WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ТЕЛУШКИН 

Павел Константинович

ИНСУЛИНОВАЯ ГИПОГЛИКЕМИЯ И МЕТАБОЛИЗМ МОЗГА

03.00.13 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в ФГОУ ВПО Санкт-Петербургском государственном

университете

Научный консультант:

Академик РАН Александр Данилович Ноздрачев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Виктор Петрович Лапицкий

доктор биологических наук, профессор Юрий Петрович Пушкарев

доктор биологических наук Наталья Эдуардовна  Ордян

Ведущее учреждение:

Институт эволюционной физиологии и биохимии  им. И.М. Сеченова РАН

Защита состоится “____” ___________ 2009 г. в ___часов

на заседании совета Д 212. 232. 10 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по

адресу:

199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд.90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького Санкт-

Петербургского государственного университета

Автореферат разослан “____” __________ 2009 г.

Ученый секретарь совета

доктор биологических наук,

профессор  Н.П. Алексеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение гипогликемии и ее последствий для организма занимает важное место среди проблем современной биологии и медицины.

Гипогликемия - широко распространенное состояние, возникающее при инсуломе поджелудочной железы, алкогольной интоксикации,  заболеваниях печени и желудочно-кишечного тракта, но чаще всего инсулиновая гипогликемия сопровождает  лечение  сахарного  диабета (Балаболкин,  2000;  Cryer,2004, 2006;  Briscoe,  Davis, 2006 и др.).

Эпизоды симптоматической гипогликемии наблюдаются у пациентов с инсулинодефицитом при интенсивной терапии около 10 раз в неделю, а  тяжелой гипогликемии, сопровождающиеся временной утратой трудоспособности и госпитализацией – по крайней мере, один раз в год (Hepburn et al., 1993; Briscoe,  Davis, 2006). По разным оценкам, от 2 до 7 % смертей пациентов с сахарным диабетом первого типа связано с гипогликемией (Cryer, 2004; Дедов, 2005).

Предшествующие эпизоды гипогликемии уменьшают нейроэндокринный, симтоматический и когнитивный ответы при последующих гипогликемиях не только при дефиците эффектов инсулина (Segel et al., 2002), но и у недиабетических пациентов (Davis et al., 1997). Компенсаторные реакции при последующих гипогликемиях возникают при меньших концентрациях глюкозы, т.е. при более тяжелой гипогликемии. Это приводит к развитию бессимптомных  гипогликемий. Механизмы ослабления симпатоадреналового ответа при последующих гипогликемиях неизвестны (Cryer, 2004, 2005; Briscoe, Davis, 2006).  Поскольку  мозг исключительно зависим от глюкозы и  является первым органом, повреждающимся при гипогликемии (McAuley et al., 2001; Cryer  et al., 2003; Zammitt, Frier, 2005), нарушения в нем обмена  могут быть причиной уменьшения симпатоадреналового ответа при последующих гипогликемиях (Cryer, 2005).

Инсулин  крови сам по себе не влияет  на обмен мозга в целом (Ames, 2000; Brown, 2004).  Действие больших доз инсулина, вызывающее определенную неврологическую симптоматику и повреждение нейронов, опосредовано гипогликемией (Siesjo, Agardh, 1983; McAuley et al., 2001; Cryer  et al., 2003; Zammitt, Frier, 2005 и др.). Купирование  гипогликемического ступора и комы глюкозой  приводит  к  сравнительно быстрому восстановлению электрофизиологических и метаболических показателей.  Исследования  нарушений гомеостазиса Са2+ при нейрогликопении (Kristian et al., 1993) привели к представлению о эксайтотоксической природе повреждения нейронов при гипогликемии (Wieloch, 1985; Nehlig, 1997).

Несмотря на обилие информации о нарушениях метаболизма в мозге собственно при гипогликемии,  изменения, возникающие в восстановительном периоде после купирования гипогликемической комы глюкозой и  сроки нормализации  связанных  с  гипогликемией нарушений обмена в головном мозге, до настоящего времени достаточно не исследованы. Повреждение нейронов может возникать не собственно в состоянии гипогликемии,  а в восстановительном периоде. Кроме того, купирование гипогликемической комы в реальных условиях часто сопровождается гипергликемией, которая сама по себе может служить причиной нарушений обмена в нервной ткани (Siesjo et al. 1988; Suh et al., 2007). Именно значительные колебания уровня глюкозы в крови приводят к большему развитию окислительного стресса, повреждению эндотелия сосудов и увеличивают риск развития кардиоваскулярных расстройств у пациентов с сахарным диабетом (Ceriello et al., 2008).

Состояния  нейрогликопении  в ходе лечения больных сахарным диабетом и при других заболеваниях, осложнением которых является гипогликемия, встречаются неоднократно. Поэтому изменения обмена, возникающие в мозге при нейрогликопении, могут создавать метаболический фон, усугубляющий течение последующих эпизодов гипогликемии; возможна "суммация" неблагоприятных изменений. 

Гипогликемия увеличивает риск развития последующих гипогликемий. Вопросы о том, как мозг адаптируется к возобновляющимся гипогликемиям и как это может приводить к увеличению  повреждаемости нервных клеток, и каким образом возможные индуцированные гипогликемией изменения метаболизма в мозге могут способствовать защите его от повреждения, остаются открытыми (Sherwin, 2008).

Поскольку состояния гипогликемии широко распространены в клинической практике  и способны приводить к необратимому повреждению нейронов, исследование патохимии гипогликемии  также имеет непосредственное практическое значение в отношении разработки способов защиты нейронов от гипогликемического повреждения.

Систематического изучения изменений метаболизма мозга, которые могут быть следствием неоднократного воздействия на него гипогликемии, не проводилось.

Цель и задачи исследования.

Цель исследования состояла в определение механизмов инсулиновой гипогликемии в патохимии нервных расстройств,  связанных  с нейрогликопенией.

Основные задачи исследования:

1. Определение принципиальной возможности и сроков восстановления основных биохимических параметров в мозге  после купирования гипогликемической комы глюкозой.

2. Выявление  изменений метаболизма в мозге при неоднократной нейрогликопении,  способствующих развитию повреждения нейронов и постгипогликемической энцефалопатии.

3. Выяснение взаимосвязи различных изменений  обмена в мозге крыс, возникающих в результате неоднократно перенесенной гипогликемии.

Научная новизна.

Впервые получены комплексные данные о состоянии энергетического обмена, метаболизма медиаторных аминокислот и  процессов перекисного окисления липидов  в различных отделах мозга  животных при гипогликемии.

  Установлено, что в отличие от однократной гипогликемии, неоднократно перенесенная гипогликемия вызывает серьезные нарушения энергетического обмена: снижение интенсивности гликолиза и гликогенолиза, активности ферментов энергетического обмена и нарушения распада гликогена в мозге.

Впервые выявлены стойкие нарушения метаболизма аминокислот в мозге животных, неоднократно перенесших гипогликемию: уменьшение активности глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы в больших полушариях и уменьшение уровня ГАМК в стволе мозга, увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы и уменьшение количества аспартата в больших полушариях мозга.

Впервые проведено комплексное исследование показателей, характеризующих интенсивность перекисного окисления липидов и систему антиоксидантной защиты в мозге при гипогликемии. Установлено, что неоднократно перенесенная гипогликемия приводит к снижению мощности антиоксидантных систем в мозге: уменьшению активности супероксиддисмутазы и продуцирующих восстановленную форму НАДФ дегидрогеназ.

Впервые проведена оценка общих показателей энергетического и азотистого обмена в организме экспериментальных животных при гиперинсулинизации. Установлено, что многократное введение высоких доз инсулина вызывает в организме в целом катаболические изменения, связанные с активацией конринсулярного аппарата.

Теоретическое и практическое значение работы. В процессе работы выявлены характерные для гипогликемии изменения метаболизма в головном мозге и в организме в целом. Проведена оценка фактора неоднократно возникающей гипогликемии в развитии нарушений обмена в головном мозге. В процессе исследования выявлены основные закономерности изменений показателей энергетического обмена, метаболизма нейромедиаторных аминокислот и перекисного окисления липидов в головном мозге при гипогликемии  и оценено значение различных нарушений метаболизма в патохимии постгипогликемической энцефалопатии. Высказано предположение об увеличении потребления кетоновых тел мозгом крыс, неоднократно перенесших тяжелую гипогликемию. Установлено, что именно неоднократная нейрогликопения вызывает комплекс нарушений метаболизма, включающий в себя уменьшение гликолитической и митохондриальной энергопродукции, нарушения обмена гликогена, снижение активности ферментов синтеза ГАМК и активацию цикла пуриновых нуклеотидов в мозге, инициацию процессов перекисного окисления.

Полученные в работе данные необходимо учитывать при  организации исследования нарушений обмена в головном мозге при различных патологических состояниях. Результаты работы могут служить основой для разработки профилактических и реабилитационных мероприятий в ходе лечения пациентов с сахарным диабетом, а также при других заболеваниях, сопровождающихся гипогликемией.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изменения метаболизма, возникающие в мозге при однократной инсулиновой гипогликемии, обусловлены нейрогликопенией и имеют, в основном, обратимый характер.

2. Неоднократно перенесенная гипогликемия приводит к нарушению энергетического обмена, метаболизма нейротрансмиттерных аминокислот и активации процессов  перекисного окисления липидов в мозге.

3. Большинство выявленных изменений энергетического, аминокислотного обмена и активация  перекисного окисления липидов  наблюдаются преимущественно в стволе мозга.

4. Общие нарушения метаболизма у животных, неоднократно перенесших инсулиновую гипогликемию, свидетельствуют об активации контринсулярного аппарата, увеличении катаболизма аминокислот и белков и сходны с таковыми при сахарном диабете.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференции “Физиологические механизмы развития экстремальных состояний ”(Санкт-Петербург, 1995), на Первом Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием  “Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы” (Москва, 1996), на конференции “Состояние и перспективы современного лекарствоведения” (Ярославль, 1997), на конференции “Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии”, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 1998), на 12-м Международном конгрессе по нейрохимии (Санкт-Петербург, 1998), на конференции “Актуальные вопросы общей и военной патологической анатомии”, посвященной 140-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 1999), на Всероссийской конференции “Проблемы медицинской энзимологии” (Москва, 2002), на Всероссийской конференции “Механизмы синаптической передачи” (Москва, 2004), на 5-й науч.-практ. конф. с международным участием “Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины” (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006), на IV съезде Российского общества  биохимиков и молекулярных биологов с международным участием (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ, включая 14 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из общего введения, описания основных методов (Глава 1), трех глав результатов собственных исследований (Главы 2-4), каждая из которых включает литературную справку, описание использованных методических приемов, результаты, обсуждение и краткое резюме. Работа заключается семью общими выводами и списком литературы, состоящим из 664 литературных источника. Работа изложена на 285 страницах, содержит 27 рисунков и 18 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты были поставлены на белых беспородных крысах массой 180-250 г. Животные содержались в обычных условиях вивария на стандартном пищевом рационе в условиях свободного доступа к корму и перед забоем были лишены пищи в течении 18-24 часов. Воду получали без ограничения во всех условиях эксперимента.  Гипогликемическую кому вызывали внутримышечным введением инсулина (Actrapid MC, Actrapid HM, 40 ЕД/кг массы тела). Купирование гипогликемической комы производили путем внутрижелудочного введения 3.0 мл 40% раствора глюкозы.

При проведении опытов с неоднократной гипогликемией экспериментальные животные были разделены на 5 групп: 1 – интактные  (контроль);  2 – крысы, находящиеся в состоянии гипогликемической комы; 3 – животные, обследованные через 48 часов после купирования 1-й гипогликемической комы; 4 – крысы, перенесшие 7-9 гипогликемических ком с интервалом в двое суток  во время последней из серии ком; 5 – животные, перенесшие 7-9 гипогликемических ком  через 48 часов после купирования последней комы.

Крыс забивали декапитацией под легким эфирным наркозом. Материалом для исследования служили большие полушария мозга  и ствол мозга,  сыворотка крови,  печень, скелетная мышца.

Уровень субстратов энергетического и азотистого обмена в сыворотке  крови определяли с использованием стандартных диагностических наборов.

Суммарную фракцию митохондрий и фракцию, содержащую растворимую часть цитоплазмы,  получали общепринятыми  методами дифференциального центрифугирования  (Sottocasa, 1979; Прохорова, 1982). Все процедуры по выделению субклеточных фракций проводили при 0 – 4оС.

Активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41), НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.42), НАДФ-зависимой малат-дегидрогеназы, (“малик-энзим”, КФ 1.1.1.40), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ. 1.1.1.49), НАД-зависимой малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37),  глутамат-дегидрогеназы  (КФ 1.4.1.3), аланинаминотрансферезы (КФ 2.6.1.2), аспартат-аминотрансферазы (КФ 2.6.1.1), количество пирувата, цитрата, α-кетоглутарата, лактата, глутамата и гликогена  определяли спектрофотометрически (Прохорова, 1982). Активность  сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.99.1), -кетоглутарат-дегидрогеназы (КФ 1.2.4.2), пируватдегидрогеназы (КФ 1.2.4.1) и НАДН-дегидрогеназы  (КФ 1.6.99.3) определяли с использованием 2,6-дихлорфенолиндофенола в качестве  акцептора электронов (Кривченкова, 1977). Интенсивность гликолиза и гликогенолиза оценивали по накоплению лактата в среде инкубации  (Панин и соавт. 1982), активность АТФаз исследовали по скорости образования неорганического фосфата  (Филиппов, 1991).

Определение количества аминокислот и активности ГАМК- аминотрансферазы  (КФ 2. 6. 1. 19) и глутаматдекарбоксилазы (КФ 4.1.1.15) проводили с использованием тонкослойной хроматографии (Розанов, 1980).  Активности глутаминазы (КФ 3.5.1.2)  и аденозинмонофосфатдезаминазы (КФ 3.5.4.6)  оценивали по накоплению аммиака (Лебедева и соавт., 1981). Активность моноаминооксидазы (КФ 1.4.3.4) определяли по накоплению аммиака, используя в качестве субстратов серотонин креатининсульфат, тирамин гидрохлорид, дофамин гидрохлорид  и глюкозамин (Горошинская и соавт., 1989).

Скорость накопления малонового диальдегида оценивали  по  реакции  с тиобарбитуровой кислотой, уровень диеновых коньюгатов - спектрофото-метрически (Никушкин и соавт., 1989). Активность супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.11) исследовали по торможению восстановления нитросинего тетразолия (Гуревич  и соавт., 1990). Активности нейтральных и кислых протеаз определяли  при рН соответственно 7.6 и 3.2 по накоплению тирозина (Мурти и соавт., 1985). Содержание белка определяли методом Lowry.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t - критерия Стъюдента после вычисления средней арифметической ряда (М), среднего квадратичного отклонения (σ) и средней ошибки средней ариф-метической (m). Также использовался непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Достоверными считали те результаты, для которых  P<0.05. Исходные числовые данные обработаны в пакете статистических программ “Biotest”, “Statistica 5.5”.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Уровень субстратов и активность ферментов энергетического и азотистого метаболизма в мозге крыс при однократной гипогликемии и в ранние сроки восстановительного периода.

В состоянии гипогликемической комы уровень глюкозы в крови крыс составлял 1.0-1.5 ммоль/л, введение глюкозы коматозным животным приводит к увеличению содержания глюкозы в крови: через 5, 15 и 30 мин величина гликемии составляет соответственно 2.0-3.0 ммоль/л,  6.0-7.0 ммоль/л и 10.0-15.0 ммоль/л.

Рис. 1.  Изменения уровней энергетических субстратов в мозге крыс при инсулиновой гипогликемии и  в ранние сроки  восстановительного периода (М±m).

Примечание: Здесь и на рис.2-7. БПМ - большие полушария мозга, СМ- ствол мозга. Статистически достоверные по сравнению с контролем изменения обозначены: * - P < 0.05, ** - P < 0.01, *** - P < 0.001. Кома - животные в состоянии гипогликемической комы, 5, 15 и 30 мин – время после купирования комы глюкозой.

У животных в состоянии гипогликемической комы уровень исследованных субстратов энергетического обмена в мозге уменьшается (Рис. 1). Через 30 мин после купирования комы глюкозой происходит полное восстановление исследованных показателей. Расчет отношения НАД/НАДН в мозге крыс в состоянии гипогликемической комы указывает на резкое уменьшение уровня восстановленности пиридиновых нуклеотидов и свидетельствует о достаточном снабжении кислородом мозга крыс в состоянии гипогликемической комы.

Изменений интенсивности гликолиза и гликогенолиза,  активности лактатдегидрогеназы, митохондриальных окислительных ферментов в больших полушариях  и в стволе мозга крыс в состоянии гипогликемической комы и через 30 мин после купирования ее глюкозой не выявлено.

Рис. 2. Изменения уровней аминокислот в мозге крыс при инсулиновой гипогликемии и в ранние сроки восстановительного периода (М±m).

В состоянии гипогликемической комы в исследованных отделах мозга  животных количество глутамата,  ГАМК и аланина уменьшается, наблюдается увеличение уровня  аспартата (Рис.2). Через 30 мин после купирования комы глюкозой происходит полное восстановление уровня исследованных аминокислот. Изменений активности глутаматдекарбоксилазы, ГАМК-, аланин- и аспартат-аминотрансфераз в  мозге  животных в этих экспериментах не выявлено.

Сам факт полного восстановления субстратного обеспечения гликолиза и цикла Кребса, уровня аминокислот, нормализация содержания гликогена в мозге при купировании комы глюкозой свидетельствует о сохранности ферментных систем и их регуляции после перенесенной однократной гипогликемии. 

Общий вывод состоит в том, что изменения уровня исследованных субстратов отражают изменения уровня глюкозы  в притекающей к мозгу крови и полностью обратимы при купировании комы глюкозой; изменения активности ферментов в состоянии однократной  гипогликемической комы и в ранние сроки восстановительного периода практически отсутствуют. Таким образом, однократная гипогликемия в первом приближении представляет собою полностью обратимое в  отношении исследованных показателей метаболизма состояние.

2. Общие показатели энергетического и азотистого обмена у крыс при неоднократной  гипогликемии.

Время впадения крыс в первую кому и во все последующие было практически одинаковым, менялось случайным образом для каждого экспериментального животного,  не зависело от количества ранее перенесенных коматозных состояний и составляло 2-3 часа. Содержание глюкозы в крови у крыс в состоянии 1-й и 7-й гипогликемических ком  было практически одинаковым (Табл.1). У крыс 4-й группы концентрация свободных жирных кислот в сыворотке крови увеличивалась, а уровень кетоновых тел не отличался от нормы. У животных остальных экспериментальных групп оба эти показателя были значительно снижены.

Содержание мочевины в сыворотке крови в состоянии  1-й  гипогликемической комы оставалось нормальным, а через 48 часов после купирования  уменьшалось. У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, в состоянии последней комы уровень мочевины значительно повышен (на 63%, P<0.001). Концентрация мочевой кислоты в сыворотке уменьшалась у животных в состоянии первой гипогликемической комы и увеличивалась через 48 часов после купирования. У крыс 4-й группы показатель повышен по сравнению с нормой и оставался высоким через 48 часов после купирования последней комы.

Таблица 1.

Содержание энергетических субстратов, продуктов азотистого обмена в крови  и гликогена в органах крыс при гиперинсулинизации (M ± m)

Показатель

Группы экспериментальных животных

1

2

3

4

5

Глюкоза, ммоль/л

5.37 ± 0.12

1.36 ± 0.14***

5.63 ± 0.17

1.76 ± 0.23***

5.47 ± 0.15

СЖК, мкмоль/л

409 ± 15

235 ± 34***

125 ± 11***

501 ± 13***

245 ± 16***

Кетоновые тела, мг/л

34.8 ± 1.6

18.6 ± 2.3***

13.1 ± 2.0***

36.9 ± 2.5

25.7 ± 1.0***

Мочевина, ммоль/л

4.6 ± 0.8

4.6 ± 0.2

2.9 ± 0.3**

7.5 ± 0.4***

4.4 ± 0.7

Мочевая кислота,

мкмоль/л

210 ± 4

168 ± 3**

245 ± 5**

244 ± 14*

250 ± 10*

Гликоген

печени, мг/г

25.9 ± 1.6

17.1 ± 1.8**

49.3 ± 2.5***

26.7 ± 1.3

25.5 ± 1.7

Гликоген скелет-ных мышц, мг/г

9.5 ± 0.6

5.6 ± 0.4***

14.7 ± 0.5***

11.2 ± 0.9

13.0 ± 1.9

Примечание. Здесь и в таблицах 2-8: M среднее, m – ошибка среднего; статистически достоверные по сравнению с контролем изменения обозначены: * - P < 0.05,  ** - P < 0.01, *** - P < 0.001. В каждой группе по 6–8 животных. СЖК – свободные жирные кислоты.

Количество гликогена в печени и скелетной мышце крыс в состоянии первой гипогликемической комы было снижено, через 48 часов после купирования комы количество гликогена в тканях увеличивается. У крыс, перенесших серию ком, таких изменений не обнаружено. Вне зависимости от конкретных механизмов, эти результаты однозначно свидетельствуют о нарушении распада и синтеза гликогена в тканях животных, неоднократно перенесших  инсулиновую гипогликемию.

Таблица 2.

Интенсивность накопления лактата в печени  крыс при гиперинсулинизации, нмоль/(мин · мг белка) (M ± m)

Субстрат

Группы экспериментальных животных

1

2

3

4

5

Глюкоза

12.7 ± 1.2

12.3 ± 1.1

12.1 ± 1.4

19.0 ± 0.8**

14.2 ± 1.4

Г6Ф

23.2 ± 1.4

21.2 ± 1.8

24.6 ± 1.7

25.4 ± 2.0

27.8 ± 1.3

Гликоген

17.3 ± 1.0

11.6 ± 1.1**

18.1 ± 0.9

26.6 ± 0.6***

16.8 ± 2.1

Примечание. Г6Ф – глюкозо-6-фосфат.

Скорость образования лактата в печени крыс в состоянии 1-ой комы при использовании в качестве субстратов глюкозы и глюкозо-6-фосфата не изменялась, а интенсивность гликогенолиза снижалась на 33% (P<0.01) (Табл.2). У животных 4-ой группы интенсивность накопления лактата при использовании глюкозы и гликогена в качестве субстратов увеличивалась в 1.5 раза (в обоих случаях P<0.01),  изменений скорости накопления лактата при использовании в качестве субстрата глюкозо-6-фосфата не выявлено.

Таблица 3.

Активность ферментов в печени крыс при гиперинсулинизации (M ± m)

Фермент

Группы экспериментальных животных

1

2

3

4

5

мкмоль / (ч · мг белка)

АСТ

5.9 ± 0.1

5.6 ± 0.3

6.2 ± 0.2

6.8 ± 0.1***

7.2 ± 0.2***

АЛТ

8.4 ± 0.2

8.8 ± 0.3

8.1 ± 0.2

9.7 ± 0.1***

9.3 ± 0.3*

нмоль / (ч · мг белка)

ГЛТ

171 ± 13

179 ± 6

84 ± 12***

203 ± 6*

240 ± 15**

АМФ-Д

37.8 ± 1.8

36.1 ± 1.8

37.2 ± 5.2

35.5 ± 3.3

25.5 ± 2.2**

мкмоль / (мин · мг белка)

СДГ

1.47 ± 0.06

1.51 ± 0.08

1.38 ± 0.21

2.17 ± 0.29*

1.76 ± 0.18

ГДГ

0.53 ± 0.02

0.51 ± 0.04

0.50 ± 0.03

0.66 ± 0.05*

0.49 ± 0.04

нмоль / (мин · мг белка)

ЛДГ

573 ± 44

582 ± 50

644 ± 29

698 ± 18*

587 ± 32

Г6Ф-ДГ

14.3 ± 0.4

15.8 ± 0.7

18.1 ± 0.6***

38.1 ± 1.5***

42.9 ± 1.2***

ГР

47.3 ± 0.8

50.5 ± 0.7*

54.7 ± 1.0***

66.9 ± 2.3***

67.6 ± 1.5***

НАДФ-ИЦДГ

89.3 ± 4.1

81.2 ± 3.8

85.8 ± 5.9

93.4 ± 4.7

95.2 ± 5.3

НАДФ-МДГ

47.1 ± 2.3

57.0 ± 2.1**

55.2 ± 1.9*

98.5 ± 5.6***

117.7 ± 4.9***

Примечание. АСТ – аспартатаминотрансфераза, АЛТ – аланинаминотрансфераза, ГЛТ – глутаминаза, АМФ-Д – аденозинмонофосфатдезаминаза, СДГ – сукцинатдегидрогеназа, ГДГ – глутаматдегидрогеназа, ЛДГ – лактатдегидрогеназа, Г6Ф-ДГ – глюкозо-6-фосфат –дегидрогеназа, ГР – глутатионредуктаза, НАДФ-ИЦДГ и НАДФ-МДГ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимые соответственно изоцитрат- и малатдегидрогеназы.

У крыс, перенесших серию ком, в состоянии последней комы активности лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы в печени оказались увеличенными соответственно на 22%, 48 и 24% (во всех случаях P<0.01) по сравнению с контролем (Табл.3).  У животных в состоянии 1-ой  гипогликемической комы в печени возрастала активность глутатионредуктазы и НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы. Через 48 часов после купирования 1-ой комы повышалась активность глутатионредуктазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-зависимой  малатдегидрогеназы соответственно на 16%, 28 и 17% (во всех случаях P<0.001). У животных 4-ой и 5-ой групп наблюдали еще более значительное увеличение активности этих ферментов.

У животных 4-ой и 5-ой групп обнаружено увеличение активности аминотрансфераз в печени на 1122% (P<0.05) (Табл.3). Активность глутаминазы у крыс в состоянии 1-ой гипогликемической комы  не отличалась от уровня контроля, а через 48 часов  после купирования  снижалась. У крыс 4-ой и 5-ой групп активность глутаминазы, напротив, увеличивалась. В печени и скелетной мышце крыс в состоянии 1-ой гипогликемической комы уменьшалась активность нейтральных протеаз, в скелетной мышце показатель оставался сниженным и через 48 часов после купирования комы (Табл.4). В состоянии комы у крыс, перенесших серию ком, обнаружено увеличение  активности кислых протеаз в печени, изменения являются стойкими. В скелетной мышце активность кислых и нейтральных протеаз у крыс 5-ой группы также заметно повышена.

Таблица  4.

Активность  кислых (рН 3.2) и нейтральных (рН 7.6) протеаз в  печени и скелетной мышце крыс при гиперинсулинизации, нмоль /(мин · г ткани)  (M ± m)

Объект

Про-теазы

Группы экспериментальных  животных

1

2

3

4

5

Печень

pH 3.2

52.1 ± 3.0

51.7 ± 1.6

52.5 ± 1.2

73.8 ± 3.3***

62.3 ± 2.4*

pH 7.6

19.7 ± 0.8

13.5 ± 1.5**

18.3 ± 1.4

21.7 ± 2.7

20.8 ± 0.7

Мышца

pH 3.2

6.68 ± 0.43

7.17 ± 0.47

7.31 ± 0.47

7.00 ± 0.19

7.88 ± 0.31* 

pH 7.6

18.0 ± 0.5

14.7 ± 0.9**

13.5 ± 0.4***

19.1 ± 0.9

19.8 ± 0.5*

 

Изменения большинства исследованных показателей в печени и крови у экспериментальных животных в состоянии 1-ой гипогликемической комы вызваны непосредственным действием инсулина (O`Brien et al., 2001;  Belke  et al., 2002). Этим обусловлено уменьшение гликогенолиза в печени (Gastaldelli et al., 2001). Снижение концентрации свободных жирных кислот и кетоновых тел в крови обусловлено ингибированием липолиза под действием инсулина (Timothy, 1996).  Уменьшение концентрации конечных продуктов азотистого обмена в крови и активности протеаз в печени и скелетных мышцах у крыс 2-ой и 3-ей групп также связаны  с эффектами инсулина и в целом отражают репрессию катаболизма аминокислот  (Charlton,  Nair,  1998).

Изменения метаболизма у животных, перенесших серию гипогликемических ком и находящихся в состоянии комы (4-ая группа), весьма значительны и связаны с активацией контринсулярного аппарата и увеличением уровней глюкагона, катехоламинов и глюкокортикоидов при гипогликемии (Bolli, Fanelli, 1999; Балаболкин, 2000). К таким изменениям относятся увеличение уровня свободных жирных кислот и мочевины в крови, сохранение нормального уровня кетоновых тел, повышение активности глутаминазы, глутаматдегидрогеназы и аминотрансфераз и в печени, поскольку глюкагон и глюкокортикоиды стимулируют липолиз в жировой ткани и глюконеогенез в печени (Timothy, 1996;  Nissim et al., 1999). Инсулин не препятствует активации глюконеогенеза в печени, особенно при высокой концентрации свободных жирных кислот в крови  (Staehr et al., 2003). Гормон ингибирует преимущественно гликогенолиз, а не глюконеогенез (Adkins et al., 2003) и инсулиновая гипогликемия может приводить к активации образования глюкозы  (Edgerton et al., 2002). Значительное увеличение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ в печени крыс, перенесших серию гипогликемических ком, связано с действием инсулина (O`Brien, 2001).

3. Интенсивность гликолиза и гликогенолиза и активность окислительных ферментов в мозге крыс при неоднократной гипогликемии.

Количество гликогена в больших полушариях мозга и в стволе мозга у крыс в состоянии 1-ой гипогликемической комы уменьшалось соответственно на 55% и 45% (в обоих случаях (P<0.01) и не отличалось от уровня контроля у животных других групп (Рис. 3). 

Рисунок 3. Содержание  гликогена  в мозге крыс при гиперинсулинизации  (M ± m).

Примечание. Здесь и на рис.4-7 - 2,3,4,5 – группы экспериментальных животных.

У крыс, забитых в состоянии последней из серии гипогликемических ком, при использовании всех субстратов обнаружено уменьшение интенсивности дихотомического распада углеводов (Табл. 5). Наиболее выраженные изменения в исследованных отделах мозга наблюдаются при использовании в качестве субстрата глюкозо-6-фосфата (-62%, P<0.001). 

Такие  изменения могут быть  связаны с уменьшением скорости фосфо-фруктокиназной реакции (Magen et al., 1995) и/или с повреждением дегидрогеназы 3-фосфоглицеринового альдегида в результате активации окислительного стресса (Ciolino, Levine, 1997; Miura et al., 1997).  Отсутствие изменений уровня гликогена и уменьшение интенсивности гликогенолиза в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию, в состоянии последней комы,  свидетельствует о нарушении утилизации полисахарида. Нарушение использования гликогена в мозге рассматривается как один из существенных патохимических маркеров в развитии энцефалопатий различного генеза (Magistretti,  Pellerin, 1996; Brown, 2004).

Таблица 5.

Интенсивность накопления лактата в головном мозге крыс при гиперинсулинизации, нмоль/(мин · мг белка) (M ± m)

Субстрат

Группы экспериментальных животных

1

2

3

4

5

Большие полушария мозга

Глюкоза

53.6 ± 1.1

55.1 ± 1.0

55.4 ± 1.2

40.0±2.1***

56.1 ± 1.1

Г6Ф

66.1 ± 4.0

63.6 ± 2.1

64.9 ± 2.8

25.8±0.6***

65.8 ±2.5

Гликоген

19.8 ± 2.1

20.1 ± 1.6

21.1 ± 1.7

10.3±2.0*

18.7 ± 2.1

Ствол мозга

Глюкоза

57.6 ± 1.0

55.7 ± 1.1

55.1 ± 1.4

37.4±1.6***

57.4 ± 1.3

Г6Ф

73.7 ± 5.5

67.4 ± 4.0

69.7 ± 3.4

28.3±2.6***

68.3 ± 3.1

Гликоген

18.7 ± 1.5

21.3 ± 1.2

19.5 ± 0.9

11.4±0.8***

14.4 ± 0.9*

Примечание. Г6Ф - глюкозо-6-фосфат.

Угнетение гликолитической энергопродукции  имеет  существенное значение в нарушении функций мозга (Lipton, 1991; Ames, 2000; Korf, Gramsbergen, 2007).  Гликолитическая энергопродукция в астроцитах обеспечивает работу Na+-, K+-АТФазы и удаление К+ из внеклеточной жидкости, поддерживая, тем самым, мембранный потенциала покоя нейронов, обеспечивает Na+-зависимый захват глутамата  астроцитами  (Pellerin, Magistretti,  1994), а также включение глутамата в состав синаптических везикул  (Ikemoto et al., 2003). Образованный астроцитами лактат используется нейронами  в качестве энергетического субстрата (Ames, 2000; Brown, 2004). Продукция молочной кислоты астроцитами имеет значение в регуляции концентрации Н+ во внеклеточной жидкости; Н+ уменьшает сродство NMDA-рецепторов  к аспартату и глутамату (Tombaugh, Sapolsky, 1993). Лактат препятствует развитию эксайтотоксических эффектов глутамата (Ros et al., 2001), способствует выживанию нейронов в отсутствии глюкозы  (Zeevalk,  Nicklas, 2000).

Полученные данные позволяют  предполагать,  что в качестве источника энергии используются неглюкозные субстраты, в частности кетоновые тела плазмы крови и кетоновые тела, образующиеся в мозге в ходе окисления аминокислот с разветвленным радикалом (валина, лейцина, изолейцина) (Honegger et al., 2002; Greene et al., 2003).

В ходе экспериментов не было обнаружено изменений активности лактатдегидрогеназы, пируватдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы в мозге. В состоянии последней гипогликемической комы у крыс, перенесших серию ком, наблюдается снижение активности α-кетоглутаратдегидрогеназы в мозге. У крыс 4-ой и 5-ой групп наблюдается уменьшение активности НАДН-дегидрогеназы  в стволе мозга. Активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы у животных 5-ой группы в стволе мозга увеличена (Табл. 6).

Таблица 6.

Активность ферментов нмоль / (мин · мг белка) в головном мозге крыс при гиперинсулинизации (M ± m)

Фермент

Отдел мозга

Группы экспериментальных животных

1

2

3

4

5

НАД-

ИЦДГ

БПМ

СМ

47.8±1.6

33.7±1.9

49.7±1.5

34.4±1.7

45.1±1.1

32.7±1.5

52.8±3.1

38.6±2.1

53.6±4.0

40.5±1.8*

НАДН-

ДГ

БПМ

СМ

83.3±1.8

54.1±2.1

80.1±2.2

51.5±1.7

85.2±2.0

57.3±1.4

78.1±1.7

44.7±1.9**

84.4±3.1

46.0±1.2**

α-КГЛ-ДГ

БПМ

СМ

53.9±2.4

53.8±3.7

48.7±2.5

45.8±3.1

51.6±2.6

49.7±3.3

45.6±2.1*

42.5±3.0*

48.6±2.2

45.1±3.4

НАД-

МДГ

надосадок

БПМ

СМ

1246±40

1416±74

1053±39**

1141±37**

1196±30

1351±55

1022±45**

1201±53*

1219±47

1342±61

НАД-МДГ

митохондр.

БПМ

СМ

416±6

388±8

430±12

371±10

440±15

369±14

408±14

360±12

432±6

354±7*

Примечание. Здесь и в табл. 7-8: БПМ – большие полушария мозга, СМ – ствол мозга. НАД-ИЦДГ – никотинамидадениндинуклеотид-зависимая изоцитратдегидрогеназа, НАДН-ДГ – дегидрогеназа восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида, -КГЛ-ДГ - -кетоглутаратдегидрогеназа, НАД-МДГ – никотинамидадениндинуклеотид-зависимая малатдегидрогеназа.

Наиболее вероятной причиной уменьшения активности α-кетоглутарат-дегидрогеназы  и НАДН-дегидрогеназы  является их повреждение в ходе активации окислительного стресса (Lenaz et al., 1997;  Kumar et al., 2003). Кроме того, α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс  способен генерировать (а при окислительном повреждении особенно) активные формы кислорода (Starkov et al., 2004). Уменьшение активности НАДН-дегидрогеназы и α-кетоглутарат-дегидрогеназы в мозге животных, перенесших серию гипогликемических ком может приводить к уменьшению продукции и окисления восстановленной формы НАД и к нарушению продукции АТФ в нервной ткани. Увеличение активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы в стволе мозга у крыс 5-ой группы, по-видимому, связано с индукцией синтеза белка-фермента и свидетельствует об увеличении окисления кетоновых тел в мозге (Veech et al., 2001).

В больших полушариях и в стволе мозга активность  Na+,K+-АТФазы была повышена у крыс, находящихся в состоянии гипогликемической комы (2-ая и 4-ая группы) в 1,5 раза (P<0.001) (Рис. 4). У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, увеличение активности фермента наблюдается и через 48 часов после купирования последней комы. 

Рисунок 4. Активность Na,K+-АТФазы  в мозге крыс при гиперинсулинизации (М±m).

Увеличение активности фермента при гипогликемии было найдено также и другими исследователями (Филиппов, 1991; Kaur, Arora, 1994). Нейрогликопения является фактором, приводящим к активации Na+,K+-АТФазы в мозге. Повышение активности фермента у животных, неоднократно перенесших гипогликемию, связано с увеличением синтеза белка-фермента. Гипогликемия приводит к увеличению продукции адренокортикотропного гормона и кортикостероидов (Bolli, Fanelli, 1999; Балаболкин, 2000), которые стимулируют синтез Na+,K+-АТФазы в мозге (Grillo et al., 1997). Увеличение активности Na+,K+-ATФазы также может быть вызвано обеспечением ее работы митохондриальным АТФ в условиях большего окисления кетоновых тел (Gribble et al., 2000; Gajewski  et al., 2003).

В состоянии собственно нейрогликопении можно предполагать другие механизмы увеличения активности Na+,K+-ATФазы  в мозге, а именно изменение скорости фосфорилирования-дефосфорилирования -субъединиц (Therien, Blostein, 2000; Kimura et al., 2007), дополнительную “сборку” молекул фермента из “внутриклеточных запасов” (Clausen, 2003), и/или изменение экспрессии регуляторных субъединиц семейства FXYD (Bguin et al., 2002; Dubyak, 2004).

5. Изменения уровня аминокислот и ферментов азотистого метаболизма в мозге крыс при неоднократной гипогликемии.

Направленность и выраженность изменений уровня исследованных аминокислот оказались практически одинаковыми у животных, подвергнутых однократной гипогликемии и у крыс, перенесших серию гипогликемических ком в состоянии последней гипогликемической комы (Рис.5). У животных 5-ой группы наблюдается уменьшение уровня аспартата в больших полушариях мозга (-10%, P<0.05) и ГАМК в стволе мозга (-29%, P<0.05). У крыс, 4-ой и 5-ой групп в больших полушариях мозга обнаружено уменьшение активности глутаматдекарбоксилазы на 11-12% (в обоих случаях P<0.01) (Табл.7).

У крыс, находящихся в состоянии 1-ой гипогликемической комы наблюдается снижение активности глутаминазы в больших полушариях и в стволе мозга (Табл. 7), изменения сохраняются и через 48 часов после купирования  комы. Аналогичные изменения обнаружены и в экспериментах с многократной гипогликемической комой. У животных 2-ой, 4-ой и 5-ой групп выявлено увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы в  мозге.

Уменьшение количества глутамата, аланина и ГАМК в мозге в состоянии гипогликемической комы является следствием снижения образования их из глюкозы и результатом использования этих аминокислот в качестве эндогенных  субстратов окисления. Увеличение содержания аспартата обусловлено уменьшением уровня восстановленности клеточных редокс-систем и снижением гликолитического потока при нейрогликопении (Auer, Siesjo, 1993; Daikhin, Yudkoff, 1998).

 

Рис. 5. Изменения уровней аминокислот в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию (M ± m).

Уменьшение количества аспартата в сочетании с увеличением активности аденозинмонофосфатдезаминазы в больших полушариях мозга крыс, перенесших гипогликемию неоднократно свидетельствует об активации непрямого дезаминирования аспартата в реакциях пуринового цикла, что неизбежно приводит к образованию свободного аммиака (Marynissen et al., 1992; Borza et al., 2003). Увеличение уровня аммиака в мозге  оказывает разнообразные неблагоприятные воздействия на метаболизм, гемоциркуляцию и синаптическую передачу и способно в конечном итоге приводить к повреждению и гибели клеток (Butterworth, 2002;  Rose et al., 2005, 2006). Уменьшение уровня аспартата в нервной ткани также может быть связано с увеличение окисления кетоновых тел мозгом (Yudkoff et al., 2001; Greene et al., 2003).

Таблица 7.

Активность ферментов азотистого метаболизма  в  мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию (M ± m)

Фермент

Отдел мозга

Группы экспериментальных животных

1

2

3

4

5

ГЛ-ДК

БПМ

14.3 ± 0.3

13.4 ± 0.4

14.4 ± 0.4

12.5 ±0.4**

12.7 ±0.4**

СМ

16.4 ± 1.0

15.7 ±1.3

15.9 ± 1.0

15.4 ± 0.9

16.5 ± 1.2

ГЛТ

БПМ

73.3±0.8

65.6±2.0**

67.1±1.3**

45.1±3.3***

49.4±3.2***

СМ

64.7±1.3

58.3±2.0*

63.4±1.9

56.8±3.0*

55.3±2.7*

ГДГ

БПМ

267±18

273±15

275±15

251±13

265±11

СМ

264±15

261±14

259±21

266±16

250±18

АМФ-Д

Митохондрии

БПМ

32.5±1.6

36.7±1.8

29.9±1.7

43.1±2.5**

39.6±1.9*

СМ

29.3±1.2

33.6±1.5*

28.5±1.6

38.3±1.9**

37.3±1.5**

АМФ-Д

Надосадок

БПМ

30.2±1.4

35.3±1.7*

34.1±1.8

40.4±1.8***

39.4±2.2**

СМ

28.5±1.1

34.2±1.4**

30.5±1.3

39.7±2.1***

41.3±2.5***

Примечание.  ГЛТ – глутаминаза, ГДГ – глутаматдегидрогеназа, ГЛ-ДК - глутаматдекарбоксилаза, АМФ-Д – аденозинмонофосфатдезаминаза. Активности ГЛТ, ГДГ и АМФ-Д выражены в нмоль / (мин · мг белка), ГЛ-ДК - в мкмоль / (ч · г ткани).

Увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы может приводить к уменьшению общего пула адениловых нуклеотидов, к снижению энергообеспечения и  нарушению межклеточных коммуникаций, обеспечиваемых нуклеотидами (Inoue et al., 2007). Образование и последующее окисление гипоксантина и ксантина в ксантиноксидазной реакции сопровождается продукцией супероксиданионрадикала (Desco et al., 2002) и тем самым способно стимулировать процессы перекисного окисления.  Окислительный стресс, в свою очередь, приводит к увеличению активности аденозинмонофосфатдезаминазы путем окисления SH-групп  в  молекуле фермента (Tavazzi et al., 2001).

Причинами обнаруженного в наших исследованиях уменьшения активности  глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы  могут быть значительные колебания уровня субстратов (глутамина, глутамата и аммиака) при гипогликемии и купировании гипогликемической комы (Rao, Murthy, 1993; Butterworth, 1998), а также повреждение ферментов в результате активации окислительного стресса. Указанные изменения могут  относиться именно к ГАМК-ергическим нейронам, поскольку эти нейроны обладают высокой фосфатзависимой глутаминазной активностью (Hogstag et al., 1988).  Независимо от конкретных механизмов, снижение активности глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы может иметь значение в уменьшении потенциальных возможностей глутамат- и ГАМК-ергической передачи в ЦНС в результате перенесенной гипогликемии, так как основным источником глутамата и ГАМК, освобождаемых нервными окончаниями, является глутамин (Sonnewald et al., 1993; Honegger et al., 2002).

6. Перекисное окисление липидов и связанные с ним реакции в мозге крыс при инсулиновой гипогликемии.

У крыс в состоянии 1-ой гипогликемической комы изменений в накоплении малонового диальдегида  в исследованных отделах мозга не выявлено. Активность супероксиддисмутазы снижалась в стволе мозга на 21% (P<0.001), активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и митохондриальной НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы была снижена в больших полушариях и в стволе мозга (на 9-12%, P<0.05). У крыс 3-ей группы изменений исследованных показателей не выявлено. У животных, перенесших серию гипогликемических ком, через 48 часов после купирования последней комы в стволе мозга обнаружено увеличение образования малонового диальдегида.

У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, наблюдалось уменьшение активности супероксиддисмутазы в больших полушариях мозга и в стволе мозга на 40-50% (P<0.05) (Табл.8). В обоих отделах мозга животных этой группы выявлено уменьшение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ, являющихся компонентами ферментативной антиоксидантной системы клеток. 

В стволе мозга экспериментальных животных, перенесших серию гипогликемических ком, активность нейтральных протеаз увеличивается на 20% (P<0.001), а кислых протеаз на 28% (P<0.01)  (Рис. 6).

Рис. 6. Активность протеаз в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию.

Таблица 8. 

Уровень  диеновых  коньюгатов (Е232 . 1000) /мг ткани, активность СОД (ЕД / мг белка),  НАДФ-зависимых дегидрогеназ нмоль/(мин · мг белка)  в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком,  через 48 часов после купирования последней комы (M ± m)

Показатель

Отдел мозга

Контроль

Опыт

ДК

БПМ

1.80 ± 0.13

1.41 ± 0.11*

2.55 ± 0.05

1.57 ± 0.12*

СОД

БПМ

210  ± 11  

102 ± 12*

СМ

220 ± 12  

135 ± 23*

Г6Ф-ДГ

БПМ

12.2 ± 0.3 

11.3 ± 0.2*

СМ

17.0 ± 0.4 

17.2 ± 0.5

ГР  цитоплазматическая фракция

БПМ

11.0 ± 0.2 

9.7 ± 0.3*

СМ

13.1 ± 0.7 

13.0 ± 0.6

НАДФ-ИЦДГ  цитоплазматическая фракция

БПМ

СМ

10.5 ± 0.3

13.1 ± 0.3

9.5 ± 0.3*

12.2 ± 0.2*

НАДФ-ИЦДГ  митохондриальная фракция

БПМ

16.6 ± 0.8  

16.5 ± 1.0

СМ

14.3 ± 1.8

9.0 ± 0.5*

НАДФ-МДГ, цитоплазматическая фракция

БПМ

6.8 ± 0.4

6.4 ± 0.3

СМ

10.3 ±  0.5

8.0 ± 0.4*

НАДФ-МДГ митохондриальная фракция

БПМ

33.6 ± 2.0 

31.8 ± 1.6

СМ

37.5 ± 1.6 

34.7 ± 1.7

Примечание. ДК – диеновые коньюгаты, СОД – супероксиддисмутаза, Г6Ф-ДГ – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, ГР – глутатионредуктаза, НАДФ-ИЦДГ и НАДФ-МДГ – соответственно никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимые изоцитрат- и малат-  дегидрогеназы.

У крыс, находящихся в состоянии гипогликемической комы, наблюдается уменьшение активности моноаминооксидазы (МАО) в больших полушариях мозга при использовании в качестве субстрата тирамина. Активность фермента в стволе мозга уменьшалась при использовании в качестве субстратов серотонина, тирамина и дофамина, и имела тенденцию к увеличению при инкубации с глюкозамином (Рис.7). На 2-е сутки после купирования 1-ой комы наблюдается уменьшение интенсивности образования аммиака при использовании в качестве субстратов МАО серотонина и тирамина. В то же время обнаружено увеличение моноаминооксидазной активности при использовании в качестве субстрата глюкозамина, в больших полушариях мозга в 2,2 раза, в стволе мозга в 2,7 раза.

У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, на 2е сутки после купирования последней комы в больших полушариях мозга уменьшается активность МАО при использовании в качестве субстрата тирамина; в стволе мозга снижается активность фермента при использовании в качестве субстрата серотонина, тирамина и дофамина (Рис.7). У животных этой экспериментальной группы наблюдается увеличение образования  аммиака при инкубации митохондриальных фракций, полученных из больших полушарий мозга и ствола мозга с  глюкозамином  соответственно в 2,6  и в 3,5 раза.


Рис. 7. Активность МАО при использовании различных субстратов фермента в мозге крыс при гипогликемии. 2 - крысы, находящиеся в состоянии гипогликемической комы, 3 - через 12 час после купирования гипогликемической комы глюкозой, 4 - через 48 часов после купирования комы и 5 - животные, перенесшие 7- 9 гипогликемических ком с интервалом 2 дня  на 2е сутки после купирования последней комы.

Увеличение скорости  накопления  малонового диальдегида  свидетельствует  об активации  процессов перекисного окисления липидов в мозге крыс,  неоднократно перенесших гипогликемию. Стимуляция перекисного окисления липидов при гипогликемии  связана не только с дефицитом энергии, нарушениями кальциевого гомеостаза и относительной гипероксией, но и с нарушением системы антиоксидантной защиты. Уменьшение активности супероксиддисмутазы в мозге крыс при гипогликемии, следует рассматривать как неблагоприятный фактор, способный в конечном итоге приводить к повреждению клеток мозга, поскольку токсичность кислорода связана, прежде всего, с  образованием супероксиданионрадикала (Lebovitz et al., 1996; Hinerfeld et al., 2004).

Выявленное в настоящем исследовании  уменьшение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ у крыс, подвергнутых гипогликемии, также может  быть связано с окислением сульфгидрильных групп белковой части молекул ферментов активными формами кислорода и азота (Halliwel, 1992; Gerlach et al, 1994). Увеличение активности протеаз также является результатом развития окислительного стресса, поскольку действие на геном продуктов перекисного окисления липидов приводит к индукции синтеза протеаз (Halliwel, 1992, 2006). Моноаминооксидаза обнаруживает высокую чувствительность к окислительному стрессу, которая выражается в снижении активности при использовании специфических субстратов и к расширению спектра относительной специфичности фермента (Горошинская и соавт.,  1999). Уменьшение активности МАО, продемонстрированное в настоящем исследовании, может быть результатом окислительного стресса и окисления сульфгидрильных групп активного центра фермента (Sablin, Ramsay, 1988; Hubalek et al., 2003).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В наших исследованиях не удалось выявить существенных изменений интенсивности гликолиза и активности ферментов цикла Кребса, активности ферментов азотистого метаболизма, показателей перекисного окисления и связанных с ним реакций в мозге крыс в состоянии однократной гипогликемической комы, в ранние сроки после купирования ее глюкозой и через 48 час после перенесенного воздействия. Восстановление субстратного обеспечения гликолиза и цикла Кребса и нормализация уровня аминокислот при купировании комы глюкозой свидетельствует о сохранности ферментных систем и их регуляции после перенесенной однократной гипогликемии. 

Изменения большинства исследованных показателей в печени и крови у экспериментальных животных в состоянии 1-ой гипогликемической комы вызваны непосредственным действием инсулина. При многократном воздействии высоких доз инсулина метаболическая реакция на введение гормона обусловлена активацией контринсулярного аппарата в ответ на гипогликемию. Такая реакция проявляется в увеличении уровня свободных жирных кислот и сохранении высокого уровня кетоновых тел в крови,  существенном повышении содержания мочевины в крови и активности глутаминазы, глутаматдегидрогеназы, аминотрансфераз в печени,  увеличении активности  протеаз в печени и скелетной мышце. Таким образом, неоднократно перенесенная гипогликемия представляет собою стрессорное воздействие  и  вызывает комплекс патохимических изменений, сходный с таковым при сахарном диабете.

У животных, неоднократно перенесших гипогликемию, в мозге выявлена активация процессов перекисного окисления и нарушения системы антиоксидантной защиты: увеличение уровня малонового диальдегида, снижение активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы, а также ферментов продуцирующих восстановленную форму НАДФ. Свидетельствами активации процессов перекисного окисления являются также увеличение активности протеаз и изменения субстратной специфичности МАО в мозге этих животных.

Выявленные изменения не только являются следствием и свидетельством развития окислительного стресса, но и способствуют дальнейшей активации перекисного окисления. Уменьшение активности НАДФН-продуцирующих дегидрогеназ и глутатионредуктазы приводит к нарушению обезвреживания активных форм кислорода. Увеличение их образования является вероятной причиной изменения активности ферментов. Повреждение МАО приводит к расширению спектра ее субстратной специфичности. Окисление МАО веществ, в норме не являющихся ее субстратами, ведет к увеличению продукции активных форм кислорода и дальнейшей активации процессов перекисного окисления, ускорению катаболизма компонентов клеточных мембран, а также к дополнительному образованию аммиака в нервной ткани. Окислительное повреждение аденозинмонофосфатдезаминазы обусловливает увеличение ее активности и, как следствие –  увеличение непрямого дезаминирования аспартата, снижение содержания аспартата и субстратного обеспечения малат-аспартатного шунта в мозге, увеличение образования  аммиака в нервной ткани,  катаболизма пуриновых нуклеотидов   и дальнейшую продукцию  активных форм кислорода в ксантиноксидазной реакции. Активация процессов перекисного окисления является вероятной причиной уменьшения интенсивности гликолиза и гликогенолиза,  активности НАДН-дегидрогеназы и активности α–кетоглутаратдегидрогеназы, глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы в мозге. Нарушения энергообеспечения, в свою очередь, способствуют развитию окислительного повреждения клеток.

Механизмы повреждения нейронов при гипогликемии имеют эксайтотоксическую природу. Угнетение энергопродукции, особенно гликолитической, является фактором, способствующим повреждению нейронов. К нарушениям, возникающим на уровне клетки, относятся изменения уровня субстратов и активности ферментов энергетического обмена в мозге и активация процессов перекисного окисления, вызываемые неоднократно перенесенной нейрогликопенией. Ряд выявленных изменений может быть связан с нарушениями, возникающими на уровне нейронных цепей. К последним можно отнести уменьшение активности глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы в больших полушариях и снижение уровня ГАМК в стволе мозга. Такие изменения могут быть связаны с повреждением нейронов базальных ганглиев и сокращением медиаторного пула ГАМК, выделяющегося окончаниями стрио- и паллидонигральных путей. Высокая уязвимость структур ствола мозга к повреждению при гипогликемии, связана с большим содержанием в них липидов и большим количеством ионов железа, накапливаемых меланином дофаминергических нейронов и освобождаемых при неблагоприятных воздействиях на мозг. Угнетение ГАМК-ергических тормозных воздействий на структуры ствола мозга также способно приводить к  повреждению нейронов  и явится одной из причин больших нарушений метаболизма в этом  отделе мозга, выявленных в настоящем исследовании.

Изменения ряда показателей позволяют также высказать предположение о возможной метаболической адаптации мозга к возобновляющейся нейро-гликопении. Периодически возникающая гипогликемия в условиях высокого уровня  кетоновых тел в крови способна приводить к уменьшению экспрессии генов гликолитических ферментов, увеличению экспрессии генов ферментов цикла Кребса и Na+,K+-ATPазы и к изменениям экспрессии генов транспортеров глюкозы и кетоновых тел через гематоэнцефалический барьер (Greene et al., 2003). У животных, неоднократно перенесших гипогликемию, содержание кетоновых тел и свободных жирных кислот в крови в состоянии гипогликемической комы поддерживалось на высоком уровне, в мозге уменьшалась интенсивность гликолиза и гликогенолиза и сохранялся высокий уровень гликогена, увеличивалась активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы и активность Na+,K+-ATPазы. С учетом  литературных данных, такие изменения можно интерпретировать  и как свидетельства увеличения окисления кетоновых тел мозгом  животных, неоднократно перенесших инсулиновую гипогликемию.

Изменения метаболизма, наблюдаемые в головном мозге животных, неоднократно перенесших гипогликемию, по-видимому, являются следствием  “суммирования неблагоприятных изменений”, в значительной мере обусловлены повреждениями, возникшим в результате предшествующего воздействия и снижающими толерантность к последующему  неблагоприятному воздействию. Гипогликемическая кома в клинике внутренних болезней часто неоднократно  наблюдается у больных сахарным диабетом. В этом случае патогенное воздействие (гипогликемическая кома) развивается у пациентов, a priori имеющих нарушения  метаболизма, связанные с основным заболеванием. В экспериментах,  выполненных на крысах с аллоксановым диабетом, уже однократная гипогликемия приводила к уменьшению интенсивности гликолиза и гликогенолиза в мозге. При этом в стволе мозга наблюдалось уменьшение активности окислительных ферментов.

В целом изменения метаболизма, выявленные в головном мозге животных, неоднократно перенесших гипогликемию, имеют неблагоприятный характер. Основной причиной таких изменений является возобновляющаяся нейрогликопения. Совокупность их складывается в комплекс, характеризующий повреждение  нервных клеток при патогенном воздействии, включающий в себя нарушения энергетического обмена, метаболизма медиаторных аминокислот и активацию процессов перекисного окисления липидов.

ВЫВОДЫ

1. Нарушения энергетического обмена и метаболизма нейромедиаторных аминокислот в мозге, возникающие в состоянии однократной гипогликемии имеют в целом обратимый характер. Большинство выявленных изменений нормализуется через 30 мин после купирования гипогликемической комы глюкозой. Изменений активности ферментных систем гликолиза, цикла Кребса и ГАМК-шунта в состоянии гипогликемической комы, в ранние сроки восстановительного периода и через 48 часов после купирования однократной комы глюкозой не выявлено.

2. У животных, неоднократно перенесших тяжелую гипогликемию, наблюдаются снижение интенсивности гликолиза и гликогенолиза, активности α-кетоглутаратдегидрогеназы  и НАДН-дегидрогеназы  в больших полушариях и в стволе мозга. Выявленные изменения  свидетельствуют о нарушении процессов энергопродукции в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком.

3. Нарушения распада гликогена в стволовых структурах мозга у животных, многократно подвергнутых воздействию гипогликемических доз инсулина, сохраняются длительное время после купирования гипогликемической комы. Такие изменения могут быть результатом развития окислительного стресса  и иметь существенное значение в механизмах возникновения и развития постгипогликемической энцефалопатии.

4. Увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы в больших полушариях и в стволе мозга и уменьшение количества аспартата в больших полушариях мозга животных, неоднократно перенесших гипогликемию, свидетельствует об активации цикла пуриновых нуклеотидов, что способствует увеличению образования  аммиака в нервной ткани,  катаболизма пуриновых нуклеотидов и  продукции активных форм кислорода, нарушает субстратное обеспечение малат-аспартатного шунта в мозге. Уменьшение активности глутаминазы указывает на снижение  потенциальных возможностей глутаматергической передачи в мозге. Уменьшение активности глутаматдекарбоксилазы в больших полушариях мозга и уровня ГАМК в стволе мозга свидетельствует о нарушении ГАМК-ергических тормозных воздействий на структуры ствола мозга.

5. Многократное воздействие гипогликемических доз инсулина  приводит к активации процессов перекисного окисления липидов,  увеличению активности протеаз,  снижению активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ и к изменению субстратной специфичности моноаминооксидазы в мозге.

6. Нарушения энергетического обмена, метаболизма медиаторных аминокислот и  активация процессов перекисного окисления липидов, вызываемые неоднократно перенесенной нейрогликопенией, более  выражены  в  стволовых структурах мозга.

7. Общая метаболическая реакция на многократное воздействие высоких доз инсулина обусловлена активацией контринсулярного аппарата и свидетельствует об увеличении катаболизма белков и липидов и стимуляции глюконеогенеза в печени.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК.

1. Телушкин П.К., Потапов П.П. Интенсивность гликолиза и активность ферментов энергетического обмена в мозге  крыс  при многократном  воздействии  гипогликемических  доз  инсулина // Пробл. эндокринологии. 1994. Т.40.  № 5. С.53-54.

2. Телушкин П.К., Потапов П.П. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ и уровень восстановленности пиридиновых нуклеотидов  в мозге крыс при инсулиновой гипогликемии и в восстановительном периоде // Вопр. мед. химии. 1995. Т. 41. № 3. С.26-28.

3. Телушкин П.К., Шидловская Т.Е. Активность ферментов и содержание субстратов ГАМК-шунта в мозге крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Вопр.  мед.  химии. 1996. Т. 42. № 4. С.306-308.

4. Телушкин П.К. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов, активность НАДФ-зависимых  дегидрогеназ и протеаз в мозге крыс при многократном введении инсулина // Пробл. эндокринологии. 1998. Т. 44. № 3. С. 35-38.

5. Телушкин П.К. Глутамат и перекисное окисление в патогенезе заболеваний ЦНС // Вопр.  мед.  химии. 1998. Т. 44. № 6. C. 520-526.

6. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д. Гипогликемия и мозг: метаболизм и механизмы повреждения нейронов // Успехи физиол. наук. 1999. Т. 30. № 4. С. 14-27.

7. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П. Активность ферментов дезаминирования в мозге крыс в восстановительном периоде после инсулиновой гипогликемии // Пробл. эндокринологии. 2001.  Т. № 5. С. 43-45.

8. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П., Лучкин А.А. Гликолиз в головном мозге крыс, подвергнутых одно- и многократной гиперинсулинизации // Вестн. С-Петербургского университета. Сер. 3. 2004. № 3. С. 50-54.

9. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П., Медведева Н.Б., Стельмах А.Ю. Гликолиз и активность окислительных ферментов в головном мозге крыс при инсулиновой гипогликемии на фоне аллоксанового диабета // Бюл. эксперим. биол. мед. 2005. Т.140. № 12. С.647-649.

10. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П., Медведева Н.Б. Показатели метаболизма у крыс при многократной инсулиновой гипогликемии // Пробл. эндокринологии.  2006. Т.52. № 5. С. 45-47.

11. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П. Изменение энергетического обмена и повреждение нервных клеток у крыс при многократном введении высоких доз инсулина // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2006. Т. 42. № 2. С. 125-129.

12. Потапов П.П., Стельмах А.Ю., Телушкин П.К., Медведева Н.Б. Изменения показателей энергетического обмена в сердце крыс при аллоксановом диабете и инсулиновой гипогликемии // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 2007. № 1. С. 24-26.

13. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П. Показатели энергетического и азотистого обмена у крыс при инсулиновой гипогликемии // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 3. С. 324-332.

14. Ноздрачев А.Д., Телушкин П.К. Активность глюкозо-6-фосфатазы в печени и уровень свободных жирных кислот в крови у крыс при инсулиновой гипогликемии //  Доклады АН. 2008. Т. 422. № 2. С. 268-269.

Статьи в научных журналах и сборниках, тезисы докладов.

1. Телушкин П.К., Филиппов С.П., Шидловская Т.Е.  Особенности обмена в мозге крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Мат. науч. конф. “Физиологические механизмы развития экстремальных состояний ”. СПб, “Наука”. 1995. С.82.

2. Телушкин П.К., Потапов П.П., Шидловская Т.Е. Изменения обмена в различных отделах мозга крыс, вызываемые многократным воздействием гипогликемии // Первый российский конгресс по патофизиологии с международным участием  “Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы”. М., 1996. С. 308.

3. Телушкин П.К. Активность супероксиддисмутазы в тканях крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Мат. науч. конф. “Состояние и перспективы современного лекарствоведения”. Ярославль, 1997. С. 203.

4.  Телушкин П.К., Шидловская Т.Е., Редько С.Ф. Неоднократная гипогликемия как стрессорное воздействие // Cб. “Современные проблемы естествознания”. Ярославль, 1997. С. 29-30.

5. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Филиппов С.П. Активность ферментов энергетического обмена в мозге крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Труды науч. конф. “Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии”, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова. СПб. 1998. С. 320-323.

6. Telushkin P.K., Nozdrachev A.D. Metabolism alteration in the rat brain during repeated hypoglycemic doses of  insulin exposure // J. Neurochem. 1998. V. 71. (Suppl.). S80D.

7. Неополитанский В.Ю., Телушкин П.К., Панченко К.И. Темные нейроны головного мозга крыс, неоднократно перенесших гипогликемию // Мат. Науч. Конф. “Актуальные вопросы общей и военной патологической анатомии”, посвященной 140-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии. СПб. 1999. С. 109.

8.  Потапов П.П., Телушкин П.К., Шидловская Т.Е., Лучкин А.А., Ноздрачев А.Д. Показатели азотистого метаболизма у крыс при воздействии высоких доз инсулина // Сб. “55 лет Ярославской государственной медицинской академии”. Ярославль, ЯГМА, 1999. С. 109-112.

9. Потапов П.П., Телушкин П.К., Лучкин А.А. Интегральные показатели метаболизма у крыс при многократном введении высоких доз инсулина // Сб. “Современные проблемы фармакогнозии и фитотерапии”. Ярославль, 1999. С.141-145.

10. Телушкин П.К., Потапов П.П. Резистентность клеток нервной ткани при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Там же. С. 145-148.

11.  Потапов П.П., Лучкин А.А., Телушкин П.К. Активность ферментов азотистого обмена у крыс при гиперинсулинизации //Труды Всероссийской конф. “Проблемы медицинской энзимологии”. Международный симпозиум “Пиридоксальзависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина”. М., “Авиаиздат”. 2002. С. 173-174.

12. Телушкин П.К., Потапов П.П. Неоднократно перенесенная гипогликемия вызывает метаболический стресс в нервной ткани // Там же. С.200 – 201.

13. Телушкин П.К., Медведева Н.Б., Потапов П.П., Стельмах А.Ю. Интенсивность гликолиза и активность некоторых окислительных ферментов в головном мозге крыс при инсулиновой гипогликемии на фоне аллоксанового диабета // Мат. Всероссийской конф. “Механизмы синаптической передачи” М.: Изд-во Икар, 2004. С. 92.

14.  Стельмах А.Ю., Медведева Н.Б., Потапов П.П., Телушкин П.К., Шидловская Т.Е. Уровень метаболитов в крови и активность ферментов азотистого обмена в сердце при гипогликемии //  Мат. 5-ой науч.-практ. конф. с международным участием “Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины” Астрахань-Волгоград-Москва, Изд-во АГМА, 2006. С. 151-155.

15. Потапов П.П., Стельмах А.Ю., Телушкин П.К., Медведева Н.Б. Изменения некоторых показателей энергетического обмена в сердце крыс при инсулиновой гипогликемии // Биомедицинская химия. 2006. Т. 52. № 6. С. 615-619.

16. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П. Глутамат,  аспартат, ГАМК, аланин и связанные с ними реакции в мозге крыс в восстановительном периоде после инсулиновой гипогликемии  // Тез. докл. IV съезда биохимиков и молекулярных биологов с международным участием. Новосибирск, 2008. С. 446.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГАМК – гамма-аминомасляная кислота

МАО – моноаминооксидаза

НАД, НАДН – никотинамидадениндинуклеотид, соответственно окисленная и восстановленная форма

НАДФ, НАДФН – никотинамидадениндинуклеотидфосфат, соответственно окисленная и восстановленная форма







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.