-e сутки (Рис. 6). Экспрессия коллагена 10 типа также усиливалась, но только на 4-e сутки после добавления СВ12-2.

Относительная экспрессия б Контроль Контроль СВ12-2 СВ12- 24ч. 96ч.

Рис. 6. Влияние пептида СВ12-2 на экспрессию коллагена 10 типа (а) и ММР-13 (б) в эксплантатах хряща. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

Локализация коллагеназной активности, стимулированной пептидом СВ12- Окрашивание неоэпитопа, образующегося при расщеплении коллагена 2 типа (С2С) под действием пептида эксплантатами бычьего хряща, культивируемого в присутствии или без СВ12-2, анализировали на 4-e и 6-e сутки (Рис. 7).

Специфическое окрашивание С2С эпитопа в присутствии СВ12-усиливалось на 4-e сутки в начале в средней зоне эксплантатов хрящей быка. На 6-e сутки специфическое окрашивание распространялось на поверхностную зону. В контрольных образцах наблюдаемое окрашивание было значительно меньшим. Никакого окрашивания не наблюдалось в поверхностной и средней зонах в эксплантатах, обработанных СВ12-2 после преадсорбции С2С антител иммунизирующим пептидом.

б в г д Рис. 7. Динамика изменения локализации коллагеназной активности в эксплантатах хряща, культивируемых в присутствии пептида СВ12-на 4-ый (а,б) и 6-ой (в,г) дни. Контроль с преадсорбцией иммунизирующим пептидом (д). Масштабная полоска=150мкм.

Локализация маркеров пролиферации РCNA и Ki Пролиферацию хондроцитов в эксплантатах бычьего хряща, культивируемого в присутствии СВ12-2 или без него, выявляли путем окрашивания на маркеры пролиферации РCNA и Ki67 (Рис. 8).

На первый день окрашивание в области ядер хондроцитов, расположенных в вертикальных стопках в средней и глубокой зонах, как в случае РCNA, так и Ki67 усиливалась в хрящах, культивируемых с пептидом. Окрашивание изначально не наблюдалось в поверхностной зоне, но присутствовало в средней зоне. Это увеличение было статистически значимым (Табл. 1). На 4-e сутки в присутствии пептида окрашивание пролиферативных антигенов оставалось интенсивным и включало большее число клеток также и в поверхностной зоне (Рис. 8; Табл. 1), хотя увеличение окрашивания в контроле в отсутствии пептида также наблюдалось.

б в г ж з д е Рис. 8. Динамика изменения локализации маркеров пролиферативной активности Ki67 (а, б, д, е) и PCNA (в, г, ж, з) хондроцитов в эксплантатах хряща, культивируемых в течение 1-го (а-г) или 4-х (дз) дней в присутствии (б, е, г, з) или без (а, в, д, ж) пептида СВ12-2.

Масштабная полоска = 150мкм.

Кроме того, одновременно диффузное окрашивание клеток и матрикса на антиген РCNA наблюдали в поверхностной и средней зонах, что возможно, свидетельствует о нарушении клеточной мембраны.

Вариабельность между контролем и СВ12-2 показана с правой стороны таблицы, Вариабельность между 1 и 4 сутками (Ki67, PCNA) и 4 и 7 сутками (TUNEL) показаны под каждым сравнением.

Пролиферация хондроцитов в присутствии пептида была в 1.6 раза выше для Ki67 в обеих точках, и в 1.9 раз больше в 1-e сутки и в 2.раза больше на 4-e сутки для РCNA по сравнению с контрольными образцами. Эти изменения происходят в тех же зонах и в том же порядке, как и в случае индукции расщепления коллагена, описанного выше.

Taблица 1.

Процент пролиферирующих клеток, детектируемых посредством окрашивания на антигены Ki67 или PCNA и апоптозных клеток, детектируемых в реакции TUNEL в эксплантатах нормального бычьего суставного хряща, культивируемого в течение 4 суток в присутствии 10 мкМ СВ12-2 или без него (контроль) ____________________________________________________________ Краситель Время (сутки) Контроль CB12- культивирования (n=10) (n=10) P 1 13.4± 3.4 21.0±4.9 0.00Ki 4 18.3±4.2 29.1±7.3 0.00________________________P=0.006____________P= 0.25___________ 1 9.8± 3.7 25.5±4.5 0.00PCNA 4 15.6±2.4 29.1±5.9 0.00_________________________P=0.006___________P=0.035_____________ 1 0 TUNEL 4 1.8±0.7 3.9±0.5 0.00 7 2.1±0.4 7.8±1.5 0.00 P=0.05 P=0.00 Локализация коллагена 10 типа Окрашивание коллагена 10 типа наблюдалось только в матриксе эксплантатов, культивируемых в присутствии пептида СВ12-начиная с 4-x суток, когда впервые обнаруживалась экспрессия гена COL10A1 (Рис. 9).

Окрашивания не наблюдалось в контрольных образцах, культивируемых в отсутствии пептида. Внеклеточный матрикс средней зоны суставного хряща интенсивно окрашивался на 4-e сутки. Окраска распространялась на поверхностную зону к 6-м суткам, повторяла распределение и совпадала по времени с изменениями расщепления коллагена и распределением пролиферирующих хондроцитов. На специфичность окраски указывает ее ингибирование посредством преадсорбции антител иммунизирующим пептидом.

б в г д Рис. 9. Динамика изменения локализации маркера гипертрофии – коллагена 10 типа в эксплантатах хряща, культивируемых 4 (а, б) или 6 (в, г) дней в присутствии (б,г) или без (а, в) пептида СВ12-2.

Отсутствие окрашивания в случае преадсорбции антитела иммунизирующим пептидом (д). Масштабная полоска=150мкм.

Локализация апоптозной активности в эксплантатах суставного хряща Для выяснения вопроса, индуцирует ли пептид СВ12-фрагментацию ДНК, характерную для апоптоза (который наблюдается в терминальной стадии дифференцировки хондроцитов в ростковой пластинке), эксплантаты суставного хряща быка культивировали в присутствии или в отсутствии СВ12-2. Образцы анализировали на 1-, 4- и 7-e сутки, используя вышеприведенный протокол оптимизированный для ростковой пластинки. После 1-х суток апоптозные клетки не выявлялись как в присутствии пептида, так и без него (Табл. 1).

б Рис. 10. Локализация апоптозных клеток в эксплантатах хряща, культивируемых в присутствии (б) или без (а) пептида СВ12-2 на 7-е сутки. Масштабная полоска=150мкм.

На 4-e сутки апоптозные клетки наблюдались только в глубокой зоне в обработанных пептидом и контрольных образцах. На 7-e сутки срезы контрольных эксплантатов продолжали содержать апоптозные клетки в глубокой зоне, однако значительное увеличение числа апоптозных клеток наблюдалось также в поверхностной зоне эксплантатов, которые культивировали в присутствии СВ12-2 (Рис.

10, Табл. 1).

Индукция повышенного расщепления коллагена посредством коллагеназы под действием пептида СВ12-2 сопровождается активацией металлопротеиназ матрикса и дифференцировкой хондроцитов в здоровом хряще человека В эксплантатах здоровых хрящей взрослого человека мужского пола в возрасте 26 лет также происходило повышение активности расщепления коллагена 2 типа при воздействии пептида CB12-(Рис. 11), Контроль а СВ12-Активность расщепления Дни коллагена б Контроль Рис. 11. Индукция активности расщепления коллагена 2 типа в среде (а) и суммарно в среде и хряще (б) в эксплантатах человека.

Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

которое сопровождалось увеличением экспрессии металлопротеиназ матрикса ММР-13, -9, -1, МТ1-ММР, маркера гипертрофии – коллагена 10 типа, маркера пролиферации циклина В2, цитокинов IL1, TNF, сопутствующих воспалительному процессу, каспазы 3, свидетельствующей о готовности клеток к апоптозу, и ростовых факторов TGF1 и 2, PTHrP, FGF-2, Ihh, активирующихся в хондроцитах, как пролиферативной, так и гипертрофной зонах ростковой пластинки (Рис. 12).

Повышение экспрессии генов сопровождалось повышенным синтезом соответствующих белков. На Рис. 13 представлена локализация коллагена 10 типа в эксплантате хряща человека в присутствии пептида СВ12-2.

Дни СВ12- Каспаза Циклин ВРис. 12. Влияние пептида СВ12-2 на экспрессию генов в эксплантатах хряща человека.

Контроль Рис. 13. Локализация коллагена 10 типа в эксплантатах хряща человека, культивируемых в присутствии пептида СВ12-2 в течение 8 дней.

В отличие от бычьих тканей дегенеративные процессы в хряще человека начинались в поверхностных участках ткани, где экспрессировались индуцированные пептидом коллаген 10 типа на 8 день культивирования, а на 12 день - апоптозные клетки (Рис. 14).

КОНТРОЛЬ День 1 СВ12-День Рис. 14. Формирование апоптозных клеток в эксплантатах хряща человека, культивируемых в присутствии пептида СВ12-2.

Таким образом, изменения в клетках, подобные тем, что наблюдаются при дифференцировке хондроцитов ростковой пластинки, предваряют расщепление коллагена, индуцированное искусственно. Кроме того, наши данные показывают, что продукты расщепления коллагена 2 типа могут участвовать в индукции гипертрофии, как в морфогенезе, так и при развитии патологии хряща при ОА.

Роль ростовых факторов в подавлении разрушения коллагена и гипертрофии хондроцитов при остеоартрозе Поскольку TGF2, FGF-2 и инсулин, действуя совместно, могут подавлять гипертрофию фетальных хондроцитов (Szuts et al., 1998), а по нашим данным, изложенным выше, активное расщепление коллагена и гипертрофия хондроцитов являются ключевыми компонентами развития ОА, мы предположили, что эти ростовые факторы могут подавлять усиленное расщепление коллагена 2 типа при ОА, если это расщепление связано с гипертрофией хондроцитов, как в ростковой пластинке.

Ингибирование коллагеназной активности ростовыми факторами Ростовые факторы TGF2 (10нг/мл), FGF-2 (10нг/мл) и инсулин (100нг/мл) по отдельности или в комбинации (GF), которую раньше использовали для подавления гипертрофии изолированных хондроцитов ростковой пластинки, были способны ингибировать расщепление коллагена 2 типа коллагеназой в культуре эксплантатов суставного хряща у 49 больных ОА. Детальное исследование пяти больных ОА приведено на рисунке 15.

Как видно из показателей уровня накопления эпитопа С1,2С в контрольных эксплантатах, коллагеназная активность у больных ОА варьировала. Степень ингибирования расщепления коллагена ростовыми факторами также различалась в исследованных образцах.

Так, средний показатель ингибирования коллагеназной активности при использовании комбинации ростовых факторов составил 56.5%, а индивидуальные ингибирования результаты варьировали от 45 до 70.3%.

Однако изучение вклада каждого ростового фактора по отдельности показало, что только TGF2 всегда ингибировал коллагеназную активность, как во всех пяти индивидуальных эксплантатах хрящей (Рис. 15), так и в 19 других эксплантатах (Рис.

16).

Анализ пяти индивидуальных случаев также показал, что средний уровень ингибирования посредством TGF2, равный 59.2% (вариабельность от 54.6 до 62.4%) соответствовал степени ингибирования ростовыми факторами в комбинации. TGFоказался более эффективен, чем инсулин (в среднем 48.5%;

вариабельность от 25.8 до 64.5%), который существенно ингибировал расщепление коллагена только в четырех из пяти культур эксплантатов. FGF-2 индивидуально ингибировал расщепление коллагена в среднем только на 26.5% (вариабельность от 0 до 61%) и только в двух эксплантатах из пяти.

а б Рис. 15. Ингибирование коллагеназной активности (а) и освобождения в среду общего протеогликана (GAG) (б) в эксплантатах хряща пяти больных ОА в присутствии ростовых факторов. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

Изменения экспрессии генов в эксплантатах хряща больных ОА под действием ростовых факторов Предварительные исследования экспрессии генов в образцах суставного хряща больных ОА, собранных непосредственно после операции по артропластике, показали, что экспрессия генов COL10A(р=0.04), маркера гипертрофии хондроцитов, а также генов, связанных с разрушением внеклеточного матрикса: ММР-13 (р=0.01) и ММР-9 (р=0.01) значительно превышает таковую у здоровых доноров (Рис. 17). Кроме того, у больных ОА наблюдалась экспрессия ММР-1 и TNFa, однако степень превышения экспрессии этих генов не удалось оценить количественно, поскольку они не экспрессировались в хряще здоровых людей. Повышенные уровни экспрессии этих генов сохранялись в эксплантатах хряща при его культивировании in vitro.

* # # Рис. 16. Ингибирование активности расщепления коллагена в эксплантатах хряща больных ОА в присутствии TGF2 (б) или смеси ростовых факторов (GF) (а). Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

Эксплантаты хряща шести больных ОА культивировали в присутствии TGF2 (10нг/мл) или без него для изучения экспрессии генов хондроцитами. Во всех шести случаях добавление ростового фактора значительно понижало активность расщепления коллагена эксплантатами хрящей. Результаты представлены на Рис. 18 и суммированы в Табл. 2.

2* 1* * C COL10A1 MMP13 MMPРис. 17. Относительная экспрессия генов, участвующих в деградации внеклеточного матрикса в хряще больных ОА (n=11) по сравнению со здоровыми донорами (n=10). Статистически значимые различия по сравнению с контролем (С) обозначены звездочками.

Результаты оценивали в рамках альтернативной системы: да – 1, нет- 0. Для резюмирования данных учитывали общее изменение экспрессии (понижение, повышение, отсутствие изменений или отсутствие экспрессии) либо в контроле, либо в присутствии TGF2 в каждый момент времени и для каждого пациента. Максимальное значение для каждого пациента по каждому гену было равно 3.

Общее возможное число вариантов –18 для трех временных точек и шести пациентов суммировалось. Анализ влияния TGF2 проводили в течение 48 ч., при этом изменения экспрессии генов регистрировали на 6, 24 и 48 ч.

Как видно из Табл. 2 и Рис. 18, экспрессия генов регистрировалась в большинстве случаев. Для всех исследованных генов за исключением PGE синтазы 1 (PGES-1), экспрессия которой обычно повышалась (в 16 из 18 образцов), TGF2 ингибировал экспрессию генов (10-18 из 18). Кроме PGES-1 наблюдалось слабое увеличение экспрессии также в случае PTHrP (4 из 18), который обладает способностью подавлять гипертрофию хондроцитов [Terkeltaub et al., 1998]. В небольшом числе случаев (обычно 0-3 из 18 для каждого гена) никаких изменений не наблюдалось. Так, TGF2 подавлял Относительная экспрессия 6ч. 24ч. 48ч. 6ч. 24ч. 48ч. 6ч. 24ч. 48ч.

Рис. 18. Экспрессия генов в эксплантатах хряща шести больных ОА при культивировании в присутствии или без TGF2.

Таблица 2.

Экспрессия генов при культивировании эксплантатов суставного хряща больных ОА в присутствии TGFИзменение экспрессии генов при культивировании с TGF-* Снижение Увеличение Отсутствие Отсутствие изменений экспрессии COL10A1 18 0 0 PTHrP 10 4 3 MMP-13 10 0 2 MMP-9 11 0 2 IL-1 15 0 1 TNF 11 0 0 PGES-1 0 16 2 Примечание. * Данные представляют результаты воздействия TGFдля всех эсплантатов во всех трех временных точках. Максимальное значение для каждого пациента равно 3, поэтому максимальное значение для шести пациентов равно 18.

экспрессию цитокинов IL-1 (15 из 18) и TNF (11 из 12, в образцах, где этот цитокин экспрессировался), а также ингибировал экспрессию маркеров дифференциации, а именно COL10A1 (28 из 18), ММР-(10 из 12 ) и ММР-9 (11 из 13).

Увеличение образования PGE2 под действием TGF Повышение экспрессии PGES-1 при действии TGF2 в тех же культурах, которые анализировали на экспрессию генов, сопровождалось увеличением освобождения PGE2 в культуральную среду (Рис. 19). При этом обработка этим ростовым фактором эксплантатов хряща больных ОА приводила к значительному увеличению содержания PGE2 в 4 из 6 исследуемых образцов.

PGE(пг/мг) Рис. 19. Освобождение PGE2, индуцированное TGF2, эксплантатами хряща больных ОА. Статистически значимые различия по сравнению с контролем (без TGF2) обозначены звездочками.

Способность малых доз простагландина Е2 подавлять разрушение коллагена и гипертрофию хондроцитров в эксплантатах суставного хряща больных ОА Воспаление индуцирует увеличение синтеза простагландинов (PG), зависимых от циклооксигеназы (СОХ) –2, которые сенсибилизируют периферические окончания носисепторов и вызывают ощущение боли [Luo et al., 2005]. Поэтому нестероидные противовоспалительные препараты и специфические СОХ-ингибиторы широко используются для подавления боли, поскольку ингибируют продукцию PG циклооксигеназой.

Между тем PGE2, генерируемый хондроцитами, как показано ранее, необходим для поддержания гомеостаза хряща [Amin et al., 1997], поскольку СОХ-2 экспрессируется в физиологических условиях в некоторых тканях и может оказывать противовоспалительное действие [Gilroy et al., 1999]. PGE2 может также выполнять протективные функции в хряще больных ОА, поскольку способен ингибировать экспрессию коллагеназы, индуцируемую IL-1 и стромелизином в фибробластах синовия, а также стимулировать синтез коллагена и протеогликана и пролиферацию хондроцитов [Lowe et al., 1996].

Более того, выше приведены данные о том, что ростовой фактор TGF2 cпособен подавлять гипертрофию хондроцитов, экспрессию коллагеназ, расщепление коллагена и экспрессию провоспалительных цитокинов в культуре эксплантатов суставных хрящей больных ОА.

Это сопровождалось повышением экспрессии PGES-1 и секрецией PGE2. Поэтому мы решили проверить, может ли PGE2 ингибировать разрушение коллагена в суставном хряще больных ОА.

Ингибирование коллагеназной активности в эксплантатах суставных хрящей больных ОА посредством PGE Предварительные исследования культур эксплантатов суставных хрящей больных ОА показали, что в культуральной среде в присутствии TGF2 в течение 16 дней обнаруживался PGE2 в концентрации от 4 до 125 пг/мл. Мы использовали эту информацию для выяснения, будет ли добавление PGE2 в сходных концентрациях влиять на расщепление коллагена 2 типа коллагеназой в эксплантатах хрящей 4 больных ОА. Оказалось, что экзогенный PGE2 в низких концентрациях 0.1-1пг/мл действительно подавлял расщепление коллагена у одного из 4 пациентов (Рис. 20).

Вместе с тем у 3 пациентов значительное подавление расщепления коллагена наблюдалось при 10пг/мл PGE2, а также в большинстве исследованных хрящей в когорте из 13 пациентов (Рис. 21).

В среднем ингибирование составляло 39.7% (вариабельность 33.549.8 %) при 10пг/мл PGE2, причем оно было также эффективно, как и ингибирование посредством TGF2 (40.1%; вариабельность 26.949.4 %). Интересно, что при более высоких концентрациях (0.1- PGE2(пг/мл) Рис. 20. Ингибирование активности расщепления коллагена PGE2 и TGF2 в эксплантатах хрящей больных ОА. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

PGEРис. 21. Ингибирование активности расщепления коллагена PGE2 в эксплантатах хрящей больных ОА. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочкой.

10нг/мл) ингибирования не наблюдалось, более того в одном случае наблюдали стимулирование расщепления коллагена.

Кроме того, мы наблюдали обратно-пропорциональную зависимость между концентрацией PGE2 в среде и активностью расщепления коллагена в контрольных культурах эксплантатов хряща больных ОА (r = - 0.507, P = 0.044) (Рис. 22).

PGE(пг/мл) Активность расщепления коллагена (пмоль/мг) Рис. 22. Влияние концентрации PGE2 на активность расщепления коллагена в контрольных культурах эксплантатов хряща больных ОА.

Изменение экспрессии генов в эксплантатах хрящей больных ОА в присутствии PGEПо сравнению с контролем эксплантаты хрящей пяти больных ОА, культивируемые в присутствии 10пг/мл PGE2, показали снижение экспрессии гена СОL10A1, связанного с гипертрофией хондроцитов, а также ММР-13 (Рис. 23). Экспрессия коллагеназы ММР-1 была также значительно ниже у 4 из 5 пациентов. Наиболее сильно ингибировались простагландином Е2 цитокины, причем экспрессия IL-1 и TNF в эксплантатах в ряде случаев полностью подавлялась в его присутствии. Между тем, экспрессия циклина В2, каспазы 3, TGF2, COX-2 и PGES-1 в присутствии 10пг/мл PGE2 существенно не изменялась.

К ММР СOL10A1 IL-1 MMP13 TNF Рис. 23 (слева). Влияние PGE2 на экспрессию генов в эксплантатах хряща больных ОА. К- контроль. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

Рис. 24 (справа). Влияние напроксена на активность расщепления коллагена эксплантатами хряща больных ОА в присутствии или без TGF2. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

Способность ингибитора циклооксигеназы противодействовать влиянию TGF 2 на расщепление коллагена Как известно, напроксен способен ингибировать СОХ-1 и –[Pairet et al., 1996]. Мы проверяли возможность того, что этот ингибитор может противодействовать влиянию TGF2 на расщепление коллагена. В 2-х из 3-х эксплантатов хряща при фармакологических [DiBattista et al., 1995] концентрациях в 5мкг/ мл и 10 мкг/мл напроксен противодействовал ингибированию расщепления коллагена, индуцированного TGF2 и только в одном случае этого эффекта не наблюдалось (Рис. 24). Между тем, в суперфармакологических концентрациях (30мкг/мл) этот ингибитор не был способен противодействовать ингибированию разрушения хряща посредством TGF2. Кроме того, в эксплантатах хряща, культивируемых исключительно с напроксеном, наблюдали значительное увеличение расщепления коллагена по сравнению с контролем у 2-х из 3-х пациентов при концентрации ингибитора мкг/мл.

Следовательно, PGE2 в концентрации значительно меньшей, чем наблюдается при воспалительном процессе, обладает хондропротективными свойствами, селективно подавляя расщепление коллагена и функционально связанную с ним гипертрофию суставных хондроцитов в хряще больных ОА. Поэтому избыточное подавление PGE2 в терапевтических целях будет благоприятствовать поддержанию патологических изменений хряща при ОА. Следовательно, дозирование препаратов для контроля воспаления не должно полностью блокировать синтез PGE2, оставляя его в необходимой концентрации для защиты суставного хряща.

ВЫВОДЫ 1. При воздействии неблагоприятных факторов хондроциты суставного хряща способны возобновить процесс дифференцировки, сходный с таковым у фетальных хондроцитов ростковой пластинки, одним из аспектов которой является резорбция хрящевого матрикса.

При этом именно эти процессы постэмбриональной дифференцировки суставных хондроцитов лежат в основе начальных процессов разрушения суставного хряща при остеоартрозе.

2.В ходе дифференцировки хондроцитов в ростковой пластинке наблюдается экспрессия разных групп генов: в верхней пролиферативной зоне усиливается экспрессия маркера пролиферации циклина В2, ростовых факторов, таких как трансформирующего ростового фактора бета 2 (TGF2), белка, родственного паратироидному гормону (PTHrP), ростового фактора фибробластов 2 (FGF-2), а также протеиназ внеклеточного матрикса ММР-13, -3, МТ1-ММР, катепсина К и их тканевых ингибиторов ТIМР-1, -2, -3; структурных компонентов матрикса коллагенов 2 и типов, аггрекана, гиалуронана (о последнем судили по уровню экспрессии гиалуронан синтазы 2 (НАS-2), декорина, фибромодулина, каспазы 3 и специфического транскрипционного фактора коллагена 2 типа (Sox 9).

3.В нижней пролиферативной зоне возрастает уровень экспрессии специфического транскрипционного фактора остеобластов Cbfa1, а также Sox 9, желатиназы ММР-9, тканевых ингибиторов металлопротеиназ - ТIМР-1 и -2, структурных компонентов матрикса коллагена 2 и 6 типов и фибромодулина.

4. В гипертрофной зоне экспрессируются маркер гипертрофии - коллаген 10 типа (COL10A1), каспаза 3 и ростовые факторы TGF1 и Ihh, которые не экспрессировались в пролиферативной зоне, а также происходит повышение экспрессии большинства ранее перечисленных генов протеиназ, их тканевых ингибиторов и структурных компонентов матрикса, за исключением PTHrP, FGF-2, коллагена 6 типа и декорина, наивысший уровень экспрессии которых наблюдался в верхней пролиферативной зоне ростковой пластинки.

5. Предикторами развития ОА-подобных изменений являются экспрессия факторов роста, связанных с зоной пролиферации хондроцитов ростковой пластинки, а именно PTHrP, FGF-2, TGF1/2, а также макромолекул матрикса COL2A1 и аггрекана как на соседних с повреждениями участках, так и на значительном расстоянии от центра повреждения.

6. При ОА-подобных повреждениях хряща, происходит повышение активности расщепления коллагена 2 типа, сопровождающееся повышением экспрессии коллагеназ ММР-1, -(МТ1-ММР), аггреканазы ADAMTS-5; цитокинов интерлейкинов1(IL-1) / и фактора некроза опухолей (TNF) ; а также увеличением экспрессии генов, связанных с гипертрофией хондроцитов COL10A1, MMP-13, MMP-9, Ihh и каспазы 3 в непосредственной близости от повреждений. Каспаза 3 и ADAMTS-экспрессируются исключительно в центре повреждения хрящевой ткани.

7. Усиление расщепления коллагена в локусах образования ранних повреждений хряща сопровождается не только усилением экспрессии генов, ответственных за разрушение матрикса, но и генов, связанных с конечной дифференцировкой хондроцитов в ростковой пластинке. Поэтому дифференцировка хондроцитов является ранним событием, связанным с повреждением хряща, которое происходит при ОА.

8. На неповрежденных участках хряща не наблюдается ни усиленного расщепления коллагена, ни избыточной экспрессии генов, связанных с различными фазами дифференцировки хондроцитов ростковой пластинки.

9. Совместным воздействием ростовых факторов, а именно TGF2, FGF-2 и инсулином, активность разрушения коллагена значительно ингибируется в эксплантатах суставного хряща больных ОА. TGFнаиболее эффективно предотвращает разрушение хряща. В суставных хондроцитах хрящей больных ОА подавление избыточного расщепления коллагена этими ростовыми факторами как в комбинации, так и исключительно TGF2 сопровождается уменьшением экспрессии генов, связанных с гипертрофией хондроцитов, а также увеличением экспрессии простагландин Е синтазы (PGES-1) и освобождением в среду простагландина Е(PGE2).

10. PGE2 при низкой концентрации также способен значительно подавлять расщепление коллагена, уменьшая при этом экспрессию ММР-13, ММР-1, цитокинов и маркера гипертрофии хондроцитов COL10A1. Тот факт, что напроксен, неспецифический ингибитор циклооксигеназы (СОХ) -1 и -2, способен противодействовать влиянию TGF2 в подавлении расщепления коллагена, свидетельствует о том, что PGE2 опосредует действие этого ростового фактора. PGE2 в концентрации значительно меньшей, чем при воспалительном процессе, обладает хондропротективными свойствами, селективно подавляя расщепление коллагена и функционально связанную с ним гипертрофию суставных хондроцитов в хряще больных ОА.

11. Дифференцировка хондроцитов предшествует разрушению коллагена в нормальном хряще при воздействии агентов, способных стимулировать коллагеназную активность. Одним из таких агентов является обнаруженный нами пептид коллагена 2 типа - CB12-2.

Пептид CB12-2 присутствует в значительных концентрациях в хряще больных ОА и обладает способностью увеличивать активность расщепления коллагена 2 типа коллагеназой.

12. В здоровом суставном хряще расщеплению коллагена в присутствии СВ12-2 предшествует увеличение пролиферативной активности хондроцитов, с последующей экспрессией генов терминальной дифференцировки хондроцитов и увеличением числа апоптозных клеток. Подавление экспрессии гипертрофного фенотипа суставных хондроцитов ростовыми факторами в сочетании с СВ12-предотвращает избыточное расщепление коллагена и ингибирует экспрессию протеиназ, цитокинов и белков, сопряженных с гипертрофией хондроцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕMЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Tchetina E.V., Wu W., Poole A.R. Collagens and collagenases expression in bovine growth plate // The Forth Annual Canadian Connective Tissue Conference (London, Canada): Abstracts, 1998. P. #01.

2. Tchetina E.V., Yasuda T., Poole A.R. Dual effects of type II collagen type II fragments on expression of chondrocyte genes associated with the synthesis and degradation of type II collagen // The Fifth Annual Canadian Connective Tissue Conference (Montreal, Canada): Abstracts, 1999. P. #64.

3. Kobayashi M., Yasuda T., Kojima T., Tchetina E.V., Feige U., Poole A.R. A peptide of type II collagen induces collagenase cleavage of type II collagen through interleukin-1 and tumour necrosis factor-dependent pathways in human articular cartilage // Annual Scientific Meeting of American College of Rheumatology (Philadelphia, USA): Arthritis and Rheumatism, 2000. Vol. 43.

P. S91.

4. Kobayashi M., Kojima T., Tchetina E.V., Poole A.R. A type II collagen fragment can induce type II collagen degradation through an IL-1-mediated pathway in explant cultures of human articular cartilage // The Sixth Annual Canadian Connective Tissue Conference (Quebec, Canada): Abstracts, 2000.

P. #7.

5. Tchetina E.V., Kobayashi M., Yasuda T., Poole A.R. Collagen type II fragments and chondrocyte differentiation // The Sixth Annual Canadian Connective Tissue Conference (Quebec, Canada): Abstracts, 2000. P. #37.

6. Wu W., Mwale F., Tchetina E., Kojima T., Yasuda T., Poole A.R. Cartilage matrix resorption in skeletogenesis. In: “The molecular basis of skeletogenesis” // Novartis Foundation Symposium. - John Wiley and Sons Ltd. (Chichester, UK), 2000. Vol. 232. P.158-170.

7. Mwale M., Tchetina E.V., Poole A.R. Upregulation of gene expression associated with chondrocyte differentiation and changes in matrix composition in the growth plate // The Sixth Annual Canadian Connective Tissue Conference (Quebec, Canada): Abstracts, 2000. P. #2.

8. Kobayashi M., Yasuda T., Kojima T., Tchetina E.V., Sakai T., Feige U., Poole A.R. A synthetic peptide of type II collagen upregulates collagenase expression and induces type II collagen cleavage by collagenases via IL-1 and TNFdependent pathways in human articular cartilage // Annual Scientific Meeting of American College of Rheumatology (San Francisco, USA): Abstracts.

Arthritis and Rheumatism, 2001. Vol. 44. P. S108.

9. Kobayashi M, Yasuda T., Kojima T., Tchetina E., Feige U., Poole A.R. A synthetic peptide of type II collagen can cause type II collagen cleavage by collagenase through IL-1- and TNF-dependent pathways in human articular cartilage // 47th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (San Francisco, USA): Transactions, 2001. Vol. 26. P. #0580.

10. Kojima T., Tchetina E.V., Ionescue M., Reigner A., Poole A.R. Comparative study of sequential cleavage of molecules that form collagen fibrils in articular cartilage // 47th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (San Francisco, USA): Transactions, 2001. Vol. 26. P. #0453.

11. Kobayashi M., Tchetina E.V., Feige U., Poole A.R. Soluble TNF-R1 and IL1ra can inhibit resorption of collagen and proteoglycan in human osteoarthritic cartilage // The Seventh Annual Canadian Connective Tissue Conference (Toronto, Canada): Abstracts, 2001. P. #11.

12. Kobayashi M., Tchetina E.V., Tanzer M., Zukor D.J., Antoniou J., Feige U., Poole A.R. Tumor necrosis factor- and interleukin-1 are required for matrix degradation in human osteoarthritic articular cartilage // Annual Scientific Meeting of American College of Rheumatology (San Francisco, USA):

Abstracts. Arthritis and Rheumatism, 2001. Vol. 44. P. S62.

13. Tchetina E.V., Kobayashi M., Feige U., Poole A.R. A peptide of type II collagen induces chondrocyte hypertrophy and type II collagen cleavage by collagenase // Annual Scientific Meeting of American College of Rheumatology (New Orleans, USA): Abstracts. Arthritis and Rheumatism, 2002. Vol.46. Suppl. P. S80.

14. Kobayashi M., Yasuda T., Kojima T., Tchetina E.V., Sakai T., Feige U., Poole A.R. A synthetic peptide of type II collagen induces upregulation of collagenase expression and type II collagen cleavage by collagenases through IL-1 and TNF pathways in human articular cartilage // 48th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (Dallas, USA):Transactions, 2002. Vol. 27.

P. 422.

15. Tchetina E.V., Kobayashi M., Yasuda Y., Poole A.R. Increased collagen degradation is associated with the upregulation of chondrocyte differentiation related genes in articular cartilage explants induced by a type II collagen peptide // 24TH Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research (San Antonio, USA): Abstracts. Journal of Bone and Mineral Research, 2002. Vol. 17. Suppl. 1. P. S404.

16. Tchetina E.V., Webb G., Poole A.R. Increased collagen degradation in association with the upregulation of chondrocyte differentiation related genes in age-related osteoarthritis-like focal human articular cartilage lesions // The Eighth Canadian Connective Tissue Conference (Sherbrooke, Canada):

Abstracts, 2002. P. #2.

17. Wu C.W., Tchetina E.V., Mwale F., Hasty K., Pidoux I., Reiner A., Chen J., Van Wart H.E., Poole A.R. Proteolysis involving MMP-13 (Collagenase-3) is required for chondrocyte differentiation and matrix mineralization // Journal of Bone and Mineral Research, 2002. Vol. 17. P. 639-651.

18. Mwale F., Tchetina E., Wu W., Poole A.R. The assembly and remodelling of the extracellular matrix in the growth plate in relationship to mineral deposition and cellular hypertrophy: an in situ study of collagens type II and IX and proteoglycan // J Bone Miner Res, 2002. Vol. 17. P. 275-283.

19. Poole A.R., Kobayashi M., Yasuda T., Laverty S., Mwale F., Kojima T., Sakai T., Wahl C., El-Maadawy S., Webb G., Tchetina E.V., Wu W. Type II collagen degradation and its regulation in articular cartilage in osteoarthritis // Annals of Rheumatic Diseases, 2002. Suppl. II. P. ii78-ii81.

20. Kobayashi M, Tchetina E.V., Tanzer M., Zukor D.J., Antoniou J., Feige U., Poole A.R. Tumour necrosis factor and interleukin-1 are involved in matrix degradation of human osteoathritic articular cartilage // 48th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (Dallas, USA):Transactions, 2002. Vol. 27.

P.155.

21. Tchetina E.V., Poole A.R. A peptide of type II collagen accelerates differentiation of bovine growth plate chondrocytes: implication to osteoarthritis // Canadian Arthritis Network Annual Conference (Montreal, Canada): Abstracts, 2003. P. 15.

22. Tchetina E.V., Mwale F., Poole A.R. Distinct phases of coordinated early and late gene expression in growth plate chondrocytes in relationship to cell proliferation, matrix assembly, remodelling and cell differentiation // Journal of Bone and Mineral Research, 2003. Vol. 18. P. 844-851.

23. Tchetina E.V., Poole A.R. Growth factors capable of suppressing chondrocyte hypertrophy arrest collagen cleavage in human osteoarthritic cartilage //The IXth Annual Canadian Connective Tissue Conference and 1st CIHR Skeletal Health training Conference: Montreal, Canada, 2003. P. 6.

24. Tchetina E.V., Webb G., Poole A.R. Increased collagen degradation is associated with the upregulation of chondrocyte differentiation in age-related osteoarthritis-like focal human articular cartilage lesions // OARSI, World Congress on Osteoarthritis (Berlin, Germany). Osteoarthritis and Cartilage, 2003. Suppl. A. P. S13.

25. Poole A.R., Nelson F., Dahlberg L., Tchetina E.V., Kobayashi M., Yasuda T., Laverty S., Squires G., Kojima T., Wu W., Billinghurst R.C. Proteolysis of the collagen fibril in osteoarthritis. Invited review article: Biochemical Society Annual Symposium: Proteases and the Regulation of Biological Processes.

Biochemical Society Symposia, 2003. Vol. 70. P. 115-123.

26. Tchetina E.V., Poole A.R. Growth factors capable of suppressing chondrocyte hypertrophy arrest collagen cleavage in human osteoarthritic cartilage // 26TH Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research, (Seattle, USA): Abstracts. Journal of Bone and Mineral Research, 2004. Vol.

19. Suppl. 1. P. S348.

27. Tchetina E.V., Webb G., Poole A.R. Increased type II collagen degradation and very early focal cartilage degeneration is associated with upregulation of chondrocyte differentiation related genes in early human articular cartilage lesions // Journal of Rheumatology, 2005. Vol. 38. P. 876-886.

28. Yasuda T., Tchetina E.V. (joint first author), Ohsawa K., Roughley P., Wu W., Mousa A., Ionescu M., Poole A.R. Peptides of type II collagen can induce the cleavage of type II collagen and aggrecan in articular cartilage // Matrix Biology, 2006. Vol. 25. P. 419-429.

29. Tchetina E.V., Antoniou J., Tanzer M., Zukor D.J., Poole A.R. TGFbetasuppresses collagen cleavage in cultured human osteoarthritic cartilage, reduces expression of genes associated with chondrocyte hypertrophy and degradation, and increases prostaglandin E2 production // American Journal of Pathology, 2006. Vol. 168. P.131-140.

30. Tchetina E.V., Kobayashi M., Yasuda T., Meijers T., Pidoux I., Poole A.R.

Chondrocyte hypertrophy can be induced by a cryptic sequence of type II collagen and is accompanied by the induction of MMP-13 and collagenase activity: implications for development and arthritis // Matrix Biology, 2007.

Vol. 26. P. 247-258.

31. Tchetina E.V., Di Battista J.A., Zukor D.L., Poole A.R. Prostaglandin Esuppresses collagen cleavage in cultured human osteoarthritic cartilage, involves a reduction in expression of proinflammatory cytokines and those associated with chondrocyte hypertrophy // Arthritis Research and Therapy, 2007. Vol. 9. P. R75.

32. Четина Е.В., Пул А.Р. Пул Роль ростовых факторов в подавлении разрушения коллагена и дифференциации хондроцитов при остеоартрозе // Bестник РАМН, 2008. №5. С. 15-21.

33. Четина Е.В., Пул А.Р. Способность фрагмента коллагена 2 типа индуцировать расщепление коллагена и гипертрофию суставных хондроцитов // Bестник РАМН, 2008. №9. С.40-45.

34. Четина Е.В., Пул А.Р. Признаки дифференциации хондроцитов при формировании ранних повреждений хряща у пожилых людей // VIII конгресс Российского Артроскопического Общества: Тезисы докладов.

Москва, 2009. С. 87-88.

35. Четина Е.В., ДиБатиста Д., Пул А.Р. Простагландин Е2 в малых дозах способен подавить разрушение коллагена в эксплантатах ОА суставного хряща человека // VIII конгресс Российского Артроскопического Общества: Тезисы докладов. Москва, 2009. С. 87.

36. Четина Е.В.Роль эмбриональных механизмов в разрушении суставного хряща при остеоартрозе // Российский конгресс ASAMI: Тезисы докладов. Курган, 2009. С. 157.

37. Четина Е.В., Пул А.Р. Роль ростовых факторов в подавлении разрушения коллагена суставного хряща и дифференциации хондроцитов при остеоартрозе // VIII конгресс Российского Артроскопического Общества:

Тезисы докладов. Москва, 2009. С. 88-89.

38. Четина Е.В., ДиБатиста Д., Пул А.Р. Роль простагландина E2 в ингибировании разрушения коллагена суставного хряща больных остеоартрозом // Научно-практическая ревматология, 2009. №3. С. 18-24.

39. Четина Е.В. Роль дифференциации хондроцитов в разрушении коллагенового матрикса суставного хряща при остеоартрозе // VIII конгресс Российского Артроскопического Общества: Тезисы докладов.

Москва, 2009. С. 86.

40. Четина Е.В. Механизмы эмбриогенеза при остеоартрозе: роль дифференцировки хондроцитов в резорбции суставного хряща // Научнопрактическая ревматология, 2010. № 3. С. 65-77.

41. Четина Е.В., Семенова Л.А. Пептид коллагена 2 типа способен ускорять дифференцировку эмбриональных хондроцитов быка // Материалы X Конгресса Международной ассоциации морфологов «Функциональная морфология человека и животных». Ярославль. Морфология, 2010. № 4.

С. 211-212.

42. Четина Е.В. Индукция расщепления коллагена под действием коллагенового пептида в хряще здоровых людей сопровождается активацией металлопротеиназ матрикса и дифференцировкой хондроцитов // Научно-практическая ревматология, 2010. № 5. С. 47-53.

43. Четина Е.В. Формировании ранних повреждений хряща у пожилых людей сопровождается дифференцировкой суставных хондроцитов // Материалы III Российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека». - Санкт-Петербург. – Профилактическая и клиническая медицина, 2010. Специальный выпуск.

С. 401-402.

44. Четина Е.В. Участие дифференцировки хондроцитов в разрушении коллагена суставного хряща при остеоартрозе // Материалы III Российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека». Санкт-Петербург. Профилактическая и клиническая медицина, 2010. Специальный выпуск. С. 401.

45. Четина Е.В. Пептид коллагена 2 типа способен ускорять дифференцировку эмбриональных хондроцитов: взаимосвязь с резорбцией матрикса суставного хряща при остеоартрозе // Научнопрактическая ревматология, 2010. № 6. С. 33-39.

46. Четина Е.В. Признаки дифференцировки хондроцитов при формировании ранних повреждений хряща у пожилых людей // Научнопрактическая ревматология, 2011. № 1. C. 35-44.

47. Tchetina E.V. Developmental mechanisms in articular cartilage degradation in osteoarthritis // Arthritis (Hindawi), 2011. V. 2011. P.1-16.

URL: http://www.hindawi.com/journals/arth/2011/683970/ С П И С О К С О К Р А Щ Е Н И Й ВКМ внеклеточный матрикс ОA остеоартроз РП ростковая пластинка ADAMTS-TS дезинтегрин и металлопротеиназа-1 с тромбоспондиновым мотивом C2C (COL2-3/4Clong) первичный неоэпитоп, генерируемый только в коллагене 2 типа при расщеплении коллагеназой C1,2C (COL2-3/4C) карбокси-терминальный нео-эпитоп, образуемый при расщеплении коллагена 1 и 2 типов коллагеназой СOL2-3/4m эпитоп, расположенный внутри цепи в домене тройной спирали коллагена СВ12 один из фрагментов коллагена 2 типа, образующийся в результате его расщепления бромистым цианидом СВ12-1,2,3,4 пептиды, синтезированные на основе нуклеотидной последовательности фрагмента СВ12 коллагена 2 типа CNBr цианистый бромид COL10A1 альфа 1 цепь коллагена 10 (Х) типа COL2A1 альфа 1 цепь коллагена 2 типа COX циклооксигеназа FGF-2 (bFGF) основной ростовой фактор фибробластов GAG гликозаминогликаны GAPDH глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа GF смесь ростовых факторов TGF2 (10нг/мл), FGF- (10нг/мл) и инсулин (100нг/мл) IGF инсулиновый ростовой фактора IL-1 / интерлейкин-1 / Ihh Indian hedgehog Ki67 антиген, который узнает циклин-зависимую киназу ММР металлопротеиназы матрикса PCNA ядерный антиген пролиферирующих клеток PGE2 простагландин Е PGES-1 простагландин синтаза PTHrP белок, родственный паратироидному гормону Runx2/Cbfa1 транскрипционный фактор, ответственный за дифференцировку остеобластов Sox9 транскрипционный фактор, ответственный за дифференцировку эмбриональных хондроцитов TGF трансформирующий ростовой фактор бета TIMP тканевый ингибитор металлопротеиназ TNF фактор некроза опухолей




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.