WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Терентюк Георгий Сергеевич

Иммунологическая реактивность

при экспериментальном воздействии

лазерной гипертермии С наночастицами

на опухолевые ткани

16.00.02  - патология, онкология и морфология животных

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

Ульяновск - 2009

Работа выполнена на кафедре оптики и биомедицинской физики в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

Хайруллин Радик Магзинурович

доктор физико-математических наук, профессор

Максимова Ирина Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор биологический наук, профессор

Сыч Виталий Федорович

доктор ветеринарных наук, профессор

Селезнёв Сергей Борисович

доктор биологических наук, профессор

Потапенко Александр Яковлевич

Ведущая организация:

ГУ Российский Онкологический Научный Центр им. Н.Н.Блохина РАМН

Защита состоится «11» июня 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет по адресу:  Набережная реки Свияги, 106, корпус 1, аудитория 703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета.

Отзывы на реферат направлять по адресу: 432000, г. Ульяновск, ул. Л.Толстого, 42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований.

Автореферат разослан «__» __________ 2009 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент

С.В. Пантелеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема иммунологической реактивности организмов при опухолевом росте остаётся одной из важнейших научных проблем в современной биологии. Вопрос о том, почему на фоне достаточной иммунологической реактивности возникают и растут опухолевые клетки, резко отличающиеся по своим морфологическим и функциональным параметрам, способные не только подавлять, но и стимулировать иммунологические свойства организма, является не только центральным вопросом иммунобиологии и экспериментальной онкологии, но и биологии развития, молекулярной биологии и генетики (Аничков Н.М., 2004).

Иммунобиологические исследования взаимодействия организмов с опухолевыми клетками и тканями показывают, что определяющим фактором в предупреждении возникновения и развития, в эффективной элиминации опухолевых клеток является стимуляция как специфических, так и неспецифических защитных систем организма и иммунитета в целом. Такая стимуляция предполагает воздействие на все компоненты противоопухолевой системы, в том числе - блокирование поздних этапов развития опухоли для предупреждения распространения опухолевых клеток в организме и возникновения вторичного опухолевого роста (Якубовская Р.И., 2000). Несмотря на значительные успехи экспериментальной онкологии и молекулярной биологии, проблемы стимуляции иммунитета при опухолевом росте не решены. Опухолевый рост является системным иммунобиологическим процессом, поражающим весь организм, все звенья его иммуногенетической и нейроэндокринной регуляции, поэтому проблема стимуляции иммунитета и изучения взаимоотношений в системе «организм-опухоль» важна не только в плане предотвращения потенциального опухолевого роста, но и с точки зрения изучения динамики развития этих процессов, особенно на поздних этапах опухолевого процесса (Барышников А.Ю., 2003). Взаимоотношение опухоли с иммунной системой организма имеет два аспекта – специфический, ассоциированный преимущественно с цитотоксическими лимфоцитами, и неспецифический, определяемый как часть системного взаимодействия опухоли и организма. Системные иммунобиологические процессы при опухолевом росте достаточно сложны и трудно поддаются тривиальному анализу.

       Большая вариабельность различных показателей состояния иммунной системы не позволяет достаточно четко определить состояние иммунологической недостаточности при опухолевом росте (Лебедев К.А., 1990, Абелев Г.И., 1999). Проблема описания и прогнозирования системных взаимоотношений между организмом и опухолью может быть решена на основе биоинформационного моделирования. В основу адекватной математической модели взаимодействия опухоль-иммунитет должны быть заложены экспериментальные параметры, для которых существуют хорошо отработанные, воспроизводимые методы определения состояния иммунологической реактивности. Не последнюю роль в обеспечении адекватной иммунологической реактивности в отношении опухолевого роста играет эндокринная система. Ряд гормонов является одним из важнейших звеньев регуляции иммунореактивности организма и может вызывать как иммуносупрессию и стимуляцию роста опухолевых тканей, так и его подавление. В современной экспериментальной онкологии отсутствуют эффективные информационные модели, отражающие максимально возможный спектр разнонаправленных взаимодействий иммунной и эндокринных систем в динамике опухолевого роста.

Традиционными направлениями экспериментальной онкологии и биологии противоопухолевых защитных систем организма является их стимуляция с помощью фармакологических агентов, естественных механизмов и продуктов жизнедеятельности иммунокомпетентных клеток (Sauter B. et al., 2000), интерферонов (Gao Y. et al., 2003), лимфокинов (Ridolfi R. et al., 2002), направленной лимфоцитарно-клеточной и генной терапии (Rodriguez-Lecompte J.C. et al., 2004). Иммуномодулирующие эффекты биофизических методов воздействия на опухолевые ткани практически не исследованы. В этом смысле наиболее перспективными представляются методы лазериндуцированной гипертермии, при которых возможно не только разрушение опухолевой ткани, но и стимуляция апоптоза (Toyota N. et al., 1998, Sapozhnikov A.M. et al., 1999, Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002), системных и локальных механизмов иммунного ответа (Chen W.R. et al., 2004). Существенно повысить их эффективность позволяет использование золотых плазмонно-резонансных наночастиц, селективно накапливающихся в опухолевой ткани (Khlebtsov N.G. et al., 2004, Bernardi R.J. et al., 2008, Huff T.B. et al., 2007, Visaria R. et al., 2007). Селективное накопление наночастиц в опухоли обусловлено повышенной васкуляризацией и проницаемостью эндотелия кровеносных сосудов и капилляров опухоли. Фенестрация эндотелия, обилие трансэндотелиальных каналов, неполноценность или отсутствие базальной мембраны эндотелия, дисфункции лимфатической системы приводят к пассивному накоплению в опухолевой ткани наночастиц, введённых в системный кровоток. Биологические особенности воздействия золотых наночастиц на организм и иммунологическая реактивность при лазерной гипертермии биотканей с их использованием не изучены.

Цель исследования установить закономерности иммуномодулирующих эффектов и тканевых реакций при управляемой локальной лазерной гипертермии опухолей с использованием золотых плазмонно-резонансных наночастиц.

Задачи исследования:

- определить статистические закономерности возникновения, динамику развития и гистологические типы наиболее часто встречающихся спонтанных опухолей у экспериментальных животных;

- создать базу данных основных параметров иммунитета и уровня гормонов в динамике развития спонтанного опухолевого процесса, эффективных для построения нейросетевого классификатора;

- установить основные тканевые и иммуномодулирующие эффекты локальной лазерной гипертермии поверхностных тканей у животных с использованием золотых плазмонно-резонансных наночастиц;

- установить тканевые и иммуномодулирующие эффекты золотых плазмонно-резонансных наночастиц при их системном введении и локальной лазерной гипертермии тканей спонтанных и перевитых опухолей животных;

- разработать биоинформационную модель биологической системы «иммунитет-опухоль» при экспериментальной системной и локальной иммуномодуляции.

Основные положения, выносимые на защиту:

       1. Экспериментальный управляемый локальный лазерный термолиз опухолевых тканей у животных с использованием золотых плазмонно-резонансных наночастиц оказывает системные иммуномодулирующие эффекты.

2. Использование золотых нанооболочек при локальной лазерной гипертермии биотканей позволяет увеличить скорость нагрева и сократить время выхода на стационарный управляемый температурный режим до 100 сек. Динамика температуры биотканей при локальной лазерной гипертермии in vivo с золотыми наночастицами имеет характерные особенности, обусловленные эффектами терморегуляции.

       3. Биологические тканевые реакции при системном введении золотых наночастиц зависят от их размера: максимально накапливаются в тканях частицы диаметром 160 нм, а наиболее значительные морфологические изменения в органах наблюдаются для частиц диаметром 50 нм. Уменьшение концентрации золота в крови экспериментальных животных происходит нелинейно, зависимость концентрации от времени может быть аппроксимирована экспоненциальным законом.

4. Биоинформационная модель описания нелинейной динамики взаимодействия «иммунная система-опухоль» с учетом внешнего воздействия и нейросетевой подход к оценке состояния экспериментальных животных являются эффективными методами анализа иммунологической реактивности.

Настоящее диссертационное исследование выполнено при поддержке РФФИ (грант № 07-02-01434 «Теоретическое и экспериментальное исследование контрастирования новообразований в биотканях при низкокогерентной оптической томографии с помощью золотых наночастиц») и Министерства науки и инноваций РФ (госконтракт № 02.512.11.2034 «Разработка нанотехнологии лазерного селективного фототермолиза и контрастирования злокачественных новообразований на основе использования плазмонно-резонансных наночастиц»).

Научная новизна исследования состоит в том, что впервые на основе репрезентативного объёма рандомизированных наблюдений определены статистические закономерности по частоте возникновения и органному распределению спонтанных опухолей эпителиальной тканевой природы, их патоморфологическая характеристика и пролиферативные свойства в длительном эксперименте, установлена закономерная динамика параметров общего иммунитета, биохимических показателей и уровня гормонов в организме животных. На основе полученной базы данных выявлены наиболее эффективные параметры иммунологической реактивности в динамике развития спонтанного опухолевого процесса, реализовано обучение нейросетевого классификатора и построение нелинейной биоинформационной модели взаимодействия «иммунная система организма - опухоль», выявлены основные биологические закономерности взаимоотношения опухоли с иммунной системой организма, необходимые для построения адекватной математической модели. Автором проведен анализ требований к математической модели коррекции противоопухолевого иммунодефицита и впервые, на основе предложенной математической модели, получены фазовые портреты систем, описывающие динамику количества опухолевых клеток в организме животного, противоопухолевых антител и концентрации интерлейкина-2 при лазерной гипертермии. Впервые на примере опухолей эпителиальной природы с различной степенью антигенности и скоростью пролиферации реализованы различные сценарии динамики исследуемой системы «иммунитет - опухоль» при иммуномодуляции с использованием фармакологических агентов и лазерной гипертермии. Впервые установлены биологические закономерности распределения в организме экспериментальных животных золотых наночастиц в различных тканях и органах и определены биофизические аспекты их действия при лазерной гипертермии. Показано, что при системном введении золотых наночастиц в организм экспериментальных животных, пораженных опухолевым процессом, наблюдается статистически значимое более высокое пассивное накопление наночастиц в опухолевых тканях по сравнению с неизменёнными, а временная динамика повышения их концентрации в опухолевой ткани имеет два выраженных максимума. Впервые с использованием разработанной биоинформационной модели установлен иммуномодулирующий эффект золотых наночастиц при их введении в системный кровоток экспериментальных животных и усиление элиминирующего воздействия локальной лазерной гипертермии на опухоли эпителиальной тканевой природы.

       Научно-практическая значимость. Полученные в работе результаты численного моделирования пространственного распределения температуры и экспериментальные термограммы модельных объектов и реальных биологических тканей in vivo при различной глубине локализации золотых плазмонно-резонансных наночастиц и различных режимах лазерного воздействия необходимы для разработки методов лазерного фототермолиза и определения его системных и локальных тканевых биологических эффектов. Результаты проведенных модельных экспериментов позволяют оценить, на какой максимальной глубине залегания области повышенной концентрации наночастиц можно добиться существенной величины поглощенной энергии, достаточной для повышения в этой области температуры на заданную величину, и указывают направление развития и совершенствования лазерных технологий и приборов, используемых в биологии и медицине. Исследования системных и локальных тканевых биологических реакций при лазерной гипертермии на экспериментальных животных, включая лазерную гипертермию с использованием золотых наночастиц, могут быть положены в основу создания новых методов малоинвазивного лечения поверхностных опухолевых заболеваний эпителиальной природы животных и человека. Разработанная автором методика проведения термографических исследований у животных с использованием компьютерного моделирования является эффективным инструментом в оценке различных физиологических и патологических процессов в биологических экспериментах. Разработанная автором биоинформационная модель нелинейного взаимодействия иммунной системы экспериментальных животных с опухолями эпителиальной природы является математической основой для построения адекватных моделей развития пролиферативных процессов и оценки иммуномодулирующих воздействий биологических, фармакологических, и биофизических агентов в экспериментальной иммунологии, онкологии и патологии животных.

Личный вклад автора в работах, выполненных в соавторстве, состоит в обосновании и разработке концептуальной модели исследования, проведении экспериментальных исследований, обобщении результатов и формулировании выводов. Автором лично проведены экспериментальные работы в рамках выполнения гранта РФФИ и Госконтракта Министерства науки и инноваций. Использованные в исследовании золотые наночастицы синтезированны в лаборатории биосенсоров и наноразмерных структур ИБФРМ РАН (рук-ль - д.ф.-м.н. проф. Н.Г. Хлебцов), электронно-микроскопические фотографии получены в лаборатории электронной микроскопии НИИ «Микроб» (рук-ль - к.б.н. Н.П. Коннов), измерения на атомно-абсорбционном микроскопе проводились в Центральной лаборатории ООО «Саратоворгсинтез» (рук-ль - д.х.н., проф. А.В. Шантроха), разработка математического обеспечения для компьютерного моделирования светорассеяния в биотканях и численного анализа дифференциальных уравнений выполнялась в ГОУ ВПО Саратовский государственный университет на кафедре оптики и биомедицинской физики (рук-ль - д.ф.-м.н. проф. В.В. Тучин) и кафедре нелинейной физики (рук-ль - член-корр РАН д.ф.-м.н. проф. Д.И. Трубецков), гистологические препараты изготовлены на кафедре патологической анатомии ГОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет Росздрава РФ (зав. кафедрой - д.м.н. проф. Г.Н. Маслякова).

Внедрение результатов исследования. Материалы диссертации используются при проведении научных исследований в ИБФРМ РАН, НИИ естественных наук ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» Федерального агентства по образованию РФ, а также в учебном процессе этого учреждения на кафедре биохимии и биофизики биологического факультета, на кафедре оптики и биомедицинской физики физического факультета при чтении спецкурсов по дисциплинам «биофизика» и «лазерные методы в медицине» для студентов специальностей «биохимическая физика» и «медицинская физика». Материалы диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре патологической анатомии ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет» Росздрава РФ при обучении студентов специальности «лечебное дело» и клинических ординаторов по дисциплине «патологическая анатомия». По материалам диссертационного исследования изданы пособия «Практические рекомендации по иммуноферментной диагностике онкологических заболеваний органов размножения у животных» (2005), «Применение метода клинической цитологии в ветеринарной практике» (2006), утвержденные секцией «Патологии, фармакологии и терапии животных» ОВМ РАСХН в качестве научно-практических рекомендаций.

В процессе выполнения диссертационного исследования разработаны оригинальные методики в области экспериментальной онкологии, защищенные действующими патентами РФ: на изобретение № 2298421 (2005) «Способ дренирования области удаленного подмышечного лимфоузла у собак при мастэктомии первой пары молочных желез с лимфанодэктомией», на изобретение № 2299738 (2005) «Способ лечения остеолизиса при метастазировании злокачественного образования в кости у собак», на изобретение № 2320293 (2006) «Способ коррекции иммунной недостаточности при лечении верифицированных форм рака молочной железы и меланомы собак», на изобретение № 2338472 (2007) «Способ овариогистерэктомии при раке левого яичника с экстирпацией метастаз из забрюшинного пространства у животных», на изобретение № 2329074 (2008) «Способ лазерной деструкции меланомы слизистой оболочки у собак», на изобретение №2342102 (2007) «Способ расширенной мастэктомии пятой молочной железы с первичной опухолью при наличии метастазов в поверхностный паховый лимфоузел у собак».

Апробация работы. Результаты диссертационного исследования доложены на II Троицкой конференции "Медицинская физика и инновации в медицине” (Троицк, 2006), II Всероссийской конференции по вопросам онкологии и анестезиологии мелких домашних животных (Москва, 2006), VI Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина: современные проблемы и перспективы развития (Саратов, 2006), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики, терапии и профилактики болезней домашних животных» (Воронеж, 2006), Full Meeting «Optical Technologies in Biophysics and Medicine» (Саратов, 2006, 2007, 2008), «27-th Annual Conference ASLMS» (Грапевайн, Техас, США, 2007), «International Congress of Toxicology ICT XI» (Монреаль, Канада, 2007), «Congress Optics and Photonics» (Сан Диего, США, 2007), XVI Московском международном ветеринарном Конгрессе (Москва, 2008), «Photonics West BiOS «Complex Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics V» (Сан Хосе, Калифорния, США, 2008), «BiOS 2008 - Plasmonics in Biology and Medicine V» (Сан Хосе, Калифорния, США, 2008), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008), Международной научно-технической конференции «Актуальные проблемы электронного машиностроения» (Саратов, 2008), V Съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008), «Photonics life 4 European network of excellence for Biophotonic» (Брюссель, Бельгия, 2008), «PIBM 2008 - 7th International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine» (Ухань, Китай, 2008), «Нанотехнологии в онкологии - 2008» (Москва, 2008).

       

Публикации. Основные результаты исследования, выводы и положения диссертации опубликованы в 52 научных работах, из них 11 – в отечественных и иностранных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 6 - являются патентами РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 312 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, включающих 7 разделов, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 77 отечественных и 308 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 103 рисунками.

содержание работы

Объекты и методы исследования. Исследования были выполнены на следующих лабораторных животных: белых лабораторных крысах массой 130-240 г, белых лабораторных мышах массой 18-22 г, кроликах массой 2700-3000 г, а также на здоровых собаках и собаках с различными видами спонтанных новообразований. При проведении экспериментальных исследований на собаках не использовались методы, наносящие вред организму животных. Проведение исследований осуществлялось согласно протоколу исследований, утвержденному Комитетом по этике ГОУ ВПО Саратовского государственного медицинского университета Росздрава РФ (протокол № 13 от 10 апреля 2007 г.) и не противоречат Женевской Конвенции 1985 г. о “Международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных”. Культура опухолевых клеток для трансплантации была получена в ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН. Общее представление об объёме проведённых исследований даёт табл. 1, в которой отражены основные объекты и методы исследования.

Таблица 1

Методы исследования

крысы

мыши

кролики

Собаки различных пород

Итого объектов на метод исследования

здоровые

со спонтан. опухолями

Иммуноферментные

методы

80

200

28

687

995

Иммуногистохимичес-кие методы

30

30

60

Трансплантация опухолевых клеток

200

200

Цитологические

методы

3146*

3146*

Гистологические

методы

360

17

493

870

Темнопольная микроскопия

360

17

87

464

Электронная микроскопия

10

23

33

Гематологические

методы

36

28

687

751

Атомно-абсорбционный спектральный анализ

240

17

257

Спектроскопия диф. светорассеивания

12

12

Лазерная

гипертермия

220

52

272

Формирование баз данных и верификация рез-в мат. моделирован.

16

170

186

Число объектов общего статистического анализа

360

200

17

28

3146*

7246

Итого животных

360

200

17

28

687

1292

Примечание: *) – цитологические препараты.

Используемые в работе сплошные золотые наночастицы диаметром 15 нм и 50 нм имеют максимум экстинкции в области 520 нм, оптические свойства таких частиц характеризуются сильным поглощением и слабым рассеянием. Для проведения лазерного фототермолиза применялись золотые нанооболочки с параметрами 140 нм/20 нм, имеющие максимум экстинкции в области 810 нм, что соответствует оптическому окну прозрачности биологических тканей. Определение иммунологического статуса экспериментальных животных проводилось на автоматическом анализаторе «Simens System 340 b DNA». Иммунологическое определение концентрации гормонов проводились на иммунодиагностическом анализаторе произвольного доступа «Centaur CP», производства фирмы "Siemens» (ФРГ). Используемый метод детекции – прямая хемилюминесценция. Количественное определение паранормальных белков проводилось методом иммунотурбидиметрии, основанном на регистрации протекающей в жидкой среде реакции «антиген-антитело», сопровождающейся образованием соответствующего преципитата с использованием реактивов и контрольных препаратов фирмы «Diasys» производства (ФРГ). Исследования проводились в статическом или кинетическом режимах в зависимости от скорости реакции. Гистологические исследования проводились по стандартной методике. Апоптоз и пролиферативную активность исследуемых опухолевых клеток определяли иммуногистохимическим методом и с помощью электронной микроскопии.Получение биоптатов тканей и клеточных препаратов у животных выполнялись по разработанной автором методике (Терентюк Г.С., 2006). Для микроскопии цитологических препаратов использовалась стандартная световая микроскопия в необходимых увеличениях, а гистологических препаратов – дополнительно к световой - темнопольная микроскопия и электронная микроскопия. Препараты исследовались на электронном микроскопе «Hitachi HU-12A» (Япония) методом трансмиссионной и сканирующей микроскопии. Для количественной оценки содержания золота в биотканях лабораторных животных в настоящем исследовании использовался атомно-абсорбционный спектрофотометр «AAS-3 Karl Zeiss» (ФРГ) с лампой типа ЛТ-6М с разрядом в полом катоде паров золота. Предел обнаружения золота в тканях составлял 0,02 мкг/мл. Детектирование наличия золотых наночастиц в организме животных при их подкожном введении осуществлялось методом спектроскопии обратного диффузного светорассеяния с использованием волоконно-оптического спектрометра ЛЕСА-01. Для лазерной гипертермии биологических тканей использовался полупроводниковый лазер «OPTO POWER CORPORATION» типа ВО-15 (США) с длиной волны 810 нм, максимальной выходной мощностью 25 Вт. Для бесконтактного измерения и регистрации пространственного распределения радиационной температуры исследуемых объектов в работе использовался инфракрасный тепловизор «IRISYS 4010» фирмы «InfraRed Integrated System Ltd.» (Великобритания). Чувствительность тепловизора «IRISYS 4010» составляет 0,150С. Диапазон регистрируемых температур от -10 до +2500С. В работе использована авторская методика совмещения термограмм и клинических фотографий новообразований кожи и слизистых оболочек у животных, позволяющая значительно повысить эффективность обработки накопленной базы данных в исследованиях биологии опухолей.

Построение нейросетевого классификатора и обучение нейросети для решения диагностических задач осуществлялось по комплексу иммунологических, гормональных и биохимических параметров крови экспериментальных животных. Накопленная база входных данных была подвергнута предварительной обработке для приведения значений элементов векторов входа к нормальному закону распределения с дисперсией, равной 1. Для решения диагностических задач в системе MATLAB 6.5 с использованием расширения Neural Network Toolbox реализована трехслойная сеть обратного распространения. Для стандартного статистического анализа данных использовались приложения MS Office-2007 «MS-Excel 2002» (Microsoft Corp., США), лицензионные версии «Primer of Biostatistics 4.03» и «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc., США). Достоверность полученных результатов оценивали с использованием соответствующих статистических коэффициентов при уровне вероятности значимости тестируемой гипотезы р<0,05.

       Результаты собственных исследований и их обсуждение

Поиск фундаментальных закономерностей взаимосвязей между получаемыми в эксперименте данными и реально наблюдаемыми патологическими процессами в онкологии начинает отставать от разработки новых методов исследования и лечения, поэтому использование для этой цели информационных технологий представляется достаточно перспективным. Существенного прогресса в понимании иммунобиологических закономерностей динамики возникающего в системе «реактивность организма – опухолевый процесс» иммунодефицита можно достичь при использовании биоинформационного моделирования. Эта методология и её научные инструменты помогают предсказывать варианты течения и общую динамику опухолевых процессов, рассчитывать периодичность и объём эффективного воздействия, исходы и продолжительность жизни. Исследование спонтанных новообразований у экспериментальных животных привлекает пристальное внимание у большого числа биологов, в связи с уникальной возможностью использования их как моделей с естественными механизмами возникновения и развития опухолей, что имеет решающее значение для понимания биологии опухолевого роста и его взаимоотношения с иммунной системой организма. Использование спонтанных опухолей животных как моделей иммунологической реактивности организма на различные факторы воздействия сдерживается отсутствием необходимой базы данных об исходных иммунных и эндокринных показателях и в динамике развития неопластических и паранеопластических процессов. Опухоли лишь немногих животных могут служить моделями (Schafer K. et al., 1998). С другой стороны, искусственно перевиваемые опухоли, как модели, имеют существенный недостаток, связанный с тем, что при прививке опухоль переносится в организм исходно здорового животного. Кроме того, исследование процессов в экспериментах с перевиваемыми опухолями не позволяет учесть всех иммунобиологических аспектов взаимодействия организма и опухоли. В частности, перевиваемые опухоли развиваются подкожно, в капсуле и состояние иммунитета животного с перевитой опухолью не тождественно иммунитету при спонтанной опухоли. Иммунитет искусственно созданной системы «перевитая опухоль и организм» принципиально отличается от иммунитета организма со спонтанно развивающейся опухолью, однако моделирование состояния такой системы представляет интерес в сравнительном аспекте. В настоящем исследовании была экспериментально изучена динамика иммуноморфологических особенностей как спонтанных злокачественных новообразований, так и искусственно перевитых.

Частота и патоморфологические особенности спонтанных злокачественных новообразований у собак. К наиболее исследованным из анализируемых в настоящей работе опухолей следует отнести рак молочных желёз, состояние иммунной и эндокринной системы при других эпителиальных опухолях изучено в значительно меньшей степени. Нами проведены детальные комплексные исследования морфологических особенностей, гормонального и иммунного статуса у собак со следующими спонтанными злокачественными эпителиальными новообразованиями: рак молочных желез (РМЖ), рак яичника, эпителиоподобная форма меланомы, плоскоклеточный рак слизистой рта, базальноклеточный рак кожи, рак предстательной и параанальных желез. Определена средняя продолжительность жизни, частота встречаемости в зависимости от пола животного, пути и органы, в которые происходит метастазирование этих опухолей (табл. 2). Согласно результатам исследования, наиболее часто у собак встречается высокодифференцированный протоковый РМЖ (рис. 1). По данным цитологического исследования при высокодифференцированном РМЖ часто на фоне элементов подострого воспаления обнаруживаются клетки, сохраняющие признаки железистой дифференцировки, со слабо выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом. Клетки образуют железистоподобные папиллярные структуры с четко очерченными краями. Довольно редко, по данным наших наблюдений, встречается такая форма протокового РМЖ, как угревидный рак.

Таблица 2

Продолжительность жизни, частота встречаемости и метастазирование различных видов спонтанных злокачественных опухолей эпителиальной тканевой природы у собак

Вид спонтанной опухоли

у собак

Продолжи-тельность жизни (месяцев)

Частота встречаемости

Органы-мишени метастазирования

%

%

региональные

лимфоузлы

яичники

матка

печень

лёгкие

кости

головной мозг

забрюшинное пространство

Рак молочных

желёз

3520

53

1

+

+

+

+

+

+

+

рак яичника

84

3

-

+

+

меланома слизистой рта

62

0,5

3

+

+

+

+

Плоск. рак слизистых

1510

4

4

+

+

Базальнокл. рак кожи

6020

8

10

рак простаты

108

-

3

+

+

+

+

рак параанальных желез

3522

1.5

10

Внутрипротоковый инфильтрирующий РМЖ имеет гистологическую картину, характеризующуюся внутрипротоковыми разрастаниями анаплазированного эпителия, заполняющего просвет протока и подвергающегося некрозу, что является одной из главных особенностей данной формы рака. В фиброзной строме определяются участки, где эпителий протоков усиленно пролиферирует с образованием полиморфных и гигантских клеток. Из эпителиальных форм злокачественных новообразований яичников чаще встречаются цистокарцинома и аденокарцинома.

Рис. 1. Растровое электронное микрофото малигнизированных клеток папиллярного протокового рака молочной железы у собаки. Ув. х5400.

До 35% злокачественных новообразований слизистой оболочки ротовой полости у собак составляет плоскоклеточный рак (рис. 2 - А). Эта разновидность злокачественного новообразования метастазирует гематогенным путем в легкие. Для плоскоклеточного ороговевающего рака слизистой оболочки ротовой полости у собак характерны цитограммы, представленные клетками различных размеров, форм с обильной цитоплазмой и гиперхромными ядрами. В цитоплазме некоторых клеток видны признаки патологического ороговения. Отмечается выраженная митотическая активность базального эпителия с образованием многоядерных, полиморфноядерных и гигантоядерных клеток, со склонностью к образованию роговых жемчужин.

 

А  Б

Рис. 2. Патоморфологическая картина отдельных видов спонтанных злокачественных новообразований у собак. А - гистологический препарат плоскоклеточного неороговевающего рака слизистой оболочки полости рта (окр. гематоксилин-эозином). Ув. х200. Б – цитологический препарат меланомы слизистой оболочки ротовой полости, эпителиоподобный вариант (Лейкодиф-200). Ув. х630.

По периферии опухолевых образований в рыхлой соединительнотканной строме обильная лимфоцитарная инфильтрация. Цитологическая картина базальноклеточного рака кожи представлена пластами и тканевыми клочками из мелких, интенсивно окрашенных клеток, со слабо выраженными признаками злокачественности. Среди клеток и пластов может располагаться межуточное вещество. Гистологическая картина базальноклеточного рака характеризуется наличием комплексов мелких интенсивно окрашенных клеток с темными округлыми ядрами. Клетки, как правило, группируются параллельно друг другу, но могут располагаться и беспорядочно. В настоящей работе исследовано 17 случаев меланомы слизистой рта у собак. По нашим данным наиболее часто встречались эпителиоподобный и невусоподобный варианты меланомы (рис. 2 – Б).

       В качестве дополнительного неинвазивного метода диагностики наличия воспалительного процесса в опухоли в работе использовалась инфракрасная термография с компьютерным совмещением термограммы и фотографического изображения области локализации спонтанного злокачественного новообразования (рис. 3 – А). На термограмме (рис. 3 - Б) чётко различимы поверхностно расположенные кровеносные сосуды в области новообразования и подмышечного лимфатического узла.

Рис. 3. Молочная железа собаки с протоковым раком, воспалением и распадом опухоли. А – фото внешнего вида опухоли. Б – инфракрасная термограмма той же опухоли, стрелками указаны: 1 - поверхностные кровеносные сосуды, 2 – подмышечный лимфатический узел.

Низкодифференцированные формы рака у собак составляют примерно 10 % от всех исследованных эпителиальных злокачественных опухолей. Основными гистотипами опухолей молочных желез у собак являются протоковый рак высокой и средней степени дифференцировки молочных желез, высокодифференцированные цистокарцинома и аденокарцинома яичников, солидные формы базальноклеточного рака кожи, высокодифференцированные аденокарциномы предстательной и параанальных желез, эпителиоподобный и невусоподобный варианты меланомы слизистой рта. Меланомы у собак на слизистой рта встречаются в 15 раз чаще, чем меланомы кожи и радужки глаз. Неороговевающий плоскоклетоный рак слизистой рта у собак встречается на 30% чаще, чем ороговевающий. Рост и развитие опухоли находятся в непосредственной связи с состоянием иммунной системы организма. Морфологически отклик иммунной системы организма на развитие опухоли проявляется накоплением в строме опухоли и в пограничных областях иммунокомпетентных клеток.

               Анализ состояния иммунной и эндокринной систем у собак при спонтанных злокачественных новообразованиях. Для решения поставленных в работе задач исследованы клеточное и гуморальное звенья иммунитета в сочетании с оценкой гормональной активности эндокринной системы животных со спонтанными опухолями эпителиального происхождения. Определялась концентрация иммуноглобулинов класса IgA, IgG, IgM в сыворотке крови, общее количество Т- и В-лимфоцитов, натуральных киллеров (NK), СD4- и CD8-позитивных клеток, концентрация интерлейкина 2 (IL-2), С-реактивного белка, тиреотропного гормона, трийодтиронина, общего тироксина, кальцитонина, кортизола, пролактина, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, эстрадиола, прогестерона, тестостерона, паратгормоноподобного белка. На основе проведённых исследований сделан вывод о возможности использования перечисленных выше показателей в качестве неспецифических маркеров динамики развития опухолевого процесса. Иммунный статус исследованных экспериментальных животных при развитии опухолевого процесса характеризуется снижением уровня Т- и В-лимфоцитов, иммуноглобулинов классов IgG и IgM, однако в отдельных случаях может наблюдаться резкое повышение IgG. Ярко выражено снижение процентного содержания NK-клеток при раке яичников. Уровень кальцитонина повышается во всех рассмотренных случаях, за исключением рака яичников. При меланоме слизистой оболочке рта резко снижено процентное содержание NK-клеток и В-лимфоцитов, отмечается нарушение соотношения CD4/CD8 - клеток, что можно охарактеризовать как явление тотального иммунодефицита. Отмечалось также повышение уровня С-реактивного белка, кортизола и паратгормоноподобного белка. При раке предстательной железы также снижается процентное содержание циркулирующих в крови Т-лимфоцитов и NK-клеток. Увеличивается соотношение CD4/CD8 клеток, что свидетельствует о выраженном иммунодефиците.

               Также отмечается снижение содержания в крови концентрации IL-2. Статистически значимо при раке предстательной железы у собак повышается содержание белка острой фазы (С-реактивного белка), в среднем в 6 раз, а в некоторых случаях до 9 раз. Как при раке предстательной железы, так и при раке параанальных желез имеет место повышение уровня кальцитонина, кортизола, тестостерона и паратгормоноподобного белка. Можно отметить, что повышение тестостерона и паратгормоноподобного белка при раке параанальных желез более выражено, чем при раке предстательной железы. При раке параанальных желез не было отмечено статистически значимых отклонений от нормы со стороны показателей общего анализа крови, а также иммунограммы, включающей IgA, IgG, IgM, Т- и В-лимфоциты, NK-клетки, CD4 и CD8-позитивные клетки. Таким образом, обнаруженные нами явления при спонтанных злокачественных новообразованиях эпителиальной тканевой природы в целом следует расценивать как явление выраженного гормонального дисбаланса, сопровождающегося явлением иммуносупрессии различной степени выраженности.

               Нейросетевой классификатор типа эпителиальных опухолей по данным иммунного и гормонального статуса с патоморфологической верификацией. Перечисленные выше результаты свидетельствуют о том, что при развитии онкологического процесса наблюдаются разнонаправленные отклонения значительного числа показателей эндокринного и иммунного статуса животных. Следовательно, эти показатели содержат потенциально значимую информацию о наличии или отсутствии опухолевой прогрессии, специфике её динамики. Однако, вследствие большого разнообразия и разнонаправленности изменений этих показателей, эта информация не очевидна и без использования специальных математических приёмов её трудно извлечь. Решение задач распознавания такого рода процессов и их динамики, когда не представляется возможным учесть все реально имеющиеся условия, от которых зависит вероятный ответ, а можно выделить лишь примерный набор наиболее важных условий, являются идеальным полем для использования нейросетевых технологий.

Нейросетевые технологии в онкобиологии применяются достаточно давно, созданы нейросетевые экспертные системы для бинарной (доброкачественная-злокачественная) классификации опухолей молочной железы по данным маммографии (Floyd C.E.Jr. et al., 1994), раннего определения меланом кожи (Ercal F. et al., 1994), дифференциальной диагностики пролиферативных изменений в фолликулах щитовидной железы (Пупышева Т.Л., Демин А.В., 2003). В работе Rossiev D.A. et al. (1994) впервые была предпринята попытка применить нейросетевую экспертную систему для диагностики вторичной иммунологической недостаточности, однако в этом исследовании не рассматривались особенности эндокринного и иммунного статуса при новообразованиях. В нашей диссертационной работе впервые предложено использовать нейросетевой подход для дифференциальной диагностики злокачественных новообразований и неонкологических патологий у животных по данным гуморального иммунитета, гормональных и биохимических показателей сыворотки крови. В работе сформирована статистически репрезентативная база данных и впервые реализовано построение и успешное обучение нейросетевого классификатора для решения задачи бинарной классификации наличия злокачественного процесса по данным гормонального и иммунного статуса с морфологической верификацией используемых для обучения наборов данных (рис. 4).

Рис. 4. Диаграмма результатов тестирования обученного нейросетевого классификатора. 1 группа – животные со злокачественными новообразованиями, 2 группа – животные с доброкачественными патологическими процессами.

Тестирование полученной нейронной сети показало, что она успешно справляется с поставленной в исследовании диагностической задачей и количество ошибочно классифицированных случаев не превышает 5%. Для выявления наиболее значимых параметров проведена процедура «контрастирования» нейронной сети. Проанализирована прогностическая значимость особенностей гормонального и иммунного статуса на разных стадиях развития онкологического процесса и их сопряжённость с вероятностью возникновения паранеопластических синдромов.

               Динамика иммуномологического и эндокринного статуса животных со злокачественными опухолями при воздействия разного типа модификаторов на первичную опухоль, метастазы и паранеопластические процессы. В основе изучения фундаментальных аспектов взаимодействия опухоли и иммунной системы организма лежат исследования иммунологической реактивности организма при различных видах воздействия на опухоль, которые могут быть охарактеризованы как модификаторы. В настоящей работе использованы механическое (хирургическое) удаление опухоли различной степени радикальности, модификация иммунитета химически синтезированными и природными биологически активными веществами, включая пептиды, локальная лазерная гипертермия опухолевой ткани с использованием золотых наночастиц.

       Механическое удаление опухоли неизбежно сопровождается стрессом, являющимся результатом воздействия травмы, премедикационных и анестезирующих фармакологических препаратов на состояние иммунной и эндокринных систем. Сравнительное исследование динамики иммунологического и эндокринного статуса нами проведено при спонтанных эпителиальных опухолях молочных желез собак при одновременном удалении (первая группа) или сохранении гормонопродуцирующих органов (вторая группа). Длительность такого исследования охватывает период до 12 месяцев. Процентное содержание Т- и В-лимфоцитов на протяжении всего года в исследуемых группах практически не различалось. Соотношение CD4/CD8 позитивных клеток, определяющее выраженность иммунодефицита, через две недели после удаления опухоли заметно повышается в обеих группах, затем различие между средними значениями указанных величин уменьшается, однако к концу года во второй группе увеличивается дисперсия данных показателей, что свидетельствует о более выраженных индивидуальных различиях в состоянии животных этой группы. Также к концу года во второй группе нами наблюдалась выраженная гипо-иммуноглобулинемия. Различия в гормональных показателях обеих исследуемых групп выражены более существенно, чем в иммунологических. В первой группе содержание фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов, эстрадиола, тестостерона, и прогестерона спустя 2 недели после удаления опухоли резко снижается, а во второй группе их содержание остается повышенным в течение всего срока наблюдения. Показатели уровня кальцитонина, кортизола, пролактина и паратгормоноподобного белка превышают нормальные значения на протяжении всего срока наблюдения, причем во второй группе это выражено значительнее. Следует особо отметить стойкое повышенное содержание кальция в крови у животных второй группы на протяжении всего периода наблюдения. В первой группе гиперкальциемия наблюдается только до воздействия. Уровень кальция отчетливо коррелирует с уровнем содержания кальцитонина. Статистически значимо выявлено, что после проведенной мастэктомии в сочетании с овариогистерэктомией нормализация иммунологических показателей у животных происходит в срок от 4 недель до 6 месяцев, в то время как при мастэктомии с сохранением гормонопродуцирующих органов наблюдается характерный гормональный дисбаланс и нарастающий иммунодефицит в сроки от 6 месяцев до одного года. Прогрессия большинства эпителиальных опухолей приводит к резорбции костной ткани и снижению иммунорезистентности организма, что повышает вероятность метастазирования опухоли в кости. Как показали наши исследования, эти процессы часто наблюдаются после удаления первичной опухоли, что обусловлено нарушением иммунологической реактивности организма животных, связанной как с самой опухолевой прогрессией, так и со стрессом при удалении опухоли. Снижение иммунорезистентности сопровождается гормональным дисбалансом, который в частности проявляется в повышении уровня кортизола и паратгормоноподобного белка, что приводит резорбции костного матрикса и выводу кальция в кровь, вызывающему гиперкальциемию. Повышенное содержание кортикостероидов приводит к вторичному иммунодефициту, что проявляется снижением содержания иммуноглобулинов, повышением соотношения CD4/CD8 позитивных клеток. Высокий уровень паратгормоноподобного белка приводит к резорбции костной ткани и гиперкальциемии, что в свою очередь вызывает ответную реакцию организма, проявляющуюся повышением уровня кальцитонина.

Нами на животных моделях исследовались также изменения иммунологической реактивности организма под воздействием модификаторов биологических реакций. Для моделирования изменения соотношения клеточного и гуморального звеньев иммунитета в нашей работе использовался алкилирующий агент, образующий ковалентные связи с ДНК (циклофосфамид) в режиме повышенной «дозовой плотности» в комплексе с различными модификаторами биологических реакций, в качестве которых использовались Т-активин, миелопид и полиоксидоний. Сравнительное исследование иммунологической реактивности показало, что в качестве наиболее эффективного препарата для коррекции иммунодефицита, обусловленного химиотерапией циклофосфамидом, целесообразно рассматривать полиоксидоний, как препарат, активирующий преимущественно клеточное звено иммунитета. Его иммунопротективное действие реализуется путем повышения продукции Т-лимфоцитами цитокинов, стимулирующих синтез иммуноглобулинов. Полиоксидоний также увеличивает синтез мононуклеарами интерлейкина-2, являющегося одним из индукторов функциональной активности цитотоксических клеток, а также интерлейкина-1 и факторов некроза опухоли ( и ), играющих ключевую роль в запуске "цитокинового каскада", обеспечивающего защиту организма от цитостатического воздействия. Кроме того, нами исследовано комбинированное применение иммуномодификаторов. Статистически значимо выявлено, что акридонацетат метилглюкамина в комбинации с интерлейкином-2 приводит к более быстрой нормализации показателей иммунитета по сравнению с изолированным воздействием этих иммуномодуляторов биологических реакций.

       Биологические и биофизические эффекты введения в организм животных золотых плазмонно-резонансных наночастиц. На основе количественного определения содержания золота в биологических тканях экспериментальных животных методом атомно-абсорбционной спектроскопии нами было установлено, что спустя 24 часа после внутривенного введения золотые наночастицы накапливаются в основном в печени и селезенке. Впервые установлено, что накопление золотых наночастиц и обусловленные этим морфологические изменения в органах животных обладают размерной зависимостью. Наиболее высокая концентрация золота в органах наблюдалась при накоплении частиц диаметром 160 нм.

Рис. 5. Содержание золота в различных органах крыс через 24 часа после внутривенного введения наночастиц.

По данным гистологических исследований, после внутривенного введения наночастиц соответствующие изменения обнаруживаются не только в печени и селезенке, но и в других органах, в которых повышения содержания золота в тканях по сравнению с уровнем естественного фона спустя 24 часа после введения не было выявлено. Нами впервые показано, что изменения во внутренних органах при системном введении золотых наночастиц имеют размерно-обусловленный характер. Частицы диаметром 160 нм воздействуют на стенку сосудов, что приводит к вакуольной дистрофии их эндотелиальных клеток. Частицы диаметром 50 нм приводят к более выраженным изменениям во внутренних органах. В селезенке лимфатические узелки имеют атипичные периферические зоны и в них отсутствуют зоны размножения. В узелках наряду с сохраненными лимфоцитами видны множественные апоптозные тельца. В печени наблюдается выраженная дистрофия гепатоцотов и умеренная гиперемия. В легких в данном случае более выраженная гиперемия, очаговые кровоизлияния. В капсулах почечных телец наблюдается пролиферация эпителиальных клеток и в полости капсулы определяются единичные эритроциты. При введении частиц диаметром 15 нм возникает умеренная дистрофия паренхиматозных клеток внутренних органов и умеренные нарушения кровообращения.

       В диссертационной работе впервые проведены количественные исследования размерной зависимости длительности циркуляции золотых наночастиц при их системном введении (рис.6). В ходе проведенного экспериментального исследования показано, что частицы наименьшего исследуемого диаметра (15 нм) циркулируют в крови значительно дольше, чем более крупные, что может быть связано с их рециркуляцией из депонирующих органов.

Рис. 6. Динамика концентрации золота в крови кролика после внутривенного введения 5 мл наночастиц.

       Полученная в ходе исследования временная зависимость уровня концентрации золота в крови во временном интервале от 30 минут до нескольких часов после введения аппроксимируется экспоненциальной функцией с коэффициентом 0.013:

       На перевитых опухолях рака почки нами получено статистически значимое повышение концентрации золота при пассивном накоплении золотых наночастиц в опухолевой ткани по сравнению с нормальными тканями. Установлено, что временная динамика повышения концентрации золота в опухолевой ткани при пассивном накоплении имеет два выраженных максимума, первый максимум наблюдается в первый час после введения, а второе повышение уровня золота происходит спустя 24 часа после введения (рис. 7). Повышение концентрации в первый час после введения связано с повышенной васкуляризацией опухоли и, соответственно, большим объемом циркулирующей в опухоли крови. Как свидетельствуют результаты экспериментальных исследований, проведенных в работе, концентрация золота в крови максимальна в первые 30 минут после введения частиц, а затем начинает экспоненциально снижаться. Следующие несколько часов концентрация золота в опухолевой ткани и соседних здоровых тканях отличается незначительно.

Рис. 7. Концентрация золота в ткани перевитой опухоли рака почки у крыс в зависимости от времени поcле внутривенного введения наночастиц. - контроль до введения частиц, - опухоль, Δ - кожа, подкожная клетчатка, поперечно-полосатая мускулатура.

Спустя 24 часа концентрация золота в опухолевой ткани при рассматриваемом пассивном накоплении примерно в три раза превышает соответствующие значения в соседних нормальных тканях и достигает 1 мкг/мл. Данное значение существенно ниже концентрации золота, регистрируемой спустя сутки в печени и селезенке. В работе также предложена методика функционализации золотых наночаcтиц для повышения селективности накопления в меланоме путем конъюгирования с L-фенилаланином.

       Нами впервые исследовано иммуномодулирующее воздействие золотых наночастиц при системном введении. Экспериментальные исследования включали сравнительный анализ восстановления иммунного ответа у собак при введении интерлейкина-2 и конъюгатов интерлейкина-2 с золотыми наночастицами после искусственно вызванного вторичного иммунодефицита. Восстановление иммунного ответа до исходных значений было получено в обеих группах (рис. 8), однако динамика этого процесса была различной. Принципиальное значение имеет тот факт, что изолированное введение интерлейкина-2 приводит к более быстрому результату, в этом случае восстановление показателей наблюдалось уже в первые 24 часа.

Рис. 8. Динамика показателей иммунитета при иммуносупрессии и последующей иммунокоррекции. контроль без иммуностимуляции, - интерлейкин-2, - конъюгаты золотых наночастиц с интерлейкином-2.

       Конъюгаты интерлейкина с золотыми наночастицами вызывают отклик иммунной системы, но наблюдается запаздывание иммунного ответа на 48-72 часа по сравнению с откликом на исходный не конъюгированный препарат интерлейкина-2. Кроме того, наблюдался и побочный эффект от введения конъюгатов интерлейкина с золотыми наночастицами, выразившийся в увеличении количества тромбоцитов в крови.

               Биологические и биофизические эффекты экспериментальной лазерной гипертермии тканей животных с применением золотых плазмонно-резонансных наночастиц. Использование золотых плазмонно-резонансных наночастиц для фототермического воздействия на ткани экспериментальных животных имеет два основных аспекта: (1) - биоспецифическое «нацеливание» на определенные ткани или клетки и (2) - оптический плазмонный резонанс. При облучении наночастиц, локализованных в биологических тканях, лазерным излучением с длиной волны в области полосы поглощения происходит нагрев частиц и окружающих их клеток.

В настоящей работе на основе компьютерного моделирования проведены оценки пространственного распределения интенсивности поглощенного лазерного излучения в образцах биологических тканей, содержащих плазмонно-резонансные наночастицы, и получены оценки температурных эффектов, возникающих при различных режимах лазерного воздействия. В экспериментах на тестовых объектах измерено пространственное распределение повышения температуры в зависимости от концентрации наночастиц и времени лазерного воздействия. Исследования на тестовых объектах в сочетании с компьютерным моделированием были необходимы для определения распределения температуры по глубине тканей на основе данных термографического исследования поверхности. Экспериментальные исследования, проведенные в работе, показали, что при концентрации частиц 5·109 см-3 прогревается не весь освещаемый лазерным излучением объем, а только его поверхностный слой, толщина которого не превышает 5-7 мм. При уменьшении концентрации частиц в 4 раза глубина нагрева увеличивается в 2 раза, однако снижается максимально достигаемая температура. При концентрации частиц 5·109 см-3 повышение температуры раствора наночастиц составляет 40C, а при 16-ти кратном разведении - 18C. Данный эффект ограничивает оптимальный диапазон концентраций частиц в тех случаях, когда требуется одновременный равномерный прогрев тканей объемом более 1см3. Исследование температурной кинетики золотых наночастиц при лазерном облучении выявило нелинейность скорости повышения температуры. Как установлено нами, скорость нагрева определяется главным образом концентрацией наночастиц и в меньшей степени мощностью используемого излучения. Наиболее быстрый нагрев происходит за первые 100 секунд лазерного воздействия, а затем температура достигает насыщения. Снижение температуры после прекращения лазерного воздействия происходит в несколько раз медленнее, чем нагрев, и не зависит от концентрации наночастиц. Данный эффект приводит к тому, что реальное время нагрева может значительно превышать длительность непосредственного лазерного облучения.

Выявлено, что лазерная гипертермия с золотыми наночастицами in vivo обладает определенной спецификой. Для её объяснения необходимо прежде всего принимать во внимание эффектны терморегуляции, обусловленные локальным повышением перфузии крови и индуцированные лазерным излучением морфологические изменения тканей животного. При гипертермии опухолевых тканей существенное значение имеет максимально быстрое повышение температуры до заданного диапазона. Золотые наночастицы при этом позволяют значительно увеличить скорость нагрева. В настоящей диссертационной работе статистически значимо доказано, что при использовании плазмонно-резонансных наночастиц для лазерной гипертермии биотканей достигается повышение скорости нагрева в 10 раз. Автором разработана методика проведения термографических исследований при лазерной гипертермии опухолей у животных, на основе специально разработанной компьютерной программы проведен статистический анализ температурного распределения нормальных и патологически изменённых тканей. Получены экспериментальные двумерные распределения поверхностной температуры при различной глубине инъекции наночастиц лабораторным животным. Исследована динамика лазерной гипертермии при непрерывном и импульсном режимах воздействия. Отчетливо продемонстрировано проявление компенсаторных реакций организма в результате повышении скорости нагрева тканей.

Биологические эффекты, возникающие при лазерной гипертермии тканей животных, определяются не только абсолютными величинами повышения температуры, но и длительностью воздействия и временными характеристиками нагрева. Нагрев опухолевых тканей до 46-600С градусов сдерживает их пролиферацию и предположительно может стимулировать процессы апоптоза. Без наночастиц достичь указанного температурного диапазона удается за 5 минут, а при их использовании - за 30 секунд. Следует отметить такую особенность лазерной гипертермии с наночастицами in vivo, как первоначальное повышение температуры на 1-3 градуса выше устанавливающегося впоследствии стационарного значения температуры (рис. 9).

Рис. 9. Динамика нагрева тканей кожи крысы при непрерывном (•,) и импульсном (, Δ) лазерном облучении. Обозначения:1, 3 - без наночастиц; 2, 4 - с наночастицами. Выходная мощность лазера в непрерывном режиме 2 Вт, расстояние от торца волокна до поверхности кожи 2 см, средняя плотность мощности 2 Вт/см2, скважность в импульсном режиме , длительность импульса 1 мсек, пиковая мощность 4 Вт.

       Нами сопоставлены возникающие в биологических тканях изменения, определяемых методами гистологического анализа с термограммами, измеренными на поверхности их локальных участков непосредственно после лазерного воздействия при разных способах введения золотых наночастиц. При этом показано, что проведение лазерного термолиза с использованием наночастиц, локализованных на глубине до 5-7 мм в биологических тканях, в частности, в коже и скелетных мышцах, позволяет селективно нагревать заданные участки в области локализации частиц без разрушения близлежащих тканей (рис.10).

Рис 10. Локальное повышение температуры и соответствующие морфологические изменения тканей экспериментальных животных при лазерном воздействии с золотыми наночастицами в непрерывном режиме с выходной мощностью 2,5 Вт, длительностью 30 сек. А – препарат кожи крысы до воздействия. Б – термограмма поверхности соответствующего участка кожи при подкожном введении золотых наночастиц. В – препарат кожи крысы после подкожного введения наночастиц и лазерного воздействия. Г – препарат скелетной мышечной ткани крысы до воздействия. Д – термограмма поверхности соответствующего участка кожи крысы при внутримышечном введении золотых наночастиц. Е – препарат скелетной мышечной ткани крысы после лазерного воздействия с наночастицами. Окр. гематоксилин-эозин. (Ув. х200).

       

       В работе исследованы патоморфологические изменения тканей под воздействием лазерного излучения с использованием золотых наночастиц в качестве селективного поглотителя и иммуномодулирующие эффекты, возникающие при этом у экспериментальных животных с перевитыми и спонтанными опухолями. Накопление наночастиц в опухолевой ткани приводит к селективному нагреву в области их локализации. Как показывают результаты термографических измерений, пассивное накопление золотых наночастиц при внутривенном введении оказывается достаточным для того, чтобы температура поверхности опухолевой ткани при лазерной гипертермии была выше температуры окружающих здоровых тканей. При плотности мощности лазерного излучения 2 Вт/см2 температура на поверхности здоровой ткани повышалась на 50С, а опухолевой на 100С. Такое повышение температуры наблюдалось при лазерном воздействии через 30 минут после внутривенного введения частиц, что коррелирует с первым пиком насыщения опухолевой ткани золотыми наночастицами вследствие ее повышенной васкуляризации, который приходится на временной промежуток от 30 до 60 минут после внутривенного введения. Повышение температуры при интерстициальном введении наночастиц в опухоль выражено значительнее, чем при внутривенном введении, поскольку такое введение позволяет достичь более высокой локальной концентрации наночастиц. Максимальная температура поверхности кожи над опухолью при той же плотности мощности лазерного излучения при интерстициальном введении достигает 56оС. Установлено, что использование наночастиц при лазерной гипертермии позволяет повысить стабильность требуемого температурного режима, при котором диапазон колебания температуры не превышает одного градуса. После лазерной гипертермии с интерстициальным введением золотых наночастиц в эпидермисе кожи над опухолью наблюдается незначительная дистрофия, в кровеносных сосудах выражена сепарация крови и плазма вакуолизирована. В дерме наблюдается лимфоидная инфильтрация, набухшие волокна с признаками отека. В ткани опухоли (рис. 11-Б) имеются достаточно обширные некрозы лентовидной формы. В области некроза клетки опухоли отсутствуют, имеются бесструктурные эозинофильные массы с полиморфноклеточной воспалительной реакцией и множество апоптозных телец. Определение степени выраженности апоптотических процессов до и после лазерного воздействия осуществлялось с помощью иммуноцитохимических и иммуногистохимических исследований с использованием маркера Bcl-2. Полученные результаты показывают, что маркер Bcl-2 лучше использовать при лимфоидной инфильтрации опухоли, или для определения перифокального воспаления после термического воздействия на опухолевые ткани.

  А  Б

Рис. 11. А - препарат опухолевой ткани подкожно трансплантированного рака почки у крысы, Б - препарат опухолевой ткани с интерстициальным введением золотых нанооболочек после лазерного воздействия, окраска гематоксилин-эозин, ув. х150.

Лазерная гипертермия перевитых опухолей при внутривенном введении наночастиц приводит к уменьшению размера опухоли в среднем на 25% и средней задержке роста опухоли на 7 дней, а при интерстициальном введении наночастиц отмечалось уменьшение размера опухоли в среднем на 50% и задержка роста на 10 дней (рис. 12).

Рис. 12. Динамика роста подкожно трансплантированного рака почки крыс (РА) до и после лазерной гипертермии. - контрольная группа без воздействия, - группа с лазерным нагревом без наночастиц, - группа с лазерным воздействием после внутривенного введения наночастиц, ∇ - группа с лазерным воздействием после интерстициального введения наночастиц.

В группе животных, подвергшихся лазерному воздействию без наночастиц, с температурой нагрева в диапазоне 40-42оС, отмечалось незначительное ускорение роста опухоли по сравнению с контрольной группой. Продолжительность жизни животных указанной группы была ниже, чем в контрольной.

       В исследовании проанализировано состояние иммунологической реактивности экспериментальных животных при экспериментальной локальной лазерной гипертермии. Поскольку среди спонтанных опухолей у изученных нами животных наиболее часто встречаются поверхностно расположенные опухоли эпителиальной тканевой природы, а лазерная гипертермия является методом наиболее целесообразным для воздействия на поверхностно расположенные ткани, в настоящем исследовании более детально рассматриваются эпителиальные опухоли и меланома слизистой оболочки ротовой полости.

Локальная гипертермия, в отличие от общей, стимулирует различные звенья иммунной системы организма. В то же время сильная термическая травма, равно как и хирургическая, может вызывать супрессию клеточного иммунитета (Munford R.S., Pugin J., 2001). В работе A. Szasz и G. Vincze (2006) отмечается, что в процессе гипертермии с клетками может происходить три процесса: они могут вернуться к своему первоначальному состоянию, подвергнуться апоптозу, либо погибнуть вследствие некроза. Точный механизм действия гипертермии неизвестен, но можно указать на следующие общепринятые положения. Повышение температуры вызывает расширение сосудов и непрерывное увеличение перфузии крови в здоровых тканях. Повышение температуры приводит также к структурным изменениям трансмембранных белков, вызывающим изменения в активном мембранном транспорте и проницаемости мембраны, в свою очередь приводящим к изменению ионных градиентов калия, натрия и кальция. Кроме того, гипертермия повышает скорости многих метаболических процессов. Однако при этом недостаток кислорода может приводить к снижению метаболизма вследствие гипоксии и образованию молочной кислоты в результате анаэробного метаболизма и разрушению клеток вследствие ацидоза. В лихорадочном диапазоне температур в опухолях возникают те же самые изменения, но при более высоких температурах в некоторых опухолях происходит вазоконстрикция, приводящая к уменьшению перфузии крови и уменьшению теплопроводности, при этом направление расширения сосудов в пограничных с опухолью здоровых тканях меняется, приводя к повышению перфузии крови и теплопроводности в этом регионе.

       Кроме непосредственных биологических тканевых эффектов фототермолиза с золотыми наночастицами в настоящей работе выявлен ряд его иммуномодулирующих эффектов. Согласно результатам наших исследований на животных с базальноклеточным раком кожи, локальная лазерная гипертермия приводит к следующим изменениям иммунологической реактивности. Динамика состояния организма, поражённого опухолью характеризуется повышением уровня паратгормоноподобного белка, при этом максимальное значение данного показателя соответствует моменту максимального разрушения опухолевой ткани. Повышение объема циркулирующих в кровотоке опухолевых антигенов в процессе разрушения опухоли приводит к увеличению процентного содержания натуральных киллеров и уменьшению отношения CD4/CD8 позитивных клеток, а также повышению количества продуцируемого CD4-позитивными клетками интерлейкина-2. После максимальной элиминации опухолевых клеток происходит снижение указанных выше показателей до физиологической нормы. Динамика изменения указанных показателей коррелирует с интервалами между лазерными воздействиями. Использование золотых наночастиц при лазерной гипертермии позволяет достичь элиминации эквивалентного объема опухоли при меньшей длительности воздействия, при этом наблюдается более выраженный иммунный отклик. Иммунный отклик организма животного на пролонгированную стимуляцию опухолевыми антигенами проявляется в повышении процентного содержания натуральных киллеров и уровня интерлейкина-2 и иммуноглобулинов IgG, снижению соотношения CD4/CD8 позитивных клеток. Уровень антигенности опухоли коррелирует с уровнем паратгормоноподобного белка. Лазерный фототермолиз, как и инструментальное удаление опухоли, при моделировании можно рассматривать как резкое уменьшение объема опухолевой ткани в организме, возможно приводящее к силовому переключению биологического триггера. Кроме того, лазерный фототермолиз, как установлено нами, обладает рядом статистически значимых иммуномодулирующих эффектов.

       В исследовании установлены различия в чувствительности различных гистологических типов опухолей к лазерной гипертермии с наночастицами. Так, в случае неороговевающего плоскоклеточного рака кожи для достижения полной элиминации опухоли достаточно было однократного воздействия и иммунный ответ организма на воздействие был выражен слабо, а при ороговевающем плоскоклеточном раке кожи у собак лазерное воздействие для достижения полной элиминации опухоли необходимо было применять многократно. В случае неороговевающего плоскоклеточного рака кожи полной элиминации опухоли удавалось достичь за 1 сеанс (37%) или за 2 сеанса (63%). В случае ороговевающего плоскоклеточного рака кожи элиминация опухоли достигалась за 3 сеанса (25%) или 4 сеанса (75%). Полученные результаты свидетельствуют о более высокой устойчивости клеток ороговевающего плоскоклеточного рака к лазерной гипертермии по сравнению с клетками неороговевающего плоскоклеточного рака кожи у собак. В последнем случае длительность безрецидивного периода составляла от 6 до 8 месяцев в 30% случаев, в 25% случаев длительность безрецидивного периода составляла от 8 до 12 месяцев, в остальных 45% случаев длительность безрецидивного периода составляла от 12 до 18 месяцев. В случае ороговевающего рака кожи безрецидивный период составлял от 6 до 8 месяцев у 5% собак, от 8 до12 месяцев – у 20% собак, от 12 до 18 – у 35%, и у 40% - от 18 до 24 месяцев. Эти различия обусловлены, на наш взгляд, специфическими тканевыми особенностями этих опухолей и исходным состоянием иммунологической реактивности экспериментальных животных.

       Проведенный в работе сравнительный анализ состояния иммунологической реактивности экспериментальных животных с меланомой слизистой рта показал, что как изолированная иммуномодуляция (1 группа), так и иммуномодуляция в сочетании с лазерной гипертермией с золотыми наночастицами (2 группа) приводит к повышению уровня иммуноглобулинов до нормальных значений, однако изолированная иммуномодуляция приводит к кратковременному эффекту с тенденцией к снижению в течении 14 дней, а в сочетании с лазерной гипертермией нормализация показателей сохраняется в течение 30 дней после окончания воздействия. Селективной лазерная гипертермии с золотыми наночастицами, в отличие от изолированной иммуномодуляции, повышает процентное содержание В-лимфоцитов и NK-клеток. Повышение уровня интерлейкина-2 в крови животных при изолированной иммуномодуляции имело пиковый характер, а иммуномодуляция в сочетании с гипертермией приводила к более раннему иммунному ответу, причем повышенный уровень интерлейкина-2 оставался стабильным в течение всего срока наблюдения.

Биоинформационная модель взаимодействия иммунной системы и опухолевого процесса в условиях воздействия биологических и биофизических эффектов управляемого лазерного фототермолиза с золотыми наночастицами. В работе сформулированы основные биологические закономерности взаимоотношения опухоли с иммунной системой организма, необходимые для построения адекватной математической модели. Проведен анализ требований к математической модели коррекции опухолевого иммунодефицита. В работе впервые проведено математическое моделирование иммунологической реактивности организма при лазерной гипертермии опухолевой ткани. Представленную в работе математическую модель, описывающую нелинейную динамику системы антиген–«антитело»–интерлейкин, можно рассматривать как обобщение моделей иммунной системы, предложенных ранее [Романовский Ю.М, Степанова Н.В, Чернавский Д.С., 1984], [Kirschner D., Panetta J.C., 1998]. Обобщение указанных моделей заключается в учете влияния продуктов биодеградации ткани при лазерной гипертермии на иммунологическую реактивность организма. Также учитывается динамика поступления извне интерлейкина-2 дискретно или непрерывно. Каждый параметр модели был получен с использованием фактических экспериментальных данных. Когда фактические данные отсутствовали, параметры выбирались таким образом, чтобы максимально соответствовать имеющимся экспериментальным данным о динамике опухолевого роста. Предложенная модель лазерной гипертермии учитывает как эффекты уменьшения опухоли вследствие термической деструкции, так и иммунный ответ на повышение антигенпрезентации продуктов распада опухоли. Полученная в результате математическая модель включает три дифференциальных уравнения:

, (1)

       ,        (2)

       .        (3)

где x – количество опухолевых клеток (размер опухоли), y – совокупное количество опухолевых антител и цитотоксических Т-лимфоцитов, z – концентрация интерлейкина, и - коэффициенты,  характеризующие рост опухоли (с насыщением), - коэффициент противоопухолевой активности антител и цитотоксических Т-лимфоцитов, n –номер сеанса фототермолиза, tn –момент времени, в который происходит сеанс гипертермии, - объем выжигаемой опухолевой ткани. Z1 – характеризует время жизни антител, - коэффициент, характеризующий убыль антител и цитотоксических Т-лимфоцитов при уничтожении опухоли. В правой части уравнения (2) член () моделирует поддержание концентрации интерлейкина в организме, не подвергнувшемся влиянию антигена, на некотором постоянном уровне , который определяется состоянием иммунной системы. Последнее слагаемое отвечает за убыль интерлейкина в процессе генерации антител. Оно описывает эффекты саморегуляции иммунной системы, препятствуя неограниченному росту концентрации антител и интерлейкина, — -функция Дирака, — функция Хевисайда, количество продуктов распада после гипертермии опухоли спадает по экспоненте.

Предложенная модель в зависимости от управляющих параметров демонстрирует различные режимы динамики, которые качественно согласуются с представлениями о поведении иммунной системы. Без лазерного воздействия могут наблюдаться следующие ситуации. Для низкого уровня антигенности существует стабильное устойчивое состояние опухоли большого размера, которого достигает система. Для более высокого уровня антигенности имеется цикл с небольшой амплитудой и коротким периодом, при очень высоком уровне антигенности организм может действительно уничтожить опухоль. Все эти моменты рассматриваются при моделировании с реальными параметрами, чтобы получить прогнозы развития ситуации. Если скорость размножения антигена велика, в фазовом пространстве существуют два неустойчивых положения равновесия, а также одно устойчивое положение. При однократном лазерном воздействии даже при практически полном выжигании опухоли модель предсказывает возобновление опухолевого роста. При трехкратном проведении процедуры лазерного фототермолиза опухоли в зависимости от объема выжигаемой опухолевой ткани моделируемая система демонстрирует различные сценарии развития ситуации – от возобновления роста опухоли до практически полного исчезновения опухоли (рис.13).

Рис. 13. Динамика показателей исследуемой системы при трехкратном лазерном воздействии различной мощности (объем выжигаемой ткани).

При одинаковых количественных параметрах фототермического воздействия на опухоль, но при различных коэффициентах стимуляции иммунной системы, зависящих от длительности периода полураспада продуктов опухоли после фототермолиза, сценарии поведения моделируемой системы могут кардинально различаться. Развитие ситуации после лазерной гипертермии также зависит от исходного состояния иммунной системы и выраженности повышения антигенпрезентации в процессе лазерного термолиза с золотыми наночастицами. Причем очень незначительное изменение значений управляющих параметров, определяемых указанными процессами, может кардинально менять исход от полной элиминации опухоли до прогрессирования процесса. Результаты моделирования хорошо коррелируют с экспериментальными исследованиями на животных.

       Заключение

       Таким образом, в основе концептуальной схемы проведённого исследования реализован вариант системного информационного подхода к анализу иммунобиологического равновесия в системе «иммунитет-опухоль» в динамике спонтанных опухолевых процессов эпителиальной тканевой природы и в условиях эксперимента трансплантации культуры клеток рака почки. На разных этапах развития сложного многокомпонентного взаимодействия между специфическими и неспецифическими системами иммунологического надзора с опухолевыми клетками его динамика может быть представлена в виде биоинформационной модели нестабильного состояния между отдельными, в первую очередь ведущими, компонентами системы, переключение на стимуляцию или подавление которых осуществляют биологические триггеры двунаправленного действия (рис. 14). Факторы внешнего воздействия на систему на молекулярно-генетическом, тканевом и организменном уровнях запускают разные по направленности и неоднозначные по конечному эффекту процессы в зависимости от переключающего эффекта триггеров, смещая нестабильное равновесие системы в ту или иную сторону. Специфика опухолевых процессов эпителиальной природы определяется в значительной степени гормональным фоном организма и чувствительностью клеток опухоли и иммунной системы к сигналам гормонов, причём продуцентами гормонов могут выступать, в том числе и сами опухолевые ткани. Модификаторами гормонального фона и иммунной системы, стимулирующей направленности могут выступать фармакологические агенты и иммуномодуляторы естественной природы, совокупные эффекты которых проанализированы нами отдельно для определения их роли в изменении ключевых показателей иммунитета. Эта группа факторов представляет один из векторов системы стремящегося остановить процесс развития опухоли и элиминировать их из организма животного. Аналогичным по направленности, но отличным по механизмам действия является вектор другой группы модификаторов. В качестве такой группы модификаторов выступают физические воздействия на опухоль (хирургическое удаление, облучение, термолиз). Их иммуномодулирующие эффекты также разнонаправлены и неоднозначны по конечным эффектам на нестабильное равновесие системы. Одними из важнейших временных факторов при этом выступает динамика многоэтапного процесса развития опухоли и её чувствительность к физическим воздействиям с одной стороны, и время физического воздействия, как фактор, определяющий развитие конечных биологических эффектов и переключение триггеров на стимуляцию или подавление иммунитета с другой.

Рис. 14. Концептуальная биоинформационная модель анализа взаимодействия иммунной системы и опухолевого процесса эпителиальной природы в условиях воздействия биологических и биофизических эффектов управляемого лазерного фототермолиза.

В этом смысле поиск наиболее быстрых по времени воздействия, точных по его направленности и естественных по конечным эффектам способов удаления опухолей эпителиальной природы представляет собой важнейшую научную проблему экспериментальной онкологии. На основе полученной в настоящем исследовании базы данных разработана и экспериментально верифицирована биоинформационная модель системы «иммунная система-опухоль». Обучение на полученной базе данных бинарного нейросетевого классификатора полностью подтвердило возможность эффективного использования ряда ключевых показателей иммунной системы, биохимических параметров сыворотки крови для анализа и прогнозирования возможных исходов опухолевых процессов эпителиальной природы. Разработанная биоинформационная модель нелинейной динамики нестабильного равновесия системы «иммунитет-опухоль», основанная на реальных экспериментальных данных демонстрирует 4 основных вида её состояния в виде графических портретов фазовых переходов: а) – неустойчивое равновесие, высокая скорость нарастания концентрации опухолевых антигенов, низкая реактивность иммунной системы и гибель организма независимо от исходных условий состояния системы, б) - неустойчивое равновесие с высокой скоростью нарастания опухолевых антигенов и высокой реактивностью иммунной системы с исходом в зависимости от условий начального состояния системы, в) - устойчивое равновесие динамики перехода в хроническое заболевание, выздоровление или гибель в зависимости от исходных условий состояния системы, в) – неустойчивое равновесие динамики полного выздоровления и регистрации процесса в иммунологической памяти организма. На основе разработанной биоинформационной модели теоретически предсказана и экспериментально подтверждена возможность стимуляции иммунного ответа при локальной лазерной гипертермии, причём эффективность такого воздействия многократно возрастает при использовании золотых плазмонно-резонансных наночастиц. Использованный в настоящем исследовании лазерный фототермолиз с применением золотых плазмонно-резонансных наночастиц по своим биофизическим эффектам (селективный нагрев тканей на заданной глубине, повышение скорости их нагрева, динамика уменьшения объёма опухоли) и биологическим эффектам реакций на термовоздействие (ожоговый стресс, воспаление, стимуляция апоптоза, стимуляция  иммунитета продуктами послеожоговой биодеградации тканей) обладает комплексным иммуномодулирующим действием. В исследовании экспериментально доказано, что при согласовании длины волны лазерного излучения, соответствующей окну прозрачности биоткани и пика поглощения плазмонно-резонансных золотых наночастиц возможна точная, высокоэффективная и быстрая деструкция опухолевых тканей эпителиальной природы на глубине до 8 мм без повреждения вышележащих слоёв неизменённых тканей.

Выводы

1. Частота встречаемости исследованных опухолей у животных зависит от пола: у животных женского пола преобладает рак молочных желез, мужского - рак параанальных желез и меланома слизистой оболочки ротовой полости. Низкодифференцированные формы рака составляют 10% всех эпителиальных злокачественных опухолей. Основными гистологическими типами опухолей у собак являются протоковый рак молочных желез высокой и средней степени дифференцировки, высокодифференцированные цистокарцинома и аденокарцинома яичников, солидные формы базальноклеточного рака кожи, высокодифференцированные аденокарциномы предстательной и параанальных желез, эпителиоподобный и невусоподобный варианты меланомы слизистой оболочки ротовой полости.

2. Развивающееся в динамике опухолевого процесса иммунодефицитное состояние животных, выражается в снижении содержания иммуноглобулинов классов IgG и IgM, процентного содержания NK-клеток и общей лимфоцитопении и сопровождается таким дисбалансом эндокринной системы, как повышение уровня кортизола, эстрадиола, прогестерона, кальцитонина и паратгормоноподобного белка.

3. На основе сравнительного анализа установлено, что по эффективности воздействия на гуморальное звено иммунитета при опухолях у экспериментальных животных иммуностимуляторы располагаются в следующей последовательности: миелопид, Т-активин, полиоксидоний. При супрессии циклофосфамидом выработки иммуноглобулинов класса IgG параллельная стимуляция цитотоксических Т-лимфоцитов позволяет преодолеть явление экранирования опухолевых клеток, при этом наиболее выраженный эффект был получен при применении полиоксидония.

4. Сформирована база данных и впервые реализовано успешное обучение нейросетевого классификатора для определения наличия злокачественного процесса по эндокринным, иммунным и биохимическим показателям с верификацией на основе морфологического анализа. В результате контрастирования нейросети установлено, что наибольшими весовыми коэффициентами обладают следующие параметры крови уровень кальция в сыворотке крови, активность аспартат- и аланин трансаминаз, уровень кальцитонина и иммуноглобулинов класса IgG.

5. Системные биологические и локальные тканевые эффекты при введении золотых наночастиц в организм экспериментальных животных имеют размерно-обусловленный характер. Частицы диаметром 160 нм воздействуют на стенку кровеносных сосудов, что приводит к вакуольной дистрофии эндотелиальных клеток, сепарации клеток крови и плазмы, незначительной дистрофии клеток паренхиматозных внутренних органов. Частицы диаметром 50 нм приводят к более выраженным изменениям внутренних органов, менее выраженной сепарации крови, умеренной дистрофии паренхиматозных клеток внутренних органов и нарушениям кровообращения. Специфические изменения в головном мозге отсутствуют.

6. Использование золотых плазмонно-резонансных наночастиц для лазерной гипертермии неизменённых и опухолевых биологических тканей повышает скорости их нагрева и выхода на стационарный управляемый температурный режим в диапазоне 46-600С, стимулирует в них процессы апоптоза опухолевых клеток и оказывает системные иммуномодулирующие эффекты. Пространственное распределение температуры биологических тканей при лазерной гипертермии с наночастицами коррелирует с возникающими в них морфологическими изменениями.

7. Количественная динамика пассивного накопления золотых наноочастиц в перевитых опухолях имеет два временных интервала максимального повышения концентрации золота в опухоли. Первый максимум, обусловленный васкуляризацией опухоли, соответствует максимальной концентрации наночастиц в циркулирующей крови, второй максимум обусловлен фенестрацией эндотелия сосудов опухоли и наблюдается спустя 24 часа после системного введения золотых наночастиц. Локальная лазерная гипертермия с плазмонно-резонансными золотыми наночастицами приводит к регрессии и ингибированию роста перевитых опухолей у экспериментальных животных.

8. Быстрая и эффективная деструкция опухолевых клеток без повреждения вышележащих тканей возможна на глубине до 8 мм при согласовании длины волны лазерного излучения, соответствующей окну прозрачности биоткани и пика поглощения золотых плазмонно-резонансных наночастиц. Клетки ороговевающего плоскоклеточного рака имеют более высокую устойчивость к такому воздействию, чем клетки неороговевающего.

9. Многократная лазерная гипертермия с использованием золотых плазмонно-резонансных наночастиц приводит к усилению иммунного отклика организма животного на пролонгированную стимуляцию опухолевыми антигенами и проявляется в повышении процентного содержания натуральных киллеров, уровней IgM и интерлейкина-2, снижении соотношения CD4/CD8. Сочетание фармакологической иммуномодуляции и локальной гипертермии с использованием золотых плазмонно-резонансных наночастиц усиливает общую иммунореактивность организма экспериментальных животных.

       Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Терентюк Г.С., Максимова И.Л. Нейросетевой подход в диагностике злокачественных новообразований молочных желез. //Альманах клинической медицины. МОНИКИ, 2006. Т.XII, С.63.

2. Тимофеев С.В., Терентюк Г.С. Особенности функционального состояния иммунной системы у собак, больных раком молочной железы. //Ветеринарная медицина, 2006. № 4. С.19.

3. Zharov V., Galanzha E., Shashkov E., Maksimova I., Khlebtsov B., Khlebsov N., Terentuk G., Akchurin G., Tuchin V. In vivo  detection and killing of individual circulating metastatic cells. // Laser Surg. Med., 2007. V.19. p.47-48.

4. Maksimova I.L., Akchurin G.G., Khlebtsov B.N., Terentyuk G.S., Akchurin G.G.Jr., Ermolaev I.A., Skaptsov A.A., Soboleva E.P., Khlebtsov N.G., Tuchin V.V. Near-infrared laser photothermal therapy of cancer by using gold nanoparticles: Computer simulations and experiment. //Med Laser Appl., 2007. V.22. р. 199-206.

5. Терентюк Г.С., Жандарова Л.Ф., Конопацкова О.М., Непомнящая Е.М. , Гудцкова Т.Н., Сулейманова Л.В., Черванев В.А., Максимова И.Л., Хлебцов Б.Н., Богатырев В.А, Дыкман Л.A., Хлебцов Н.Г. Применение иммуностимуляторов и фототермической лазерной терапии при меланоме у собаки. //Известия ВУЗов Северо-Кавказский регион, 2007. № 5. С.139-141.

6. Терентюк Г.С. Химиотерапия рака молочных желез у собак. //Ветеринарная патология. 2008. №1(24). С.76-80.

7. Забродский П.Ф., Терентюк Г.С., Плахута И.А. Сравнительная характеристика эффективности иммуномодуляторов при иммунодефиците, обусловленном циклофосфамидом. //Вестник ВолГМУ, 2007. №1(21). С.37-39.

8. Терентюк Г.С., Трояновская Л.П., Конопацкова О.М., Акчурин Г.Г., Максимова И.Л. Термографический метод в ветеринарной и сравнительной онкологии. //Российский ветеринарный журнал мелкие домашние и дикие животные, 2008. №3. С.11-15.

9. Терентюк Г.С., Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г., Долганова М.В., Иванов А.Н., Киричук В.Ф., Максимова И.Л., Маслякова Г.Н., Трояновская Л.П., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Шантроха А.В. Особенности воздействия золотых наночастиц и их конъюгатов на физиологические показатели организма при онкозаболеваниях. //Российский биотерапевтический журнал, 2008. Т.7. №1. С.33.

10. Максимова И.Л., Акчурин Г.Г., Ревзина Е.М., Рябухо В.П., Скапцов А.А., Терентюк Г.С., Тучин В.В., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. Использование наночастиц для контрастирования злокачественных новообразований при оптических методах диагностики (низкокогерентная томография, спектроскопия диффузного отражения). //Российский биотерапевтический журнал, 2008. Т.7. №1. С.30.

11. Максимова И.Л., Акчурин Г.Г., Терентюк Г.С., Хлебцов Б.Н., Акчурин Г.Г.мл.,  Ермолаев И.А., Скапцов А.А., Ревзина Е.М., Тучин В.В, Хлебцов Н.Г. Лазерный фототермолиз биотканей с использованием плазмонно-резонансных наночастиц. //Квантовая электроника, 2008. Т.38. №6. С.536-542.

12. Черванев В.А., Терентюк Г.С. Способ дренирования области удаленного подмышечного лимфоузла у собак при мастэктомии первой пары молочных желез с лимфапоэктомией Патент на изобретение № 2298421, дата приоритета 26.09.2005, Бюл. № 13

13. Черванев В.А., Терентюк Г.С. Способ лечения остеолизиса при метастазировании злокачественного образования в кости у собак. Патент на изобретение № 2299738. 2007, дата приоритета 08.12.2005, Бюл. №15.

14. Черванев В.А., Терентюк Г.С. Способ коррекции иммунной недостаточности при лечении верифицированных форм рака молочной железы и меланомы собак. Патент на изобретение № 2320293, дата приоритета 07.11.2006, Бюл. №9.

15. Акчурин Г.Г., Максимова И.Л., Сулейманова Л.В., Пчелинцева Н.О., Терентюк Г.С., Черванев В.А. Способ лазерной деструкции меланомы слизистой оболочки у собак. Патент на изобретение № 2329074, дата приоритета 7.02.2008, Бюл. №20.

16. Черванев В.А., Терентюк Г.С. Способ овариогистерэктомии при раке левого яичника с экстирпацией метастаз из забрюшинного пространства у животных. Патент на изобретение № 2338472, дата приоритета 19.03.2007, Бюл. №32.

17. Терентюк Г.С. Способ расширенной мастэктомии пятой молочной железы с первичной опухолью при наличии метастазов в поверхностный паховый лимфоузел у собак. Патент на изобретение №2342102, дата приоритета 24.08.2007.

18. Терентюк Г.С. Полихимиотерапевтический способ лечения и реабилитации собак при неоплазии молочных желез. //Труды 2 международной конф. "Здоровье, разведение, защита мелких домашних животных" - Уфа, 2001. С.77-79.

19. Терентюк Г.С. Мастэктомия в сочетании с лимфоденэктомией опухоли молочных желез у собак. //Труды 10 Московского международ. ветеринар. Конгресса - Москва, 2002.С.170-172.

20. Бабушкин В.А., Терентюк Г.С., Ключников А.Г. Коррекция гиповолемии у собак при тяжелых формах гестозов ЭМИ КВЧ-диапазона. //ММ-волны в биологии и медицине. 2003. №3. С.17-19.

21. Терентюк Г.С. Практический подход к диагностике и лечению неоплазии репродуктивных органов у сук. //Ветеринария Поволжья, 2003. №2(5). С.30-31.

22. Терентюк Г.С., Авдеенко В.С. Оценка состояния плода и новорожденного приплода при синдроме внутриутробной задержки развития. // Труды Международ. науч.-практ. конф. "Развитие народного хозяйства в Западном Казахстане" - Уральск, 2003. С.290-291.

23. Терентюк Г.С., Авдеенко В.С. Диагностика фетоплацентарной недостаточности у беременных собак с экстрагенитальной патологией. // Труды Международ. науч.-практ. конф. "Развитие народного хозяйства в Западном Казахстане" - Уральск, 2003. С.293-294.

24. Терентюк Г.С. Проведение реанимации мелких домашних животных. //Ветеринария Поволжья, 2003. №1(4). С.37-38.

25. Терентюк Г.С., Черванев В.А., Трояновская Л.П., Пальцев С.С. Практические рекомендации по иммуноферментной диагностике онкологических заболеваний органов размножения у животных, - Воронеж, Изд-во ВГАУ, ISBN 5-7267-0404-5, 2005. - 35с.

26. Терентюк Г.С. Диагностика и оперативно-консервативные методы лечения злокачественных новообразований молочных желез у собак. - Воронеж, "Истоки", ISBN 5-7267-0409-6, 2006. - 40с.

27. Дмитриев А.В., Терентюк Г.С. Распространение, этиология и клинические проявления мочекаменной болезни у котов и кошек. //Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина», - Саратов, 2006. С.132-135.

28. Музалевская А.В., Терентюк Г.С. Лечение хронической интоксикации на фоне фиброзно-кистозной мастопатии собак. //Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина», - Саратов, 2006. С.256-257.

29. Пчелинцева Н.О., Терентюк Г.С. Биохимические показатели крови при различных видах простатита. //Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина», - Саратов, 2006. С.283-284.

30. Терентюк Г.С. К вопросу о терапии рака молочной железы у собак. //Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики, терапии и профилактики болезней домашних животных», - Воронеж, 2006. С.295-296.

31. Терентюк Г.С. Применение ронколейкина в ветеринарной онкологии. //Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики, терапии и профилактики болезней домашних животных», - Воронеж, 2006. С.297-299.

32. Терентюк Г.С. Значение определения уровня D-димера в плазме крови собак, больных раком молочной железы.//Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики, терапии и профилактики болезней домашних животных», - Воронеж, 2006. С.328-329.

33. Терентюк Г.С. Применение метода клинической цитологии в ветеринарной практике. - Воронеж, «Истоки», ISBN 5-7267-0410-X, 2006. - 24с.

34. Терентюк Г.С., Черванев В.А., Пальцев С.С. Неоплазии молочных желез у собак. - Воронеж, «Истоки», ISBN 5-7267-0418-5, 2007. - 152с.

35. Terentuk G.S., Plahuta I.A. Features of pharmacological regulation of disturbances of the immune answer caused by cyclophosphamide. ICT XI 2007 Montreal, Canada International Congress of Toxicology 15-19 July ICT XI, IUTOX2007-3156.

36. Maksimova I. L., Terentyuk G. S., Genina E. A., Skaptsov A. A., Tuchin V.V., Khlebtsov B. N., Bogatyrev V. A., Dykman L. A., Khlebtsov N. G. Diagnostic potentialities of plasmon-resonant nanoparticles as contrast agents for the diffuse back scattering spectroscopy of biotissues. //Proc. SPIE. 2007. V. 6536. P. 65360C (1-10) (doi: 10.1117/12.753447).

37. Terentyuk G.S., Maksimova I.L., Tuchin V.V., Zharov V.P., Khlebtsov B.N., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov N. G. Application of gold nanoparticles to x-ray diagnostics and photothermal therapy of cancer // Proc. SPIE. 2007. V.6536. P. 65360B (1-12). (doi: 10.1117/12.753446).

38. Akchurin G.G.Jr, Akchurin G.G., Bogatyrev V.A., Maksimova I.L., Seliverstov G.A., Khlebtsov B.N., Khlebtsov N.G., Terentyuk G.S., Tuchin V.V. Near-infrared laser photothermal therapy and photodynamic inactivation of cells by using gold nanoparticles and dyes. // Proc. SPIE, 2007. V. 6645, p. 66451U.

39. Terentyuk G.S., Akchurin G.G., Maksimova I.L., Maslyakova G.N., Suleymanova L.V., Tuchin V.V. Optimization of laser heating with the treatment of spontaneous tumors of domestic animals by the use of the thermography. //Proc. SPIE, 2008. V. 6791, p. 67910Q-10, DOI:10.1117/12.803985.

40. Akchurin G.G., Khlebtsov B.N., Khlebtsov N.G., Kolbenev I.O., Lychagov V.V., Maksimova I.L., Ryabukho V.P., Skaptsov A.A., Terentyuk G.S., Tuchin V.V. Dynamic of gold nanoparticles labeling studied on the basis of OCT and backscattering spectra of tissues and phantoms  //Proc. SPIE. 2008. V. 6855, р. 68550K

41. Терентюк Г.С. Отчет по НИР «Разработка нанотехнологии лазерного селективного фототермолиза и контрастирования злокачественных новообразований на основе использования плазмонно-резонансных наночастиц» рег. номер темы 0120.0 801037, инвентарный № 0220.0 800223 в ЦИТиС, 2008. 78с.

42. Данилова Т.В., Конопацкова О.М., Терентюк Г.С. Компьютерная обработка термограмм для оценки параметров новообразований кожи и слизистых оболочек. //Математические методы в технике и технологиях. – ММТТ-21,  Сборник трудов ХХI Международной научной конференции в 10т. Т.9, ISBN 978-5-7433-1926-8 - Саратов, 2008. – c.52-54.

43. Терентюк Г.С., Трояновская Л.П., Соболева Е.П., Акчурин Г.Г., Максимова И.Л., Сулейманова Л.В. Оптимизация режимов лазерного термического воздействия для стимуляции процессов апоптоза при онкологических заболеваниях у мелких домашних животных. Материалы ХVI Московского международного конгресса по болезням мелких домашних животных, - Москва, 26-28 апреля 2008. с.44-45

44. Терентюк Г.С., Трояновская Л.П., Соболева Е.П., Храмова М.И. Лечение миокардита, осложненного синоатриальной блокадой у лошадей. Материалы Всероссийского ветеринарного конгресса, - Москва, 26-28 апреля 2008. с.137-138

45. Терентюк Г.С., Акчурин Г.Г., Максимова И.Л., Маслякова Г.Н., Сулейманова Л.В., Тучин В.В., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Шантроха А.В. Применение золотых наночастиц для селективной фототермической терапии злокачественных новообразований. Труды V Съезда фотобиологического общества. - Пущино 8-13 июня 2008. С.216.

46. Максимова И.Л., Рыскин НМ., Терентюк Г.С.  Особенности иммунного ответа при лазерной гипертермии. Труды V Съезда фотобиологического общества. - Пущино 8-13 июня 2008. С.234.

47. Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г., Максимова И.Л., Селиверстов Г., Терентюк Г.С., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Тучин В.В. Инфракрасный лазерный фототермолиз и фотодинамическая инактивация клеток при взаимодействии излучения с фотосенсибилизаторами и плазмонно-резонансными наночастицами. Труды V Съезда фотобиологического общества. - Пущино 8-13 июня 2008. С. 163.

48. Akchurin G. G.; Akchurin G. G.; Ivanov A. N.; Kirichuk V.F.; Terentyuk G. S.; Khlebtsov  B. N.; Khlebtsov N. G. Influence of gold nanoparticles on platelets functional activity in vitro. //Proc. SPIE, 2008. V. 6869, p. 68690V-6.

49. Akchurin G.G.; Maksimova I.L.; Rybukho V.P.; Lychagov V.V.; Khlebtsov B.N.; Khlebtsov N.G.; Akchurin G.G., Jr.; Kolbenev I.O.; Maksimov V.Y.; Naumova O.G.; Skaptsov A.A.; Terentyuk G.S.; Tuchin V.V. Dynamic of gold nanoparticles labeling studied on the basis of OCT and backscattering spectra of tissues and phantoms. //Proc. SPIE, 2008. V. 6855, p. 68550K-10.

50. Данилова Т.В., Терентюк Г.С., Компьютерная обработка термограмм для оценки асимметрии новообразований кожи и слизистых оболочек у человека и животных, 2008 Труды конференции (АПЭП-2008) 24-25 сентября 2008. - Саратов. С.473-478.

51. Suleymanova L.V., Тerentyuk G.S., Maslyakova G.N., Kogan B., Khlebtsov N.G., Khlebtsov B.N., Akchurin G. G., Maksimova I.L., Shantrocha A.V., Tuchin A.V., Changes of biological tissues and biochemical changes after intravenous injection of gold nanoparticles, Proc. 7th International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine, - Wuhan, China, 24-27 November 2008. P.6-37.

52. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Б.Н., Терентюк Г.С., Максимова И.Л., Акчурин Г.Г., Шантроха А.В., Тучин В.В. Золотые наночастицы для применений в диагностике и терапии онкозаболеваний, Труды всероссийской конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008», - Москва, Российский научный центр «Курчатовский институт», 2008. - C. 176.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.