WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

  На правах рукописи

ВАССЕРЛАУФ Ирина Эгоновна

ИЗУЧЕНИЕ  ВЗАИМОРАСПОЛОЖЕНИЯ  ХРОМОСОМ

В ЯДРАХ  ТРОФОЦИТОВ  ЯИЧНИКОВ

У НЕКОТОРЫХ  ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ  DIPTERA

Специальности:

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 

03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2010

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биологии и биофизики Томского государственного университета, г. Томск.

Научный консультант:  доктор биологических наук

Стегний Владимир Николаевич

  НИИ биологии и биофизики

Томского государственного университета,

  г. Томск

Официальные оппоненты:

  доктор биологических наук

Смирнов Александр Федорович

Санкт-Петербургский государственный  университет,

г. Санкт-Петербург

  доктор биологических наук

Зыбина Татьяна Геннадьевна

  Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург 

 

доктор биологических наук

  Демаков Сергей Анатольевич

  Институт химической биологии и фундаментальной  медицины 

СО РАН, г. Новосибирск

 

  Ведущее учреждение: Институт систематики и экологии животных СО РАН

  г. Новосибирск

Защита  диссертации  состоится  «__»  ______________  2011  г.  в  __ часов  на  заседании совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном  университете  по  адресу:  199034,  Санкт-Петербург,  Университетская  наб.  7/9,

биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке

им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета.

Автореферат разослан «__» ______________ 2011 г

Ученый секретарь 

Диссертационного совета Д 212.232.12

кандидат биологических наук  Л.А. Мамон 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Достижения современной генетики и биологии развития эукариот демонстрируют, что прогрессивное эволюционное преобразование онто- и филогенеза осуществляется не за счет изменений генного состава организма, а связано с дифференциальной экспрессией генов [Корочкин, 1977; Георгиев, 1989; Ferrai, Pombo, 2009]. Экспрессия множества генов жестко скоординирована по месту и времени в онтогенезе, которая, вероятно, имеет четкую «программу развития», носящую видоспецифичный характер [Wolpert, 1978; Gilbert, 1991; Lewin, 1994; Tanabe et al., 2002]. Тканеспецифичная экспрессия генов обеспечивается внутри- и межхромосомным взаимодействием различных доменов, формирующих хромосомные территории [Жимулев, 1993; Tarlof et al., 1984; Zhimulev, 1998; Zink et al., 2001; Boyle et al., 2001; Goetze et al., 2007]. При этом важнейшим обстоятельством эпигенетического контроля являются позиционные отношения хромосом между собой и с ядерной оболочкой [Гвоздев, 2001; Серов, 2003; Marshall, 2003]. Ориентация хромосом в пространстве ядра у эукариот играет важную роль в экспрессии генов, в сегрегации хромосом в процессе клеточного деления [Стегний, 1979; Глазков, 1999; Marshall, Sedat, 1999; Sadoni, Langer, 1999; Cremer, Cremer, 2001]. Для интерфазного ядра характерна динамичность хроматина [De Boni, Mintz, 1986; Marshall, et al., 1997; Abney et al., 1997; Csink, Henikoff, 1998], при этом хромосомы сохраняют свою территориальность и взаимное расположение [Croft et al., 1999; Cremer, Cremer, 2001; Karen et al., 2007]. По своей функциональной значимости ядра с политенными хромосомами большинства двукрылых насекомых являются хорошей моделью интерфазных для изучения функциональной, структурной и пространственной организации хромосом.

Изучение Anopheles показало, что пространственная организация политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников имеет тканевую и видовую специфику. Архитектоника хромосом ядер трофоцитов яичников может являться таксономическим признаком. Такая реорганизация архитектуры хромосом ядер трофоцитов яичников, сопряженная с видообразованием, была названа системной мутацией [Стегний, 1979, 1993]. Есть основания предполагать, что в подобных структурных перестройках архитектуры хромосом принимают участие мобильные генетические элементы (МГЭ), активация которых, в ряде случаев, осуществляется при инбредном размножении, гибридном дисгенезе и экстремальных температурах развития [Медведева, Савватеева, 1991; Стегний, 1993; Евгеньев и др., 1998; Васильева и др., 2009; Biemont et al., 1990]. Явление гибридного дисгенеза объясняется моделью Сведа [Sved, 1976], согласно которой при скрещивании лабораторных линий и природных популяций D. melanogaster проявляется несоответствие взаиморасположения родительских хромосом в пространстве ядра.

Ооцит и трофоциты по происхождению являются сестринскими клетками. У малярийных комаров политенные хромосомы трофоцитов имеют дисковую исчерченность и их можно идентифицировать [Стегний, 1979, 1993]. У других двукрылых насекомых в ядрах трофоцитов образуются политенные хромосомы, не имеющие четкой дисковой структуры.

В норме у дрозофилы в эндоциклах с S3 по S7 выявляются эндополиплоидные ядра с различной степенью политенизации и морфологией хроматина: первичные политенные хромосомы, имеющие гетерохроматиновые блоки; помпонообразные, компактные хромосомы; стадия дезинтеграции помпонообразных хромосом и ядра с ретикулярной структурой [Жимулев, 1992; Painter, Reindrop, 1939; King et al., 1981].

Исследования архитектуры ядер на протяжении эндомитотических циклов и изучение феномена реорганизации ядра в генеративной системе клеток (системной мутации) при видообразовании у ряда представителей двукрылых насекомых являются актуальными для понимания механизмов реорганизации ядра в процессе сальтационного видообразования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение взаиморасположения хромосом в ядрах трофоцитов яичников у ряда представителей Diptera и выявление видовых особенностей пространственной организации хромосом в подгруппе melanogaster и группе virilis рода Drosophila .

В ходе исследования решались следующие задачи:

  1. Изучить взаиморасположение и особенности политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников на протяжении всех стадий политенизации у близкородственных видов подгруппы melanogaster и группы virilis рода Drosophila (Diptera: Drosophilidae), и Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae).
  2. Изучить филогенетическую реорганизацию гетерохроматина и ДНК хромоцентра D. orena в ядрах трофоцитов у близкородственных видов подгруппы melanogaster.
  3. Выявить связь между декомпактизацией прицентромерного гетерохроматина и образованием ядрышка в ядрах трофоцитов яичников дрозофил и малярийных комаров.
  4. Провести сравнительный анализ взаиморасположения хромосом в ядрах сестринских клеток трофоцитов и ооцита, а также сперматоцитов у малярийных комаров.
  5. На основании анализа полученных данных выяснить эволюционные закономерности реорганизации хромосом в ядрах генеративной системы у близкородственных видов подгруппы melanogaster и группы virilis.

Научная новизна.         Впервые в работе проведен анализ ориентации первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников у Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae), близкородственных видов подгруппы melanogaster и видов группы virilis рода Drosophila. У дрозофил обнаружены четыре типа организации ядра: 1) с локальным хромоцентром; 2) с диффузным хромоцентром; 3) с отсутствием визуального хромоцентра; 4) с прикреплениями хромосом к ядерной оболочке. Эволюционные преобразования взаиморасположения хромосом в ядрах трофоцитов у видов происходили по схеме: от локального хромоцентра у филогенетически исходных видов к его частичному, а затем и к полному исчезновению у производных видов, при этом хромосомы рассредоточены в ядре и образуют связи с оболочкой ядра у ряда видов. Показано, что реорганизация хромосомного аппарата при видообразовании у видов группы virilis и подгруппы видов melanogaster имеет сходный характер. 

Установлено, что такие факторы, как низкая температура и инбридинг  оказывают значительное влияние на синаптирование гомологичных хромосом в ядрах трофоцитов яичников в линиях D. melanogaster.

Обнаружено, что разобщенность плеч хромосом, выявленная на определенных стадиях эндоциклов (S3-S4) в ядрах трофоцитов у дрозофил и малярийных комаров происходит за счет декомпактизации прицентромерного гетерохроматина и образования ядрышка. У Calliphora erythrocephala с ростом политенизации плечи хромосом не разобщаются. Установлено сходство в организации пахитенных хромосом ооцита и политенных хромосом трофоцитов у малярийных комаров.

Основные положения, выдвигаемые на защиту.

  1. У видов подгруппы melanogaster и группы virilis рода Drosophila характерны четыре морфологических типа организации ядер трофоцитов яичников.
  2. Последовательности ДНК хромоцентра D. orena у близкородственных видов подгруппы melanogaster локализованы в прицентромерных и интеркалярных районах хромосом.
  3. К факторам, приводящим к изменению организации хромосом в ядрах трофоцитов яичников у Drosophila, относятся низкие температуры и продолжительный инбридинг, которые играют важную роль в процессе видообразования.
  4. У видов подгруппы melanogaster рода Drosophila и у малярийных комаров выявляется стадия политенизации, при которой плечи хромосом разобщаются за счет декомпактизации прицентромерных гетерохроматиновых блоков с образованием ядрышка.

Практическая значимость. Критерий «архитектоника ядра» имеет практическое значение для систематики двукрылых насекомых, что позволяет решить некоторые проблемы в диагностике эпидемически опасных видов (малярийных комаров) для человека. Были вскрыты видовые особенности взаиморасположения хромосом в ядрах трофоцитов яичников.

Результаты работы используются при чтении лекционных курсов для студентов Томского государственного университета. Полученный материал может быть использован в курсах лекций по цитологии, генетике и эволюционной цитогенетике в вузах c биологическими специальностями.

Апробация работы. Материалы работы доложены и представлены на следующих научных конференциях: V Всесоюзное совещание по проблемам биологии и генетики дрозофилы, г. Львов, 1987; IV Всесоюзное совещание  «Структура и функции хромосом», г. Пущено, 1988; VI Всесоюзное совещание  по проблемам биологии и генетики дрозофилы, г. Одесса, 1989; III Школа-семинар по генетике и селекции животных. II Научные чтения памяти ак. Д.К. Беляева, г. Новосибирск, 1989; III Всесоюзная конференция по генетике и цитологии мейоза, г. Новосибирск, 1990; VII Всесоюзное совещание «Структура и функции хромосом», г. Пущено, 1991; I Всесоюзная конференция по генетике насекомых, Москва, 1991; VI съезд ВОГиС, г. Минск, 1992; I съезд ВОГиС, Саратов, 1994; XX International Congress of Entomology, Fierce, Italy, 1996; Конференция, посвященная памяти В.П.Чехова, ТГУ, г. Томск, 1997; Конференция «Проблемы эволюции, цитологии и интродукции», г.Томск, 1997; Региональная научно-практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых, «Сибирская школа молодого ученого», г. Томск, 1998, II Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, г. Санкт-Петербург, 2000; 1-ая Международная конференция «Проблема вида и видообразования», г. Томск, 2000; 2-ая Международная конференция «Проблема вида и видообразования», 2001, г. Томск; «Their impact on organisms, genomes, and biodiversity», Second meeting 14-17 June 2002, Helsinki, Finland; XV Всероссийское совещание «Структура и функции клеточного ядра», г. Санкт-Петербург, 2002; «Генетика в ХХI веке: современное состояние и  перспективы развития» III Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, г. Москва, 2004; IV международная конференция по кариосистематике беспозвоночных животных г. Санкт-Петербург, 2006; VII Межрегиональное совещание энтомологов Сибири и Дальнего Востока, г. Новосибирск, 2006; IV Международная конференция «Проблема вида и видообразования», г. Томск, 2006.

Вклад автора. Основные материалы и результаты получены автором самостоятельно. Данные по FISH в ядрах трофоцитов яичников C. erythrocephala и D. orena были получены совместно с Т.В. Ананьиной, А.Е. Ведерниковым, Т.А. Шелковниковой, К.Е. Усовым. Некоторые цитологические эксперименты проводились совместно с В.Н. Стегнием, Т.В. Ананьиной, Е.Ю. Митрениной, Т.А. Шелковниковой, Н.М. Немирович-Данченко, К.Е. Усовым.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы. Представленный материал иллюстрирован 8 таблицами и 61 рисунками, включающими в себя схемы, гистограмму и микрофотографии. Список цитируемой литературы включает 389 публикаций в отечественных и зарубежных журналах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 тезисов и 20 научных статей, опубликованных в центральных научных журналах списка ВАК.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Drosophila: Изучали особенности ориентации первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников 1 - 1,5-суточных самок девяти близкородственных видов подгруппы Drosophila melanogaster: D. melanogaster Meigen, D. simulans Sturtevant, D. sechellia Tsacas, Baechli, D. mauritiana Tsacas, David, D. yakuba Burla, D. teissieri Tsacas, D. erecta  Tsacas, Lachaies, предоставленные из фонда центра штата Аризона (США)), D. santomea Lachaise, Harry и D. orena Tsacas, David, любезно предоставленные F. Lemeunier (Laboratoire Populations, Genetique et Evolution, UPR CNRS, Gif-sur-Yvette, Франция) (табл. 1). Были получены межвидовые гибриды в F1 от следующих скрещиваний – D. mauritiana D. simulans; D. simulans D. melanogaster; D. simulans D. sechellia; D. mauritiana D. sechellia; D. sechellia D. mauritiana.

Таблица. 1. Характеристика изученного материала подгруппы melanogaster рода Drosophila.

Объекты исследований

Количество самок

Количество изученных ядер трофоцитов на одну особь

Общее количество изученных ядер

линии Drosophila melanogaster (Canton S; Oregon R)

42

27

1134

инбредная линия Oregon F 30

8

22

176

межлинейные гибриды Oregon R, F30F0

Oregon R, F0F30

19

25

475

высокоинбредные линии (ВА и НА ) F928

34

26

884

межлинейные гибриды: ВА НА; НАВА

32

22

704

дисгенные линии:

Р-М; I-R; системы гибридного дисгенеза

62

25

1550

межлинейные гибриды в системах Р-М; I-R гибридного дисгенеза

35

21

735

Berlin Canton`S, Canton`S Berlin, Berlin Oregon R, Canton`S Oregon R

83

26

2158

In (2L) PC 6-49/In (2LR) Cy0, dplv1Cy pr cn

27

24

648

In (2L) PC 6-49/In (2LR) Cy0, dplv1Cy pr cn2 Canton’S

24

21

504

fs(2)B; otu11

45

18

810

D. simulans

34

25

850

D. mauritiana

38

22

836

D. sechellia

34

21

714

D. erecta

27

24

648

D. teissieri

37

23

851

D. yakuba

32

21

672

D. santomea

34

24

816

D. orena

28

25

700

Для идентификации первичной политенной хромосомы 2, была использована линия In (2L) PC 6-49/In (2LR) Cy0, dplv1Cy pr cn2 D. melanogaster, несущая перестройку в 2L плече. Поставлено скрещивание – In (2L) PC 6-49/In (2LR) Cy0, dplv1Cy pr cn2 Canton’S от которого в F1 были получены гетерозиготы по инверсии 2L. Также были использованы 17-дневные самки мутантной линии fes (fs(2) B ms (2)2 b cn sp/in (2LR)SM1, al2 Cy dp pr B1 Lt3cn2 L4 sp2) и otu11, предоставленные И.Ф. Жимулевым (Институт химической биологии и фундаментальной  медицины СО РАН, г. Новосибирск).

Изучалась ориентация хромосом трофоцитов яичников у 2-3 дневных самок двенадцати близкородственных видов группы virilis (табл. 2), предоставленные В.Г. Митрофановым (Институт биологии развития РАН, г. Москва) и М.Б. Евгеньевым (Институт молекулярной биологии РАН, г. Москва). Только в филаде «virilis» были получены в F1 межвидовые гибриды от следующих скрещиваний: D. virilis D. lummei, D. virilis D. texana и D. texana D. americana.

Таблица. 2. Характеристика изученного материала группы virilis рода Drosophila.

Объекты исследований

Количество самок

Количество изученных ядер трофоцитов на одну особь

Общее количество изученных ядер

Drosophila virilis Sturtevant

31

23

713

D. texana Patterson

34

26

884

D. lummei Hackman

28

21

588

D. americana Spenser

27

24

648

D. kanekoi Watabe, Higuchi

25

23

575

D. montana Stone

32

21

672

D. novamexicana Patterson

31

22

682

D. ezoana Takada

34

24

816

D. borealis Patterson

37

21

777

D. flavomontana Patterson

28

23

644

D. littoralis Meigen

34

25

850

D. lacicola Patterson

33

25

825

Для изучения влияния инбридинга на ориентацию хромосом в ядрах трофоцитов яичников использовали 1–1,5 суточные самки линий D. melanogaster: Oregon R; инбредные линии Oregon R (F30); высокоинбредные линии ВА (F928) и НА (F928), полученные Л.З. Кайдановым [Кайданов и др., 1997] и любезно предоставленные О.В. Иовлевой, Санкт-Петербургский госуниверситет; D. melanogaster – взята из природных популяций г. Сочи (2004 г.). В линии Oregon R нами был поставлен тесный братско-сестринский инбридинг и получено 30-ое поколение. Инбредные линии содержались при оптимальной (24 – 26 С) и пониженной (16 С) температурах. В качестве контроля служили мухи исходной лабораторной линии Oregon R и линия из природной популяции г. Сочи, содержащиеся при 24 – 26 С и 16 С. Высокоинбредные линии мух (низкоактивные (НА) и высокоактивные (ВА)) содержались при 24 – 26 С.

Для изучения ориентации хромосом в ядрах трофоцитов при гибридном дисгенезе материалом исследований служили 1,5–2-х-суточные самки линий D. melanogaster – Сanton`S, Berlin и Oregon R, а также линии P-М (Cy/Pm; D/Sb - М-цитотип; 2 (C(1) Dx y f - Р-цитотип (полученная от В. Энгельса, (Engels V.) и линии I-R системы гибридного дисгенеза (Cha, JA (реактивные линии); W1118, Lumeni (индуцированные линии) – любезно предоставленные К. Бьемоном (Biemont С.) и А. Буссо (Busseu I.) Франция. Были поставлены межлинейные и дисгенные скрещивания.

Calliphora: Исследования проводили на синей мясной мухе Сalliphora erythrocephala Meigen (табл. 3), взятой из природной популяции г. Алма-Аты. Лабораторное культивирование мух осуществляли по стандартной методике [Тамарина, 1958] при температуре 25 °С. Культивирование инбредной линии проводили в условиях братско-сестринского инбридинга в течение пяти поколений при температуре 16 °С. Для анализа структуры ядер трофоцитов из общей культуры была выделена линия, с момента окукливания содержавшаяся при температуре 13 °С; для цитогенетического анализа использовали самок разного возраста (с 1-го по 9-й день после выхода имаго из пупария).

Таблица. 3. Характеристика изученного материала Calliphora erythrocephla.

Объекты исследований

Количество самок

Количество изученных ядер трофоцитов на одну особь

Общее количество изученных ядер

Calliphora erythrocephala

26

38

988

Anopheles: Изучение хромосом ооцитов и сперматоцитов проводили у малярийных комаров Anopheles messeae Falleroni, An. atroparvus van Thiel и у гибридов F1 между An. maculipennis Meigen и An. subalpinus Hack, et Lew (табл. 4).

Таблица. 4. Характеристика изученного материала малярийных комаров.

Объекты исследований

Количество самок

Количество изученных ядер трофоцитов на одну особь

Общее количество изученных ядер

Anopheles messeae

23

23

529

An. atroparvus

25

21

525

An. maculipennis

22

23

506

An. subalpinus

21

24

504

An. maculipennis An. subalpinus

12

25

300

Гибриды получали скрещиванием видов методом принудительной копуляции [Geerse et al., 1986]. Для анализа мейотических профазных хромосом из ооцитов отбирали суточных взрослых самок. Для изучения сперматоцитов использовали личинок IV возраста. Были изучены политенные хромосомы трофоцитов яичников у суточных самок малярийных комаров и с дисковой структурой политенные хромосомы взрослых самок после питания кровью.

Приготовление цитологических препаратов. У дрозофил и синей мясной мухи яичники выделяли в растворе 0,7 % NaCl и фиксировали в метанол-уксусной смеси (3:1). Приготавливали препараты по стандартной лактоацетоорсеиновой методике, при этом яичники не давили, а осторожно накрывали покровным стеклом так, что ядра сохраняли целостность и сферическую форму.

Для изучения пахитенных хромосом сперматоцитов первого порядка у фиксированных личинок IV возраста самцов малярийных комаров выделяли семенники, окрашивали ацетоорсеином и лактоацетоорсеином, семенники промывали в 45 % уксусной кислоте, затем накрывали покровным стеклом, давили и получали препараты. Препараты анализировали и фотографировали при помощи микроскопа Laboval-4 и фотоаппарата Olympus C3030-ADU (увеличение 10100).

Дифференциальная окраска хромосом. С-, R-, G-, DAPI и Ag-окрашивание хромосом трофоцитов яичников C. erythrocephala проводили по общепринятым методикам [Макгрегор, 1986]. Выявление пахитенных хромосом ооцитов у малярийных комаров проводили с помощью метода модифицированной двойной Фёльген-Гимза окраски [Kornberg et al., 1987]. Препараты анализировали и фотографировали при помощи микроскопа Laboval-4 и фотоаппарата Olympus C3030-ADU (увеличение 10100).

Получение хромосомоспецифичной ДНК-пробы и FISH в ядрах трофоцитов яичников C. erythrocephala и D. orena. Микродиссекцию проводили с помощью микроскопа AXIOVERT 10, оснащенного микроманипулятором IR (Zeiss, ФРГ) и механическим позиционером [Rubtsov et al., 2000]. ДНК- библиотека хромосомы 6 C. erythrocephala и ДНК из хромоцентра политенных хромосом ядер трофоцитов яичников D. orena были получены микроманипуляционным сбором, с последующей амплификацией ДНК с частично вырожденным праймером (DOP-PCR), как описано ранее [Rubtsov et al., 2000; Карамышева и др. 2001]. Для C. erythrocephala продукт полимеразной цепной реакции метили введением дигоксигенин-11-дУТФ. Флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) и детекцию меченой ДНК проводили согласно стандартным протоколам [Lichter et al., 1988]. Для окрашивания хромосом после in situ гибридизации использовали DAPI. Районы включения зонда определяли методом сравнения хромосом с включенной меткой с окрашенными лактоацетоорсеином политенными хромосомами на соответствующей стадии. Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss AxioImager (Zeiss, Германия), ССD-камеры AxioCam и программного обеспечения AxioVision LE Rel. 4.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности ориентации хромосом в ядрах генеративной системы клеток яичников у ряда представителей Diptera

Структурная организация и ориентация политенных хромосом в ядрах трофоцитов Drosophila melanogaster

Первичные политенные хромосомы. Была изучена динамика развития первичных политенных хромосом в ядрах псевдопитающих клеток яичников fs(2)B D. melanogaster и в ядрах трофоцитов линии Canton’S D. melanogaster. Хромосомы идентифицировали по размерным соотношениям плеч. С помощью гетерозиготы по инверсии хромосомы 2L идентифицировали 2R плечо, для которого характерны прицентромерные гетерохроматиновые блоки. Из всех хромосом хорошо диагностируется Х-хромосома, которая является телоцентриком, субметацентрическая хромосома 3 определяется по соотношению плеч: 3R длиннее 3L плеча. Плечи хромосомы 3 также можно различать по гетерохроматиновому блоку, локализованному вблизи прицентромерного района 3R плеча. Иногда можно выявить точечную хромосому 4.

Было обнаружено сходство в ориентации первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов между линиями fs(2)B и Canton S (рис. 1 б, в). Прицентромерные районы хромосом не образуют общего хромоцентра, характерного для слюнных желез и других соматических тканей. Взаиморасположение хромосом в ядрах трофоцитов яичников D. melanogaster упорядочено – прицентромерные районы хромосом Х и 3 близко ассоциированы по отношению друг к другу, а хромосома 2 располагается напротив них. Точечная хромосома 4 очень компактная и локализована в зоне прицентромерного района хромосомы 3. Причем хромосомы расположены в порядке ХL - 4 - 3 – 2 (по часовой стрелке). Таким образом, первичные политенные хромосомы трофоцитов яичников D. melanogaster не образуют хромоцентра и этим отличаются от хромосом слюнных желез.

Рис.1. Ориентация первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников линий fs (2)B – (б); Canton’S – (в) и вторичных политенных хромосом в ядрах псевдопитающих клеток яичников линий fs (2)B – (а); otu11 – (г, д) D. melanogaster. Стрелками обозначены прикрепления хромосом прицентромерными районами к оболочке ядра. XL, 2R, 2L, 3R, 3L – плечи хромосом; С – прицентромерные районы; N – ядрышко.

Вторичные политенные хромосомы. Вторичные политенные хромосомы имеют дисковую структуру, характерную для «классических» политенных хромосом, и выявляются в ядрах псевдопитающих клеток яичников мутантных линий fs(2)B (рис. 1 а), otu11 (рис. 1 г, д). Ориентация вторичных политенных хромосом сходна с взаиморасположением первичных политенных хромосом fs(2)B, otu11 и Canton’S (рис. 1). Для них также характерно отсутствие хромоцентра, плечи хромосом разобщены и связаны между собой тонкими гетерохроматиновыми фибриллами. В прицентромерных районах 2R и 3L хромосомных плеч выявляются асинапсисы, от которых отходят фибриллы к центромерным гетерохроматиновым блокам. Эти блоки с помощью тонких фибрилл, непосредственно контактируют с оболочкой ядра (рис 1 а, д).

Таким образом, на протяжении всех стадий политенизации хромосомы в ядрах трофоцитов яичников D. melanogaster не образуют хромоцентра, имеют связь с оболочкой ядра и принципиально отличаются от хромосом слюнных желез, имеющих общий хромоцентр, что является главным тканеспецифичным критерием.

Особенности ориентации первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов у близкородственных видов подгруппы melanogaster рода Drosophila

Виды подгруппы melanogaster рода Drosophila (Sophophora) известны как комплекс девяти морфологически сходных и близкородственных видов. Подгруппу melanogaster, в свою очередь подразделяют на два комплекса – «melanogaster» и «yakuba». В комплекс «melanogaster» входят: D. melanogaster и гомосеквентные виды – D. simulans; D. mauritiana; D. sechellia. В комплекс «yakuba» входят: D. orena, D. erecta, D. teissieri и гомосеквентные виды – D. yakuba, D. santomea. Ареалом обитания большинства видов является Африканский континент, кроме D. melanogaster и D. simulans, являющихся космополитами (распространены по всему миру).

У всех близкородственных видов подгруппы melanogaster в ядрах трофоцитов были обнаружены первичные политенные хромосомы, удобные для изучения видовых особенностей расположения хромосом в пространстве ядра (рис.2).

У видов подгруппы melanogaster была обнаружена сходная упорядоченность и ассоциация прицентромерных районов первичных политенных хромосом трофоцитов.

У D. melanogaster хромосомные плечи разобщены и связаны прицентромерными районами с оболочкой ядра (рис. 2). Хромосомные плечи D. simulans объединены «растянутым» (диффузным) хромоцентром. Хромосомы D. sechellia объединены в «кольцевой» (диффузный) хромоцентр. У D. mauritiana плечи хромосом 2 и 3 не имеют разобщения, и их прицентромерные районы содержат гетерохроматиновые блоки.

D. orena имеет локальный хромоцентр и этим отличается от других видов подгруппы. У D. erecta хромосомные плечи объединены диффузным хромоцентром. D. yakuba, D. santomea и D. teissieri имеют сходную ориентацию хромосом в ядре – плечи хромосом 2 и 3 не разобщены и объединены гетерохроматиновым блоком (рис. 2).

Рис. 2. Взаиморасположение хромосом в пространстве ядер трофоцитов у видов подгруппы melanogaster.

Таким образом, можно выделить четыре морфологических типа организации ядер трофоцитов: с локальным хромоцентром (D. orena), с диффузным хромоцентром (D. simulans, D. sechellia и D. erecta), с визуальным отсутствием хромоцентра (D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea и D. teissieri) и с хромосомами, связанными прицентромерными районами с оболочкой ядра (D. melanogaster) (рис. 2). Поскольку ряд видов имеют сходную организацию хромосом в ядре, нами были получены межвидовые гибриды с целью анализа более тонких видовых особенностей организации хромосом в пространстве ядра.

Организация хромосом в ядрах трофоцитов межвидовых гибридов

В комплексе «melanogaster» в F1 были получены межвидовые гибриды от следующих скрещиваний – D. mauritiana D. simulans; D. simulans D. melanogaster; D. simulans D. sechellia; D. mauritiana D. sechellia;

D. sechellia D. mauritiana. У всех межвидовых гибридов в ядрах трофоцитов яичников выявляются нарушения в спаривании гомеологов, и асинаптированными могут быть прицентромерные районы или же целиком хромосомные плечи (рис. 3). Такая дезинтеграция гомеологов возможно связана с тем, что в гибридной конфигурации сохраняются видоспецифичные позиции хромосомных плеч.

Рис. 3. Локализация гомеологичных хромосом в пространстве ядер трофоцитов у межвидовых гибридов подгруппы melanogaster. XL, 2R, 2L, 3R, 3L – плечи хромосом; на схемах обозначены различными цветами хромосомы определенных видов и их гомеологичные хромосомы у межвидовых гибридов F1.

У гибрида D. mauritiana D. simulans наблюдается объединение  прицентромерных участков гомеологов «simulans» с диффузным хромоцентром, характерным для данного вида; гомеологи «mauritiana» в центромерной части не образуют такого объединения. У гибрида D. simulans D. melanogaster  гомеологичные хромосомы полностью асинаптированы и рассредоточены в пространстве ядра (рис. 3).

У межвидовых гибридов D. simulans D. sechellia; D. mauritiana D. sechellia; D. sechellia D. mauritiana в ядрах трофоцитов также проявляются нарушения в спаривании гомеологов в прицентромерных районах, или полное асинаптирование хромосомных плеч (рис. 3). В ядрах гомосеквентных видов D. simulans и  D. sechellia визуально организация хромосом сходна (рис. 3, см. схему), однако в F1 от скрещивания между этими видами наглядно выявляется рассредоточение хромосом в пространстве ядра.

D. santomea является гомосеквентным видом по отношению к D. yakuba, и поэтому эти виды легко скрещиваются между собой в обоих направлениях. Ориентация и структура хромосом в ядрах трофоцитов яичников у D. yakuba и D. santomea визуально сходна. Тем не менее, у межвидовых гибридов D. yakuba D. santomea; D. santomea D. yakuba было выявлено нарушение в спаривании гомеологичных хромосом в прицентромерных районах или полное асинаптирование плеч гомеологов.

Подобные результаты были ранее получены у гомосеквентных видов малярийных комаров Anopheles maculipennis  и An. subalpinus; An. atroparvus и An. subalpinnus [Стегний, 1993]. Для гомосеквентных видов, таких как D. sechellia и D. simulans (комплекс  «melanogaster»), а также D. yakuba и D. santomea (комплекс «yakuba»), характерно сходство в ориентации хромосом в ядре, а их видовые особенности проявляются только у межвидовых гибридов. Эти данные могут также свидетельствовать о филогенетической близости этих видов. Следует отметить, что только с помощью гибридологического анализа проявляются отличия в ориентации хромосом в ядрах трофоцитов у видов подгруппы melanogaster. Таким образом, также как и у малярийных комаров [Стегний, 1979; 1987; 1991], у дрозофил нами была выявлена реорганизация ориентации хромосом в ядрах трофоцитов.

Закономерности межвидовых преобразований ориентации хромосом в ядрах трофоцитов и проблема филогенетических взаимоотношений в подгруппе melanogaster рода Drosophila (Sophophora)

На основании полученных нами результатов об ориентации хромосом в ядрах трофоцитов близкородственных видов подгруппы melanogaster, с учетом рассмотренных ниже филогенетических данных мы построили схему эволюционных преобразований взаимного расположения хромосом в ядрах трофоцитов в подгруппе melanogaster (рис. 4). D. orena дает начало двум филогенетическим комплексам – «yakuba» и «melanogaster», причем преобразование организации хромосом в ядрах этих линий отличается удивительным параллелизмом. Первый этап характеризуется превращением локального хромоцентра D. orena в диффузный, объединяющий плечи хромосом (D. erecta, D. simulans и D. sechellia). Затем эта картина преобразуется либо в независимо (без хромоцентра) расположенные отдельные хромосомы (D. yakuba, D. santomea, D. teissieri), либо в состояние фиксации хромосом на ядерной оболочке за счет прикрепления центромерных (иногда теломерных) участков хромосом к оболочке ядра (D. melanogaster).

Филогенетические отношения внутри подгруппы melanogaster интенсивно изучались при помощи различных методов: цитогенетических – анализ политенных хромосом [Lemeunier, Ashburner, 1976, 1984], биохимических – анализ электрофоретической подвижности белков [Eisses et al., 1979; Kalantzi-Makri et al., 1999], гистохимических особенностей слюнных желез [Thomopoulos et al., 2004], гибридологического анализа [Lee, Watanabe, 1987], морфологических – сравнения ультраструктуры оболочки яиц [Kalantzi-Makri et al., 1999] и секреторных гранул слюнных желез [Thomopoulos et al., 2004], а также молекулярных [Ashburner et al., 1984; Caccone et al., 1996; O`Grady et al., 2001; Ko et al., 2003]. Вместе с тем, до настоящего времени не ясны отношения между гомосеквентными видами simulans – sechellia – mauritiana. Противоречиво трактуются данные по инверсионным и молекулярным различиям отдельных видов. Основополагающие данные по филогении в подгруппе melanogaster были получены на основе сравнительного анализа политенных хромосом [Lemeunier, Ashburner, 1976]. Если в этой работе авторы совершенно верно, на наш взгляд, расположили вид D. melanogaster в терминальное положение, то в более поздней [Lemeunier, Ashburner, 1984] работе поставили этот вид в стволовое положение по отношению к гомосеквентному кластеру видов simulans – sechellia – mauritiana.

Рис. 4. Схема эволюционных преобразований ориентации хромосом в ядрах трофоцитов у девяти видов подгруппы melanogaster. Обозначены морфологические типы организации хромосом: голубым – хромоцентральная организация, красным – хромосомы с диффузным хромоцентром, синим – хромосомы с визуальным отсутствием хромоцентра, зеленым – хромосомы, контактирующие с оболочкой ядра.

Авторы [Lemeunier, Ashburner, 1976; 1984] считают, что видообразование на основе хромосомных инверсий осуществляется посредством перехода полиморфных инверсий в фиксированное состояние. Перепроверка данных по локализации полиморфной и фиксированной инверсий показала, что точки разрывов этих инверсий хотя и близки, но не совпадают на 2-3 диска. Эта ситуация аналогична ряду примеров, описанных у малярийных комаров [Стегний, 1976]. Данные, полученные на малярийных комарах, показали, что полиморфные инверсии не имеют отношения к видообразованию, а фиксированные инверсии, отличающие один вид от другого, никогда не были распространены в полиморфном состоянии более 2-3 поколений [Стегний, 1984]. На основании анализа десяти независимых показателей, установлено, что D. orena является филогенетически исходным видом не только для комплекса «yakuba», но и, очевидно, для всей подгруппы melanogaster [Доувер и др., 1986]. С открытием нового вида D. santomea было дополнено филогенетическое древо близкородственных видов подгруппы melanogaster. Молекулярные и кариотипические данные показали, что D. santomea является новым таксоном и близкородственным видом по отношению к D. yakuba. [Lachaise et al, 2000]. Такое же расположение видов в филогенетическом древе подтвердилось данными, полученными на основании фрагментов ОРС3, выделенных из «активного» варианта МДГ4 близкородственных видов подгруппы melanogaster [Саленко, 2007].

Известно, что количество гетерохроматина может определять хромосомную организацию в ядре. Можно предположить, что выявленная нами реорганизация ядра в процессе видообразования у видов подгруппы melanogaster непосредственно связана с изменением количества и перераспределением гетерохроматинового материала по геному. Чем больше гетерохроматина содержится в прицентромерных районах, тем вероятней наличие хромоцентральной организации хромосом в ядре. Так, например, у D. orena, в хромоцентре содержатся два гетерохроматиновых блока, которые образуют локальный хромоцентр. У D. erecta, D. simulans и D. sechellia таких больших блоков гетерохроматина прицентромерные районы хромосом не содержат, в результате чего образуется диффузный хромоцентр. У других видов подгруппы melanogaster не образуется хромоцентр, возможно, это связано с перераспределением прицентромерного гетерохроматина по плечам хромосом при видообразовании.

Локализация гетерохроматиновых районов в хромосомах трофоцитов яичников у видов подгруппы melanogaster

С целью изучения эволюционной динамики количества и распределения прицентромерного гетерохроматина у видов подгруппы melanogaster c помощью микродиссекции и DOP-PCR была получена смесь фрагментов ДНК (минибиблиотека) гетерохроматина хромоцентра из трофоцитов яичников D. orena. Затем с помощью FISH гибридизации на политенные хромосомы трофоцитов яичников девяти близкородственных видов подгруппы melanogaster (рис. 5) анализировали все стадии политенизации.

На стадии удлиненных первичных политенных хромосом сигнал ДНК пробы хромоцентра D. orena выявлялся в прицентроменых районах всех хромосом у видов комплекса «melanogaster» (D. melanogaster, D. simulans, D. sechellia, D. mauritiana) (рис. 5 а-г). Между видами были обнаружены только некоторые изменения по интенсивности свечения зонда ДНК-пробы хромоцентра D. orena, включенного в прицентромерные районы хромосом. У видов комплекса «yakuba» сигнал пробы, взятой из хромоцентра D. orena, также локализовался в прицентромерных районах всех хромосом (рис.5 д-и). Только D. erecta, помимо прицентромерного мечения на хромосомах, имеет локализацию метки в субтеломерном районе хромосомы 3 (рис.5 з). В тоже время, следует отметить, что виды комплекса «yakuba» отличаются от комплекса «melanogaster» по наличию наиболее сильного сигнала, локализованного в прицентромерных районах хромосом.

Рис. 5 FISH-гибридизация ДНК-пробы из хромоцентра D. orena на первичные политенные хромосомы трофоцитов видов комплекса «melanogaster»: D. melanogaster – (а), D. simulans – (б), D. sechellia – (в), D. mauritiana – (г) и комплекса «yakuba»: D. orena – (д), D. yakuba – (е), D. santomea – (ж), D. erecta – (з), D. teissieri – (и). Синий псевдоцвет – DAPI, красный псевдоцвет – библиотека ДНК из хромоцентра трофоцитов яичников D. orena; Ch – хромоцентр; с – прицентромерный район; зеленой стрелкой обозначена локализация пробы в прителомерном районе хромосомы 3 D. erecta; белой стрелкой показано отсутствие сигнала в хромосоме 2.

Можно предположить, что выявленная нами эволюционная реорганизация хромосом в ядрах трофоцитов у видов подгруппы melanogaster, может зависеть от количества гетерохроматина в прицентромерных районах хромосом и от его молекулярной структуры, в которую встроены МГЭ, имеющие свойство перемещаться по геному с захватом участков гетерохроматина.

Ориентация первичных политенных хромосом трофоцитов яичников у 12 видов группы virilis рода Drosophila (Sophophora)

В группе virilis в ядрах трофоцитов яичников анализировали первичные политенные хромосомы, имеющие определенную локализацию гетерохроматиновых блоков в прицентромерных, теломерных или интеркалярных районах, по которым можно идентифицировать хромосомы. Однако, у D. virilis все хромосомы – акроцентрики, в связи, с чем хромосомы сложно поддаются идентификации. Известно, что политенная хромосома 2 слюнных желез в теломерном районе содержит гетерохроматиновый блок и иногда наблюдается эктопическая связь этого района с теломерным районом хромосомы 3 [Губенко, 1983]. В первичных политенных хромосомах у одной из хромосом выявляется такой блок. Так, идентифицировали хромосому 2, остальные хромосомы идентифицировали по особенностям кариотипов (слияние первичных политенных хромосом теломерными районами хромосом 2-3 и Х-4) всех видов группы, хромосомы которые по структуре сопоставимы между собой.

Особенности ориентации первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников у видов группы virilis

Филада «virilis». Изучение ориентации хромосом в ядрах трофоцитов у видов филады «virilis» выявило, что для всех видов характерна хромоцентральная организация хромосомного аппарата, а для D. americana – диффузный хромоцентр (рис. 6). Видовые отличия заключаются только в особенности структуры хромоцентра – в наличии (D.virilis, D. texana) или отсутствии (D. lummei, D. novamexicana) гетерохроматинового блока в центре хромоцентра.

Для всех видов филады «virilis» характерна следующая ассоциация между хромосомами: хромосомы 2 и 3 располагаются рядом друг с другом, а также пара хромосом Х и 4 расположены рядом, хромосома 5 обособлена от всех хромосом, но чаще ассоциируется с парой хромосом 2 и 3. Таким образом, наблюдается следующая упорядоченность хромосом: 2-3; 5; Х-4. В результате наших исследований можно отметить сходство между видами филады «virilis» не только по упорядоченности хромосом, но и по хромоцентральной организации хромосомного аппарата. Поиск наиболее тонких отличий между видами возможен методом получения межвидовых гибридов.

Анализ межвидовых гибридов в F1 от скрещиваний по схемам D. virilis D. lummei, D. virilis D. texana и D. texana D. americana показал, что спаривание гомеологичных хромосом нарушается и несконъюгированными могут быть центромерные районы или же целиком хромосомные плечи. Причем, уровень нарушений спаривания хромосом коррелирует со степенью филогенетической близости скрещиваемых видов. Так, у гибридов F1 от скрещивания D. virilis и D. texana, эволюционно более отдаленных видов, выявлено отсутствие конъюгации гомеологов, а гибриды между F1 филогенетически близкими видами – D. virilis и D. lummei, D. texana и D. americana – имеют частичную конъюгацию гомеологов и разобщенность только прицентромерных областей хромосом, что, видимо, отражает проявление межвидовых различий в прикреплении хромосом к ядерной оболочке.

Рис. 6. Схема эволюционных преобразований ориентации хромосом в ядрах трофоцитов у видов группы virilis.

Таким образом, для всех видов филады «virilis» характерна хромоцентральная организация хромосом в ядре и сходная ассоциация между хромосомами, в то же время, с помощью анализа межвидовых гибридов были обнаружены видоспецифичные особенности локализации хромосом в ядре и их связь с оболочкой ядра.

Филада «montana». В филаде «montana» диффузный хромоцентр характерен для D. kanekoi (диффузный хромоцентр содержит гетерохроматиновый блок), D. flavomontana (диффузный хромоцентр не содержит гетерохроматинового блока) (рис. 6). Для остальных видов филады (D. littoralis, D. ezoana, D. borealis, D. lacicola, D. montana) характерно визуальное отсутствие хромоцентра, рассредоточенность хромосом по периферии ядра, и контактирование некоторых хромосом прицентромерными районами с оболочкой ядра. У видов филады «montana» и подфилад «littoralis», «kanekoi» выявляются более специфичные признаки в организации хромосом в ядрах трофоцитов по сравнению с филадой «virilis». Тем не менее, как и в филаде «virilis» выявлена аналогичная упорядоченность хромосом по отношению друг к другу – 2-3; 5; Х-4. В целом можно отметить, что для филады «montana» и подфилад «littoralis», «kanekoi» характерна большая динамичность архитектоники хромосом в ядре, чем для филады «virilis».

На основании комплексных данных по филогении группы virilis [Throckmorton, 1982; Spicer, Bell, 2002], с учетом наших данных по архитектонике хромосом было установлено, что для филогенетически исходного вида D. virilis характерно наличие локального хромоцентра с ярко выраженным блоком гетерохроматина (что сходно с D. orena) (рис. 6), а для D. kanekoi – диффузный хромоцентр. Остальные виды частично (в филаде «virilis») или полностью (в филаде «montana») визуально теряют хромоцентральную организацию, хромосомы рассредоточены в пространстве ядра и имеют связь с оболочкой ядра. Отсюда следует, что при видообразовательном процессе у видов группы virilis происходила сходная ситуация, что и в подгруппе видов melanogaster (рис. 7). Здесь также как и у видов подгруппы melanogaster выявляются четыре типа организации хромосом в ядрах трофоцитов – с хромоцентральной организацией хромосом; с хромосомами, объединенными диффузным хромоцентром; с хромосомами, рассредоточенными в пространстве ядра; и с хромосомами, прикрепленными прицентромерными районами к оболочке ядра (рис. 6, 7).

 

Рис. 7. Общая схема эволюционных преобразований организации хромосом в ядрах трофоцитов у видов подгруппы melanogaster и группы virilis.

Эволюционные преобразования архитектоники хромосом в ядре у исходных видов также шли от локального к диффузному хромоцентру, к его частичному, а затем и к полному визуальному исчезновению, при этом хромосомы рассредоточены в ядре и некоторые из них контактируют с оболочкой ядра у производных видов (рис. 6).

Таким образом, выявленная ранее на малярийных комарах реорганизация архитектоники ядер генеративной системы клеток, происходящая в процессе сальтационного видообразования (системная мутация) [Стегний, 1979; 1993], характерна как для видов подгруппы melanogaster, так и для группы virilis. Полученные данные позволяют считать, что реорганизация архитектоники хромосом в ядрах трофоцитов, является одним из ключевых механизмов в видообразовательных процессах.

Организация пахитенных хромосом в ядрах ооцитов и сперматоцитов у малярийных комаров

Малярийные комары, как и все Diptera имеют нутриментарный тип оогенеза, при котором ооцит и трофоциты яичников развиваются из одной стволовой клетки и являются сестринскими. В связи с этим мы предположили, что ориентация хромосом на стадии пахитены ооцита может быть сходной с ориентацией хромосом в ядрах трофоцитов.

В ядрах ооцитов пахитенные хромосомы имеют хромомерную структуру (рис. 8). Было обнаружено, что хромосомы ооцита, как и ранее изученные хромосомы трофоцитов, не имеют хромоцентральной организации (рис. 8 а). Таким образом, подтвердилось ранее высказанное мнение [Стегний, 1987] о сходстве организации ядер ооцита и трофоцитов. Анализ ооцитов межвидовых гибридов (An. maculipennis An. subalpinus) выявил значительно большее количество хромосомных тяжей и их меньшую толщину по сравнению с «негибридными» хромосомами ооцита (рис. 8 в, г). По-видимому, у гибридов F1 отсутствует конъюгация гомеологичных хромосом в пространстве ядра. Ранее при изучении ядер трофоцитов гибридных самок (от скрещивания этих же и других видов) было обнаружено, что гомеологи политенных хромосом не конъюгируют и разобщены, особенно по участкам прикрепления к ядерной оболочке [Стегний, 1987].

Рис. 8. Ориентация пахитенных хромосом в ядрах ооцитов – (а, в, г) и сперматоцита (б) малярийных комаров: Anopheles messeae – (a, б); межвидовые гибриды F1 (An. maculipennis An. subalpinus) – (в, г); стрелкой показан кольцевой хромоцентр; XR – правое плечо Х-хромосомы

При проведении настоящего исследования организация хромосом в генеративной системе клеток самцов оценивалась в основном на стадии сперматоцитов в профазе мейоза. Было обнаружено, что у малярийных комаров хромосомы сперматоцитов имеют хромоцентр, объединяющий центромерные районы всех хромосом (рис. 8 б). Эта картина подтверждает ранее полученные данные по An. atroparvus [Diaz, Lewis, 1975].

Особенности структуры и ориентации политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников у Calliphora erythrocephala

Морфотипы ядер трофоцитов С. erythrocephala. Нами были проанализированы политенные хромосомы трофоцитов яичников С. erythrocephala на различных стадиях политенизации хромосом с целью выявления оптимальной стадии развития, на которой можно идентифицировать хромосомы. Для улучшения структуры хромосом мух содержали при пониженной температуре 13 °С. Были выявлены следующие морфотипы ядер трофоцитов: мелкие ядра с сетчатой ретикулярной структурой хроматина (1-2-х дневные мухи); ядра с хроматином, содержащим гетерохроматиновые блоки (2-3-х дневные мухи); стадия формирования удлиненных первичных политенных хромосом (4-х дневные мухи). У пятидневных мух наблюдались ядра не только с первичными политенными хромосомами, но и ядра с компактными помпонообразными хромосомами. На более поздней стадии развития мух хромосомы дезинтегрируются на хромосомные элементы, подобные метафазным хромосомам, которые затем декомпактизуются в хроматиновые нити с хромомерами. В результате образуются высоко полиплоидные ядра с ретикулярной структурой, которые были названы ядрами с вторичной ретикулярной структурой.

Нами были проанализированы политенные хромосомы трофоцитов яичников самок C. erythrocephala разного возраста, содержащихся при температурах 13 °С и 25 °С. Было установлено, что при сохранении общей тенденции в динамике морфологии политенных хромосом у мух, содержащихся при температуре 25 °С, уже на 4-й день после выхода имаго из пупария в фолликулах были обнаружены только крупные вторичные ретикулярные ядра. В то время как, при содержании при 13 °С развитие яичников было замедленным, и эта стадия наблюдалась на 8-9-й день. Следовательно, для получения препаратов, имеющих первичные политенные хромосомы, можно использовать 4-х дневного возраста имаго, содержащихся при 13 °С, а 2-х дневного возраста – при 25 °С.

Идентификация первичных политенных хромосом трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala. Идентификация по структуре первичных политенных хромосом трофоцитов яичников С. erythrocephala нами проводилась методом сопоставления со вторичными политенными хромосомами (иллюстрация вторичных политенных хромосом была взята из работы Рибберта [Ribbert, 1979] (рис. 9 б)). По данным Рибберта, у всех хромосом левое плечо длиннее правого, и в пуфовых районах локализованы центромеры (рис. 9 б). Эти районы у первичных политенных хромосом не пуфируют и представлены в виде перетяжек, рядом с которыми локализованы гетерохроматические блоки (рис. 9 а). Нами было выявлено сходство маркирующих районов у первичных и вторичных политенных хромосом всего кариотипа.

Ориентация первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников C. erythrocephala. Была изучена ориентация первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников С. erythrocephala и выявлено отсутствие локального хромоцентра. Хромосомы рассредоточены в пространстве ядра и имеют упорядоченное расположение в ядре по отношению друг к другу (рис. 9 в-г). Так, точечная хромосома 6 близко располагается с хромосомой 2 (рис. 9 б, г); хромосома 4 локализована рядом с хромосомой 3 и 5, а 5 – с хромосомой 1.

Рис. 9. Идентификация первичных политенных хромосом – (а) методом их сравнения со вторичными политенными хромосомами трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala – (б) [Ribbert, 1979] и ориентация первичных политенных хромосом трофоцитов яичников С. erythrocephala – (в-е). Стрелками и красными цифрами указаны сходные гетерохроматиновые блоки первичных и вторичных политенных хромосом; черными цифрами обозначены хромосомы; с – центромерные районы. На рисунках – (в-е) - стрелками обозначены районы контактирования хромосом с оболочкой ядра.

Таким образом, можно обнаружить следующее ассоциированное расположение хромосом: 6-2, 4-3, 5-1 (рис. 9 в-е). Прикрепление хромосом к оболочке ядра визуально сложно было обнаружить, иногда просматриваются тонкие тяжи, отходящие от хромосом к оболочке ядра. Следует отметить, что у C. erythrocephala, также как у Anopheles, выявляется тканевая специфичность взаимного расположения хромосом в ядрах трофоцитов яичников, так как в ядрах трихогенных клеток (соматическая система клеток) политенные хромосомы прицентромерными районами объединены в общий хромоцентр [Bier, 1958].

Динамика гетерохроматиновых районов хромосом и функционирование ядрышка в ядрах трофоцитов яичников на протяжении политенизации у видов подгруппы melanogaster, Anopheles и Calliphora erythrocephala

Drosophila. У всех видов подгруппы melanogaster (D. melanogaster, D. simulans, D. sechellia, D. mauritiana, D. orena, D. erecta, D. teissieri, D. yakuba, D. santomea) проводили сравнительный анализ позиционирования хромосом в ядрах трофоцитов с S1 по S7 стадии эндоциклов. У самок возраста от 0,5- до 3-х суточных были обнаружены все стадии эндомитоза, характерные для Diptera. У всех видов подгруппы на определенной стадии политенизации (с S3 по S4) первичных политенных хромосом выявляется динамика разобщения плеч хромосом за счет декомпактизации прицентромерных гетерохроматиновых районов. У D. orena, отличающейся от других изученных видов хромоцентральной организацией, также проявляется некоторая разобщенность плеч. Так, на ранних стадиях плечи хромосом прицентромерными районами близко связаны с хромоцентром. На более поздних стадиях проявляется декомпактизация прицентромерных районов хромосом, и поэтому плечи хромосом связаны с хромоцентром тонкими фибриллярными тяжами. При этом сохраняется близость ассоциаций между прицентромерными районами хромосом 3 и Х. Можно предположить, что выявленные нами стадии декомпактизации прицентромерных гетерохроматиновых блоков, связаны с образованием ядрышкового материла, необходимого для формирования ооцита.

Известно, что у видов подгруппы melanogaster ядрышкообразующими хромосомами являются половые Х и Y хромосомы, кроме видов D. simulans и D. sechellia, которые утратили ядрышковый организатор на Y хромосоме, вместо которого присутствуют только межгенные спейсеры повторов рДНК [Roy et al., 2005]. Для выявления ядрышка в ядрах трофоцитов яичников у близкородственных видов подгруппы melanogaster использовали метод Ag-окрашивания. На ранних стадиях политенизации выявляется ассоциация между прицентромерными районами хромосомы 3 с Х-хромосомой и между ними образуется ядрышко (рис. 10 а-г). Затем, с ростом ядрышка, плечи хромосомы 2 также разобщаются, и прицентромерные районы контактируют с ядрышком (рис. 10 д). На более поздних стадиях политенизации (компактные хромосомы), в большинстве ядер контактирование с ядрышковым материалом и разобщенность плеч хромосом сохраняется (рис. 10 е), в то время как в некоторых ядрах с компактизацией прицентромерных гетерохроматиновых блоков плечи хромосом вновь объединяются (рис. 10 ж).

Обобщая полученный экспериментальный материал по всем изученным видам подгруппы melanogaster, следует отметить, что «динамичность плеч» хромосом в течение политенизации связана с декомпактизацией прицентромерного гетерохроматина и образованием ядрышкового материала в ядрах трофоцитов яичников. В тоже время, ориентация хромосом по отношению друг другу и области локализации их центромер на оболочке ядра не изменяется, в связи с чем сохраняется специфичность ориентации хромосом в ядрах на всех стадиях эндоциклов, особенно на стадии S4. Можно предположить, что на протяжении всего процесса политенизации у всех близкородственных видов подгруппы melanogaster наблюдаемая ассоциация прицентромерных районов хромосом 3 и Х в ядрах трофоцитов яичников связана с образованием двух ядрышек, которые затем сливаются в одно большое ядрышко. Контактирование прицентромерных районов хромосом с ядрышком связывают с содержанием фрагментов ЯО [Прокофьева-Бельговская, 1986] или с наличием в районах интеркалярного гетерохроматина «гнезд» полигенов (в том числе и генов рРНК) [Михайлова и др., 1982]. При активации последовательностей рДНК, локализованных в прицентромерном гетерохроматине, возможно, происходит декомпактизация гетерохроматина, разобщенность плеч хромосом и гетерохроматиновые блоки, содержащие рДНК последовательности [Zurita et al, 1999], непосредственно принимают участие в образовании ядрышка в ядрах трофоцитов у видов подгруппы melanogaster.

Рис. 10. Общая схема образования ядрышка в ядрах на протяжении политенизации хромосом трофоцитов у видов подгруппы melanogaster – (а-ж).

Anopheles. После питания кровью у самок комаров в ядрах трофоцитов развиваются хорошо структурированные политенные хромосомы, и этим комары отличаются от большинства двукрылых насекомых, в том числе и дрозофил. В то же время, у 1,5 – 2-х суточных самок, после вылупления из куколок (не питающихся кровью) на ранних стадиях развития яичников в ядрах трофоцитов можно выявить политенные хромосомы, по своей морфологии и структуре сходные с первичными политенными хромосомами трофоцитов дрозофил. Также как и у дрозофил, у малярийных комаров в ядрах трофоцитов на стадии первичных политенных хромосом выявляется динамика разобщения плеч хромосом, связанная с декомпактизацией прицентромерных гетерохроматиновых блоков. Возможно, что у комаров разобщенность плеч хромосом также связана с образованием ядрышка. С помощью Ag-окрашивания у An. messeae и An. atroparvus ядрышко выявляется на ранних стадиях развития «первичных» политенных хромосом. XL-хромосома непосредственно связана с ядрышком, и плечи хромосом 2 и 3 не разобщены, в то же время хромосома 3 прицентромерным районом контактирует с оболочкой ядра. С ростом ядрышка и политенизацией хромосом, как у «первичных», так и у «вторичных» политенных хромосом прицентромерный гетерохроматин декомпактизуется и плечи хромосомы 3 разобщаются, при этом 3L плечо  контактирует интеркалярными районами с ядрышком, а прицентромерным районом связано с оболочкой ядра. Плечи хромосомы 2 у An. messeae не разобщаются, и центромерный район контактирует с ядрышком, а у An. atroparvus хромосома 2 имеет незначительное разобщение между плечами за счет образования небольшого второго ядрышка. Таким образом, у малярийных комаров, также как и у дрозофил (рис. 10), с ростом политенизации хромосом в ядрах трофоцитов выявляется разобщенность плеч хромосом, связанная с образованием ядрышка. При этом прицентромерные районы хромосом контактируют с ядрышком, сохраняют связь с оболочкой ядра и пространственную локализацию хромосом в ядре.

Calliphora. Анализ всех стадий политенизации ядер трофоцитов Calliphora erythrocephala выявил постепенную конденсацию первичных политенных хромосом, дезинтегрирующихся затем на хромосомные элементы, с их последующей декомпактизацией и переходом в ретикулярное состояние. Морфотипы ядер, характерные для определенных стадий политенизации, отражают функциональное состояние хроматина. Вероятно, декомпактизация хроматина связана с повышением его общей транскрипционной активностью [Ribbert, 1979]. Интересным является то, что у Calliphora на протяжении всех циклов политенизации плечи хромосом не разобщаются, как это наблюдается у дрозофил и малярийных комаров.

Первичные политенные хромосомы ядер трофоцитов C. erythrocephala имеют ряд ярко окрашенных блоков. Это связано с компактизацией хроматина, а также с наличием гетерохроматиновых блоков (рис. 11). Дифференциальная окраска (G-, R-, С-окраска, DAPI-бэндинг) выявила практически все интенсивно окрашиваемые блоки в хромосомах, наблюдаемые при лактоацетоорсеиновом окрашивании (рис. 11 г). Сравнительный анализ первичных политенных хромосом при различных типах дифференциальной окраски (G-; R-; С- banding) (рис. 11 а-в), показал сходство рисунков хромосом по некоторым С-, G- и DAPI сегментам (рис. 11 л). Отличие в окрасках заключалось только в том, что при R-дифференциальном (рис. 11 б) окрашивании линейные размеры позитивно окрашиваемых блоков визуально больше, чем размеры этих же сегментов при G-дифференциальном окрашивании (рис. 11 а). Эти данные показали наличие постоянных плотно компактизованных блоков хроматина, характерных для структуры первичных политенных хромосом некоторых представителей Diptera. Интенсивно окрашиваемые районы хромосом наблюдали не только в первичных политенных хромосомах (рис. 11 д, е), но и на остальных стадиях политенизации (рис. 11 ж-к). В ходе эндомитотических циклов происходило заметное укорочение политенных хромосом (рис. 11 ж, з), сопровождающееся уменьшением числа ярко окрашенных сегментов хромосом и увеличением их линейных размеров. На стадии дезинтеграции хроматид хромосома 6 не распадается, остается компактной и хорошо видна в ядрах на всех стадиях политенизации и компактизации (рис. 11 и). На стадии ретикулярного ядра наблюдается ярко окрашиваемый блок, характерный для хромосомы 6 (рис. 11 к). Для проведения анализа пространственной организации хромосомы 6 в ретикулярных ядрах была получена ее ДНК-библиотека. FISH хромосомоспецифичной ДНК-пробы хромосомы 6 с политенными хромосомами окрасила эухроматиновые районы хромосомы 6 (рис. 11 л), при этом сигнал не выявлялся в районе прицентромерного гетерохроматина, что может быть объяснено плотной упаковкой ДНК этого района и, как следствие, ее недоступностью для меченых фрагментов гомологичной ДНК при проведении FISH. В ядрах с ретикулярной структурой ДНК проба окрашивала практически всю хромосому 6 (рис. 11 м). Полученные данные подтверждают, что хромосома 6 действительно имеет определенное место локализации в ядрах с ретикулярной структурой. Аналогичные данные были получены на D. melanogaster, в ядрах трофоцитов с ретикулярной структурой, где постоянно выявляемый блок гетерохроматина принадлежит хромосоме 4 [Dej, Spradling, 1999].

Рис. 11. Дифференциальное окрашивание первичных политенных хромосом трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala (G-окрашивание – (а); R-окрашивание – (б); С-окрашивание – (в); лактоацетоорсеиновое окрашивание – (г); DAPI-окрашивание и FISH-гибридизация (первичные политенные хромосомы – (л), стадия ретикулярного ядра – (м)) и стадии компактизации хромосом: удлиненные первичные политенные хромосомы – (д); первичные политенные хромосомы – (е); конденсированные хромосомы – (ж); высококонденсированные хромосомы – (з); дезинтеграция высококонденсированных хромосом - (и); ядро с ретикулярной структурой – (к). Стрелками обозначены районы дифференциального окрашивания. Цифрами (1, 2, 3, 4, 5, 6) обозначены хромосомы. С – центромеры.

Хромосома 6 C. erythrocephala имеет ярко окрашиваемый блок гетерохроматина и является ядрышкообразующей хромосомой [Ribbert, 1979]. Методом Ag-окрашивания была изучена активность ядрышка на протяжении всей политенизации в ядрах трофоцитов. На стадии удлиненных хромосом формируется крупное ядрышко. В ядрах с компактными первичными политенными хромосомами ядрышко дезинтегрируется на микроядрышки. С увеличением уровня компактизации хромосом микроядрышки распределяются по всему ядру, затем их количество уменьшается (стадия высоко конденсированных хромосом) до практически полного исчезновения в ядрах с дезинтегрирующимися хромосомами. Возможно, это связано с тем, что на стадии дезинтеграции хромосом функционирование ядрышка прекращается. В ядрах с ретикулярной структурой вновь выявляются гранулы ядрышкового материала, особенно ярко прокрашивается область хромосомы 6. Полученные данные показывают, что в течение эндомитотических циклов изменяется активность ЯОР, которая связана с конденсацией хромосом. Подобная зависимость интенсивности функционирования ядрышка от конденсации хроматина была ранее обнаружена в ядрах трофобластов у крысы и мыши [Зыбина, 1986], имеющих полиплоидизированные ядра. Вероятно, что выявленная нами специфика функционирования ядрышка в полиплоидизированных ядрах трофоцитов у дрозофил, малярийных комаров и синей мясной мухи имеет общебиологическое значение.

Изменение структуры хромосом трофоцитов яичников Drosophila melanogaster при инбридинге и гибридном дисгенезе

Пространственная ориентация политенных хромосом в ядрах трофоцитов у Anopheles [Стегний, 1979; 1986; 1993] имеет видовую специфику. Наиболее наглядно видоспецифичность взаимного расположения хромосом в ядрах трофоцитов яичников проявляется у межвидовых гибридов, у которых гомеологи асинаптированы в прицентромерных районах или полностью нарушено их спаривание. Это связано с тем, что гомеологи «сохраняют» свою видоспецифичную позицию в пространстве ядра и характерное для каждого вида прикрепление хромосом к оболочке ядра.

С целью выявления возможных механизмов внешнего воздействия на модификации структуры взаиморасположения хромосом трофоцитов яичников были изучены такие факторы как пониженная температура и продолжительный инбридинг. Нами изучалось влияние низкой температуры на архитектуру хромосом в ядрах трофоцитов яичников лабораторных линий D. melanogaster давно изолированных друг от друга инбредных линий 30-го поколения и линий НА и ВА с продолжительным инбредным размножением. В линии D. melanogaster Oregon R был проведен тесный братско-сестринский инбридинг до 30-го поколения. Сравнительный анализ ядер трофоцитов Oregon R и инбредной (F30) линий, выращенных при 24 С и 16 С, выявил ориентацию хромосом в ядре, характерную для D. melanogaster. По сравнению с лабораторной линией Oregon R, у инбредной линии (F30), культивируемой при 24 С, и у исходной Oregon R, выращенной при 16 С, проявляется возрастание количества асинапсисов прицентромерных районов хромосом (рис. 12). При воздействии двух факторов – инбридинга и температуры – было обнаружено, что температура оказывает гораздо более сильное воздействие на синапсис гомологов, чем инбридинг F30 поколения (рис. 12, 13).

С целью выявления возможных изменений в ориентации хромосом в ядре при инбридинге и воздействии низкой температурой, нами были поставлены прямое и обратное скрещивания между инбредной F30 и исходной F0 линиями Oregon R (при температурах 16 С и 24 С). В результате было установлено, что только пониженная температура (16 С) является экстремальным фактором, оказывающим влияние на синаптирование хромосом.

Рис. 12. Влияние температурных режимов на характер синаптирования гомологичных хромосом в ядрах трофоцитов яичников линий Drosophila melanogster и их межлинейных гибридов

Примечание: * - достоверное отличие на уровне значимости р < 0,05, ** - на уровне значимости р < 0,01по сравнению с соответствующим значением при 24°С.

В связи с тем, что инбридинг F30 - поколения не оказывает значимого влияния на изменение организации хромосом в ядре, изучалось влияние продолжительного инбридинга на синаптирование хромосом в ядрах трофоцитов. Анализ ядер трофоцитов высокоинбредных линий (ВА и НА F928 поколения) D. melanogaster обнаружил организацию хромосом в ядрах трофоцитов, характерную для D. melanogaster, при этом не выявляется асинаптирование гомологов (рис. 13). При скрещиваниях высокоинбредных линий ВА НА и НА ВА (дисгенные скрещивания Н-Е (hobo) в системе гибридного дисгенеза [Кулигина и др., 1999]) практически во всех ядрах (90 ± 0,3% ядер) межлинейных гибридов проявлялось нарушение в спаривании гомологичных хромосом. Такая же картина была обнаружена и у межлинейных гибридов (НА Canton'S; Canton'S НА) (было выявлено 95 ± 0,2% ядер с асинаптированными гомологами). Для сравнения и выявления изменений в архитектуре ядер трофоцитов, происходящих у инбредных и высокоинбредных линий мух, проводили скрещивания с мухами, взятыми из природной популяции (г. Сочи). У гибридов от этих скрещиваний также выявлялись нарушения в спаривании гомологичных хромосом. Частота встречваемости таких ядер у межлинейных гибридов значительно выше  при скрещивании с высокоинбредными линиями (было обнаружено 93,0 ± 0,4 % ядер с нарушением спаривания хромосом), чем с инбредными мухами 30 поколения линии Oregon R (выявлено 25,0 ± 0,5 % ядер с асинаптированными хромосомами). Полученные результаты свидетельствуют о том, что низкая температура и продолжительный инбридинг являются достаточно значимыми факторами, оказывающими влияние на ориентацию хромосом в пространстве ядер трофоцитов.

Нами рассматривались P-M и I-R системы гибридного дисгенеза. В большинстве ядер трофоцитов гибридных мух, полученных от дисгенных скрещиваний, выявлялось асинаптирование гомологичных хромосом в прицентромерных районах или полное отсутствие конъюгации гомологичных плеч. Такие же результаты получены и при межлинейных скрещиваниях: Berlin Canton S; Canton S Berlin; Berlin Oregon; Canton S Oregon. Следовательно, линии D. melanogaster визуально сходные по архитектонике хромосом в ядрах трофоцитов, при скрещивании между собой проявляют некоторые различия в пространственной организации хромосом в ядре.

Рис. 13. Схема изменения хромосом в пространстве ядер трофоцитов при воздействии низкой температуры и продолжительного инбридинга. Зеленым и красным цветом обозначены хромосомы и их гомологи линий D. melanogaster, синим и красными цветами обозначены места локализаций прикреплений хромосом на оболочке ядра.

Известно, что при скрещиваниях межлинейных и дисгенных линий D. melanogaster происходит перемещение МГЭ [Biemont et al., 1990; Bucheton et al., 1992; Carmena, Gonzales, 1995; Гришаева, Иващенко, 1997; Евгеньев и др., 1998], можно предположить, что в связи с этим возникает несовместимость родительских геномов и асинаптирование гомологов, что соответствует гипотезе Сведа [Sved, 1976]. Таким образом, к факторам, приводящим к изменению организации хромосом в ядрах трофоцитов яичников у Drosophila, можно отнести низкую температуру и продолжительный инбридинг.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В филогенезе у дрозофил подгруппы melanogaster и группы virilis проявилась общая тенденция эволюционной реорганизации хромосом в пространстве ядер трофоцитов. По критерию «взаиморасположение хромосом в пространстве ядра» с учетом литературных данных нами были построены схемы эволюционных преобразований организации ядер трофоцитов у видов группы virilis и подгруппы melanogaster. Особенно, спорным вопросом, по литературным данным, являлись филогенетические отношения между гомосеквентными видами D. simulans, D. sechellia и D. mauritiana, для которых характерна идентичная линейная структура политенных хромосом. По нашим данным (взаиморасположение хромосом в ядрах трофоцитов) стволовым видом для комплекса «melanogaster» наиболее вероятно, является D. simulans, от которого независимо друг от друга возникли D. melanogaster и D. sechellia, а от последнего – D. mauritiana. Также можно постулировать, что в комплексе «yakuba» направление эволюции видов и их геномов в генеративной ткани шло от D. оrеnа к D. erecta, D. teissieri к D. yakuba и D. santomea. В группе virilis нами были учтены те же параметры, что и в подгруппе melanogaster, и стволовым видом в филаде «virilis» является – D. virilis, а в филаде «montana» – D. kanekoi.

Анализ полученных нами схем эволюционных преобразований взаиморасположения хромосом в ядрах трофоцитов двух групп дрозофил выявил сходные морфологические типы ядер и их изменения при видообразовании. Выявленные морфологические типы организации ядер трофоцитов у видов дрозофил отображают эволюционные этапы преобразования хромосом в ядрах трофоцитов при видообразовании. При этом происходили изменения в количестве и локализации гетерохроматина в хромосомах, что оказало влияние на архитектонику ядра. D. orena в подгруппе melanogaster и D. virilis, а также D. kanekoi в группе virilis являются стволовыми (исходными) видами в филогенетическом древе по отношению к видам своей подгруппы и группы. Для этих древних видов свойственно большое содержание гетерохроматина в хромосомах, вероятно, поэтому в ядрах трофоцитов выявляется локальный хромоцентр с ярким гетерохроматиновым блоком. При видообразовании происходило перераспределение хромоцентрального гетерохроматина по плечам хромосом, что было выявлено нами с помощью FISH гибридизации ДНК последовательностей хромоцентра D. orena на хромосомы трофоцитов у видов подгруппы melanogaster. Уменьшение количества гетерохроматина или перераспределение его по плечам хромосом, в прицентромерных районах приводило к изменению структуры хромоцентра: к образованию диффузного хромоцентра, а затем к его визуальному исчезновению, при этом хромосомы рассредоточиваются в пространстве ядра, либо хромосомы за счет прицентромерного -гетерохроматина контактируют с оболочкой ядра и имеют видоспецифичное место прикрепления на оболочке ядра.

Ранее феномен реорганизации хромосом в пространстве ядер трофоцитов в ходе филогенеза был открыт у семи видов малярийных комаров и отнесен в ранг системных мутаций [Стегний, 1979; 1986, 1993]. Полученные данные позволяют предположить, что выявленное сходство в параметрах видоспецифичности и в реорганизации хромосом в пространстве ядер генеративной системы клеток при видообразовании у малярийных комаров и дрозофил, возможно, широко распространено среди двукрылых насекомых и может иметь общебиологическую значимость.

Интересен вопрос, какие факторы окружающей среды могли привести к таким изменениям организации хромосом в ядре и к образованию близкородственных видов? Из двух основных факторов экологической периферии, которые могли оказать влияние на архитектонику ядра, являются низкая температура и продолжительный инбридинг. Эксперимент, проведенный нами с линиями D. melanogaster, выявил, что низкая температура и продолжительный инбридинг оказывают влияние на организацию хромосом в ядрах генеративной системы клеток. Таким образом, полученные данные можно свести в следующую гипотетическую схему (рис. 14).

Рис. 14. Схема возможного механизма реорганизации ядер генеративной системы клеток при сальтационном видообразовании. Стрелки (в ядрах) показывают перераспределение гетерохроматина.

Из схемы следует, что при воздействии двух из основных экстремальных факторов экологической периферии – низкой температуры и инбридинга на геном генеративных клеток дрозофил видов группы virilis и подгруппы melanogaster, происходило изменение в молекулярной структуре гетерохроматина, что могло привести к изменению в пространственной организации хромосом в ядре с образованием четырех морфологических типов ядра: с локальным хромоцентром, с диффузным хромоцентром, с визуальным отсутствием хромоцентра и с хромосомами, имеющими прикрепление к оболочке ядра.

ВЫВОДЫ

В результате работы установлено:

  1. Взаиморасположение хромосом в ядрах трофоцитов яичников у изученных видов дрозофил подгруппы melanogaster и группы virilis упорядочено, и ряд видов отличаются по организации хромосом ядер соматических тканей визуальным отсутствием локального хромоцентра. У видов подгруппы melanogaster хромосомы ассоциированы следующим образом: Х-хромосома с хромосомой 3, хромосома 2 обособлена от них, у видов группы D. virilis: 2-3; 5; Х-4, Calliphora erythrocephala: 6-2, 4-3, 5-1. Ассоциация прицентромерных районов хромосом у всех видов подгруппы melanogaster и у видов группы virilis не изменяется от вида к виду.
  2. У видов подгруппы melanogaster и группы virilis рода Drosophila выявлены четыре типа организации ядра: 1) с локальным хромоцентром; 2) с диффузным хромоцентром; 3) с отсутствием визуального хромоцентра; 4) с прикреплениями хромосом к ядерной оболочке.
  3. Эволюционные преобразования в организации ядер трофоцитов у близкородственных видов в подгруппе melanogaster и в группе  virilis происходили по следующей схеме: от локального хромоцентра к диффузному хромоцентру, а затем к полному его визуальному исчезновению и к прикреплению хромосом прицентромерными районами к оболочке ядра.
  4. Выявленные последовательности ДНК хромоцентра D. orena у других близкородственных видов подгруппы melanogaster локализованы в прицентромерных и интеркалярных районах хромосом, что свидетельствует о возможном перераспределении последовательностей ДНК хромоцентра D. orena при видообразовательных событиях.
  5. Низкая температура и продолжительный инбридинг оказывают влияние на синаптирование гомологичных хромосом в ядре и локализацию прикреплений прицентромерных районов хромосом к оболочке ядра трофоцитов у D. melanogaster. Возможно, что эти факторы могли привести к реорганизации хромосом в ядрах трофоцитов при видообразовании.
  6. В ядрах трофоцитов у Drosophila и у малярийных комаров Anopheles messeae и An. atroparvus на определенной стадии политенизации в прицентромерных районах хромосом происходит разобщение плеч, связанное с декомпактизацией гетерохроматиновых блоков прицентромерных районов и образованием ядрышка. У C. erythrocephala при политенизации плечи хромосом не разобщаются, и ядрышко дезинтегрирует на микроядрышки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

       

Список статей:

  1. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Особенности взаимного расположения политенных хромосом в генеративной ткани у Drosophila melanogaster // Генетика. 1991. Т.27. №7. с.1163-1168.
  2. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Межвидовые отличия коориентации первично политенных хромосом трофоцитов у Drosophila melanogaster, D.simulans и D.mauritiana // Генетика. 1991. Т.27. №7. С. 1169-1173.
  3. Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Видоспецифичные особенности архитектоники первично политенных хромосом трофоцитов  у Drosophila orena, D.erecta, D.teissieri, D.yakuba // Генетика. 1992. №3. С.198-201.
  4. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Видовая архитектоника хромосом генеративной  ткани и проблемы филогенетических отношений в подгруппе melanogaster рода  Drosophila (Sophophora). // Генетика. 1994. Т.30. №4. c.478-483.
  5. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Пространственная организация хромосом в ооцитах и сперматоцитах у малярийных комаров. //Генетика. 1995. Т.31. №2. С. 276-280.
  6. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В.  Взаиморасположение первичных политенных хромосом яичников у 12 видов группы “virilis” рода Drosophila (Sophophora). // Генетика. 1996. Т.32. №6. С.750-754.
  7. Шарахов И.В., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Особенности  прикрепления политенных хромосом к ядерной оболочке в псевдопитающих клетках яичников Drosophila melanogaster // Генетика. 1997. T.32. № 10. С.189-195.
  8. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В. Идентификация, взаиморасположение и развитие первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов у Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // Генетика. 1999. Т.35. №7. С.912-918.
  9. Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В., Унгер М.Ф., Карамышева Т.В., Мельникова Н.Н., Рубцов Н.Б., Стегний В.Н. Организация и дифференциальная окраска хромосом эндомитотических ядер трофоцитов Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // Генетика.2003. Т.39. № 9. С.1004-1012.
  10. Вассерлауф И. Э., Митренина Е. Ю., Стегний В.Н. Изменение структуры хромосом трофоцитов яичников Drosophila melanogaster рода Drosophila (Sophophora) при гибридном дисгенезе // Генетика. 2003. Т.39. № 5. С.687-693.
  11. Ананьина Т.В., Ведерников А.Е., Вассерлауф И.Э., Карамышева Т. В., Рубцов Н.Б., Стегний В.Н. Изучение упорядоченности хроматина в ядрах трофоцитов в ходе эндомитотического цикла Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // Цитология. 2003. № 9. Т. 45. С. 844.
  12. Ананьина Т.В., Ведерников А.Е., Вассерлауф И.Э., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Стегний В.Н. Визуализация хромосомных территорий в интерфазных ядрах трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala Mg (Diptera: Calliphoridae) // Генетика. 2005. Т 41. №10. С.1106-1112.
  13. Вассерлауф И.Э., Шелковникова Т.А., Митренина Е.Ю., Стегний В.Н. Нарушения спаривания гомологичных хромосом в ядрах трофоцитов яичников Drosophila melanogaster при действии инбридинга и низкой температуры // Цитология. 2005. Т. 47. № 9. С. 798-799.
  14. Усов К.Е., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Архитектура ядер трофоцитов яичников Drosophila santomea и Drosophila yakuba на разных стадиях эндорепликации // Вестник ТГУ. 2007. № 299. C. 212 -216.
  15. Шелковникова Т.А., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Изменение архитектуры ядер при развитии трофоцитов яичников у видов Drosophila подгруппы melanogaster // Вестник ТГУ. 2007. № 301. C. 222 – 226.
  16. Вассерлауф И.Э., Шелковникова Т.А., Митренина Е.Ю., Стегний В.Н. Влияние инбридинга и низкой температуры на характер синапсиса  хромосом в ядрах трофоцитов яичников в линиях Drosophila melanogaster // Генетика. 2008. Т. 44. № 8. С. 1066-1074.
  17. Вассерлауф И.Э. Изменение организации хромосом в ядрах трофоцитов яичников Drosophila melanogaster при инбридинге и гибридном дисгенезе // Вестник ТГУ. 2008. № 301. C. 222 – 226.
  18. Вассерлауф И.Э. Динамика  ориентации хромосом в ядрах трофоцитов яичников у близкородственных видов подгруппы D. melanogaster и группы D. virilis // Вестник ТГУ. 2008. № 313. С.205-214.
  19. Усов К.Е.,. Шелковникова Т.А, Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Молекулярно-цитогенетический анализ прицентромерного гетерохроматина хромосом трофоцитов яичников у видов подгруппы melanogaster рода Drosophila // Цитология. 2008. Т. № 12. С. 1043-1047.
  20. Вассерлауф И.Э., Усов К.Е., Митренина Е.Ю., Стегний В.Н. Изучение видовых особенностей взаимного расположения первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников у видов D. yakuba Burla и D. santomea Lachaise, Harry подгруппы «melanogaster» рода Drosophila (Sophophora) // Вестник ТГУ. 2008. Т. 4. № 3. С. 78-80.

Список тезисов:

       

  1.   Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Пространственная и линейная организация интерфазного ядра генеративной ткани Drosophila melanogaster линии fs(2)B // Сб. тез. III Школы-семинара по генетике и селекции животных. II Научные чтения памяти ак. Д.К. Беляева 12-19 сент. Новосибирск. 1989. С. 15.
  2. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Особенности организации мейотических ядер у малярийных комаров // III Всес. конф. по генетике и цитологии мейоза. 1990, Тез. докл., Новосибирск. С. 6.
  3. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Видоспецифичность взаиморасположения первично политенных хромосом в ядрах трофоцитов в группе Drosophila virilis // Тез. докл. 1Всес. конф. по генетике насекомых. Москва. 19-22 ноября. 1991. С. 98.
  4. Вассерлауф И.Э. Взаиморасположение первично  политенных хромосом в  ядрах  трофоцитов восьми видов подгруппы D. melanogaster // Мат-лы I съезда ВОГиС. Саратов. 1994. Генетика. Т.30, приложение. С. 453.
  5. Stegnii V.N., Sibataev A.K., Sharakhov I.V., Sharakhova M.V.,Vasserlauf I.A. Evolution-genetic analysis of the palearctic Anopheles maculipennis (Diptera: Culicidae) complex // Proceed. of XX International Congress of Entomology. Firence. Italy. 1996. P. 256.
  6. Stegnii V.N., Sibataev A.K., Sharakhov I.V., Sharakhova M.V.,Vasserlauf I.A. Evolution-genetic analysis of the palearctic Anopheles maculipennis (Diptera: Culicidae) complex // Proceed. of 10th. European SOVE Meeting, Strasbourg, France. 1996. P. 41.
  7. Ананьина Т.В., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Политенные хромосомы трофоцитов яичников у Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // Материалы конференции, посвященной памяти В.П.Чехова. Томск. ТГУ, 1997. С. 12.
  8. Ананьина Т.В., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Политенные хромосомы трофоцитов яичников у Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // Сборник тез. «Проблемы эволюции цитологии и интродукции». Томск. 1997. С. 9.
  9. Ананьина Т.В., Вассерлауф И.Э. Политенизация хромосом трофоцитов у Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // Тезисы (региональной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых) «Сибирская школа молодого ученого». 1998. Т. 5. С. 5.
  10. Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В., Стегний В.Н. Политенизация хромосом и их взаиморасположение в ядрах трофоцитов Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoraidae)// Тезисы. ВОГИС. 1999. С. 17.
  11. Вассерлауф И.Э., Митренина Е.Ю., Стегний В.Н. Изучение механизмов системной мутации при видообразовании // I Международная конференции «Проблема вида и видообразования»: Тез. докл. Томск: Изд-во Томского университета. 2000. С. 23-24.
  12. Митренина Е. Ю., Вассерлауф И. Э. Изучение механизмов реорганизации архитектуры ядра при видообразовании / Эволюционная биология: Материалы II международной конференции «Проблема вида и видообразование». Томск:  Изд-во Томского госуниверситета. 2002. Т.2. С. 375-376.
  13. Вассерлауф И. Э., Ананьина Т. В., Стегний  В. Н. Исследование интерфазного ядра трофоцитов Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // тезисы конференции «Структура и функции ядра». Цитология. 2002. Т. 44. № 9. С. 865.
  14. Mitrenina E.Y., Wasserlauf I.A. Influence of Drosophila melanogaster Inbreeding on Spatial Interrelation of Primary Polytene Chromosomes of Ovarian Nurse Cells / Second meting 14-17 June. 2002. Helsinki, Finland; Retrotransposons: Their impact on organisms, genomes, and biodiversity. P. 45-46.
  15. Ананьина Т.В., Ведерников А.Е., Вассерлауф И.Э., Карамышева Т. В., Рубцов Н.Б., Стегний В.Н. Изучение упорядоченности хроматина в ядрах трофоцитов в ходе эндомитотического цикла Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // Цитология. 2003. № 9. Т. 45. С. 844.
  16. Вассерлауф И.Э., Митренина Е.Ю., Белоногова Н.М., Стегний В.Н. Инбридинг как возможный механизм пространственной реорганизации архитектуры ядер трофоцитов яичников у Drosophila // Материалы III Съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». 2004. Т.2. С. 249.
  17. Ананьина Т.В., Вассерлауф И.Э., Ведерников А.Е., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Стегний В.Н. Хромосомные территории в высокополиплоидных ядрах трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala (Diptera:Calliphoridae) // Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития. Материалы III Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 6-12 июня. 2004. С. 277.
  18. Вассерлауф И. Э., Шелковникова Т. А., Стегний В. Н. Сравнительный анализ ядрышкообразующих хромосом в ядрах трофоцитов яичников близкородственных видов подгруппы Drosophila melanogaster и межвидовых гибридов // Материалы IV международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных. Санкт-Петербург. 2006. С. 18.
  19. Вассерлауф И.Э., Митренина Е.Ю. Усов К.Е., Стегний В.Н. Сравнительный анализ динамики архитектуры хромосом и ядрышка трофоцитов яичников на протяжении эндоцикла Drosophila santomea lanchais, Harry и D. yakuba Burla // Материалы IV международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных Санкт - Петербург, 2006. С.19.
  20. Усов К.Е., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Изучение взаимного расположения первичных политенных хромосом трофоцитов яичников в линиях Drosophila simulans // Энтомологические исследования в Северной Азии. Материалы VII Межрегиональное совещание энтомологов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск. 2006. С. 152.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.