WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 





На правах рукописи









СОРОКИНА Ирина Васильевна








КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ КОРРЕКЦИИ

ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ПОЛИОРГАННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ

ТРИТЕРПЕНОИДАМИ КЛАССА ЛУПАНА

БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТОЙ И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫМИ





03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология

14.03.06 фармакология, клиническая фармакология





Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук













Новосибирск 2010

Работа выполнена в Новосибирском институте органической химии им. Н.Н.Ворожцова СО РАН и Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск)


Научные консультанты:


доктор биологических наук,

профессор                                                Толстикова Татьяна Генриховна

доктор биологических наук,

профессор                                                Лушникова Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:


академик РАМН,

доктор биологических наук, профессор                Ляхович Вячеслав Валентинович

доктор биологических наук, профессор                Айдагулова Светлана Владимировна

доктор биологических наук, профессор                Плотников Марк Борисович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава.



Защита диссертации состоится «_____» ______________ 2010 г. в _____ час. на заседании диссертационного совета Д 001.037.01 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

Автореферат диссертации разослан « _______ » ________________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.037.01

доктор биологических наук                                                Молодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы. Совершенствование схем полихимиотерапии злокачественных опухолей является одной из актуальных проблем практической онкологии. Наряду с разработкой препаратов, обладающих высокой цитостатической активностью, в последнее время также развивается направление, связанное с поиском агентов – модификаторов биологических реакций, повышающих переносимость традиционной противоопухолевой терапии. (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Трещалина Е.М., 2005; Pucheault M., 2008). Основными требованиями к агенту-кандидату являются низкая токсичность, отсутствие стимулирующего влияние на опухоль и ее метастазы, усиление противоопухолевого иммунитета, повышение морфо-функционального статуса здоровых клеток и тканей.

Большинство применяемых в клинической практике препаратов-модификаторов является иммуномодуляторами белковой природы: БСЖ, препараты тимуса (Т-активин, тималин), полипептиды (бестатин, циклоспорин А), цитокины и факторы роста, стимуляторы гемопоэза (колониестимулирующие факторы) и др. Побочными эффектами данных биогенных стимуляторов являются нежелательные иммунологические реакции (выработка нейтрализующих антител, сенсибилизация), а также способность стимулировать в определенных условиях рост первичного узла или метастазов опухоли (Трещалина Е.М., 2005; Корман Д.Б., 2006). Этих недостатков лишены препараты растительного происхождения, обладающие противоопухолевыми и антиметастатическими свойствами. В лечении злокачественных новообразований показана высокая эффективность экстрактов шлемника байкальского, элеутерококка, подорожника, побегов и листьев облепихи и др. (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Амосова Е.Н. и др., 2003). Поскольку растительные соединения обычно обладают комплексной активностью (гепатопротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и иммуномодулирующей) и лучше переносятся организмом, то они остаются в фокусе внимания при отборе корректоров химиотерапии.

В настоящее время поиск перспективных растительных корректоров цитостатиков ведется среди соединений различных классов: алкалоидов, сапонинов, флавоноидов, кумаринов, полисахаридов, терпеноидов и др (Жанатаев А.К. и др., 2004; Разина Т.Г. и др., 2006). В этом ряду особое значение имеют пентациклические тритерпеноиды лупанового типа – легкодоступные вторичные растительные метаболиты. В экспериментах in vitro установлено, что бетулин, лупеол, бетулиновая кислота и их производные проявляют противовоспалительную, противоопухолевую, противовирусную, антимикробную активность (Chartulvedula V.P. et al., 2003; Mutai C. et al., 2004; Tolstikova T.G. et al., 2006). В опытах на животных было показано, что эти агенты могут использоваться для профилактики и лечения злокачественных опухолей. Уникальным свойством данных соединений является сочетание цитотоксического действия на опухолевые клетки и низкой токсичности в отношении нетрансформированных клеток (Eiznhamer D.A., Ze-Qi Hu, 2004; Chaturvedy P.K. et al., 2008). В настоящее время бетулиновая кислота проходит клинические испытания за рубежом в качестве препарата для профилактики и лечения меланомы и диспластического невуса (Fulda S. et al., 2009). Синтетические трансформации тритерпеноидов лупанового ряда рассматриваются как современный и перспективный подход к получению нового поколения препаратов с противоопухолевыми и химиопревентивными свойствами (Baglin I. et al., 2003, Cichewicz R.H., Kouzi S.A., 2004).

Другой многообещающей лупановой платформой можно считать бетулоновую кислоту (БК), получаемую путем одностадийного окисления бетулина. Несмотря на то, что БК является близким структурным аналогом бетулиновой, ее синтетические превращения и фармакологические свойства, в отличие от последней, до сих пор широко не изучены. По имеющимся данным, полученным на культурах опухолевых клеток человека (миеломы, лимфомы, карциномы молочной железы и яичника и др.), цитотоксическая активность БК в 2 – 19 раз выше, чем у бетулиновой (Ле Банг Шон и др., 2004; Шинтяпина Ф.Б. и др., 2008).

Результаты исследований, проведенных за последние 10 лет, выявили молекулярные мишени тритерпеноидных соединений в клетке, что позволило обосновать политаргетный механизм их действия. Показано, что взаимодействуя с белком KEAP1, тритерпеноиды активируют гены сигнального пути Nrf2, кодирующие семейство цитопротекторных белков, включая ферменты синтеза глутатиона, хинонредуктазу, каталазу, супероксиддисмутазу, гемоксигеназу, тиоредоксин, а также подавляют индукцию ЦОГ2 и NO-синтазы (Liby K.T. et al., 2007; Chaturvedy P.K. et al., 2008). Противовоспалительная активность агентов также связана с ингибированием белков сигнального пути NFB, регулирующего процессы воспаления, апоптоза и дифференцировки (Shishodia S. et al., 2006; Fulda S. et al., 2009). Противоопухолевое действие тритерпеноидов может реализовываться через индукцию ими внутреннего митохондриального пути апоптоза, не зависящего от внешнего, связанного с экспрессией р53 и CD95/FasL, что характерно для большинства противоопухолевых препаратов (Zarec J. et al., 2003; Eiznhamer D.A., Ze-Qi Hu, 2004). Последнее обстоятельство повышает интерес к тритерпеноидам, как агентам, способным преодолевать лекарственную устойчивость к традиционной химиотерапии. В доказательство этой способности в экспериментах на культурах опухолевых клеток был установлен синергический эффект бетулиновой кислоты с различными химиопрепаратами (доксорубицином, этопозидом, цисплатином, таксолом, актиномицином D), направленный на повышение апоптоза и подавление клоногенного окружения клеток опухоли (Fulda S. et al., 2005). Бетулиновая кислота также усиливает цитотоксический эффект винкристина на клетки меланомы (Sawada N. et al., 2005), повышает апоптотическую активность индуктора внешнего пути апоптоза TRAIL (Fulda S. et al., 2004).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что лупановые соединения могут потенциально являться эффективными средствами дополнительной противоопухолевой терапии. Однако до настоящего времени интересы исследователей фокусировались в основном на изучении противоопухолевой активности тритерпеноидов, в то время как их свойства как модификаторов биологических эффектов цитостатической химиотерапии оставались за рамками внимания. В частности, практически не исследовано протекторное действие лупанов в тканях животных на фоне цитотоксических полиорганных эффектов традиционных противоопухолевых препаратов. Отчасти это связано с тем, что основные результаты были получены в экспериментах на культурах клеток, в то время как системных исследований in vivo не проводилось.

Таким образом, актуальность изучения лупановых тритерпеноидов в качестве потенциальных модификаторов цитостатической химиотерапии не вызывает сомнений. Решение данной проблемы связано, прежде всего, с исследованием не изученных ранее клеточных механизмов протекторного действия тритерпеноидов в условиях полиорганных цитотоксических эффектов как индивидуальных противоопухолевых препаратов, так и  комбинированных схем полихимиотерапии.

Цель исследования – выявить среди тритерпеноидов ряда лупана соединения с комплексной протекторной и противоопухолевой активностью и изучить клеточные механизмы коррекции цитотоксических повреждений разных тканей при комбинированном и изолированном введении противоопухолевых препаратов, исследовать влияние лупановых тритерпеноидов на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатический полихимиотерапии.

Задачи исследования:

  1. Провести широкий скрининг фармакологических свойств соединений ряда лупана и выявить среди них агенты с гепатопротекторной, кардиопротекторной, нефропротекторной, антиоксидантной и противовоспалительной активностью. Изучить противоопухолевую активность и антиметастатический эффект лупановых тритерпеноидов.
  2. Изучить особенности морфологических изменений печени и миокарда при изолированном применении бетулоновой кислоты и ее производных и при их сочетаниях с цитостатиками (циклофосфамидом и доксорубицином).
  3. Изучить особенности внутриклеточной реорганизации гепатоцитов и кардиомиоцитов при изолированном применении бетулоновой кислоты и ее производных и при их сочетаниях с цитостатиками (циклофосфамидом и доксорубицином) с оценкой цитопротекторных и цитотоксических свойств исследуемых агентов.
  4. Изучить особенности коррекции бетулоновой кислотой и ее производными токсических эффектов полихимиотерапии СНОР у интактных животных
  5. Изучить характер влияния отобранных соединений на морфологию и лейкоцитарный профиль периферической крови, клеточный состав костного мозга, уровень перекисного окисления липидов в условиях полихимиотерапии СНОР у животных с перевиваемыми опухолями.
  6. Установить характер морфологических изменений печени и почек в условиях комбинированного воздействия цитостатической полихимиотерапии СНОР и лупановых тритерпеноидов.
  7. Оценить влияние различных лупановых тритерпеноидов на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатической полихимиотерапии СНОР у мышей с перевиваемыми опухолями – карциномой легких Льюис и злокачественной лимфомой RLS, резистентной к циклофосфамиду.

Научная новизна. Впервые в результате комплексного морфологического исследования изучен характер модифицирующего влияния бетулоновой кислоты и ее производных  на действие цитостатических препаратов в различных тканях интактных животных и у животных с перевиваемыми опухолями. Впервые установлены in vivo фармакологические свойства широкого спектра лупановых соединений. Выделены наиболее эффективные тритерпеноидные агенты для включения их в схемы противоопухолевой терапии.

Впервые установлены особенности ремоделирования печени, сердца и почек, отражающие коррекцию тритерпеноидами повреждений, вызванных противоопухолевыми препаратами. Показано, что применение тритерпеноидов после моделирования противоопухолевой химиотерапии способствует снижению выраженности дистрофических и некробиотических изменений паренхиматозных клеток без значимого влияния на цитостатические свойства противоопухолевых препаратов.

Впервые выявлены особенности ультраструктурной перестройки основных внутриклеточных компартментов гепатоцитов и кардиомиоцитов под действием цитостатиков и тритерпеноидов. Показано, что бетулоновая кислота и ее -аланиламид при изолированном введении интактным животным оказывают одновременно умеренное цитотоксическое и стимулирующее действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусоидов, клетки Купфера) и миокарда (кардиомиоциты, эндотелиоциты). Впервые исследованы общецитологические особенности цитопротекторных и цитотоксических эффектов бетулоновой кислоты и ее -аланиламида, представлены их ультраструктурные эквиваленты.

Впервые показано, что бетулоновая кислота и ее -аланиламид, вводимые на фоне цитостатиков (циклофосфамида и доксорубицина), проявляют политаргетное действие на клеточные популяции печени и миокарда, потенцируя цитотоксическое действие цитостатиков в отношении одних клеток и стимулируя регенераторные реакции – в других. Восстановление ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов при комбинированном применении цитостатиков и тритерпеноидов происходит быстрее. Установлено, что оба тритерпеноида не ингибируют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов.

Получены доказательства иммуномодулирующей и противовоспалительной активности аланиламидов бетулоновой кислоты, лежащей в основе их системных эффектов и клеточных механизмов коррекции цитотоксического воздействия. Впервые проведено комплексное исследование протекторных свойств широкого ряда новых соединений лупанового типа, позволившее выявить перспективные агенты с антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.

Теоретическая и практическая значимость. Впервые получены фундаментальные знания о фармакологической активности нового класса корректоров токсических эффектов цитостатической химиотерапии. Получены новые знания о характере тканевой и внутриклеточной реорганизации печени, почек, сердца и тимуса в условиях комбинированного и изолированного действия цитостатических противоопухолевых препаратов и тритерпеноидов лупанового типа.

Показана высокая перспективность бетулоновой кислоты как новой тритерпеноидной платформы для получения агентов с широким спектром фармакологической активности. На основании результатов исследования 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионо­вая кислота рекомендована для доклинических испытаний в качестве препарата-модифи­катора цитостатической полихимиотерапии. Результаты исследования и методические подходы, разработанные в диссертации, могут быть использованы при подготовке материалов доклинических испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Тритерпеноиды лупанового ряда – новый класс модификаторов биологических реакций, оказывающих антиоксидантное, противовоспалительное и цитопротекторное действие при токсическом и лекарственном поражении. Аланиламидные производные бетулоновой кислоты в условиях цитостатической гемодепрессии модулируют содержание нейтрофилов и мононуклеаров в периферической крови.
  2. К общецитологическим цитопротекторным свойствам бетулоновой кислоты и ее -аланиламида как при изолированном, так и комбинированным с цитостатиками применении относится их способность усиливать эндоцитозную (пиноцитозную) активность клеток и стимулировать в них процессы внутриклеточной регенерации. Оба агента не подавляют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов.
  3. К общецитологическим цитотоксическим свойствам обоих тритерпеноидов относится их способность вызывать умеренные литические изменения цитоплазматического матрикса, деструктивные изменения органелл и усиление аутофагических процессов. При комбинированном применении с цитостатиками бетулоновая кислота и ее производные способствуют более быстрому восстановлению ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов, уменьшают степень выраженности дистрофических изменений эпителиоцитов почечных канальцев.
  4. Введение БК и ее производных мышам-опухоленосителям понижает интенсивность перекисного окисления липидов и повышает противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии СНОР. В то же время бетулоновая кислота и ее -аланил­амид уменьшают выраженность дистрофических и некробиотических изменений гепатоцитов, обусловленных неопластическим процессом и полихимиотерапией.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на 2-м съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), XII Международной конференции «Медицина XXI века» (Словакия, Низкие Татры, 2004), Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов, 2004), Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 2004), Научно-практической конференции с международным. участием «Медицина и образование в XXI веке» (Новосибирск, 2004), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально значимых заболеваниях» (Новосибирск, 2004), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), Научной конференции «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005), III Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), III International Сonference «Basic science for Medicine» (Novosibirsk, 2007), III Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), II Международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Казахстан, Алматы, 2007), EHRLICH II, 2nd World Conference on Magic Bullets (Nurnberg, Germany, 2008), 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current issue of natural products chemistry and biotechnology» (Novosibirsk, 2010), ученом совете в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 64 работы, из них 21 – в рецензируемых журналах по списку ВАК, получено 6 патентов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 232 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 5 глав с результатами собственных исследований, обсуждения, выводов; иллюстрирована 33 таблицами, 56 микрофотографиями. Список использованной литературы включает 348 работ отечественных и иностранных авторов.

Материал и методы ИССЛЕДОВАНИЯ


Исследуемыми соединениями были 44 впервые синтезированных тритерпеноидов ряда лупана, в том числе 4 производных бетулина, 2 – лупеола и 38 – бетулоновой кислоты (БК). Соединения были получены из нескольких научно-исследовательских институтов Сибирского и Уральского отделений РАН. Все агенты вводили животным в виде взвеси в воде с Твином-80, готовившейся непосредственно перед экспериментом.

Эксперименты проводили на беспородных мышах (1844 особей) и крысах линии Вистар обоего пола (360 особей), а также мышах-самцах СВА/Lac (300 особей) и самках C57BL/6 (460 особей) (табл. 1), полученных из лаборатории разведения лабораторных животных Института цитологии и генетики СО РАН.

Таблица 1. Общая характеристика экспериментальных групп

Этапы и цели исследования

Вид животных

Количество животных

Скрининг антиоксидантной, гепатопротекторной, противовоспалительной и противоопухолевой активности лупановых соединений

Мыши:

беспородные СВА/Lac

C57BL/6

1844

140

220

Исследование клеточных механизмов действия производных бетулоновой кислоты в различных тканях на фоне изолированного и комбинированного введения противоопухолевых препаратов интактным животным

Крысы Вистар

360

Оценка корректорного действия тритерпеноидов и их влияния на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатической полихимиотерапии перевиваемых опухолей

Мыши:

СВА/Lac

C57BL/6

160

240


Во время опытов животных содержали в условиях естественного освещения, они получали гранулированный корм ПК120-1 (Лабораторснаб, Москва) и воду ad libitum. Все манипуляции выполняли в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Животных выводили из опыта декапитацией под легким эфирным наркозом.

Экспериментальные модели и скрининг гепатопротекторных, антиоксидантных, противовоспалительных и противоопухолевых свойств. При скрининге синтезированных соединений использовали модели и схемы введения, рекомендованные для проведения доклинических исследований (Руководство …, 2005).

Модель CCl4-индуцированного поражения печени. Беспородным мышам однократно вводили в желудок 25% раствор CCl4 в подсолнечном масле. Испытуемые соединения вводили однократно внутрижелудочно в виде водно-твиновой взвеси в дозах 20, 50, или 100 мг/кг за 1 ч до токсического воздействия. В качестве референсного соединения использовали известный антиоксидант дигидрокверцетин [(2R,3R)-3,5,7,3’,4’-пентагидрок­сифлаванон] (99% чистоты), который вводили в желудок в эффективной дозе 100 мг/кг. Контрольные животные получали водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме. Гепатопротекторные свойства оценивали через сутки по снижению в сыворотке крови активности трансаминаз (АЛТ и АСТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) с использованием стандартных наборов реактивов («Biocon», «Olvex Diagnosticum»). Антиоксидантный эффект определяли у этих же животных по уменьшению в крови концентрации ТБК-активных соединений (ТБКАС), согласно общепринятой методике (Камышников В.С., 2000).

Модели индуцированного воспаления. Воспалительный отек вызывали у мышей введением в апоневроз задней лапы водного раствора флогогена (1,5% каррагенина или 0,1% гистамина) в объеме 0,05 мл. Тестируемые соединения вводили внутрижелудочно в виде водно-твиновой взвеси за 1 ч до введения флогогена. Референсными препаратами были субстанции индометацина («Fluka») и ибупрофена («ICN Farmaceutical») в дозах 20 мг/кг. Контрольным животным вводили эквивалентное количество воды с твином. Через 5 ч после введения флогогена животных умерщвляли путем кранио-цервикальной дислокации и определяли массу обеих задних лап ниже голеностопного сустава с отеком и без него. Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению индекса отека у животных опытных групп по сравнению с контролем. Индексы воспаления рассчитывали как отношение разности здоровой и воспаленной лапы к массе здоровой, выраженной в процентах.

Модель экспериментальной полихимиотерапии. Применяли классическую схему СНОР, адаптированную для лабораторных животных (Каледин В.И. и др., 2000; Мишенина С.В. и др., 2002). Однократно парентерально вводили комплекс цитостатических препаратов в дозах, составляющих 1/5 от ЛД50 соответственно для мышей и крыс: циклофосфан («Биохимик», Саранск) – 50 и 21 мг/кг; доксорубицин – («ЛЭНС-Фарм», Москва) – 4,0 и 2,1 мг/кг; винкристин («Гидеон Рихтер», Венгрия) – 0,1 и 0,04 мг/кг; преднизолон («Гидеон Рихтер», Венгрия) – 5,0 и 2,1 мг/кг. Контрольным животным вводили эквивалентное количество физиологического раствора.

Методы перевивки и характеристика опухолевых штаммов. Для перевивки использовали штаммы опухолей с разной степенью злокачественности и чувствительности к циклофосфану. Весь перевивочный материал был получен из банка опухолей лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН. Использовали следующие штаммы опухолей:

- карциному легких Льюис (LLC), возникающую спонтанно у мышей линии С57Bl/6, растущую в виде солидного узла и метастазирующую гематогенно в легкие практически в 100% случаев (Козлов А.М., Софьина З.П., 1978). Перевивали внутримышечно в бедро задней лапы по 1 – 6х106 опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора;

- лимфому LS – первично индуцированную у мышей СВА/Lac нитрозометилмочевиной, растущую в виде солидного узла, склонную к спонтанной регрессии (Каледин И.И., 2002). Перевивали внутримышечно в бедро задней лапы по 1х106 опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора;

- лимфому RLS – субштамм лимфомы LS, возникший у мышей СВА/Lac в результате многочисленных пассажей на фоне введения повышающихся доз циклофосфана. Характеризуется агрессивным течением и устойчивостью к циклофосфану, спонтанной регрессии не подвергается, метастазирует гематогенно в печень и почки. Перевивали внутримышечно в бедро задней лапы по 1х105 опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора;

- асцитную опухоль Эрлиха перевивали беспородным мышам внутрибрюшинно по 0,2 мл асцита в разведении 1:10.

Лупановые тритерпеноиды вводили на разных стадиях развития опухоли: на фоне сформированного первичного узла или через 48 ч после перевивки. В первом случае применяли режимы однократного введения (внутрижелудочно – 500 мг/кг, внутрибрюшинно – 250 мг/кг) либо курсового (ежедневно по 50 мг/кг течение 8 дней). Во втором случае использовали курсовой режим введения и референсный препарат циклофосфан в дозах 100 и 40 мг/кг внутрибрюшинно. Критерием противоопухолевого эффекта было уменьшение объемов опухоли по отношению к контролю, которые измеряли в период от начала ее визуализации до наступления массовой гибели животных в группе.

Исследование особенностей и механизмов политаргетного действия тритерпеноидов в условиях изолированного и комбинированного введения противоопухолевых препаратов интактным животным. Эксперименты проводили в трех независимых сериях. Цитотоксическое воздействие моделировали: 1) однократным парентеральным введением интактным крысам комбинации циклофосфана (ЦФ), доксорубицина (ДОК), винкристина и преднизолона по схеме СНОР; 2) однократным внутрибрюшинным введением ЦФ в дозе 125 мг/кг; 3) однократным внутрибрюшинным введением ДОК в дозе 7 мг/кг. Дозы препаратов в двух последних сериях выбирали с учетом оптимальной выраженности основного побочного действия для каждого цитостатика (Гольдберг Е.Д. и др., 1999, 2000).

Тритерпеноидные соединения вводили внутрь через сутки после цитотоксического воздействия в дозе 50 мг/кг в течение 13 дней. Состояние животных исследовали по следующим показателям: динамике массы тела, картине периферической крови, лейкоцитарной формуле, биохимическому профилю крови, клеточному составу костного мозга, массе основных паренхиматозных органов. В каждой серии экспериментов с помощью светооптических методов проводили морфологическое исследование органов-мишеней, преимущественно поражаемых цитостатиками: для СНОР – печени, почек, тимуса; для ЦФ – печени, сердца; для ДОК – сердца, печени. Обследование животных проводили дважды: в период максимальной выраженности токсического эффекта цитостатиков (4 – 5-й дни после введения) и после окончания введения тритерпеноидов (14 – 15-й дни).

Оценка действия тритерпеноидов и их влияния на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатической полихимиотерапии животных с перевиваемымыми опухолями. Полихимиотерапию СНОР проводили у мышей с перевиваемыми опухолями LLC и RLS соответственно на 10-й и 5-й дни после перевивки. Изучаемые соединения вводили через сутки после цитостатиков внутрижелудочно в курсовом режиме в дозе 50 мг/кг течение 8 дней. Референсной группе мышей проводили только полихимиотерпию. Контролем была группа животных с опухолью, которые получали внутрь водно-твиновую взвесь. В период введения агентов оценивали их влияние на рост опухоли путем измерения объема опухолевых узлов штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях. Противоопухолевый эффект определяли по величине индекса торможения роста опухоли (ТРО), который рассчитывали как отношение разности средних объемов опухолей в контрольной и опытной группах к ее среднему объему в контроле.

По окончании введения соединений у животных исследовали периферическую кровь с использованием проточного гемоанализатора («Медоник Оден», Швеция). В мазках крови, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали лейкоцитарную формулу. В сыворотке крови определяли активности трансаминаз (АЛТ, АСТ) и вторичные продукты окисления (ТБАС). Для цитологического исследования брали костный мозг, для морфологического анализа и определения степени метастатического поражения брали образцы легких, печени и почек.

Методы морфологического исследования. Для светооптического исследования органы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, а затем подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе Микром («Zeiss», Германия). Для заливки в блоки использовали гистопласт. Срезы толщиной 4 – 5 мкм готовили на ротационном микротоме той же фирмы. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по методу PAS – гематоксилин – оранжевый G. Препараты исследовали в световых микроскопах Axioscop 2 plus и «Leica DM 4000B» (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровых фотокамер «Leica DFC 320» (Германия) и обрабатывали с помощью компьютерных программ «Leica QWin V3» и AxioVision.

Для электронно-микроскопического исследования брали образцы миокарда и печени размерами не более 1 мм3, которые первоначально фиксировали в 4% растворе параформальдегида, постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. После обезвоживания в серии спиртов возрастающей концентрации образцы печени заливались в смесь эпона и аралдита. Полутонкие (1 мкм) и ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-III. Полутонкие срезы окрашивали 1% раствором азура II. Полутонкие срезы использовали для морфологического описания, морфометрического и стереологического анализа. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Исследование проводили в электронном микроскопе JEM-1400 (фирмы «Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Veleta и программного обеспечения iTEM (фирма «Olympus», Япония, Германия).

Тканевый стереологический анализ проводили с помощью сетки из 289 точек (Автандилов Г.Г., 1990). В печени подсчитывали объемную плотность (Vv) зон с дистрофическими и некротическими изменениями гепатоцитов, объемную плотность синусоидов и клеток с двумя ядрами. В почках определяли объемную плотность нефроцитов с дистрофическими и некротическими поражениями, объемную плотность интерстициальной ткани и просветов канальцев. Объемную плотность каждого структурного компонента в тканях определяли по формуле: Vv = X/n, где X – количество точек, приходящееся на каждый структурный компонент, n – общее количество подсчитанных точек. Изменение объемной плотности в опытных группах выражали в процентах относительно контроля.

Оценка клеточного состава костного мозга. Приготовление мазка костного мозга для подсчета миелограмм проводили согласно рекомендациям (Гольдберг Е.Д. и др., 1992) с некоторыми модификациями. Костномозговой канал левой бедренной кости вскрывали со стороны эпифиза и 0,05 мл плазмы крови крыс осторожно ресуспендировали непосредственно в канале, переносили на обезжиренное стекло и делали мазок шлифованным стеклом. Окраску препаратов производили по Папенгейму (Наджимитдинов С.Т., 1969), подсчитывали в каждом случае 500 миелокариоцитов.

Подсчет метастатических поражений проводили путем морфометрического анализа срезов обеих долей легких у мышей с перевиваемой LLC, печени и почек у животных с RLS. Объемную плотность (Vv, %) метастазов подсчитывали по методу Г.Г.Автандилова (1990) с использованием окулярной сетки из 289 точек с помощью программы «Видео-Тест». Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ). Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (ЧМ) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ):

(Ак  х Вк ) – (А х В) х  100%,

(Ак  х Вк )

где Ак  – частота метастазирования в контрольной группе, А – частота метастазирования в опытной группе, Вк  – плотность метастазов у животных контрольной группы, В – плотность метастазов у животных опытной группы.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ «STATISTIKA 6,0». При оценке значимости различий применяли критерий Стьюдента, различия считались достоверными при р0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ


Скрининг гепатопротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной

и противоопухолевой активности

На модели CCl4-индуцированного поражения печени и индуцированного воспалительного отека лапы протестированы 44 тритерпеновых соединений лупанового типа, в том числе 4 производных бетулина, 2 – лупеола и 38 – бетулоновой кислоты (БК). Среди них выявлены агенты со значимыми гепатопротекторным, антиоксидантным и противовоспалительным свойствами. В ряду производных, синтезированных из БК, установлено, что наиболее высоким антицитолитическим эффектом, не уступающим дигидрокверцетину, обладают ее производные с аминокислотными фрагментами в положении С28 (-алаБК, Of-19, Ме--алаБК, Ме--алаБК) (табл. 2).

Таблица 2. Влияние тритерпеноидов на концентрацию маркеров цитолиза (АЛТ, АСТ), холестаза (ЩФ) и перекисного окисления липидов (ТБАС) в сыворотке крови мышей с CCl4 индуцированным поражением печени

Шифр агента

Химическое название агента

Доза, мг/кг

Биохимические показатели сыворотки крови (в % от контроля)

АЛТ

АСТ

ЩФ

ТБКАС

БК

Бетулоновая кислота

100

44,5**

41,6**

109,3

69,1**

50

51,3

69,1

96,0

-

Ме-БК

Метиловый эфир бетулоновой кислоты

50

60,4

102,5

87,2

97,1

-алаБК

2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота

50

66,2

97

103,7

44,1*

Ме--алаБК

Метиловый эфир 2-[3-оксо-20(29)-лу-пен-28-оиламино]-пропионовой кислоты

50

55,3*

71,6

85,6

71,0*

-алаБК

3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота

50

40,4*

63,9

112,8

92,6

Ме--алаБК

Метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лу-пен-28-оиламино]-пропионовой кислоты

50

49,7*

72,9

67,9*

87,3

Of-19

3-оксо-28-(О’-метил-L-изолейцино)кар-бонил-28-луп-20(29)-ен

100

48,6*

50,1*

101,0

79,8

Of-8

Метиловый эфир 2-фурфурилиден-бе-тулоновой кислоты

100

61,6*

64,8**

65,7*

88,6

Of-2

3-оксим бетулоновой кислоты

100

55,6*

56,2*

118,9

71,2**

Of-15

Метиловый эфир 3,20-диоксимино-29-норлуп-28-овой кислоты

50

41**

30**

97

20

74,0

80,2*

70,9*

56,8

Of-18

3,28-ди-О-ацетил-29-норлуп-20-оксим

50

84

101

-

34**

A-75

Нитроксил бетулоновой кислоты

50

57,0***

49,5**

103,8

119,2

ВГ-153

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-иода-нилин

20

56,2***

54,6*

59,1*

124,5

ВГ-157

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(N-пиперидинопропаргил-1)анилин

50

70,0*

61,1*

62,1*

65,0

ВГ-132

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(N-морфолинопропаргил-1)анилин

50

78,1

69,0

100,4

196,9*

ВГ 156

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(2-этинилпиридил)анилин

50

114,3

90,5

126,6

58,3*

ВГ-182

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(N,N-диэтиламинопропаргил-1-ин)анилин

50

88,0

102,1

73,7*

69,1*

ВГ-211

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(1-гексил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)анилин

20

118,9

85,2

92,7

66,1*

ВГ-216

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)анилин

20

124,6

75,9

81,4

58,4*

ВГ-263

N-3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(1-(4-ацетилфенил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)анилин

20

141,9

111,1

108,2

39,9**

ВГ-264

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(1-(4-метоксифенил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)анилин

20

195,2*

105,6

99,1

41,2***

Of-30

3,4-секо-3-нитрило-28-( N-карбонил-О`-метил-L-лейцин)-4(23),20(29)-лупандиен

100

50,4*

64,1*

120,8

89,1

Of-31

3,4-секо-3-нитрило-28-( N-карбонил-О`-метил- -аланин)-4(23),20(29)-лупандиен

100

39,8*

42,3**

79,0*

83,2

К

Контроль

-

100

100

100

100

ДКВ

Референс (дигидрокверцетин)

100

56,2

56,1

110,0

78,1

Достоверный эффект продемонстрировали также секо-производные (Of-30, Of-31) и бетулоны с метиловым (Ме-БК), диоксииминовым (Of-15), оксимным (Of-2), нитроксильным (А75), фурфурилиденовым (Of-8) и анилиновым (ВГ153, ВГ157, ВГ132,) заместителями (см. табл. 2). Среди этих соединений выделяются агенты, обладающие дополнительно антихолестазными свойствами: Ме--алаБК, Of-8, Of-15, ВГ153, ВГ157, ВГ182 и Of-31.

В ряду производных БК выявлены соединения с большей, чем у референсного соединения, антиоксидантной активностью, в том числе сама БК, ее оксимы (Of-18, Of-2), триазолы (ВГ263, ВГ264, ВГ216, ВГ211), производные анилина (ВГ156, ВГ182), аланиламиды (-алаБК, Ме--алаБК) (табл. 2). У некоторых агентов (Ме--алаБК, Of-15, ВГ157, Of-19) антиоксидантные свойства проявились лишь на уровне тенденции.

В результате скрининга производных БК на 2 моделях воспаления выявлены соединения с высокой противовоспалительной активностью (табл. 3). Эта группа агентов представлена в основном аланиламидными и анилиновыми производными БК и соединениями с метильным, децилуреидным и метилпиперазиновым заместителями в тритерпеноидной структуре. Аланиламиды БК проявляли статистически достоверный эффект в диапазоне доз 50 – 100 мг/кг, при этом их активность имела доза-зависимый характер. При введении в дозе 100 мг/кг их активность убывала в ряду -алаБКМе--алаБК-алаБКМе--алаБК. Метиловый эфир БК был более активным, чем сама кислота. Аналогичная зависимость активности от структуры для производных с анилиновым фрагментом, вводимых в дозе 20 мг/кг, имела вид: ВГ174ВГ182ВГ112ВГ157. В целом лупановые тритерпеноиды уступали по выраженности противовоспалительного действия индометацину, однако три производных в аналогичных условиях проявили активность, не уступающую референсному препарату: ВГ174, ВГ182 и Ме-БК.

Таблица 3. Влияние однократного внутрижелудочного введения лупановых тритерпеноидов  на воспалительный отек лапы мышей, индуцированный гистамином и каррагенином

Шифр агента

Химическое название

Доза, мг/кг

Модель

1ИО, % относит. контроля

2ПВА, %

БК

Бетулоновая кислота

100

50

20

гист

карр

гист

71,8*

80,9*

107,5

28,2

19,1

0

Ме-БК

Метиловый эфир бетулоновой кислоты

100

50

20

гист

карр

гист

95,0

68,9**

67,7*

5

31,1

32,3

-алаБК

2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионо-вая кислота

100

50

20

гист

карр

гист

72,8*

77,8**

95,7

27,2

22,2

4,3

Ме--алаБК

Метиловый эфир 2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил-амино]-пропионовой кислоты

100

50

20

гист

карр

гист

73,7*

95,9

95,7

26,3

4,1

4,3

-алаБК

3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионо-вая кислота

100

50

20

гист

67,2**

92,6

97,3

32,8

7,4

2,7

карр

гист

Ме--алаБК

Метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил-амино]-пропионовой кислоты

100

50

20

гист

карр

гист

80,3

70,7**

112,9

19,7

29,3

0

Of-40

3-оксо-28-(4,4’-диаминодифенилсульфон)-кар-бонил-луп-20(29)-ен

100

гист

75,5*

24,5

Of-11

3-оксо-17 -(N-децилуреидо)-28-норлуп-20(29)-ен

100

гист

51,3**

48,7

ВГ-157

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(N-пипериди-нопропаргил-1)анилин

20

карр

74,3**

25,7

ВГ-132

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(N-морфоли-нопропаргил-1)анилин

20

карр

87,2

12,8

ВГ-176

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(N-пирроли-динопропаргил-1-ин)анилин

20

гист

81,9

18,1

ВГ-156

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(2-этинилпи-ридил)анилин

20

гист

89,1

10,9

ВГ-182

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(N,N-диэтил-аминопропаргил-1-ин)анилин

20

гист

62,0*

38,0

ВГ-174

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-{N-метил-N-[(1S,2S)-2-(метиламино)-1-фенил-1-гидрокси-пропил]пропаргин-1-ил)}анилин

20

гист

53,4**

46,6

ВГ-112

N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(2-гидрокси-5-метилгексадиинил-1,3-ил)анилин

20

гист

71,9*

28,1

К

Контроль

-

100

0

ИН

Референс (индометацин)

20

карр

гист

54,9**

61,8**

45,1

38,2

Примечание. * – р<0,05; ** – р<0,01 – при сравнении с контролем. 1ИО – индекс отека; 2ПВА – противовоспалительная активность.

Скрининг противоопухолевых свойств тритерпеноидов лупанового ряда проводили выборочно для соединений разных структурных типов с использованием нескольких видов перевиваемых опухолей при разных режимах и способах введения. В табл. 4 приведены максимальные значения индекса торможения роста первичного узла опухоли.

Таблица 4. Значения индекса торможения роста опухоли лупановых тритерпеноидов в зависимости от режима и способа введения в организм

Шифр

Химическое название агента

Вид опухоли

Способ введения

Доза, мг/кг

ТРО, %

Введение на фоне растущего опухолевого узла

БК

Бетулоновая кислота

LLC

RLS

RLS

LS

В/Ж

В/Б

В/Ж

В/Б

50х8 дней

250

50х8 дней

250

2

15

22

31

-алаБК

2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота

LLC

LLC

LS

В/Ж

В/Ж

В/Ж

500

50х8 дней

500

28

33

18

Ме--алаБК

Метиловый эфир 2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оилами-но]-пропионовой кислоты

LLC

LLC

LS

В/Ж

В/Ж

В/Ж

500

50х8 дней

500

25

23

0

-алаБК

3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота

LLC

LLC

RLS

RLS

RLS

LS

LS

В/Ж

В/Ж

В/Б

В/Ж

В/Ж

В/Б

В/Ж

500

50х8 дней

250

500

50х8 дней

250

500

26

15

39

33

35

22

33

Ме--алаБК

Метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оилами-но]-пропионовой кислоты

LLC

LLC

В/Ж

В/Ж

500

50х8 дней

18

2

ОФ-1

Бетулиновая кислота

RLS

LS

В/Б

В/Б

250

250

12

17

of-40

3-оксо-28-(4,4’-диаминодифенил-сульфон)-карбонил-луп-20(29)-ен

LLC

В/Ж

50х8 дней

11

of-41

3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен

LLC

В/Ж

50х8 дней

23

of -3

3,28-ди-О-никотинат бетулина

LLC

RLS

В/Ж

В/Ж

50х8 дней

18

31

of -15

Метиловый эфир 3,20-диоксимино-29-норлуп—28-овой кислоты

LLC

RLS

В/Ж

В/Ж

50х8 дней

50х8 дней

24

28

Введение через 48 ч после перевивки

-алаБК

3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота

LLC

В/Ж

20х8 дней

44

LLC

В/Ж

50х8 дней

43

LLC

В/Ж

100х8дней

55

А75

Нитроксил бетулоновой кислоты

LLC

В/Ж

50х8дней

28

М-Ме

N-[3-оксо-лупано-28-ил]-4′-метилпи-перазин

LLC

В/Ж

20х8дней

25

М-Et

N-[3-оксо-лупано-28-ил]-4′-этилпи-перазин

LLC

В/Ж

20х8дней

26

М-Et-I

N-[3-оксо-лупано-28-ил]-4′-метил-4′-этилпиперазоний йодид

LLC

В/Ж

20х8дней

0

of-15

Метиловый эфир 3,20-диоксимино-29-норлуп-28-овой кислоты

А.Эрлиха

В/Б

50х5дней

51

of-17

Лупеол

А.Эрлиха

В/Б

50х5дней

0

of -18

3,28-ди-О-ацетил-29-норлуп-20-оксим

А.Эрлиха

В/Б

50х5дней

0

of -19

3-оксо-28-(О’-метил-L-изолейцино)карбонил-28-луп-20(29)-ен

А.Эрлиха

В/Б

50х5дней

0

ЦФ

Референс (циклофосфан)

LLC

LLC

В/Б

В/Б

100х2дней

10х2дней

770

40

Примечание. В/Ж – внутрижелудочное введение; В/Б – внутрибрюшинное введение.

Сравнение эффективности однократного и курсового режимов введения аланинамидных производных выявило преимущество курсового введения, которое в большинстве случаев позволяло снизить дозу без существенного ослабления эффекта. Не установлено повышения активности агентов при внутрибрюшинном способе введения по сравнению с внутрижелудочным, что, по-видимому, объясняется низкой растворимостью исследуемых соединений в водных и липидных средах.

Оценивая выраженность противоопухолевого эффекта лупановых агентов, вводившихся через 2 сут после перевивки опухоли и на фоне сформировавшегося узла, можно сделать вывод об их относительно невысокой противоопухолевой активности, которая не превышала 50% по критерию ТРО и существенно уступала эффекту ЦФ. Вместе с тем, необходимо отметить, что изучаемые соединения не оказывали стимулирующего действия на рост трансплантатов. Наиболее значимую противоопухолевую активность демонстрировали БК и ее аланиламидные производные, 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (of-15), 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (of-41), 3,28-ди-О-никотинат бетулина (of-3), нитроксил БК (А75), N-[3-оксо-лупано-28-ил]-4′-метилпиперазин и N-[3-оксо-лупано-28-ил]-4′-этилпиперазин (М-Ме и М-Et).

На основании результатов скрининга тритерпеноидов ряда лупана для дальнейшего исследования в качестве потенциальных корректоров цитостатиков были выбраны следующие соединения: БК, ее метиловый эфир (МеБК), 2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оилами­но]-пропионовая кислота (-алаБК), ее метиловый эфир (Ме--алаБК), 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота (-алаБК), ее метиловый эфир (Ме--алаБК), 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (of-41), 3-оксо-28-(N-метилпипера­зин)-карбонил-луп-20(29)-ен (of-15) и 3,28-ди-О-никотинат бетулина (of-3).

Морфологический анализ и клеточные механизмы политаргетных эффектов

тритерпеноидов в условиях изолированного и комбинированного введения

c противоопухолевыми препаратами


Исследование клеточных механизмов коррекции бетулоновой кислотой и ее -аланиламидом цитотоксических эффектов циклофосфана у интактных животных. Ведущим осложнением при лечении ЦФ является угнетение иммунной системы и кроветворения. Введение экспериментальным животным этого алкилирующего препарата в токсических и субтоксических дозах вызывает глубокие и стойкие нарушения практически во всех ростках гемопоэза (Гольдберг Е.Д. и др., 2000). Для клинической картины ЦФ также характерно поражение печени, вызванное токсическими продуктами его метаболизма. Клинически данный тип поражения печени характеризуется ее увеличением, болезненностью и асцитом, развитием вено-окклюзионного синдрома и симптомами острого гепатита (Никитин И.Г. и Сторжаков Г.И., 2002). Образующийся при метаболизме ЦФ акролеин вызывает поражение почек и тяжелый геморрагический цистит. ЦФ также обладает кардиотоксическими свойствами (Лушникова Е.Л. и др., 2009).

В данной работе для оценки общей картины полиорганных повреждений, вызванных ЦФ, и их коррекции бетулоновой кислотой и ее -аланиламидом, использовали интегральный показатель – коэффициенты массы внутренних органов. Анализ полученных данных выявил достоверный ингибирующий эффект ЦФ на лимфоидные органы – тимус и селезенку (табл. 5). В группе с изолированным введением цитостатика относительная масса тимуса на 4-й день опыта снизилась в 5 раз, а селезенки – в 2 раза относительно контроля. К 14-му дню в этой же группе мышей масса тимуса отставала в 1,4 раза, а масса селезенки превысила в 2,5 раза соответствующие показатели контрольной группы. Под действием ЦФ происходило достоверное повышение массы экскреторных органов, обусловленное их кровенаполнением вследствие нарушения гемодинамики. Масса почек на 4-й день увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контролем и оставалась повышенной до конца эксперимента, в конце опыта значимо повысились коэффициенты масс печени и легких.

Таблица 5. Изменение коэффициентов массы внутренних органов на 4-й и 14-й дни опыта под влиянием введения БК и -алаБК на фоне циклофосфана (M±m)

Группа

Печень

Селезенка

Почки

Легкие

Тимус

4

14

4

14

4

14

4

14

4

14

Контроль

4,93±0,28

4,74±0,25

0,76±0,12

0,61±0,02

0,73±0,03

0,70±0,02

0,73±0,07

0,62±0,03

0,20±0,0

0,17±0,02

ЦФ

4,87±0,12

5,83±0,03*

0,37±0,07*

1,53±0,22*

0,9±0,04*

0,86±0,04*

0,68±0,02

1,21±0,42*

0,04±0,00***

0,12±0,04**

ЦФ+БК

5,32±0,25

5,79±0,66

0,43±0,02*

1,15±0,25

0,81±0,02

0,89±0,05*

0,74±0,07

1,14±0,19*

0,04±0,00***

0,08±0,01**

ЦФ+-алаБК

5,17±0,11

5,00±0,13

0,96±0,09###

0,78±0,09#

0,73±0,03

0,72±0,03

0,69±0,05

0,67±0,06

0,23±0,02###

0,23±0,01**#

БК

5,26±0,12

5,22±0,12

0,38±0,06*

0,77±0,11

0,95±0,03**

0,90±0,07

0,75±0,05

0,80±0,05

0,07±0,01***

0,08±0,02*

-алаБК

5,01±0,09

4,97±0,37

0,86±0,03

0,77±0,09

0,78±0,66

0,74±0,04

0,66±0,04

0,64±0,05

0,19±0,01

0,19±0,02

Примечание. * - р<0,05, ** - р<0,01 относительно контроля.

Введение -алаБК на фоне ЦФ полностью купировало его депрессивный эффект на тимус и селезенку, а также нормализовало массу экскреторных органов. Введение БК в тех же условиях не купировало негативный эффект цитостатика на оба лимфоидных органа в течение всего наблюдаемого периода и не оказало регулирующего влияния на массу выделительных органов. В режиме изолированного введения -аланиламид не оказывал влияния на массу лимфоидных органов, в то время как БК, подобно ЦФ, вызвала такое же продолжительное угнетение тимуса и временное угнетение селезенки.

По данным литературы, однократное введение ЦФ в максимально переносимой дозе приводит к длительно сохраняющейся (до 6 мес) дезорганизации клеточного состава тимуса и нарушению функционального состояния клеток иммунной системы (Гольдберг Е.Д. и др., 2000; Захаров А.А., 2008). Известно, что снижение численности Thy1,2+ в костном мозге приводит к подавлению образования селезеночных колоний. Показано, что тимоциты необходимы для миграции КОЕ-С из костного мозга в селезенку, а также для активации колониеобразования в селезенке (Гольдберг Е.Д. и др., 1999, 2008). Поэтому отмеченное нами снижение массы селезенки на 4-й день эксперимента в группах с изолированным введением ЦФ и его совместным введением с БК можно объяснить как значительным угнетением гемопоэза в костном мозге, так и выраженным угнетением тимуса в этот период.

В ряде работ показано, что восстановление массы селезенки сопровождается увеличением ее клеточности, связанной с активной миграцией костномозговых стволовых и некоммитированных кроветворных клеток в селезенку, что совпадает по времени с активным восстановлением гемопоэза в костном мозге. Восстановление массы селезенки происходит в большей степени за счет ее заселения клетками миелоидного ряда, тогда как численность лимфоцитарной колонии увеличивается позже [Barcew K., 2008, Sefc L., 2003]. Эти данные объясняют развитие спленомегалии в группах с изолированным введением ЦФ и с его сочетанным введением с БК к 14-му дню опыта и косвенно указывают на восстановление кроветворной функции костного мозга и селезенки.

Отмеченные выше изменения в состоянии органов кроветворения нашли отражение в картине периферической крови крыс (табл. 6). Под влиянием ЦФ в первые четыре дня у животных развилась тяжелая лейкопения (снижение лейкоцитов в 13 раз), которая к 14-му дню сменилась лейкоцитозом (увеличение лейкоцитов в 3,6 раза). В этих условиях БК и -алаБК оказали модулирующий эффект, снижая выраженность как лейкопении (в 1,4 раза), так впоследствии и лейкоцитоза (в 1,3 – 1,7 раза относительно циклофосфана). При изолированном введении оба тритерпеноидных агента не вызвали статистически значимых изменений в содержание лейкоцитов периферической крови.

Введение тритерпеноидов на фоне ЦФ не оказало значимого влияния на вызванные им сдвиги в количестве тромбоцитов и эритроцитов. Динамика изменений показателей гематокрита и гемоглобина в группе с ЦФ и тритерпеноидами была аналогична динамике изменения количества эритроцитов.

Таблица 6. Изменения в картине периферической крови на 4-й и 14-й дни опыта после введения БК и -алаБК на фоне циклофосфана (M±m)

Группа

Гематологические показатели

RBC

HCT

WBC

HGB

PLT

4

14

4

14

4

14

4

14

4

14

Контроль

5,94±0,55

5,65±0,23

32,9±3,4

31,8±0,7

12,4±0,5

14,1±2,1

16,4±1,2

16,2±0,1

210±14

193±8

ЦФ

5,20±0,27

4,7±0,27*

28,0±1,4

23,6±0,8**

0,9±0,1*

51,2±6,2**

15,2±0,6

12,2±0,7**

101±9***

371±23**

ЦФ+БК

5,11±0,17

4,74±0,25

27,0±1,0

27,2±1,4

1,3±0,2*

39,7±4,9**

14,6±0,5

13,9±0,5*

95±8***

336±47

ЦФ+ -алаБК

4,96±0,31

4,69±0,46

28,5±1,7

25,1±2,7

1,3±0,2*

30,3±4,8*

15,7±0,9

15,3±0,6

138±16*

387±20***

БК

5,09±0,10

4,88±0,18*

27,2±0,7

26,2±1,0**

12,7±0,8

12,5±1,7

14,9±0,5

14,8±1,7

195±16

193±12

-алаБК

5,07±0,19

5,83±0,31

26,3±0,8*

31,1±1,8

18,2±3,6

14,3±4,1

14,5±0,4

17,0±0,7

213±28

198±13

Примечание. RBC – число эритроцитов, HCT – гематокрит, PLT – число тромбоцитов, WBC – число лейкоцитов, HGB – концентрация гемоглобина. * - р<0,05, ** - р<0,01 относительно контроля.

Анализ лейкоцитарной формулы показал, что лейкопения, выявленная у крыс через 4 дня после введения ЦФ, обеспечивалась в основном за счет значительного угнетения гранулоцитарного ростка крови, прежде всего сегментоядерных нейтрофилов, количество которых снизилось в 3,4 раза относительно контроля (табл. 7). БК и ее -аланиламид, вводимые на фоне цитостатика, оказали в тот же период корригирующий эффект, достоверно снизив вызванную им нейтропению соответственно в 2,5 и 1,9 раз. К 14-му дню опыта во всех группах, которым вводили ЦФ, содержание гранулоцитов в крови нормализовалось. Обращает на себя внимание появление палочкоядерных нейтрофилов в группах с сочетанным введением ЦФ и обоих тритерпеноидов, свидетельствующее о стимуляции гранулопоэза в костном мозге. Следует отметить, что сами по себе тритерпеноиды не вызвали достоверных изменений в гранулоцитарном профиле в течение всего периода наблюдений.

В условиях цитостатического воздействия были выявлены определенные сдвиги в количестве циркулирующих мононуклеаров. После введения ЦФ у крыс наблюдалось тенденциозное повышение моноцитов, а также небольшой лимфоцитоз, который компенсировался к 14-му дню опыта. На этом фоне -аланиламид БК уже в ранние сроки нормализовал количество моноцитов (снижение в 1,6 раз), тогда как БК достигла такого же эффекта в конце эксперимента. Ведение тритерпеноидов в изолированном режиме не влияло на содержание моноцитов – оно было близко к норме в течение всего опыта. Содержание лимфоцитов в группах с введением БК и ее -аланиламида в целом не имело достоверной разницы с контролем.

Таблица 7. Изменения показателей лейкоцитарной формулы на 4-й и 14-й дни опыта после введения БК и -алаБК на фоне циклофосфана (M±m)

Группа

Эозинофилы

Нейтрофилы

Моноциты

Лимфоциты

палочкоядерные

сегментоядерные

4

14

4

14

4

14

4

14

4

14

Контроль

2±1

1,5±0,5

-

-

21,2±2,5

27±4,7

7,3±1,7

4,3±0,9

63±1,5

68±3,8

ЦФ

1±0

1±0

-

-

6,3±0,9***

30,3±7,1

12±1,4

10±1,5

82±2,1***

59±6,1

ЦФ+БК

1,5±0,5

4,7±1,5

-

2±0,6

15,5±2,4##

27±3,7

11,3±1,2

6,4±0,7

73±1,9**

63±4,3

ЦФ+ -алаБК

-

1±0

-

2±1

12,2±1,8*#

48,3±9,7

7,3±1,3

7,7±1,7

74±5,9

42±9,5

БК

1,8±0,5

1±0

1±0

-

19±2,2

23±2,0

8,5±1,1

6±0,7

72±3,1

71±1,5

-алаБК

1,5±0,3

5±0

1,5±0,5

-

16,2±2,4

22±4,6

9,3±1,1

6,8±0,6

74±2,4

70±5,8

Примечание. * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 относительно контроля; # - р<0,05, ## - р<0,01 относительно циклофосфана.

Выявленная динамика изменения клеточного состава крови подтверждается литературными данными, описывающими состояние костномозгового кроветворения после введения ЦФ (Гольдберг Е.Д. и др., 1999, Дыгай А.М. и др., 2009). Известно, что через сутки после введения цитостатика в максимально переносимой дозе, происходит значительное угнетение гранулоцитарного ростка костного мозга, что сопровождается резким уменьшением количества гемопоэтических островков. К 5-м суткам количество нейтрофилов возрастает, достигая максимума к 8 – 12-му дню (Гольдберг Е.Д. и др., 1999, Дыгай А.М. и др., 2009). Эти данные согласуются с наблюдавшимся нами увеличением количества лейкоцитов в крови через 14 дней после введения цитостатика, существенно превышавшим их число в контроле. В то же время в крови сохранялись признаки угнетения эритрона.

Выявленные сдвиги в состоянии периферической крови, а также в массе селезенки и тимуса, вызванные действием ЦФ, в целом соответствовали описанной в литературе картине морфофункциональных изменений в системе кроветворения. Выраженность гематотоксического эффекта ЦФ в нашем опыте определялась введенной дозой препарата, которая составляла от максимально переносимой. В этих условиях гемопротекторное действие БК и ее -аланиламида было направлено преимущественно на гранулоцито-моноци­тарный росток и выражалась в модуляции патологических сдвигов, вызванных ЦФ.

У аланиламида БК дополнительно было установлено протекторное действие в отношении тимуса и селезенки, которое выражалось в поддержании их нормальной массы в течение опыта. Это обстоятельство позволяет предположить сохранение под действием -алаБК клеточного пула Thy1,2+, и сделать вывод о иммунопротекторном действии агента. Кроме того, сохранение функциональной активности тимуса могло способствовать активизации процессов дифференцировки предшественников в костном мозге, что не потребовало дополнительной стимуляции кроветворной функции селезенки. БК не оказала корректирующего влияния на депрессивный эффект ЦФ в отношении как тимуса, так и селезенки.

Морфологические изменения печени через 3 сут после введения ЦФ проявлялись в виде мелкоочаговых некрозов паренхимы, распространявшихся от портальных трактов. Отмечались нарушения гемодинамики – неравномерное полнокровие синусоидов, центральных и портальных вен. В расширенных просветах синусоидов находились многочисленные мононуклеарные клетки, преимущественно клетки Купфера. К гепатотоксическим эффектам ЦФ следует отнести и выраженную субплазмалеммальную «вакуолизацию» цитоплазмы гепатоцитов. Регенераторные реакции гепатоцитов проявлялись в усилении их митотической активности, особенно в перипортальной зоне, где возрастало количество двуядерных гепатоцитов.

К 14-м суткам после введения ЦФ происходило нарастание воспалительноклеточной инфильтрации, развивался тромбоз и обтурирование (особенно клетками Купфера) просветов синусоидов, центральных и портальных вен. Регенераторные реакции гепатоцитов в этот срок проявлялись в усилении цитокинеза двуядерных клеток (уменьшении их числа) и увеличении популяции «мелких» одноядерных гепатоцитов, направленных на восстановление общей численности гепатоцитов. Некробиотические изменения гепатоцитов и стимуляция их регенераторных реакций были наиболее выраженными в перипортальных зонах. Портальный и перипортальный склероз, выявляемый в более поздние сроки после введения ЦФ, свидетельствовал о наиболее выраженных повреждениях цитотоксическими агентами клеточных популяций портальных зон печени.

В печени животных после введения ЦФ и БК отмечалось уменьшение степени полнокровия как в крупных сосудах, так и в синусоидах. В гепатоцитах как центролобулярных, так и перипортальных зон выявлялась очаговая дистрофия. Отмечались некрозы отдельных гепатоцитов. После введения ЦФ и амида БК сохранялось более выраженное, по сравнению с ЦФ и БК, полнокровие сосудов. По всей паренхиме выявлялись коагуляционные некрозы отдельных гепатоцитов. В то же время регистрировались гепатоциты, находившиеся на разных фазах митотического цикла, и двуядерные клетки. В группах животных получавших БК и амид БК в режиме изолированного введения гистологическое строение печени существенно не отличалось от контроля. Однако при введении амида БК отмечалась более значительная активация эндотелиоцитов синусоидов, чем при БК. К признакам корректорного влияния амида на фоне ЦФ можно отнести усиление регенераторных процессов в печени в виде повышения митотической активности гепатоцитов и увеличения количества двуядерных клеток.

По данным ультраструктурного анализа, внутриклеточная реорганизация гепатоцитов после однократного введения ЦФ определялась выраженными изменениями тонкой структуры митохондрий, транзиторными изменениями гранулярной цитоплазматической сети (расширениями профилей и частичной дегрануляцией), значительной редукцией гладкой цитоплазматической сети, гиперплазией и гипертрофией структурных элементов комплекса Гольджи. Характерной особенностью внутриклеточной реорганизации гепатоцитов обеих зон через 3 сут после введения ЦФ были лизис и секвестрация гранул гликогена, которые регистрировались во всех клетках, но различались по интенсивности. В наибольшей степени эти процессы были выражены в гепатоцитах перипортальной зоны.

Значительным изменениям подвергалось микроциркуляторное русло печеночной дольки. Через 3 сут после введения ЦФ регистрировалась гетерогенность эндотелиоцитов синусоидных капилляров, которая была обусловлена преимущественно присутствием в эндотелиальной выстилке активированных форм клеток и некробиотически измененных клеток. Через 14 сут после введения ЦФ ультраструктурные изменения гепатоцитов усиливались. В первую очередь это касалось тонкого строения митохондрий и скоплений гранул гликогена. Тонкая структура митохондрий была значительно изменена, они содержали, как правило, электронно-плотный матрикс, но кристы в них практически не различались; отмечалась «осмиофильная» дегенерация митохондрий с образованием остаточных телец. Выстилка синусоидов была представлена как активированными, так и дегенеративными формами эндотелиоцитов. Важной особенностью поражения печени после введения ЦФ можно считать массивную обтурацию синусоидов клетками Купфера и лимфоцитами с образованием тромботических масс, носивших распространенный характер.

При изолированном введении БК и ее амида отмечались сходные изменения ультраструктуры гепатоцитов. Через 3 сут ультраструктура гепатоцитов в обоих случаях была близка к норме, но отмечалось нарушение тонкой структуры митохондрий. Митохондрии, как правило, были с электронно-плотным матриксом, в котором плохо различались кристы. При этом усиливалась эндоцитозная и трансцитозная функции гепатоцитов: на синусоидальном полюсе регистрировалось большое количество эндоцитозных (пиноцитозных) везикул, на билиарном полюсе – многочисленные везикулы гладкой цитоплазматической сети, гипертрофированный комплекс Гольджи. Желчные капилляры, как правило, были расширенными, в них присутствовали небольшие осмиофильные структуры. Вблизи желчных капилляров часто встречались остаточные тельца с мелкой осмиофильной зернистостью.

Повышенная эндоцитозная (пиноцитозная) активность также была характерна для активированных форм эндотелиоцитов и клеток Купфера. В синусоидах часто располагались переходные формы моноцитов – клетки с большим бобовидным ядром, электронно-прозрачной цитоплазмой, в которой присутствовали многочисленные укороченные трубочки гранулярной цитоплазматической сети, первичные лизосомы, комплекс Гольджи, небольшие митохондрии и вакуоли с гомогенным содержимым; плазмалемма формировала множественные эндоцитозные/пиноцитозные везикулы. Усиление эндоцитозной (пиноцитозной) активности гепатоцитов, эндотелиоцитов и клеток Купфера (моноцитов) было наиболее манифестным при действии амида БК. После введения БК практически во всех клетках Купфера содержалось большое количество фагосом с осмиофильной зернистостью, эти же мельчайшие частицы диффузно распределялись по цитоплазме клеток и представляли собой фагоцитированные частицы БК.

В то же время при действии обоих тритерпеноидов отмечался некроз и некробиоз отдельных гепатоцитов и эндотелиоцитов, преимущественно в перицентральной зоне, формирование пристеночных скоплений клеточного детрита.

Через 14 сут после введения БК и ее амида ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Хорошо была развита гладкая цитоплазматическая сеть, везикулы которой встречались как на билиарном, так и на синусоидальном полюсах. В гепатоцитах присутствовали небольшие поля гликогена, отмечалась его умеренная секвестрация. В некоторых клетках отмечалось неравномерное расширение профилей гранулярной цитоплазматической сети и межмембранного околоядерного пространства. Во всех гепатоцитах сохранялась выраженная эндоцитозная активность синусоидальной плазмолеммы. Для амида БК характерным было появление в некоторых гепатоцитах крупных митохондрий с просветленным матриксом. Эндотелий синусоидов был представлен в основном активированными формами, но после введения амида БК отмечалось также появление некротизированных эндотелиоцитов. В обоих случаях наблюдалась значительная обтурация просветов синусоидов мононуклерами.

Через 3 сут после введения ЦФ и БК ультраструктура гепатоцитов была сходна с таковой после введения только одного ЦФ. В гепатоцитах присутствовало большое количество гликогена, который был подвержен лизису и секвестрации, субплазмалеммально локализовались липидные включения и вакуоли с осмиофильным содержимым. Профили гранулярной цитоплазматической сети были неравномерно расширены, гладкая цитоплазматическая сильно редуцирована. Изменения тонкой структуры митохондрий касались частичной редукции крист. На билиарном полюсе часто регистрировались вторичные лизосомы и остаточные тельца с мелкой осмиофильной зернистостью. В этот срок эксперимента в просветах синусоидов и перисинусоидально располагалось большое количество клеток Купфера с многочисленными фагосомами с мелкой осмиофильной зернистостью. В отличие от введения только одного ЦФ в данном случае отмечалась выраженная эндоцитозная активность синусоидальной плазмолеммы гепатоцитов.

Через 3 сут после введения ЦФ и амида БК ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Отмечался выраженный полиморфизм митохондрий, которые были представлены часто крупными формами с разрыхленным матриксом. В гепатоцитах часто выявлялись везикулы гладкой цитоплазматической сети, преимущественно на билиарном полюсе. Отмечались гиперплазия и гипертрофия структурных элементов комплекса Гольджи. Желчные капилляры, как правило, были расширенными и содержали осмиофильную субстанцию. Отмечалась высокая эндоцитозная активность гепатоцитов и клеток Купфера.

Через 14 сут после введения ЦФ и БК отмечалась нормализация ультраструктуры одних гепатоцитов и усиление повреждения – других. В первых при этом сохранялись изменения тонкой структуры митохондрий, но появлялись везикулы гладкой цитоплазматической сети. Во вторых отмечались субплазмалеммальные скопления вакуолеобразных остаточных телец и выраженная секвестрация гликогена. Наблюдался некроз отдельных гепатоцитов. В некоторых случаях регистрировалось нарушение плотных контактов между соседними гепатоцитами, формирование апоптотических телец, которые попадали в просветы синусоидов, где резорбировались макрофагами. Через 14 сут после введения ЦФ и амида БК ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Отличительной чертой ультраструктурной организации гепатоцитов при действии амида БК было присутствие большого количества крупных митохондрий с неравномерно расширенными кристами. Биологические эффекты обоих тритерпеноидов проявлялись в усилении эндоцитозной активности как гепатоцитов, так и эндотелиоцитов и клеток Купфера. В обоих случаях сохранялся тромбоз части синусоидов мононуклеарами.

Морфологические изменения миокарда через 3 сут после введения ЦФ заключались в увеличении количества кардиомиоцитов с контрактурными повреждениями. Наблюдались умеренный интерстициальный отек и диффузная инфильтрация стромы мононуклеарами. Через 14 сут в этой группе животных мозаичность повреждений сохранялась, нарастало количество кардиомиоцитов с литическими изменениями цитоплазмы. Усиливалась фенотипическая гетерогенность кардиомиоцитов – встречались как атрофированные, так и гипертрофированные клетки. Последнее обстоятельство способствовало восстановлению массы сердца. Сохранялись гемодинамические расстройства, в некоторых случаях происходило усиление интерстициального и периваскулярного отека. Абсолютная численность кардиомиоцитов через 3 сут после введения ЦФ существенно не изменялась, что свидетельствовало о сохранении клеточной формы регенерации кардиомиоцитов. В то же время следует отметить заметное уменьшение (на 31%) доли одноядерных кардиомиоцитов и увеличение (на 10%) доли двуядерных клеток. В миокарде крыс в этот срок эксперимента появлялись кардиомиоциты, в которых происходило митотическое деление ядер.

Через 14 сут после введения ЦФ нарушения гемодинамики сохранялись. Практически у всех животных кровеносные сосуды и капилляры кроме форменных элементов крови содержали плазму, наблюдались также явления плазморрагии. Количество кардиомиоцитов с литическими и вакуолеобразными изменениями цитоплазмы возрастало. В то же время общее количество кардиомиоцитов через 14 сут после введения ЦФ возрастало на 50%, при этом доля одноядерных клеток также возрастала, но оставалась уменьшенной (на 13%) по сравнению с контролем.

При введении ЦФ и БК в миокарде животных через 3 сут более выраженной была мозаичность повреждений кардиомиоцитов, чем при введении только ЦФ. Возрастало количество клеток с контрактурными повреждениями. Как и при введении ЦФ, отмечались выраженные нарушения гемодинамики. Через 14 сут сохранялась мозаичность повреждений миокарда. Возрастало количество кардиомиоцитов с литическими изменениями цитоплазмы (у некоторых животных их доля составляла 30 – 40%). Количественные изменения популяции кардиомиоцитов через 3 сут после введения ЦФ и последующего введения БК были такими же, как и после введения ЦФ. Через 14 сут эксперимента в миокарде животных в отличие от группы крыс, которым вводили только ЦФ, изменений в количественном соотношении одно- и двуядерных кардиомиоцитов не происходило.

При введении ЦФ и амида БК через 3 сут эксперимента также манифестировали контрактурные и литические повреждения кардиомиоцитов. Одновременно присутствовали кардиомиоциты, в саркоплазме которых наблюдались многочисленные вакуолеобразные расширения. Через 14 сут усиливались проявления некробиоза и атрофии одних кардиомиоцитов и гипертрофия других; сохранялась мозаичность повреждения мышечных сегментов. Нарушения гемодинамики манифестировали, выраженность отека стромы варьировала. Наблюдалась диффузная инфильтрация стромы мононуклеарами, количество которых возрастало также в адвентиции интрамуральных артерий. Выявлено уменьшение общей численности кардиомиоцитов (на 26%) через 3 сут эксперимента при сохранении соотношения одно- и двуядерных клеток. К 14-м суткам эксперимента происходило восстановление общей численности кардиомиоцитов в сердце, но при этом уменьшалась (на 35%) доля одноядерных клеток и возрастала (на 19%) доля двуядерных клеток.

В группе с изолированным введением БК и амида БК через 3 сут наблюдались сходные изменения кардиомиоцитов: сочетание контрактурных и литических повреждений. Через 14 сут в миокарде животных, получавших БК, отмечено увеличение количества атрофированных и некробиотически измененных кардиомиоцитов при одновременном увеличении количества гипертрофированных клеток. Гемодинамические нарушения сопровождались умеренной диффузной инфильтрацией стромы миокарда мононуклеарами; у некоторых животных отмечался мелкоочаговый кардиосклероз. Через 14 сут после введения амида БК происходило усиление литических повреждений отдельных кардиомиоцитов. Отмечалось развитие диффузного и мелкоочагового кардиосклероза. Введение крысам БК и ее аланинового амида не вызывало заметного изменения общей численности кардиомиоцитов в сердце во все сроки эксперимента. Однако через 3 сут после введения амида БК выявлено увеличение на 92% доли одноядерных кардиомиоцитов и уменьшение доли дву- и многоядерных клеток. Через 14 сут после введения БК и ее амида происходило достоверное уменьшение доли одноядерных кардиомиоцитов соответственно на 39 и 28%.

По данным электронно-микроскопического анализа, введение ЦФ вызывало через 3 сут эксперимента умеренно выраженный преимущественно очаговый лизис миофибриллярных пучков, расширение везикул гранулярной и агранулярной саркоплазматической сети и деструкцию митохондрий с образованием миелиноподобных остаточных телец. При действии ЦФ в кардиомиоцитах сохранялось большое количество гликогена, наблюдалась его секвестрация. Ультраструктурные изменения ядер кардиомиоцитов проявляются преимущественно в изменении их формы, значительных инвагинациях ядерной оболочки и транслокации в субсарколеммальную зону. Через 14 сут после однократного введения ЦФ происходило восстановление ультраструктуры большинства кардиомиоцитов.

БК и ее амид при изолированном введении вызывали сходные с ЦФ, но менее выраженные изменения ультраструктуры кардиомиоцитов. К наиболее значимым повреждениям ультраструктуры относились лизис саркоплазматического матрикса, особенно в околоядерной зоне, умеренный лизис миофибриллярных пучков, расширения везикул агранулярной саркоплазматической сети. Литические изменения миофибриллярных пучков были незначительными, в этих участках всегда локализовались полисомы, наблюдалось новообразование миофиламентов. Важно отметить, что при действии БК отмечалось формирование сарколеммой эндоцитозных везикул и кавеол. К особенностям амида БК относится его способность вызывать в некоторых клетках значительные повреждения тонкой структуры митохондрий (диффузный лизис митохондриального матрикса, редукцию крист и нарушение их упаковки), которые манифестировали на протяжении всего эксперимента. Следует отметить, что эти изменения были наиболее выраженными также в первые 3 сут эксперимента, восстановление ультраструктуры кардиомиоцитов при использовании тритерпеноидов происходило быстрее, чем после воздействия ЦФ.

При последовательном применении ЦФ и тритерпеноидов в первые 3 сут воздействия проявлялся их синергизм в отношении основных видов ультраструктурных изменений кардиомиоцитов – литических повреждений миофибрилл, расширениях везикул саркоплазматической сети и межмембранного околоядерного пространства (основных ультраструктурных маркеров регенераторно-пластической недостаточности кардиомиоцитов). Восстановление ультраструктуры кардиомиоцитов при комбинированном применении ЦФ и тритерпеноидов происходило быстрее. Во многих кардиомиоцитах в саркоплазме присутствовали многочисленные полисомы, в околоядерной зоне отмечалась гиперплазия структурных элементов комплекса Гольджи.

Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о том, что изучаемые соединения вызывают морфофункциональные изменения в миокарде, сходные с ЦФ. Литические и некробиотические повреждения кардиомиоцитов обусловлены цитотоксическим действием исследуемых агентов. Наиболее выраженными эти изменения были при сочетанном введении ЦФ и амида БК, что обусловило наиболее значительное уменьшение массы сердца на 3-и сутки эксперимента и снижение общей численности кардиомиоцитов. В то же время, при использовании только одного амида БК происходило увеличение массы органа к 14-м суткам эксперимента и наиболее значительное возрастание пула одноядерных кардиомиоцитов. Использование тритерпеноидов в то же время стимулировало процессы внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов. Эти данные свидетельствуют о том, что БК и ее амид могут потенцировать как цитотоксические эффекты ЦФ, так и выступать в качестве индукторов регенераторных реакций миокарда.

Исследование клеточных механизмов коррекции бетулоновой кислотой и ее -аланиламидом цитотоксических эффектов доксорубицина (ДОК) у интактных животных. Известно, что одним из основных проявлений токсичности антрациклиновых антибиотиков, наряду с кардиотропным эффектом, является развитие гипо- и апластических состояний кроветворения (Дыгай А.М. и др., 2009). В результате анализа коэффициентов массы внутренних органов установлено снижение под действием ДОК массы тимуса к 14-му дню опыта (табл. 8). Этот эффект частично компенсировался при совместном введении цитостатика и тритерпеноидов, что выразилось в отсутствии, по сравнению с контролем, значимых изменений данного показателя в группах с введением БК и аланиламида БК на фоне ДОК. В то же время при изолированном введении БК и -алаБК не влияли на массу вилочковой железы.

Таблица 8. Изменение коэффициентов массы внутренних органов на 4-й и 14-й дни опыта под влиянием введения БК и -алаБК на фоне доксорубицина (M±m)

Группа

Печень

Сердце

Селезенка

Почки

Легкие

Тимус

День

4

14

4

14

4

14

4

14

4

14

4

14

Контроль

4,33±0,19

4,60±0,14

0,40±0,01

0,32±0,01

0,36±0,05

0,24±0,01

0,76±0,02

0,70±0,03

0,64±0,04

0,49±0,04

0,25±0,05

0,21±0,02

ДОК

4,77±0,24

4,21±0,17

0,40±0,03

0,37±0,01

0,30±0,05

0,42±0,08

0,83±0,04

0,75±0,06

0,66±0,06

0,71±0,02*

0,18±0,04

0,11±0,03*

ДОК+БК

4,47±0,17

4,51±0,21

0,40±0,01

0,36±0,02

0,26±0,04

0,39±0,06

0,84±0,05

0,74±0,02

0,69±0,05

0,64±0,07

0,16±0,02

0,14±0,03

ДОК+ -алаБК

4,87±0,11*

4,36±0,23

0,37±0,01

0,38±0,01*

0,34±0,04

0,33±0,03

0,77±0,02

0,74±0,02

0,64±0,04

0,59±0,04#

0,19±0,03

0,14±0,04

БК

5,01±0,19

4,16±0,15

0,38±0,01

0,35±0,01

0,38±0,02

0,32±0,04

0,76±0,02

0,70±0,02

0,60±0,03

0,61±0,07

0,25±0,01

0,20±0,02#

-алаБК

4,75±0,10

4,21±0,09

0,39±0,02

0,38±0,02

0,37±0,05

0,42±0,07

0,76±0,02

0,77±0,06

0,64±0,06

0,54±0,02

0,26±0,03

0,22±0,02#

Примечание. * - р<0,05 относительно контроля ; # - р<0,05 относительно доксорубицина.

Колебания массы селезенки во всех группах не выходили за пределы статистически значимых изменений с контролем, однако можно отметить в виде тенденции ее увеличение на 14-й день в группах с изолированным введением ДОК и -аланиламида БК (в 1,8 раза). Что касается массы сердца, поражение которого стоит на первом месте среди побочных эффектов ДОК, то в данном опыте не отмечено достоверных изменений его массы ни в одной из групп.

В картине периферической крови (табл. 9) подопытных животных не выявлено статистически значимых сдвигов в содержании эритроцитов и тромбоцитов. К концу опыта отмечено снижение гематокрита во всех группах с введением ДОК, а также с изолированным введением -алаБК. Кроме того, в те же сроки понизилось содержание гемоглобина у крыс, получивших только один цитостатик.

Введение ДОК вызвало у животных лейкоцитоз в конце эксперимента (увеличение лейкоцитов в 1,4 раза относительно контроля). В группах с введением тритерпеноидов на фоне ДОК количество лейкоцитов достоверно не отличалось от контроля.

Таблица 9. Изменения в картине периферической крови на 4-й и 14-й дни опыта после введения БК и -алаБК на фоне доксорубицина (M±m)

Группа

Число эритроцитов

Число лейкоцитов

Концентрация гемоглобина

Число тромбоцитов

День

4

14

4

14

4

14

4

14

Контроль

5,75±0,07

6,03± 0,26

10,4± 0,78

14,31±0,72

18,4±0,40

18,97±0,13

293±58

217±21

ДОК

5,45±0,35

5,52±0,12

9,84±1,35

20,45±1,41***

18,6±0,77

17,38±0,22*

273±22

239±18

ДОК+БК

6,02±0,20

5,60±0,10

9,87±1,03

14,72±3,06

19,47±0,61

18,36±0,48

303±22

214±18

ДОК+ -алаБК

5,63±0,17

5,03±0,30

15,03±3,41

16,28±1,50

18,75±0,44

17,00±1,08

266±10

277±31

БК

5,48±0,16

6,14±0,55

12,6±0,65

14,98±2,50

17,78±0,42

18,4±0,39

239±11

241±26

-алаБК

5,62±0,34

5,25±0,45

15,76±1,79

17,13±0,64

17,96±0,73

18,24±0,30

216±15

243±7

Примечание. * - р<0,05, *** - р<0,001 относительно контроля.

Показатели лейкоцитарной формулы крови во всех группах статистически значимо не отличались от контроля в течение всего опыта (табл. 10). Однако в группе с изолированным введением ДОК можно отметить как тенденцию увеличение к 14-му дню количества сегментоядерных нейтрофилов (в 1,8 раз) и моноцитов (в 1,4 раза). Введение тритерпеноидов на фоне ДОК оказывало небольшой корректирующий эффект, снижая нейтрофилез и моноцитоз соответственно в 1,3 и 1,2 раза (относительно группы с ДОК).

Таблица 10. Изменения показателей лейкоцитарной формулы на 4-й и 14-й дни опыта после введения БК и -алаБК на фоне доксорубицина (M±m)

Группа

Эозинофилы

Палочкоядерные

Сегментоядерные

Моноциты

Лимфоциты

День

4

14

4

14

4

14

4

14

4

14

Контроль

2±1,2

1,7±0,9

0±0

0±0

22,7±6,3

20±1,5

7,3±2,3

7±2

68±7,0

71,3±4,4

ДОК

1±0,5

1±1

0,4±0,2

0±0

35,2±7,4

35,6±9,2

8,0±2,1

9,6±1,7

55,4±8,66

53,8±8,7

ДОК+БК

0,7±0,5

0,6±0,2

0,2±0,2

0±0

32,2±8,4

26,8±6,12

8,8±1,3

7,8±1,6

58,3±7,87

64,8±7,3

ДОК+ -алаБК

0,3±0,2

0,5±0,3

0±0

0,2±0,2

28,7±4,1

28,2±7,3

11,6±0,7

8,5±1,6

58,83±3,61

56±8,5

БК

1±0,7

0,6±0,2

0±0

0±0

19±2,2

21,4±3,5

11,6±1,1

11±2,3

68,2±3,12

67±4,9

-алаБК

1,6±0,6

0,4±0,3

0±0

0±0

20±4,2

26,4±4,1

10±0,7

12,2±1,1*

68,2±4,51

61±3,9

Примечание. * - р<0,05, относительно контроля.

Полученные результаты показали, что введение цитостатика в дозе 7 мг/кг не оказывает существенного патологического влияния на картину периферической крови. Введение ДОК вызвало лишь изменение со стороны белой крови в виде достоверного лейкоцитоза к 14-м суткам наблюдения. При этом соотношение форменных элементов в лейкоцитарной формуле не отличалось от контроля. Тем не менее, БК и -алаБК на фоне ДОК проявили тенденцию к нормализации показателей белой крови, что коррелировало с результатами, полученными в опыте с ЦФ. Отмеченные выше сдвиги в белой крови под действием ДОК согласуются с литературными данными об абортивном увеличении зрелых форм нейтрофилов в костном мозге к 4 – 7-м суткам после введения препарата в максимально переносимой дозе (Гольдберг Е.Д. и др., 1999).

Описанные в литературе механизмы коррекции функций лимфоидных органов после воздействия ЦФ и ДОК в целом одинаковы и связаны с ролью Т-лимфоцитов в восстановлении костномозгового и селезеночного кроветворения. В представленной работе характер и степень выявленного гематотоксического эффекта ДОК определялись величиной введенной дозы, которая составляла половину от максимально переносимой. В этих условиях не удалось достичь значимого токсического действия цитостатика на кроветворную систему и, соответственно, выявить корректорное действие лупановых агентов. Однако в данном случае, так же как и в опыте с ЦФ, наблюдалась тенденция к нормализации лейкоцитов крови и массы тимуса при сочетанном введении ДОК и тритерпеноидов, свидетельствующая о иммунопротекторном действии БК и ее аланиламида.

Морфологические изменения печени. Повреждения печени после введения ДОК проявлялись в виде умеренной жировой дистрофии гепатоцитов (преимущественно мелкокапельной) и значительных литических изменениях цитоплазмы («опустошении» цитоплазмы, как правило, это был лизис больших скоплений гликогена). Гемодинамические нарушения, проявлявшиеся в ранние сроки эксперимента полнокровием и окклюзией синусоидов (многие сосуды были заполнены плазмой), усиливались к 14-м суткам наблюдения. К концу эксперимента в печени развивался венозный застой, который был также следствием гемодинамических нарушений в большом круге кровообращения. На этом фоне регистрировались преимущественно перицентральные некрозы гепатоцитов и инфильтрация очагов некроза мононуклеарными клетками в основном лимфоидного ряда.

Наблюдалось также нарушение поглотительной, накопительной и экскреторной функции гепатоцитов, ультраструктурными маркерами этих изменений были снижение количества эндоцитозных/пиноцитозных везикул и числа микроворсинок плоть до сглаживания поверхности гепатоцитов на синусоидальном полюсе и спавшиеся диктиососмы комплекса Гольджи. В то же время в других гепатоцитах отмечалось увеличение площади синусоидальной поверхности за счет сокращения латеральной поверхности и образования микроворсинок, отражающего усиление трансмембранного обмена.

Ультраструктурный анализ синусоидальной выстилки и пространства Диссе показал, что токсическое действие ДОК вызывало окклюзию микрососудов и синусоидных капилляров печени клетками крови. В пространство Диссе мигрировали многочисленные клетки лимфо- и моноцитарного ряда, плазмоциты разной функциональной активности. Наблюдалось значительное расширение синусоидов, заполненных гипертрофированными макрофагами (клетками Купфера). При этом свободный (полезный) просвет синусоидов сужался; во многих синусоидах наблюдался некроз эндотелиальных клеток.

Следует особо подчеркнуть, что в данной модели доксорубицинового повреждения печени не отмечалось развитие перицеллюлярного фиброза во все сроки эксперимента, звездчатые клетки встречались очень редко. Основной клеточной популяцией среди соединительнотканных клеток были клетки Купфера, которые часто содержали гетерогенные липидные включения. К 14-м суткам в синусоидах появлялись сегментоядерные нейтрофилы, активированные плазмоциты с хорошо развитой цитоплазматической сетью и активные формы клеток Купфера с обилием лизосом, фагосом и остаточных телец. Миграция нейтрофилов в печень в эти сроки была связана с некрозами гепатоцитов.

Через 3 сут после введения ДОК с последующим введением БК и ее амида морфологические изменения печени были сходными. Отмечались умеренная субплазмалеммальная липидная инфильтрация гепатоцитов, некроз отдельных гепатоцитов, венозное и синусоидальное полнокровие, более выраженное при применении амида БК. В обоих случаях отмечалась умеренная миграция моноцитов (в основном клеток Купфера) в перисинусоидальные пространства. Через 14 сут после введения ДОК и БК сохранялась субплазмалеммальная липидная инфильтрация гепатоцитов, в которых при этом отмечались массивные накопления гликогена. После применения ДОК и амида БК липидная инфильтрация гепатоцитов была более выраженной (по характеру как мелко-, так и крупнокапельная), при этом отложения гликогена были менее значительными, чем после применения БК. При использовании обоих тритерпеноидов регистрировалось неравномерное полнокровие сосудов. В этот срок эксперимента усиливалась мононуклеарная инфильтрация печеночной дольки.

Ультраструктурные изменения гепатоцитов через 3 сут после введения ДОК и последующего введения БК и ее амида заключались в усилении секвестрации гликогена, частичной деструкции митохондриальных крист и усилении аутофагоцитоза. Через 14 сут подобные изменения регистрировались в отдельных гепатоцитах. Следует отметить, что при сочетанном применении ДОК и тритерпеноидов так же, как и в случае с ЦФ, усиливалась эндоцитозная активность гепатоцитов, отмечалась гипертрофия и гиперплазия структурных элементов комплекса Гольджи. Синусоидные капилляры во все сроки эксперимента были обтурированы мононуклеарами и клеточным детритом.

Морфологические изменения миокарда после введения ДОК были более значительными при сравнении с ЦФ. Через 3 сут после введения ДОК отмечались литические изменения саркоплазмы и ультраструктур кардиомиоцитов. Литические изменения миофибрилл при доксорубициновом повреждении чаще носили диффузный характер. В изменениях ядрышек чаще манифестировали явления сегрегации фибриллярного и гранулярного компонентов нуклеолонемы. Практически во всех кардиомиоцитах наблюдались расширения межмембранного околоядерного пространства и агранулярной саркоплазматической сети. В то же время изменения митохондриального компартмента были незначительными и заключались в основном в неравномерном расширении крист. Важно отметить, что при доксорубициновых, как и при циклофосфановых повреждениях кардиомиоцитов, в очагах лизиса миофибрилл в этот срок эксперимента всегда регистрировались полисомы и наблюдались хаотично расположенные новообразованные миофиламенты, что свидетельствовало об активации процессов внутриклеточной регенерации.

Через 14 сут после однократного введения крысам ДОК литические и деструктивные изменения отдельных кардиомиоцитов усиливались (выявлялись очаговые и диффузные литические изменения миофибриллярных пучков и расширенные везикулы агранулярной саркоплазматической сети). В этот срок эксперимента манифестировали также расширения межмембранного околоядерного пространства, отмечались явления аутофагоцитоза (особенно в околоядерной зоне).

В группе крыс, получавших ДОК и в последующем БК или ее амид, ультраструктурные изменения кардиомиоцитов были более выраженными, чем в аналогичных группах с циклофосфановыми повреждениями. Через 3 сут после введения ДОК и последующего введения БК во многих кардиомиоцитах выявлялись значительные диффузные литические повреждения миофибриллярных пучков и саркоплазматического матрикса, в результате чего саркоплазма клеток выглядела разреженной. Манифестировали также расширения межмембранного околоядерного пространства и саркоплазматической сети. Во многих кардиомиоцитах эти изменения были даже более выраженными, чем при введении только ДОК. К 14-м суткам общий характер изменений кардиомиоцитов сохранялся, но значительно уменьшалась выраженность литических изменений миофибриллярных пучков, отмечалось более компактное расположение органелл в клетках. Одновременно в некоторых клетках наблюдались значительные вакуолеобразные расширения межмембранного околоядерного пространства, в которых часто регистрировались мембранозные образования. Следует также отметить, что в кардиомиоцитах часто встречались единичные митохондрии со значительным лизисом матрикса и выраженной редукцией крист.

В кардиомиоцитах крыс, получавших ДОК и в последующем амид БК, через 3 сут эксперимента также регистрировался весь спектр отмеченных выше ультраструктурных изменений: диффузные литические изменения миофибриллярных пучков и митохондриального компартмента, расширения межмембранного околоядерного пространства и агранулярной саркоплазматической сети. Отмечался выраженный полиморфизм ядер, в которых содержались фрагментированные и сегрегированные ядрышки. В саркоплазме кардиомиоцитов наблюдалось большое количество равномерно распределенных полисом. Через 14 сут в кардиомиоцитах значительно снижалась выраженность литических изменений миофибрилл и митохондрий; реже встречались клетки с расширенным межмембранным околоядерным пространством. Регистрировался полиморфизм ядер кардиомиоцитов, в которых содержались фрагментированные ядрышки или ядрышки с преимущественно гранулярным компонентом.

В миокарде при введении ДОК и тритерпеноидов в первые 3 сут отмечен их синергизм с цитостатиком в отношении выраженности ультраструктурных изменений основных компартментов кардиомиоцитов, но без длительного подавления процессов внутриклеточной регенерации и более быстрым восстановлением тонкой структуры клеток. Участие амида БК в стимуляции регенераторных резервов клеток показано на примере восстановления ультраструктуры кардиомиоцитов после однократного введения ЦФ (Лушникова Е.Л. и др., 2007, 2008). При этом для амида БК характерны более выраженные изменения ультраструктуры митохондрий, чем для БК. Выраженные изменения ультраструктуры митохондрий под действием амида БК косвенно свидетельствуют о возможной активации проапоптотических факторов, обеспечивающих внутренний митохондриальный механизм клеточной смерти, который является ведущим механизмом для тритерпеноидных соединений.

Полученные нами данные косвенно указывают на наличие у амида БК апоптоз-индуцирующей активности, что, вероятно, связано с его противоопухолевым действием. Важнейшей особенностью действия амида БК, выявленного нами в условиях цитостатического воздействии, является активация им репаративных сигнальных путей, с которыми связана стимуляция пластических резервов клетки. Признаками такой стимуляции были повышение на фоне сочетанного введения амида и ЦФ регенераторного резерва печени и сердца в виде увеличения пула двуядерных гепатоцитов и одноядерных кардиомиоцитов, а также более быстрое восстановления ультраструктуры кардиомиоцитов на фоне ДОК. Протекторное действие БК в условиях цитотоксического воздействия ЦФ менее выражено, оно проявилось лишь в виде стимулирующего влияния на гранулоцитарный росток крови. БК в меньшей степени, чем ее амид, снижала некрозогенное действие ЦФ в печеночной паренхиме, а также демонстрировала большую выраженность литических повреждений миофибрилл кардиомиоцитов на фоне ДОК.

Установлено, что вызываемая тритерпеноидами олеонанового типа (CDDO CDDO-Me) митохондриальная дисфункция предшествует гибели опухолевых клеток путем аутофагии (Samudio I. еt al., 2008). При этом в клетках клонированной хронической миелоидной лейкемии с помощью трансмиссионной электронной микроскопии было выявлено интенсивное образование везикул, окруженных двойной мембраной. Кроме того, иммуногистохимическими методами было обнаружено увеличение окрашивания белка LC3B, обычно связанного с аутофагосомами. Развитию аутофагии предшествовало резкое увеличение реактивных кислородных частиц, истощение пула внутриклеточного глутатиона и уменьшение потребления клетками кислорода. Причем если в субтоксических дозах тритерпеноиды нарушают процессы дыхания в опухолевых клетках, то в токсических вызывают быстрое падение митохондриального потенциала, окислительный стресс и гибель в результате апоптоза или аутофагии.

Исследование коррекции бетулоновой кислотой и ее производными

цитотоксических эффектов комбинированного введения цитостатиков

по схеме СНОР у интактных животных


В данной серии экспериментов изучались корректорные свойства БК и двух ее аланиламидных производных (-алаБК и Ме--алаБК).

Исследование морфологической картины периферической крови после введение крысам комплекса химиотерапевтических препаратов (ПХТ) выявило угнетение эритроцитарного и лейкоцитарного ростка. К 5-м суткам после цитостатического воздействия количество лейкоцитов крови снизилось на 42% и удерживалось на этом уровне в течение 10 дней. Уменьшение числа циркулирующих эритроцитов было небольшим 6-9%. Содержание тромбоцитов в циркулирующей крови достоверно не отличалось от контроля во всех группах с ПХТ. Введение БК на фоне ПХТ не оказало заметного корригирующего влияния на численность клеток белой крови. Ее аланинамидные производные, напротив, задержали развитие лейкопении и несколько снизили ее тяжесть. Так в группе с введением -алаБК количество лейкоцитов в крови на 5-й день после ПХТ уменьшилось на 28%, а в группе с его эфирным аналогом на 10-й день опыта – на 15%. В конце постцитостатического периода содержание эритроцитов и лейкоцитов в группах с введением аланинамидных производных оставалось ниже нормы, бетулоновая кислота повысила лишь уровень красных кровяных клеток. Показатели гемоглобина во всех группах коррелировали с количеством эритроцитов. Уменьшение гематокрита в первые 10 дней после ПХТ было связано с падением клеточности крови в этот период.

В результате анализа лейкоцитарной формулы, установлено достоверное снижение лимфоцитов в ответ на ПХТ (на 14 – 22% относительно контроля), сохранявшееся на протяжении всего постцитостатического периода. Введение БК и ее производных не оказало заметного влияния на выраженность лимфопении, однако Ме--алаБК  в первые 5 дней после ПХТ частично купировал этот эффект, повысив уровень лимфоцитов на 6%. Кроме того, тритерпеноиды оказали корригирующий эффект в отношении моноцитоза, развившегося под влиянием цитостатиков. В первые 5 дней после ПХТ в группах с введением БК и Ме--алаБК количество моноцитов оставалось в норме, в то время как в группе с изолированным введением цитостатиков их уровень повысился в 1,6 раза. В конце постцитостатического периода отмечена тенденция к более быстрому восстановлению содержания моноцитов в крови под действием всех тритерпеноидов.

На фоне вызванной цитостатиками лимфопении у крыс наблюдалось достоверное увеличение сегментоядерных нейтрофилов (максимально в 2,0 раза на 10-й день после ПХТ). В конце цитостатического периода данный показатель снижался, однако оставался в 1,5 раза выше по сравнению с контролем. Введение БК и ее аланинамидных производных не оказало заметного корригирующего влияния на выраженность нейтрофилеза, вызванного ПХТ. Тритерпеноиды также не влияли на уровень эозинофилов в крови, превысивший норму во всех группах с ПХТ в конце постцитостатического периода.

Следует отметить, что в конце постцитостатического периода во всех опытных группах и в референсной группе с ПХТ наблюдалось постепенное восстановление показателей периферической крови и различия между группами уменьшались. Так на 14-й день введения тритерпеноидов на фоне ПХТ,  их влияние выражалось в небольшом подъеме эозинофилов и уменьшении моноцитоза, в то время как количество нейтрофилов и лимфоцитов в основном соответствовала показателям референсной группы.

Таким образом, корректорный эффект тритерпеноидов в условиях ПХТ выражался в ослаблении ее угнетающего эффекта на лейкоцитарный росток крови в раннем постцитостатическом периоде. При этом регулирующее влияние агентов было направлено преимущественно на моноциты, а не гранулоциты.

Анализ препаратов костного мозга через 15 дней после цитостатического воздействия показал, что во всех группах с ПХТ в целом происходит восстановление костномозгового кроветворения. Содержание стромальных и миелоидных клеток у крыс не выходило за пределы аналогичных показателей в контроле. Соотношение предшественников и зрелых миелоцитов (индекс созревания) соответствовало норме. Вместе с тем, в костном мозге крыс с изолированным введением цитостатиков отмечалось увеличение количества эозинофильных и моноцитарных клеток (в 1,3 и 1,7 раз относительно контроля). В группах с введением БК и β-алаБК происходила коррекция этих элементов до уровня контроля. Эфир амида подобным эффектом не обладали. Аланинамидные производные БК нормализовали также количество плазматических клеток, которое возрастало после введения цитостатиков. Состояние гемопоэтических предшественников эритроцитов и тромбоцитов свидетельствовало о завершении восстановительного периода эритро- и мегакариоцитопоэза через 15 дней после ПХТ. Достоверно не отличалось от контроля и количество костномозговых лимфоцитов у всех животных после ПХТ, хотя содержание эритроцитов и лимфоцитов в циркулирующей крови в эти сроки еще не достигало нормы.

Данные анализа костного мозга свидетельствуют о более ранней нормализации основных клеточных элементов под действием тритерпеноидов с преимущественным влиянием на клетки моноцитарного ряда. 

Отмеченные ранее особенности корректорного действия тритерпеноидов в опытах с циклофосфаном и доксорубицином проявились также на фоне экспериментальной химиотерапии по схеме СНОР. В частности, выявленный тимус-протекторный эффект агентов  подтвердился в результате морфологического исследования ткани этого лимфоидного органа. Показано, что через 15 дней после цитостатического воздействия в тимусе наблюдается мелкоочаговая гипоплазия лимфоидной ткани, которая проявлялась в виде относительного снижения плотности его лимфоклеточной популяции, сужения корковой части, увеличения числа телец Гассаля в мозговом веществе (табл. 11).

По литературным данным, в результате воздействия противоопухолевых препаратов наступает дезорганизация тимуса, которая характеризуется истончением коркового вещества, инверсией окраски коркового и мозгового слоев и сопровождается сокращением массы тимуса. При этом количество Thy1,2+ в костном мозге животных резко сокращается (Гольдберг Е.Д. и др., 1999). В нашем эксперименте под влиянием СНОР корково-мозговой индекс снизился в 1,6 раз относительно контроля. Это указывает на уменьшение поступления из костного мозга в корковую зону тимуса низкодифференцированных лимфоцитов, что может являться следствием как угнетения костномозгового кроветворения, так и гипоплазии самого тимуса. Последнее предположение подтверждается данными морфологического анализа, выявившим увеличение числа телец Гассаля, которые являются продуктами дегенерации медулярных клеток тимуса и содержат в основном кератины. Введение тритерпеноидных агентов на фоне СНОР привело к повышению корково-мозгового индекса и снижению количества телец Гассаля в паренхиме тимуса. Наиболее выраженный тимус-протекторный эффект проявил β-алаБК, увеличивший тимический индекс в 1,8 и снизивший число телец Гассаля в 2,2 раза. Соответствующее корректорное действие его метилового эфира и самой БК проявилось слабее (см. табл. 11).

Таблица 11. Влияние БК и ее -аланиламидных производных на морфометрические показатели ткани тимуса крыс в постцитостатическом периоде

Группа

Объемная плотность, Vv %

Индекс К/М

Количество телец Гассаля

К

М

Контроль

64,61±1,02

35,56±1,03

1,97±0,10

3,37±0,23

ПХТ

55,62±1,03*

43,41±1,00

1,22±0,06*

7,16±0,26*

ПХТ+БК

60,32±1,03

39,68±1,03

1,55±0,06

5,05±0,18

ПХТ+-алаБК

68,58±0,68#

31,42±0,68#

2,22±0,07#

3,28±0,12#

ПХТ+ Ме--алаБК

57,83±0,88*

43,24±1,04*

1,4±0,05

6,04±0,18*

Примечание. К – кора; М - мозговое вещество. * - р<0,05 в сравнении с контролем;  # - р<0,05 в сравнении с ПХТ.

Морфологическое исследование почек, проведенное через 15 дней после введения комплекса цитостатиков, выявило развитие альтеративных процессов, как в паренхиме, так и клубочках. На гистологических срезах наблюдалось полнокровие сосудов, отек интерстиция, расширение мезангия, сужение просвета капсулы Шумлянского-Боумена, дистрофические и атрофические изменения эпителиоцитов канальцев. На всем протяжении канальцевой системы, в том числе и в собирательных трубочках, расширенный просвет был заполнен белково-клеточными массами, встречались гиалиновые цилиндры.

На 15-е сутки после ПХТ СНОР у животных референсной группы объемная плотность нефроцитов, находящихся в состоянии дистрофии, превышала соответствующие показатели в контроле в 37,5 раз, в состоянии некроза – в 3,2 раза. Сужение просвета капсулы составляло 27% от контроля (табл. 12).

Таблица 12. Влияние БК и ее -аланиламидных производных на морфометрические показатели ткани почек крыс в поститостатическом периоде

Группа

Паренхима Vv,%

Дистрофия Vv,%

Некрозы Vv,%

Диаметр сосудистого клубочка

Просвет капсулы

Контроль

96,87±0,28

0,35±0,10

0,18±0,07

2,97±0,04

0,32±0,01

ПХТ

92,16±0,21

13,14±0,38*

0,58±0,06*

2,92±0,04

0,09±0,01*

ПХТ+БК

91,27±0,28

3,63±0,26#

0,51±0,07*

2,61±0,04

0,26±0,04#

ПХТ+ -алаБК

91,6±0,44

4,53±0,20*#

0,24±0,05*#

2,88±0,03

0,26±0,01#

ПХТ+ Ме--алаБК

91,62±0,43

4,11±0,18*#

0,23±0,05*#

2,85±0,05

0,14±0,01

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с контролем;  # - р<0,05 в сравнении с ПХТ.

Оценка влияния изучаемых соединений на альтеративные процессы в почках, вызванные СНОР, показала, что тритерпеноиды существенно ослабляли нефротоксическое действие цитостатических препаратов. Введение крысам БК и ее производных вызывало снижение объемной плотности нефроцитов в состоянии дистрофии по сравнению с изолированным введением цитостатиков. На фоне БК объемная плотность нефроцитов проксимальных канальцев в состоянии дистрофии уменьшилась на 72%, на фоне -алаБК – на 65%, Ме--алаБК– на 69%. Объемные плотности некрозов снижались у животных, получавших -алаБК – в 2,4 раза, Ме--алаБК – в 2,5 раза, тогда как под влиянием БК существенного снижения не наблюдалось. Все тритерпеноиды, кроме Ме--алаБК, способствовали восстановлению просвета капсулы (табл. 16).

Таким образом, курсовое введение БК, и особенно ее аланинамидных производных в постцитостатическом периоде, уменьшало признаки токсического нефроза, оказывая позитивное влияние на состояние нефрона.

Морфологическое исследование печени показало, что на 15-й день после введения комплекса цитостатических препаратов ее балочная структура в основном сохранялась, однако в ней наблюдались выраженные альтеративные изменения: отек интерстиция, полнокровие вен, значительное сужение синусоидальных капилляров, просвет которых местами не определялся. Отмечены дистрофия гепатоцитов, фокальные микронекрозы, наиболее выраженные в центральных отделах долек.

Объемная плотность дистрофических и некротических изменений под влиянием цитостатиков достигала 64,82 и 11,37% объема паренхимы (табл. 13). У животных в группе с изолированным введением цитостатических препаратов наблюдалось снижение, относительно контроля, объемной плотности синусоидов на 46,43%, увеличение цитоплазмы гепатоцитов на 15,28%, снижение ядерно-цитоплазматического отношения на 20%. Количество двуядерных гепатоцитов снизилось на 38,63%, что свидетельствует о депрессии пролиферативных процессов.

Введение тритерпеноидов способствовало восстановлению гистологической картины печени. В печеночной паренхиме наблюдалось уменьшение отека, увеличение просвета синусоидов, сокращение количества некротизированных участков, цитолитических повреждений гепатоцитов, количества клеток с пикнотическими ядрами. Отмечено умеренное неравномерное полнокровие сосудов (центральных вен) и синусоидных капилляров преимущественно в центре долек. Тритерпеноиды достоверно уменьшали степень выраженности альтеративных изменений гепатоцитов, вызванных введением цитостатических препаратов. Введение БК вызвало достоверное уменьшение в 11,5 раз объемной плотности гепатоцитов в состоянии дистрофии относительно референсной группы (ПХТ – 64,8%, БК – 5,6%). В группах животных с введением -алаБК и Ме--алаБК также наблюдалось достоверное снижение объемной плотности дистрофических изменений в 4 и 6,6 раза соответственно, однако по степени выраженности гепатозащитного действия аланиламидные производные уступали БК. Введение БК на фоне ПХТ уменьшало в 6,6 раза показатель объемной плотности некрозов (ПХТ – 11,3%, БК – 1,7%). Введение животным аланинамидных производных БК после ПХТ сопровождалось недостоверным снижением объемной плотности некрозов. Согласно данным таблицы, все тритерпеноиды восстанавливали до нормы объемную плотность синусоидов.

Таблица 13. Влияние БК и ее -аланиламидных производных на морфометрические показатели ткани печени крыс в постцитостатическом периоде

Группа

Дистрофия, Vv,%

Некрозы, Vv,%

Синусоиды, Vv,%

Двуядерные гепатоциты

Отношение Я/Ц

Контроль

2,78±0,42

1,19±0,31

25,63±0,83

7,74±0,51

0,25±0,009

ПХТ

64,82±1,15*

11,31±0,60*

13,74±1,40*

4,75±0,46

0,20±0,01*

ПХТ+БК

5,63±0,6#

1,72±0,63#

31,51±1,08#

6,46±0,5

0,28±0,02

ПХТ+ -алаБК

16,39±0,77*#

7,36±1,18

23,22±0,99

6,95±0,56

0,26±0,02

ПХТ+ Ме--алаБК

16,47±1,17*#

6,14±0,68

24,63±1,26

0,31±0,02

0,31±0,02

Примечание. Я/Ц – ядерно-цитоплазматическое отношение. * - р<0,05 в сравнении с контролем; # - р<0,05 в сравнении с ПХТ.

Нормализация структуры печени под влиянием БК и ее производных сопровождалась увеличением объемной плотности ядер при сохранении нормальной плотности цитоплазмы, что привело к достоверному повышению ядерно-цитоплазматического отношения в этих группах. Полученные результаты указывают на усиление синтетических процессов в клетках печени, что свидетельствует о повышении их функциональной активности. В связи с этим обращает на себя внимание, что Ме--алаБК в большей степени, чем остальные тритерпеноиды увеличивал ядерно-цитоплазматическое отношение и количество двуядерных гепатоцитов.

Данные морфологического анализа свидетельствуют о том, что коррекция лупановыми тритерпеноидами структурных повреждений в тканях и клеточных компартментах в результате изолированного введения цитостатиков или их комбинации здоровым животным, обеспечивается в основном противовоспалительным действием данных агентов. Основываясь на данных различных исследователей, свидетельствующих об индукции тритерпеноидами цитопротекторных сигнальных путей в ответ на действие провоспалительных факторов, можно предположить, что производные бетулоновой кислоты на фоне введения цитостатиков активируют сигнальный путь Nrf2. Этот вывод подтверждается данными группы исследователей, которые обнаружили у ряда цианопроизводных бетулоновой кислоты способность подавлять индуцированную макрофагами синтазу окиси азота и активировать NAD(P)H хинон оксидоредуктазу и гемоксигеназу – ферменты второй фазы репарационного ответа, с помощью которых клетки подавляют развитие электрофильного или окислительного стресса (Liby K. Et al., 2007).

Еще одним доказательством выдвинутого предположения являются результаты исследования, в котором изучалось влияние тритерпеноида олеонанового типа ODDO-Im на развитие острого Т-клеточного воспаления в печени мышей, вызванного введением конковалина А (Osburn W.O. et al., 2008). В данной модели  развитие иммуногенного воспалительного процесса сопровождается выделением активированными макрофагами про-воспалительных цитокинов, что приводит к некрозам гепатоцитов. Используя различные линии нокаутных мышей, авторы показали, что ODDO-Im уменьшает воспалительное повреждение печени путем активации генов сигнального пути Nrf2, уменьшая при этом экспрессию про-воспалительных генов и снижая секрецию эффекторных клеток на поздних стадиях воспаления. Эти результаты продемонстрировали, что усиление сигнализации Nrf2 обеспечивает мощную защиту печени от воспалительного и иммуногенного некроза гепатоцитов.

Другой возможной мишенью лупановых соединений могут являться белки-регулятоы сигнального пути NFB, выступающего ключевым регулятором воспалительного процесса и контролирующего экспрессию различных цитокинов и факторов адгезии (Lu H. Et al., 2006). Лупановые тритерпеноиды – бетулин и бетулиновая кислота, как было показано на культуре стимулированных IFN- макрофагов, подавляют активность выделяемых ими провоспалительных цитокинов IL-1, TNF-, а также снижают активность индуцибельных синтазы окиси азота и циклоосигеназы-2 (Suh N. Et al., 1998, 1999). Аналогичные результаты были получены на такой же модели для лупеола (Fernandes M.A. et al., 2001) и ряда олеонановых и урсановых тритерпеноидов (Honda T. et al., 1997). Приведенные данные могут являться доказательством кардиопротекторного действия олеоноловой и урсоловой кислот в модели оксидативного повреждения миокарда, вызванного введением некрозогенного агента изопротеринола (Senthil S. Et al., 2007). В последнем случае тритерпеноиды существенно снижали количество некротизированных клеток и уровень ТБАС в ишемизированном миокарде.

Полученные нами данные свидетельствуют о вовлеченности иммунной системы в механизмы корректирующего влияния лупановых тритерпеноидов. На это указывают модулирующий эффект бетулоновой кислоты и ее производных на численность клеток гранулоцитарно-моноцитарного ряда, являющихся эффекторами иммунных и воспалительных реакций, а также выявленное тимус-протекторное действие этих агентов. Сообщалось, что иммунорегулирующая активность характерна также для других тритерпеноидов – олеаноловой и урсоловой кислот (Rafael TJ Kuttan, 2003) и их производных (Hsu H-J et al., 1997), бетулиновой и бетулоновой кислот и их амидов (Покровский А.Г. и др., 2001). На тесную связь противовоспалительных и иммунокорректорных свойств лупановых агентов указывают данные (Zdzisinska B. Et al., 2003), полученные на культуре цельной крови человека. Они показывают, что бетулиновая кислота не влияет на продукцию секретируемого стимулированным моноцитами TNF-, но уменьшает соотношение IFN-/ IL-10. Принимая во внимание, что про-воспалительный IFN- секретируется популяцией Th1 клеток, а противовоспалительный IL-10 – популяцией Th2, то можно сделать заключение о сложном характере регуляторных взаимодействий тритерпеноидов с их молекулярными мишенями в клетке.

Таким образом, на основании приведенных данных можно предположить, что механизмы цитопротекторного действия лупановых тритерпеноидов могут обеспечиваться их регулирующим влиянием на внутриклеточную сигнальную трансдукцию, а также на клеточные и гуморальные факторы иммунной системы, контролирующие процессы воспаления и оксидативного стресса.

Оценка политаргетного действия тритерпеноидов в условиях цитостатической

полихимиотерапии СНОР у животных с перевиваемыми опухолями


Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию печени мышей с перевитой карциномой легких Льюис (LLC) на фоне ПХТ. В печени животных с перевитой карциномой Льюис выявлены морфологические изменения, связанные с общим и местным влиянием опухоли, а также изменения, обусловленные проведением ПХТ и введением изучаемых химических соединений. У мышей всех групп наблюдались очаговые клеточные метастазы, часто в просвете синусоидов с активным делением в них опухолевых клеток.

У мышей с LLC (контрольная группа) отмечались в разной степени выраженности проявления регенераторно-пластической недостаточности гепатоцитов (дистрофия, атрофия некоторых клеток). Ведущим типом поражения гепатоцитов была очаговая «опустошенность» цитоплазмы, ассоциированная с лизисом и секвестрацией гранул гликогена. В то же время вблизи портальных трактов отмечалась пролиферация гепатоцитов, появление небольших двуядерных клеток с ацидофильной цитоплазмой и гиперхромными ядрами. Появление мелких двуядерных гепатоцитов в условиях метастазирования свидетельствует о сохранении их регенераторного потенциала. Нарушения гемодинамики проявлялись в виде неравномерного полнокровия и частичной окклюзии просвета синусоидов. Стенки сосудов были PAS-положительными, толуидиновый синий вызывал их метахроматическое окрашивание, а при окраске по методу ван Гизона соединительная ткань в этих структурах не выявлялась. На полутонких срезах в просветах синусоидов обнаруживались звездчатые клетки и полинуклеарные лейкоциты.

ПХТ обусловливала массивную гибель гепатоцитов с формированием крупных очагов некроза. Во многих гепатоцитах отмечалась крупно- и мелкокапельная липидная инфильтрация цитоплазмы (размеры жировых капель иногда были сопоставимы или превышали размеры ядер). Гликоген в виде разной степени интенсивности PAS-положительных скоплений выявлялся преимущественно в гепатоцитах перипортальных зон; во многих гепатоцитах наблюдалось истощение запасов гликогена с формированием в этих участках «оптически» пустых пространств. Отмеченные морфологические изменения гепатоцитов характерны и для действия других лекарственных препаратов и расцениваются некоторыми авторами как стереотипные (Непомнящих Г.И. и др., 2008; Молодых О.П. и др., 2010). При проведении ПХТ на 88% возрастала доля моноцеллюлярных некрозов гепатоцитов в центролобулярных зонах (табл. 14). Доля синусоидов со свободными просветами уменьшалась на 21%.

Таблица 14. Стереологический анализ печени при введении бетулоновой кислоты и ее производных на фоне полихимиотерапии мышей с перевитой карциномой Льюис (M±m)

Группа

Объемная плотность, Vv, %

дистрофические измененные гепатоциты

некротически измененные гепатоциты

синусоиды

лейкоциты

метастазы

Контроль (LLC)

0,64±0,22

0,09±0,13

0,21±0,22

0,020±0,06

0,050±0,009

LLC + ПХТ

0,62±0,03

0,15±0,09**

0,15±0,06*

0,028±0,07

0,046±0,010

LLC + ПХТ + БК

0,59±0,04

0,09±0,09

0,21±0,02

0,06±0,02

0,03±0,010*

LLC +ПХТ + МеБК

0,62±0,01

0,12±0,01

0,21±0,01

0,024±0,005

0,034±0,008*

LLC +ПХТ+Ме--алаБК

0,63±0,01

0,12±0,02

0,17±0,01

0,036±0,008

0,034±0,008*

LLC +ПХТ +-алаБК

0,61±0,03

0,07±0,01#

0,18±0,01

0,017±0,007

0,043±0,030

LLC +БК

0,64±0,04

0,11±0,05

0,19±0,03

0,023±0,005

0,038±0,030

LLC +МеБК

0,64±0,06

0,09±0,08

0,19±0,09

0,025±0,030

0,055±0,020

LLC +Ме--алаБК

0,64±0,05

0,09±0,07

0,16±0,08

0,024±0,020

0,051±0,030

LLC +-алаБК

0,63±0,08

0,04±0,05**

0,27±0,05*

0,024±0,020

0,022±0,020*

Примечание. LLC – карцинома легких Льюис, ПХТ – полихимиотерапия; БК – бетулоновая кислота; МеБК – метиловый эфир БК. * – p < 0,05, ** – p < 0,01 – по сравнению с контролем; # – p < 0,05 – по сравнению с LLC+ ПХТ.

Введение тритерпеноидов на фоне ПХТ обусловливало изменения структуры гепатоцитов и синусоидов. При введении БК и -алаБК доля дистрофически измененных гепатоцитов существенно не изменялась по сравнению с контролем и ПХТ, но выраженность изменений была меньше: в гепатоцитах практически отсутствовали зоны «опустошения» цитоплазмы и липидная инфильтрация, отмечалась незначительная субплазмалеммальная вакуолизация цитоплазмы. Доля моноцеллюлярных некрозов после введения БК и -алаБК уменьшилась соответственно на 42 и 53% при сравнении с ПХТ, но не с контролем. Введение мышам МеБК и Ме -алаБК на фоне ПХТ не приводило к существенному снижению объемной плотности некротически измененных гепатоцитов по сравнению с ПХТ.

Сочетанное воздействие всех тестируемых соединений с ПХТ вызывало изменения синусоидального русла и перицеллюлярных пространств (пространств Диссе). В ряде случаев отмечалось склерозирование пространств Диссе с разрастанием пучков коллагеновых волокон вокруг гепатоцитов. Склеротические процессы сопровождались появлением в просветах синусоидов и перисинусоидально звездчатых клеток с липидными включениями в цитоплазме. Повреждение гепатоцитов и активация медиаторами воспаления звездчатых клеток, приводящая к усилению синтеза коллагена, являются основными факторами, вызывающими нарушение архитектоники и уменьшение (или прекращение) транссинусоидального обмена (Непомнящих Д.Л. и др., 2006; Жукова Н.А. и др., 2008; Молодых О.П. и др., 2008).

Коллагенизацию пространств Диссе и «капилляризацию» синусоидов после проведения ПХТ и введения тритерпеноидов можно рассматривать в качестве компенсаторно-приспособительного ремоделирования печени в ответ на действие токсических соединений. Снижение транссинусоидального обмена в условиях повышенного содержания в крови цитопатических агентов способствует уменьшению повреждения гепатоцитов, но одновременно замедляет приток пластических веществ и факторов роста, необходимых для внутриклеточной и клеточной регенерации.

ПХТ и ее сочетания с исследуемыми химическими агентами вызывали существенное уменьшение объемной плотности метастазов в просветах синусоидов. Наиболее значительно объемная плотность метастазов уменьшалась после сочетания ПХТ с тритерпеноидами: после сочетания с БК – на 50%, после сочетания с МеБК и Ме -алаБК – на 43% по сравнению с LLC (p<0,05). Как следствие, введение БК, МеБК и Ме -алаБК на фоне ПХТ способствовало увеличению объемной плотности синусоидов со свободными просветами как по сравнению с LLC (на 5 – 11%), так и по сравнению только с ПХТ (на 33 – 40%).

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию печени мышей с перевитой лимфомой RLS. Лимфома RLS является злокачественной неходжкинской крупноклеточной лимфомой, относительной резистентной к ЦФ. В печени всех животных выявлялись множественные метастазы, расположенные преимущественно перипортально. В центре и по периферии метастатических очагов наблюдались мелко- и крупноочаговые фибриноидные некрозы гепатоцитов, инфильтрированные мононуклеарами. Гепатоциты находились в состоянии дистрофии различной степени выраженности. Под влиянием комплекса цитостатиков в печени развивался гепатоз, сопровождавшийся ростом некротических повреждений гепатоцитов (на 28% по сравнению с контролем) (табл. 15). Объемная плотность синусоидов была снижена незначительно.

Таблица 15. Изменение объемной плотности структурных компонентов печени мышей с перевитой лимфомой RLS в результате курсового введения агентов на фоне и без ПХТ (M±m)

Экспериментальная группа

Дистрофические измененные гепатоциты

Некротически измененные гепатоциты

Синусоиды

RLS

0,58± 0,017

0,29± 0,036

0,11± 0,010

RLS + ПХТ

0,42± 0,040*

0,37± 0,017

0,095± 0,020

RLS + ПХТ + БК

0,49± 0,017

0,31± 0,026

0,11± 0,004

RLS + ПХТ + -алаБК

0,53± 0,010#

0,19± 0,014#

0,13± 0,011

RLS + БК

0,45± 0,016*

0,31± 0,017

0,14± 0,008

RLS + -алаБК

0,52± 0,024

0,26± 0,018

0,12± 0,009

Примечание. RLS – лимфома RLS, БК – бетулоновая кислота, АБК – амид бетулоновой кислоты, ПХТ – полихимиотерапия.* - p < 0,05 относительно животных с RLS; # - p < 0,05 относительно ПХТ.

Введение тритерпеновых соединений на фоне ПХТ вызывало снижение, по сравнению только с ПХТ, количества гепатоцитов в состоянии некроза. При этом выраженность дистрофических изменений существенно уменьшалась. Указанные положительные сдвиги проявлялись наиболее ярко у мышей, которым вводили -алаБК. По данным морфометрического анализа (см. табл. 15), под действием аланинамидного производного БК достоверно снижалась объемная плотность некрозов (на 63%) по сравнению с ПХТ. В группе с введением БК аналогичные сдвиги были незначительными. В обеих группах отмечена тенденция к росту объемной плотности синусоидов (на 28% для -алаБК, на 10% для БК).

В отсутствии ПХТ -алаБК не оказывал достоверного влияния на объемную плотность некрозов и дистрофий. По сравнению с ним БК достоверно снижала объемную плотность дистрофий (на 24%), но также не влияла на некробиоз. БК способствовала также увеличению объемной плотности синусоидов.

Представленные данные свидетельствуют о том, что аланинамидное производное БК оказывает заметный гепатопротекторный эффект на мышей со злокачественной лимфомой, который выражается в уменьшении некробиотических повреждений паренхимы. БК на фоне ПХТ не оказывал заметного влияния на печень, хотя в отсутствии цитостатиков и вызывала сдвиги в отдельных показателях.

Результаты, полученные на животных с перевиваемыми опухолями, коррелируют с данными, установленными в модели экспериментальной полихимиотерапии на интактных крысах, которые свидетельствуют о снижении объемной плотности некрозов и дистрофий в печени под действием бетулоновой кислоты и ее аланиламидных производных. Наблюдаемое в условиях полихимиотерапии уменьшение метастатических поражений в синусоидах наряду с сокращением объемной плотности некрозов гепатоцитов, свидетельствует об активации тритерпеноидами апоптоза. Обнаруженная у этих соединений способность усиливать васкулопатию коррелировала с повышенной инфильтрацией синусоидов полинуклеарами. Возможно ремоделирование выстилки синусоидов связано с воздействием на нее продуктов секреции моноцитарных клеток, таких как цитокины, матриксные металлопротеиназы, коллагеназы, катепсин В (Mantovani A. Et al., 2008). Кроме того, нельзя исключить возможность активации под действием тритерпеноидов системы комплимента. Известно, что в результате повышения активности комплимента увеличивается продукция фактора С5а, который стимулирует нейтрофилы. Активированные нейтрофилы, накапливаясь в капиллярах, могут вызывать повреждение эндотелия путем выделения токсичных кислородных метаболитов (Козлов Л.В. и др., 2007).

Данные литературы свидетельствуют о том, что характер структурных и внутриклеточных изменений в тканях, наблюдаемых под действием лупановых тритерпеноидов, может быть непосредственно связан с их влиянием на продукцию реактивных кислородных соединений. На примере бетулиновой и некоторых производных олеоноловой кислот было показано, что в низких концентрациях тритерпеноиды оказывают цитопротекторное действие, уменьшая оксидативный стресс в клетках, а в высоких – способствуют накоплению реактивных продуктов окисления (Sporn M.B. et al., 2006; Liby K. et al., 2007). Последнее наблюдение непосредственно связано с механизмом их противоопухолевого действия. Известно, что тритерпеноиды запускают процессы гибели в опухолевых клетках внутренним путем апоптоза, связанным с нарушением проницаемости митохондриальной мембраны и последующим выходом апоптоз-стимулирующих факторов, которые, в свою очередь, сдвигают редокс-баланс в клетке в направлении оксидативного стресса.

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек мышей с перевитой LLC. В почках животных с LLC выявлены преимущественно морфологические изменения проксимальных канальцев в виде умеренно выраженных дегенеративно-некротических изменений эпителиоцитов. Изменения клубочков и интерстициальной ткани были минимальными. В отдельных клубочках выявлялись лишь незначительное расширение мезангиального матрикса и отложения фибрина в виде PAS-позитивной субстанции между петлями капилляров. Выявленные поражения почек у животных с перевитой опухолью (отсутствие метастазов, повреждение сосудов клубочков и интерстициальной ткани, минимальные патологические изменения в канальцах), позволяют сделать заключение о паранеопластическом характере нефропатии.

Введение комплекса цитостатиков по схеме CHOP привело к развитию у мышей тубулоинтерстициального нефрита в сочетании с мембранозной нефропатией. Основные патологические изменения выявлены в эпителиоцитах проксимальных канальцев: набухание цитоплазмы и фрагментация щеточной каймы, очаговая дистрофия и некрозы эпителиоцитов отдельных канальцев.

По данным морфометрического анализа, относительный объем эпителиоцитов с выраженными дистрофическими изменениями увеличился на 157%, на 77% уменьшилась доля эпителиоцитов со слабо выраженными дистрофическими процессами (табл. 16). На фоне ПХТ на 366% возрастала объемная плотность очагов некрозов эпителиоцитов. В просвете собирательных трубочек определялись гиалиновые цилиндры, в интерстициальной ткани развивались умеренное полнокровие и периваскулярный отек. Существенного изменения относительного объема интерстициальной ткани и просвета канальцев при проведении ПХТ не выявлено. ПХТ в данном эксперименте осложняла течение нефропатии и сопровождалась увеличением дегенеративно-некротических повреждений нефроцитов.

Введение БК, ее метилового эфира и двух -аланиламидных производных БК снизило степень альтерации в проксимальных канальцах. Отмечено уменьшение объемной плотности эпителиоцитов в состоянии некроза (на 80 – 98%) и выраженной дистрофии (на 54 – 60%). Кроме того, увеличился объем эпителиоцитов с признаками слабо выраженной дегенерации на 170 – 180% (см. табл. 16). Под действием -аланиламида БК и его метилового эфира просвет проксимальных канальцев увеличился на 50 – 75% вследствие уменьшения отека эпителиоцитов и щеточной каймы. Наиболее выраженная положительная динамика репаративных процессов наблюдалась на фоне введения -аланиламида БК.

Таблица 16. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных, вводимых на фоне полихимиотерапии, на объемную плотность структур почек мышей с карциномой легких Льюис (M±m)

Экспериментальная группа

Эпителиоциты

Интести-циальная ткань

Просвет канальцев

умеренная дистрофия

выраженная дистрофия

некрозы

LLC

0,54±0,01

0,19±0,02

0,015±0,003

0,14±0,004

0,11±0,01

LLC + ПХТ

0,18±0,015***

0,49±0,023***

0,07±0,011**

0,15±0,004

0,12±0,008

LLC + ПХТ + БК

0,50±0,007###

0,23±0,016###

0,012±0,005##

0,12±0,008

0,13±0,009

LLC + ПХТ + МеБК

0,46±0,016###

0,27±0,014###

0,009±0,004##

0,13±0,007

0,14±0,013

LLC+ПХТ+ -алаБК

0,46±0,009###

0,19±0,011###

0,0026±0,001##

0,14±0,017

0,21±0,012###

LLC+ПХТ+ Ме--алаБК

0,42±0,004###

0,26±0,008###

0,017±0,003##

0,13±0,004

0,18±0,006##

LLC+БК

0,46±0,01**

0,23±0,018

0,007±0,004

0,14±0,005

0,17±0,004**

LLC+МеБК

0,48±0,007**

0,19±0,018

0±0**

0,14±0,009

0,17±0,004**

LLC+ -алаБК

0,50±0,011**

0,22±0,017

0,0023±0,001*

0,11±0,011*

0,17±0,009*

LLC+ Ме--алаБК

0,47±0,006**

0,21±0,011

0,0021±0,001*

0,15±0,011

0,18±0,005**

Примечание. LLC – карцинома легких Льюис, ПХТ – полихимиотерапия, БК – бетулоновая кислота. *** - p < 0,001; ** - p < 0,01 - относительно V группы; ### - p < 0,001; ## - p < 0,01 – относительно VI группы.

В отсутствии ПХТ лупановые тритерпеноиды снижали у мышей выраженность паранеопластической нефропатии. В проксимальных канальцах отмечалось уменьшение в среднем на 56% объемной плотности некрозов эпителицитов (см. табл. 16). Доля эпителиоцитов с мелковезикулярной липидной инфильтрацией и фрагментированной щеточной каймой уменьшилась в среднем на 8 – 13% по сравнению с контролем. Во всех группах после введения тритерпеновых соединений отмечалось уменьшение отека эпителиоцитов проксимальных канальцев и щеточной каймы, в результате чего просвет канальцев увеличился на 54%. Кроме того, -аланиламид БК несколько уменьшил (на 22%) отек интерстциальной ткани. Следует отметить, что БК и ее производные не оказали заметного влияния на состоянии гломерулярного аппарата, где по-прежнему сохранялись утолщение базальной мембраны клубочков и увеличение объема мезангиального матрикса.

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек мышей с перевитой лимфомой RLS. После инокуляции клеток опухоли, в почках подопытных животных развивались мелкоочаговые метастазы, располагавшиеся в петлях капилляров клубочков, по ходу кровеносных сосудов в корковом веществе, а также в интерстициальной ткани на границе коркового и мозгового вещества. Метастазы четко отграничены от окружающих тканей. В нефроцитах, эпителиоцитах дистальных, проксимальных канальцев, собирательных трубочек наблюдалось развитие дегенеративных и некротических процессов. Просвет канальцев был расширен и заполнен слущенными клетками, детритом щеточной каймы, фибрином. В интерстициальной ткани отмечался выраженный отек, слабо выраженная инфильтрация мононуклеарами, полнокровие сосудов.

Введение цитостатиков приводило к развитию у мышей тяжелого некротического нефроза, сопровождавшегося увеличением некротических повреждений нефроцитов (на 35% по сравнению с контролем) (табл. 17). Клетки канальцевого эпителия отечные, просвет проксимальных канальцев полностью заполнен некротизированной щеточной каймой и клеточным детритом. Отмечалось незначительное (на 28% по сравнению с контролем) уменьшение объема интерстициальной ткани, обусловленное сохранением отечности.

Таблица 17. Объемная плотность структурных элементов паренхимы почек мышей с лимфомой RLS (M±m)

Группа

Дистрофические изменения канальцевого эпителия

Некротические изменения канальцевого эпителия

Просвет канальцев

Интерстициальная ткань

RLS

49,0±1,08

17,0±3,5

14,0±0,7

10,0±1,0

RLS + ПХТ

49, 0±3,2

23,0±6,5

14,0±0,4

7,2±1,5

RLS + ПХТ + БК

56, 0±3,6

17,0±4,8

16,0±1,2

4,9±1,1

RLS + ПХТ + -алаБК

75,0±1,5*#

4,0±0,4*#

8,0±0,4*

6,8±0,5*#

RLS + БК

58,0±6,6

22,0±4,6

12,0±1,7

6,6±0,3

RLS + -алаБК

67,0± 4,2*

8,0±1,09*

10,0±0,7*

6,7±0,9

Примечание. БК – бетулоновая кислота, -алаБК – амид бетулоновой кислоты, ПХТ – полихимиотерапия.* - p < 0,05 относительно контроля; # - p < 0,05 относительно ПХТ.

Под влиянием изучаемых соединений, вводимых на фоне ПХТ, снижалась выраженность структурных повреждений почек за счет уменьшения очагов некроза и отечности интерстициальной ткани. Отмеченные сдвиги наиболее ярко проявлялились при введении амида БК. В этой группе животных достоверно снижалось (на 77%) количество некротизированных нефроцитов и возрастало (на 53%) количество клеток со слабо выраженной дистрофией по сравнению с ПХТ. Введение амида БК вызывало также уменьшение на 43% просвета канальцев.

В отсутствие полихимиотерапии амид БК проявлял значимый, хотя и менее выраженный, чем в комбинации с цитостатиками, нефропротективный эффект. У животных этой группы снижение некрозов канальцевого эпителия составило 53%, а увеличение количества клеток со слабо выраженной гиалиново-капельной дистрофией – 37% по сравнению с контролем; просветы канальцев уменьшились на 29%. Введение БК мышам с лимфомой в тех же условиях приводило к незначительным однонаправленным изменениям показателей объемной плотности зон дистрофических нарушений, просвета канальцев и интерстициальной ткани. Обращает на себя внимание увеличение количества некротических повреждений нефроцитов в этой группе животных.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что изучаемые тритерпеноиды снижают тяжесть повреждений почек мышей со злокачественной лимфомой, вызванную ПХТ, путем уменьшения дегенеративно-некротических изменений нефроцитов, отека интерстициальной ткани и просвета канальцев. -аланиламид БК обладает выраженным нефропротективным действием, уменьшая степень некробиоза нефроцитов как на фоне полихимиотерапии, так и без нее. БК в тех же условиях не оказывала значимого эффекта.

Влияние агентов на показатели белой крови и костного мозга у мышей с перевиваемыми опухолями. Через 8 сут после ПХТ в лейкоцитарном профиле крови мышей с LLC выявлено достоверное увеличение общего количества лейкоцитов (в 1,5 раза), в том числе палочкоядерных нейтрофилов (в 1,8 раза). Повышение числа юных полиморфноядерных лейкоцитов, а также появление их предшественников метамиелоцитов свидетельствует о сдвиге лейкоцитарной формулы влево и может быть связано с активацией воспаления, вызванного некротизацией опухолевого узла под действием цитостатиков. На фоне увеличения общей клеточности белой крови отмечено угнетение ее лимфоцитарного ростка (в 1,5 раза), что свидетельствует о серьезных нарушениях процессов дифференцировки и созревания предшественников лимфоцитов в костном мозге и тимусе.

Введение БК и ее производных на фоне ПХТ не оказало влияния на выраженность лимфопении и сдвиги в соотношении полиморфноядерных гранулоцитов. Однако БК, в отличие от остальных тритерпеноидов, достоверно усилила (в 1,4 раза) лейкоцитоз в крови по сравнению с ПХТ. Ее метиловый эфир и оба аланиламида, напротив, снизили общее количество лейкоцитов. При этом для всех производных БК было характерно увеличение моноцитов в крови более чем в 2 раза относительно контроля. Максимальная выраженность моноцитоза отмечена для -аланиламида БК, который значимо повышал данный показатель относительно ПХТ (в 1,9 раза).

Характер сдвигов в лейкоцитарном профиле крови мышей указывает на то, что -аланиламид БК и в меньшей степени метиловые эфиры сохраняют модулирующее влияние на общую численность клеток белой крови, при этом у них отмечается стимулирующее влияние на моноциты крови. В условиях неопластического процесса и цитотоксического воздействия эти сдвиги могут быть направлены на снижение выраженности альтеративных процессов в тканях за счет регуляции макрофагами секреторных продуктов эффекторных клеток, участвующих в иммунном ответа и воспалении. Лейкоцитоз, вызванный БК на фоне ПХТ, свидетельствует об усилении воспалительного процесса в тканях.

Изменения в лейкоцитарной формуле крови животных с лимфомой RLS через 8 сут после ПХТ отражали те же тенденции, которые были отмечены выше у мышей с LLC. Это выражалось в сдвиге формулы влево, развитии моноцитоза и небольшой лимфопении. Введение БК и ее -аланиламида не вызвало достоверного изменения этих показателей по отношению к группе ПХТ, однако привело дополнительно к снижению количества эозинофилов по сравнению с контролем.

Анализ миелограммы животных c LLC свидетельствовал о продолжительном угнетении под действием ПХТ эритроидного и мегакариоцитарного ростков в костном мозге. Количество эритробластов по сравнению с контролем значимо снижалось (в 1,4 раза), прежде всего за счет менее зрелых негемоглобинизированных форм (в 1,5 раза против контроля). В этих условиях БК и ее производные усиливали негативное влияние цитостатиков на эритрон, вызывая значимое уменьшение количества эритробластов относительно ПХТ. Через 8 сут после проведения ПХТ состояние гранулоцитарного звена костномозгового кроветворения у животных с LLC характеризовалось небольшим снижением низкодифференцированных форм и таким же повышением зрелых форм метамиелоцитов относительно соответствующих показателей в контроле. Ведение БК на фоне ПХТ не изменило показателей гранулоцитопоэза, тогда как ее производные вызвали значимое повышение количества зрелых лейкоцитов относительно группы ПХТ, а -аланиламид БК также увеличивал продукцию незрелых миелоцитов. Клеточность эозинофилов, лимфоцитов и моноцитов достоверно не отличалась от контроля. Следует отметить, что на фоне ПХТ лишь БК и ее -аланиламид достоверно увеличили индексы созревания эритроцитов, а последний дополнительно повысил и индекс созревания гранулоцитов, что можно рассматривать как стимуляцию дифференцировки этих клеточных элементов гемопоэза.

Проведение ПХТ мышам с лимфмой RLS, так же как и у животных с LLC, привело к существенному падению (почти в 1,5 раза) числа эритробластов в костном мозге, особенно их более ранних форм. Введение обоих тритерпеноидов усилило негативный эффект цитостатиков на красный росток крови, вызывая дальнейшее двукратное снижение клеточности эритрона относительно ПХТ. Аналогичный синергизм с цитостатиками проявлялся у БК и ее амида в отношении лейкоцитарного звена гемопоэза. Оба агента достоверно увеличивали продукцию предшественников гранулоцитов, а также несколько повышали общее количество лейкоцитов относительно ПХТ. Введение тритерпеноидов в постцитостатическом периоде животным с RLS не оказало достоверного влияния на другие виды лейкоцитарных клеток, хотя следует отметить тенденцию к повышению количества плазматических клеток в 3 и 6,5 раз и снижении моноцитоза в 2,4 и 2 раза под влиянием соответственно БК и ее -аланиламида.

Данные индексов созревания клеток костного мозга у мышей с лимфомой RLS, подвергавшихся воздействию цитостатиков и тритерпеноидов, подтверждают стимулирующее влияние БК и ее -аланиламида в основном на гранулоцитарно-моноцитарный росток крови.

Стимулирующее влияние тритерпеноидов на дифференцировку гранулоцитарно-мак­рофагальных предшественников указывают данные других исследователей. S. Koschmieder et al. (2007), показали, что обработка клеток костного мозга больных миелоидной лейкемией тритерпеноидом олеонанового типа (CDDO) вызывала признаки повышения дифференцировки гранулоцитов и моноцитов: увеличение ядерно-цитоплазматического отношения, ядерной сегментации и уменьшение степени базофильности цитоплазмы. Эти же авторы сообщали о том, что повышение дифференцировки и фагоцитарной активности гранулоцитов и макрофагов достигается независимо от апоптозиндуцирующего действия CDDO и в дозах существенно меньших.

Антиоксидантное действие соединений на фоне ПХТ. Развитие окислительного стресса является неспецифическим осложнением опухолевого процесса и цитостатической химиотерапии. Способность лупановых производных снижать его интенсивность определяли по концентрации в крови ТБ-активных соединений – маркера вторичных продуктов окисления. У мышей с LLC, получавших ПХТ, концентрация ТБАС была повышена в 5 – 6 раз относительно интактных животных (рисунок).

Введение БК и ее -аланиламидных производных уменьшало данный показатель соответственно в 2,7 и 4 раза, под действием пиперазиновых производных of-40 и of-41 его концентрация снижалась в 1,8 и 2,5 раз. Агент of-15 и производное бетулина of-3 в тех же условиях не проявили антиоксидантного эффекта у мышей с карциномой Льюис, однако у животных с лимфомой RLS они уменьшили выраженность окислительного стресса в постцитостатическом периоде в 3,5 и 1,5 раза соответственно. На фоне лимфомы -алан­иламид БК вызвал более чем двукратное падение ТБАС относительно группы ПХТ.

В то же время под действием изученных тритерпеноидов не наблюдалось достоверного снижения уровней АЛТ и АСТ в крови животных-опухоленосителей, получавших ПХТ. Высокий уровень трансаминаз можно рассматривать как результат интенсивного цитолиза вследствие некротических процессов в опухоли и других тканях, а также нарушений в метаболическом статусе клеток в терминальной фазе развития опухоли.

Таким образом, у производных лупана выявлена способность снижать интенсивность перекисного окисления в условиях цитостатической полихимиотерапии.

Влияние лупановых тритерпеноидов на противоопухолевый эффект полихимиотерапии. Наблюдения за динамикой роста трансплантатов LLC во время введения лупановых производных показало, что они не стимулируют опухолевый рост на фоне химиотерапии. У протестированных соединений – аланиламидных и пиперазиновых производных БК, ее диоксиимино метилового эфира и диникотината бетулина – не зафиксировано случаев достоверного увеличения объема опухолевых узлов в период введения агентов вслед за ПХТ. Кроме того, у некоторых из этих агентов была выявлена способность потенцировать противоопухолевый эффект самой химиотерапии.


Влияние тритерпеноидов на уровень вторичных продуктов перекисного окисления (ТБАС) в сыворотки крови мышей с карциномой легких Льюис и лимфомой RLS в конце периода введения агентов

Введение α-аланиламида БК и его метилового эфира на фоне ПХТ привело к усилению цитостатического эффекта химиопрепаратов с сохранением высокой противоопухолевой активности в конце периода введения. Противоопухолевое действие ПХТ максимально потенцировалось к 6-м суткам введения амида, содержащего фрагмент α-аланина, при этом размеры опухолевых узлов уменьшались почти в 1,5 раза по сравнению с ПХТ. У его метилового эфира достоверный противоопухолевый эффект на фоне ПХТ проявился в конце опыта.

-Аланиламид и диникотинат бетулина уже через двое суток достоверно повышали противоопухолевую эффективность ПХТ и сохраняли ее до конца введения. Индекс торможения роста опухоли в этих группах вырос соответственно в 1,3 и 1,5 раза. Диоксиимино метиловый эфир БК в первые 4 сут потенцировал эффект ПХТ в 1,6 раз, затем его вклад уменьшался. В то же время у мышей, которым в постцитостатическом периоде вводили БК и ее метиловый эфир, изменений в активности цитостатиков не обнаружено. Метиловые эфиры -аланиламида и пиперазинового производного БК также не оказывали влияния на активность противоопухолевой терапии, а сульфопроизводное БК достоверно уменьшало противоопухолевое действие ПХТ.

В условиях злокачественной лимфомы -аланиламид и диоксиимино метиловый эфир БК, а также диникотинат бетулина подтвердили свою способность увеличивать противоопухолевый потенциал цитостатической химиотерапии. Торможение роста опухоли на 7-е сутки повышалось соответственно в 1,7, 1,7 и 1,3 раз. БК в этом случае также проявляла потенцирующий эффект, повышая в 1,3 раза индекс торможения роста опухоли.

Влияние тритерпеноидов на антиметастатический эффект ПХТ. Анализ показателей метастазирования карциномы легких Льюис выявил высокую антиметастатическую активность самой цитостатической химиотерапии. Во всех группах с введением цитостатических препаратов наблюдалось существенное (в 3,8 – 7,5 раз) снижение объемной и поверхностной плотностей метастазов в легких относительно контроля. Однако показатели метастазирования достоверно не отличались от контроля.

Введение лупановых соединений на фоне ПХТ оказывало различное влияние на ее антиметастатический потенциал. -Аланиламид и его метиловый эфир повышали эффективность химиотерапии LLC путем снижения объемной плотности метастатических поражений, а -аланиламид еще и частоты метастазирования в легких. В результате ИИМ в этих группах повышался в 1,4 и 1,2 раза относительно эффекта ПХТ.

Введение -аланиламидных производных вызывало незначительное снижение антиметастатического потенциала ПХТ, выражавшееся в увеличении площади метастатических поражений и частоты метастазирования. Однако эти изменения не были статистически достоверными и не привели к существенному изменению ИИМ, который оставался высоким благодаря значительной разнице показателей объемной плотности метастазов в этих группах по сравнению с контрольной.

Влияние БК и ее сульфо- и метилпиперазинового производных на показатели метастазирования ПХТ выражалось в увеличении объемной плотности метастазирования LLC соответственно в 3,4, 3,4 и 1,2 раза и частоты метастазирования в 1,6 – 1,7 раз по сравнению с ПХТ. В случае метилпиперазинового производного снижение ИИМ составило 1,1 раза, тогда как под действием сульфопроизводного БК величина ИММ уменьшилась в 2, а под влиянием БК – в 7 раз по отношению к ПХТ. Введение агента of-41 на фоне ПХТ не приводило к существенным изменениям ее антиметастатического эффекта, в отличие от его аналога of-40 и БК, которые заметно снижали этот эффект.

ВЫВОДЫ

  1. Бетулоновая кислота и ее производные с аланиламидными, диоксидииминовым, метилпиперазиновым заместителями, а также никотинат бетулина являются перспективными агентами-модификаторами биологических реакций с политаргетным механизмом, в котором сочетаются цитопротекторное действие на неповрежденные клетки и цитотоксическое – на неопластические. Цитопротекторные свойства реализуются через противовоспалительную и антиоксидантную активность, цитотоксические – через стимуляцию сигнальных путей некроза и апоптоза.
  2. При моделировании циклофосфановых поражений -аланиламид в отличие от бетулоновой кислоты оказывает корригирующее влияние на массу тимуса, селезенки, печени, почек и легких. Оба тритерпеноида модулирует содержание нейтрофилов и мононуклеаров в периферической крови. При воспроизведении доксорубициновых повреждений -аланиламид и бетулоновая кислота вызывают коррекцию массы тимуса и содержания лейкоцитов в периферической крови.
  3. Бетулоновая кислота и ее -аланиламид при изолированном введении интактным животным оказывают одновременно умеренное цитотоксическое и стимулирующее действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусоидов, клетки Купфера). По данным ультраструктурного анализа, цитотоксическое действие бетулоновой кислоты и ее амида проявляется в изменении тонкой структуры митохондрий гепатоцитов, секвестрации гликогена и усилении аутофагических процессов (субплазмалеммальной вакуолизации цитоплазмы), появлении некробиотически измененных гепатоцитов и эндотелиоцитов. Амид бетулоновой кислоты модифицирует тонкую структуру митохондрий (появление крупных органелл в разреженным матриксом и неравномерно расширенными кристами). Стимулирующее влияние бетулоновой кислоты и ее амида на гепатоциты, эндотелиоциты и клетки Купфера (моноциты) проявляется в виде усиления их эндоцитозной (пиноцитозной) активности. В синусоидальной выстилке доминируют функционально активные формы эндотелиоцитов и клеток Купфера.
  4. При изолированном введении бетулоновая кислота и ее -аланиламид вызывают сходные с цитостатиками (циклофосфаном и доксорубицином), но менее выраженные изменения ультраструктуры отдельных кардиомиоцитов. К таким изменениям относятся лизис саркоплазматического матрикса, особенно в околоядерной зоне, умеренный лизис миофибриллярных пучков, умеренные расширения межмембранного околоядерного пространства и цистерн агранулярной саркоплазматической сети. Амид бетулоновой кислоты вызывает также значительные изменения тонкой структуры митохондрий (диффузный лизис митохондриального матрикса, редукцию крист и нарушение их упаковки).
  5. Бетулоновая кислота и ее -аланиламид, вводимые на фоне цитостатиков (циклофосфамида и доксорубицина), проявляют политаргетное действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусоидов, клетки Купфера) и миокарда (кардиомиоциты и эндотелиоциты), потенцируя цитотоксическое действие цитостатиков в отношении одних клеток и стимулируя регенераторные реакции – в других. Восстановление ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов при комбинированном применении цитостатиков и тритерпеноидов происходит быстрее. В гепатоцитах последовательное применение цитостатиков и тритерпеноидов активизирует эндоцитозную и трансцитозную активность и способствует сохранению гладкой цитоплазматической сети. В кардиомиоцитах тритерпеноиды также активизируют эндоцитозную активность и стимулируют процессы внутриклеточной регенерации (появление многочисленных полисом в участках лизиса миофибрилл).
  6. К общецитологическим цитопротекторным свойствам бетулоновой кислоты и ее -аланиламида как при изолированном, так и комбинированным с цитостатиками применении относится их способность усиливать эндоцитозную (пиноцитозную) активность клеток и стимулировать в них процессы внутриклеточной регенерации. Оба агента не подавляют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов. К общецитологическим цитотоксическим свойствам обоих тритерпеноидов относится их способность вызывать умеренные литические изменения цитоплазматического матрикса, деструктивные изменения органелл и усиление аутофагических процессов. Амид бетулоновой кислоты вызывает однотипную модификацию ультраструктуры митохондрий в разных клетках – увеличение размеров органелл, разрыхление их матрикса и расширение крист.
  7. При моделировании полихимиотерапии СНОР на здоровых животных корректорный эффект тритерпеноидов выражается в ослаблении ее угнетающего эффекта на тимус и более раннем восстановлении костномозгового кроветворения. Регулирующее влияние агентов направлено преимущественно на клетки моноцитарного, а не гранулоцитарного ряда. Под действием тритерпеноидов происходит коррекция цитотоксических повреждений в печени и почках: снижение некробиотических повреждений гепатоцитов и эпителиоцитов извитых канальцев, улучшение микроциркуляции, повышение пластических резервов.
  8. Курсовое внутрижелудочное введение мышам-опухоленосителям α-аланиламида бетулоновой кислоты, его метилового эфира, -аланиламида, диоксииминометилового эфира бетулоновой кислоты и диникотината бетулина повышает противоопухолевый эффект полихимиотерапии СНОР. Выраженность эффекта зависит от вида перевиваемой опухоли. Производные с -аланиламидным и метилпиперазиновым заместителем не стимулируют диссеминацию опухоли на фоне полихимиотерапии; -аланиламид и его метиловый эфир повышают антиметастатическую эффективность СНОР.
  9. Введение -аланиламидных производных бетулоновой кислоты мышам с перевиваемыми опухолями на фоне полихимиотерапии уменьшает выраженность лейкоцитоза и стимулирует моноцитарное звено периферической крови.
  10. Курсовое введение бетулоновой кислоты, ее метилового эфира и -аланиламидных производных на стадии прогрессии опухоли существенно подавляет ее диссеминацию в печени; бетулоновая кислота уменьшает выраженность дистрофических изменений гепатоцитов, а -аланиламид – усиливает дегенеративные изменения гепатоцитов. На фоне полихимиотерапии СНОР бетулоновая кислота и ее -аланиламид снижают выраженность дистрофических изменений гепатоцитов и уменьшают объемную плотность очагов некроза гепатоцитов по сравнению с полихимиотерапией. Эфирные производные не оказывают существенного положительного влияния на состояние печеночной паренхимы.
  11. Бетулоновая, [3–оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовая кислоты и их метиловые эфиры оказывают протективное действие на морфологию почек животных, как на фоне полихимиотерапии, так и без ее воздействия. Все исследуемые тритерпеноиды обладают способностью уменьшать на фоне полихимиотерапии степень деструктивно-некротических процессов только в канальцах почек.
  12. Бетулоновая кислота, ее -аланиламидные и пиперазиновые производные, а также  диоксииминометиловый эфир бетулоновой кислоты и диникотинат бетулина понижают интенсивность перекисного окисления в условиях цитостатической полихимиотерапии.
  13. Бетулоновая кислота является новой перспективной тритерпеноидной платформой для синтеза соединений с высокой гепатопротекторной, кардиопротекторной, нефропротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и противоопухолевой активностью, а -аланиламидное производное бетулоновой кислоты предложено для доклинических испытаний в качестве корректора цитостатической химиотерапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г, Бубнова Е.Б., Петренко Н.И., Шульц Э.Э. Изучение антиоксидантных свойств производных бетулоновой кислоты на модели острого токсического гепатита // Научный вестник Тюменской медицинской академии. – 2003. – № 1. – С. 60 – 62.
  2. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Бубнова Е.Б., Петренко Н.И., Шульц Э.Э. Антиоксидантные свойства амидов бетулоновой кислоты // Материалы 2-го съезда Рос. науч. общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии». – М., 2003. – Ч. 1. – С. 186.
  3. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г.,  Жукова Н.А., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Узенкова Н.В., Грек О.Р., Позднякова С.В., Толстиков Г.А.. Бетулоновая кислота и ее производные – новая группа агентов, снижающих побочное действие цитостатиков// Доклады академии наук. 2004. Т. 399, № 2. С. 274