WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова _______________________________________________

На правах рукописи

Пономаренко Наталья Александровна

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА – ПРОТЕАЗЫ

Специальность 03.00.03 - "Молекулярная биология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2008

Работа выполнена в лаборатории биокатализа Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Деев Сергей Михайлович Доктор биологических наук, профессор Георгиева София Георгиевна

Ведущая организация: Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится ____________ 200_ года, в ____ на заседании Диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан __ _______ 2008 года.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.



Актуальность проблемы. В последние два десятилетия представление о биокатализе существенно расширилось в связи с обнаружением каталитической активности молекул РНК и антител, альтернативных эволюционно совершенным ферментам. Каталитические антитела (абзимы) представляют интерес как с точки зрения механизма их возникновения и роли в функционировании иммунной системы организма, так и как потенциальные терапевтические агенты. К настоящему моменту известно значительное число абзимов, катализирующих более 30 химических реакций, для многих из которых не описано природных ферментов.

Существует несколько различных подходов для поиска каталитических антител. Наиболее изученными абзимами являются искусственные биокатализаторы, получаемые иммунизацией стабильными аналогами переходных состояний реакций. Область их применения включает разнообразные реакции органического синтеза и, в основном, ограничивается уровнем энергетического барьера ускоряемой реакции. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке позволяет использовать абзимы для разрушения психоактивных веществ и активации предшественников противоопухолевых лекарственных средств in vivo.

«Ковалентный катализ» является одним из основополагающих механизмов, обеспечивающих уникальные свойства ферментов как наиболее эффективных биокатализаторов. Способность ферментов образовывать ковалентные комплексы с механизм-зависимыми ингибиторами позволяет проводить их отбор посредством нуклеофильных остатков, принимающих непосредственное участие в «ковалентном катализе». Для получения абзимов, обладающих повышенными нуклеофильными свойствами, механизм-зависимые ингибиторы сериновых гидролаз на основе фосфонатов могут быть использованы в двух направлениях: «реакционная иммунизация» и «реакционная селекция». Использование метода фагового дисплея, в свою очередь, открывает широчайшие возможности по дизайну новых биокатализаторов и улучшению их каталитических свойств.

Другим возможным способом создания протеолитических антител является получение антиидиотипических антител к протеазам, т.е. антител, направленных к области связывания антигена у антител, узнающих, в свою очередь, участок активного центра протеаз. Эффективность этого метода была ранее продемонстрирована на примерах получения каталитически активных анти идиотипических антител к ацетилхолинэстеразе и -лактамазе.

Необходимо отметить, что к настоящему моменту накоплено достаточно данных о спонтанном образовании каталитических антител в организме человека и животных при аутоиммунных патологиях. Одним из таких заболеваний является рассеянный склероз (РС) - хроническое нейродегенеративное заболевание, приводящее к разрушению миелиновой оболочки нервных волокон. Традиционно ведущая роль в патогенезе рассеянного склероза отводилась аутореактивным CD4+ Th1 клеткам, специфичным к компонентам миелиновой оболочки, в первую очередь – основному белку миелина (ОБМ). Однако в последнее время значительное внимание было уделено роли гуморального ответа в патогенезе РС, и сейчас непосредственное участие аутоантител к ОБМ и миелин олигодендроцит гликопротеину (МОГ) в демиелинизации не вызывает сомнений и подтверждено экспериментально. Таким образом, вместе со связывающей компонентой иммунноглобулинового ответа, особый фундаментальный и практический научный интерес представляет изучение роли каталитических аутоантител к ОБМ в развитии РС. Структурно-функциональные исследования патогенных аутоантител могут оказаться весьма перспективными как с точки зрения понимания механизмов развития заболевания, разработки новых подходов к терапии и диагностики, так и для решения фундаментальных вопросов иммунологии.

Очевидной областью потенциального медицинского применения абзимов является избирательное расщепление биополимеров и, в частности, белков. Высокая вероятность спонтанного образования абзимов в ходе развития аутоиммунного процесса, а также возможность индукции каталитического ответа на различные антигены у модельных животных с аутоиммунными патологиями дают основания для определенного оптимизма в области дизайна новых биокатализаторов – протеаз на основе антител.

Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания «эволюционно совершенного» биокатализатора. А конструирование на их основе «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий, могло бы стать одним из подходов к получению «лекарств будущего».

Цель работы и основные задачи исследования. Целью данной работы было получение протеолитических антител определенной специфичности и их струк турно-функциональный анализ. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Поиск протеолитических антител при различных аутоиммунных патологиях человека и модельных животных и характеристика их ферментативных свойств.

2. Индукция протеолитических антител, расщепляющих поверхностный антиген вируса ВИЧ-1 gp120, с использованием двух различных подходов: «реакционной» иммунизации и иммунизации на фоне аутоиммунного процесса.

3. Получение антиидиотипических антител с протеолитической активностью к участку активного центра эндопротеиназы - субтилизина Карлсберг.

4. Селекция из полусинтетической фаг-дисплейной библиотеки абзимов, обладающих повышенными нуклеофильными свойствами, с использованием механизм-зависимых ингибиторов сериновых гидролаз на основе фосфонатов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены данные о наличии природных антител с различной каталитической активностью у мышей линий MRL-lpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1, характеризующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунными заболеваниями, что делает эти линии перспективной моделью для направленного получения и детального изучения специфических абзимов с различной активностью.

В ходе исследований впервые продемонстрирована антигенспецифическая каталитическая активность аутоантител к ОБМ у больных РС и модельных животных, коррелирующая с тяжестью заболевания. Определены преимущественных сайтов расщепления молекулы ОБМ абзимами, и оценены кинетические параметры данной реакции. По отношению к фрагментам ОБМ была изучена как связывающая, так и каталитическая активности аутоантител, изолированных из сывороток крови пациентов с РС, больных с другими нейродегенеративными заболеваниями, здоровых доноров и модельных животных.

Гидролизу абзимами во всех приведенных случаях подвергался исключительно энцефалитогенный фрагмент ОБМ81-103. Обнаруженная связывающая и сайтспецифическая каталитическая активность анти-ОБМ антител при РС и других, мимикрирующих, нейродегенеративных заболеваниях позволяет вплотную подойти к разработке новых дифференциальных методов диагностики и эффективного лечения данной патологии.

Исследования антиидиотипического антитела 6B8E12 к субтилизину Карлсберг показали, что данное антитело способно расщеплять эфирную, а также пептидную связь, как в составе п-нитроанилидных производных пептидов, так и белков. Эксперименты по определению специфичности протеолити ческого антитела показали общее сходство со специфичностью исходного фермента. Экспрессия рекомбинантного антиидиотипического антитела в виде одноцепочечного антитела и демонстрация его каталитической активности явилась наиболее убедительным доказательством «абзиматической» природы обнаруженной активности.

Впервые показано, что полученные в результате реакционной иммунизации пептидил дифенил фосфонатом (LAEEE-VPhos) поликлональные антитела обладают специфичностью по отношению к пептидному фрагменту «реакционного» гаптена и способны ковалентно взаимодействовать с фосфонатной составляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз.

Кроме того, было продемонстрировано, что иммунизация мышей линии SJL гибридным белком, состоящим из константных областей поверхностного антигена ВИЧ-1 gp120 и фрагмента ОБМ, приводит к появлению протеолитических антител, избирательно расщепляющих антиген. Было показано, что полученные антитела способны специфически гидролизовать полноразмерный гликозилированный gp120, и установлен преимущественный сайт гидролиза gp120 Pro493-Leu494, находящийся в константной области белка.

При селекции полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием п-нитрофенил 8-метил-8азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфоната получены рекомбинантные одноцепочечные антитела, ковалентно взаимодействующие с необратимыми ингибиторами сериновых гидролаз. Определены аминокислотные остатки, участвующие в «ковалентном катализе». Показано, что отобранные рекомбинантные антитела способны гидролизовать амидную связь.

Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию путей получения искусственных биокатализаторов. Разработанные подходы могут быть использованы для индукции протеолитических антител, расщепляющих различные белковые субстраты. Оригинальные методы анализа ферментативной активности протеолитических антител могут быть использованы для изучения различных биокатализатиров.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано статьи и патент. Результаты диссертации были представлены на международных российских и зарубежных конференциях: Third Al-Ain International Immunology Meeting: Immunoregulation in Chronic Inflammatory Disorders, (2008, Al-Ain, United Arab Emirates); XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (2008 г., Москва); Biology of B-Cells in Health and Disease, (2007, Banff, Alberta);

Международная конференция «Biocatalysis 2007: Fundamentals & Applications», (2007, Moscow - St. Petersburg, Russian Federation); VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007); 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress (2006, Kyoto, Japan); научная конференция «VIII чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова», (2006, Москва); 1st Mediterranean workshop on Clinical Immunology, (2006, Evora, Portugal); Международная конференция «Biocatalysis 2005: Fundamentals & Applications» (2005, St. Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russian Federation); 6-ая международная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии (СанктПетербург – Москва, 2003 г.).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (369 наименований). Диссертация изложена на 279 страницах и содержит 69 рисунков и 13 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

1. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ «РЕАКЦИОННОЙ СЕЛЕКЦИИ» 1.1. Реакционная селекция антител из синтетической библиотеки генов иммуноглобулинов человека.

Механизм-зависимая селекция комбинаторных библиотек является эффективным инструментом для получения новых биокатализаторов. Использование необратимых ингибиторов позволяет проводить селекцию по способности активных биокатализаторов образовывать с ними ковалентные комплексы. На сегодняшний день примеры химической селекции в применении к фаговому дисплею антител были в основном сфокусированы на нековалентном связывании с аналогами переходного состояния реакции или на ковалентной реакционной способности суицидальных субстратов.

В работе была использована полусинтетическая библиотека сегментов вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека Griffin.1 (MRC, Center for proteing engineering, UK). Библиотека была построена на основе зародышевых линий 49 сегментов вариабельных регионов тяжелых цепей, а также 26 и 21 сегмента вариабельных регионов и легких цепей, соответственно.

Третий гипервариабельный участок как тяжелых, так и легких цепей был рандомизирован методом ПЦР (Griffiths, Williams et al. 1994). Гены вырожденных одноцепочечных антител (ScFv) были проклонированы в фагемидный вектор pHEN2. Представительность библиотеки составила 1,2х10. Схематически библиотека Griffin.1 представлена на рисунке 1.

Для проведения химической селекции и скрининга были использованы пРис. 1. А – создание синтетического репертуара тяжелых и легких цепей (Griffiths, Williams et al. 1994). Б – карта библиотеки, построенной на основе вектора pHEN2 и синтетического репертуара сегментов генов иммуноглобулинов человека.

нитрофенил 8метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонат (Х) и его биотинилированный аналог (Bt-X) (рис. 2).

Рис. 2. Структура п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфоната (А) и его биотинилированного аналога (Б).

Данный фосфонат был разработан как ингибитор сериновых гидролаз (Tramontano, Ivanov et al. 2000), и ранее был использован для детекции протеолитической активности у природных антител при различных аутоиммунных на рушениях (Paul, Tramontano et al. 2001). В отличие от фторпроизводных фосфонатов, данное соединение устойчиво в водных растворах и не проявляет неспецифической активности по отношению к инертным белкам.

Для селекции активных фаговых антител, способных ковалентно взаимодействовать с Bt-X, была использована стандартная схема, с некоторыми модификациями. Реакцию фаговых частиц с биотинилированным фосфонатом проводили в растворе. Для достижения специфичности реакции варьировали о о концентрацию Bt-X (от 40 до 1 мкМ) и температуру реакции (22 С и 37 С). Избыток Bt-X удаляли двукратным переосаждением фаговых частиц раствором ПЭГ/NaCl. Для предотвращения неспецифической сорбции использовали кислый Трис-глициновый буфер (рН 2,7). Элюцию фаговых частиц проводили раствором трипсина.

По описанной выше схеме были проведены три раунда селекции. После третьего раунда селекции поликлональные одноцепочечные антитела (ScFv) были проэкспрессированы в клетках HB2151. Растворимые ScFv были выделены из периплазматической фракции методом металло-хелатной хроматографии с использованием сорбента Ni-NTA. Полученные рекомбинантные антитела были использованы для реакции с Bt-X.

Продукты реакции разделяли в полиакриламидном геле (ПААГ) и детектировали методом иммуноблоттинга с использованием стрепРис. 3. Иммунодетекция поликлональных ScFv после реакции с Bt-X, методом тавидина, коньюгированного с пеиммуноблоттинга. На ПААГ наносили белки, роксидазой хрена. Наличие рекомвыделенные из: десяти пулированных клонов, отобранных после третьего раунда се- бинантных ScFv, контролировали лекции (1); общего пула клонов, отобранных гибридизацией с моноклональныпосле третьего (2) и второго (3) раундов семи антителами к шестигистидинолекции; неселектированной библиотеки Griffin.1 (5). 4 – контрольное рекомбинантное вому эпитопу (рис. 3).

антитело к тиреоглобулину; 6 - 0,1 мкг трипПолученные результаты посина. Детекцию осуществляли с использовазволили сделать вывод о том, что нием стрептавидина или моноклональных антител к 6xHis эпитопу, конъюгированных с селекция прошла успешно, и полипероксидазой хрена.

клональные антитела, полученные после третьего раунда, способны ковалентно взаимодействовать с Bt-X фосфонатом. Девяносто шесть клонов после третьего раунда селекции были выбраны для дальнейшего изучения. Клоны, показавшие в ПЦР анализе наличие полноразмерного фрагмента одноцепочечных антител, были использованы для экспрессии. Периплазматическая фракция была выделена для каждого индивидуального клона и использована в реакции с Bt-X фосфонатом.

Реакционные смеси были проанализированы методом иммуноблоттинга, как описано выше.

Одиннадцать эффективно экспрессирующихся ScFv были отбраны на основании специфического мечения полосы в области 28 кДа (обозначены «А»). Семь рекомбинантных анРис. 4. Иммуноферментный анализ тител, не способных к ковалентной ScFv, после реакции с Bt-X. Адсорбцию ScFv проводили в лунках с иммобилизомодификации (обозначены «S»), но ванными анти c-myc антителами. Компоказавших хороший уровень эксплекс ScFv-Bt-X детектировали при попрессии, были выделены и, после рекмощи стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. S.1, S.3, S.7, S.9, ции с биотинилированным фосфонаS.11, S.14, S.17 - рекомбинантные антитом, использованы для иммунофертела, отобранные после третьего раунментного анализа методом ELISA. да, неспособные ковалентно взаимодействовать с Bt-X. N - ScFv из неселектиСвязывание с антигеном оценивали по рованной библиотеки, anti-TyrFv - односравнению с антителом из неселектицепочечное антитело к тиреоглобулину, Bt-X - биотинилированный фосфонат, рованной библиотеки, антителом, свяинкубированный с реакционным буфезывающем тиреоглобулин, и двумя ром. A.5 и A.17 - ScFv, отобранные поантителами, способными взаимодей- сле третьего раунда и взаимодействующие с фосфонатом ковалентно.

ствовать с Bt-X ковалентно. Данные ИФАВприведены трех раундов селекции из библиотеки были отобраны хорошо результатена рисунке 4.

экспрессирующиеся растворимые одноцепочечные антитела, способные взаимодействовать с Bt-X фосфонатом либо ковалентно, либо нековалентно.

1.2. Структурно-функциональный анализ рекомбинантных одноцепочечных антител.

Нуклеотидная последовательность была определена для всех отобранных ScFv. На основании сравнения их первичных последовательностей были выделены 8 (из 11) уникальных «реакционных» клонов (способных взаимодействовать с Bt-X ковалентно) и 6 (из 7) связывающих клонов. Зародышевые линии и семейства тяжелых и легких цепей всех отобранных антител приведены в таблице 1.

Интересно отметить, что легкие цепи всех отобранных ScFv, как связывающих, так и реакционных, за исключением S.9, принадлежат к V1 семейству, причем DPL-3 сегмент является наиболее распространенным. Среди связыТаблица 1. CDR3 последовательности, сегменты и семейства зародышевых линий отобранных клонов.

* AAWDDSL, GTWDSSL, NSRDSSG Указанные последовательности не варьировались в библиотеке Griffin.1.

вающих клонов встречаются VH1, VH4 и VH3 семейства тяжелых цепей, однако для реакционных клонов основным семейством является VH4 (только A.относится к VH1 семейству). Таким образом, для связывания с Bt-X фосфона том необходимо наличие либо V1 DPL3, либо VH4 DP-67 сегментов антител, тогда как для ковалентного взаимодействия предпочтительной является комбинация DPL3 сегмента и VH4 семейства, исключения составляют только A.17 и A.21. Третий гипервариабельный регион тяжелых цепей реакционных клонов имеет некий консервативный консенсус, а последовательность FGGQQVP встречается в двух различных клонах, что может свидетельствовать о непосредственном участии данного фрагмента в «ковалентном катализе».

В таблице 2 приведены кинетические характеристики реакции взаимодействия с фосфонатом Х для всех реакционных ScFv. Можно заметить, что для Таблица 2. Кинетические параметры реакции ScFv с фосфонатом Х. большинства антител кинетические параметры варьируются в очень узком диапазоне. Однако антитело А.17 оказалось практически на порядок более -реакционно-способным (k2=0,32 мин ). Согласно ранее опубликованным данным значения констант скорости реакции для бутирилхолинэстеразы, химот-1 - рипсина и трипсина с фосфонатом Х составляли 1800; 2600 и 4100 М мин, соответственно (Tramontano, Ivanov et al. 2000). Т.е., наиболее активное антитело А.17 обладает реакционной способностью, сравнимой с таковой для природных сериновых гидролаз.

Реакция А.17 с Bt-X фосфонатом ингибировалась прединкубацией с ингибиторами сериновых протеаз, такими как: аминоэтилбензенсульфонил фторид (AEBSF) и аналоги валина и фенилаланина, карбоксильная группа которых заменена на дифенил фосфонат. В то же время прединкубация с более активными фтор фосфонатами, такими как: зарин и кумаринил этил п-трифтор ацетамидофенилметил фосфонат, - не приводила к ингибированию реакции модификации А.17 Bt-X (рис. 5). Полученные данные свидетельствуют о специфичности активного центра, отобранного в результате селекции на Bt-X фосфонат.





Наличие ковалентного взаимодействия между фосфонатом и антителами было подтверждено при помощи прямого метода масс-спектрометрии SELDI. В результате реакции одноцепочечных антител с биотинилированным фосфонатом происходит увеличение массы антител, соответствующее ровно одному остатку Bt-X (646 Да).

Для определения нуклеофильного остатка, участвующего в ковалентном катализе, антитело А.17 было промодифицировано Bt-X, Рис. 5. Иммунодетекция реакций подвергнуто исчерпывающему трипсинолизу, антитела А.17 с механизмзависимыми ингибиторами серии триптический гидролизат был проанализиновых протеаз. А.17 (1 мкМ) инрован методом масс-спектрометрии SELDI в кубировали 1ч на 37оС с 5мМ сравнении с контролем (рис. 6). Было обнаAEBSF (1), 5мМ валил фосфоната (2), 5мМ фенилаланин фосфоната ружено, что модификации подвергается пеп(3), с 100 мкМ зарина (4), 1тид 152 – 180 одноцепочечного антитела:

мкМ кумаринил этил пVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK трифторацетамидофенилметилфосфоната (5), 100 мкМ Х (6) и в (таб. 3). Данный пептид соответствует первоотсутствии ингибитора (7). Затем му гипервариабельному региону легкой цепи все образцы инкубировали 1ч при 37оС со 100 мкМ Bt-Х, разделяли в и фланкирующим его первому и второму карПААГ. Детекцию осуществляли касным участкам.

методом иммуноблоттинга с исМодифицированный пептид был дополпользованием стрептавидина, конъюгированного с пероксиданительно очищен методом аффинной хромазой хрена.

тографии с использованием стрептавидин- сефарозы и подвергнут тандемной масс-спектрометрии. МС/МС анализ показал, что ковалентной модификации подвергается Tyr36 легкой цепи, расположенТаблица 3.

*Цистеины, выделенные жирным шрифтом, образуют дисульфидную связь.

** приведены средние молекулярные массы.

Рис. 6. SELDI масс-спектр триптического гидролизата одноцепочечного антитела А.17 (верхняя панель) и антитела А.17, модифицированного Bt-X фосфонатом (нижняя панель).

ный во втором каркасном регионе легкой цепи.

Аналогичным образом для других антител, было показано, что в «ковалентном катализе» принимает участие Tyr32, расположенный в первом гипервариабельном регионе легкой цепи. Интересно отметить, что тирозины 32 и являются весьма консервативными аминокислотными остатками в белках иммуноглобулиновой природы.

Одним из преимуществ работы с рекомбинантными антителами является возможность быстрого осуществления сайт-направленного мутагенеза. Для подтверждения масс-спектрометрических данных тирозины 32 и 36 легкой цепи А.17 и А.5 были заменены на фенилаланин, что не должно было сказаться на структуре антител, но могло кардинальным образом повлиять на их каталитические свойства. Кроме того, тирозин 36 антитела А.17 был заменен на серин. Антитела А.17 и А.5 и их мутанты были проэкспрессированы и выделены методом металл-хелатной хроматографии. Полученные препараты были использованы в реакции с Bt-X фосфонатом. В качестве отрицательного контроля использовалось одноцепочечное антитело к тиреоглобулину. Детекцию протекания реакции вели методом иммуноблоттинга (рис. 7). Замена тирозина 32 на фенилала нин приводит к полной потере активности по отношению к Bt-X в случае антитела А.5, однако это практически не влияет на активность антитела А.17. При этом, замена тирозина 36 на фенилаланин приводит к прямо противоположному результату: мутанты А.17Y36F и A.17Y32,36F оказываются неактивными в реакции с фосфонатом. Неактивным оказался также и мутант A.17Y36S, содержащий замену тирозина 36 на серин. Таким образом, результаты мутагенеза двух «реакционных» антител полностью подтвердили масс-спектрометрические исследования. Было также показано, что в случае антитела А.17 важно не только наличие аминокислотного остатка, содержащего гидроксильную группу в положении легкой цепи, но и расположение этой гидроксильной группы в активном Рис. 7. Иммунодетекция антител А.17, А.5 и их мутанцентре.

тов после взаимодействия с Bt-X. Комплекс детектироА.17, как наиболее вали стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (верхняя панель) и моноклональными антиреакционно-способный, телами к c-myc эпитопу (нижняя панель).

был проверен на амидазную активность на небольшой библиотеке метилкумарин амидных субстратов.

После трехстадийной хроматографической очистки одноцепочечное антитело катализировало гидролиз двух гидрофобных субстратов: Phe-MCA и Boc-AlaAla-Phe-MCA. Амидазная активность отсутствовала в препарате мутированного антитела A.17Y36F, ингибировалась в результате прединкубации А.17 с фосфонатом X и исчезала в результате иммуноадсорбции антителами к с-myc эпитопу, иммобилизованными на агарозу. Гидролиз субстрата Phe-MCA, рекомбинантным одноцепочечным антителом А.17 -подчиняется кинетической схеме -Михаэлиса-Ментен (kcat = 2,1 ± 0,8 x 10 min, Km = 47 ±12 мкM).

В данном исследовании химическая селекция была применена для поиска белковых молекул, проявляющих ковалентную реакционную способность - химическую особенность, являющуюся универсальной для катализа. Одноцепочечные антитела, полученные в этой работе, могут быть рассмотрены как пример простейшего устройства активного центра ферментов и использованы в ка честве матрицы для получения новых искусственных ферментов методом целенаправленного улучшения их свойств (directed enzyme evolution).

2. АНТИИДИОТИПИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ ФУНКЦИЕЙ.

Данная часть работы проводилась в кооперации с коллегами из лаборатории инженерии ферментов технологического университета Компьена (Франция). Идиотипическое моноклональное антитело 5-H4, полученное при иммунизации мышей линии Balb/c субтилизином Карлсберг, обладало способностью связываться с активным центром фермента и специфически ингибировало его протеолитическую активность. Антиидиотипические антитела были получены при иммунизации мышей линии Balb/c антителом 5-H4. На первом этапе исследований методом иммуноферментного анализа (ELISA) было отобрано несколько десятков моноклональных антител, узнающих вариабельный фрагмент идиотипа 5-H4. На следующей стадии антитела, выделенные из соответствующих клонов, были протестированы на способность гидролизовать хромогенные субстраты субтилизина suc-AAPFpNa и suc-GGLpNa. Из всей панели проанализированных клонов антитело 6B8-E12 наиболее эффективно катализировало гидролиз обоих субстратов и было выбрано для дальнейших исследований.

2.1. Исследование каталитической активности антиидиотипического антитела 6B8-E12.

Для изучения протеолитической активности антитела были предварительно очищены методами аффинной хроматографии с использованием протеин G-сефарозы и аффинного сорбента – иммобилизованных на сефарозе антител козы к иммуноглобулинам мыши, а также ионообменной хроматографии и гель-фильтрации.

Таб. 4. Кинетические параметры для реакций амидолиза и эстеролиза субтилизи ном Карлсберг и антителом 6B8-E12.

Полученные данные по гидролизу низкомолекулярных субстратов sucAAPFpNa и suc-GGLpNa и эстеролизу п-нитрофенилацетата приведены в Таб. 4.

Оказалось, что каталитическая эффективность (kкат/KМ) в реакции с sucAAPFpNa и для субтилизина и для антитела выше, чем для реакции sucGGLpNa, что предполагает сходную субстратную специфичность между ферментом и антителом. В случае п-нитрофенилацетата каталитическая эффективность абзима и фермента сравнима, что можно объяснить слабой эстеролитической активностью субтилизина.

Детекция протеолитической активности абзима проводилась при помощи метода, основанного на разгорании флуоресценции при протеолитическом расщеплении белка, избыточно меченного флуорофорной группой. Прохождение реакции детектировалось по разгоранию флуоресценции во времени по сравнению с контролем. Субстратом реакции являлся бычий сывороточный альбумин, избыточно меченный флуоресцеинизотиоцианатом (БСА-ФИТЦ). В качестве модельной протеазы для определения кинетических параметров данного метода использовался трипсин. Протеолитическая активность Рис. 8. Гидролиз субстрата БСА-ФИТЦ полнаблюдалась как в случае полноноразмерным антиидиотипическим антитеразмерного антитела 6B8-E12, так и лом 6B8-E12 (черный) и его Fabфрагментом (серый). Антитело 4H7-H3 исв случае его Fab-фрагмента, в то пользовалось в качестве отрицательного время как увеличение флуоресценконтроля.

ции в случае амидазного антитела 4H7-H3, гидролизующего suc-AAPFpNa, сводилась к фоновым значениям (Рис.

8). Кроме того, было показано, что антитело 6B8-E12, также как и субтилизин, способно специфически расщеплять РНКазу А.

Эндопротеиназная активность антитела 6B8-E12 уменьшалась при добавлении в реакционную смесь апротинина и, практически, сводилась до фоновых значений при действии классического ингибитора сериновых протеаз - PMSF, что предполагает участие в катализе нуклеофильного аминокислотного остатка (Рис. 9а). Кроме того, протеолитическое расщепление БСА-ФИТЦ абзимом ин а б Рис. 9. Ингибирование гидролиза БСА-ФИТЦ антителом 6B8-E12. 0,16 мкМ БСА-ФИТЦ инкубировалась: а - с 0,5 мкМ абзима (), в присутствии 1 мкМ апротинина () или мкМ PMSF (). б – с 1 мкМ 6B8-E12 в присутствии антитела 5-H4 (концентрация 5-Hизменялась от 0 до 3 мкМ). Относительная активность рассчитывалась как отношение скорости гидролиза субстрата в присутствии 5-H4 к скорости гидролиза БСА-ФИТЦ в отсутствии идиотипа.

гибировалось в присутствии идиотипического антитела 5-H4 (Рис. 9б). Полученные результаты свидетельствуют о том, что каталитическая активность связана с антителом, и активный центр находится в антигенсвязывающем центре.

Альтернативное подтверждение «абзиматического» характера обнаруженной активности и отсутствия вклада в эту активность сопутствующих ферментативных примесей было получено методом зимографии. Анализ зимограммы (Рис. 10) показывает наличие протеолитической активности только у белков с Mw150 кДа (дорожки 2,3), в то время как флюоресценция контрольных антител (дорожка 1) отсутствует.

Для исследования специфичности полученного антиидиотипическоРис. 10. Зимограмма препарата антитела 6B8-E12. 100 нг (дорожка 2) и 200 нг го каталитического антитела был про(дорожка 3) белка разделялось в 10% веден масс-спектрометрический анаПААГ в присутствии флуоресцентного лиз продуктов протеолиза некоторых субстрата БСА-ФИТЦ, внесенного в гель при полимеризации. Трипсин в количеприродных биоактивных пептидов стве 100 пг (дорожка 4) и 1 нг (дорожка (Рис. 11). Приведенные данные сви5). Mab к с-Myc эпитопу (200 нг) (дорожка 1).

детельствуют о том, что большинство исследованных пептидных субстратов имеют сайты расщепления, содержащие ароматические и алифатические аминокислотРис. 11. Гидролиз биоактивных пептидов антителом 6B8-E12.

ные остатки до Гидролизуемая связь указана черной стрелкой для антитела, красной – для фермента; ароматические аминокислотные остатки или после сай(прямоугольник), алифатические аминокислотные остатки (круг).

та, что в некоПродукты гидролиза детектировались масс-спектрометрически.

торой степени соответствует субстратной специфичности «родительского антигена» - субтилизина Карлсберг.

2.2. Структурный анализ вариабельных доменов моноклональных антител 5-H4 и 6B8-E12.

Для изучения структурных особенностей антител и экспрессии абзима в гетерологичной системе вариабельные домены легких и тяжелых цепей данных антител были клонированы и определена их нуклеотидная последовательность.

В качестве источника мРНК для клонирования генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-H4 и 6B8-E12 использовались соответствующие гибридомы. Наработка кДНК и амплификация генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей (FvH и FvL) проводилась методом одностадийного RТ ПЦР. Амплификация вариабельных доменов легкой цепи (VL) проводилась с использованием прямых вырожденных нуклеотидных праймеров, соответствующих N-концевым последовательностям легких цепей мышиных антител, и обратных вырожденных праймеров, соответствующих J-фрагментам мышиных антител. Вариабельные домены тяжелой цепи (VH) амплифицировали при помощи набора прямых вырожденных праймеров, созданных на основе основных лидерных последовательностей тяжелых цепей антител мыши, и обратных праймеров для J-фрагментов. Очищенные ПЦР-продукты, соответствующие по размеру VL- и VH-фрагментам, были лигированы в плазмиду pGEM5Zf(+), обработанную рестриктазой EcoRV. Полученными лигатами трансформировали клетки E. coli штамма DH5. Для положительных клонов была определена нуклеотидная последовательность цепей ДНК и предсказана первичная структура, соответствующая FvH и FvL районам иммуноглобулинов.

Сравнение аминокислотных последовательностей антитела 5-H4 с опубликованными ранее (Protein Data Bank) показало высокую степень сходства с антителами – ингибиторами ферментов: с легкой цепью антитела F11.2.32, полученного против протеазы ВИЧ 1, и легкой цепью антитела 2b-2F; которое ингибирует рибонуклеазную активность ангиогенина, реагируя с его ключевыми каталитическими остатками. Антитело F11.2.32 имеет интересную структурную особенность: CDR1 легкой цепи образует «выпячивание», формируя подобие «пальца», который предположительно входит в активный сайт при связывании с протеазой ВИЧ 1.

Компьютерная трехмерная модель одноцепочечного антитела 5-H4 (Рис.12) была построена с использованием программного обеспечения Insight II на основе двух структурных моделей из Protein Data Bank с высокой VH+VL гомологией: 1dzb (анти-лизоцим scFv 1F9) и 1jp5 (scFv фрагмент антитела 1696 против протеазы ВИЧ 1).

Анализ 3D-модели антитела 5-HРис. 12. Трехмерная модель вариабельного показал наличие плоской поверхфрагмента идиотипического антитела 5-H4.

ности, образованной тяжелой цеЗаметны, характерные выступающая часть легкой цепи (1) и плоский участок тяжелой пью, что характерно для белокцепи (2) связывающих антител, и наличие выступающей вперед легкой цепи, которая, возможно, взаимодействует с активным центром субтилизина.

Для создания 3D-модели одноцепочечного антитела 6B8-E12 в качестве матрицы использовалась последовательность 1qok (scFv против антикарциноэмбрионального антигена). При анализе этой модели было также установлено наличие плоской поверхности, типичной для белок- и пептид-связывающих ан тител, и широкой «щели» между VH и VL CDR участками с высокой концентрацией гидрофобных аминокислотных остатков, что, возможно, и определяет алифатическую и ароматическую специфичность абзима 6B8-E12.

(Рис. 13) 2.3. Экспрессия рекомбинантного антитела 6B8E12 в виде одноцепочечного антитела.

Генетическую конструкцию для экспрессии рекомбинантного одноцепочечного антитела создавали по следующей схеме (Рис.

Рис. 13. Трехмерная модель вариабельного 14) фрагмента антиидиотипического антитела На основании полученных 6B8-E12. Стрелками указана щель между вариабельными доменами легкой и тяжелой цеданных по определению нуклеопей.

тидной последовательности антитела 6B8-E12 были созданы праймеры соответствующие N-концевым последовательностям (11, 12) и J-фрагментам (13, 14) легких и тяжелых цепей. Для клонирования в соответствующий вектор данные праймеры содержали необходимые сайты для эндонуклеаз рестрикции. Гибкий серин-глициновый линкер ((Ser-Gly4)3) был создан на основе праймеров 15-17. Линкер соединяли с вариабельным доменом легкой цепи с использованием сайтов PciI и NcoI, соответственно. Полученный фрагмент (линкер-VL) был амплифицирован с использованием праймеров 15 и 13 и лигирован с VH последовательностью при помощи XhoI и SalI сайтов рестрикции.

Конечный фрагмент, содержащий полную последовательность одноцепочечного антитела, был амплифицирован с использованием праймеров 12 и 13, рестрицирован эндонуклеазами NcoI и NotI и клонирован по соответствующим сайтам в плазмидный вектор pET22N, созданный на основе вектора pET22b(+) и содержащий NcoI рестриктный сайт в последовательности периплазматического лидера. Дополнительный фрагмент, содержащий последовательности, кодирующие эпитоп с-myc и шестигистидиновый кластер, был клонирован в конечную конcтрукцию по сайтам BglII и NotI (Рис. 14Б).

Для экспрессии рекомбинантных белков был выбран штамм E.coli Рис. 14. Схема создания генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного антитела 6B8-E12 в виде одноцепочечного антитела.

BL21(DE3). Для scFv были подобраны условия культивирования, приводящие к появлению максимально возможного количества целевого белка в растворимой форме. Одноцепочечное антитело выделяли в нативных условиях методом металло-хелатной хроматографии с использованием сорбента Co2+-TALON. Дополнительная очистка была проведена с помощью ионообменной хроматографии на колонке MonoQ (Amersham). Экспрессированный белок также был дополнительно охарактеризован с помощью масс-спектрометрии продуктов его трипсинолиза. Полученные результаты свидетельствуют о соответствии экспериментально полученного белка его теоретической пептидной карте.

2.4. Исследование каталитических свойств полученного одноцепочечного антитела.

Полученное рекомбинантное антитело проявляло заметную амидазную активность (Рис. 15) по отношению к метилкумариламидным (MCA) субстратам, содержащим алифатические (Met-MCA, LeuMCA) и ароматические (Phe-MCA) аминокислотные остатки, что соответствует данным по субстратРис. 15. Гидролиз MCA-пептидов (50 мкМ) рекомбиной специфичности исход- нантным scFv6B8-E12 (0,75 мкМ). () – Met-MCA, () – Leu-MCA, () – Phe-MCA, () – буфер PBS ного антиидиотипического антитела 6B8-E12.

Кинетика данных реакций подчинялась уравнению Михаэлиса-Ментен, что позволило рассчитать их кинетические параметры (Таб. 5). При этом не удалось зарегистрировать сколько-нибудь значительную протеолитическую активность по отношению к БСА-ФИТЦ.

Таким образом, рекомбинантное одноцепочечное антитело, в общих чертах, сохранило функцию исходного моноклонального антитела, что свидетельствует в пользу Таб. 5. Кинетические параметры для реакций «абзиматической» природы амидолиза рекомбинантным scFv 6B8-E12.

обнаруженной активности.

Отсутствие активности по отношению к высокомолекулярному субстрату может быть обусловлено структурными особенностями рекомбинантного антитела – наличием междоменного гибкого линкера, затрудняющего правильный фолдинг продукта. По всей видимости, полученный «минимальный катализатор», не способен осуществить в полной мере сложную протеолитическую функцию, присущую полноразмерному антителу.

3. КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ ПРИ АУТОИММУННЫХ ПАТОЛОГИЯХ.

Спонтанная индукция каталитических антител при ряде аутоиммунных нарушений, таких как системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит, склеродермия, аутоиммунный миокардит и др. является сегодня неопро вержимым фактом. Протеолитическая деградация белковых антигенов абзимами описана для тироглобулина при аутоиммунном тироидите, вазоактивного интестинального пептида у больных бронхиальной астмой, фактора VIII свертывания крови у больных гемофилией А. Показана протеолитическая активность белка Бенс-Джонса. Однако, вопрос о функциональной роли абзимов при аутоиммунных патологиях, путях и закономерностях их появления остается открытым и требует дальнейшего изучения.

3.1. Каталитическая активность нативных антител у мышей с аутоиммунными нарушениями.

Инбредные линии мышей с аутоиммунными заболеваниями являются моделью для изучения многих аспектов аутоиммунности. У мышей линии MRLlpr/lpr, дефицитных по FAS, с возрастом возникают аутоиммунные нарушения, во многом сходные с СКВ и ревматоидным артритом. Новозеландские гибриды NZB/NZW F1 спонтанно развивают СКВ-подобный нефрит. Линия SJL/J характеризуется целым рядом индуцируемых аутоиммунных нарушений, в том числе развитием экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) – модели рассеянного склероза. Таким образом, исследование природного спектра каталитических антител, образующихся у этих мышей, представляет безусловный интерес. В данной работе впервые был проведен сравнительный анализ каталитической активности антител у аутоиммунных мышей линий MRL-lpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1 по отношению к линии BALB/c. Активность выделенных препаратов поликлональных IgG антител была охарактеризована по трём реакциям (ДНК-гидролиз, протеолиз, эстеролиз), для которых ранее была показана возможность катализа абзимами.

Протеолитическая активность в препаратах антител детектировалясь двумя различными методами: флуоресцентным и энзиматическим. В флуоресцентном тесте в качестве субстрата для протеолиза использовался бычий сывороточный альбумин, избыточно меченный флуоресцеинизотиоцианатом (БСАФИТЦ).

Кроме того, для изучения кинетических параметров реакции расщепления белков абзимами был разработан альтернативный, принципиально новый способ - энзиматический тест. Принцип данного метода, основан на использовании в качестве субстрата малых количеств высокоактивного фермента - рибонуклеазы А, что позволяет достичь значительного молярного избытка фермента над субстратом и, таким образом, приблизить условия изучаемой реакции про теолиза к таковым для стандартной модели нестационарной кинетики (S0<

На рис. 16 представлены результаты тестирования протеолитической активности в препаратах антител, выделенных из мышей линий MRL-lpr/lpr, SJL/J, NZB/NZW F1 и BALB/c. Полученные в ходе исследований результаты свидетельствуют о наличие природных антител с различной каталитической активностью у мышей, характеризующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунными заболеваниями.

Рис. 16. Определение протеолитической активности препаратов антител, выделенных из мышей линий BALB/c, NZB/NZW F1, MRL-lpr/lpr, SJL/J, флуоресцентным методом(а) и энзиматическим методом(б). а - 1 мкг БСА-ФИТЦ инкубировали с 5мкг очищенных IgG в течение 24 и 48 часов. Изменение флуоресценции определяли в % по отношению к контролю (1 мкг БСА-ФИТЦ), инкубированному в тех же условиях. б - РНКазу А в концентрации 11 нM инкубировали с очищенными IgG в концентрации 3.мкM в течение 17 и 32 часов. Степень гидролиза РНКазы определяли в % как отношение измеренной рибонуклеолитической активности к таковой в начальный момент времени.

Таким образом, охарактеризованные аутоиммунные линии мышей MRLlpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1 являются перспективной моделью для направленного получения и изучения специфических абзимов с различной активностью.

3.2. Каталитические аутоантитела при рассеянном склерозе.

Механизмы развития системных аутоиммунных заболеваний, а также этиологические факторы, приводящие к возникновению этих нарушений, сегодня остаются неясными. При этом патологическая роль аутоантител в разрушении тканей и клеточных структур не вызывает сомнений. Среди заболеваний аутоиммунной природы рассеянный склероз (РС) представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему. Факторы, приводящие к массовой демиелинизации нервных волокон при данном заболевании, неизвестны. Одна из наиболее обоснованных теорий патогенеза отводит основную роль в разрушении миелина воспалительному процессу, связанному с аутоиммунными реакциями. В этой связи нами была высказана гипотеза о роли каталитической функции аутоантител в протеолитическом расщеплении компонентов миелиновой оболочки. На предварительном этапе настоящего исследования был проведен анализ неспецифической протеолитической активности антител, выделенных из сывороток крови больных РС. Для детекции абзиматической активности был использован разработанный ранее флуоресцентный тест. Тестирование сывороток на наличие специфических аутоантител к ОБМ проводили с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Анализ полученных данных выявил высокую корреляцию (р<0.001) между концентрацией аутоантител и наличием протеолитической активности в препаратах антител у больных РС.

Таким образом, безусловный интерес представляло определение каталитической активности фракции аутоантител к ОБМ по отношению к антигену у больных РС и модельных животных. Индукцию ЕАЕ у мышей линии SJL проводили по классической схеме двукратной иммунизацией ОБМ.

Выделение поликлональных Рис. 17. Электрофореграмма (А, Б, Г) и иммуноблот (В) образцов IgG из сывороток гидролиза ОБМ (А), БСА (В) и МОГ (Г) препаратами антител, полученными из сывороток крови больных РС (А, Г) и мышей линии крови пациентов с SJL c индуцированным EAE (Б, В). Показана протеолитическая акРС и мышей литивность суммарного пула иммуноглобулинов класса G (IgG фракнии SJL с ЕАЕ ция), а также сорбирующихся (IgG ОБМ+) и не сорбирующихся (IgG ОБМ-) на иммобилизованный ОБМ антител. Легкие и тяжелые осуществляли цепи антител обозначены Lc и Hc соответственно.

хроматографией на колонке HiTrap Protein-G Sepharose (Amersham), дальнейшее получение ОБМ-связывающих антител проводили методом аффинной хроматографии с использованием в качестве сорбента иммобилизованного на сефарозе основного белка миелина.

Активность полученных препаратов антител была охарактеризована по реакциям протеолиза с использованием неспецифических (биотинилированный бычий сывороточный альбумин, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (МОГ), тиоредоксин I E. сoli) и специфического (основной белок миелина) субстратов. Результаты, представленные на рис. 17, свидетельствуют о том, что препараты антител, выделенных из сывороток больных рассеянным склероРис. 18. Электрофореграммы гидролиза ОБМ препаратами зом и модельных антител, полученными из сывороток крови больных РС, помышей линии SJL с сле выделения методом гель-фильтрации в денатурирующих условиях (A, Б) и адсорбции (В) с антителами против иммуиндуцированным ноглобулинов человека (-h) и мыши (-m). На профиле EAE, обладали катаэлюции обозначены анализируемые фракции, соответствующие 150 кДа.

литической активностью только в отношении основного белка миелина. Контрольные антитела из пулированной сыворотки здоровых доноров проявляли фоновый уровень активности ко всем описанным субстратам.

Подтверждение «абзиматического» характера обнаруженной активности и отсутствия вклада в эту активность сопутствующих Рис.19. Электрофореграмма гидролиза ОБМ Fab ферментативных примесей было фрагментами антител, полученных из сывороток крови больных РС (А). Зиммограмма сорбируюполучено методами гельщихся (ОБМ+) и не сорбирующихся (ОБМ-) на фильтрации (рис.18) в денатурииммобилизованный ОБМ IgG антител (Б). Белки рующих условиях (6М мочевина разделялись в 5-20% ПААГ в присутствии флуоресцентного субстрата БСА-ФИТЦ, внесенного в или буфер Gly-HCl, pH 2.6) и зигель при полимеризации. Трипсин в количестве мографии (рис. 19б). Выделенные 10 пг и 30 пг использовался в качестве положительного контроля.

Fab фрагменты антител также обладали гидролизующей активностью по отношению к ОБМ (рис.19а). Кроме того, обнаруженная активность исчезала после прединкубации с иммобилизованными антивидовыми антителами (рис. 18).

При сравнительном анализе протеолитической активности аутоантител, для 24 пациентов с различными стадиями РС была выявлена корреляция между уровнем каталитической активности аутоантител и глубиной развития патологического процесса РС согласно общепринятой шкале EDSS (expended disability status scale). Кроме того, обнаруженная активность ингибировалась копаксоном (Copaxone), известным лекарственным средством при РС, представляющим собой сополимер лизина, глутаминовой кислоты, аланина и тирозина.

Методами иммуногистохимии удалось показать взаимодействие ОБМРис.20. Иммунодетекция взаимодействия ОБМ-специфичных антител с миелиновыми структурами мозга. (А) Иммуноблот: ОБМ (m), гомогенат мозга крысы (h), указаны антитела, использованные для детекции. (Б) Схема среза мозга крысы. (В) Окрашивание миелина по Райту. Г-Е – двойное окрашивание: (Г) –MAт382 (Alexa 546, красный), (Д) – антитела пациента с РС (FITC, зеленый), (Е) – колокализация Г и Д, (Ж-З) – окрашивание на серийных срезах: (Ж) – MAт382 (Alexa 546, красный), (З) – IgG антитела мыши с ЕАЕ (Alexa 488, зеленый).

специфичных абзимов с миелином на нативных срезах мозга и колокализовать их с моноклональным антителом к ОБМ МАт 382, что свидетельствует о потенциальной возможности взаимодействия ОБМ-абзимов с миелиновыми структурами мозга (рис.20).

Определение сайт-специфичности гидролиза основного белка миелина аутоантителами.

Для определения сайт-специфичности гидролиза ОБМ аутоантителами было применено сочетание методов обращенно-фазовой хроматографии, трицинового белкового электрофореза и масспектрометрии SELDI. На первом этапе продукты гидролиза были разделены с использованием обращенно-фазовой хроматографии на колонке C4 (Рис. 21А). Далее, образцы фракций анализировали с использованием трицинового электрофореза, с последующей детекцией Рис. 21. Обращенно-фазовая хроматография продуктов гидролиза ОБМ аутоантителами (А) и анализ образцов посредством трицинового электрофореза (Б): 1 - интактный ОБМ, 2-8 - фракции, полученные при разделении продуктов гидролиза на обращенной фазе, 9 - гидролизат без разделения; показаны идентифицированные фрагменты. (В) основные сайты гидролиза ОБМ специфическими аутоантителами (красные стрелки). Желтым отмечены иммунодоминатные районы белка, оранжевым обозначен энцефалитогенный пептид.

низкомолекулярных пептидов при помощи флуоресцентного красителя Sypro Orange (Рис. 21Б), и SELDI-масспектрометрии.

В результате удалось идентифицировать каждый фрагмент в структуре основного белка миелина и показать присутствие шести основных сайтов гидролиза ОБМ специфическими аутоантителами (Рис. 21В). Пять из них расположены в иммунодоминантных районах ОБМ, опознаваемых молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса, ассоциированными с рассеянным склерозом, а два - локализованы на энцефалитогенном пептиде – индукторе EAE у модельных животных.

Исследование субстратной специфичности анти-ОБМ аутоантител на модельных пептидах.

Дальнейшее исследование специфичности аутоантител проводили с помощью сконструированной «эпитопной библиотеки» перекрывающихся пептиРис. 22. (А) Схема плазмидного вектора, сконструированного для экспрессии слитного белка тиоредоксина I E. сoli c фрагментами основного белка миелина. (Б) Аминокислотная последовательность ОБМ человека. Показано распределение пептидов на последовательности основного белка миелина.

дов в составе слитных белков с тиоредоксином, соответствующей полной последовательности ОБМ. Этот подход был выбран на основании концепции предпочтительного «представления» субстратных пептидов в растворе в составе биополимера. Для изучения протеолиза изолированных эпитопов ОБМ специфичными антителами на основе экспрессионного вектора pET-32b-CH(+) были созданы двенадцать генно-инженерных конструкций, содержащих последовательности, кодирующие различные фрагменты основного белка миелина человека (Рис. 22). Между тиоредоксином и последовательностью пептидов основного белка миелина был помещен линкер (SGGGG)3S, для придания гибкости и подвижности конструируемым рекомбинантным белкам. Наличие подобного пептидного линкера содействует корректной презентации фрагментов ОБМ в составе фьюжн-белка с тиоредоксином.

Фрагменты ДНК, кодирующие данные пептиды (ОБМ1-12) и серинглициновый линкер (Link), были наработаны методом ПЦР с использованием перекрывающихся специфических олигонуклеотидных праймеров, содержащих дополнительно сайты рестрикции (Рис. 23). Затем полученные ПЦР продукты пептидов ОБМ были рестрицированы эндонуклеазой BamHI и лигированы с рестрицированным BglII линкером, с одновременной рестрикцией BamHI и BglII для удаления из реакционной смеси нецелевых продуктов лигирования. Лигазная смесь была использована для амплификации фрагментов Link-ОБМ методом ПЦР с использованием концевых специфических олигонуклеотидных праймеров.

Наработанный таким образом фрагмент ДНК был рестрицирован эндонуклеазами PciI и BclI и лигирован в NcoI-BamHI рестрицированный вектор pET-32b-CH(+). Полученным лигатом трансформировали клетки E.

coli штамма DH5.

Экспрессию проводили в клетках E. coli штамма BL21(DE3) в стандартных условиях. Поскольку все рекомбинантные белки содержат Рис. 23. Схема получения экспрессионного вектора pET-32b-ОБМпептид-CH(+), содер- (His)6 кластеры, их выделение из жащего фрагменты 1-12 ОБМ клеточных лизатов проводилось с применением металл-хелатной хроматографии. Дальнейшая очистка велась на ионообменной смоле MonoS с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex75. Гомогенность полученных препаратов контролировалась электрофорезом с окрашиванием Кумасси и иммуноблоттингом с использованием моноклональных антител к c-myc эпитопу и составляла более 95%.

Для характеристики субстратной специфичности антител, фьюжнбелки тиоредоксина с фрагментами ОБМ инкубировались с иммуноглобулинами (суммарная IgG фракция), изолированными из сыворотки крови 26 больных рассеянным склерозом, пациентов с другими нейродегенеративными заболеваниями (OND), здоровых доноров (HD) и мышей аутоиммунной линии SJL с ЕАЕ. Как видно из приведенных электрофореграмм (Рис. 24), в случае пациентов с РС и остеохондрозом протеолизу подвергались только пептиды, содержащие энцефалитогенную последовательность ОБМ. С другой стороны у мышей SJL c EAE, предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний, наблюдался множественный гидролиз перекрывающихся эпитопов ОБМ. Каталитические свойства проявили антитела, изолированные из 77% пациентов с прогрессирующим и 85% с ремитирующим типом течения РС. Среди больных с OND и здоровых Рис. 24. Сверху - вниз: Контроль; гидролиз модельных пептидов антителами, изолиродоноров каталитического ответа не ванными из пациента с РС, остеохондронаблюдалось, за исключением двух зом, мышей линии SJL с ЕАЕ;трипсином, каслучаев остеохондроза, при которых тепсином D и ММР 3.

было отмечено наличие каталитической деградации пептида ОБМ под действием аутоантител. Причем эти больные характеризовались значительной длительностью патологического процесса и серьезными нейрональными поражениями.

Контроль специфичности гидролиза осуществлялся разрезанием рекомбинантных белков трипсином, катепсином D и металлопротеазой матрикса 3 (MMP-3) (Рис. 24).

Для всех исследованных антител методом масспектрометрии SELDI сайты гидролиза были локализованы исключительно в рекомбинантных фрагментах ОБМ (Рис. 25), и повторяют таковые в нативном белке. При детальном анализе продуктов расщепления энцефалитогенного пептида антителами было обнаруРис. 25. Последовательности пептидных фрагментов ОБМ человека. Сайты гидролиза рекомбинантных фрагментов антителами, изолированными из пациентов с рассеянным склерозом, обозначены красным; из мышей линии SJL с EAE - отмечены белым.

жено, что сайтами гидролиза являются как Lys91 так и Arg97, причем лишь у двух пациентов степень расщепления по двум приведенным сайтам оказалась сравнимой. В большинстве случаев при РС наиболее предпочтительным для гидролиза являлся аргининовый сайт, и антитела, специфичные к участку ОБМ81-103, составляют подавляющее большинство в общем пуле ОБМ-гидролизующих иммуноглобулинов. Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными относительно В-клеток, изолированных из больных РС, и узнающих преимущественно данный эпитоп, а также - с фактом значительной иммунодоминантности этого фрагмента при представлении молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса патогенных T-клеток.

Специфичность гидролиза ОБМ аутоантителами позволила разработать «модельный субстрат» для анализа сывороток больных РС и скрининга гибридом, продуцирующих моноклональные каталитические антитела к ОБМ. Для этого на основе вектора pQЕ30 была создана генно-инженерная конструкция, экспрессирующая два флуоресцентных белка PS-CFP2 и TurboYF, соединенные пептидом ОБМ81-103, содержащим энцефалитогенную последовательность, - Рис. 26. (А) Принципиальная схема FRET-подхода к исследованию кинетики абзиматической реакции. (Б,В) Расщепление белка EPeFRET абзимами и модельными протеазами соответственно. Во врезке показано изменение спектра флуоресценции во времени.

так называемый «EPeFRET» - от Encephalitogenic Peptide Fluorescence Resonance Enegy Transfer (Рис. 26А). При разрезании линкера прекращается резонансный перенос энергии и происходит падение флуоресценции (Рис. 26Б, В).

Были получены кинетические константы гидролиза EPeFRET аутоантителами и ингибирование данной реакции слитными белками и копаксоном.

Можно предположить, что достаточно медленное, но направленное действие антител по протеолизу ОБМ возможно играет определенную роль в разрушении миелиновых структур и патогенезе рассеянного склероза. Нами показано, что каталитическая активность аутоантител по отношению к ОБМ и его фрагментам выделяет рассеянный склероз в сравнении с другими нейродегенеративными заболеваниями значительно больше, чем связывание с данным антигеном.

Продемонстрированная сайт-специфичность в отношении основного белка мие лина и его презентированных пептидов позволяет вплотную подойти к созданию тест-систем на основе сконструированных модельных субстратов.

4. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ, РАСЩЕПЛЯЮЩИХ ПОВЕРХНОСТНЫЙ ГЛИКОПРОТЕИН ВИЧ-1 GP1Создание протеазы, способной узнавать и гидролизовать избранный белковый эпитоп, является одной из фундаментальных проблем современной биохимии и молекулярной биологии. В качестве белка-мишени в настоящей работе был выбран поверхностный гликопротеин gp120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), являющийся основным антигеном вируса и ключевым участником системы подавления вирусом иммунного ответа реципиента (Poignard, Saphire et al. 2001). Выбор объекта обусловлен безуспешностью попыток нейтрализовать ВИЧ in vivo антителами, полученными непосредственно иммунизацией животных поверхностными антигенами и их аналогами (Burton 1997; Tang, Kuhen et al. 1999; Burton and Parren 2000), что является следствием гипервариабельности иммунодоминантных областей gp120 и маскирования константных частей белка в результате тримеризации gp120 и экранирования многочисленными N-связанными олигосахаридными группами (Pollard, Meier et al. 1991; Blankson, Persaud et al. 2002). Расщепление gp120 в организме пациента по специфическим сайтам позволит преодолеть иммунологическую мимикрию вируса, нарушить упаковку поверхностного антигена, экспонировать его константные эпитопы и обеспечить возможность элиминации или эффективного сдерживания инфекции ВИЧ иммунной системой пациента.

Как уже отмечалось выше, природные протеолитические антитела часто обнаруживались при аутоиммунных патологиях. Одновременно с этим было показано, что при иммунизации аналогом переходного состояния реакции гидролиза сложных эфиров (фосфонатом) мышей линий SJL и MRL/lpr, склонных к аутоиммунным патологиям, частота появления гидролитических абзимов значительно выше, чем в случае контрольной линии Balb/c (Tawfik, Chap et al. 1995).

На основании всего вышесказанного для получения антител, расщепляющих gp120, было предложено использовать два различных подхода: «реакционную иммунизацию» и индукцию антиген-специфического каталитического ответа на фоне аутоиммунного процесса.

4.1. Индукция эпитоп-специфического каталитического ответа методом «реакционной иммунизации».

Суть метода «реакционной иммунизации» заключается в индукции антител, которые в отличие от «традиционных» связываются с гаптеном ковалентно.

Образование ковалентного интермедиата с фторпроизводными фосфонатов было показано для каталитических эстеролитических антител 17Е8 (Zhou, Guo et al. 1994; Guo, Huang et al. 1995) и 9А8 (Kolesnikov, Kozyr et al. 2000). Эти факты позволяют предположить, что ковалентный каталитический аппарат сериновых гидролаз в абзимах может быть воспроизведен. Для получения специфического абзима методом реакционной иммунизации необходимо, чтобы гаптен представлял собой структуру, «голова» которой содержит механизм-зависимый ингибитор протеазы, а «хвост» – пептидильную цепь, соответствующую по длине участку, взаимодействующему в активном центре фермента.

В качестве полипептидной цепи была выбрана небольшая последовательность Leu-Ala-Glu-Glu-Glu-Val, соответствующая аминокислотным остаткам 265-270 гликопротеина вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) – gp120.

Ранее было показано (Pollard, Meier et al. 1991), что специфичное расщепление по этому сайту приводит к тому, что gp120 теряет свою способность связываться с рецептором CD4, что не позволяет вирусу инфицировать CD4+ клетки.

Данный пептид был модифицирован по С-концевой аминокислоте группой механизм-зависимого ингибитора – дифенил фосфонатом. Такой пептид относится к пептидил -аминоалкилфосфонатам. Схема его синтеза и структура представлены на рис. 27. Необходимо отметить, что важным свойством выбранного гаптена является низкая неспецифическая реакционная способность и высокая стабильность в водных растворах.

Рис. 27. Схема синтеза пептидил фосфоната – LAEEEV-Phos.

Поскольку известно, что малые молекулы, в большинстве случаев, являются слабыми иммуногенами, для проведения эффективной иммунизации синтезированные реакционные пептиды были конъюгированы с KLH. Для присоеди нения N-концевой аминогруппы пептида к доступным аминогруппам KLH был выбран метод с предварительной 3 активацией носителя при помощи бис[сулфосукцинимидилсуберата] (BS, Pierce) и последующим присоединением гаптена. Для эффективной детекции каталитических антител N-конец синтезированного пептидил фосфоната был модифицирован активированным эфиром биотина.

Для получения эпитопспецифических абзимов использовали три линии мышей: MRL/lpr, NZB/NZW F1 и SJL – являющихся моделями различных аутоиммунных заболеваний. Иммунизацию мышей данных линий проРис. 28. Иммуноферментный анализ сывороток крови иммунизированных мышей. Адсорбцию про- водили по ранее опублиководили в лунках с иммобилизованными антигенаванной схеме получения ми. Комплекс детектировали при помощи антивикаталитических антител к довых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена.

аналогам переходного состояния ферментативных реакций (Tawfik, Chap et al. 1995). Сравнительный анализ специфического иммунного ответа на антиген у разных иммунизированных мышей всех трех линий (рис. 28) проводили методом иммуноферментного анализа (ELISA). В качестве антигена был использован исходный пептидилфосфонат, меченный биотином; биотинилированный Val-фосфонат и нитрофенилметил-пбиотинилфенилметил фосфонат (Bt-Y), для которого ранее была показана специфическая ковалентная модификация активного центра абзимов (Kolesnikov, Kozyr et al. 2000). Для всех трех линий иммунизированных мышей оказалось, что антитела обладают высокой специфичностью к модифицированному пептидному фрагменту антигена, не взаимодействуют в условиях данного эксперимента со свободным Val-фосфонатом, и, в то же время, связываются с более активным и менее специфичным модифицирующим агентом - Bt-Y.

Дальнейшее изучение типа взаимодействия полученных антител с реакционным пептидом проводилось на аффинно-очищенных препаратах IgG. Иммобилизованный на мембране ковалентный комплекс антиген–антитело детекти ровали методом иммуноблоттинга. Результаты данного эксперимента (рис. 29) свидетельствуют о наличии в препаратах поликлональных антител, выделенных из аутоиммунных мышей, иммунизированных «реакционным» пептидом LAEEEV-Phos, как легких, так и тяжелых цепей иммуноглобулинов, способных к ковалентной модификации пептидом.

Т.е. в результате реакционной иммунизации образовались антитела, способные ковалентно взаимодействовать с гаптеном и строго Рис. 29. Электрофореграмма и иммуноблоттинг поликлональных анспецифичные тител (1 мкг), выделенных из иммунизированных мышей линий SJL, MRL и NZB/NZW F1 после реакции с пептидил фосфонатом - LAEEEVк его пептидPhos (0,1 мкМ). Трипсин (1 мкг), БСА (5 мкг) и поликлональные IgG, ной комповыделенные из мыши линии BALB/c (1 мкг), были использованы в качестве положительного и отрицательного контролей, соответст- ненте.

венно.

В результате скрининга панели гибридом, полученных из селезенок опытных мышей, были отобраны 7 моноклональных антител, способных к ковалентной модификации реакционным пептидил фосфонатом. Причем в двух случаях модификации подвергались легкие цепи антител, а в пяти – тяжелые.

ДНК, соответствующая вариабельным доменам данных антител, была наработана методом ПЦР, и определена нуклеотидная последовательность. Одноцепочечные антитела были экспрессированны в прокариотической системе. Рекомбинантные антитела Е11 и Е6 обладали каталитической активностью по отношению к низкомолекулярному субстрату LAEEEV-MCA. Кинетические па-3 -раметры гидролиза амидной связи составили: kcat = 1,1 ± 0,5 x 10 min, Km = -4 -53 ±14 мкM для антитела Е6 и kcat =3,2 ± 0,7 x 10 min, Km = 48 ±11 мкM для антитела Е11.

Проведенные эксперименты показали принципиальную возможность по лучения специфичных к антигену каталитических антител методом реакционной иммунизации.

4.2. Получение каталитических антител, специфичных к gp120, на фоне индуцированного аутоиммунного заболевания.

Для целей настоящего исследования была выбрана линия мышей SJL, развивающая ЕАЕ при иммунизации иммунодоминантным пептидом ОБМ 85-97 (Sakai, Zamvil et al. 1988; Tan, Kennedy et al. 1992).

Была разработана оригинальная схема индукции антиген-специфического протеолитического иммунного ответа при иммунизации животных слитным белком, состоящим из константных областей gp120 и пептида ОБМ 85-101.

Получение слитных белков для иммунизации и изучения свойств антител Исходя из опубликованных исследований по структуре, иммуногенности и функциональной активности gp120 (Hansen, Lund et al. 1996; Shioda, Oka et al. 1997;

Sullivan, Sun et al. 1998) были определены участки белка с относительно константной последовательностью. Для дальнейшего использования был выбран химерный полипептид, состоящий из трех фрагментов gp120 (аббревиатуры I, II, III) c делецией первого, второго и третьего гипервариабельных регионов и окружающих их гидрофобных альфа-спиральных участков 1, 2; также был удален лидерный пептид gp120 и С-концевой альфа-спиральный участок 6. В качестве исходной матрицы для получения “минимального” белка была использована последовательность гена HXB2-env, соответстующий клон был предоставлен AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIH.

Был получен набор генетических конструкций, кодирующих выбранные фрагменты gp120, тиоредоксин I E.coli, гексагистидиновые кластеры, эпитоп человеческого белка р62c-myc и пептид ОБМ 85-101, в различных комбинациях (рис. 30).

Для экспрессии рекомбинантных белков был выбран штамм E.coli BL21(DE3). Полипептиды trx, и 1-3 выделяли методом металло-хелатной хроматографии в нативных условиях, тогда как для продуктов конструкций 4-использовали денатурирующие условия. Полученные белки были охарактеризованы масс-спектрометрически.

Для исследования сайт-специфичности протеолитических антител была также получена растворимая форма белка trx-gp120I-III при экспрессии в штамме E.coli Origami B (DE3), с последующей преципитацией белка сульфатом аммония, металло-хелатной хроматографией и анионообменной хроматографей.

Рис. 30. Схема участков экспрессионных конструкций, кодирующих рекомбинантные белки. Названия рекомбинантных белков приведены справа, номера конструкций – слева.

Поскольку нативный gp120 содержит 22-24 N-связанные олигосахаридные группы (Yeh, Seals et al. 1993), гликозилированный полноразмерный gp120 для целей настоящего исследования был получен в бакуловирусной системе экспресии.

Были использованы вектор pMelBacB и фрагмент гена env из плазмиды HXB2-env, соответствующий зрелому gp120. Целевой белок был выделен из супернатанта культуры и очищен до гомогенности по ДСН-ПААГ. Идентичность очищенного gp120 была подтверждена N-концевым секвенированием и энзиматическим Nдегликозилированием; электрофоретическая подвижность дегликозилированного gp120 соответствовала теоретической массе (56 кДа). Таким образом, был получен набор рекомбинантных белков, достаточный для иммунизации животных, изучения параметров иммунного ответа и характеризации каталитических антител.

Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей.

Индукция ЕАЕ у мышей линии SJL была проведена при помощи слитного белка gp120I-IIImbp или пептида ОБМ85-97 в соответствии со стандартным протоколом (Miller and Karpus 1996). Распределение мышей по опытным и контрольным группам приведено в таб. 6.

Развитие ЕАЕ у мышей, иммунизированных gp120I-IIImbp или пептидом ОБМ85-97, было дополнительно исследовано путем гистологического анализа, проведенного через 30 дней после начала иммунизации. На срезах тканей были зафиксированы изменения, типичные для развивающегося ЕАЕ (Schwartz 1993), что показывает возможность индукции ЕАЕ пептидом ОБМ85-101 в составе слитного белка.

Группа животных SJL-1 SJL-2 SJL-3 SJL-4 SJL-5 SJL-6 Balb-1 Balb-Пептид gp120IИммуноген - ОБМ Gp120I-IIImbp gp120I-III IIImbp 85-Доза, мкг - 170 150 300 150 300 - 3trx-gp120I-III - - + + + + - + trx- gp120I-II - - + + + + - + trx- gp120III - - + + + + - + trx-mbp - + + + - - - + ОБМ85-97 – БСА - + + + - - - + Trx - - - - - - - - Таб. 6. Специфический иммунный ответ мышей линии SJL, по данным ИФА. Результат ИФА считали положительным, если для всех мышей из исследуемой группы величина сигнала в три и более раз превышала фоновое значение. Разведение исследуемых сывороток при анализе варьировалось для разных антигенов. Все группы состояли из 5 мышей.

Каталитические свойства полученных антител Исследование протеолитических свойств антител иммунизированных мышей проводилось с помощью ранее разработанного флуоресцентного теста. В качестве специфического субстрата использовался gp120I-III, избыточно меченый флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Как видно из Рис. 32, при иммунизации мышей слитным белком gp120I-III-mbp происходит значительное увеличение протеолитической активности антител по отношению к антигену, достигающее 9-ти раз при иммунизации gp120I-III-mbp в дозе 150 мкг/мышь, по сравнению с контролями.

Уменьшение активности антител в случае иммунизации gp120I-III-mbp в дозе 3 мкг/мышь, может быть объяснено более интенсивным маскированием субстрата связывающими антителами. Также следует отметить, что уровень протеолитической активности антител по отношению к неспецифическому субстрату ФИТЦ-БСА практически одинаков для иммунизированных и интактных мышей SJL Рис. 32. Протеолитическая активность антител.

Увеличение интенсивности флюоресценции gp120I(данные не приводятся).

III-ФИТЦ при распаде субстрата. Относительное Установление сайтувеличение интенсивности флюоресценции вычислено как отношение разности интенсивности флюо- специфичности протеолиресценции в момент времени t (Ft) и интенсивности тических антител к gp1флюоресценции в момент начала реакции (F0) к инСпецифичность протеолиза, тенсивности флюоресценции в момент начала реакции (F0): A=(Ft-F0)/F0. Приведены средние значения катализируемого исследуемыми для трех независимых измерений и стандартное отантителами, была исследована клонение.

при использовании в качестве субстрата gp120I-III и гликозилированного полноразмерного gp120, а также контрольного субстрата – БСА. Продукты гидролиза анализировали при помощи ДСНПААГ и блоттинга (Рис. 32). Распад контрольного субстрата БСА под действием антител не наблюдался ни в одном из случаев. В то же время при инкубации антител, выделенных из мышей группы SJL-3, с gp120I-III и гликозилированным gp1наблюдалось появление единственного крупного продукта расщепления, обозначенного треугольником. В случае негликозилированного gp120I-III разница в молекулярной массе субстрата и продукта гидролиза, рассчитанная по изменению подвижности полос, составила около 3 кДа, что соответствует расположению сайта гидролиза в районе C-конца gp120 перед гексагистидиновым кластером либо в Nконцевой части белка.

Для точного определения сайта гидролиза gp120 антителами был использован слитный белок Trx-gp120I-III, полученный в растворимой форме. Он содержит одиночный гексагистидиновый кластер между доменами тиоредоксина и gp120 и два кластера на C-конце белка. Для отделения пептидных продуктов протеолиза gp1и точного измерения их молекулярной массы была применена масс-спектометрия SELDI. Наличие у предполагаемых продуктов реакции гексагистидиновых класте Рис. 32. Катализируемый антителами гидролиз gp120I-III по данным ДСН-ПААГ (A), гликозилированного gp120 по данным ДСН-ПААГ (Б) и иммуноблоттинга (В); отсутствие гидролиза биотинилированного БСА по данным ДСН-ПААГ (Г) и иммуноблоттинга (Д). Гели окрашивали серебром (А, Б, Г) либо проводили иммуноблоттинг с использованием конъюгата нейтравидина и пероксидазы хрена (В, Д). Молекулярные массы полос маркера указаны стрелками и приведены в кДа, тяжелые цепи IgG, легкие цепи и продукты распада gp120 отмечены надписями Hc, Lc и треугольником, соответственно. Ат – антитела.

ров позволило использовать мишень, содержащую иммобилизованные комплексы нитрилтриуксусной кислоты и ионов никеля. Масс-спектрометрический анализ продуктов гидролиза Trx-gp120I-III под действием антител показал (рис. 33), что основной пик на опытном спектре соответствует пептиду с молекулярной массой 5526.8 Да, что соответствует расположению сайта гидролиза между остатками Pro493 и Leu494 (позиции обозначены в соответствии с номенклатурой HXB2CG).

В молекуле слитного белка Trx-gp120I-III этот сайт соответствует позициям 484485; теоретическая молекулярная масса отщепляемого пептида – 5528 Да, что соответствует ошибке определения 0,02%.

Выявленный сайт гидролиза находится в относительно консервативной области gp120. Согласно сведениям базы данных, содержащей большинство известных вариантов последовательностей белка gp120 ВИЧ-1 (HIV Sequence Database, 2002), 12-членный пептид, окружающий сайт гидролиза, содержится полностью в 34% последовательностей. 7-членные пептиды, содержащие сайт гидролиза и составляющие типичный линейный эпитоп, узнаваемый антителами, содержатся целиком в 48% последовательностей (среднее значение для 6 возможных пептидов). Таким Рис. 33. Масс-спектрометрический анализ гидролиза gp120 антителами.

По оси абсцисс отложено отношение массы молекулярных ионов к их заряду, по оси ординат - интенсивность сигнала. Основной пик, соответствующий C-концевому пептиду trxgp120I-III, обозначен стрелкой. Контрольные спектры сдвинуты вниз, молекулярные массы приведены в Да.

образом, около половины из охарактеризованных вариантов ВИЧ-1 потенциально чувствительны к действию изучаемых протеолитических антител.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые продемонстрирована каталитическая активность природных антител у мышей с SPF статусом линий MRL-lpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1, характеризующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунными заболеваниями, что делает эти линии перспективной моделью для направленного получения и детального изучения специфических абзимов с различной активностью.

2. Впервые показана антиген-специфическая каталитическая активность аутоантител к основному белку миелина (ОБМ) у больных рассеянным склерозом (РС) и модельных животных, коррелирующая с тяжестью заболевания. Определены шесть преимущественных сайтов расщепления молекулы ОБМ абзимами, и оценены кинетические параметры данной реакции. По отношению к фрагментам ОБМ была изучена как связывающая, так и каталитическая активности аутоантител, выделенных из сывороток крови пациентов с РС, больных с другими нейродегенеративными заболеваниями, здоровых доноров и модельных животных. Гидролизу абзимами во всех приведенных случаях подвергался исключительно энцефалитогенный фрагмент ОБМ81-103. Обнаруженная связывающая и сайт-специфическая каталитическая активность анти-ОБМ антител при РС и других, мимикрирующих, нейродегенеративных заболеваниях позволила создать основу для новых дифференциальных методов диагностики РС.

3. На примере антитела 6B8E12 к субтилизину Карлсберг впервые показано, что антиидиотипические антитела, полученные к протеазе, могут осуществлять каталитическую функцию, схожую с первичным антигеном. Экспрессия антитела 6B8E12 в виде рекомбинантного одноцепочечного антитела и демонстрация его каталитической активности явилась наиболее убедительным доказательством «абзиматической» природы обнаруженной активности.

4. Впервые показано, что полученные в результате реакционной иммунизации пептидил дифенил фосфонатом (LAEEE-VPhos) поликлональные антитела обладают специфичностью по отношению к пептидному фрагменту «реакционного» гаптена и способны ковалентно взаимодействовать с фосфонатной составляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз.

5. Разработана оригинальная схема иммунизации мышей линии SJL гибридным белком, состоящим из константных областей поверхностного антигена ВИЧ-gp120 и фрагмента ОБМ, приводящая к появлению протеолитических антител, из бирательно расщепляющих антиген. Показано, что полученные антитела способны специфически гидролизовать полноразмерный гликозилированный gp120, и установлен преимущественный сайт гидролиза gp120 Pro493-Leu494, находящийся в константной области белка. Разработанный подход может быть использован для получения «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий.

6. При селекции полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием п-нитрофенил 8-метил-8азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфоната получены рекомбинантные одноцепочечные антитела, ковалентно взаимодействующие с необратимыми ингибиторами сериновых гидролаз. Определены аминокислотные остатки, участвующие в «ковалентном катализе». Показано, что отобранные рекомбинантные антитела способны гидролизовать амидную связь. Данные одноцепочечные антитела могут быть рассмотрены как пример простейшего устройства активного центра ферментов и использованы в качестве матрицы для получения новых искусственных ферментов методом целенаправленного улучшения их свойств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи:

1. Н.А. Пономаренко, Е.С. Александрова, И.И. Воробьев, О.М. Дурова, А.В. Козырь, А.В. Колесников, Г.Б. Телегин, А.Р. Калинина, С.В. Сучков, А.Г. Габибов.

Каталитическая активность нативных антител у мышей с аутоиммунными нарушениями. // Доклады Академии Наук, 2000. Т. 375. С. 224-227.

2. N.A. Ponomarenko, O.M. Durova, I.I. Vorobiev, E.S. Aleksandrova, G.B. Telegin, O.G. Chamborant, L.L. Sidorik, S.V. Suchkov, Z.S. Alekberova, N.V. Gnuchev, A.G.

Gabibov. Catalytic antibodies in clinical and experimental pathology: human and mouse models. // J. Immunol. Methods. 2002. v. 269. №1-2 p.197-211.

3.А.Г. Габибов, А. Фрибуле, Д. Тома, А.В. Демин, Н.А. Пономаренко, И.И. Воробьев, Д. Пиле, М. Паон, Е.С. Александрова, Г.Б. Телегин, А.В. Решетняк, О.В.

Григорьева, Н.В. Гнучев, К.А. Малышкин, Д.Д. Генкин. Антитела – протеазы:

подходы к индукции каталитического ответа.// Биохимия, 2002, т. 67, с. 14131426.

4. Н.А. Пономаренко, О.М. Дурова, И.И. Воробьев, С.В. Сучков, А.Г. Габибов.

К вопросу о каталитической активности аутоантител при рассеянном склерозе.// Доклады Академии Наук, 2004 т.395, с.839-842.

5. Воробьев И.И., Пономаренко Н.А., Решетняк А.В., Дурова О.М., Мисиков В.К., Сучков С.В., Габибов А.Г. Каталитические антитела в медицине: специфическая деградация аутоантигенов и новые подходы к инактивации патогенов// Молекулярная медицина, 2004, №3, с.48-55.

6. Сучков С.В., Мисиков В.К., Дурова О.М., Черепахина Н.Е., Кимова М.В., Введенская О.Ю., Пономаренко Н.А., Пронина О.А., Котов С.В., Габибов А.Г.

Аутоантитела при рассеянном склерозе: патогенетическая и клиническая зависимость// Неврологический журнал, 2005, №4, т.10, с. 49-54.

7. С.В. Сучков, Т.Е. Наумова, А.Н. Хитров, В.А. Агеев, Е.А. Огнева, З.С. Алекберова, О.М. Дурова, Н.А. Пономаренко, А.Г. Габибов // Новые механизмы антителоопосредованной цитотоксичности и их возможная роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний// Молекулярная медицина, 2005, №1, С. 32-36.

8. Е.В. Калинина, Н.А. Пономаренко, О.М. Дурова, Ф.Н. Палеев, И.И. Воробьев, Н.Н. Кекенадзе, З.А. Шогенов, М.Е. Земцова, Н.В. Гнучев, А.Г. Габибов, С.В.

Сучков Каталитические аутоантитела при аутоиммунном миокардите: клиничкое и патогенетическое значение// Терапевтический архив, 2005, №(9), с. 65-70.

9. С.В. Сучков, З.С. Алекберова, Ф.Н. Палеев, Т.Е. Наумова, В.К. Мисиков, Е.С.

Кряжева, Н.А. Пономаренко, А.Г. Габибов // Достижения и перспективы клинической абзимологии// Вестник РАМН, 2005, №9, С. 38-43.

10. В.К. Мисиков, М.В. Кимова, О.М. Дурова, А.Г. Габибов, С.В. Сучков, И.И.

Воробьев, Н.А.Пономаренко Каталитические аутоантитела при рассеянном склерозе: патогенетические и клинические аспекты.// Бюл. Экс. Биол. Мед. 20т. 139. №(1), с. 98-101.

11. N. A. Ponomarenko, O. M. Durova, I. I. Vorobiev, A. A. Belogurov, A. G.

Petrenko, G. B. Telegin, S. V. Suchkov, V. K. Misikov, S. L. Kiselev, M. A. Lagarkova, V. M. Govorun, M. V. Serebryakova, B. Avalle, P. Tornatore, A. Karavanov, H.

C. Morse III, D. Thomas, A. Friboulet, A. G. Gabibov. Autoantibodies from MS patients and EAE developing mice exhibit site-specific cleavage of myelin basic protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006. V. 103. № 2, P.281-286.

12. N.A. Ponomarenko, O.M. Durova, I.I. Vorobiev, A.A. Belogurov, G.B. Telegin, S.V. Suchkov, V.K. Misikov, H.C. 3rd Morse, A.G. Gabibov. Catalytic activity of autoantibodies toward myelin basic protein correlates with the scores on the multiple sclerosis expanded disability status scale. // Immunol Lett. 2006. Т. 103. № 1 С. 4550.

13. Ponomarenko N.A., Vorobiev I.I., Alexandrova E.S., Reshetnyak A.V., Telegin G.B., Khaidukov S.V., Avalle B., Karavanov A., Morse H.C. 3rd, Thomas D., Friboulet A., Gabibov A.G. Induction of a protein-targeted catalytic response in autoimmune prone mice: antibody-mediated cleavage of HIV-1 glycoprotein GP120.// Biochemistry. 2006 Jan 10;45(1):324-330.

14. К.А. Мальцев, А.Н. Хитров, О.Ю. Введенская, Н.А. Пономаренко, М.А.

Исаева, М.В. Кимова, Е.Б.Третьяк, З.С. Шогенов, З.С. Алекберова, А.Г. Габибов, С.В. Сучков. //Каталитические аутоантитела - новый молекулярный инструмент в кардиологии и офтальмологии.// Терапевтический архив, 2006, №11, стр.70-76.

15. А.Н. Хитров, К.А. Мальцев, О.Ю. Введенская, Н.А. Пономаренко, М.А.

Исаева, М.В. Кимова, Е.Б.Третьяк, З.С. Шогенов, З.С. Алекберова, А.Г. Габибов, С.В. Сучков. //Каталитические аутоантитела как новый молекулярный ин струмент в ревматологической практике.// Терапевтический архив, №6, 2006, стр.59-66.

16. Gabibov A.G., Ponomarenko N.A., Tretyak E.B., Paltsev M.A., Suchkov S.V.

Catalytic autoantibodies in clinical autoimmunity and modern medicine.// Autoimmun Rev. 2006, №(5) p. 324-330.

17. Калинина Е.В., Воробьев И.И., Шогенов З.С., Пономаренко Н.А., Земцова М.Е., Дурова О.М., Палеев Ф.Н., Кекенадзе Н.Н., Габибов А.Г., Гнучев Н.В., Джанашия П.Х., Мальцев К. А., Сучков С.В. Феномен антителоопосредованного катализа при аутоиммунном миокардите.// Молекулярная медицина, 2006, №1, с.36-41.

18. Reshetnyak A.V., Armentano M.F., Ponomarenko N.A., Vizzuso D., Durova O.M., Ziganshin R., Serebryakova M., Govorun V., Gololobov G., Morse H.C.3rd, Friboulet A., Makker S.P., Gabibov A.G., Tramontano A. Routes to covalent catalysis by reactive selection for nascent protein nucleophiles.// J Am Chem Soc. 2007;v. 129, №(51), p. 16175-16182.

19. Ponomarenko N.A., Pillet D., Paon M., Vorobiev I..I, Smirnov I.V., Adenier H., Avalle B., Kolesnikov A.V., Kozyr A.V., Thomas D., Gabibov A.G., Friboulet A.

Anti-idiotypic antibody mimics proteolytic function of parent antigen.// Biochemistry.

2007, v. 46, №(50), p. 14598-14609.

20. А.В.Решетняк, М.Ф.Арментано, Г.С.Морзе, А.Фрибуле, С.П.Маккер, А.Трамонтано, В.Д.Кнорре, А.Г.Габибов, Н.А.Пономаренко. Механизмзависимая селекция библиотек генов иммуноглобулинов для получения ковалентных биокатализаторов.// Доклады Академии Наук, 2007, т. 415, №2, с. 268-272.

21. С.В. Сучков О.Ю. Введенская, И.В. Вострикова,А.Г. Габибов, М.В. Кимова, Ю.А. Бурдакова, Н.А. Пономаренко, М.А. Пальцев. Антителоопосредованный протеолиз ассоциированных с миелином белков как новый механизм контроля за процессами демиелинизации при рассеянном склерозе.// Вестник РАМН, 2007, №7, с. 32-36.

22. Белогуров А.А., Куркова И.Н., Мисиков В.К., Сучков С.В., Телегин Г.Б., Алехин А.И., Гончаров Н.Г., Кнорре В.Д., член-корреспондент РАН Габибов А.Г. и Пономаренко Н.А. К вопросу о субстратной специфичности каталитических аутоантител при нейродегенеративных процессах. // Доклады Академии Наук, 2007, т.413, №3, с. 408–411.

23. Belogurov A.A. Jr, Kurkova I.N., Friboulet A., Thomas D., Misikov V.K., Zakharova M.Y., Suchkov S.V., Kotov S.V., Alehin A.I., Avalle B., Souslova E.A., Morse H.C. 3rd, Gabibov A.G., Ponomarenko NA. Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies: novel biomarker for multiple sclerosis.// J Immunol. 2008, v. 180, №2, p. 1258-1267.

24. Смирнов И.В., Воробьев И.И.,Фрибуле А.,Аваль Б., Тома Д., Кнорре В.Д., член-корреспондент РАН Габибов А.Г. и Пономаренко Н.А. Антиидиотипический подход для получения антитела-протеазы.// Доклады Академии Наук, 2008, т.420, №1, с. 1-4.

Патент 1. 20040265975 (United States Patent Application) Габибов А.Г., Пономаренко Н.А., Колесников А.В., Воробьев И.И., Александрова Е.С., Демин А.В. «Метод получения каталитических аутоантител; антигены для иммунизации и нуклеотидные последовательности» 30.12. 20






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.