WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

РОМАНОВА Елена Борисовна

Иммунофизиологические механизмы поддержания гомеостаза организма в условиях воздействия стрессорных факторов среды обитания

03.00.13 – Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Нижний Новгород

2008

Работа выполнена на кафедре экологии Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского

Научный консультант:                        доктор биологических наук, профессор

ГЕЛАШВИЛИ Давид Бежанович

Официальные оппоненты:                доктор биологических наук

АНАСТАСИЕВ Валентин Васильевич

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук

ЗАХАРОВ Владимир Михайлович

доктор биологических наук

ЯГИН Валерий Васильевич

Ведущая организация:                        Нижегородская государственная медицинская академия

Защита состоится «____» _____________2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д. 212.166.15 Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, д.23, корп.1, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университете им. Н.И.Лобачевского

Автореферат разослан «___»_______________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, доцент                                                А.С. Корягин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.



Актуальность проблемы

Реакции адаптации организма к стрессорным факторам среды обитания проявляются, в первую очередь, на уровне ведущей физиологической регуляторной системы – иммунной, контролирующей гомеостаз организма (Иванов, 1994; Черешнев и др., 2002, Галактионов, 2004; Хаитов, 2000, 2005; Levy, Boitard, 2000). Стало привычным рассматривать иммунитет, как способ защиты организма от всех антигенно чужеродных веществ как экзогенной, так и эндогенной природы (Петров 1987; Ярилин, Добротина, 1997; Хаитов, Манько, Ярилин, 2005, 2006; Benoist, Germain, Mathis, 2006 и др.). Иммунная система имеет достаточно широкий, но в тоже время, конечный набор осуществляемых ею эффекторных реакций, комбинации которых позволяют организму противостоять огромному числу ксенобиотиков окружающей среды. Одной из составляющих взаимоотношений между организмами являются аллелохимические взаимодействия, сигналами в которых выступают химические вещества, в том числе, природные яды животного происхождения (зоотоксины). Начало исследованиям физиологических основ действия зоотоксинов, в нашей стране, положено работами профессора кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ им Н.И.Лобачевского Николаем Михайловичем Артемовым, 100-летие со дня рождения которого отмечается в 2008 году.

Согласно токсинологической классификации, ядовитые животные, продуценты зоотоксинов могут быть разделены на две большие группы: первично-ядовитые (в свою очередь подразделяющиеся на активно- и пассивно-ядовитых) и вторично-ядовитые (Павловский, 1950; Орлов, Гелашвили, 1985). С общебиологической точки зрения зоотоксины, отличаясь большим разнообразием и селективностью действия (Артемов, 1941, 1962; Каменская, 1982; Овчинников, 1990; Ташмухамедов, Усманов, 1991), являются химическими факторами межвидовых взаимодействий и относятся к алломонам, принося пользу организму-продуценту (Гелашвили, 2002). С их помощью организмы взаимодействуют между собой в течение своей эволюции, избирательно и специфически влияют на интегральные физиологические системы организма. Это и послужило основанием для выбора в качестве базовой экспериментальной модели зоотоксинов, как биотических стресс-факторов, и определило актуальность исследования иммунологических механизмов адаптационной реакции организма – реципиента на их воздействие.

       С другой стороны, в настоящее время, когда практически отсутствуют ландшафты, не подвергающиеся антропогенному влиянию, фундаментальные исследования физиологических функций иммунной системы, особенно значимы. Изучение компенсаторного потенциала иммунных реакций при антропогенной трансформации среды обитания позволяет вскрыть механизмы, благодаря которым организмы (виды, популяции) выживают и приспосабливаются к новым условиям существования. Амфибии представляют собой класс, который делает определенный прорыв в совершенствовании системы адаптивного иммунитета. Связано это с их переходом от водного образа жизни к наземному и с необходимостью иметь дополнительные возможности защиты от новой группы инфекционных агентов наземной и почвенной сред (Галактионов, 2005). У бесхвостых амфибий впервые появляются эволюционные предшественники всей совокупности лимфоидных и миелоидных органов млекопитающих. В их числе: тимус, селезенка и добавочные миелиновые органы, напоминающие гемолимфатические узелки млекопитающих (Cooper, 1976; Manning, Horton, 1982), а также функционирующая костномозговая ткань, содержащая плазматические клетки и выполняющая функцию поставщика стволовых кроветворных элементов для формирования Т- и В- клеточных популяций (Turpen et al., 1982), что обосновывает возможность оценки гематологических и иммунологических параметров этих животных в качестве показателей состояния среды. Теоретическая значимость биоиндикационных исследований связана с поиском общих физиологических закономерностей функционирования иммунной системы в изменяющихся условиях среды обитания.

       Методологическим обоснованием онтогенетических и популяционных исследований, может рассматриваться концепция (Захаров и др., 2000), нацеленная на разностороннюю характеристику гомеостаза живых организмов. Успех протекания онтогенеза может быть оценен с помощью флуктуирующей асимметрии (ФА) – незначительных, ненаправленных отклонений билатеральных структур от строгой симметрии (Захаров, 1987; Васильев, 2005; Palmer, 1986), отражающей неспецифическую реакцию организма на постоянное стрессорное воздействие.. Захаровым с сотрудниками (2000) предложена система балльной оценки, позволяющая оценить качество среды по уровню стабильности развития (ФА) индикаторных видов, а распоряжением Росэкологии от 16.10.2003 № 460 утверждены «Методические рекомендации по выполнению оценки качества среды по состоянию живых существ (оценка стабильности развития живых организмов по уровню асимметрии морфологических структур)». Интегральным показателем состояния организма считается эффективность физиологических процессов, обеспечивающих его нормальное развитие. Поэтому следующая экспериментальная модель (гомеостатические механизмы природных популяций) базируется на оценке комплекса показателей гомеостаза: уровня стабильности развития и иммунного статуса организма индикаторных видов амфибий.

       Таким образом, вышеперечисленные базовые модели легли в основу изучения закономерностей и механизмов поддержания гомеостаза организма в различных условиях его жизнедеятельности и взаимодействия со средой обитания.

Перечисленные обстоятельства позволяют считать тему диссертации актуальной и важной для современной теоретической и практической физиологии.

1.2. Цель и основные задачи исследования

Цель работы: Исследование физиологических закономерностей функционирования иммунной системы организма, поддерживающей гомеостаз, в условиях воздействия биотических стресс-факторов (зоотоксинов, как алломонов) и комплекса антропогенных неспецифических факторов среды.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. Исследовать иммуногенные свойства белковых зоотоксинов пассивно-ядовитых (колорадского жука – Leptinotarsa decemlineata Say., сем. Chrysomelidae, класс Insecta) и активно-ядовитых животных (гюрзы среднеазиатской - Vipera lebetina L., сем. Viperidae, класс Reptilia).

2. Изучить закономерности функционирования гуморальных иммунных реакций (на модели первичного иммунного ответа к Т-зависимому антигену) при введении экспериментальным животным зоотоксинов, продуцируемых представителями разных токсинологических групп.

3. Изучить закономерности функционирования клеточных иммунных реакций (на модели гиперчувствительности замедленного типа) при введении экспериментальным животным зоотоксинов, продуцируемых представителями разных токсинологических групп.

4. Исследовать фагоцитарную активность и состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеток донорской крови под влиянием ядов вооруженных активно-ядовитых животных.

5. Выявить особенности качественного состава иммунокомпетентных клеток периферической крови и лимфоидных органов (тимуса и селезенки) индикаторных видов амфибий в условиях антропогенной трансформации среды обитания.

6. Дать интегральную оценку качества среды (эпигенетическим и иммунологическим подходами) и изучить взаимосвязь лейкоцитарного состава периферической крови с уровнем средового стресса, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии (ФА) индикаторных видов амфибий (выборок из популяций зеленых лягушек урбанизированных территорий).

1.3. Научная новизна

Впервые сформулирована биофизиологическая концепция иммунотропного действия зоотоксинов, базирующаяся на токсинологической классификации ядовитых животных и интегрирующая специфику химического строения ядов и биологии их продуцентов. Выявлено дозозависимое действие ядовитых секретов активно- и пассивно- ядовитых животных в отношении формирования гуморальных иммунных реакций, проявляющееся в стимуляции в низких и угнетении в высоких дозах. Впервые показано, что клеточные иммунные реакции стимулируются белковыми ядами активно- и пассивно-ядовитых животных в низких дозах, тогда как яд небелковой природы активно-ядовитых животных угнетает их. Впервые выявлены иммуногенные свойства ядовитого секрета пассивно-ядовитых животных (колорадского жука - Leptinotarsa decemlineata Say., класс Insecta, сем. Chrysomelidae). Установлена стимуляция перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеток крови белковыми ядами активно-ядовитых животных, независимо от их таксономической принадлежности (ядами пчелы и кобры), при условии содержания в них цитотоксинов. Впервые на модели гомеостаза организма выявлена прогрессирующая лейкопения, как характерный показатель возрастания средового стресса, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии амфибий. Репрезентативным показателем усиления пресса антропогенной нагрузки на организм является возрастание доли агранулоцитов в лейкограмме периферической крови амфибий.

1.4. Научная и практическая значимость

       Работа представляет собой исследование закономерностей функционирования иммунной системы и физиологических механизмов адаптации к природным (зоотоксинам) и антропогенным стресс-факторам. На экспериментальных моделях (гуморальной и клеточной формах иммунного реагирования и иммунном статусе организма бесхвостых амфибий) показано развитие общих неспецифических иммунофизиологических реакций на действие различных стрессорных факторов. Проведен физиологический анализ иммунотропных свойств ядов животных разных токсинологических групп. Выявлена иммуномодулирующая активность зоотоксинов активно-ядовитых животных и пассивно-ядовитых животных. В работе получил дальнейшее развитие комплексный подход к оценке стабильности развития природных популяций индикаторных видов (в пределах модельного класса амфибий) методами эпигенетического и иммунологического анализа. Выявлено адаптивное значение иммуногематологических изменений в условиях загрязнения среды. На основе полученных данных разработаны технологии изготовления нового иммунобиологического препарата - аллергена из яда пчел для иммунодиагностики и специфической гипосенсибилизации больных, обладающих повышенной чувствительностью к яду пчел (патент на изобретение №1524226) и липосомальной формы яда гюрзы среднеазиатской (Vipera lebetina L.) для получения препарата для иммунотерапии.

       Тема диссертационной работы является частью исследований научного направления биологического факультета ННГУ им. Н.И.Лобачевского по теме: «Исследование процессов регуляции и управления в биосистемах с целью интенсификации, рационального использования биологических ресурсов, обеспечения экологической безопасности среды, укрепление здоровья человека». Полученные результаты, положения и выводы диссертации включены в учебные пособия: «Экологический мониторинг» Ч.2 (1995), Ч.3 (1998), Ч.4(2000), Ч.5 (2003), Ч.6 (2006), обзорные работы, используются в учебном процессе на биологическом факультете ННГУ им. Н.И. Лобачевского.

       1.5. Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на VI Всесоюзной герпетологической конференции (г. Ташкент, 18-20 сент. 1985), на заседании Ученого совета Института иммунологии МЗ СССР (г. Москва, 21 янв., 1987), на Московском научно-практическом обществе аллергологов ( г. Москва, 27 дек. 1988), на 6-ой Ростовской областной научно-практической школе-семинаре (г.Ростов-на- Дону, 10-14 сент. 1990), на Всесоюзной конференции «Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза» ( г. Сыктывкар, 4-8 июня, 1991), на Всесоюзной конференции «Получение, свойства, анализ и применение соединений с молекулярной кристаллической решеткой для новой технике» (г. Нижний Новгород, 10-12 сент. 1991), на VI Всесоюзном совещании «Применение металлоорганических соединений для получения неорганических покрытий и материалов» (г. Нижний Новгород, 16-18 сент. 1991), на Первой Всесоюзной токсинологической конференции (г. Ашхабад, 8-12 окт. 1991), на Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды» (г. Томск, 12-16 сент. 1995), на Международной конференции «Экологические аспекты устойчивого развития региона (г. Новгород, 1995), на Первой конференции герпетологов Поволжья (г. Тольятти, 27-30 ноября 1995), на симпозиуме с международным участием «Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциальным условиям среды» (г. Ульяновск, 24-26 сент. 2002), на Международной и молодежной конференции «Экологические проблемы крупных рек-3» (г.Тольятти, 15-19 сент. 2003), на VII Всероссийском популяционном семинаре (г. Сыктывкар, 16-21 февр. 2004), на VIII Всероссийском популяционном семинаре (г. Нижний Новгород, 12-15 апр. 2005), на Второй всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека» (г. Ульяновск, 6-7 окт. 2005) на региональной межвузовской научно-практической конференции «Человек. Природа. Общество» (г. Нижний Новгород, 15 марта 2006), на Международной научно-практической конференции в области экологии и безопасности жизнедеятельности «Дальневосточная весна -2006» (г. Комсомольск – на - Амуре, 27 апр. 2006), на  IX Всероссийском популяционном семинаре (г. Уфа, 2-6 окт. 2006), на IX конгрессе по апитерапии  «Апитерапия сегодня» (г. Рыбное, 25-26 мая 2006), на Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (г. Ульяновск, 24-28 сент. 2007), на VIII Межд. научно-практической конференции «Экологическая безопасность регионов России и риск от техногенных аварий и катастроф», (Пенза, 25-26 апр. 2008).

1.6. Основные положения, выносимые на защиту

1. В поддержании гомеостаза организма позвоночных животных в ответ на действие зоотоксинов закономерно развиваются общие неспецифические иммунофизиологические реакции.

       2. Иммунотропная активность зоотоксинов зависит не только от их химической природы, но и положения организма-продуцента в токсинологической классификации.

3. Гуморальные иммунные реакции стимулируются низкими и угнетаются высокими дозами ядов активно- и пассивно-ядовитых животных.

4. Белковые яды активно- и пассивно-ядовитых животных в низких дозах стимулируют клеточные иммунные реакции, тогда как яд небелковой природы невооруженных активно-ядовитых животных угнетает их.

       5. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) клеток крови стимулируется белковыми ядами активно-ядовитых животных, независимо от их таксономической принадлежности (ядами пчелы и кобры), при условии содержания в них цитотоксинов.

       6. Прогрессирующая лейкопения индикаторных видов амфибий является характерным показателем возрастания средового стресса, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии.

7. Репрезентативным показателем усиления пресса антропогенной нагрузки на организм является возрастание доли агранулоцитов в периферической крови индикаторных видов амфибий.

1.7. Публикации

       По материалам диссертации опубликовано 58 научных работ, в том числе 12 работ в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и получен 1 патент.

1.8. Структура и объем работы

Решение поставленных задач определило структуру диссертационной работы, состоящую из введения, 7 глав, заключения, выводов. Диссертация изложена на 340 страницах. Работа иллюстрирована 46 таблицами, 60 рисунками. Список использованной литературы включает 339 отечественных и 366 зарубежных источников.

1.9. Личный вклад соискателя

В основу диссертационной работы положены многолетние (1984-2008 гг.) исследования по изучению физиологических механизмов поддержания гомеостаза организма. Постановка проблемы, проведение экспериментальных исследований, обработка и оценка результатов, интерпретация полученных материалов и научные выводы диссертационной работы принадлежат автору.

Благодарности. Автор считает своим долгом выразить искреннюю сердечную благодарность и признательность своему научному консультанту д.б.н., профессору Д.Б. Гелашвили. Автор благодарен соавторам и сотрудникам клинико-диагностической лаборатории и лаборатории молекулярной иммунологии Института иммунологии МЗ РФ; лаборатории инженерной энзимологии Института экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН РФ (г. Москва); лаборатории молекулярной иммунологии бактериальных и вирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии и лаборатории биохимии НИЦ «Биофармавтоматика» (г. Нижний Новгород), где выполнялась часть работы. Автор выражает слова благодарности соавторам, коллегам, коллективу биологического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского за помощь и участие в выполнении работы. Автор благодарен д.м.н., профессору Н.А. Добротиной, д.б.н., профессору В.В. Новикову, д.б.н. профессору А.П. Веселову, к.б.н. Е.И.Исаевой за конструктивные замечания, советы и помощь.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ. Включает обоснование актуальности темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна, научная и практическая значимость и положения, выносимые на защиту.

       Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Современные проблемы иммунофизиологических механизмов адаптации организма к стрессорным факторам среды»

В главе представлена сводка современных основных работ отечественных и зарубежных исследователей, посвященных характеристике структурно-функциональных блоков иммунной системы; даны представления о физико-химических свойствах и механизмах действия животных ядов, вырабатываемых продуцентами разных токсинологических групп; анализируются эпигенетический и иммунологический подходы для комплексной оценки стабильности развития живых организмов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика материалов и объектов исследования

В работе были использованы выборки из природных популяций амфибий рода Rana и лабораторные животные – всего 2254 особи, яды животных (зоотоксины) разных систематических групп, донорская кровь и плазма (табл.1).

Таблица 1

Экспериментальные животные и биологические материалы, использованные в работе

№ п/п

Вид экспериментального животного или биологического материала, масса

Методика исследования

Количество, особи

1

Мыши линии СВА, 18-20г

Метод локального гемолиза

200

2

Мыши линии (СВАхС57Bl)F1 –гибриды, самцы, 18-20 г

Метод локального гемолиза, метод агглютинации, реакция ГЗТ

620

3

Мыши линии Balb/c, 18-20г

Реакция ГЗТ, острая токсичность, метод локального гемолиза

260

4

Белые беспородные лабораторные мыши, 16-18 г

Оценка острой токсичности, получение иммунных сывороток

70

5

Белые беспородные лабораторные крысы, 180-200 г

Определение коагулазной активности

25

6

Морские свинки, 200-250 г

Хроническая токсичность, анафилактогенные и иммуногенные свойства, метод пассивной кожной анафилаксии

54

Морские свинки, 240-280 г

Метод пассивной кожной анафилаксии

55

7

Выборки из природных популяций зеленых лягушек рода Rana

Основные гематологические и иммунологические показатели, метод флуктуирующей асимметрии

970

8

Донорская кровь

Оценка фагоцитарной активности клеток крови, перекисное окисление липидов (ПОЛ)

1000 мл

9

Донорская жидкая цитратная плазма

Определение гемокоагулирующей активности

500 мл

10

Сухая лиофилизированная плазма крови

Определение гемокоагулирующей активности

500 мл

Природные животные яды (зоотоксины). Яды рептилий (Reptilia) (подотряд змей-Ophidia): гадюки обыкновенной – Vipera berus L., сем. Viperidae; гюрзы среднеазиатской – Vipera lebetina L., сем. Viperidae; эфы песчаной – Echis carinatus Schneid., сем. Viperidae; гадюки Никольского – Vipera nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva сем. Viperidae; кобры среднеазиатской – Naja oxiana Eichw., сем. Elapidae, полученные из Института экологии Волжского бассейна РАН и НПФ «Биоком» (г.Тольятти). Яды амфибий (Amphibia): зеленой жабы – Bufo viridis Laur., сем. Bufonidae; яды паукообразных(Arachnida): кавказского скорпиона – Buthus caucasicus Nordm., сем. Buthidae; яды насекомых (Insecta): пчелы медоносной – Apis mellifera L., сем. Apidae; колорадского жука – Leptinotarsa decemlineata Say., сем.Chrysomelidae, полученные в экспедициях сотрудниками кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ.

Образцы ядов готовились непосредственно перед опытом и вводились в дозах кратных ЛД50. ЛД50 определяли для каждого образца яда на лабораторных животных методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький, 1963).

Антитела к зоотоксинам. Для получения иммунных сывороток белым лабораторным мышам (20 особей, массой 18-20 г, содержащихся на обычном рационе вивария), трехкратно подкожно вводили стерильный раствор яда гюрзы среднеазиатской (3,0 мкг/мышь) в течение 3 месяцев с интервалом в 3 недели. Иммунизацию мышей гемолимфой колорадского жука проводили двумя способами: однократно, внутрибрюшинно в дозах 0,5-5,5 мг/кг с забором крови (методом декапитации) на 7, 15 и 24 сутки первичного иммунного ответа и трехкратно, подкожно, по 3 мкг/мышь с интервалом в три недели. После окончания иммунизации, в полученных сыворотках, выявляли специфические антитела одним из вариантов твердофазного иммуноферментного анализа (ПАП-методом) (Новиков, Андреев, 1987). Сорбцию антигенов яда гюрзы (в концентрации 1,0 мг/мл, по 150 мкл в натрий фосфатном буфере, рН 7,3 ± 0,1) проводили в лунках полистероловой планшеты с последующей инкубацией при +40С в течение 24 ч. Для постановки сандвич-варианта иммуноферментного анализа (Коллинз, 1991) использовали коммерческий препарат моновалентной противозмеиной сыворотки «Антигюрза» (Ташкентский НИИ вакцин и сывороток), кроличьи антитела к иммуноглобулинам лошади и антикроличий конъюгат с пероксидазой хрена.

Липосомы. Из очищенного фосфатидилхолина (10% лецитин-стандарт) получали липосомы, в которые включали нативный яд Vipera lebetina (0,04 ЛД50) двумя способами: методом обращения фаз (Szoka, Papahadjopoulos, 1978); либо диспергированием (Bangham, Standish, Watkins,1965). Формирование липосом и процент включения яда оценивали флуоресцентным методом, используя в качестве метки флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ, «Serva») и кальцеин («Serva»). Полноту удаления несвязанного ФИТЦ-меченного яда контролировали центрифугированием в градиенте плотности фиколла (ультрацентрифуга “Beckman”35 тыс.об./мин, 170С, 1 ч). Из каждой пробирки отбирали по 10-11 фракций и определяли интенсивность флуоресценции до и после добавления детергента (Тритон Х-100) и, соответственно, процент связывания яда с фосфолипидными липосомами.

Аллерген из пчелиного яда. Аллерген приготовлен из нативного яда пчел медоносных – Apis mellifera L., стабилизированного сывороточным человеческим альбумином (0,03 мкг/мл) и лиофилизированного. В работе использовали четыре лабораторно-экспериментальные серии аллергена (1000 мкг белка яда). Сухой препарат растворяли в 1 мл разводящей альбуминовой жидкости, содержащей 0,3 % раствора альбумина человека в жидкости Эванса-Кока. Безвредность и острую токсичность проверяли на мышах (50 особей), массой 16-18 г. Хроническую токсичность, специфические иммуногенные свойства – на морских свинках, массой 200-250 г, содержащихся на обычном рационе вивария.

2.2. Методы исследования гуморальных иммунных реакций

Экспериментальная модель in vivo первичного иммунного ответа. Экспериментальной моделью первичного иммунного ответа на тимусзависимый антиген являлась иммунизация мышей линии СВА и (СВА х С57Bl) F1 – гибридов 10% взвесью эритроцитов барана (ЭБ). На 5, 7 и 10 сутки иммунного ответа, в селезенке мышей определяли число антителообразующих клеток (АОК) методом локального гемолиза (Jerne, Nordin, 1963; Cunnigham, 1965).

Антитела в сыворотке крови иммунизированных животных. Титр антител (до 30 суток иммунного ответа) в сыворотке крови мышей определяли реакцией гемагглютинации (Кэбот, Мейер, 1968). Результаты выражали через log2Т, где Т - наибольшее разведение сыворотки, дающее положительную реакцию (++).

2.3. Методы исследования клеточных иммунных реакций

Экспериментальная модель гиперчувствительности замедленного типа. Для индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo применяли метод Tamura et al. (1983) с дополнениями (Подоплелов, Крылов, Медуницын, 1985). При воспроизведении реакции использовали разные антигены: тимусзависимый – эритроциты барана (Collins, Morrison, 1976) или растворимые белковые – яичный альбумин (ЯА), метилированный бычий сывороточный альбумин (МБСА, “Serva”, Германия) (Земсков и др., 1988). Для индукции реакции ГЗТ к белковому антигену применяли метод сенсибилизации животных МБСА (250 мкг/0,1 мл) с использованием в качестве адъюванта красителя синего Эванса (ЭС, “Serva”, Германия), для оценки супрессорного действия или без применения адъюванта – для оценки стимулирующего действия. Местную реакцию на введение разрешающей инъекции антигена (25 мкг) оценивали через 24ч по разнице массы опытной и контрольной конечностей каждой мыши. В опыты были включены группы мышей, которым делали только разрешающую инъекцию антигена (отрицательный контроль) и животные, получавшие как сенсибилизирующую, так и разрешающую инъекцию антигена (положительный  контроль).

2.4. Методы оценки иммуногенных и анафилактогенных свойств зоотоксинов

Иммуногенные свойства. Оценку иммуногенных характеристик аллергена проводили методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА) (Ovary, Benacerraf, Block, 1963). Для сенсибилизации использовали аллерген из яда пчел (по 0,1 мл в подушечки четырех лап). Сыворотку крови получали на 28-30 день внутрисердечным забором. Разведения сыворотки (1:2 – 1:1024) вводили интактным морским свинкам-альбиносам. Через 24 ч животные получали разрешающую инъекцию в объеме 0,2 мл на 100 г массы тела. Затем животных забивали и проводили учет реакции по внутренней стороне снятой шкурки.

Анафилактогенные свойства. Животным, на 30-40 день после сенсибилизации аллергеном из яда пчел, вводили разрешающую дозу пчелиного яда. Анафилактический индекс  определяли по Вейглу (Weigle et al., 1960).

2.5. Методы оценки функциональной активности и состояния перекисного окисления липидов (ПОЛ)

Фагоцитарная активность. Фагоцитирующую активность клеток крови изучали с помощью люминолзависимой хемилюминесценции (Добротина и др., 1991). Измерения проводили на биохемилюминометре БХЛ-06, производства НИЦ «Биоавтоматика» г. Нижний Новгород. В качестве наблюдаемых параметров использовали интенсивность и светосумму хемилюминесценции сигнала (в мВ).

Перекисное окисление липидов (ПОЛ). Оценку интенсивности процесса ПОЛ эритроцитов донорской крови проводили с помощью системы сульфат железо-перекись водорода (Владимиров, Арчаков, 1982). Змеиные яды использовали в концентрациях 50 и 100 мкг/мл; пчелиный яд в концентрации 1,0 и 2,5 мкг/мл.

2.6. Методы эпигенетического и иммунологического подходов для оценки состояния природных популяций

Стабильность развития. В качестве объекта был использованы фоновые виды зеленых лягушек рода Rana. Стабильность развития оценивали по интегральному показателю флуктуирующей асимметрии (Захаров, 1978; Захаров, Чубинишвили, 2001). Определение пола и возраста лягушек проводили по стандартной методике (Шляхтин, Голикова, 1986). При учете асимметрии меристических признаков (bij) в альтернативной форме, когда при наличии асимметричного признака bij = 1, и когда признак симметричен bij=0 (Захаров и др., 2000), долю асимметричных признаков вычисляли по формуле (Гелашвили и др., 2001): , где n- количество признаков, j=1,..n,  m- количество особей в выборке, i=1,..m., bij – асимметричные меристические признаки. Степень отклонения качества среды от нормы определяли по нарушению стабильности развития (по величине ФА) земноводных и оценивали по пятибалльной шкале (Методические рекомендации.., 2003).

Лейкограмма периферической крови. Определение содержания в крови лейкоцитов и количественную оценку основных популяций ядросодержащих клеток периферической крови амфибий проводили общепринятым способом (Меньшиков и др., 1987).

Иммунограмма периферической крови и лимфоидных органов (тимуса и селезенки). Для определения содержания Т-лимфоцитов (Т-РОЛ%) использовали метод розеткообразования с эритроцитами курицы. В-лимфоциты (В-РОЛ%) определяли в тесте розеткообразования с эритроцитами барана, нагруженными антителами к иммуноглобулинам лягушки (Исаева, Вязов, 1996). Определение содержания нулевых клеток проводили по формуле: нулевые клетки, % = 100% – (В-РОЛ% + Т-РОЛ%).





Фагоцитарная активность. Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали по  способности поглощать клетки пекарских дрожжей (Иммунологические..,1988).

2.7. Статистический анализ

Полученные экспериментальные данные обрабатывали с использованием параметрических (критерий Стьюдента, в том числе с поправкой Бонферрони, дисперсионный однофакторный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса) и непараметрических (коэффициент ранговой корреляции Спирмана, критерий Крускала-Уоллеса, критерий Манна-Уитни, критерий Фридмана) методов математической статистики. За величину уровня статистической значимости принимали р=0,05.

2.8. Методы обобщения экспериментальных данных

Для интегральной характеристики качества окружающей среды применяли обобщенную функцию желательности (Адлер и др., 1976; Максимов, 1980; Kaitala, Maximov,1986; Носов, Булгаков, Максимов, 1997; Гелашвили, Чупрунов, Иудин, 2004).

Глава 3. ОЦЕНКА ИММУНОТРОПНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЗООТОКСИНОВ

Согласно токсинологической классификации, ядовитые животные могут быть разделены на две большие группы: первично-ядовитые и вторично-ядовитые (Павловский, 1950; Орлов, Гелашвили, 1985). К первично-ядовитым животным относятся организмы, вырабатывающие ядовитый секрет в специальных железах или имеющие ядовитые продукты метаболизма в тканях и органах. Ядовитость этих животных является видовым признаком и встречается у всех особей данного вида. Вторично-ядовитые – аккумулируют экзогенные яды в своем теле и проявляют токсичность только при попадании внутрь другого организма.

Первично-ядовитые по способам выработки яда и его применения делятся на активно- и пассивно-ядовитых. Активно-ядовитые животные, имеющие специализированный ядовитый аппарат, снабженный ранящим устройством, позволяющим им вводить яд в тело жертвы минуя пищеварительный тракт, называются вооруженными. Другая группа активно-ядовитых животных, ядовитые аппараты которых лишены ранящего приспособления, относятся к невооруженным. Яды этих животных выполняют в основном, защитные функции, т.е. являются отпугивающими веществами. У пассивно-ядовитых животных ядовитые метаболиты вырабатываются в организме, накапливаются в различных органах и тканях и эффективны при попадании с пищей.

Первой стадией исследования иммунотропных свойств физиологически активных веществ является оценка их иммуногенной активности. В данной серии экспериментов исследовали белковые яды змей: гадюки обыкновенной – Vipera berus L. и гюрзы среднеазиатской – Vipera lebetina L., класс Reptilia, сем. Viperidae, а также, гемолимфу колорадского жука – Leptinotarsa decemlineata Say., класс Insecta, сем. Chrysomelidae.

Рис.1. Уровень накопления антител, специфичных к гемолимфе колорадского жука, в сыворотке крови животных при однократной (1) и трехкратной (2) иммунизации.

По оси ординат – величина светопропускания (длина волны = 492нм).

Использование иммуноферментного анализа (ПАП-метод) (Новиков, Андреев, 1987), позволило выявить иммуногенные свойства практически не изученного в иммунологическом аспекте белкового зоотоксина – гемолимфы колорадского жука. Действие гемолимфы было дозозависимым: титр антител в сыворотке крови иммунизированных животных после трехкратной иммунизации, превышал аналогичный показатель после однократной иммунизации (рис. 1).

При оценке активности сывороток животных, иммунизированных ядом гюрзы среднеазиатской, также были выявлены специфичные к яду антитела. Данная система позволяла оценить иммуногенную активность близких по химическому составу змеиных ядов сем.Viperidae (рис.2). Титры антител в сыворотках крови экспериментальных животных при иммунизации ядами змей, относящихся к одному семейству, статистически значимо различались между собой, что показывает возможность применения ПАП - метода для оценки видовой принадлежности змеиных ядов.

Рис. 2. Оценка иммуногенной активности змеиных ядов методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого препарата моновалентной сыворотки «Антигюрза».

По оси ординат - значение оптической плотности растворов (отн. единицы) при = 492 нм.

       Другим методическим приемом, вносящим ясность в идентификацию животных ядов, является использование гемокоагуляционных тестов (Руководство по…, 1980; Баркаган, 1977, 1985). Воспроизведение классической методики при работе с ядами змей сем. Viperidae не позволяет различить зоотоксины, т.к. границы доверительных интервалов значений индексов коагулянтности ядов перекрываются. Так, значение индекса коагулянтности для яда гюрзы среднеазиатской составляет – (62,74 ÷ 80,89), а для гадюки обыкновенной – (60,91 ÷ 74,25).

       Таблица 2

Время рекальцификации (с) цитратной плазмы под действием змеиных ядов

Яд гадюки обыкновенной

Яд гюрзы среднеазиатской

Донорская стандартизированная цитратная плазма

41,95±3,85

21,62±0,97

р<0,001

Плазма, бедная тромбоцитами

Плазма, богатая тромбоцитами

Плазма, бедная тромбоцитами

Плазма, богатая тромбоцитами

114,62±19,78

58,03±9,59

18,34±1,54

19,18±1,36

р=0,019

р=0,518

Решить задачу можно, если, во-первых, определять абсолютное время свертывания стандартизированного образца цитратной плазмы и, во-вторых, использовать в качестве субстрата последовательно два образца плазмы: богатой и бедной тромбоцитами. В первом случае установлено, что абсолютное время свертывания под действием яда гадюки почти в 2 раза превышает время свертывания цитратной плазмы под действием яда гюрзы (табл. 2). Исходя из известной зависимости гемокоагуляционной активности яда змей от наличия в плазме тромбоцитарных факторов и фосфолипидных мембранных матриц (кефалина) (Баркаган и др., 1988; Баркаган и др., 1995), дальнейшее определение строится на вычислении отношения времени свертывания плазмы, бедной тромбоцитами к времени свертыванию плазмы, богатой тромбоцитарными факторами под действием каждого яда. Для яда гадюки это отношение 1,5 (1,14÷1,86) было статистически значимо выше, чем для яда гюрзы 1,08 (0,79 ÷ 1,38), р=0,037. Полученные данные позволяют успешно применять модифицированный метод коагулазной активности в целях идентификации и дифференцировки зоотоксинов.

* *

*

Таким образом, впервые выявлена иммуногенная активность гемолимфы колорадского жука и создана методическая база для определения близких по химическому составу змеиных ядов, являющихся основой для разработки новых лекарственных средств с широким спектром физиологической активности. Выявление закономерностей функционирования иммунной системы организма-реципиента под действием ядов животных, относящихся к разным токсинологическим группам, предполагает необходимость изучения особенностей проявления гуморальных и клеточных форм иммунного реагирования. Решению этой задачи посвящены следующие главы работы.

Глава 4. ГУМОРАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ ГОМЕОСТАЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ЗООТОКСИНОВ (МОДЕЛЬ ПЕРВИЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА)

Эволюционно возникшая и развившаяся иммунная форма защиты организма представлена многообразием клеточных и молекулярных участников, среди которых выделяют две взаимосвязанные формы иммунного реагирования: В – (гуморальная) и Т – (клеточная). Ни одна из систем не работает автономно, комплексно они создают мощный заслон от любого чужеродного в антигенном отношении материала, с которым может столкнуться организм в течение онтогенеза. Настоящая глава посвящена оценке характера действия зоотоксинов на специфические гуморальные реакции. Модельной экспериментальной системой in vivo гуморального ответа являлся метод локального гемолиза (Jerne, Nordin, 1963; Cunnigham, 1965). Данная модель позволяет изучить зависимость влияния зоотоксинов на динамику первичного иммунного ответа от дозы и времени введения.

4.1. Эффекты ядовитых секретов вооруженных активно-ядовитых животных

       Яд пчелы медоносной (Apis mellifera L.). Установлено, что нативный пчелиный яд в зависимости от дозы вызывал разнонаправленные изменения в реакциях гуморального иммунитета. В малых дозах (0,02 ЛД50) пчелиный яд обладал стимулирующим действием на иммуногенез. В широком диапазоне более высоких концентраций (ЛД10 – ЛД50) яд пчел угнетал процесс накопления антителообразующих клеток (АОК) в селезенке (рис.3) и выработку антиэритроцитарных антител в сыворотке крови мышей. Действие яда было сильнее выражено при его инъекции до введения эритроцитов барана (ЭБ).

Рис.3. Влияние пчелиного яда на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат – число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

Кроме нативного яда, в реакциях гуморального иммунитета были исследованы иммунотропные свойства очищенного аллергена из пчелиного яда. У всех сенсибилизированных свинок при внутривенном введении разрешающей дозы аллергена из яда пчел развивался анафилактический шок различной степени выраженности (от 1,5 до 3,0 баллов). Установлено, что анафилактогенная активность аллергена (2,38±0,41) не уступала аналогичным свойствам нативного яда пчел (2,33±0,42, р=0,870). Проявление анафилактической реакции было строго специфичным. Высокие иммуногенные свойства аллергена из яда пчел проявлялись и в реакции пассивной кожной анафилаксии. Титр специфических кожно-сенсибилизирующих антител в сыворотках крови морских свинок, сенсибилизированных аллергеном из яда пчел (200 мкг белка яда), составлял 1:512 – 1:1024. Наличие анафилактогенных и иммуногенных свойств соответствует требованиям, предъявляемым к аллергенным препаратам, которые могут быть использованы при диагностике и лечении аллергических заболеваний, вызванных ужалениями пчел.

Яд скорпиона кавказского (Buthus caucasicus Nordm.). При изучении действия яда скорпиона на реакции гуморального иммунитета было установлено, что он обладал модулирующим действием на формирование первичного иммунного ответа к Т-зависимому антигену. Для яда скорпиона была характерна дозовая зависимость. Наименьшая из исследованных доз яда (0,04ЛД50) не вызывала изменений количества АОК и количества выработки антиэритроцитарных антител в сыворотке крови. Увеличение дозы яда в интервале значений (0,09ЛД50 – 0,4ЛД50), приводило к стимуляции иммуногенеза, что находило отражение в увеличении числа АОК селезенки. Наибольшая из исследованных доз яда (0,6 ЛД50) проявляла супрессорное действие (рис.4). Выявлено, что яд скорпиона не влиял на иммунокомпетентные клетки, находящиеся в фазе G0 клеточного цикла, а активно действовал на процессы, развивающиеся вслед за антигенным стимулом, и пролиферативную стадию иммунного ответа.

Таким образом, установлено дозозависимое действие яда скорпиона на первичный иммунный ответ.

Рис.4. Влияние яда скорпиона кавказского на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при одновременном введении с антигеном (ЭБ).  По оси ординат – число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

Яд среднеазиатской гюрзы (Vipera lebetina L.). Наименьшая из исследованных доз яда (0,01ЛД50) не вызывала изменений в реакциях гуморального иммунитета. Увеличение дозы вводимого яда (0,1ЛД50) приводило к подавлению синтеза антителообразующих клеток (АОК)(рис.5). Более чувствительны к действию яда незрелые лимфоидные клетки. Яд гюрзы не вызывал изменения в выработке антиэритроцитарных антител в сыворотки крови мышей в динамике первичного иммунного ответа.

Рис.5. Влияние яда гюрзы среднеазиатской на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном.  По оси ординат – число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

Для снижения токсичности яда гюрзы и возможности дальнейшего изучения иммуногенных свойств зоотоксина мы получили его липосомальную форму. Использование липосом, как носителя яда, обеспечивает более высокий иммунный ответ на включенный или распределенный на их поверхности антиген (Липосомы.., 1983; Марголис,1986; Baneryi, Alving,1990) и снижает токсичность змеиных ядов (New et al., 1985; Freitas et al.,1989; Radvanyi et al., 1989). Установлено, что более эффективно захватывали яд липосомы, изготовленные методом обращения фаз (70,0±3,0 % нативного яда). Для контроля распределения яда липосомы нагружали кальцеином в концентрации самотушения (40 мкмоль) и исследовали возбуждение флуоресценции в присутствии или отсутствии детергента. Показана преимущественная локализации антигенов яда во внутреннем пространстве замкнутых фосфолипидных липосом. Рассчитанная методом пробит–анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький, 1963) средняя смертельная доза (ЛД50) нативного яда составила 2,22 (1,07 3,37) мг/кг, а липосомальной формы – 6,9 мг/кг, что свидетельствовало о снижении более чем в три раза токсичности нативного яда при его включении в липосомы. Включение яда в токсической дозе (1,0 ЛД50) в липосомы не вызывало летальности мышей, при этом титры специфических антител в сыворотках крови этих животных уже на 7 сутки иммунного ответа (8,38±0,38, р<0,001) были гораздо выше по сравнению с титрами антисывороток животных, иммунизированных свободным ядом (4,11±0,10), либо липосомами, содержащими яд в дозе 0,04 ЛД50 (4,21±0,13) (рис.6).

Рис.6. Уровень накопления антител, специфичных к яду гюрзы среднеазиатской (Vipera lebetina), на седьмые сутки после иммунизации животных свободным ядом (0,04 ЛД50) и ядом, включенным в липосомы. По оси ординат – величина оптической плотности растворов (отн.единицы) при длине волны 492 нм.

Таким образом, установлено снижение первичного иммунного ответа в условиях введения яда гюрзы (Vipera lebetina L.). Уменьшение антителообразования более выражено в индуктивный период антителогенеза. Внутрибрюшинное введение токсической дозы яда, инкапсулированной в липосомы не вызывало гибели животных. Липосомальная форма яда вызывала стимуляцию выработки специфических антител, что свидетельствовало о перспективах ее применения для производства антисывороток и защитной иммунизации против яда среднеазиатской гюрзы.

4.2. Эффекты ядовитых секретов невооруженных активно-ядовитых животных

Яд жабы зеленой (Bufo viridis Laur). Однократное внутрибрюшинное введение яда в дозе 0,01ЛД50 в различные сроки по отношению к началу иммунизации, вызывало ярко выраженный стимулирующий эффект. Более высокий уровень иммунокомпетентных клеток отмечен нами при инъекции яда до антигена. Яд жабы в дозах 0,08ЛД50 – 0,25ЛД50 оказывал подавляющее действие на число АОК. Заметим, что степень снижения уровня АОК определялась не столько концентрацией введенного токсина, сколько зависела от срока его введения (рис.7).

Таким образом, на модели первичного иммунного ответа для яда жабы зеленой установлена зависимость «доза–эффект» и «время–эффект».

Рис. 7. Влияние яда жабы зеленой на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа.  По оси ординат – число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

4.3. Эффекты ядовитых секретов пассивно-ядовитых животных

       Гемолимфа колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.). Иммунотропные эффекты гемолимфы колорадского жука обуславливались как величиной введенной дозы, так и временем исследования. Совместное введение гемолимфы (в дозах 0,07ЛД50–0,4ЛД50) с тимусзависимым антигеном приводило к более интенсивной ответной иммунной реакции, чем при введении только эритроцитов барана. Пик стимуляции соответствовал дозе 0,07ЛД50, которая вызывала почти трехкратное увеличение количества АОК по сравнению с контролем (рис.8).

Дальнейшее увеличение дозы гемолимфы вызывало угнетение процессов антителообразования. Наиболее значительная супрессия наблюдалась при введении гемолимфы до иммунизации. Оценка титров антиэритроцитарных антител в сыворотке крови мышей подтвердила выявленные эффекты гемолимфы. Таким образом, установлено дозозависимое действие гемолимфы колорадского жука в отношении гуморальной формы иммунного реагирования, выражающиеся в стимуляции при введении малых доз и угнетении в больших дозах.

Рис. 8. Влияние гемолимфы колорадского жука на процесс накопления антителообразующих клеток в селезенке мышей на 4-5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат – число АОК на 106 клеток селезенки.

*  *

*

       Несмотря на определенную специфичность действия зоотоксинов на формирование гуморального иммунного ответа, отчетливо выявлены общие закономерности, обусловленные токсинологическим статусом организма-продуцента. Низкие дозы активно- и пассивно-ядовитых животных (гюрза среднеазиатская, пчела медоносная, скорпион кавказский, жаба зеленая, колорадский жук) стимулируют, высокие, напротив, угнетают формирование гуморальных иммунных реакций. Яды активно-ядовитых животных, меняя амплитуду иммунного ответа, не извращают его динамику. Стимуляция гуморальных реакций ядом пассивно-ядовитых животных (колорадский жук) обеспечивается, по-видимому, включением в процесс антителообразования большего числа клеток-предшественников, что вызывает смещение пика максимума выработки антиэритроцитарных антител к более поздним срокам и меняет динамику иммунного ответа (рис.9).

               Рис.9. Динамика выработки антиэритроцитарных антител в сыворотке мышей при введении зоотоксинов разных токсинологических групп        По оси абсцисс – сутки первичного иммунного ответа.        По оси ординат – величина титров антител (log2 АТ).

Глава 5. КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ ГОМЕОСТАЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ЗООТОКСИНОВ (МОДЕЛЬ РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА)

Результаты, полученные на модели гуморального иммунного ответа, позволяли полагать, что механизм иммунотропной активности зоотоксинов обуславливался и изменением функциональной активности Т-клеток. Поэтому на следующем этапе, был изучен характер действия зоотоксинов на экспериментальной модели одной из форм клеточного иммунного ответа: реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Подоплелов, Крылов, Медуницын, 1985). Данная методика является классическим способом воспроизведения реакции (Tamura et al., 1983), не предполагает гистологического подтверждения и позволяет оценить адъювантные и супрессорные свойства антигенов.

5.1. Эффекты ядовитых секретов вооруженных активно-ядовитых животных

Яд пчелы медоносной (Apis mellifera L).  Установлено, что пчелиный яд не препятствовал процессу формирования клеточных иммунных реакций в модели ГЗТ. Наименьшая из исследованных доз (0,01ЛД50) стимулировала формирование реакции. Стимулирующие свойства яда проявлялись как при воспроизведении реакции ГЗТ с адъювантом (оценка супрессорных свойств), так и без него (оценка стимулирующих свойств). Эффекты суммации адъювантных свойств яда и красителя отсутствовали. Выраженность реакции ГЗТ при использовании пчелиного яда в дозе (0,1ЛД50) была незначительной. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии стимулирующих эффектов при использовании пчелиного яда в большой дозе.

Змеиные яды. Для анализа были взяты ядовитые секреты змей сем. Viperidae: гадюки обыкновенной – (Vipera berus L.), гюрзы среднеазиатской – (Vipera lebetina L.), эфы песчаной – (Echis carinatus Schneid.), гадюки Никольского – (Vipera nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva); а также липосомальная форма яда гюрзы среднеазиатской.

Яд гюрзы (0,1ЛД50) оказывал супрессорное действие на воспроизведение реакции ГЗТ к обоим антигенам. Так, при сенсибилизации животных ЭБ индекс реакции (ИР) составлял 3,57±0,90% (р=0,119), т.е. статистически значимо не отличался от показателя у интактных животных (5,88±1,06%). Аналогичные результаты получены при моделировании реакции ГЗТ к МБСА. В этих опытах ИР составлял 5,03±0,90%, р<0,001 (18,15% от значения «положительного» контроля) и не отличался от «отрицательного» контроля (р=0,833), что свидетельствовало о полном подавлении реакции ГЗТ. Снижение дозы яда (0,01ЛД50) приводило к формированию клеточных иммунных реакций. Эта доза яда обладала четким адъювантным эффектом в обеих моделях реакции ГЗТ к МБСА и ЭБ и стимулирующей активностью в отношении специализированных популяций Т-клеток, участвующих в формировании клеточного звена иммуногенеза. Адъювантные свойства яда гюрзы были сравнимы с действием красителя, эффекты суммации отсутствовали.

Яды гадюки обыкновенной (0,25ЛД50) и гадюки Никольского (0,1ЛД50) полностью блокировали развитие клеточных реакций. Яд эфы песчаной (0,04ЛД50) оказывал адъювантное действие в отношении реакции, вызванной МБСА с ЭС. Эффекты суммации адъювантных свойств яда и ЭС отсутствовали. Яд гюрзы среднеазиатской (0,04ЛД50) в форме липосомального препарата значительно стимулировал формирование клеточных иммунных реакций, что, по-видимому, было

обусловлено синергизмом действия компонентов липосомальной формы яда и активацией Т-клеток и макрофагов, принимающих участие в иммунном ответе на антигенный стимул.

Таким образом, змеиные яды в реакциях клеточного иммунитета давали дозозависимый иммунотропный эффект. Большие дозы подавляли, а малые оказывали адъювантное действие и не препятствовали формированию полноценной реакции ГЗТ. Наблюдаемые эффекты следует рассматривать как результат совместного действия мембранно-активных компонентов яда (Орлов, Гелашвили, 1985) на эффекторные и регуляторные клетки, обеспечивающие реализацию клеточных иммунных реакций.

*  *

*

Установлено, что исследованные яды активно-ядовитых животных вызывали изменения антиген-специфических реакций замедленного типа, осуществляемых иммунными Т-клетками. Специфичность действия определялась величиной вводимой дозы (рис.10). При этом пчелиный яд в отличие от яда гюрзы в сопоставимых дозах (0,1 ЛД50) не оказывал подавляющего действия в модельной реакции ГЗТ для оценки супрессорных свойств.

Рис.10. Действие зоотоксинов вооруженных активно-ядовитых животных на воспроизведение реакции ГЗТ, сенсибилизация мышей МБСА без СЭ (оценка супрессорного действия).

По оси ординат – Индекс реакции, в %.

5.2. Эффекты ядовитых секретов невооруженных активно-ядовитых животных

На модели реакции клеточного иммунитета оценивали иммунотропные свойства очищенного препарата секрета кожных желез жаб (Крылов и др., 1980), любезно предоставленного заведующим кафедрой физиологии и биохимии человека и животных ННГУ им. Н.И.Лобачевского профессором В.Н.Крыловым. Очищенный препарат яда жаб обладал способностью вызывать снижение формирования реакции ГЗТ. Степень подавления реакции зависела от дозы и срока введения препарата по отношению к антигенному воздействию. Статистически значимые различия в величине отека отмечены при введении препарата в дозе 0,05ЛД50, через 48 ч после сенсибилизации (38,40±3,13%, р<0,001) и в дозе 0,3ЛД50, через 24 ч после сенсибилизации (47,30±7,14%, р=0,02). Степень подавления реакции в этих группах была максимальной, и ИР практически не отличался от значения отрицательного контроля (39,66± 2,68%). Изменение интервала между введением антигена и очищенным препаратом яда жаб снижало выраженность реакции ГЗТ к соответствующему антигену (рис.11).

Рис. 11. Действие ядовитых секретов невооруженных активно-ядовитых животных

на воспроизведение реакции гиперчувствительности замедленного типа (оценка супрессорных свойств). По оси ординат – индекс реакции в % от показателя положительного контроля.

Таким образом, препарат яда жаб обладал супрессорным действием на формирование иммунологически обусловленной воспалительной реакции. Учитывая, что биологически действующие начала яда жаб относятся к стероидным соединениям животного происхождения (Захаров,1960; Крылов, 1978; Орлов и др., 1980; Albuquerque, 1971) с мощными противоспалительными свойствами (Сейфулла, 1982; Тринус и др., 1987), можно полагать, что подавление реакции ГЗТ обусловлено антивоспалительным действием кардиотонического препарата.

5.3. Эффекты ядовитых метаболитов пассивно-ядовитых животных

       Гемолимфа личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.). В диапазоне доз (0,07ЛД50 – 0,8ЛД50) белковый токсин пассивно-ядовитых животных (гемолимфа колорадского жука) стимулировала активность Т-лимфоцитов, оцениваемую по реакции ГЗТ. Адъювантные свойства гемолимфы проявляются в обоих вариантах экспериментальной воспалительной реакции (рис.12). Эффекты суммации и супрессорного действия гемолимфы не выявлены.

* *

*

Таким образом, оценка иммунотропных свойств зоотоксинов в реакции ГЗТ позволила выявить закономерности изменения клеточных иммунных реакций на природные раздражители внешней среды. Яды первично-ядовитых животных белковой природы оказывали преимущественно стимулирующее действие на формирование экспериментальной воспалительной реакции. Ядовитые секреты вооруженных активно-ядовитых животных в малых дозах не препятствовали нормальному процессу формирования клеточной воспалительной реакции и оказывали адъювантное (стимулирующее) действие. Выраженность клеточных иммунных реакций уменьшалась при возрастании дозы, при этом яд пчелы, в отличие от яда гюрзы, не оказывал супрессорного действия. Ядовитый белковый секрет пассивно-ядовитых насекомых (гемолимфа колорадского жука), не обладал избирательностью действия в отношении клеточных иммунных реакций, но и не препятствовал нормальному процессу формирования реакции ГЗТ. Ядовитый секрет стероидной природы невооруженных активно-ядовитых животных подавлял иммунологически обусловленную клеточную воспалительную реакцию.

       Рис. 12. Действие гемолимфы колорадского жука на воспроизведение реакции гиперчувствительности замедленного типа.

По оси ординат – индекс реакции в % от показателя положительного контроля.

А – сенсибилизация мышей антигеном с адъювантом (оценка супрессорных свойств). Б – сенсибилизация мышей антигеном без адъюванта (оценка адъювантных свойств).

Глава 6. МОДУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ И СОСТОЯНИЯ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ (ПОЛ) КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗООТОКСИНАМИ

       Важным звеном в реализации патофизиологических реакций является нарушение структурных и функциональных свойств мембран лимфоидных клеток. Одной из наиболее важных причин дезинтеграции клеток является активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Повышение интенсивности ПОЛ приводит к нарушениям матричной и барьерной функции мембран, изменению активности ферментных систем, ослаблению белок-липидных взаимодействий и, как следствие этого, к структурной дезорганизации клеток (Абрамова, Оксегендлер, 1985; Владимиров, Арчаков, 1989). В тоже время имеются лишь фрагментарные данные о влиянии ядов, в частности, яда гюрзы, на процессы ПОЛ, активность ферментов антиоксидантной системы эритроцитов и генерации кислородных радикалов (Орлов, Вальцева, 1977; Корягин, Уткина, Лашина, 1991). Кроме того, изучено воздействие малых доз зоотоксинов (ядов пчелы жабы и саламандры) на активность свободнорадикальных процессов (Корягин, 2007).        На первых базовых моделях, было установлено дозозависимое иммунотропное действие большинства ядов белковой природы активно-ядовитых животных. Поэтому, исследование изменений интенсивности процессов ПОЛ и фагоцитарной активности клеток крови проводили в условиях воздействия ядами вооруженных активно-ядовитых животных. Был использован яд пчелы медоносной – Apis mellifera L. и змеиные яды: гюрзы среднеазиатской – Vipera lebetina L., сем. Viperidae; эфы песчаной – Echis carinatus Schneid., сем.Viperidae; кобры среднеазиатской – Naja oxiana Eichw., сем. Elapidae.

Рис. 13. Интенсивность хемилюминесцентного ответа фагоцитарных клеток крови при действии змеиными ядами. По оси ординат – интенсивность хемилюминесценции (мВ).

Хемилюминесцентная (ХЛ) кривая фагоцитирующих клеток периферической крови контрольных проб имела относительно пологую фазу роста и характеризовалась тремя пиками активности: собственным (5-7 мин), опсоническим (12-15 мин) и суммарным (19-20мин). Максимальная хемилюминесценция клеток крови контроля составляла 0,179 мВ на 19 мин фагоцитарного ответа. Светосумма ХЛ сигнала у контрольного образца равнялась 88,41 мВ. Иной

характер имели кривые ХЛ-ответа опытных проб (рис.13). Показано, что яд эфы практически сразу же после внесения в пробу резко угнетал процесс фагоцитоза. Светосумма ХЛ ответа под действием яда эфы значительно уменьшалась и составляла 43,68 мВ. Яд гюрзы, напротив, вызывал значительное усиление фагоцитарной активности, превышая более чем в два раза значение контроля (0,179 мВ) до 0,395 мВ на 9 мин фагоцитоза. В динамике развития фагоцитоза, как известно, выделяют несколько стадий (Маянский А.М., Маянский Д.М., 1989). Можно полагать, что активация процесса фагоцитоза ядом гюрзы происходила за счет более быстрого включения иммуноглобулинов, обладающих опсонизирующей активностью для нейтрофилов. Напротив, яд эфы снижал резервные возможности активированных клеток. Супрессорное действие яда эфы проявлялось в начальной внеклеточной фазе фагоцитоза и препятствовало контакту модельных антигенов с рецепторами нейтрофилов и активации мембранных механизмов клеток. Оценка действия змеиных ядов на ПОЛ эритроцитарных мембран свидетельствовала о разной степени нарушений в системе окислительного метаболизма эритроцитов (табл. 3). Яд эфы, в обеих концентрациях, не оказывал существенного влияния на кинетику ХЛ-ответа и не вызывал изменения интенсивности свечения по сравнению с контрольным образцом. Интенсивность сигнала при инкубации эритроцитов с ядом гюрзы (100 мкг) снижалась на 13% по сравнению с контролем. Яд кобры (100 мкг) приводил к значительному увеличению интенсивности ХЛ до 175 % по отношению к контролю. Пчелиный яд, характеризующийся высокой гемолитической

Таблица 3

Изменение антиокислительной активности липидов клеточных мембран под действием зоотоксинов

Образец яда

Количество в пробе, мкг

Средняя интенсивность биохемилюминесцен

ции, мВ

Уровень значимости, р

Контроль

0,49±0,008

Яд эфы песчаной

50

0,49±0,03

0,920

100

0,48±0,01

0,454

Яд гюрзы среднеазиатской

50

0,45±0,03

0,169

100

0,42±0,03

0,031

Яд кобры среднеазиатской

50

0,50±0,006

0,407

100

0,86±0,04

0,001

Яд пчелы медоносной

1,0

0,79±0,03

<0,001

2,5

0,88±0,02

<0,001

активностью (Habermann, 1972), в концентрациях 1,0 и 2,5 мкг (не вызывающих видимого гемолиза клеток с эритроцитарной массой), приводил к интенсификации ПОЛ. С определенной уверенностью можно полагать, что модуляция окислительного метаболизма клеток находится в тесной зависимости с их гемолитической активностью. По суммарному воздействию на свободно-радикальные процессы исследованные яды могут быть расположены в убывающей по силе воздействия последовательности: пчелиный яд > яд кобры среднеазиатской > яд гюрзы среднеазиатской. Модулирующее действие исследованных ядов в отношении перекисного окисления (ПОЛ) клеточных мембран связано с непосредственным воздействием их гемолизирующих составляющих (цитотоксинов) на рецепторы цитоплазматических мембран.

* *

*

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о модуляции ядами активно-ядовитых животных фагоцитарной активности и ПОЛ клеток крови, связанной с непосредственным воздействием их гемолизирующих составляющих на рецепторы цитоплазматических мембран. Перекисное окисление липидов стимулируется белковыми ядами активно-ядовитых животных, независимо их таксономической принадлежности (ядами пчелы и кобры), при условии содержания в них цитотоксинов.

Глава 7. ИММУНОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ ГОМЕОСТАЗА ОРГАНИЗМА В УСЛОВИЯХ АНТРОПОГЕННОГО СРЕДОВОГО СТРЕССА

Важной составляющей химической коммуникативной системы являются взаимодействия между организмами (популяциями, сообществами) и средой обитания. Изучение компенсаторных  иммунных реакций позволяет понять физиологические механизмы, благодаря которым организмы выживают и приспосабливаются к изменяющимся условиям существования. В этой связи весьма важна оценка состояния популяции, для получения которой использовали комплекс показателей гомеостаза: уровень стабильности развития и иммунного статуса организма индикаторного вида амфибий (Захаров и др., 2000; Захаров, Крысанов, Пронин, 2007).

       7.1. Оценка качества среды обитания по величине флуктуирующей асимметрии меристических признаков популяций лягушек рода Rana

       Для оценки качества среды за период с 2000 по 2006 г была проведена биоиндикация водоемов, расположенных в заречной части г. Нижнего Новгорода (8 водоемов) и Нижегородской области (7 водоемов) по стабильности развития популяций зеленых лягушек рода Rana, оцениваемой по величине флуктуирующей асимметрии (ФА) (n=970). В результате были получены значения величин ФА, основанные на традиционном, разностном методе вычисления (Методические рекомендации…, 2003), по комплексу из 11 стационарных признаков окраски для зеленых лягушек (Захаров, Чубинишвили, 2001). Показано, что популяции амфибий урбанизированных территорий характеризовались возрастанием величины интегрального показателя. Методами непараметрической (критерий Крускалла-Уоллеса) обоснована правомерность распределения исследованных популяций животных на пять объединенных групп в соответствии с пятибалльной шкалой качества среды. В качестве интегральной характеристики применили среднюю взвешенную величину ФА (Гелашвили и др., 2001), имеющую наименьшую дисперсию среди линейных оценок (Ивантер, Коросов, 1992), рассчитанную для каждого балла качества среды обитания с учетом численности объединенной группы (табл. 4). Полученные величины ФА для каждого балла, установленные с учетом доверительного интервала (X ± mt), не выходили за границы нормативных значений, соответствующих «Методическим рекомендациям.., 2003».

Таким образом, полученные значения величин ФА для популяций зеленых лягушек г. Нижнего Новгорода и Нижегородской обл., позволили провести оценку качества среды обитания согласно нормативной документации и распределить исследованные популяции животных на пять объединенных групп, в соответствии с пятибалльной шкалой оценки изменения состояния организма по уровню стабильности. Оценку иммунного гомеостаза организма амфибий проводили путем определения лейкоцитарной формулы крови, количества Т- и В-лимфоцитов, фагоцитирующих нейтрофилов в крови, тимусе и селезенке, индекса лимфоидных органов.

Таблица 4

Качество среды обитания в водоемах г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области, оцениваемое по средней взвешенной величине ФА популяций зеленых лягушек рода Rana

Обобщенная группа

Качество среды обитания

Число водоемов

Годы  исследования

Значение средней взвешенной ФА (Мвзв±m)

1

I балл – условно-нормальное

3

2000,2003,2004,2005

0,45±0,0014

2

II балл –начальные (незначительные) отклонения от нормы

6

2000,2001,2002,2005,2006

0,51±0,0006

3

III балл – средний уровень отклонения от нормы

4

2000,2001,2003,2006

0,57±0,0014

4

IV балл – существенные (значительные) отклонения от нормы

5

2002,2003,2004,2005,2006

0,62±0,0007

5

V балл – критическое состояние

4

2002,2003,2004,2005

0,67±0,0015

7.2. Количественная и качественная характеристика лейкоцитарного состава периферической крови амфибий урбанизированной среды

       Снижение общей доли лейкоцитов в периферической крови характерно для всех популяций лягушек, обитающих в водоемах с высоким прессом антропогенной нагрузки (II - V балл качества среды)(15 водоемов г. Нижнего Новгорода и Нижегородской обл.), при этом установлена отрицательная корреляция величины ФА и общего числа лейкоцитов в периферической крови  лягушек. Уравнение регрессии, аппроксимирующее линейную зависимость данных показателей

Рис. 14. Зависимость числа лейкоцитов в периферической крови зеленых лягушек от величины флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков.

имеет вид: (R2 = 0,65; r=0,80;p<0,001) (рис.14). Результат анализа зависимости, как по первичным экспериментальным данным, так и по средневзвешенным величинам, показал, что примерно на 65% (показатель детерминации R2=0,65), дисперсия показателя лейкоцитов может быть объяснена дисперсией величины ФА.

Результаты непараметрического метода сравнения первичных экспериментальных данных по критерию Крускала-Уоллеса и медианному тесту позволяют отклонить нулевую гипотезу об отсутствии различий групп и принять альтернативную гипотезу о различии между группами по всем основным показателям лейкограмм (табл.5). В периферической крови зеленых лягушек, 

Таблица 5

Лейкоцитарный состав периферической крови амфибий урбанизированных территорий

Показатель

Средняя взвешенная показателя для обобщенной группы (%)

Значение критерия Крускала-Уоллеса(H), медианный тест (2)

1 группа

(I балл качества среды)

2 группа

(II балл качества среды)

3 группа

(III балл качества среды)

4 группа

(IV балл качества среды)

5 группа

(V балл качества среды)

Нейтрофильные гранулоциты

15,67±0,46

(n=96)

13,78±0,53

(n=147)

16,56±1,11

(n=54)

13,32±0,46

(n=95)

13,68±0,47

(n=110)

H=18,59,

p=0,0009;

2=16,25, р=0,0027

Эозинофильные гранулоциты

7,53±0,33

(n=96)

10,01±0,66

(n=148)

10,66±0,94

(n=55)

6,16±0,53

(n=94)

6,09±0,30

(n=110)

H=34,98,

p<0,001;

2=28,13, p<0,001

Базофильные гранулоциты

6,39±0,45

(n=90)

7,42±0,52

(n=137)

11,92±0,92

(n=55)

2,09±0,14

(n=96)

3,08±0,182

(n=110)

H=125,96, p<0,001,

2=102,13, p<0,001

Моноциты

2,18±0,201

(n=96)

1,83±0,169

(n=137)

2,41±0,44

(n=54)

4,02±0,30

(n=95)

3,20±0,18

(n=110)

H=78,58, p<0,001;

2=45,39, p<0,001

Лимфоциты

67,66±0,46

(n=96)

65,28±1,05

(n=147)

57,56±1,21

(n=55)

73,95±0,66

(n=95)

74,07±0,57

(n=110)

H=116,13, p<0,001;

2=62,95, p<0,001

обитающих в условиях II балла качества среды, фоне общей лейкопении, уменьшается доля нейтрофилов за счет палочкоядерных форм. В условиях среднего уровня отклонения качества среды от нормы (III балл) изменения качественных характеристик всех типов лейкоцитов более выражены. Лейкоцитарная формула характеризуется возрастанием доли эозинофилов, базофилов и уменьшением доли лимфоцитов. Наблюдаемый при этом сдвиг в формуле клеток «влево» свидетельствует о резком подавлении защитных сил и истощении костно-мозговых резервов нейтрофилов.

       При существенных (значительных) отклонениях качества среды от нормы (IV балл) и в условиях критического состояния среды обитания (V балл) в белой крови лягушек наблюдается уменьшение доли нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, возрастание числа моноцитов и лимфоцитов. Возрастание доли агранулоцитов свидетельствует о напряжение иммунных реакций организма и, по-видимому, обеспечивает адаптацию амфибий к существованию в условиях загрязнения. Наряду с деструктивными процессами имеют место и компенсаторно-восстановительные реакции, проявляющиеся в активации кроветворения (возрастание числа молодых форм гранулоцитов).

       Анализ зависимости количества лимфоцитов периферической крови от величины флуктуирующей асимметрии показал, что примерно на 58% (показатель детерминации R2=0,58) дисперсия количества лимфоцитов может быть объяснена дисперсией величины ФА. Коэффициент корреляции Спирмана между этими показателями составляет (r=0,76; p=0,0001) и характеризует статистическую связь между анализируемыми показателями (рис.15).

Рис. 15. Анализ зависимости числа лимфоцитов в периферической крови популяций зеленых лягушек от величины флуктуирующей асимметрии.

(R2=0,58; r=0,76; p=0,0001).

По оси абсцисс – значение флуктуирующей асимметрии, отн.ед.

По оси ординат – число лимфоцитов в периферической крови зеленых лягушек, в %.

На основании анализа лейкограмм периферической крови популяции амфибий, обитающих в одном из водоемов г. Нижнего Новгорода – оз. Лунском (Сормовский район, 1999-2006) выявлены существенные изменения всех рядов дифференцировки лейкоцитов в динамике многолетних наблюдений. Ответная реакция животных на пресс антропогенной нагрузки выражается в перестройке иммуногематологического статуса, связанного с возрастанием количества агранулоцитов (лимфоцитов) и снижением количества нейтрофильных гранулоцитов, ответственных за механизмы неспецифической резистентности (рис.16). Исследуемые показатели обнаруживают умеренную отрицательную корреляцию (r= - 0,47, p<0,001).

Рис. 16. Динамика изменения субпопуляций лейкоцитов периферической крови амфибий популяции оз. Лунское (1999-2006 гг.). По оси ординат – число клеток, в%;

По оси абсцисс – качество среды обитания в водоеме (балл) в конкретный срок наблюдения (год).

* *

*

Таким образом, для популяций зеленых лягушек установлена обратная корреляция между уровнем средового стресса (оцениваемого по величине ФА) и общим количеством лейкоцитов в периферической крови. Возрастание нестабильности развития сопровождалось повышением количества агранулоцитов и снижением всех форм гранулоцитов в периферической крови зеленых лягушек. Информативным показателем пресса антропогенной нагрузки на организм является доля лимфоцитов в лейкоцитарном составе периферической крови. Учитывая, что лимфоциты, одна из объемных составляющих комплекса иммунокомпетентных клеток, представлялось целесообразным изучить динамику их отдельных субпопуляций в условиях возрастания антропогенного стресса. Исследованию этого вопроса посвящен следующий раздел работы.

7.3. Изменение иммунологических показателей периферической крови и лимфоидных органов амфибий урбанизированной среды

В центральном (тимус) и периферическом (селезенка) органах иммунной системы и периферической крови зеленых лягушек в условиях возрастания антропогенной нагрузки меняется соотношение субпопуляций лимфоидных клеток. Выявлено статистически значимое снижение числа Т- и В- лимфоцитов, фагоцитирующих нейтрофилов и, соответственно, возрастание числа нулевых клеток в периферической крови лягушек (рис.17).

       Анализ межгрупповых различий с использованием непараметрического критерия Крускала-Уоллеса (Н) и попарного сравнения групп (критерий Манна-Уитни – Z), выявил значимые различия между обобщенными группами по всем изученным показателям лимфоидных органов (табл.6).

Рис.17. Перестройка баланса лимфоидных клеток в периферической крови лягушек при различном качестве среды обитания, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии.

Таблица 6

Статистический анализ иммунологических показателей лимфоидных органов популяций зеленых лягушек урбанизированных территорий

Показатель

Средняя взвешенная показателя для обобщенной группы

1 группа (I балл качества среды)

2 группа (II балл качества среды)

4 группа (IV балл качества среды)

5 группа (V балл качества среды)

Тимус

Т-розеткообразующие лимфоциты, %

Критерий Крускала-Уоллеса (H)

Критерий Манна-Уитни (Z)

34,1±0,74

n=50

27,51±2,95

n=20

29,95 ±1,33

n=40

29,26 ±0,59

n=100

H=21,80, p=0,0001; Z1-2=4,76, p<0,001; Z1-4=2,10, p=0,035;

Z1-5=4,33, p<0,001; Z-2-4=0,039, p=0,9686; Z2-5= 0,531, p=0,594; Z4-5=0,002, p=0,998

Селезенка

В-розеткообразующие лимфоциты, %

Критерий Крускала-Уоллеса (H)

Критерий Манна-Уитни (Z)

34,70 ±0,633

n=50

19,05 ±0,678

n=20

17,80 ±1,29

n=40

24,33 ±0,572

n=100

H=90,697, p<0,001; Z1-2=6,461, p<0,001; Z1-4=7,55, p<0,001;

Z1-5=8,09, p<0,001; Z-2-4=1,29, p=0,19; Z2-5= 4,228, p<0,001; Z4-5=4,088, p<0,001

Нулевые клетки, %

Критерий Крускала-Уоллеса (H)

Критерий Манна-Уитни (Z)

41,78 ±0,800

n=50

57,95 ±1,52

n=20

63,92 ±1,7784

n=40

59,84 ±0,92

n=100

H=38,27, p<0,001; Z1-2=5,19, p<0,001; Z1-4=0,79, p=0,423;

Z1-5=1,21, p=0,224; Z-2-4=4,56, p<0,001; Z2-5=5,85, p<0,001; Z4-5=1,84, p=0,062

Нейтрофилы фагоцитирующие,%

Критерий Крускала-Уоллеса (H)

Критерий Манна-Уитни (Z)

69,80 ±0,52

n=50

58,03 ±0,91

n=20

52,55 ±1,33

n=40

44,47 ±0,46

n =100

H=80,30,p<0,001; Z1-2=5,09, p<0,001; Z1-4=5,41, p<0,001;

Z1-5=6,27, p<0,001; Z-2-4=3,77, p=0,0001; Z2-5=6,27, p<0,001;

Z4-5=4,65, p<0,001

       Иммунограммы тимуса амфибий урбанизированных территорий характеризовались снижение количества Т-лимфоцитов, по сравнению с популяциями условно контрольных зон. В условиях возрастания пресса антропогенной нагрузки в селезенке зеленых лягушек уменьшалось число дифференцированных В-лимфоцитов и возрастало количество недифференцированных клеток, что свидетельствовало о нарушении баланса клеточных компонентов лимфоидного органа.

Функциональная активность нейтрофилов снижалась при возрастании пресса антропогенной нагрузки. Анализ взаимосвязи В-лимфоцитов и недифференцированных лимфоидных клеток в селезенке лягушек с применением коэффициента ранговой корреляции Спирмана (r=-0,88; p<0,001) выявил отрицательную корреляцию между исследованными показателями. Использование, с целью исследования вида зависимости, регрессионного анализа, позволило объяснить дисперсию числа В-лимфоцитов приблизительно на 78% (показатель детерминации R2 = 0,78) дисперсией числа нулевых клеток.

       Показано, что в условиях возрастания пресса антропогенной нагрузки у амфибий происходит изменение индекса лимфоидных органов (рис. 18). Относительная масса селезенки уменьшается при среднем уровне отклонения качества среды от нормы (0,47±0,03, Z=2,54;p=0,010) и возрастает при критическом состоянии среды обитания (2,01±1,26, Z=2,06; p=0,038). Известно, что ритмы и средние уровни субпопуляций лимфоидных клеток крайне лабильны и определяют те механизмы, которые обеспечивают тонкую адаптационную реакцию иммунной системы в условиях постоянного загрязнения окружающей среды (Ивантер и др., 1985). Увеличение индекса селезенки указывает на более интенсивное протекание процессов кроветворения и/или иммунологических реакций, вызванное негативным воздействием окружающей среды. Колебания относительной массы, по-видимому, обусловлены корректирующим действием антропогенных факторов и адаптивными реакциями животных .

Рис. 18. Изменение значений индексов лимфоидных органов: тимуса и селезенки при разном качестве среды обитания, определенном по величине флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков.

       

       Выявленные сдвиги баланса компонентов иммунных клеток свидетельствовали о чрезмерной активации работы иммунной системы, ее напряжении и могли быть связаны с начальными нарушениями в системе гуморального иммунного ответа.

* *

*

Таким образом, выявлено снижение числа дифференцированных и возрастание количества низкодифференцированных клеток в  крови и лимфоидных органах популяций зеленых лягушек г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области, обитающих в условиях постоянно негативного воздействия комплекса антропогенных факторов. В результате оценки иммунного статуса амфибий получен широкий спектр показателей, интерпретация и обобщение которых, является важнейший задачей физиологических исследований. Набор параметров можно свести воедино, используя различные интегральные показатели, позволяющие более корректно и наглядно представить полученный экспериментальный материал. Решению этого вопроса посвящена следующая глава нашей работы.

7.4. Обобщенный анализ экспериментальных данных, полученных иммунологическим и эпигенетическим подходами

С целью объединения показателей иммунного гомеостаза организма амфибий, использовали обобщенную функцию желательности. Вначале были вычислены значения частных функций желательности (di) для семи, определенных для всех групп, показателей. Затем рассчитали обобщенную функцию желательности (D) для пяти объединенных групп (табл.7) с

Таблица 7

Оценка состояния популяций амфибий, обитающих в водоемах разного качества среды, по средневзвешенным показателям иммунного статуса и уровня стабильности развития, с помощью функции желательности

п/п

Показатель

Вид

показателя

Группы амфибий

1 группа (I балл качества среды)

2 группа (II балл качества среды)

3 группа (III балл качества среды)

4 группа

(IV балл качества среды)

5 группа

(V балл качества среды)

1

Нейтрофильные

гранулоциты

%

15,67

13,78

16,56

13,32

13,68

di

0,998

0,983

1,000

0,976

0,982

2

Эозинофильные гранулоциты

%

7,53

10,01

10,66

6,16

6,06

di

0,977

0,888

0,861

0,999

1,000

3

Общее количество лейкоцитов

тыс/мм3

38,52

26,20

29,29

27,70

26,89

di

1,000

0,930

0,963

0,948

0,938

4

Лимфоциты

%

67,66

65,28

57,56

73,95

74,07

di

0,987

0,992

1,000

0,969

0,969

5

Моноциты

%

2,18

1,83

2,41

4,02

3,20

di

0,985

1,000

0,936

0,754

0,862

6

Индекс тимуса

отн.ед.

0,09

0,17

0,22

0,20

0,14

di

1,000

0,827

0,700

0,748

0,909

7

Индекс селезенки

отн.ед.

0,60

0,59

0,47

0,59

2,02

di

0,970

0,974

1,000

0,974

0,441

Обобщенная функция желательности, D

0,988

0,940

0,920

0,903

0,845


построением гистограммы (рис. 19).

Показано, что популяции амфибий, обитающие в условиях повышенной антропогенной нагрузки, характеризуются более низкими значения обобщенной функции желательности, по сравнению с популяциями условно-контрольных зон. Построение функции желательности может быть рекомендовано для использования в экспериментальной физиологии при сравнительной оценки нарушений иммунологического гомеостаза организма.

Рис. 19. Оценка состояния популяций амфибий, находящихся в разных качественных условиях среды, по иммунологическим показателям с построением функции желательности.

* *

*

Таким образом, оценка комплекса показателей гомеостаза организма амфибий, выявила специфику иммуногематологического ответа животных к антропогенной трансформации среды обитания, на примере популяций зеленых лягушек, обитающих в водных объектах г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области. Ухудшение качества среды обитания вызывает возрастание нестабильности развития организма амфибий. Адаптацией к изменению качества среды является повышение доли агранулоцитов, а также, снижение уровня дифференцированных и возрастание уровня низкодифференцированных клеток в периферической крови и лимфоидных органах популяций зеленых лягушек урбанизированной территории.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование основных базовых моделей: биотических стресс-факторов (зоотоксинов) и иммунного статуса организма индикаторного вида амфибий, позволило выявить физиологические закономерности функционирования иммунной системы организма в различных условиях жизнедеятельности. В поддержании гомеостаза организма позвоночных животных в ответ на действие различных стрессорных факторов закономерно развиваются общие неспецифические иммунофизиологические реакции. Исследование реакции организма на яды животных, принадлежащих к разным систематическим группам (насекомые, рептилии, амфибии), четко показало, что одна из главнейших интегральных систем – иммунологическая – остается небезучастной и отвечает разнокачественной реакцией. Характер изменений и их развитие во времени обуславливается спецификой химического состава и дозой зоотоксина. Обе причины определяют быстроту возникновения, глубину, степень выраженности, а также качественный характер самого нарушения. Важно отметить, что токсические дозы зоотоксинов направлены в конечном итоге на нарушение регуляторных взаимоотношений, лежащих в основе нормального функционирования организма, как единого целого. Влияние же нетоксических доз не маскируется вторичными процессами, развивающимися при отравлении, и позволяет выявить качественное своеобразие иммунотропного действия биотических стресс-факторов.

Рис.20. Общая схема иммунотропного действия изученных зоотоксинов на моделях гуморального иммунитета – процесс накопления антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и клеточного иммунитета – реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

  - стимуляция иммунной реакции;        -супрессия иммунной реакции

Установленный факт не противоречит существующим теоретическим представлениям о воздействии химических веществ разной природы и интенсивности на иммунитет. Для многих биологически активных веществ показано, что первоначальный сдвиг активности адаптивной системы, вызываемый ими, затем сменяется на противоположный (Ковалев, Полевая, 1981; Сейфулла и др., 1982). Реакция иммунологической системы – это интегральный показатель действия множества механизмов. Естественные факторы окружающей среды разной степени интенсивности нарушают это тонкое межклеточное взаимодействие, что приводит к подавлению иммунореактивности отдельных популяций лимфоцитов. При этом в комплексе ответных реакций могут регистрироваться разнокачественные изменения: стимуляция гуморальных реакций на фоне супрессии клеточных или наоборот. Вариабельность ответов отдельных звеньев иммунной системы является установленным фактом (Земсков и др., 1997; Петров и др., 1981; Хаитов, 2000) и отражает пластичность компенсаторных возможностей иммунитета.

Рассмотрение зоотоксинов в качестве природных стресс-факторов, органично объединяет их роль, как алломонов, участвующих в аллелохимических взаимодействиях, с физиологическими механизмами формирования интегральной адаптивной реакции организма. Полученные результаты лежат в основе выдвигаемого положения о зависимости иммунотропной активности зоотоксинов не только от их химической природы, но и положения организма-продуцента в токсинологической классификации. Анализ экспериментальных материалов позволяет предложить схему воздействия зоотоксинов на иммунологическую систему организма, основанную на токсинологической характеристике ядовитых животных (рис.20), которая органично интегрирует в себе специфику химического строения ядов и биологии их продуцентов.

Закономерности действия зоотоксинов на функционирование иммунной системы выявлены при использование двух экспериментальных форм иммунного реагирования. В отношении гуморальных иммунных реакций экспериментально доказана стимуляция низкими и угнетение высокими дозами ядов активно- и пассивно-ядовитых животных (табл.9).

Таблица 9

Иммунотропное действие зоотоксинов в реакциях гуморального иммунитета

Токсинологическая классификация ядовитых животных

Представитель

Дозы яда

Характер действия

Вооруженные активно-ядовитые

Гюрза среднеазиатская (Vipera lebetina L.)

0,01 ЛД50

Эффект отсутствует

0,1 ЛД50

Супрессорный эффект

Пчела медоносная (Apis mellifera L.)

0,02 ЛД50

Стимулирующий эффект

0,08-1,0 ЛД50

Супрессорный эффект

Скорпион кавказский (Buthus caucasicus Nordm.)

0,04 ЛД50

Эффект отсутствует

0,09-0,4 ЛД50

Стимулирующий эффект

0,6 ЛД50

Супрессорный эффект

Невооруженные активно-ядовитые

Жаба зеленая(Bufo viridis Laur )

0,01 ЛД50

Стимулирующий эффект

0,08-0,25 ЛД50

Супрессия

Очищенный препарат яда жабы

зеленой (Bufo viridis Laur.)

0,05-0,2 ЛД50

Эффект отсутствует

Пассивно-ядовитые

Колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say.)

0,01-0,4 ЛД50

Стимулирующий эффект

0,6-0,8 ЛД50

Супрессорный эффект

На другой форме иммунного реагирования (клеточном типе ответа) выявлены закономерности изменения клеточных иммунных реакций на природные стресс-факторы (табл.10). Белковые яды активно- и пассивно-ядовитых животных в низких дозах стимулируют клеточные иммунные реакции, тогда как яд небелковой природы невооруженных активно-ядовитых животных угнетает их. В зависимости от токсинологической характеристики действующего стресс-фактора (зоотоксина) меняется качественное формирование эффекторных иммунофизиологических реакций.

Таблица 10

Иммунотропное действие зоотоксинов в реакциях клеточного иммунитета

Токсинологическая классификация ядовитых животных

Представитель

Дозы яда

Характер действия

Вооруженные активно-ядовитые

Гюрза среднеазиатская (Vipera lebetina L.)

0,01 ЛД50

Стимулирующий эффект

0,1 ЛД50

Супрессорный эффект

Пчела медоносная (Apis mellifera L.)

0,01 ЛД50; 0,1 ЛД50

Стимулирующий эффект

Невооруженные активно-ядовитые

Очищенный препарат яда жабы

зеленой (Bufo viridis Laur.)

0,05-0,25 ЛД50

Супрессорный эффект

Пассивно-ядовитые

Колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say.)

0,07-0,8 ЛД50

Стимулирующий эффект

Иммуномодулирующие свойства зоотоксинов согласуются с закономерным фазовым развитием стресс-реакции, вызванной активацией биотическими стресс-факторами нейрогормональной системы организма: гипоталамус–гипофиз–надпочечники. Стресс представляет собой неспецифическую адаптационную многостадийную реакцию, которая развивается на сильные, неблагоприятные раздражители (Селье, 1979; Барабой, 2006). Одна из стадий стресса (стадия резистентности), характеризуется как повышенной устойчивостью, так и элементами повреждения физиологических структур. В последнее время выделяют несколько разновидностей реакций адаптации на слабые (реакция тренировки) и средние (реакция активации) по силе воздействия (Гаркави и др., 1998). Показано, что реакции активации обуславливается стимуляцией защитных и регуляторных систем организма (Гаркави и др., 1990), что нашло подтверждение при изучении радиопротекторного (Корягин, 2007) и термопротекторного (Хомутов, Гиноян, Ягин, 2005; Ягин, 2007) действия зоотоксинов. Поступление невысоких биологических доз яда, вызывает активацию симпато-адреналовой системы и при этом наблюдается повышение иммунных реакций. Более значительные дозы яда, по-видимому, вызывают формирование следующей фазы стресса – фазы повышения уровня кортикостероидов в крови (Артемов и др., 1961), следствием чего является угнетение реакций иммунитета.

Выявленные различия действия зоотоксинов в отношении двух форм иммунного реагирования, нам представляется логичным объяснить с позиций химической природы, и роли животных ядов в аллелохимических взаимодействиях между организмами. Имеется определенное соответствие между химическим составом, морфологическими особенностями ядовитого аппарата и биологической спецификой действия того или иного яда (Орлов, Гелашвили, 1985). Вооруженные активно-ядовитые животные, в качестве средства нападения и защиты, используют широкий спектр химических соединений, среди которых ведущую роль играют токсины белковой природы (в яде пчел – это меллитин, фосфолипаза А; в яде гюрзы – протеиназы, оксидаза L-аминокислот, фосфолипаза А2, фосфодиэстераза; в яде скорпиона – положительно заряженные нейротоксические полипептиды.). Характерно, что эти яды активны в основном при парентеральном введении, а при поступлении через пищеварительный тракт подвергаются ферментативному расщеплению. Отсюда становится понятным и морфологическая специализация ядовитого аппарата, снабженного ранящим приспособлением. Высокая биологическая активность секретов вооруженных активно-ядовитых животных, представляющих собой смесь токсических полипептидов и ферментов, объясняется их избирательным действием на конкретные физиологические структуры организма (холинорецепторы, ионные каналы и др.). Для организма-реципиента эти белковые вещества являются носителями антигенных детерминант, способных вызывать синтез антител.

С другой стороны, у животных с невооруженным ядовитым аппаратом, продуцируемые ими яды имеют небелковую природу и выполняют в основном защитные функции (стероиды, органические кислоты, эфиры и др.). При рассмотрении секрета кожных желез жаб, в первую очередь обращает на себя внимание наличие большого количества кардиотропных веществ стероидного происхождения, а также адреналина и производных индола (Физер, Физер, 1964, Орлов и др., 1980; Albuquerque et al.,1971). Как известно, соединения стероидной природы обладают ярко выраженными иммунорегуляторными и противоспалительными свойствами, а также, большой широтой физиологического действия, определяющейся дозой и временем введения в организм (Сейфулла, 1982; Тринус и др., 1987; Albuquerque et al.,1971). Мишенью действия основного компонента яда амфибий (батрахотоксина) являются натриевые каналы нервных клеток и мышечных волокон, связывание с которыми вызывает деполяризацию клеточных мембран (Ходоров, 1985; Daly, Witkop, 1965).

У пассивно-ядовитых животных ядовитые метаболиты вырабатываются в организме и накапливаются в различных органах и тканях и используются ими в качестве средства защиты от врагов. Пассивно-ядовитые животные представляют опасность только при попадании в пищеварительный тракт другого организма. Яды этих животных, как химические факторы межвидовых взаимодействий, занимают особое место среди других алломонов и считаются систематическим видовым признаком. Гемолимфа колорадского жука имеет белковую природу, характеризуется высокой антигенной активностью, но отличается менее сложным составом, по сравнению с ядами змей и пчел. Основная составляющая гемолимфы – лептинотарзин, имеет высокое сродство к гидрофобным участкам клеточных мембран, способных воздействовать на процессы экзоцитоза, нервно-мышечную передачу (Madeddu et al., 1985a; Madeddu et al., 1985b) и активировать кальциевые каналы пресинаптической мембраны (Crosland et al., 1984). Своеобразие химического состава гемолимфы накладывает отпечаток и на характер ее иммунотропной активности. Дозозависимое действие гемолимфы колорадского жука сохранялось в отношении гуморальных иммунных реакций организма-реципиента. Действие гемолимфы вызывает увеличение активности Т-клеток, оцениваемой по реакции гиперчувствительности замедленного типа.

В формировании общей реакции организма на стрессорное действие зоотоксинов можно выделить неспецифический компонент, связанный с интегральными адаптационными реакциями и специфический – обусловленный воздействием на мембранные структуры. Установленная модуляции фагоцитарной активности и состояние эритроцитарных мембран под влиянием зоотоксинов, легли в основу защищаемого положения о стимуляции ПОЛ белковыми ядами активно-ядовитых животных, независимо от их таксономической принадлежности (ядами пчелы и кобры), при условии содержания в них цитотоксинов.

При сопоставлении эффективности зоотоксинов на одной и той же иммунологической реакции или при рассмотрении одного и того природного яда на разных формах иммунного реагирования, выявляется дисперсия эффектов, свидетельствующая об иммунотропной способности исследуемых веществ. Несмотря на то, что пусковой этап во взаимодействии зоотоксинов с организмом, обуславливается относительной селективностью, физиологической основой иммунотропного действия животных ядов, является формирование универсального набора эффекторных компонентов, обеспечивающих развитие адаптивной реакции, направленной на поддержание гомеостаза организма в условиях интоксикации. Иммунотропная активность зоотоксинов не является отражением их общего фундаментального свойства угнетать или стимулировать иммунную систему в целом, а служит выражением их способности в определенных условиях тормозить или усиливать ту или иную форму иммунного ответа.

Комплексная оценка показателей гомеостаза организма природных популяций индикаторного вида амфибий, выявила специфику иммуногематологического ответа и приспособительную изменчивость иммунных реакций к антропогенной трансформации среды обитания. Анализ иммунного статуса организма позволяет заключить, что прогрессирующая лейкопения является характерным показателем возрастания средового стресса, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии амфибий. Ухудшение качества среды обитания вызывает повышение количества агранулоцитов и снижение всех форм гранулоцитов в крови амфибий, что связано с развитием как общих неспецифических анаболических процессов, так и со специфической стимуляцией и напряжением защитных реакций организма. При отклонениях качества среды от условной нормы, отмечается усиление выхода в циркуляцию молодых клеток из лимфоидных органов (тимуса и селезенки), о чем свидетельствует увеличение содержания нулевых клеток, как в этих органах, так и в периферической крови амфибий. Адаптивными характеристиками популяций амфибий городских водоемов можно считать уменьшение общей доли лейкоцитов, перестройку лейкоцитарного баланса клеток в сторону увеличения доли агранулоцитов (моноцитов и лимфоцитов), изменение баланса иммунокомпетентных клеток периферической крови и лимфоидных органов, выражающееся в возрастании числа низкодифференцированных и снижении числа специализированных лимфоцитов. Репрезентативным показателем усиления пресса антропогенной нагрузки на организм является возрастание доли агранулоцитов в периферической крови индикаторных видов (амфибий).

Таким образом, иммунофизиологические механизмы поддержания гомеостаза организма позвоночных животных, в ответ на действие различных стрессорных факторов среды (биотических и антропогенных), связаны с формированием общей неспецифической интегральной адаптивной реакции с использованием универсального набора эффекторных клеток.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлены иммуногенные свойства гемолимфы колорадского жука, представителя пассивно-ядовитых животных. Выявлена иммуногенная активность яда активно-ядовитых животных (гюрзы среднеазиатской).

2. Яды активно-ядовитых и пассивно-ядовитых животных оказывают дозозависимое действие в отношении гуморальных иммунных реакций. Низкие дозы ядов (пчелы медоносной - 0,02 ЛД50; гюрзы среднеазиатской - 0,01 ЛД50; скорпиона кавказского - 0,09-0,4 ЛД50; жабы зеленой - 0,01 ЛД50; колорадского жука - 0,01-0,4 ЛД50) стимулируют, а высокие (пчелы медоносной - 0,08-1,0 ЛД50; гюрзы среднеазиатской - 0,1 ЛД50; скорпиона кавказского - 0,6 ЛД50; жабы зеленой - 0,08-0,25 ЛД50; колорадского жука - 0,6-0,8 ЛД50) – угнетают антителогенез.

3. Яды активно-ядовитых животных (пчелы медоносной, гюрзы среднеазиатской, скорпиона кавказского, жабы зеленой) в сопоставимых дозах (0,08-0,1 ЛД50), влияя на продуктивный или индуктивный период антителогенеза, меняют амплитуду первичного иммунного ответа, без изменения его динамики.

Стимулирующее действие секрета пассивно-ядовитых животных (гемолимфы колорадского жука – 0,07 ЛД50) более выражено в индуктивный период антителогенеза и связано с изменением динамики иммунного ответа.

4. Яды белковой природы активно - ядовитых (гюрза среднеазиатская - 0,01 ЛД50; пчела медоносная – 0,01 ЛД50; 0,1 ЛД50) и пассивно-ядовитых животных (колорадского жука – 0,07-0,8 ЛД50) вызывают стимуляцию Т-лимфоцитов, оцениваемую по реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Яд небелковой природы активно-ядовитых животных (очищенный препарат яда жаб – 0,05 - 0,25 ЛД50) подавляет развитие ГЗТ.

5. Яды активно-ядовитых животных белковой природы, разной специфической направленности: гематотропного (пчелы медоносной) и нейротропного (кобры среднеазиатской) действия,  в опытах in vitro стимулируют индуцированное в мембранах клеток крови ПОЛ.

6. В сопоставимых концентрациях яды активно-ядовитых животных (яды змей) оказывают разнонаправленное действие на фагоцитарную активность клеток крови. Установлена активация фагоцитарной активности клеток крови при воздействии ядом гюрзы среднеазиатской (сем. Viperidae) и ее снижение под действием яда эфы песчаной (сем. Elapidae).

7. В выборках популяций зеленых лягушек установлена отрицательная корреляция уровня средового стресса, оцененная по величине флуктуирующей асимметрии с общим количеством лейкоцитов в периферической крови. Ухудшение качества среды обитания вызывает повышение количества агранулоцитов и снижение всех форм гранулоцитов в периферической крови амфибий.

8. В условиях ухудшения качества среды обитания наблюдается перестройка баланса клеточных компонентов в периферической крови и лимфоидных органах (тимусе и селезенке) лягушек, проявляющаяся в возрастании количества низкодифференцированных и снижении числа специализированных лимфоцитов.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Романова, Е.Б. Пчелиные продукты-как сырье для фармацевтической промышленности / Е.Б. Романова // Химико – фармацевтический журнал.–1990. –№ 8. – С. 51–53.

2. Швец, С.М. Новый отечественный аллерген из яда пчел для специфической диагностики аллергических реакций на ужаления пчел / С.М. Швец, И.С. Гущин, Ю.А. Порошина, С.М. Титова, В.Г. Читаева, Е.Б. Романова, Н.В. Корнева, Б.Н. Орлов, Ю.С. Лебедин // Терапевтический архив.– 1991. – № 8. – С. 108–110.

3. Романова, Е.Б. Влияние некоторых зоотоксинов на формирование гиперчувствительности замедленного типа / Е.Б. Романова, И.И. Подоплелов // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. –1991. – № 4. – С. 22–24.

4. Романова, Е.Б. Экспериментальное изучение сенсибилизирующего действия алкильных соединений теллура и олова / Е.Б. Романова // Гигиена и санитария.–1993.– №5. – С. 48–50.

5. Мартынова, Т.Г. Возможности применения моноклонального ПАП-набора в иммунобиотехнологических исследованиях / Т.Г. Мартынова, Е.Б. Романова, В.В. Новиков, А.Ю. Барышников // Биотехнология.–1995. – № 9–10.- С. 52–54.

6. Романова, Е.Б.  Модуляция функциональной активности и состояния перекисного окисления липидов клеток периферической крови под влиянием змеиных ядов / Е.Б.Романова, С.В. Ермолин, Е.И. Кузьмина // Токсикологический вестник.– 1995. – № 4. – С. 23–26.

7. Романова, Е.Б. Иммунотоксические свойства гемолимфы личинок колорадского жука /Е.Б. Романова, О.Т. Федоров// Токсикологический вестник. – 1996. –№ 2. – С. 2–5

8. Романова, Е.Б. Разработка методов оценки иммуногенной и биологической активности змеиных ядов / Е.Б. Романова, В.В. Новиков // Вестник Нижегородского гос. ун-та. –1999. – С. 79–83

9. Романова, Е.Б. Особенности лейкоцитарной формулы периферической крови зеленых лягушек в условиях антропогенной нагрузки / Е.Б. Романова, О.Ю. Романова // Журнал эволюц. биохимии и физиологии. –2003. – №4. –С. 384–387.

10. Логинов, В.В. Особенности морфометрических и морфогенетических показателей популяций зеленых лягушек рода Rana, обитающих в водоемах Нижнего Новгорода и Нижегородской области / В.В. Логинов, Д.Б. Гелашвили, Е.Б. Романова // Вестник Нижегородского гос. ун-та. – 2004. – Вып. 3(5). –С. 73–79.

11. Романова, Е.Б. Использование иммунологических подходов для оценки состояния природных популяций амфибий в естественных условиях и при антропогенном воздействии /Е.Б.Романова // Вестник Нижегородского гос. ун-та. – 2005. – Вып. 2(10). –С. 115–121.

12. Романова, Е.Б. Динамика гематологических показателей периферической крови лягушек рода Rana трансформированной городской среды / Е.Б. Романова, М.Н. Егорихина // Экология. – 2006. – Т. 37.– № 3. – С. 208–213.

Статьи в международных журналах, региональных изданиях и материалах конференций

13. Романова, Е.Б.. Иммунотропные свойства яда зеленой жабы Bufo viridis. / Е.Б. Романова // Вопросы герпетологии: Тез. докл. VI Всесоюзная герпетологическая конф., г. Ташкент, 18-20 сент. 1985. – Л., 1985 – С. 179.

14. Романова, Е.Б. Иммунофармакологический анализ действия биологически активных веществ (зоотоксинов) на кинетику первичного иммунного ответа / Е.Б. Романова // Механизмы действия зоотоксинов: Межвуз. сб. – Горький: ГГУ, 1987. – С. 90– 94.

15. Титова, С.М. Аллергия к пчелам и разработка на основе пчелиного яда гипосенсибилизирующего препарата / С.М. Титова, Е.Б. Романова, Н.В. Корнева // Биологические ресурсы пчеловодства и их рациональное использование в народном хозяйстве и медицине: Межвуз. сб.– Горький: ГГУ, 1988. – С. 87– 98.

16. Титова, С.М. Экспериментальное изучение биологических свойств аллергена из яда пчел / С.М. Титова, Е.Б. Романова // Биологические ресурсы пчеловодства и их рациональное использование в народном хозяйстве и медицине: Межвуз. сб.– Горький: ГГУ, 1989. – С. 34– 39

17. Романова, Е.Б. Гуморальные иммунологические механизмы адаптации животных в условиях экспериментальной серотерапии / Е.Б. Романова // Механизмы адаптации животных и растений к экстремальным факторам среды: Тез. докл.: 6-ой Ростовской областной научн.-практ. школы семинара г. Ростов-на-Дону, 10-14 сент.1990.– г. Ростов-на-Дону, 1990. – Т.2. – С. 126– 127.

18. Гелашвили, Д.Б. Оценка иммунобиологической реактивности организма при экспериментальной серотерапии коммерческим и модифицированными препаратами противозмеиной сыворотки «Антигюрза» / Д.Б. Гелашвили, Е.Б. Романова // Здравоохранение Туркменистана. – 1990. – №9. – С. 33– 40.

19. Романова, Е.Б. Оценка действия яда среднеазиатской гюрзы в реакциях гуморального и клеточного иммунитета / Е.Б. Романова // Зоотоксины в экспериментальной биологии и медицине: Межвуз.сб. – Горький: ГГУ, 1990. – С. 31– 36.

20. Гелашвили. Д.Б. Токсикологическая характеристика диметилтеллура / Д.Б. Гелашвили, А.А. Силкин, Е.Б. Романова, Т.В. Ложкина, М.Е. Безруков // Получение и анализ чистых веществ: Сб.ст. – Нижний Новгород: ННГУ, 1990. –С. 68– 73.

21. Романова, Е.Б. Оценка влияния очищенного препарата жабьего яда на иммунные реакции организма / Е.Б. Романова; Редкол. «Фармакол. и токсикол» – М.,1990. – 10с. – «Деп. в ВИНИТИ 7.06.1990 № 3144-В.

22. Романова, Е.Б. Анализ сенсибилизирующих свойств тетраэтилолова и диметилтеллура / Е.Б. Романова // Применение металлоорганических соединений для получения неорганических покрытий и материалов: Тез. докл VI Всесоюзн. сов. г. Нижний Новгород, 16-18 сент. 1991.-Нижний Новгород: ННГУ, 1991. – Ч.2. – С. 112– 113.

23. Гелашвили, Д.Б.  Эколого-токсикологическое обеспечение получения и применения, летучих особо чистых веществ / Д.Б. Гелашвили, А.А. Силкин, В.Л. Лашина, Е.Б. Романова, А.А. Черников, В.В. Егоров // Получение, свойства, анализ и применение соединений с молекулярной решеткой для новой техники: Тез. докл. Всес. конф., Нижний Новгород, 10-12 сент. 1991. – Нижний Новгород, 1991. – С. 130.

24. Романова, Е.Б. Клеточные механизмы поддержания гомеостаза при экстремальном воздействии зоотоксинов / Д.Б. Гелашвили, В.В. Егоров, В.Л. Лашина, Е.Б. Романова, А.А. Силкин // Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза: Тез. докл. Всес. конф., г. Сыктывкар, 4-8 июня 1991. – г. Сыктывкар, 1991. – С. 27.

25. Романова, Е.Б. Метод встраивания яда гюрзы в фосфолипидные липосомы для использования в иммунологических исследованиях / Е.Б. Романова, В.П. Торчилин, В.А. Трубецкой, Н.В. Кошкина, Д.Б. Гелашвили // Проблемы теоретической и прикладной токсинологии: Тез. докл 1-ой Всес. токсинол. конф., г. Ашхабад, 8-12 окт. 1991. – г. Ашхабад: Ылым, 1991. – С. 35–36.

26. Романова, Е.Б. Изучение токсичности и иммуногенных свойств липосомальной формы яда Vipera lebetina./ Е.Б. Романова, Д.Б. Гелашвили, Н.В. Кошкина, В.П. Торчилин; Редкол. «Фармакол. и токсикол. – М.,1991. – 13с. – «Деп. в ВИНИТИ 16.12.1991.- № 4646-91В.

27. Гелашвили, Д.Б. Иммунотоксикология элементоорганических соединений / Д.Б. Гелашвили, Е.Б. Романова // Металлоорганическая химия.– 1992. – Т.5. –№6. – С. 1223–1229.

28. Романова, Е.Б. Стимуляция реакции гиперчувствительности замедленного типа ядом среднеазиатской гюрзы Vipera lebetina и его липосомальной формой / Е.Б. Романова, Д.Б. Гелашвили, О.Т. Федоров // Биологические науки.–1992. – № 7. – С. 81–86.

29. Romanova, E.B. Toxicity and immunogenic properties of liposomal form of Vipera libetina venom/ E.B.Romanova, D.B.Gelashvili, N.V. Koshkina, V.P. Torchillin // J. of liposome research. – 1992. –№2(2) – P.205–216.

30. Федоров. О.Т. Действие гемолимфы личинок колорадского жука на гуморальное звено иммуногенеза / О.Т. Федоров, Е.Б. Романова, Д.Б. Гелашвили // Вестник Днепропетровского университета «Биология и экология». Днепропетровск: Видавництво ДДУ. – 1993. –Вып.1. – С.79.

31. Романова, Е.Б. Иммунобиологическая активность гемолимфы личинок колорадского жука в реакциях гуморального иммунитета /Е.Б. Романова, О.Т. Федоров // Биологические науки.– 1993. – № 5–6. – С. 90–96.

32. Гелашвили, Д.Б. К токсикологической характеристике тетраэтилолова / Д.Б. Гелашвили, А.А. Силкин, М.Е. Безруков, Е.Б. Романова // Антропогенные воздействия и здоровье человека: Сборник научн. работ. – Калуга, 1995. – Вып.1. – С. 31–38.

33. Романова, Е.Б. О роли иммунотоксических реакций в механизмах адаптации к изменениям экологической ситуации / Е.Б. Романова // Тез. докл. межд. конф. «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды», г. Томск, 12-16 сент. 1995. – Томск: ТГУ, 1995. – Т.2. – С. 288.

34. Романова, Е.Б. Экологические аспекты антитоксической функции аллергических реакций и роль иммунотоксикологии в системе непрерывного экологического образования / Е.Б. Романова // Экологические аспекты устойчивого развития региона: Тез. докл. Межд. конф. во Новгородского гос. ун-та им. Я. Мудрого.– г. Новгород: НГУ, 1995. – Ч.3. – С. 43–44.

35. Романова, Е.Б. Изучение состояния ПОЛ и функциональной активности периферической крови под действием змеиных ядов / Е.Б. Романова, С.В. Ермолин, Е.И. Кузьмина // Тез. докл. Первой конф. герпетологов Поволжья, Тольятти, 27-30 ноября 1995.– Тольятти, 1995.– С. 50– 51.

36 Романова, Е.Б. Методы иммунологического мониторинга / Е.Б. Романова // Экологический мониторинг: Методы биомониторинга. – Нижний Новгород: ННГУ, 1995. – Ч. 2. –  Гл. 7. – С. 339– 387.

37. Романова, Е.Б. Методы иммунотоксикологии в биомониторинге / Е.Б. Романова, Г.П. Ежова // Экологический мониторинг: Методы биологического и физико-химического мониторинга. –  Нижний Новгород: ННГУ, 1998. – Ч. 3–- Гл. 6. – С. 145– 174.

38. Романова, Е.Б. Методы оценки аллергенных свойств экотоксикантов / Е.Б. Романова// Экологический мониторинг: Методы биологического и физико-химического мониторинга. –  Нижний Новгород: ННГУ, 2000. – Ч.4.– Гл. 12. – С. 367– 375.

39. Романова, Е.Б. Баланс компонентов иммунной системы амфибий в механизмах адаптации к возрастающему прессу антропогенной нагрузки на водные экосистемы/ Е.Б. Романова, С.А. Кутазов, Л. Н. Винокурова // Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциальным условиям среды: Матер. симп. с межд. участием, г. Ульяновск, 24-26 сент. 2002. – Ульяновск: УлГУ, 2002. – С. 138–139.

40. Романова, Е.Б. Иммунотоксикологический мониторинг популяций амфибий, населяющих урбанизированные ландшафты / Е.Б. Романова // Тез. докл. Междунар. и молод. «Экологические проблемы крупных рек-3: Тез. докл. Межд. и молод. конф., г. Тольятти, 15-19 сент. 2003.– Тольятти: ИЭВБ, РАН, .2003. – С. 240.

41. Романова, Е.Б. Методы морфологических исследований в иммунотоксическом мониторинге / Е.Б. Романова // Экологический мониторинг: Методы биологического и физико-химического мониторинга.– Нижний Новгород: ННГУ, 2000.– Ч.5.– Гл.6. – С. 286–299.

42. Романова, Е.Б. Изменение функционального состояния клеток крови и гиперчувствительности замедленного типа в условиях воздействия зоотоксинами / Е.Б. Романова // Актуальные вопросы герпетологии и токсинологии: Сб. науч. тр.– г. Тольятти, 2004.– Вып.7.– С. 112.–118.

43. Романова, Е.Б. Применение методов иммунотоксикологического анализа популяций животных в мониторинге окружающей среды / Е.Б. Романова // Методы популяционной биологии: Сб. матер. VII Всерос. популяционного семинара, г. Сыктывкар, 16-21 февр. 2004.–Сыктывкар, 2004.– Ч.1. – С. 179–180.

44. Романова, Е.Б. Иммунологическая характеристика природных популяций зеленых лягушек в условиях антропогенного средового стресса / Е.Б. Романова, И.О. Иванова, А.А. Поспелова // Популяции в пространстве и времени: Сб. матер. VIII Всероссийского популяционного семинара, г. Нижний Новгород, 12-15 апр. 2005.– Нижний Новгород: ННГУ, 2005. – С. 351–354.

45. Романова, Е.Б. Индикация состояния природных экосистем с применением иммунологического подхода / Е.Б. Романова // Актуальные вопросы здоровья и среды обитания: Матер.. 2-ой Всерос. научн. конф., г. Ульяновск, 6-7 окт. 2005.– Ульяновск: УлГУ, 2005. – С. 97–98.

46. Романова, Е.Б. Гематологические аспекты механизмов адаптации природных популяций лягушек в условиях антропогенного средового стресса / Е.Б. Романова // Актуальные проблемы герпетологии и токсинологии: Сб. научн. тр.– Тольятти, 2005.– Вып.8. – С. 169–176.

47. Романова, Е.Б. Показатели иммунограммы как тест-система для первичной оценки качества среды обитания / Е.Б. Романова, М.Н. Егорихина // Человек. Природа. Общество: Матер. региональной межвуз. научн.-практ. конф., г. Нижний Новгород, 15 марта 2006.–Нижний Новгород: Рос НУ, 2006.–Ч.2. – С. 164–168.

48. Романова, Е.Б. Изменение клеточного баланса лимфатических органов амфибий в условиях антропогенной нагрузки / Е.Б. Романова, Л. Г. Ненашева // Человек. Природа. Общество: Матер. региональной межвуз. научн.-практ. конф., г. Нижний Новгород, 15 марта 2006.–Нижний Новгород: Рос НУ, 2006.–Ч.2. – С. 168–172.

49. Романова, Е.Б. Изменения в лимфоидных органах зеленых лягушек урбанизированных ландшафтов / Е.Б. Романова // Естествознание и гуманизм: Сб. научн. работ.– Томск: изд-во Томского гос. ун-та, 2006.– Т.3, № 1. – С.107–108.

50. Romanova, E.B. Changes in Hematological Parameters of Rana Frogs in a Transformed Urban Enviroment / E.B. Romanova, M.H. Egorikhina // Russian of Ecology. – 2006. –V.37, № 3. –P.188–192.

51. Романова, Е.Б. Методы анализа основных типов ядросодержащих клеток в периферической крови видов-индикаторов качества среды (на примере амфибий) / Е.Б. Романова // Экологический мониторинг: Методы биологического и физико-химического мониторинга.– Нижний Новгород: ННГУ, 2006.– Ч.6.– Гл.8. – С. 307–327.

52. Романова, Е.Б. Адаптивные изменения иммунологических показателей амфибий в антропогенно загрязненной среде / Е.Б.Романова // Дальневосточная весна-2006: Межд. научн.-практ. конф., г. Комсомольск-на-Амуре, 27 апр.2006.–.Комсомольск–на–Амуре: ГОУ ВПО «КнАГТУ», 2006. – С. 342–347.

53. Романова, Е.Б. Оценка гомеостаза развития индикаторных популяций амфибий иммунологическими и морфогенетическими подходами / Е.Б.Романова // Особь и популяция – стратегии жизни: Сб. матер. IX Всероссийского популяционного семинара, г. Уфа, 2-6 октября 2006.- Уфа. Издательский дом ООО «Вили Окслер», 2006.– Ч.1. – С. 407–412.

54. Романова, Е.Б. Специфика баланса клеток лимфо-миелоидного комплекса зеленых лягушек в условиях антропогенной трансформации среды / Е.Б.Романова // Естествознание и гуманизм: Сб. науч. работ.– Томск: изд-во Томского гос. ун-та, 2006.– Т.3, № 4. – С. 52–53.

55. Романова, Е.Б. Морфогенетические и морфофизиологические изменения в популяциях зеленых лягушек трансформированной среды / Е.Б.Романова, Е.С. Блохина // Естествознание и гуманизм: Сб. науч. работ.– Томск: изд-во Томского гос. ун-та, 2006.– Т.3, № 4. – С. 53–54.

56. Романова, Е.Б. Иммунотропные свойства пчелиного яда / Е.Б.Романова // Апитерапия сегодня: Матер. XII Всероссийской научн.-практ. конф., г.Рыбное, Рязанской обл., 25-26 мая 2006.– Рыбное, 2006. Вып. 12. – С. 84–87.

57. Романова, Е.Б. Интегральная оценка экологического состояния водных объектов урбанизированных территорий по иммунологическим показателям амфибий / Е.Б.Романова // Медико-физиологические проблемы экологии человека: Матер. Всерос. конф. с межд. участием, г. Ульяновск, 24-28 сент. 2007.– Ульяновск: УлГУ, 2007. –С. 211–213.

58. Романова, Е.Б. Биоиндикация водных объектов городской территории / Е.Б.Романова // Экологическая безопасность регионов России и риск от техногенных аварий и катастроф: Сб. статей VIII Межд. научн.-практ. конф., Пенза, 25-26 апр. 2008.– Пенза: АНОО «Приволжский Дом Знаний», 2008. – С. 46–49.

Изобретения

59. Титова, С.М. Способ получения аллергена из пчелиного яда / С.М. Титова, Б.Н. Орлов, Н.В. Корнева, Е.Б. Романова // Роспатент Российской Федерации № 1524226.– Приоритет 8.05.1987. Действует с 15.11.1994






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.