WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

БУРЯЧКОВСКАЯ

Людмила Ивановна

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ. СВЯЗЬ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМ СОСТОЯНИЕМ

03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2007 г.

Работа выполнена в Отделе клеточной биологии Института экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

академик РАН                       Евгений Иванович Чазов

доктор медицинских наук,

профессор                       Алексей Владимирович Мазуров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик РАМН                

Аслан Амирханович Кубатиев

ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

доктор медицинских наук, профессор

Владимир Александрович Макаров ГУ Гематологический научный центр РАМН

доктор биологических наук

Юрий Аскольдович Романов

ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий»

Ведущая организация Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова, биологический факультет.

Защита диссертации состоится 23 января 2008 г. в 13.30 час.

на заседании диссертационного совета Д 208.073.01в РКНПК «Росмедтехнологий» по адресу: 121552, г. Москва, ул. З-я Черепковская, д. 15-А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РКНПК «Росмедтехнологий»

Автореферат разослан " ____ " _______________ 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор                                                                В.Е.Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям тромбоциты играют ведущую роль в образовании тромба. Кроме того, они участвуют в иммунных процессах и воспалении, защите организма-хозяина от вирусов и бактерий, в транспорте веществ, регуляции сосудистого тонуса, росте раковых клеток, их метастазировании и уничтожении, в ангиогенезе и ремоделировании сосудов. Такая полифункциональность связана со способностью тромбоцитов к активации, которая в свою очередь, зависит от их морфо-функционального состояния.

Неоднородность пула циркулирующих в крови тромбоцитов была обнаружена еще в начале прошлого века. Различия отмечены в количестве, морфологии, возрасте, объеме, плотности, функциональной активности, содержании белков, гликогена, ферментов и рецепторов, что позволило говорить о гетерогенности пула тромбоцитов (Karpatkin, Khan, 1978).

Интактные тромбоциты имеют характерную форму диска. При активации происходит быстрое, занимающее менее секунды, изменение формы из дисковидной в сферическую. На разных этапах этого процесса могут появляться переходные формы, которые долгое время рассматривались в качестве одной из причин гетерогенности тромбоцитарного пула, а их выявление использовалось для определения риска тромботических осложнений у больных (Corash, 1990). Кроме того, были обнаружены и другие по форме тромбоциты, которые R. Allen (1979) относил к атипичным или артефактным. Но в дальнейшем появились неопровержимые данные, что такие формы появляются в результате их рождения мегакариоцитами (Gladwin, Martin, 1990; Hartwig, Italiano, 2003; Kozaki, 2005).

Возможны следующие пути появления тромбоцитов из мегакариоцитов: 1) разделение цитоплазмы мегакариоцитов демаркационными мембранами и быстрый «взрывной» выброс тромбоцитов, 2) образование эндоплазматических пузырей, содержащих пластинки, и их отделение от материнской клетки, 3) инвагинация мембраны с отделением тромбоцитов в виде бус, 4) образование из цитоплазмы псевдоподий, которые проникают в синусы костного мозга и отшнуровываются, в результате чего рождаются незрелые формы тромбоцитов, названные протромбоцитами. В дальнейшем, уже в кровотоке, они разделяются, образуя тромбоциты дисковидной формы.

Важную роль в продукции разных тромбоцитов играет степень полиплоидизации ядра мегакариоцитов (Ravid et al, 2002). С ней связан уровень содержания в тромбоцитах специфичных для них белков. Транскрипционные факторы, поэтины, цитокины, молекулы адгезии и катехоламины являются определяющими для созревания и полиплоидизации мегакариоцитов (Slayton et. al., 2005).

В настоящее время выделяют три формы тромбоцитов, появление которых в кровотоке зависит от состояния мегакариоцитов и в первую очередь от их плоидности. Это дисковидные тромбоциты, удлиненные биполярные протромбоциты (менее зрелые формы, рожденные клетками с низкой плоидностью) и большие сферические («ретикулярные») тромбоциты с высоким содержанием мРНК, происходящие из мегакариоцитов с высокой плоидностью. Кроме этих трех, выделяют четвертую субпопуляцию – сферические тромбоциты размером 1–2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий. За исключением редких патологий их появление в крови не связано с мегакариоцитопоэзом, а происходит в результате активации и изменения дисковидной формы кровяных пластинок.

Большинство исследований функциональных свойств тромбоцитов проводится на дисковидных и их производных – сферических формах. Что касается протромбоцитов и больших сферических («ретикулярных») форм, они остаются мало изученными, данные о них в основном имеют описательный характер, а сведения об их функциональных свойствах, способности к активации и роли в различных процессах единичны и противоречивы.

Цель и задачи исследования. Основной целью данного исследования было выяснение взаимосвязи между морфологической гетерогенностью тромбоцитов, их функциональными свойствами и участием различных субпопуляций в гемостазе и тромбозе.

К задачам исследования были отнесены:

  1. выявление и характеристика различных субпопуляций тромбоцитов, циркулирующих в крови человека и животных в норме;
  2. отработка экспериментальных моделей, в которых в крови увеличивается количество протромбоцитов и появляются большие сферические («ретикулярные») тромбоциты;
  3. подбор условий и изучение механизмов появления разных субпопуляций тромбоцитов в крови;
  4. изучение функциональной активности отдельных субпопуляций кровяных пластинок – в особенности протромбоцитов и больших сферических тромбоцитов;
  5. поиск факторов, влияющих на появление протромбоцитов и больших тромбоцитов in vitro;
  6. исследование морфофункциональных особенностей тромбоцитов у больных при различных патологиях и вклад в развитие тромбозов и геморрагий;
  7. изучение влияния различных фармакологических препаратов на содержание в крови разных субпопуляций тромбоцитов.

Иными словами, основным направлением работы был поиск ответа на вопросы: существует ли взаимосвязь между морфологией тромбоцитов, приобретенной ими в ходе мегакариоцитопоэза, и функциональной активностью пластинок, а также, какие факторы внешней среды могут оказаться решающими в появлении в кровотоке различных субпопуляций?

Научная новизна. Практически все основные результаты работы получены впервые. Для исследования особенностей морфологии и функций тромбоцитов была использована модель метаболического стресса у крыс. Это позволило выявить условия повышения количества протромбоцитов в крови и провести исследование редко встречающихся в норме форм тромбоцитов. До нашей работы такую модель для исследования морфофункциональной гетерогенности тромбоцитов никто не применял.

Разработанный нами метод смыва неактивных тромбоцитов с адгезивных поверхностей дал возможность выделить высоко-гомогенную фракцию протромбоцитов, что помогло получить доказательства их функциональной инертности.

Впервые получены экспериментальные данные о форме и структуре протромбоцитов, не способных к агрегатообразованию. Количественное определение таких клеток у больных повышает возможности более адекватной оценки риска возникновения у них геморрагических осложнений.

Впервые обнаружено, что длительно поддерживающееся высокое содержание катехоламинов в крови приводит к продукции протромбоцитов. Наиболее значительное количество функционально инертных протромбоцитов обнаружено у больных феохромоцитомой и пациентов с инфекционными заболеваниями на стадии гипокоагуляции.

Показано, что циркулирующие мегакариоциты из донорской крови, способны к тромбоцитопоэзу в условиях хранения тромбомассы in vitro. Появление молодых тромбоцитов влияет на сохранение функциональной активности хранящейся тромбомассы и способствует продлению срока пригодности ее для переливания.

Экспериментально подтверждено, что протромбоциты секвестируются в селезенку и возвращаются в кровоток под действием катехоламинов.

Установлено, что присутствие в крови больших сферических тромбоцитов повышает агрегационную способность всего пула. Существует тесная взаимосвязь между количеством этих клеток в пуле и спонтанной агрегацией. В больших сферических тромбоцитах не обнаружена типичная для тромбоцитов грануляция и выявлена сильно развитая сеть канальцев, заполненных аморфным материалом.

Для более адекватной оценки появления в крови больших тромбоцитов нами впервые применен разработанный в лаборатории оригинальный метод определения среднего объема тромбоцитов по тромбоцитокриту. Метод оказался нетрудоемким и высокоэффективным, отличается более высокой точностью и воспроизводимостью по сравнению с использованием гематологических анализаторов.

Большие «ретикулярные» тромбоциты отсутствуют в крови здоровых добровольцев. У всех больных с верифицированным атеросклерозом, независимо от места его локализации, в крови выявлены большие тромбоциты.

Риск тромботических осложнений тесно связан с увеличением количества больших тромбоцитов, обладающих повышенной активностью. Отмечено, что при развитии ДВС-синдрома присутствие в крови (до 10 %) больших сферических форм соответствует фазе тромбозов, а увеличение количества биполярных протромбоцитов (до 50 %) – фазе геморрагий.

Научно-практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные позволяют расширить сложившиеся представления о циркулирующих в крови тромбоцитах в норме и при патологических состояниях.

За период выполнения исследования разработаны методы выделения и количественной оценки протромбоцитов и больших «ретикулярных» тромбоцитов. Получены данные о количестве протромбоцитов в норме у человека и животных и о его повышении при различных сердечно-сосудистых патологиях. Показано, что количество биполярных протромбоцитов резко возрастает в условиях гиперкатехоламинемии. Обнаружено, что при феохромоцитоме на их долю приходится от 17% до 49% от общего числа тромбоцитов, и это может служить диагностическим критерием. Получено авторское свидетельство «Метод диагностики феохромоцитомы». Этот метод используется в клинической практике.

Отмечено, что увеличение количества протромбоцитов в крови соответствует фазе геморрагии. В отличие от этого, риск тромботических осложнений возрастает с появлением в крови больших «ретикулярных» тромбоцитов. Они обладают повышенной активностью, способны спонтанно агрегировать. Ингибиторы циклооксигеназы не оказывают влияния ни на количество, ни на функциональные свойства этих клеток. Результаты этой работы могут оказаться полезными для разработки новых методов диагностики тромботических осложнений и в поиске способов их лечения.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 19 июня 2007 г. на заседании Ученого совета Института экспериментальной кардиологии РКНПК «Росмедтехнологий». Результаты исследования были представлены в виде устных и стендовых сообщений на российских и международных конгрессах и симпозиумах: Пленум правления ВНОГ (Рига, СССР, 1986 г.); Всесоюзная Конференция «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» (Москва, 1987 г.); 1th Congress International Soсiety for Pathophysiology (Москва, 1991 г.); Всесоюзная Конференция по тромбозу и гемостазу (Полтава, 1992); Всесоюзный съезд гематологов (Львов, 1993);., VII, XI , XII, XIII, XV European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 1995 г., 1999 г., 2001 г., 2003 г., 2005 г.); Всероссийская конференция «Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения» (Москва, 1997 г., 2003 г., Ярославль, 2005 г.); XI и XIV International Symposium on Atherosclerosis (Париж, Франция, 1997 г., Рим, Италия, 2006 г.); 31th Annual Scientific Meeting of European Society for Clinical Investigation (Киль, Германия, 1997 г.); I и III Украинская научная конференция «Микроциркуляция и ее возрастные изменения» (Киев, Украина, 1999 г., 2002 г.); XVII, XVIII, XIX, XXI Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Вашингтон. США, 1999 г., Париж, Франция, 2001 г., Бирмингем, Англия, 2003 г., Женева, Швейцария, 2007.); 18th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (Чикаго, США, 2000 г.); The 5th UK Meeting on platelets and the 9th и 10th Erfurt Conference on Platelets (Ноттингем, Англия, 2002 г.. Эрфурт, Германия, 2004 г.); 42nd American Society for Cell Biology Annual Meeting (Сан-Франциско, США, 2002 г.); I II и III Всероссийская научная конференция “Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии” (Москва, 2003 г., 2005 г., 2007 г.); 14 Международный симпозиум Дунайской лиги по борьбе с тромбозами, нарушениями гемостаза и патологии сосудистой стенки (С-Петербург, 2004 г.); Российский национальный конгресс кардиологов (Томск, 2004 г.); Симпозиум «Человек и лекарство» (Москва, 2005 г.); 1 съезд физиологов СНГ (Сочи, 2005 г.); World Congress of Cardiology (Барселона, Испания, 2006 г,); Всероссийская конференция «Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия» (С.-Петербург, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 55 печатных работ: 28 в отечественных и 27 в международных изданиях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 6-ти глав, посвященных собственным результатам и их обсуждению, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 210 страницах, содержит 38 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 381 источник.

Материалы и методы исследования.

Проводились исследования крови 54 специально отобранных здоровых добровольцев, 24 случайно обратившихся в донорский пункт с целью коммерческой сдачи крови добровольца, состояние здоровья которых не контролировалось, 38 профессиональных доноров, 29 больных бронхиальной астмой, 15 больных с артериальной гипертонией кризового течения, 18 больных феохромоцитомой, 18 больных с различными воспалительными заболеваниями (пневмония, пиелонефрит, абсцессы разной локализации), 14 – с генерализованными формами менингококковой инфекции, 52 больных ИБС с атеросклерозом коронарных сосудов, 11 больных с атеросклерозом брахиоцефальных артерий.

Отдельные эксперименты выполнены на 126 самцах крыс линии Wistar весом 250-300 г, 23 белых лабораторных мышах весом 25-30 г, 54 кроликах породы Шиншилла весом 2,5-3,5 кг, 7 сусликах весом 120-130 г. Часть экспериментов проводили на предварительно подвергнутых двусторонней демедуляции надпочечников крысах. Кровь брали самотеком из вены или шприцем из сердца, в некоторых экспериментах на крысах и мышах – через имплантированный в брюшную аорту катетер.

Метаболический стресс создавали с помощью болюсного введения 500 мг/кг 2-дезокси-Д-глюкозы (2ДГ). Концентрацию эндогенных катехоламинов в плазме определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием.

Выделение и хранение концентрата тромбоцитов осуществляли в отделении переливания крови ФГУ РКНПК в контейнерах Fenwal PL-1240. Тромбомассу от 38 доноров получали двумя способами: «в осадке» и из лейкоцитарной пленки методом «Buffy Coat». Забор образцов для исследования осуществляли непосредственно после помещения тромбомассы в мешки для хранения (0 точка), на 1, 3 и 5 сутки хранения. Одновременно с этим проводился анализ контроля стерильности.

Исследование морфологии. Для оценки формы тромбоцитов 50 мкл цельной крови непосредственно при взятии или 10 мкл ОТП фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде (1:30), помещали на поликарбонатные мембраны и подготавливпали препараты для исследования. Подсчет разных форм тромбоцитов проводили в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) «PHILLIPS PSEM 550х». Количество пластинок каждой формы выражали в % по отношению к общему числу клеток в образце.

При подсчете выделяли 4 типа тромбоцитов: дисковидные (Д) размером 2-4 мкм; сферические (С1) размером 1-2 мкм, с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий; большие сферические (С2) размером 4-5 мкм, с выраженными инвагинациями плазматической мембраны, часто называемые в литературе «ретикулярными тромбоцитами»; вытянутые биполярные протромбоциты (ПТ) длиной 2-20 мкм и диаметром 0,5-0,7 мкм, одинаковые по всей длине или сужающиеся к концам наподобие веретена.

Для исследования внутриклеточных структур тромбоцитов 2 мл крови с антикоагулянтом префиксировали в 1% глутаровом альдегиде, отделяли ОТП и проводили более жесткую фиксацию 2,5% глутаровым альдегидом. Импрегнацию осуществляли 0,1% раствором четырехокиси осмия. Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) “JEOL” – 200 CH.

Исследование функций тромбоцитов. Агрегацию исследовали с помощью лазерного двухканального анализатора агрегации НПФ «БИОЛА» модели 230LA. Способность к образованию агрегатов малого размера (от 3 до 100 клеток) оценивали по спонтанной и индуцированной 0,1 и 0,5 мкмоль АДФ агрегации. Образование агрегатов среднего и большого размера (свыше 100 клеток) оценивали по индуцированной 1,0 и 5,0 мкмоль АДФ агрегации.

Адгезию оценивали с помощью СЭМ. 50 мкл ОТП наносили на адгезивную поверхность, инкубировали 5 мин. при комнатной t в закрытом бюксе, снимали неприкрепленные клетки с поверхности и фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом. Параллельно исследовали тромбоциты, прикрепившиеся к поверхности и оставшиеся в суспензии, которые характеризовали как не способные к адгезии. Подсчет разных форм проводили на 25 полях сканирования, передвигая столик по диагонали, при увеличении 2500х или на 50 полях при увеличении 5000х. Для определения количества тромбоцитов (в %), способных к адгезии, использовали формулу: А=Nаx100/Na+Nn, где: A – количество тромбоцитов определенной формы, способных к адгезии; Nа – общее число подсчитанных клеток, прикрепленных к поверхности; Nn – общее число подсчитанных клеток, оставшихся в суспензии.

Способность к эндо-экзоцитозу регистрировали с помощью флюориметрии методом АО-теста. Флюоресцентный зонд акридиновый оранжевый (АО) избирательно поглощается и запасается в основном внутри гранул и по его накоплению и освобождению можно судить о функциональном состоянии тромбоцитов.

Средний объем тромбоцитов (СОТ) оценивали по тромбоцитокриту. В кювету переменного диаметра добавляли 1 мл ОТП с 0,1 моль ЭДТА и центрифугировали 20 мин при 2000 g. Высоту столбика осевших клеток измеряли по линейке бинокуляра и пересчитывали по формуле DxH/N-3, где D – диаметр капилляра, H – высота столбика осевших клеток, получившегося после центрифугирования, N – количество клеток в мм3 ОТП. Объем тромбоцитов выражается в фл. Параллельно для контроля проводили измерение СОТ на гемоанализаторе "Hemascreen 5".

Статистическую обработку и оценку корреляций с помощью критерия Спирмана осуществляли с помощью компьютерной программы Statistica 6.0. Определение различий проводили с использованием параметрического критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манна-Уитни. На рисунках и в таблицах приводятся отклонения от среднего значения, соответствующие стандартной ошибке или стандартному отклонению.





Результаты исследования и обсуждение

  1. Особенности морфологии и функций тромбоцитов человека и животных

В крови относительно здоровых лиц тромбоциты морфологически достаточно однородны. Однако в разных группах людей, наиболее часто используемых в качестве контрольных, могут наблюдаться отличия.

В цитратной крови специально отобранных здоровых добровольцев, чье состояние оценивается по отсутствию хронических заболеваний, жалоб на здоровье и обращений к врачу в течение последнего года, 85 – 98 % (в среднем 94±5,2%) тромбоцитов имеют форму дисков. С1 формы немногочисленны и в среднем составляют 6,3±0,7%. Обнаружено также от 1 до 4% (2,4±0,3%) ПТ небольшой длины (до 6 мкм). Более длинные ПТ, делящиеся или с перетяжками отсутствуют. Больших сферических тромбоцитов, относящихся к субпопуляции С2, нет (рис. 1).

Рисунок 1. Содержание тромбоцитов разной формы в цельной крови (темные столбики) и в ОТП (светлые столбики) отобранных здоровых добровольцев (1),профессиональных доноров (2) случайных добровольцев (3). * – р<0,05; ** – p<0,01.

Для тромбоцитов отобранных здоровых добровольцев характерно отсутствие способности спонтанно агрегировать. В ответ на добавление 0,1 мкмоль АДФ агрегация составляет 1,7±0,1 отн ед, а в ответ на  5 мкмоль АДФ – 47,8±3,7 %. СОТ соответствует 8,6±0,6 фл и не превышает 10 фл. Реакция освобождения, оцениваемая по АО-тесту, достигает 19,2±1,9 усл ед, но не выходит за предел 22 усл ед.

У профессиональных доноров содержание Д форм снижено, а С1 форм повышено, что может быть связано с активацией, вызванной кровопотерей и перестройкой организма в результате длительного донорства. Содержание ПТ увеличено почти в 2 раза и колеблется от 3 до 7% (в среднем 4,8±0,8%, р<0,05) по сравнению с ЗД. В основном они имеют веретенообразную или биполярную конфигурацию, но в отдельных случаях присутствовали единичные ПТ до 20 мкм длиной с перетяжками на концах. С2 не обнаружены. Спонтанная агрегация отсутствовала. АДФ-индуцированная агрегация (18,6±2,0%), СОТ (8,2±0,9 фл) и реакция освобождения (18,6±2,0 усл ед) незначительно отличались от сходных показателей у ЗД.

У большинства случайных добровольцев, обратившихся в донорский пункт с целью сдачи крови на коммерческой основе, состояние здоровья не контролировалось, и поэтому среди них могли оказаться лица с  различными заболеваниями. По сравнению со здоровыми добровольцами, у этого контингента исследованных повышено содержание С1 и снижено количество Д форм, хотя это не столь выражено, как у доноров. В то же время, у отдельных случайных добровольцев отличий от здоровых добровольцев не наблюдалось. В среднем содержание ПТ также не отличалось, но у некоторых представителей этой группы выявлены С2  формы (рис. 1). Несмотря на то, что их количество ни у одного случайного добровольца не превышало 1%, у них наблюдается спонтанная агрегация (1,5±0,1 отн ед), повышенные 0,1 мкмоль АДФ-индуцированная агрегация (2,1±0,3 отн ед) и реакция освобождения (20,3±2,9 усл ед), хотя СОТ не менялся. Встречающиеся в ряде работ данные о присутствии С2  форм в крови здоровых лиц может быть связано с недостаточно строгим отбором людей для включения в группу нормы.

По сравнению с цельной кровью, в ОТП увеличивается количество С1 и уменьшается число Д форм в результате активации, вызванной процедурой выделения тромбоцитов. В то же время производимые при выделении действия не влияют на состояние С2 и ПТ, количество которых в ОТП и цельной крови одинаково.

Анализ проведенных исследований в различных группах относительно здоровых лиц позволил нам выбрать группу отобранных здоровых добровольцев в качестве контроля для исследования морфо-функциональных особенностей тромбоцитов. Можно говорить о минимальной гетерогенности тромбоцитов у этой группы лиц, чей пул представлен преимущественно Д формами, минимальным количеством ПТ и отсутствием С2 форм, что ограничивает возможность исследовать эти субпопуляции.

В поиске возможности использования лабораторных животных для изучения функциональных свойств тромбоцитов различных субпопуляций, мы исследовали кровь бодрствующих крыс, кроликов, мышей и сусликов. У всех видов животных в цельной крови основная часть пула тромбоцитов представлена Д формами, которые различаются по размеру и структуре. У крыс Д формы более уплощенные и крупнее, чем у других животных. У кроликов, мышей и сусликов тромбоциты субпопуляции Д более выпуклые, но без признаков активации. Максимальное количество Д форм обнаружено в крови крыс и кроликов, в то время как у мышей и сусликов их количество меньше, но одновременно с этим повышено число С1 с гладкой поверхностью и без выраженных псевдоподий, что говорит о минимальной активации.

Таблица 1.

Морфо-функциональные особенности тромбоцитов у различных видов лабораторных животных. Агрегация в ответ на добавление 5 мкмоль АДФ.

Ни у одного из видов интактных животных не обнаружены С2 тромбоциты. В то же время у крыс почти в 5 раз увеличено число циркулирующих ПТ. У остальных животных их содержание сходно с наблюдаемым у ЗД. Такая морфологическая гетерогенность пула тромбоцитов крысы отличает ее от других видов лабораторных животных.

Межвидовые различия касаются и функциональной активности кровяных пластинок. Спонтанная агрегация отсутствовала у всех видов животных. АДФ-индуцированная агрегация была самой высокой у кроликов, а наиболее низкой у крыс. Сходные различия касаются и способности к экзоцитозу: тромбоциты крыс наименее активны по этому параметру (табл. 1).

Выявленные особенности морфологии и функции тромбоцитов у крыс могут быть связаны с тем, что эти животные наиболее восприимчивы к эмоциональному стрессу, а иммобилизация, которой они подвергались для взятия крови, приравнивается у них к такому состоянию. Это позволило нам предположить, что стрессорные воздействия различной природы могут влиять на изменение пула тромбоцитов, и в частности на появление ПТ.

  1. Роль катехоламинов в регуляции тромбоцитарного пула крыс

Одним из компонентов стресс-реакции в организме рассматриваются катехоламины. Принципиальная трудность, связанная с исследованием причин и взаимосвязи между стрессорной ситуацией и ответом, заключается в количественной оценке вызывающего стресс стимула. В этой связи удобной моделью активации симпато-адреналовой системы является метаболический стресс, вызванный введением 2ДГ.

Рисунок 2. Изменение концентрации адреналина и норадреналина в крови на фоне метаболического стресса, развившегося в ответ на болюсное введение через вживленный катетер бодрствующим крысам 2ДГ. Первая доза составляла 125 мг/кг, вторую дозу (375 мг/кг) вводили через 15 мин. * – p<0,05; ** – p<0,01.

Исходно концентрация адреналина и норадреналина в плазме крови составляли 0,158±0,052 нг/мл и 0,393±0,065 нг/мл соответственно. Через 15 мин после введения крысе первой дозы 2ДГ (125 мг/кг)  уровень адреналина возрастал почти в 12 раз. Максимальный его прирост (в 41 раз) наблюдался через 15 мин после введения второй дозы, равной  375 мг/кг, и далее менялся незначительно в течение двух часов. Общий выброс норадреналина после первой дозы увеличивался в 1,4 раза, а после второй дозы – в 2,7 раза, в дальнейшем сохраняясь повышенным в 2,5 раза (рис. 2).

Уже через 15 мин после введения первой дозы 2ДГ количество тромбоцитов в крови возрастает на 31% (рис. 3).

Рисунок 3. Количество тромбоцитов в крови крыс до и через 15 мин после введения первой  и 120 мин после введения второй доз 2ДГ. * – p<0,05.

Реально в физиологическом состоянии треть тромбоцитов секвестрируется в селезенку. Под действием высоких концентраций катехоламинов они могут достаточно быстро покидать это депо, что и может быть причиной повышения их количества в крови. Через 2 часа наблюдалось увеличение количества тромбоцитов еще на 8%. и одновременно имело место появление более длинных и находящихся на разных стадиях деления ПТ. Это может быть связано со стимуляцией стресс-поэза и запуском продукции тромбоцитов из мегакариоцитов, находящихся на ранних стадиях созревания. Такой поворот событий вполне реален, если учитывать, что стадия полиплоидизации и созревания может занимать менее 90 мин после поступления стимула.

Рисунок 4. Содержание ПТ в крови крыс в условиях метаболического стресса в зависимости от времени взятия проб после введения 2ДГ. * – p<0,05 по отношению к первоначальным показателям до введения 2ДГ (0 точка);^ – p<0,05 по отношению к показателям на 15й мин, соответствующей введению первой дозы 2ДГ.

В то же время через 15 минут после введения 2ДГ содержание ПТ возрастает почти в 5 раз (p<0,01) (рис.4). Трудно себе представить, что за такой короткий срок такое повышение может произойти за счет рождения из мегакариоцитов. Это подтверждает высказанное ранее предположение о выбросе запасного пула из селезенки, так как известно, что именно молодые клетки задерживаются в ней, где и происходит их дальнейшее созревание.

Полученные данные позволили выбрать для проведения дальнейших исследований ПТ временной интервал в 120 мин после введения 2ДГ, за который в крови появляется достаточно большое количество ПТ разного происхождения, но животные еще не погибают.

На рис. 5 (А, Б) представлены отдельные ПТ, на дистальных концах которых происходит формирование Д форм (В), остающиеся еще соединенными с основной структурой. Обнаружены ПТ различной длины (от 2 мкм до 20 мкм), находящиеся на разных стадиях деления. Большинство биполярных ПТ имели длину 2-4 мкм и закругленные или вытянутые сужающиеся концы. Именно такие более короткие формы появлялись в первые 15 мин. после введения 2ДГ, что свидетельствует о том, что именно они находились в селезенке. Можно предположить, что в таком виде ПТ остаются после последнего отделения Д форм и задерживаются в селезенке для «дозревания». Через 2 часа в крови появляются более длинные, делящиеся ПТ.

Рисунок 5. А, Б, В – различные формы ПТ в крови крыс в условиях метаболического стресса, СЭМ, увеличение х2500 – 7000. 1 бар – 2мкм. Г, Д, Е – внутренняя структура ПТ, ТЭМ, Г, Д, – увеличение х40000, Е – увеличение 10000, стрелками отмечены места формирования Д тромбоцитов.

Ультраструктура ПТ значительно отличается от структуры Д форм (рис. 5 Г, Д). На дистальных концах ПТ концентрируются пучки микротрубочек, которые отличаются плотной упаковкой и способствуют удержанию вытянутой биполярной формы. У Д форм микротрубочки располагаются по внутреннему периметру мембраны: при активации они рассеиваются хаотически по цитоплазме и вследствие этого происходит изменение формы и переход из Д в С1 формы. В делящихся ПТ микротрубочки более выражены в сформировавшемся, но еще не отделившемся участке, который в дальнейшем даст начало Д форме (Е). Понятно, что именно такое расположение микротрубочек способствует как поддержанию формы и формированию перетяжек на концах ПТ, так и отделению новых Д тромбоцитов.

Кроме разницы в форме, важнейшим отличием является величина плотных гранул и их количество в ПТ. Для биполярных, размером до 4 мкм ПТ характерно почти двукратное снижение количества гранул (р<0,05) и увеличение их размера (p<0,001). В более длинных делящихся ПТ плотные гранулы были единичными, а в отдельных клетках отсутствовали.

Мы предположили, что такие различия в морфологической картине могут влиять на функциональную активность тромбоцитов. Создавая метаболический стресс, т.е. условия, когда значительно повышается выброс в кровоток ПТ, у нас появилась возможность исследования функциональной активности этих форм и оценки вклада данной субпопуляции в общее состояние всего пула.

Агрегационная способность тромбоцитов крыс по сравнению с человеком снижена. У здоровых животных, находящихся в бодрствующем состоянии, агрегация тромбоцитов в крови, взятой через катетер, находится в пределах 18 – 42 % (рис. 6). В крови таких животных циркулирует от 4,2 до 7,3 % ПТ, а основную часть (83±9,1 %) составляют Д формы. Спонтанная агрегация отсутствует. В условиях метаболического стресса спонтанная агрегация тромбоцитов у крыс также отсутствовала, а индуцированная 5 мкмоль АДФ была снижена и ни у одного животного не достигала нижней границы нормы (рис.6). Возможно, что именно присутствие значительного количества ПТ вызывает такую агрегационную картину всей популяции пластинок.

Рисунок 6. Агрегация тромбоцитов интактных крыс (контроль) и через 2 часа после введения 2ДГ. Жирными горизонтальными линиями отмечены пределы показателей у здоровых животных. Индуктор агрегации – 5 мкмоль АДФ.

Для проверки этой гипотезы были исследованы образцы ОТП после исследования процесса агрегации. Кюветы для агрегатометрии после ее измерения оставляли на столе на 5 мин для того, чтобы образованные агрегаты осели на дно, а затем отбирали надосадок и определяли в нем содержание тромбоцитов разной формы. Подсчитывали также общее количество клеток в ОТП и супернатанте, чтобы выяснить, сколько тромбоцитов не способны к образованию агрегатов.

У контрольных крыс 32,8±2,7% тромбоцитов не участвуют в образовании агрегатов и остаются в суспензии. Среди одиночных тромбоцитов находится 39,3±4,7% Д форм, 44,0±3,9% С1 форм и 16,1±1,8% ПТ. Увеличение числа С1 форм связано с активацией тромбоцитов Д формы под действием АДФ, но в основном это были мелкие, с гладкой поверхностью, по-видимому старые или рефрактерные пластинки. Увеличение содержания ПТ в суспензии (р<0,001) свидетельствует о том, что они не участвуют в образовании агрегатов и их число по отношению к другим формам растет.

Более ярко это проявляется при метаболическом стрессе. Вне агрегатов остается 23,8±2,7% Д форм, 21,4±3,1% С1 форм и 55.2% ПТ. Значительное количество ПТ, не включившихся в состав агрегатов, остается в неизмененном виде. Такое увеличение числа ПТ в надосадке по сравнению с ОТП (р<0,001) связано с тем, что часть Д и С1 форм уходит в агрегаты, а все ПТ остаются в нем, и их содержание по отношению к другим формам возрастает.

Такая картина подтверждает неспособность ПТ взаимодействовать друг с другом и тромбоцитами других субпопуляций и позволяет сделать вывод об их функциональной инертности в отношении агрегации.

Таблица 2.

Содержание различных по морфологии тромбоцитов у крыс, находящихся в условиях метаболического стресса среди адгезированных и не способных к адгезии клеток.

Адгезивные свойства ПТ также изменены. Около трети тромбоцитов крыс, пребывающих в метаболическом стрессе адгезируют к фольге и стеклу, а к подложкам, покрытым коллагеном IV типа еще меньше. Остальные, неприкрепившиеся, легко смываются с поверхностей. К поверхностям адгезировали активные формы, а неактивные оставались в смывах. Практически все ПТ оказывались среди последних, что говорит об их неспособности выполнять функцию адгезии (табл. 2).

Исследование адгезивных свойств тромбоцитов, не способных к агрегации (см. раздел на стр. 18) показало, что только 7,3±1,5% из них способны к адгезии. Но ПТ и в этом эксперименте оставались инертными. Сходная картина получена при исследовании агрегации тромбоцитов, оставшихся в смыве после адгезии. В ответ на 5 мкмоль АДФ ни в одном образце агрегация не наблюдалась. Поскольку более 50% пула составляли инертные ПТ, именно они могут снижать агрегационный ответ всего пула. Спонтанная агрегация также отсутствовала.

Реакция освобождения (экзоцитоз). Тромбоциты контрольных крыс способны захватывать флуоресцентный маркер и накапливать его внутри гранул (эндоцитоз). В ответ на стимул они почти полностью высвобождают его в окружающую среду, удерживая лишь незначительное количество, рассеянное в цитоплазме. Через 2 часа после введения 2ДГ, на фоне повышения в крови содержания ПТ, способность к эндоцитозу возрастает на 28% (p<0,05), а освобождение метки снижается на треть (p<0,01). Флуоресцентная микроскопия показала, что метка остается внутри гранул, вызывая ярко-красное свечение. У тромбоцитов, оставшихся в смыве после адгезии, на фоне повышенного на 33% эндоцитоза, освобождение метки снижается в 2,5 раза (p<0,01). Это может быть связано с тем, что в ПТ как в молодых клетках, внутриклеточные гранулы содержат только небольшое количество веществ и часто даже не визуализируются, так как могут находиться в «слипшемся» состоянии. Этим определяется их повышенный потенциал к эндоцитозу. В то же время, резкое снижение экзоцитоза может зависеть как от потребности клеток в насыщении гранул, так и от нарушения в них такой физиологической функции как реакция освобождения.

Взаимодействие ПТ с лейкоцитами. Для проверки способности ПТ образовывать лейкоцитарно-тромбоцитарные агрегаты, мы добавляли суспензию отмытых аутологичных лейкоцитов (1:50) к образцам тромбоцитов из смыва после адгезии, в которых сконцентрированы ПТ. После инкубации этой смеси в течение 15 мин при 370С и перемешивании (1200 об/мин) с помощью СЭМ было обнаружено образование гетероклеточных агрегатов. При подсчете тромбоцитов до и после этих манипуляций выяснилось, что их количество в свободном состоянии снизилось на 7,4±1,1%, и это произошло за счет уменьшения числа Д форм. ПТ оставались в суспензии и не участвовали во взаимодействии с лейкоцитами. Это свидетельствует об их инертности и по отношению участия в воспалительных реакциях.

Анализ полученных данных о неспособности ПТ к адгезии и агрегации, взаимодействию с лейкоцитами, а также сниженной реакции освобождения позволил сделать вывод об их инертности.

Демедулляция надпочечников у крыс приводила к тому, что уровень адреналина в плазме крови животных не превосходил предел его хромотографического определения (0,02 нг/мл) ни до, ни после введения 2ДГ. Базальная концентрация норадреналина в плазме демедуллированных крыс оказалась выше, чем у крыс с интактными надпочечниками. После введения полной дозы 2ДГ она повышалась в 2,5 раза, что было сходным с показателями у интактных крыс.

У демедуллированных крыс в крови обнаружено не более 4% ПТ (2,9±0,6%), что было ниже этого показателя у тех же животных до операции. Агрегационная активность тромбоцитов не отличалась от показателей у интактных животных. После введения 2ДГ количество ПТ не изменялось, но большинство тромбоцитов имели С1 форму. Агрегация тромбоцитов в ответ на АДФ у большинства животных превышалась, что может быть связано с умеренным возрастанием (в 2-3 раза) уровня норадреналина, который оказывает активирующее действие на пластинки.

Адреноблокаторы празозин, тропафен и пропраналол предотвращали повышение в крови ПТ, происходящее на фоне стрессорного воздействия, что можно объяснить блокадой выброса запасного пула тромбоцитов селезенкой. Агрегация тромбоцитов на фоне блокады и -адренорецепторов повышалась, хотя есть различия в ее степени. В первую очередь это связано с отсутствием в общем пуле инертных, неспособных к агрегации ПТ.

Эксперименты по демедулляции надпочечников и действию адреноблокаторов указывают на то, что изменения морфологии и функциональных свойств тромбоцитов обусловлено не непосредственным введением 2ДГ, а именно стрессорной реакцией.

  1. Образование ПТ в условиях in vitro.

В патологических условиях (например, при курении, стрессе и особенно кардиогенном шоке) в крови повышается уровень катехоламинов, которые могут существенно содействовать внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Возможно, именно выброс значительного количества инертных ПТ в циркуляцию является защитной реакцией организма против развития массированного тромбоза на фоне гиперкатехоламинемии. Хотя нельзя было исключить и более прямого пути, связанного с непосредственным влиянием высоких концентраций катехоламинов на трансформацию тромбоцитов разных субпопуляций, присутствующих в кровотоке, в биполярные формы ПТ. В наших экспериментах in vitro адреналин, серотонин и гистамин в концентрациях 10-8 – 10-7 моль индуцируют агрегацию тромбоцитов, а в более высоких (выше 10-5 моль) – являются дезагрегантами. Инкубация ОТП с катехоламинами в концентрации 10-7 моль не приводила к появлению ПТ в суспензии. Повышение концентрации веществ до 10-4 моль принципиально не меняло картину, что свидетельствует об отсутствии прямого влияния катехоламинов на трансформацию тромбоцитов в формы, характерные для ПТ.

Ионы Са играют важную роль в поддержании формы тромбоцитов. По нашим данным, при использовании ЭДТА в качестве антикоагулянта в крови, отсутствуют ПТ. Это позволило предположить, что связывание двухвалентных катионов, происходящее на фоне добавление ЭДТА к ОТП с высоким содержанием ПТ, может приводить к потере их формы.

Рисунок 7. Влияние хелатирования, вызванного добавлением 1 мкмоль ЭДТА, на содержание тромбоцитов разных субпопуляций в крови крыс, пребывающих в состоянии метаболического стресса. * – p<0,05; ** – p<0,001.

После инкубации с ЭДТА тромбоцитов крыс с метаболическим стрессом, ПТ теряли свою биполярную форму и их количество уменьшалось, содержание С1 форм повышалось, а количество Д форм снижалось (рис. 7). Микроскопический анализ выявил, что среди сферических тромбоцитов попадаются более крупные, с гладкой поверхностью или с длинными псевдоподиями, т.е. формы, которых не было до добавления ЭДТА. Вероятно, они появляются в результате преобразования ПТ, которые первоначально присутствовали в ОТП. Изменение их формы может влиять на показатели СОТ, исследование которого проводят на фоне ЭДТА.

ИЛ-2 и ИЛ-6, влияющие на созревание и пролиферативную активность мегакариоцитов и стимулирующие рождение ПТ, после инкубации с ОТП в течение 3 мин при 370 С не влияют на форму и агрегационную активность тромбоцитов in vitro. Известно, что ИЛ-2 стимулирует иммунную реактивность лимфоцитов, а также синтез и экспрессию ИЛ-1 и ФНО-. Добавление к ОТП предварительно инкубированных с ИЛ-2 аутологичных лимфоцитов приводило к активации тромбоцитов и увеличению количества С1 форм на фоне снижения Д форм, что может быть связано с взаимодействием с лейкоцитами. Но интерлейкины, ни непосредственно сами, ни опосредованно через лейкоциты, не вызывают образования ПТ.

  1. Состояние тромбоцитов в условиях хранения тромбомассы.

Для выяснения возможности трансформации тромбоцитов при длительном нахождении в условиях in vitro (5 дней), исследовали концентраты тромбомассы, полученные с помощью разных методов – традиционным «в осадке» и с использованием процедуры получения из лейкоцитарной пленки, так называемым «buffy coat».

В течение хранения количество тромбоцитов в тромбомассе менялось. В «buffy coat» уже в первые сутки хранения количество тромбоцитов повышалось в среднем на 7,1%, незначительно падало к 3 суткам и затем понижалось на 5-е сутки (рис. 8 А). В контейнерах с «осадком» через сутки количество пластинок сохранялось, на 3 сутки повышалось на 9,7%, после чего снижалось к 5 дню. На первые сутки хранения в «buffy coat» увеличивается количеств ПТ, среди которых есть тромбоциты длиной до 10 мкм. В дальнейшем их число снижалось и к 5 дню достигало первоначального уровня. В «осадке» сходное, но более выраженное повышение начиналось на 3 сутки и продолжало расти и к 5 дню (рис. 8 Б). С2 формы отсутствовали во всех исследованных пробах.

Спонтанная агрегация во всех исследованных образцах отсутствовала. АДФ-индуцированная (5 мкмоль) агрегация в начале хранения была достоверно выше (р<0,01), чем в донорской крови (рис. 8 В). Однако в дальнейшем она снижалась в зависимости от срока хранения. Это может быть связано как с деградацией тромбоцитов, так и с повышением количества функционально инертных ПТ, хотя до 3-х суток агрегация сохранялась в пределах нормальных величин.

Рисунок 8. Динамика изменения количества тромбоцитов в тромбомассе, полученной разными методами, при хранении в течение 5 суток (А); содержание ПТ в общем пуле (Б); агрегация тромбоцитов в ответ на добавление 5 мкмоль АДФ (В). * – p<0,05; ** – p<0,001 по сравнению с показателями в 1й час хранения.

СОТ в образцах «buffy coat» через сутки хранения повышался (р<0,05), а затем постепенно снижался и к 5-му дню был меньше, чем в первый час хранения. Повышение СОТ объясняется скорее всего тем, что под действием ЭДТА ПТ изменяют форму и увеличиваются в объеме, и именно присутствие в контейнерах ПТ ведет к повышению СОТ на 1-3 сутки хранения. Появление на 5 сутки мелких тромбоцитов приводит к снижению СОТ.

Повышение общего количества тромбоцитов и увеличение числа ПТ в контейнерах при 5-ти дневном хранении in vitro и сохраняющейся контролируемой стерильности можно объяснить присутствием в них циркулирующих мегакариоцитов, которые нам удалось выявить при микроскопии (рис. 9). По разным данным в венозной крови здоровых лиц присутствует от 1 до 20 мегакариоцитов на 1,5 мл. С учетом того, что один мегакариоцит может продуцировать от 103 до 6х104 тромбоцитов, достаточно попадания в контейнер нескольких мегакариоцитов, чтобы значительно повысить количество тромбоцитов. Мощным регулятором тромбоцитопоэза в данных условиях могут служить цитокины, которые вырабатываются лейкоцитами, находящимися в тромбомассе. Есть данные, что содержание интерлейкинов зависит от величины контаминации лейкоцитами (Wadhwa et.al., 1996). Это относится в первую очередь к ИЛ-1, ИЛ-6 и TGF-, уровень которых постепенно возрастает к 5-му дню хранения. В то же время содержание ИЛ-8 повышается уже в первые сутки.

То, что ни в одном из образцов не обнаружено С2 форм, подтверждает мнение о невозможности трансформации в эти формы тромбоцитов других субпопуляций. Мы предполагаем, что С2 тромбоциты вырабатываются только клетками костного мозга и не образуются из циркулирующих мегакариоцитов, которые по литературным данным имеют пониженную плоидность.

Рисунок 9. Мегакариоцит из контейнера с тромбомассой на 3-и сутки хранения. 1 Бар соответствует 5 мкм.

В то же время быстрое появление ПТ в условиях in vitro позволяет предположить, что и в организме человека in vivo они могут образовываться не только в костном мозге, но и из циркулирующих мегакариоцитов.

5. Гетерогенность тромбоцитов человека c различными патологиями.

У больных атопической бронхиальной астмой, которая часто сопровождается воспалительной реакцией, отмечены повышенная активность тромбоцитов и накопление на их поверхности IgE и IgG. С целью снижения содержания этих иммуноглобулинов, играющих важную роль в патогенезе заболевания, у больных проводили процедуру тромбоцитофереза, удаляя из организма до 60% (в среднем оставалось 102,4±9,7 тыс/мм3) тромбоцитов. Количество тромбоцитов восстанавливалось до первоначального уровня через сутки (до – 295,7±31, после – 316,6±27 тыс/мм3). До проведения процедуры тромбоциты были активированы, в пуле присутствовали С2 формы, содержание которых кореллировало с уровнем спонтанной агрегации (r=0.448. р>0,05). После процедуры тромбоцитофереза, на фоне достоверного повышения количества Д и снижения содержания С1 форм, исчезали С2 тромбоциты и почти в 6 раз увеличивалось число ПТ (табл. 3).

Таблица 3.

Содержание тромбоцитов разной формы и их агрегация у больных бронхиальной астмой до и после тромбоцитофереза. * – p<0,05; ** – p<0,001 – по сравнению с данными до процедуры.

Такая картина свидетельствует о стимуляции мегакариоцитопоэза и включении пути быстрой выработки тромбоцитов для пополнения утерянного пула. Агрегационный ответ снижался, спонтанная агрегация исчезала у всех больных, а индуцированная была даже ниже нормальных величин у большей части больных. Это может быть связано с повышением количества неактивнях, функционально инертных ПТ.

Феохромоцитома (ФХЦ). Учитывая ранее установленный факт, что избыточная концентрация катехоламинов изменяет состав пула и функциональное состояние тромбоцитов у крыс, логично было предположить, что у больных ФХЦ возможна сходная картина. Экскреция адреналина, норадреналина и ВМК с суточной мочой у больных ФХЦ в десятки раз выше, чем у здоровых лиц и  больных АГ с подозрением на ФХЦ, которая после детального обследования была отвергнута.

Таблица 4.

Соотношение различных форм тромбоцитов и экскреция катехоламинов.

Содержание ПТ у больных ФХЦ также на порядок больше, чем у здоровых и больных АГ (p<0,001). Длина их может колебаться от 3 мкм до 10 мкм, а толщина – от 0,4 мкм до 1 мкм. Клетки субпопуляции С2 не обнаружены (табл. 4). Общее число тромбоцитов в периферической крови во всех случаях было сходным. Агрегация тромбоцитов, индуцированная 2 мкмоль АДФ, у больных ФХЦ достоверно снижена по сравнению со здоровыми, хотя для больных АГ характерно даже некоторое ее повышение. После операции удаления ФХЦ уровень экскреции катехоламинов и содержание ПТ нормализуются, что существенно отличает их от значений до хирургического вмешательства. Изменения количества Д и С1 форм недостоверны. После удаления опухоли агрегационный ответ также восстанавливается. Спонтанная агрегация наблюдалась у всех больных после операции, что может быть вызвано воспалительным процессом, сопровождающим вмешательство, и у 3 из 15 пациентов с АГ.

Присутствие в пуле тромбоцитов значительного количества инертных ПТ снижает его общую функциональную активность. Этим можно объяснить невысокую агрегационную способность тромбоцитов у больных ФХЦ, что в свою очередь может служить причиной геморрагических осложнений. Так, у одного из 18 больных ФХЦ (случай злокачественной АГ) во время операции удаления опухоли возникло массивное интраоперационное кровотечение. В основе кровотечения лежало нарушение тромбоцитарного звена гемостаза с развитием ДВС-синдрома, в связи с чем больная умерла на третьи сутки после операции, несмотря на повторные переливания донорской крови. Сходные осложнения отмечены и другими авторами.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество тромбоцитов биполярной формы значительно повышается только у больных с ФХЦ. Содержание их в крови, превышающее 17%. может служить диагностическим тестом ФХЦ (Авторское свидетельство № 1446527), что особенно важно в случаях с "нехарактерной" клинической симптоматикой и должно нацеливать на дальнейший поиск в плане топической диагностики ФХЦ.

Воспаление. Тот факт, что интерлейкины регулируют мегакариоцитопоэз, и в то же время их уровень повышается при воспалительных процессах разной природы, позволил нам предположить, что это может повлиять на появление в крови разных субпопуляций тромбоцитов.

У больных пневмонией, острым пиелонефритом, с гнойными абсцессами, содержание С-реактивного белка в крови было повышено (>5мг/дл). Известно, что его повышение сопровождается увеличением уровня цитокинов, и в первую очередь ФНО-. На этом фоне в 3-4 раза увеличивалось содержание ПТ (p<0,001) и появилось до 4% С2 форм (p<0,001). Спонтанная агрегация регистрировалась у всех больных. Выявлена корреляция между спонтанной агрегацией и содержанием С2 форм (r=0,596, p=0,02). АДФ-индуцированная агрегация у большинства больных оставалась в пределах нормальных величин.

Еще более выраженной была картина у больных менингитом и менингококкцемией, при которых уровень цитокинов может быть повышен в сотни раз. При генерализованных формах менингококковых инфекций у больных развивается тромбогеморрагический синдром, для различных фаз которого характерны либо тромбозы, либо геморрагические явления.

У 8 больных количество тромбоцитов в момент взятия крови сохранялось в пределах нормальных величин и наблюдалась гиперкоагуляция. Основную часть пула составляли тромбоциты, находящиеся на разных стадиях перехода из Д в С1 форму, Количество ПТ повышалось по сравнению с ЗД (8,6±0.7%) и в основном они имели веретенообразную форму. Также обнаружено 10,4±1,4% С2 форм, большинство из которых находились во взаимодействии с другими тромбоцитами и редко оставались одиночными, что говорит об их суперактивности. Отмечена повышенная способность тромбоцитов к эндоцитозу флуоресцентного маркера (35,3±4,1 усл ед p<0,05) и его экзоцитозу (31,4±2,6 усл ед; p<0,05). Можно предположить, что именно присутствие С2 форм приводит к такому эффекту. У всех больных наблюдалась высокая спонтанная агрегация (2,3±0,4 отн ед), но в то же время индуцировнная 5 мкмоль АДФ агрегация у 5 из них была ниже границ нормы (21,4±2,2%), а в образцах после регистрации оставалось 58,4±6,7% одиночных, не вошедших в агрегаты тромбоцитов. Это свидетельствует об их рефрактерности, приобретенной в результате повышения в крови активирующих веществ, в первую очередь АДФ. Несмотря на сниженную АДФ-индуцированную агрегацию, тот факт, что есть сверхактивные и способные спонтанно агрегировать тромбоциты, свидетельствует о высоком тромботическом потенциале этих пластинок и их вкладе в возникновение риска тромбоза, присущем этим пациентам. Исследование образцов после проведения агрегации показало, что среди не включенных в агрегаты клеток отсутствовали С2 формы.

Противоположная картина обнаружена у 6 больных с выраженными геморрагическими явлениями. У всех этих пациентов наблюдались гипокоагуляция и тромбоцитопения. Количество тромбоцитов не превышало 100 тыс/мм3. При этом в крови половину пула составляли ПТ (46,4±5,2%). У одного больного, который умер от желудочного кровотечения, их количество превышало 50%. Остальная часть пула представлена Д формами и мелкими (менее 1,5 мкм), с гладкой поверхностью С1 формами. Спонтанная агрегация у всех больных этой группы отсутствовала. АДФ-индуцированная агрегация была снижена (22,3±3,1 отн ед), что еще раз подтверждает функциональную инертность ПТ. Кроме того, на фоне повышенной способности к захвату флуорохрома (38,2±3,7 усл ед, р<0,001 по сравнению со здоровыми лицами), наблюдалось снижение его выброса (21,8±1,1 усл ед, p<0,001). Сходную картину мы наблюдали у больных феохромоцитомой. Несмотря на принципиальные отличия в факторах, на фоне которых в крови повышается число ПТ, их вклад в функциональное состояние всего пула одинаков, что свидетельствует в пользу их инертности, несмотря на то, что это молодые формы.

  1. Атеросклероз.

Атеросклеротическое поражение сосудов часто сопровождается повышенным риском артериального тромбоза, развитие которого зависит от большого количества разнообразных факторов. Но одним из основных является функциональная активность тромбоцитов, так как именно они первыми взаимодействуют с поврежденной сосудистой стенкой.

Рисунок 10. СЭМ С2 тромбоцитов у больных ИБС (А, Б – увеличение х5000) и ТЭМ (В – увеличение 42000, Г – увеличение 120000).

В крови больных ИБС с верифицированным коронарным атеросклерозом присутствует 2,8±1,1% С2 тромбоцитов. Чаще всего С2 встречаются в составе мелких агрегатов, состоящих из нескольких тромбоцитов, но могут оставаться и одиночными (рис. 10 А, Б). Они присутствуют в крови всех без исключения больных ИБС.

Анализ внутриклеточных структур выявил, что мембрана С2 формы рыхлая с множеством инвагинаций, приводящих к увеличению площади поверхности, внутриклеточные гранулы единичны и практически не видны плотные гранулы. В то же время сильно развита система открытых канальцев, которая ответственна за захват и интернализацию чужеродных частиц (В, Г). Сложно сказать, почему эти молодые пластинки выходят из мегакариоцитов с такой внутренней организацией, но это еще один признак, по которому их можно отличить.

Кроме того, в крови больных ИБС повышается количество ПТ, в среднем до 6,9±2,1%. У отдельных больных их число достигает 10%. Такая картина свидетельствует о повышении мегакариоцитопоэза и запуске пути быстрого поэза, что может быть вызвано как усиленным потреблением тромбоцитов, часто происходящим при атеросклерозе, так и сокращением срока их жизни до 6 суток. Сходная картина наблюдалась и у больных с атеросклерозом брахиоцефальных артерий.

У 20 из 53 больных ИБС регистрировалась спонтанная агрегация. В целом по группе она соответствовала 1,5±0,9 отн ед и не коррелировала с содержанием тромбоцитов различных субпопуляций. Но если разбить группу больных по содержанию в их крови С2 форм и выделить подгруппу с их числом менее 2% (группа 1) и более 2% (группа 2), можно отметить, что во вторую группу попали больные с высоким уровнем спонтанной агрегации (r=0,376), что свидетельствует о влиянии этих форм на регистрацию общей активности тромбоцитов. В то же время индуцированная 5 мкмоль АДФ агрегация у 5 больных из группы 2 была даже понижена. В группе 1 спонтанная агрегация отсутствовала. АДФ-индуцированная агрегация у 2 больных выходит за верхние границы нормы. Такая картина свидетельствует о необходимости индивидуального подхода к оценке морфо-функционального состояния тромбоцитов и факторов, влияющих на активность пула в целом.

Показательным оказалось определение СОТ с помощью тромбоцитокрита, позволившее выявить положительную корреляцию между СОТ и числом С2 пластинок (r=0,372). Определение СОТ с помощью гемоанализатора не дает возможности обнаружить подобную закономерность.

Различные антитромбоцитарные препараты влияют на функциональную активность и морфологическую гетерогенность пула тромбоцитов. Среди широко применяющихся в клинической практике препаратов, есть лекарства, которые могут менять морфофункциональные свойства тромбоцитов. Наиболее широко используемый препарат – аспирин, в дозе 125 мг/сут не влияет на количество С2 форм и ПТ. На фоне его приема спонтанная агрегация в среднем по группе достоверно снижается, но у отдельных больных сохраняется выше нормальных значений. Guthikonda et al. (2007) показали, что присутствие «ретикулярных» тромбоцитов снижает эффективность терапии аспирином, что связано с увеличенным содержанием в них СОХ-1 и СОХ-2. По нашим данным, если в крови повышено количество С2 форм, действие аспирина снижается, т.е. наблюдается резистентность к нему (p<0,05). Более эффективными в этом случае оказались тиклид, клопидогрель, трентал и индометацин. На фоне приема этих препаратов количество С2 форм значительно снижается или они исчезают полностью (p<0,001), что можно расценивать как способность упомянутых лекарств воздействовать на мегакариоцитопоэз. Известно, что метаболиты тиенопиридинов могут трансформировать рецепторы к АДФ на мегакариоцитах, в результате чего вышедшие из них тромбоциты попадают в циркуляцию уже с измененными свойствами (Cazenave, Gachet. 1997). Спонтанная агрегация у большинства больных исчезает, а АДФ-индуцированная значительно снижается в ответ на прием тиклида и клопидогреля (p<0,05). Полученные данные свидетельствуют о преимуществе применения этих препаратов для лечения больных с повышенным содержанием С2 форм. Следует отметить, что при выявлении резистентности  к аспирину оценка морфологической гетерогенности тромбоцитов может помочь в более правильном выборе терапии.

Широко применяемые в настоящее время для лечения больных ИБС статины не обладают прямым действием на тромбоциты. Но на их фоне наблюдается некоторое снижение количества С2 форм и уровня спонтанной агрегации. И хотя симвастатин не приводит к достоверным изменениям, можно говорить об имеющейся тенденции к нормализации морфофункциональных свойств тромбоцитов на фоне его приема.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Принципиальные различия в морфологии и функциональной активности тромбоцитов закладываются на этапе мегакариоцитопоэза, и большинство качеств, характерных для этих форменных элементов, даны им при рождении.

Целью данного исследования была попытка изучения природы появления в крови разных субпопуляций тромбоцитов, не связанных с их переходом из Д в С1 формы. К моменту начала работы было известно, что у человека и лабораторных животных существует 3 пути мегакариоцитопоэза, но уже к концу 80-х годов появились первые работы, свидетельствующие о четвертом пути рождения тромбоцитов, когда из мегакариоцитов выходят незрелые длинные фрагменты, названные ПТ. В это же время стало ясным, что повышение плоидности мегакариоцитов приводит к усилению синтеза и накопления в них большего количества специфичных для тромбоцитов белков, которые затем передаются формируемым ими тромбоцитам. В результате появляются крупные, получившие при рождении повышенное количество различных белков тромбоциты субпопуляции С2. Одновременно с этим, в конце 70-х – начале 80-х годов впервые заговорили о морфологической гетерогенности тромбоцитов, как о явлении, возможно влияющем на функциональное состояние пула тромбоцитов и их участие в тромбообразовании.

Предложено выделять три субпопуляции – Д, ПТ и С2 тромбоцитов, появление которых в крови связано с мегакариоцитопоэзом.. Кроме того, во многих случаях наблюдаются различные переходные формы, которые связаны с активацией Д тромбоцитов, приводящей к их сферуляции. Поэтому в отдельную субпопуляцию выделены тромбоциты С1, хотя их появление и не связано с поэзом. До сегодняшнего дня практически не было данных о функциональном состоянии ПТ и достаточно ограниченными оставались знания о поведении С2 тромбоцитов. Поскольку проводить прямые исследования мегакариоцитопоэза в условиях организма in vivo в большинстве случаев сложно (из-за необходимости проводить трипанобиопсию), о нем можно судить по появлению в циркуляции тромбоцитов различных субпопуляций.

Образование ПТ происходит и в норме, у здоровых людей и животных. В крови присутствуют ПТ разной длины, редко, но достигающие значительного размера. В основном циркулируют более короткие ПТ, находящиеся на разных стадиях отделения от них Д тромбоцитов. После выхода в кровь ПТ депонируются в селезенке, где, по-видимому, происходит их окончательное созревание и затем вторичное поступление в циркуляцию уже в функционально активном виде. Мы показали, что сами по себе ПТ функционально инертны и не способны к осуществлению ими в полной мере основных функций – адгезии, агрегации и реакции освобождения. Это затрудняет их участие, как в процессе нормального гемостаза, так и в транспорте веществ. Но, будучи молодыми клетками, они содержат все необходимые для жизнедеятельности белки, которые передаются отделяющимся от них Д тромбоцитам, уже функционально активным. Можно предположить, что интенсивное включение такого пути поэза в условиях тромбоцитопении, с одной стороны, может быть связано с необходимостью быстрого пополнения утраченного пула тромбоцитов, а с другой – сокращения одновременного выброса пластинок с гемостатическим потенциалом. Особенно важно это в условиях повышеного содержания в крови агонистов тромбоцитов, наблюдаемое при стрессе или воспалении. Так организм защищается от повышения гемостатической реактивности тромбоцитов. Хотя могут быть ситуации, при которых на фоне повышения потребления тромбоцитов и тромбоцитопении в крови преобладают ПТ. Это способствует развитию геморрагий, например, при ДВС-синдроме. Так что появление ПТ в крови – это и физиологический процесс, и защитная реакция, но в ряде случаев может приводить и к катастрофическим последствиям.

Другая ситуация связана с появлением в циркуляции субпопуляции С2 тромбоцитов. Так как их продукция в результате тромбоцитопоэза редко отмечена в здоровом организме и связана с различными патологическими ситуациями, появление в крови С2 может говорить о развитии патологии. Кроме того, высокая функциональная активность С2 тромбоцитов и их агрессивность в отношении агрегатообразования, делают важным проведение контроля их появления в крови пациентов.

Проведенные фундаментальные исследования делают простым и доступным подход к оценке и пониманию вклада тромбоцитов различных субпопуляций в процесс тромбообразования и возникновения риска тромбозов и геморрагий у пациентов различных групп.

Наши исследования показали, что выявление морфологических и функциональных особенностей тромбоцитов разных субпопуляций может быть полезным при оценке риска тромбоза у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Это особенно важно для назначения адекватной корригирующей терапии.

ВЫВОДЫ.

  1. Выявлена морфологическая гетерогенность популяции циркулирующих тромбоцитов в крови человека и животных в норме и при различных патологических состояниях. Выделяются три различных по форме и функциям типа – дисковидные размером 2-4 мкм с гладкой поверхностью или небольшими кратерами открытой системы канальцев, биполярные протромбоциты длиной от 2 до 20 мкм веретенообразной или биполярной конфигурации, в отдельных случаях с перетяжками на концах, и большие сферические или «ретикулярные» тромбоциты размером 4-5 мкм с неровной, складчатой или слоистой поверхностью.
  2. Показано, что дисковидные тромбоциты, преобладающие в здоровом организме человека и животных, способны активироваться в кровотоке под действием различных факторов окружающей среды и преобразовываться в сферические формы размером 1-2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий;
  3. Протромбоциты в незначительных количествах присутствуют в крови здоровых лиц и животных, где способны отделять формирующиеся на их концах зрелые дисковидные формы. Количество протромбоцитов значительно возрастает в условиях гиперкатехоламинемии различной природы и может в отдельных случаях составлять половину пула.
  4. Доказано, что протромбоциты функционально инертны. Они не способны к адгезии на различные поверхности, агрегации друг с другом и лейкоцитами, для них характерна сниженная способность к реакции освобождения. Повышение их содержания в крови может приводить к развитию геморрагических явлений. Увеличение уровня интерлейкинов и катехоламинов в крови повышает содержание протромбоцитов
  5. Циркулирующие мегакариоциты присутствуют в крови здоровых лиц и могут быть выделены in vitro с фракцией тромбоцитов. В условиях хранения тромбомассы они способны к тромбоцитопоэзу, который идет по пути продукции биполярных протромбоцитов
  6. Большие сферические тромбоциты отсутствуют в крови здоровых лиц и животных. Они появляются в условиях воспаления при повышении уровня провоспалительных медиаторов, при инфекции и атеросклерозе.
  7. Большие сферические «ретикулярные» формы – наиболее активная субпопуляция тромбоцитов. Для них характерна развитая открытая система канальцев, увеличенная площадь мембраны за счет большого количества инвагинаций, пониженное количество внутриклеточных гранул, повышенный объем, склонность к агрегатообразованию.
  8. Аспирин не влияет на содержание протромбоцитов и больших сферических «ретикулярных» тромбоцитов в крови, но присутствие повышенного количества последних снижает эффективность действия аспирина и может быть одной из причин резистентности к нему. Прием тиклида и клопидогреля приводит к полному исчезновению или значительному снижению количества больших тромбоцитов и одновременному подавлению спонтанной агрегации, что свидетельствуют о преимуществе применения этих препаратов для лечения больных с повышенным содержанием таких форм.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

  1. Действие полисахарида менингоккка на функциональные свойства тромбоцитов / В.И. Покровский, В.В. Булычев, Х.Д. Ломазова, А.М. Грачева, А.М. Полякова, Л.И. Бурячковская, Н.Ю. Мольков. // Бюлл Эксперим Биол Мед. – 1982. – №3. – C. 8-10.
  2. Действие токсических субстанций стафилококка на функциональные свойства тромбоцитов / В.В. Малеев, А.М. Полякова, Л.И. Бурячковская, О.С. Астрина. // Бюлл Эксперим Биол Мед. – 1986. – № 12. – С. 678-681.
  3. Коррегирующее действие индометацина на изменение функции тромбоцитов при экспериментальной сальмонеллезной интоксикации / С.Г. Пак, М.П. Синельникова, Д.Б. Цукерман, Л.И. Бурячковская, О.С. Астрина. // Материалы пленума Правления ВНОГ, Рига. – 1986. – С. 654-655.
  4. Некоторые особенности тромбогеморрагического синдрома при генерализованной форме менингококковой инфекции, осложненной токсикоинфекционным шоком / А.М. Полякова, Л.И. Бурячковская, О.С. Астрина, Х.Д. Ломазова. // Тер архив. – 1986. – № 10. – С. 38-42.
  5. Нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза при эндотоксинемии и коррекция их ингибитором биосинтеза простагландинов индометацином / С.А. Пак, М.М. Синельникова, Д.Б. Цукерман, М.В. Нелюбов, Д.В. Беликов, Л.И. Бурячковская, О.С. Астрина. // Биологич науки. – 1987. – № 7. – С. 68-72.
  6. Морфо-функциональные особенности биполярных форм тромбоцитов / Л.И. Бурячковская, Р.А. Маркосян. // Бюллетень ВКНЦ АМН СССР. – 1987. – № 1. – С. 66-72.
  7. Нарушение РАСК при генерализованной форме менингококковой инфекции, осложненной токсико-инфекционным шоком / Х.Д. Ломазова, А.М. Полякова, Л.И. Бурячковская, О.С. Астрина, В.В. Малеев. // Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике»: – М., 1987. – С. 347-348.
  8. Способ диагностики феохромоцитомы. / Г.Г. Арабидзе, Г.Н. Потапова, Л.И. Бурячковская, Р.А. Маркосян. / Авторское свидетельство № 1446527 от 22 августа 1988 г.
  9. Функциональное состояние тромбоцитов при иерсиниозной инфекции / А.В. Кравченко, Х.Д Ломазова, А.М. Полякова, Л.И. Бурячковская, В.В. Малеев. // Вестник академии медицинских наук. – 1991. – № 10. – С. 9-13.
  10. Pathogenesis of platelet activation by endotoxine / X. Lomazova, A. Polyakova, D. Zukerman, V. Maleev, L. Buryachkovskaya. //. I Congress International Society for Pathophysiol: poster/Abstract. – M., 1991. – p. 220-221.
  11. Морфофункциональные свойства биполярных тромбоцитов в норме и при некоторых патологических состояниях / Л.И. Бурячковская., Х.Д. Ломазова, Г.Н. Потапова. // Всесоюзная конференция «Физиология и патология гемостаза»: Тезисы доклада. – Полтава, 1991. – С. 68.
  12. Корреляция между формой и функциями тромбоцитов при стрессе / Л.И. Бурячковская, О.А. Тюрмина, Е.Ю. Бычкова, О.А. Семенова. // Всесоюзная конференция «Физиология и патология гемостаза»: Тезисы доклада. – Полтава, 1991. – С. 69.
  13. Platelet shape change, aggregation and adhesion in diagnostic of pheochromocytoma in hypertensive patients / L. Bourjachkovskaya, G. Arabidze, G. Potapova, I. Uchitel. // J Hypertension. – 1992. – V. 10 №4. – P. 190.
  14. Role of interleukin-2 and mononuclear cells in platelet tumor interaction / L. Oleksowicz, D. Zuckerman, K.D. Lomazova, L. Bourjachkovskaya, O.S. Astrina, E.G. Slavina. // Invasion Metastasis. – 1994. – № 13. – P. 119-131.
  15. Исследование морфологии тромбоцитов у больных бронхиальной астмой до и после тромбоцитофереза / А.Р. Татарский, К.М. Алиева, Л.И. Бурячковская, Л.Е. Петрова, А.Г. Чучалин. // Тер архив. – 1995. – №3. – С. 39-41.
  16. Platelet shape change in essential hypertensive patients with and without coronary atherosclerosis / L. Bourjachkovskaya, Ye. Parfyonova, T. Polevaya, G. Potapova, I. Uchitel. // 7th European Meeting on Hypertension: Abstract/poster. – Milan, 1995. – P. 29.
  17. Значение морфо-функциональной гетерогенности тромбоцитов при различных патологических состояниях, сопровождающихся  тромбогеморрагическими явлениями / Л.И. Бурячковская, И.А. Учитель, Г.Н. Потапова. // Всероссийская конференции «Патология гемокоагуляции»: Тезисы доклада. – М., 1995. – С. 34-36.
  18. Опыт длительного лечения ловастатином больных с гетерозиготной формой наследственной гиперхолестеринемии / Х.Г. Алиджанова, А.О. Елисеев, М.Г. Творогова, Л.И. Бурячковская, И.А. Учитель, В.В. Кухарчук. // Тер архив. – 1997. – № 8. – С. 13-17.
  19. Особенности морфо-функционильного состояния тромбоцитов у больных с сосудистыми патологиями разного генеза / Л.И. Бурячковская, И.А. Учитель, Г.Н. Потапова, Е.Я. Позин, З.А. Габбасов, Е В. Парфенова, Г.Г. Арабидзе. // Симпозиум «Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения»: Тезисы доклада. – М., 1997. – С. 33-34.
  20. Simvastatin effect on platelet activity in patients with familial hypercholesterlaemia / Kh. Alidhanova, L. Bourjachkovskaya, I. Uchitel, Z. Gabbasov, V. Kukharchuk. / Atherosclerosis. 1997. – V. 134. – № 1,2. – P. 182.
  21. Platelet count, morphology and aggregation in patients with familial hypercholesterolaemia / L. Bourjachkovskaya, Kh. Alidhanova, I. Uchitel, Z. Gabbasov, V. Kukharchuk. // Atherosclerosis. 1997. – V. 134 № 1,2. – P. 183.
  22. Семейная гиперхолистеринемия: фактор риска церебрального атеросклероза / Х.Г. Алиджанова, Л.И. Бурячковская, М.А. Творогова, В.В. Кухарчук. // Терапевтический архив. – 1997. – №10. – С. 26-32.
  23. Platelet morphology, aggregation and adhesion in patients with pheochromocytoma / L. Bourjachkovskaya, I. Uchitel, G. Potapova. // J Clin Invest. – 1997. – V. 27 №1. – P. 123-124.
  24. Myocardial isсhemia and platelet function  in patients with essential hypertension / Z. Gabbasov, Ye. Parfyonova, Ye. Djakonova, L. Bourjachkovskaya. // J Clin invest. – 1997. – V. 27 №1. – P. 122.
  25. Platelet morphology and functions in vasсular diseases / L. Bourjachkovskaya, I. Uchitel, G. Potapova, Z. Gabbasov, E. Popov, G. Arabidze. / J Amer College Cardiol, Suppl. – 1998. – C. 124C.
  26. Platelets and erythrocytes involvement in cobalt-induced thrombosis in mice / S. Dugin, L. Bouryachkovskaya, T. Orlova, I. Uchitel, Z. Gabbasov, T. Dugina. / Thromb Haemost. – 1999. – Suppl 1. – P. 778.
  27. Platelet activation in patients with hypertensive crisis / L. Bouryachkovskaya, I. Uchitel, G. Potapova, T. Polevaya, G. Arabidze, A. Sumarokov. // 9th European Meeting on Hypertension: Abstract/poster. – Milan., 1999. – P. S185.
  28. Особенности морфологии тромбоцитов у больных феохромацитомой / Л.И. Бурячковская, Г.Н. Потапова, И.А. Учитель, Г.Г. Арабидзе. // Кардиология. – 1999. – № 6. – C. 49-53.
  29. Platelet activity and thrombo-haemorrhagical complications in patients with hypertension / G. Potapova, L. Bourjachkovskaya, I. Uchitel. // J Hypertens. – 2000. – V. 18, Suppl 4. C. S59.
  30. Number and morphology of platelets incapable to aggregation and adhesion / L. Bourjachkovskaya, I. Uchitel, A. Ryazanov, G. Potapova. // Thromb Haemost. – 2001. – V. 86, Suppl.1. – P. 1052.
  31. Number and morphology of platelets incapable of aggregation / L. Bouriachkovskaia, I. Uchitel, G. Potapova. // Platelets. – 2002. – V. 13 №. 5/6. – P. 330-331.
  32. Mean platelet volume and the number of large platelet in atherosclerotic patients / L. Bouriachkovskaia, I. Uchitel, E. Rogova, A. Sumarokov, G. Tchernina. // Atherosclerosis. – 2002. – V. 163, Suppl. 3/2. - P. 78-79.
  33. Influence of high dose of catecholamines on appearance of elongated platelets in circulation / G. Potapova, L. Bouriachkovskaia, V. Sitina, I. Uchitel. // Molecular Biology of Cell. – 2002. – V. 13. P. 125a.
  34. Platelet activity and circulating leukocyte-platelet aggregates can be markers of thrombotic and inflammatory processes in patients with coronary atherosclerosis / L. Bouriachkovskaia, E. Rogova, I. Uchitel, A. Sumarokov, N. Dovlatova. // J Thrombosis Haemostasis. – 2003. – V. 1, suppl 1. – P. 1805.
  35. Leukocyte-platelet interaction: modulation by lipids different density and inhibition by high dose of catecholmines / N. Dovlatova, L. Bouriachkovskaia, I. Uchitel, V. Masenko. // J Thrombosis Haemostasis. – 2003. – V. 1, suppl 1. – P. 0193.
  36. Влияние активации тромбоцитов на образование лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов у больных ишемической болезнью сердца / И.А. Учитель, Л.И. Бурячковская, Н.Л. Довлатова, А.Б. Сумароков. // Первая Всероссийская научная Конференция “Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии”: Тезисы доклада. – М., 2003. – C. 161-162.
  37. Способность тромбоцитов к взаимодействию и необходимость дифференциального подхода к ее коррекции у больных с сердечно-сосудистыми патологиями / Л.И. Бурячковская, И.А. Учитель, А.Б. Сумароков, В.П. Масенко. // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов, Москва. – 2003. – приложение №2. – C. 27.
  38. Platelet activity and platelet-leukocyte conjugates in hypertensive patients with familian hypercholesterolaemia / L. Bouriachkovskaia., N. Dovlatova., Sumarokov A., Masenko V. // 13th European Meeting on Hypertension: Abstract/poster. – Milan, 2003. – P. S276.
  39. Relation of thrombo-haemorrhagical complications with platelets activity and action prazosin in patients with paroxysmal hypertension / G. Potapova, L. Bourjachkovskaya, V. Sitina, I. Uchitel. // 13th European Meeting on Hypertension: Abstract. – Milan., 2003. – P. S187.
  40. Гетерогенность тромбоцитов и ее роль в развитии тромботических осложнений при сердечно-сосудистых патологиях / Л.И. Бурячковская, И.А. Учитель, А.Б. Сумароков, Н.Л. Довлатова. // Симпозиум Дунайской лиги по борьбе с тромбозами и нарушениями гемостаза: Тезисы доклада. – С-Петербург, 2004. – C. 71.
  41. Leukocyte-platelet aggregates as a marker of inflammation / L. Bouriachkovskaia, I. Uchitel, N. Dovlatova, T. Pogorelova. // Platelets. – 2004. – V. 16 № 8. – P. 483-484.
  42. Морфо-функциональная гетерогенность тромбоцитов и ее значение для организма человека и животных / Л.И. Бурячковская, И.А. Учитель. // Научные труды съезда физиологов СНГ: Тезисы доклада. – Сочи, 2005. – Т. 1. – С. 93-94.
  43. Formation of small size platelet aggregates as a risk factor of thrombosis in hypertensive patients / L. Bouriachkovskaia, I. Uchitel, N. Dovlatova, T. Pogorelova, G. Potapova. // 15 Meeting ESH: Abstract/poster. – Milan, 2005. – P. S75.
  44. Circulating leukocyte-platelet aggregates and biochemical markers of inflammation in patients with coronary heart disease and depression / N.L. Dovlatova, L.I. Bouriachkovskaia, E.O. Poliakova, A.V. Zorin, I.A. Uchitel, A.B. Sumarokov, V.P. Masenko. // Eur J Cardiol: Abstract – 2006. – V. 27 (suppl). – P. 756.
  45. Platelet activation and biochemical markers of inflammation in patients with CHD and depression / L. Buriachkovskaia, E. Poliakova, A. Zorin, I. Uchitel, V. Masenko, A. Sumarokov, N. Dovlatova, T. Kuznetsova. // Atherosclerosis. – 2006. – V. 7 №3. – P. 283.
  46. Platelet activation and red blood cells abnormalities in coronary heart disease / T.E. Pogorelova, A.B. Sumarokov, L.I. Buriachkovskaia., I.A. Uchitel. // Atherosclerosis. – 2006. – V. 7 №3. – P. 394.
  47. Активация тромбоцитов и маркеры воспаления у больных ИБС c депрессивными расстройствами / Л.И. Бурячковская, Е.О. Полякова, А.В. Зорин, И.А. Учитель, Н.Л. Довлатова, В.П. Масенко, А.Б. Сумароков, Т.А. Кузнецова, Т.Л. Погорелова, Е.И. Чазов. // Тер архив. – 2006. – №10. – C. 9-14.
  48. Влияние депрессивных расстройств на развитие и исход сердечно-сосудистых заболеваний. Обзор / Л.И. Бурячковская, Е.О. Полякова, А.Б. Сумароков. // Тер архив. – 2006. – №11. – C. 82-87.
  49. Полифункциональность тромбоцитов, их активация и возможности ее оценки / Л.И. Бурячковская, И.А. Учитель, А.Б. Сумароков, Е.Г. Попов. // Сердечно-сосудистые заболевания. Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. – 2007. – Т. 8 № 2. С. 43-50.
  50. Modulation of platelet reactivity by erythrocytes in coronary arthery disease patients taking aspirin / T.E. Shirokova, L.I. Buriachkovskaia, I.A. Uchitel, A.B. Sumarokov, E.G. Popov. // J Thromb Haemost: Abstract. – 2007. – V. 5 Suppl. 2. – P. W-367.
  51. Circulating proplatelets in healthy subjects and patients / L.I. Buryachkovskaya, I.A. Uchitel, A.B. Sumarokov, E.G. Popov. // J Thromb Haemost: Abstract. – 2007. – V. 5 Suppl 2. – P. S-253.
  52. Влияние эритроцитов и лейкоцитов на чувствительность тромбоцитов к антиагрегантной терапии / Л.И. Бурячковская, И.А. Учитель, А.Б. Сумароков, Е.Г. Попов. // Научно-практический журнал Клинико-лабораторный Консилиум. – 2007. – №16. – С. 64.
  53. Функциональная активность тромбоцитов и их способность захватывать и интернализировать вирусы у больных ДКМП / Е.М. Гуппало, А.Б. Сумароков, И.А. Учитель, Л.И. Бурячковская. // Третья Всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии»: Тезисы доклада. – М., 2007. – С. 27.
  54. Клеточные и биохимические предпосылки применения Омега-3 ПНКЖ для профилактики и лечения ИБС / Л.И. Бурячковская, А.И. Каминный, В.В. Кухарчук, Н.А. Мазур, А.Б. Сумароков, И.А. Учитель, Т.Е. Широкова. // Российский медицинский журнал. – 2007. – Т. 15, №4. – С. 290-295.
  55. Участие гликопротеина IIB-IIIA в спонтанной агрегации тромбоцитов / О.В. Сироткина, А.М. Заботина, Е.Б. Тараскина, Л.И. Бурячковская, И.А. Учитель, С.Г. Хаспекова, Т.В. Вавилова, А.Л. Шварцман, А.В. Мазуров. // Бюлл Эксперим Биол и Мед. – 2007. – Т. 143, № 4. – С. 398-401.

СОКРАЩЕНИЯ

АДФ – аденозиндифосфорная кислота

АО – акридиновый оранжевый

ВМК – ванилилминдальная кислота

Д – тромбоциты дисковидной формы

ДВС – диссеминированное внутрисосудистое свертывание

2ДГ – 2-дезокси-Д-глюкоза

ИБС – ишемическая болезнь сердца

ИЛ – интерлейкин

мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота

ОТП – обогащенная тромбоцитами плазма

ПТ – протромбоциты

С1 – сферические тромбоциты размером 1-2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий, активированные формы

С2 – большие сферические тромбоциты размером 3-4 мкм с выраженными инвагинациями плазматической мембраны

СОТ – средний объем тромбоцитов

СЭМ – сканирующая электронная микроскопия

ТЭМ – трансмиссионная электронная микроскопия

ФНОа – фактор некроза опухоли

ФХЦ – феохромоцитома

ЭДТА – этилендиаминтетраацетат Na

COX – циклооксигеназа

Ig – иммуноглобулин

TGF- – трансформирующий фактор роста






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.