WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Учреждение Российской академии наук

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

Чудаков Дмитрий Михайлович

ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИВЫХ СИСТЕМ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Москва - 2011

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный консультант:

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, Лукьянов С.А.

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Деев С.М.

(Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН) Доктор химических наук, профессор Савицкий А.П.

(Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН) Доктор биологических наук, Васильев А.В.

(Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН)

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова.

Защита состоится "18" мая 2011 г. в 10.00 часов на заседании на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 совета при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан " " 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук В. А. ОЛЕЙНИКОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клонирование в 1992 году гена зеленого флуоресцентного белка из гидромедузы Aequorea victoria (avGFP) положило начало разработке целого арсенала инструментов и методов для изучения живых систем. Были получены различные спектральные варианты флуоресцентных белков, позволяющие проводить эксперименты многоцветного мечения и визуализировать белок-белковые взаимодействия с использованием эффекта FRET (Frster resonance energy transfer - ферстеровский перенос энергии), фотоактивируемые флуоресцентные белки, позволяющие проводить прицельное фотомечение и слежение за органеллами и клетками, генетически кодируемые сенсоры, позволяющие визуализировать активность ферментов и изменения в концентрации различных ионов, и другие инструменты.

Тем не менее, многие достижения носили скорее теоретический характер. Можно выделить две ключевые проблемы, стоявшие перед разработчиками новых генетически кодируемых флуоресцентных инструментов. Первая - расширение палитры спектральных вариантов флуоресцентных белков до крайних областей видимого спектра – синей (максимум эмиссии флуоресценции при 440-460 нм) и дальнекрасной (максимум эмиссии флуоресценции выше 630 нм). Особый интерес, как эффективный инструмент для визуализации объектов в модельных животных, представляли дальнекрасные флуоресцентные белки, длинноволновое излучение которых наиболее эффективно проникает через толщу живых тканей. Полученные до настоящей работы варианты дальнекрасных флуоресцентных белков характеризовались крайне низкой яркостью флуоресценции и низкой фотостабильностью, что делало эти белки практически непригодными для реального применения. По тем же причинам, не находили применения на практике известные синие флуоресцентные белки.

Вторая проблема состояла в том, что практически все открытые природные флуоресцентные белки (за исключением avGFP) имели олигомерную структуру и были непригодны для исследования локализации белков, отслеживания белок-белковых взаимодействий и других исследований, в которых требуется получение конструкций слияния с целевым белком. Полученные путем мутагенеза природных белков мономерные красные флуоресцентные варианты отличались низкой яркостью сигнала, и достаточно низким, по сравнению с природными мономерными зелеными флуоресцентными белками, качеством работы в составе белков слияния. Известные обратимо фотоактивируемые флуоресцентные белки характеризовались тетрамерной природой, что делало невозможным их применение для фотомечения исследуемых белков, в том числе для развивающихся технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения.

Оставался также ряд других значимых проблем, решение которых было актуально на момент начала выполнения данной работы. Так, время полу-созревания хромофора составляло для большинства полученных флуоресцентных белков многие десятки минут и даже часы, что затрудняло их применение в экспериментальных системах, требующих быстрого появления флуоресцентного сигнала. Полученные генетически кодируемые сенсоры на основе флуоресцентных белков отличались низким динамическим диапазоном изменений флуоресцентного сигнала при ответе на детектируемые ионы или исследуемую активность, что существенно осложняло получение достоверных результатов.

Настоящая работа была направлена на системное решение перечисленных выше проблем и создание панели эффективных молекулярных инструментов на основе флуоресцентных белков, способных вывести современные технологии микроскопии и in vivo имиджинга на качественно новый уровень.

Цель работы. Создание нового поколения генетически кодируемых флуоресцентных инструментов для флуоресцентной микроскопии и визуализации структур и процессов в живых тканях.

Задачи работы включали:

1. Получение полной палитры мономерных флуоресцентных белков, предназначенных для мечения целевых белков, характеризующихся высокой яркостью флуоресцентного сигнала, высокой скоростью созревания хромофора, высокой устойчивостью флуоресцентного сигнала к изменениям значения pH и фотообесцвечиванию.

2. Получение палитры ярких быстро созревающих флуоресцентных белков для мечения клеток и тканей. В том числе, получение ярких дальнекрасных флуоресцентных белков, предназначенных для эффективной визуализации объектов в модельных животных.

3. Получение генетически кодируемых сенсоров с высоким динамическим диапазоном флуоресцентного ответа (далее - «высококонтрастных» сенсоров).

4. Получение мономерных фотоактивируемых флуоресцентных белков и разработка технологий их применения.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе было получено новое поколение генетически кодируемых флуоресцентных маркеров и инструментов, существенно расширивших возможности для визуализации объектов и процессов при исследовании живых систем. Решение проблемы олигомеризации флуоресцентных белков позволило создать панель ярких мономерных флуоресцентных маркеров со спектрами флуоресценции, покрывающими всю область видимого спектра. Благодаря этому, стало возможным проводить многоцветное мечение целевых белков и органелл в живых клетках, существенно расширились возможности для отслеживания взаимодействия целевых белков и изменения внутриклеточных параметров с использованием эффекта FRET. Полученные мономерные фотоактивируемые флуоресцентные белки позволяют отслеживать перераспределение целевых белков в живых клетках, и применимы для технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, в том числе двухцветной.

Полученные яркие дальнекрасные флуоресцентные белки позволяют эффективно визуализировать клетки и ткани в теле интактных живых модельных организмов, а быстросозревающие флуоресцентные белки - регистрировать активность и исследовать динамику работы промотеров исследуемых генов. Получен ряд генетически кодируемых сенсоров, характеризующихся высоким динамическим диапазоном флуоресцентного ответа, позволяющих достоверно детектировать изменения, происходящие в живых клетках.

Принципы организации и флуоресцентные домены полученных сенсоров могут в дальнейшем служить основой для создания высококонтрастных сенсоров с различной специфичностью.

Большинство полученных в данной работе инструментов и технологий уже сегодня находят широкое применение в области молекулярной и клеточной биологии, биологии развития, канцерогенеза, иммунологии, нейробиологии и фармакологии; они активно используются в сотнях лабораторий по всему миру, как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях.

Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: «FEBS meeting on Advanced Light Microscopy» (Семмеринг, Австрия, 2005, приглашенный доклад), «The 32nd Lorne Conference on Protein Structure and Function» (Лорне, Австралия, 2007, приглашенный доклад), «3rd Annual FABLS Workshop» (Мельбурн, Австралия, 2007, приглашенный доклад), "Лазерная конфокальная микроскопия в биологии и медицине" (Звенигород, Россия, 2005, приглашенный доклад), Четвертая международная конференция "Нанобио- и другие новые и перспективные биотехнологии" (Пущино, Россия, 2007, приглашенный доклад), «Fluorescent Proteins and Biological Sensors. Janelia Farm Conference.» (Вашингтон, США, 2007, приглашенный доклад), «Международная конференция им. Гельмгольца» (Москва, Россия, 2008, приглашенный доклад), «Symposium on Watching Biomolecules in Action» (Осака, Япония, 2009, приглашенный доклад), XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2008), "Molecular Imaging" (Крит, Греция, 2005), съезд Биохимического и молекулярно-биологического общества Германии (Мюнстер, Германия, 2004), «ASDD Symposium» (Москва-Кижи-Валаам-Санкт-петербург, Россия, 2004), «BIOCATALYSIS–2005» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), «BIOCATALYSIS–2007» (Москва-Санкт-Петербург, Россия, 2007), Национальная конференция «Рентгеновское, Синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов» (Москва, Россия, 2009).

Публикации по теме работы. По материалам диссертации опубликовано 42 статьи в российских и международных рецензируемых журналах, а также 2 главы в книгах.

Личный вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором или под его руководством, при непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Автор также осуществлял выбор направлений и методов исследования, анализ полученных данных и подготовку материалов к публикации.

1. Мономерные флуоресцентные белки для мечения целевых белков В составе химерных конструкций, флуоресцентные белки широко применяются для мечения исследуемых белков в живых клетках. Такое мечение позволяет решать целый ряд задач, включая визуализацию синтеза, локализации, транслокации, взаимодействий и деградации белков в различных биологических системах в режиме реального времени.

Присоединение белковой метки, представляющей собой мономерный флуоресцентный белок, в большинстве случаев не нарушает, или почти не нарушает, естественной локализации и функций белка-мишени. Однако лишь немногие природные варианты флуоресцентных белков характеризуются мономерным состоянием при физиологических концентрациях. Следует считать огромной удачей для развития экспериментальной биологии, что первый клонированный флуоресцентный белок, avGFP, оказался естественным мономером. По этой причине, avGFP и его многочисленные производные варианты с флуоресценцией в голубой (циановой), зеленой, и желтой (максимумы эмиссии от 470 до 530 нм) областях спектра, такие как ECFP, Cerulean, EGFP, Emerald, EYFP, Citrine, Venus, и другие, сегодня широко применяются в составе белков слияния. В то же время, все известные природные красные флуоресцентные белки характеризуются димерной либо тетрамерной природой. Настоящая глава посвящена описанию получения и тестирования мономерных флуоресцентных белков. Для белка TagRFP и ветки его производных вариантов c эмиссией в красной и дальнекрасной областях спектра описание дается в хронологическом порядке (TagRFP-mKate-mKate2-FusionRed). Отдельно рассматриваются синий флуоресцентный белок TagBFP и белки, полученные на основе GFP из Aequorea macrodactyla, с эмиссией в средней части видимого спектра.

1.1. TagRFP: яркий красный мономерный флуоресцентный белок За основу для создания мономерного красного флуоресцентного белка нами был взят красный димерный (тетрамерный при высоких концентрациях) белок TurboRFP (раздел 2.2). С одной стороны, TurboRFP обладает предпочтительными характеристиками: высокой яркостью флуоресценции, высокой скоростью созревания хромофора, высокой устойчивостью к изменениям значения pH. С другой стороны, для высокогомологичного белка eqFP611 было ранее показано, что один из двух интерфейсов, отвечающих за тетрамеризацию, легко поддается дестабилизации без существенной потери спектральных характеристик и нарушения созревания хромофора. Эти данные давали основания надеяться, что мономеризация белка TurboRFP окажется менее трудоемкой, чем мономеризация белка DsRed, и завершится с меньшими потерями в яркости флуоресценции.

С использованием известной на тот момент структуры белка eqFP611 (PDB ID: 1UIS) были определены основные точки в составе так называемого гидрофильного интерфейса, отвечающего за димеризацию белка TurboRFP. По результатам анализа, для дестабилизации взаимодействий по этому интерфейсу методом сайт-направленного мутагенеза были внесены точечные замены R162E, Q166D, S180N, F198V, и F200Y. Для дестабилизации взаимодействий по другому, гидрофобному, интерфейсу TurboRFP, была введена замена N126R, предотвращающая, по данным для белка eqFP611, межсубъединичные взаимодействия через этот интерфейс. По данным гель-фильтрационной хроматографии низкого давления, результирующий мутантный вариант характеризовался мономерной природой. Таким образом, введения этих замен оказалось достаточно для дестабилизации олигомерных форм TurboRFP.

Несмотря на существенные изменения в структуре бета-бочонка, которые неизбежны при мономеризации, полученный мутантный вариант сохранил способность к формированию хромофора и проявлению флуоресцентных свойств. Тем не менее, как и ожидалось, мономеризация резко снизила скорость созревания и яркость флуоресценции. Для восстановления утраченных характеристик была использована комбинация методов случайного и сайт-направленного ПЦР-мутагенеза. В ходе проведения случайного мутагенеза, ключевые для сохранения мономерности аминокислотные позиции были закреплены с использованием специфических праймеров. После каждого раунда случайного мутагенеза проводился визуальный анализ индивидуальных бактериальных клонов с использованием флуоресцентного стереомикроскопа, с отбором быстро созревающих вариантов, характеризующихся максимально яркой красной флуоресценцией.

Примечание: Под термином «яркость», в зависимости от контекста, подразумевается одна из двух характеристик: расчетная яркость флуоресценции, получаемая как произведение квантового выхода флуоресценции и коэффициента молярной экстинкции при максимуме возбуждения флуоресценции, либо результирующая (детектируемая) яркость флуоресцентного сигнала в живой системе, которая зависит, помимо расчетной яркости флуоресцентного белка, от ряда других параметров, таких как эффективность транскрипции и трансляции гена флуоресцентного белка, стабильность мРНК, скорость и эффективность (процент) созревания хромофора в данных условиях, скорость деградации флуоресцентного белка в живых клетках.

Аминокислотные замены, приводящие к улучшению характеристик, но не способные, согласно анализу трехмерной структуры eqFP611, привести к восстановлению димеризации, объединяли методом направленного мутагенеза и использовали в качестве основы для последующих раундов случайного мутагенеза. В общей сложности, было проведено семь раундов случайного мутагенеза, результатом которых стал финальный отобранный вариант, получивший название TagRFP (от английского Tag - ярлык, бирка, и Red Fluorescent Protein - красный флуоресцентный белок).

Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции TagRFP приходятся на 555 нм и 5нм, соответственно (рис. 1a). Молярный коэффициент экстинкции белка TagRFP при 556 нм составляет 100 000 M-1см-1, а квантовый выход флуоресценции равен 0.48 (расчетная яркость в 2.2 раза превышает таковую красного мономерного белка mCherry, полученного коллективом Р. Тсиена). Спектр поглощения свежевыделенного белка TagRFP характеризуется единственным максимумом при 556 нм (рис. 1b), что говорит о быстром и полном созревании хромофора, без образования альтернативных либо промежуточных, медленно дозревающих форм.

ab c 11556 нм 555 нм 584 нм 350 400 450 500 550 600 6350 400 450 500 550 600 650 700 35 40 45 50 55 Длина волны, нм Объем элюции (мл) Длина волны, нм Рисунок 1. Характеристики белка TagRFP in vitro. a. Нормированные спектры возбуждения (прерывистая линия) и эмиссии (непрерывная линия) флуоресценции. b. Нормированный спектр поглощения. c. Результаты гель-фильтрации белков TurboGFP (димер, зелёная прерывистая линия), EGFP (мономер, зелёная непрерывная линия) и TagRFP (мономер, красная линия).

Флуоресцентный сигнал TagRFP отличается высокой pH-стабильностью: кажущееся значение pKa, определяемое как значение pH, при котором яркость флуоресцентного сигнала составляет половину от максимальной, составляет < 4 (Таблица 1). По данным гель-фильтрационной хроматографии низкого давления, TagRFP сохранил мономерную природу исходного варианта (рис. 1c).

Примечание: Здесь следует отметить, что позднее данные высокоэффективной жидкостной хроматографии, в ходе которой, в отличие от хроматографии низкого давления, не происходит существенного разбавления белка, показали, что при высоких концентрациях (> 1 мг/мл) белки ряда TagRFP существуют в виде равновесия димерной и мономерной форм. Тем не менее, как показано ниже, в реальных условиях в живых клетках эта слабая димеризация не нарушает работу белков ряда TagRFP в составе белков слияния.

Для практического применения, важной характеристикой флуоресцентных белков является фотостабильность флуоресценции. Сравнение скорости фотообесцвечивания белка TagRFP с другими красными флуоресцентными белками в клетках HeLa с использованием широкопольной микроскопии (постоянное облучение ртутной лампой, светофильтр 540-5нм) и конфокального сканирующего микроскопа (сканирующее облучение линией лазера 532 нм) показало, что время полуобесцвечивания (снижения интенсивности флуоресценции на 50%) TagRFP при конфокальной микроскопии сопоставимо с таковым для ряда широко используемых флуоресцентных белков: Cerulean, EYFP, mCherry, и mPlum (при возбуждении светом соответствующих длин волн той же интенсивности), и несколько уступает mCherry при широкопольной микроскопии.

Примечание: Существуют различные подходы к сравнению фотостабильности флуоресцентных белков. В условиях облучения различной мощности и длин волн, непрерывного или сканирующего облучения, в растворе и в живых клетках, и даже при различной локализации внутри клетки, одни и те же флуоресцентные белки могут характеризоваться различной относительной фотостабильностью. Мы применяли несколько разных подходов для сравнения фотостабильности и в контексте работы следует понимать этот термин как относительную фотостабильность сравниваемых флуоресцентных белков при облучении в выбранных условиях.

При экспрессии TagRFP в эукариотических клетках, появление надежно детектируемой красной флуоресценции наблюдалось в клетках Phoenix Eco (производные от HEK-293T) через 8 часов после трансфекции, а в клетках HeLa – через 12 часов. В клетках линии Phoenix Eco, как правило, наблюдается высокий уровень экспрессии генетических конструкций, содержащих ориджин репликации SV40 и промотер CMV. По этой причине (отн. ед.) Поглощение (отн. ед.) Поглощение при 280 нм Флуоресценция (отн. ед.) мы применяем их для проверки токсичности и поведения белков в условиях высоких концентраций в живых клетках. Существенно, что, в отличие от белка mCherry, TagRFP не формировал видимых агрегатов даже через 5 дней после трансфекции. Для проверки качества работы TagRFP в составе белков слияния, был получен ряд химерных конструкций TagRFP, включая -актин, -тубулин, -актинин, ламин-B1, -V-интегрин, коннексин-26, коннексин-32, коннексин-43, EB3, тирозинкиназу FAK, гистон H2B, цитокератин-18, профилин, винкулин, зиксин. При экспрессии химерных конструкций в клеточных линиях мы наблюдали яркий красный сигнал с локализациям, соответствующими ожидаемым по предыдущему опыту с проверенными мономерными флуоресцентными белками, такими как EGFP (рис. 2). Были также получены конструкции для мечения органелл, содержащие последовательность, кодирующую сигнал предшественника VIII субъединицы оксидазы цитохрома C человека, направляющий химерный белок в матрикс митохондрий, а также фрагмент 1,4-бета-галактозил трансферазы человека, направляющий белок в комплекс Гольджи. В обоих конструкциях TagRFP специфично локализовался в соответствующих компартментах клетки, и не формировал видимых агрегатов.

abcd Рисунок 2. Локализация белка TagRFP и белков слияния с TagRFP в живых клетках HeLa. a.

TagRFP. b. TagRFP-зиксин. c. TagRFP-цитокератин-18. d. TagRFP-бета-актин.

Ещё одной важной характеристикой флуорофора является время жизни флуоресценции, пропорциональное квантовому выходу флуоресценции, и в значительной степени определяющее его эффективность в качестве донора энергии при эффекте FRET. Мы сравнили время жизни флуоресценции для белков mCherry и TagRFP в клетках линии HeLa (совместно с проф. T.W.J. Gadella, Голландия). Флуоресцентный сигнал клеток, экспрессирующих TagRFP, характеризовался временем жизни флуоресценции около 2.3 нс, в то время как сигнал клеток, экспрессирующих mCherry, характеризовался временем жизни флуоресценции 1.4 нс, что соответствует более высокому квантовому выходу флуоресценции TagRFP. Выраженная разница во времени жизни флуоресценции позволила нам осуществить двухцветное мечение с использованием двух красных флуоресцентных белков, различаемых по времени жизни флуоресценции. Высокое время жизни флуоресценции делает белок TagRFP перспективным FRET-донором для дальне-красных акцепторов, таких как mNeptune. С другой стороны, высокий коэффициент молярной экстинкции TagRFP позволяет использовать его в качестве эффективного акцептора FRET для флуоресцентных белков с более коротковолновой эмиссией. В частности, с использованием FRET-пары TagGFP-TagRFP нами был создан высококонтрастный внутриклеточный биосенсор для детекции активности каспазы-3 – ключевого фермента апоптотического каскада (раздел 4.2.). Полученные данные показывают, что TagRFP может успешно применяться для мечения исследуемых белков, органелл и клеток, многоцветного мечения, а также для создания генетически кодируемых FRET-сенсоров. Несмотря на то, что область разработки флуоресцентных белков развивается быстрыми темпами, опубликованный в 2007 году (Merzlyak EM et al., Nature Methods 2007) белок TagRFP до сегодняшнего дня остается самым ярким из когда-либо полученных мономерных красных флуоресцентных белков.

1.2. mKate и mKate2: мономерные дальнекрасные флуоресцентные белки; tdKatushkaПолучение белка mKate. Ввиду хороших спектральных характеристик и мономерной природы, TagRFP был выбран нами как основа для получения мономерного дальнекрасного флуоресцентного белка. К этому времени мы получили димерный белок Катюша (Katushka), характеризующийся дальнекрасной флуоресценцией высокой яркости (Раздел 2.4.). И TagRFP, и Katushka берут начало от одного белка дикого типа, eqFP578, и сохраняют высокую гомологию. По этой причине мы надеялись, что точечные аминокислотные замены в окружении хромофора, позаимствованные у белка Katushka, могут привести к воспроизведению его спектральных характеристик без возникновения существенных пространственных конфликтов с другими аминокислотными остатками в окружении хромофора, которые неминуемо привели бы к нарушению его созревания и/или потере флуоресцентных свойств. Методом сайт-направленного мутагенеза мы внесли ряд комбинаций замен аминокислотных остатков в микроокружение хромофора TagRFP. Среди нескольких опробованных вариантов направленного мутагенеза, сочетание позаимствованных у белка Katushka замен R69K, N148S, F181L и H203R привело к желаемому батохромному сдвигу эмиссии флуоресценции TagRFP, при сохранении приемлемой яркости и скорости созревания.

Полученный белок был назван mKate (мономерная Катюша - от monomeric и Katushka).

Спектральные характеристики белка mKate приведены в Таблице 1. По данным флуорометрии, белки Katushka и mKate обладают практически идентичными спектрами возбуждения и эмиссии флуоресценции. Максимум возбуждения флуоресценции mKate приходится на 588 нм, максимум эмиссии флуоресценции – на 635 нм. Спектр поглощения mKate характеризуется единственным пиком, максимум которого совпадает с максимумом возбуждения флуоресценции, что говорит об отсутствии альтернативных либо промежуточных форм созревания хромофора в зрелом белке. По pH-стабильности флуоресценция mKate заметно уступает TagRFP (Таблица 1). При pH 7.5 квантовый выход флуоресценции mKate составляет 0.28, молярный коэффициент экстинкции при 588 нм составляет 31 500 M-1 см-1. По данным гель-фильтрации низкого давления, белок mKate сохранил мономерные свойства TagRFP, что позволяет использовать его для мечения белковых молекул.

Для проверки эффективности белка mKate в качестве флуоресцентной метки в химерных конструкциях с другими белками мы использовали модель визуализации -актина и тубулина. В клетках линий HeLa и 3Т3, трансфицированных полученными рекомбинантными плазмидами, наблюдалось специфичное мечение актиновых филаментов и микротрубочек, соответственно, без присутствия видимых агрегатов флуоресцентной метки или её неспецифической локализации. Для тестирования белка mKate на цитотоксичность мы сравнили его поведение при временной трансфекции клеток линий HeLa и Phoenix Eco с белками DsRed2, DsRed-Express, mCherry и mRaspberry. Через 5-дней после трансфекции белки DsRed2 и DsRed-Express в значительной степени локализовались в комплексе Гольджи, а белки mCherry и mRaspberry формировали точечные агрегаты. Следует отметить, что формирование белковых агрегатов может быть токсичным для клеток и затрудняет использование агрегирующих белков для получения стабильно экспрессирующих клеточных линий и трансгенных животных. В то же время в клетках, экспрессирующих mKate, не наблюдалось видимой агрегации или неспецифичной локализации. При этом достаточно яркий флуоресцентный сигнал появлялся через 12-часов после трансфекции, что свидетельствует о достаточно быстром созревании хромофора mKate в клетках млекопитающих. Белок mKate характеризуется относительно высокой фотостабильностью. На момент публикации (Shcherbo D и др., Nature Methods.

2007), белок mKate являлся самым ярким мономерным флуоресцентным белком с пиком эмиссии флуоресценции более 630 нм, оптимальным для многоцветного мечения и технологий FRET. Однако расчетная и детектируемая яркость флуоресценции mKate всё же существенно уступали яркости исходного белка TagRFP.

Получение белка mKate2. Дальнейший прогресс в разработке дальнекрасных мономерных флуоресцентных белков потребовал структурных данных, которые помогли бы лучше сориентироваться в особенностях окружения хромофора и его конформации в белке mKate.

Мы надеялись, что трехмерная структура белка mKate поможет объяснить сложную кинетику процесса фотообесцвечивания белка mKate, включающую фазу усиления флуоресцентного сигнала (рис. 3c), относительно низкую pH-стабильность флуоресценции этого белка, и относительно низкую яркость его флуоресценции. В сотрудничестве с Лабораторией рентгеноструктурного анализа ИБХ РАН был проведён анализ кристаллов mKate, полученных при трёх значениях pH: 2.0, 4.2 и 7.0.Было установлено, что в mKate наблюдается pH-зависимая цис-транс изомеризация хромофорной группы. Так, при pH 2.0, 90% хромофорных групп белка mKate находятся в транс положении. Наиболее яркая флуоресценция наблюдается при значении pH 7.0, при котором лишь 10% молекул белка содержат транс-изомер хромофора. При pH 4.2 соотношение транс- и цис- форм составляет около 70% к 30%. Мы предположили, что незначительная фотоактивация при облучении в зелёной, желтой и оранжевой области (при длинах волн от 540 до 580 нм) может объясняться фотоиндуцируемой транс-цис изомеризацией хромофора. В таком случае, точечный мутагенез в микроокружении хромофора, направленный на стабилизацию хромофорной группы во флуоресцентном цис- положении, либо на дестабилизацию трансформы, должен был повысить яркость и pH-стабильность флуоресценции белка mKate.

Исходя из данных рентгеноструктурного анализа можно было заключить, что остаток серина в положении 165 стабилизирует транс- конформацию хромофора, аналогично тому, как это происходит в белке eqFP611 и известных GFP-подобных хромобелках, в то время как остаток серина в положении 148 стабилизирует цис- конформацию, по аналогии с большинством красных флуоресцентных белков, включая DsRed.

Информация о трехмерной структуре белка mKate оказалась чрезвычайно полезной для дальнейшей работы. С целью дестабилизации транс-изомера хромофора mKate и смещения равновесия в пользу флуоресцентной цис-формы, с использованием направленного мутагенеза мы получили библиотеку вариантов mKate, содержащую варианты с кодонами всех двадцати возможных аминокислот в положении 165. Библиотека была проэкспрессирована в бактериях E. coli, и среди 20 вариантов был отобран один, характеризующийся повышенной яркостью флуоресценции и pH-стабильностью, и сохранивший положение пика эмиссии исходного белка mKate. Этот вариант содержал аминокислотную замену S165A, что согласуется с выдвинутым выше предположением.

Действительно, в отличие от гидрофильного полярного остатка серина, гидрофобный неполярный остаток аланина не способен принимать участие в сети водородных связей, стабилизирующих хромофорную группу mKate в транс-конформации. Соответственно, изменение соотношения изомеров в пользу флуоресцентной цис-формы должно приводить к увеличению яркости как при кислых, так и при физиологических значениях pH. Для ускорения созревания хромофора полученного варианта mKate-S165A мы провели два раунда случайного ПЦР-мутагенеза, с отбором наиболее ярких и быстро созревающих вариантов белка, не содержащих потенциально димеризующих замен, не характеризующихся наличием промежуточных или альтернативных форм созревания хромофора согласно спектрам поглощения и флуоресценции, и не характеризующихся гипсохромным сдвигом эмиссии флуоресценции по сравнению с белком mKate-S165A.

Вариант, наиболее соответствовавший искомым характеристикам, содержал дополнительные аминокислотные замены V48A и K238R и получил название mKate2. Эти замены значительно ускоряют созревание хромофора белка при 37°C. Интересно, что аргинин в положении 238 содержится также в белке дикого типа eqFP578, и таким образом в данном случае случайный мутагенез привел к обратной мутации. Согласно данным гель фильтрации, эта внешняя относительно структуры бета-бочонка замена не повлияла на мономерные свойства mKate2.

Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции mKate2 близки к белку mKate и приходятся на 588 и 633 нм, соответственно. Однако, по сравнению с mKate, коэффициент молярной экстинкции при 588 нм при pH 7.5 был увеличен практически в 2 раза и составил 62 500 М-1см-1, а квантовый выход флуоресценции был увеличен в 1.4 раза и составил 0.4. В результате, яркость флуоресценции mKate2, рассчитанная как произведение коэффициента молярной экстинкции и квантового выхода, составляет 74% от яркости EGFP, и в 10 раз превышает яркость известного на тот момент дальнекрасного мономерного белка mPlum.

Время полусозревания mKate2 составляет менее 20 мин, что делает его самым быстро созревающим мономерным красным флуоресцентным белком (для сравнения, время полусозревания составляет 40 мин для mCherry, 75 мин для mKate и 100 мин для TagRFP).

На спектре поглощения mKate2 выделяется единственный пик, соответствующий красной форме хромофора, и совпадающий по форме со спектром возбуждения флуоресценции (рис.

3a). По сравнению с белком mKate, флуоресценция mKate2 характеризуется значительно более высокой устойчивостью к изменению значения pH (кажущееся значение pKa = 5.против 6.2 у mKate) (рис. 3b, Таблица 1).

tdKatushkaa b c mKate mKate 1.0 1.0 10 mCherry mRaspberry mPlum 0.5 50.0.0 0.300 400 500 600 700 83 4 5 6 7 8 9 10 0 1000 2000 3000 4000 50Длина волны, нм pH Время, с Рисунок 3. Характеристики белка mKate2 in vitro. a. Нормированные спектры поглощения (чёрная линия), возбуждения (прерывистая красная линия), и эмиссии флуоресценции (непрерывная красная линия) белка mKate2. b. Зависимость флуоресцентного сигнала белков mKate (чёрная линия) и mKate2 (красная линия) от значения pH. Пунктирными линиями показано физиологическое значение pH 7.5 и значение относительной яркости флуоресцентного сигнала, составляющее половину от максимальной для данного белка. c. Фотообесцвечивание флуоресценции различных красных и дальнекрасных флуоресцентных белков в сканирующем конфокальном микроскопе.

Для сравнения фотостабильности флуоресценции белка mKate2 с наиболее известными аналогами: белками mKate, mCherry, mRaspberry и mPlum, использовались химерные конструкции флуоресцентных белков с гистоном H2B, экспрессированные в клетках HeLa.

Такой подход позволяет сравнивать фотостабильность непосредственно в живых клетках, причем ядерная локализация химерной конструкции с гистоном H2B позволяет лучше стандартизировать эксперимент. Определялась фотостабильность как при облучении сканирующим лазером конфокального микроскопа, так и с использованием постоянного облучения ртутной лампой широкопольного флуоресцентного микроскопа. В обоих случаях, белок mKate2 характеризовался более высокой устойчивостью к обесцвечиванию, чем белки mKate, mRaspberry и mPlum, и не уступал белку mCherry. Кроме того, в ходе обесцвечивания mKate2 мы не наблюдали стадии фотоактивации, характерной для белка mKate (рис. 3с). Это наблюдение в целом согласуется с предположением о том, что незначительная фотоактивация флуоресценции белка mKate связана с транс-цис фотоизомеризацией хромофора, в то время как хромофор белка mKate2 исходно стабилизирован во флуоресцентной цис-конформации.

Фотоны на молекулу Флуоресценция, отн.ед.

Флуоресценция, отн.ед.

Тандемный белок tdKatushka2. Возможный альтернативный путь получения так называемых «псевдомономерных» флуоресцентных белков, не способных к формированию межмолекулярных димеров и применимых для мечения в составе белков слияния, это получение «тандемных» вариантов димерных белков, в которых две копии белка кодируются одной рамкой считывания. Существенное увеличение яркости и фотостабильности белка mKate в результате внесения замены S165A указывало на потенциальную возможность улучшить характеристики гомологичного белка Katushka, также содержащего серин в положении 165. Действительно, введение с помощью сайтнаправленного мутагенеза замены S165A увеличило яркость флуоресценции белка Katushka на 20%. Для того чтобы получить вариант, пригодный для мечения белковых молекул, мы создали тандемный конструкт, состоящий из двух субъединиц димерного белка Katushka-S165A, соединённых гибким глицин-богатым линкером. Полученная «псевдомономерная» метка была названа tdKatushka2 (тандем-Katushka2). Коэффициент молярной экстинкции tdKatushka2 равен 2 x 66 000 М-1см-1, а квантовый выход 0.37, и таким образом расчетная яркость на тандемную молекулу tdKatushka2 превышает таковую белка EGFP в 1.46 раза. Флуоресценция белка tdKatushka2 характеризуется высокой pHстабильностью (кажущееся значение pKa = 5.4) и фотостабильностью (рис. 3с).

Применение mKate2 и tdKatushka2 в качестве белков слияния. При временной трансфекции клеток линий HeLa и Phoenix Eco белки mKate2 и tdKatushkaхарактеризовались равномерным распределением флуоресцентного сигнала по клетке без формирования видимых агрегатов или неспецифичной локализации через 4 дня после трансфекции. Эти данные говорят в пользу низкой токсичности полученных белков и о принципиальной возможности их использования в стабильно трансфицированных клеточных линиях. Было получено более 20 белков слияния, содержащих кодирующие последовательности mKate2 и tdKatushka2 и различных клеточных белков и сигналов внутриклеточной локализации. Для большинства слитных белков наблюдалась правильная локализация и функциональность (рис. 4). В частности, слитный белок mKate2-аннексин-IV при воздействии иономицина на клетку транслоцировался, как и ожидалось, из цитоплазмы на ядерную и клеточную мембраны (рис. 4а).

abcd Рисунок 4. Локализация белков слияния с mKate2 в живых клетках HeLa. a. mKate2-аннексин-А4, после индукции иономицином. b. mKate2-клатрин, лёгкая цепь. c. mKate2-VASP. d. mKate2-EB(белок семейства RP/EB, ассоциированный с микротрубочками). Масштабная линейка, 10 мкм.

Применимость mKate2 в трансгенных организмах. Дальнекрасная флуоресценция высокой яркости в сочетании с мономерной природой делает белок mKate2 перспективным маркером для мечения белков слияния в живых тканях. Для проверки возможности использования белка mKate2 для визуализации объектов в многоклеточных организмах, мы поместили кодирующую последовательность mKate2 под контроль фрагмента промотора Xanf1 шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Полученные рекомбинантные плазмиды экспрессировались в трансгенных X. laevis (совместно с Лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН). Мы наблюдали яркий флуоресцентный сигнал в передней части головы, включая глаза и назальные плакоды (рис. 5). Для сравнения яркости и скорости созревания mKate и mKate2 мы провели микроинъекции конструкций mKate и mKate2 в эмбрионы X. laevis на стадии двух бластомеров. В этих экспериментах, яркость флуоресцентного сигнала mKate2 оказалась значительно выше. В качестве модели мечения белковых молекул в целом организме мы использовали X. laevis, экспрессирующие химерный белок mKate-2-зиксин. Несмотря на высокий уровень экспрессии, обеспечиваемый промотором CMV, мы не наблюдали проявлений токсичности слитного белка: головастики выглядели здоровыми и выживаемость была сопоставима с контрольными головастиками, экспрессирующими белок EGFP. Эти результаты свидетельствуют о низкой токсичности mKate2 и его применимости для мечения белков, клеток и тканей в трансгенных организмах.

Белый свет Флуоресценция Наложение Рисунок 5. Экспрессия mKate2 под контролем промотера Xanf1 в трансгенных эмбрионах X. laevis на стадии 28. Наблюдается специфическая локализация в передней части головы, включая глаза и назальные плакоды.

1.3. Красный «супермономерный» флуоресцентный белок.

К 2009 году нами и другими коллективами был получен ряд мономерных красных и дальнекрасных флуоресцентных белков, что открыло широкие возможности для многоцветного мечения белков, приложений FRET, и других методов в современной микроскопии, основанных на использовании генетически кодируемых флуоресцентных маркеров в качестве белков слияния. Тем не менее, несмотря на очевидный успех, достигнутый в данном направлении за последние 5 лет, опыт многих лабораторий говорит о том, что доступные красные мономеры, такие как mCherry или TagRFP, все еще уступают естественным зеленым мономерным белкам в качестве маркеров в составе белков слияния.

В ряде «требовательных» конструкций, известные красные мономеры могут нарушать локализацию исследуемых белков если не во всех, то в значимой части транзиентно трансфицированных клеток, особенно при высоких уровнях экспрессии, что нарушает воспроизводимость экспериментов и в целом затрудняет количественную работу. В некоторых случаях, получение стабильно трансфицированных линий с такими белками слияния также может быть затруднено. Вероятным объяснением этих проблем являются остаточная слабая димеризация, а также неспецифические взаимодействия искусственно «обнаженных» интерфейсов мономеризованных красных белков.

Мы поставили себе задачу окончательно решить эту проблему и разработать мономерный красный флуорсцентный белок, качество работы которого в составе химерных белков слияния не уступало бы лучшим зеленым флуоресцентным белкам. Как описано выше, при продолжительном культивировании клеток, экспрессирующих белок mCherry, наблюдается появление видимых флуоресцирующих агрегатов последнего. Мы предположили, что это явление указывает на способность mCherry и гомологичных белков ряда mFruits к агрегации и, возможно, к неспецифическим взаимодействиям в живых клетках. Полученные нами белки TagRFP и mKate2 не формировали агрегатов при 1.0.8 длительной экспрессии. Однако эти белки mKate0.демонстрировали остаточную слабую димеризацию, не 0.детектируемую методом гель фильтрации низкого 0.давления (рис. 1с), но детектируется методом 1.высокоэффективной жидкостной хроматографии, в ходе 0.mKate2.0.6 которой не происходит заметного разбавления белка 0.(рис. 6). Мы предположили, что получение 0.«супермономерного» варианта на основе TagRFP или 1.mKate2 позволит создать белок, для которого не будут 0.характерны ни проблемы белков ряда mFruits, ни FusionRed 0.0.4 проблемы слабой димеризации. Для определения 0.ключевых позиций, которые отвечают за слабую димеризацию белков ряда TagRFP-mKate-mKate2, мы 82 63 49 38 30 23 18 14 11 8 вновь обратились к данным рентгеноструктурного Молекулярный вес, кДа анализа белка mKate. Так как в ходе кристаллизации Рисунок 6. Высокоэффективная концентрация белка поднимается до очень высоких жидкостная хроматография значений, даже слабо димеризующийся белок белков mKate2, mKate2.1 и формирует строгие димеры в составе кристалла.

FusionRed при нанесении в Данные о структуре белка mKate указывали на участие концентрации 10 мг/мл.

в димеризации аминоксилотных остатков в позициях 164, 182 и 200, а также, что интересно, гидрофобного С-концевого участка белка, непосредственно взаимодействующего с бета-бочонком «партнера» по димеризации.

Основываясь на этих данных, мы продолжили работу по мономеризации белка mKate2, в ходе которой гидрофобный С-концевой участок был заменен на гибкий глицин-богатый линкер, и проведен ряд мономеризующих замен: R164A, K182E, Y200N. Полученный вариант, mKate2.1, отвечал основному требованию: демонстрировал строго мономерное поведение при высокоэффективной жидкостной хроматографии при нанесении в концентрациях до 10 мг/мл (рис. 6). Однако были катастрофически утеряны скорость и полнота созревания, относительная яркость флуоресцентного сигнала, а также его устойчивость к изменениям значения pH.

Работа по восстановлению спектральных характеристик полученного «супермономерного» варианта велась согласно следующему алгоритму: Библиотеки мутантных вариантов, полученные методом случайного ПЦР мутагенеза, экспрессировали в E. coli и с использованием флуоресцентного стереомикроскопа проводили визуальный отбор из >100,000 колоний, характеризующихся наиболее яркой красной флуоресценцией. После секвенирования последовательностей отобранных 30-50 вариантов, выбирались только те из них (как правило, 2-3 варианта), которые не несли потенциально димеризующих мутаций, согласно анализу трехмерной структуры белка mKate. Отобранные варианты содержали желаемые аминокислотные замены, способные привести к ускорению созревания хромофора и/или к улучшению спектральных характеристик (увеличению квантового выхода флуоресценции и/или коэффициента молярной экстинкции). Эти замены объединяли в различных комбинациях с использованием метода вырожденного сайтнаправленного мутагенеза, и полученный набор вариантов подвергали следующему раунду случайного мутагенеза. Такой цикл повторяли в общей сложности 7 раз. На некоторых этапах перед отбором клонов проводили облучение колоний E. coli, экспрессирующих мутантные варианты белка, мощными источниками зеленого (530-560 нм) либо белого света, с целью отбора наиболее фотостабильных вариантов. Кроме того, метод вырожденного сайт-направленного мутагенеза применяли для оптимизации непосредственного окружения хромофора. Также сайт-направленным мутагенезом были Нормированное поглощение внесены замены K69R и R203H, позаимствованные от белка TagRFP, характеризующегося высокой pH-стабильностью.

В конечном итоге, нам удалось восстановить высокую pH-стабильность и яркость флуоресцентного сигнала, при сохранении «супермономерной» природы белка.

Полученный белок, предназначенный для мечения белков слияния, был назван FusionRed (от fusion – белок слияния). FusionRed характеризуется пиками возбуждения и эмиссии флуоресценции при 580/608 нм, отсутствием промежуточных или альтернативных форм созревания хромофора согласно спектру поглощения, высокой фотостабильностью как в конфокальной, так в широкопольной микроскопии, высокой устойчивостью к изменениям значения pH (кажущееся значение pKa = 4.2). Квантовый выход флуоресценции белка FusionRed составляет 0.19, коэффициент молярной экстинкции при 580 нм - 125 000 М-1см-1, что делает его потенциально эффективным акцептором энергии для FRET. Было получено и протестировано при экспрессии в клетках млекопитающих более 40 белков слияния FusionRed. В подавляющем большинстве случаев, качество работы FusionRed не уступало лучшим мономерным зеленым флуоресцентным белкам, и в ряде случаях превосходило качество работы белков ряда mFruits и ряда TagRFP (рис. 7).

abcd Рисунок 7. Локализация белков слияния с FusionRed в клетках HeLa. a. FusionRed-кератин. b.

FusionRed-коннексин-26. c. FusionRed-lifeact (пептид, связывающий филаменты актина). d.

FusionRed-кавеолин. Масштабная линейка, 10 мкм.

1.4. TagBFP: мономерный синий флуоресцентный белок на основе TagRFP.

Первые варианты синих флуоресцентных белков (blue fluorescent protein, BFP) характеризовались крайне низкой расчетной яркостью и фотостабильностью. Полученные не так давно улучшенные варианты, Azurite и EBFP2, характеризуются более высоким квантовым выходом флуоресценции и несколько более высокой фотостабильностью, но все ещё заметно уступают по расчетной яркости известным зеленым флуоресцентным белкам, в первую очередь за счет низкого коэффициента молярной экстинкции. Следует отметить, что все первые варианты синих флуоресцентных белков содержали замену Y66H в составе хромофора. Предыдущие попытки получить синий флуоресцентный белок, содержащий Tyr66 в протонированном состоянии на основе зеленых флуоресцентных белков с замедленным эффектом переноса протона (excited-state proton transfer, ESPT) не привели к созданию яркого флуоресцентного варианта.

Ранее нами было показано, что хромофоры красных флуоресцентных белков DsRed-типа формируются через промежуточную синюю флуоресцентную форму, предположительно представляющую собой протонированный GFP-подобный хромофор. Эта промежуточная форма детектировалась в процессе созревания ряда красных тетрамерных флуоресцентных белков, в том числе DsRed, hsriCP и asulCP, и, скорее всего, характерна для созревания большинства красных флуоресцентных белков. Мы предположили, что методом сайтнаправленного мутагенеза аминокислотных остатков в окружении хромофора красного флуоресцентного белка возможно заблокировать хромофор в промежуточной синей флуоресцентной форме, получив таким образом новый Tyr66-содержащий синий флуоресцентный белок. В качестве исходного варианта красного флуоресцентного белка был выбран TagRFP, сочетающий высокую яркость флуоресценции и мономерную природу.

Выбор позиций для сайт-направленного мутагенеза проводился на основе известной на тот момент структуры гомологичного белка eqFP611 (PDB ID: 1UIS). Нашей целью было заблокировать созревание хромофора на стадии промежуточной GFP-подобной формы и стабилизировать его в протонированном состоянии. Во всех известных красных флуоресцентных белках, входящую в состав хромофора позицию 65 занимает Met, Gln либо Glu. Мы предположили, что формирование специфичной для красного хромофора ацилиминной группы будет менее вероятно в случае замены положения 65 на алифатическую либо ароматическую аминокислоту, за счет меньшей поляризации связи 65C-H. Другие позиции аминокислотных остатков в окружении хромофора: 148, 165, 181 и 203 были выбраны с целью его стабилизации в протонированной форме.

В первом раунде, мы провели сайт-направленный вырожденный (с одновременной заменой на ряд возможных вариантов) мутагенез белка TagRFP по позициям Met65, Asn148, Ser165, Phe181 и His203. На этом этапе нам удалось получить несколько синих флуоресцентных вариантов, содержащих замены ряда: M65L,H,F/N148F,I,W/S165N,I,A,T/F181I,A,V/H203Y,F.

Дальнейшая оптимизация велась с использованием метода проточной цитометрии клеток бактерий, экспрессирующих полученную библиотеку (проводилась в медицинском колледже Альберта Эйнштейна, США). После 5 последовательных раундов оптимизации методом случайного мутагенеза был получен вариант, названный TagBFP, содержащий дополнительных аминокислотных замен: R69K/C179A (внутренняя), и N23D/P131T/M151T/G175S/D213N/K214N (внешние по отношению к бета-бочонку белка).

Полученный белок TagBFP характеризуется единственным пиком возбуждения флуоресценции при 402 нм, с максимумом эмиссии 457 нм. По сравнению с лучшим из разработанных ранее синим флуоресцентным белком EBFP2, TagBFP характеризуется более высоким коэффициентом молярной экстинкции (в 1.6 раза) и более высоким квантовым выходом. Расчетная яркость TagBFP выше таковой EBFP2 в 1.8 раза, что сопоставимо с яркостью широко используемых зеленых флуоресцентных белков. Время полу-созревания хромофора TagBFP при 370C составляет 13 минут, что вдвое короче времени полусозревания EBFP2. Флуоресценция TagBFP характеризуется исключительно высокой устойчивостью к изменениям значения pH (кажущееся значение pKa < 3.0).

Фотостабильность TagBFP сравнивали с наиболее фотостабильными синими флуоресцентными белками - Azurite и EBFP2, в двух системах: в каплях воды в масляной эмульсии, содержащих очищенный белок, с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа (100 Вт ртутная лампа, светофильтр DAPI 350/50), и в клетках HeLa, с использованием конфокального микроскопа (лазер 405 нм). В первой системе, время полу-обесцвечивания TagBFP было сопоставимо с таковым для белка Azurite и немного уступало времени EBFP2. Время полу-обесцвечивания TagBFP при облучении лазером 405 нм в сканирующем конфокальном микроскопе превышало таковое для белков EBFP2 и Azurite в 2.1 и 3.3 раза, соответственно. Согласно данным гель фильтрации низкого давления, TagBFP является мономером при нанесении в концентрации 10 мг/мл, и хорошо показал себя в работе в составе таких белков слияния как бета-актин и альфа-тубулин.

1.5. Мономерные белки средней части видимого спектра: TagCFP, TagGFP, TagYFP.

К началу нашей работы уже был разработан целый ряд вариантов флуоресцентных белков, характеризующихся эмиссией в циановой (470-480 нм), зеленой (500-510 нм) и желтой (520530 нм) областях видимого спектра. Тем не менее, некоторые их характеристики, такие как скорость созревания хромофора, устойчивость к изменениям значения pH и устойчивость к фотообесцвечиванию, нуждались в дополнительной оптимизации. Для разработки улучшенных вариантов мы взяли за основу мономерный зеленый флуоресцентный белок Aequorea macrodactyla, близкий к avGFP. Ключевые «классические» замены, приводящие к сдвигу пиков флуоресценции в коротковолновую (Y66W), и длинноволновую (T203Y) области, были внесены методом сайт-направленного мутагенеза.

Рисунок 8. Многоцветное мечение в транзиентно трансфицированных клетках HeLa. a. TagBFP-mito.

b. TagCFP--актин. с. TagYFP--тубулин. d. TagRFP-гольджи. e. mKate-H2B. f. Наложение.

В дальнейшем мы применили сочетание методов случайного и вырожденного сайтнаправленного мутагенеза для оптимизации указанных выше характеристик. Отбор вариантов проводили визуально, с использованием флуоресцентного стереомикроскопа, с проведением предварительного фотообесцвечивания с целью селекции наиболее фотостабильных вариантов. В результате этой работы были получены циановый, зеленый и желтый мономерные флуоресцентные белки, названные TagCFP, TagGFP и TagYFP, соответственно. Время полу-созревания хромофора при 370C для всех трех белков не превышает 30 мин. Флуоресценция белка TagYFP отличаются повышенной устойчивостью к изменениям pH в сравнении с аналогичными спектральными вариантами, что предположительно обусловлено входящим в состав хромофора аминокислотным остатком Thr65, занимаемого глицином во всех прочих мономерных вариантах желтых флуоресцентных белков. Все три результирующих белка характеризуются строго мономерной природой и хорошо показали себя при работе в составе белков слияния в живых клетках.

В общей сложности, в этой части работы нами было получено 8 основных вариантов мономерных флуоресцентных белков, сочетание которых позволяет проводить эффективное многоцветное мечение в живых клетках (рис. 8). Основные характеристики полученных мономерных белков приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Сравнение полученных в работе мономерных флуоресцентных белков с лучшими аналогами, в том числе полученными позднее. Жирным шрифтом выделены флуоресцентные белки, полученные в настоящей работе.

расч.

макс. макс. EC, каж. относительные белок QY яркость, возб., нм эм., нм M-1 cm-1 знач. pKa характеристики от EGFP Azurite 383 447 26 000 0.55 0.43 5.0 pH+, Ps+, mat+ EBFP2 383 448 32 000 0.56 0.54 4.5 pH+, Ps+, mat+ TagBFP 402 457 52 000 0.63 0.99 2.7 B+, pH++, Ps+, mat+ ECFP 434 477 32 500 0.40 0.39 4.7 pH+ Cerulean 433 475 36 000 0.57 0.62 4.7 B+, pH+, Pi- TagCFP 458 480 37 000 0.57 0.64 4.7 B+, pH+, mat+ EGFP 489 509 55 000 0.60 1.00 5.9 B+,Ps+ EmGFP 487 509 57 500 0.68 1.19 6.0 B+, Pi- TagGFP 482 505 58 000 0.59 1.04 4.7 B+, Ps+, pH+, mat+ EYFP 514 527 84 000 0.61 1.55 6.5 B+, pH-, Cl- Venus 515 528 92 200 0.57 1.59 6.0 B+, Pi-, Ps- Citrine 516 529 77 000 0.76 1.77 5.7 B+, Ps- TagYFP 508 524 64 000 0.62 1.20 5.5 B+, pH+, mat+ TagRFP-T* 555 584 81 000 0.41 0.99 4.6 B+, pH+, Ps+ mStrawberry 574 596 90 000 0.29 0.79 <4.5 B+, pH+, Ps- TagRFP 555 584 100 000 0.48 1.42 <4.0 B+, pH++ mCherry 587 610 72 000 0.22 0.48 <4.5 pH+, Ps+ FusionRed 580 608 125 000 0.19 0.72 4.2 B+, pH+, mat- mRaspberry 598 625 86 000 0.15 0.39 - Ps- mPlum 590 649 41 000 0.10 0.12 <4.5 B-, pH+, Ps- mNeptune* 599 649 57 500 0.18 0.31 5.8 mat-, Gr mKate 588 635 31 500 0.28 0.27 6.2 pH- mKate2 588 633 62 500 0.40 0.76 5.4 B+, pH+, Ps+, mat+ B- : низкая расчетная яркость B+ : высокая расчетная яркость (>0.60 от EGFP) Ps- : низкая фотостабильность Ps+ : высокая фотостабильность Pi- : выраженная обратимая фотоинактивация pH+ : высокая pH-стабильность (кажущееся значение pKa <5.5) pH- : низкая pH стабильность pH++ :экстремально высокая pH стабильность (кажущееся значение pKa > 6.5) (кажущееся значение pKa <4.0) Cl- : чувствительность флуоресценции к ионам Cl- mat+ : высокая скорость созревания хромофора mat-: низкая скорость созревания хромофора Gr : остаточная зеленая флуоресценция *Белки TagRFP-T* и mNeptune* получены в лаборатории Р. Тсиена (США) на основе наших белков TagRFP и mKate, соответственно.

QY – квантовый выход флуоресценции; EC, коэффициент молярной экстинкции при максимуме возбуждения.

2. Димерные флуоресцентные белки для мечения клеток и тканей.

Эта часть работы была нацелена на получение максимально эффективных флуоресцентных маркеров для мечения живых клеток и тканей, визуализации активности промотеров и других приложений, в которых не требуется получения химерных конструкций белков слияния. Для таких приложений мономерность не является необходимым свойством, и наши усилия были направлены на получение новых спектральных вариантов и оптимизацию флуоресцентных белков по таким параметрам как яркость флуоресцентного сигнала, скорость созревания хромофора, низкая токсичность, отсутствие видимой агрегации и неспецифической локализации в живых клетках, а также устойчивость к фотообесцвечиванию. На практике, яркость детектируемого сигнала при экспрессии флуоресцентного белка зависит также от других характеристик, таких как эффективность транскрипции и трансляции мРНК, стабильность мРНК и среднее времени жизни белка в клетке. Дальнейшее сравнительное тестирование в клеточных линиях и модельных животных позволяло оценить качество работы маркера по совокупности параметров.

2.1. Быстро созревающий неагрегирующий зеленый флуоресцентный белок TurboGFP.

Один из наиболее быстро созревающих природных зеленых флуоресцентных белков, ppluGFP2 (AY268072), был ранее клонирован в нашей лаборатории из рачка Pontellina plumata (подкласс Copepoda). Белок ppluGFP2 характеризуется исключительно высокой скоростью появления яркого флуоресцентного сигнала при экспрессии как в бактериальных клетках E. coli, так и в клетках млекопитающих. Однако, при высоких уровнях экспрессии, ppluGFP2 формирует видимые микрокристаллы (рис. 9a), что делает его высокотоксичным и малоприменимым для использования в стабильных клеточных линиях и трансгенных организмах.

Рисунок 9. a,b. Конфокальная микроскопия клеток HeLa, экспрессирующих белки ppluGFP2 (a) и TurboGFP (b). После 48 часов экспрессии, ppluGFP2 формирует характерные микрокристаллы, разрушающие клетку. Белок TurboGFP равномерно распределен по клетке и не формирует видимых агрегатов. c. сравнение сигналов TurboGFP и EGFP при экспрессии в развивающихся зародышах X.

laevis. Показаны стадии ранней (вверху) и средней (внизу) гаструлы.

Моделирование с использованием известной структуры белка avGFP показало, что поверхность белка ppluGFP2 преимущественно составляют отрицательно заряженные аминокислотные остатки, за исключением небольшого позитивно заряженного участка, формируемого в районе выхода N- и C-концов белка. Мы предположили, что характерная агрегация ppluGFP2 может быть вызвана электростатическими взаимодействиями между позитивно и негативно заряженными поверхностями белка. С тем чтобы экранировать позитивно заряженный участок, мы использовали сайт-направленный мутагенез для добавления отрицательно зараженных аминокислотных остатков на N- и C-концевые участки ppluGFP2. Действительно, полученный мутантный вариант характеризовался меньшей склонностью к агрегации in vitro, однако при продолжительной экспрессии в клетках HeLa по-прежнему формировал характерные микрокристаллы. Согласно данным гель-хроматографии низкого давления, ppluGFP2 характеризуется тетрамерной природой.

Задавшись целью получить мономерный быстро созревающий зеленый флуоресцентный белок, мы провели несколько раундов сайт-направленного мутагенеза, преимущественно заменяя экспонированные гидрофобные аминокислотные остатки предполагаемых интерфейсов олигомеризации. В результате этой работы, нам не удалось получить мономерный мутантный вариант белка ppluGFP2, который сохранил бы свои флуоресцентные свойства. Однако, был получен белок, названный TurboGFP, характеризующийся димерной природой согласно гель-хроматографии низкого давления, и не формирующий агрегатов при продолжительной гипер-экспрессии в живых клетках. Мы предполагаем, что формирование тетрамера является необходимым событием для инициации дальнейшей олигомеризации и агрегации белка ppluGFP2.

Белок TurboGFP характеризуется яркой зеленой флуоресценцией с квантовым выходом 0.и коэффициентом молярной экстинкции 70 000 M-1cм-1, высокой устойчивостью флуоресцентного сигнала к изменению значения pH (кажущееся значение pKa = 5.2). При физиологических условиях (pH 7.4, 20 мМ фосфатный буфер, 0.14 M NaCl) TurboGFP сохраняет растворимость в концентрациях до 60 мг/мл. Как и белок дикого типа, TurboGFP характеризуется быстрым созреванием хромофора in vitro (время полу-созревания около минут, рис. 10), и in vivo (рис. 9с). В отличие от белка дикого типа, белок TurboGFP не формирует токсичных агрегатов в живых клетках, что позволило получить стабильные экспрессионные клеточные линии (получены проф. C. Petzelt, Германия). Мы также получили дестабилизированную версию белка (TurboGFPdest), путем слияния с деградационным доменом орнитин декарбоксилазы. В транзиентно трансфецированных клетках млекопитающих, добавление циклогексимида в концентрации 100 мкг/мл (ингибитор синтеза белка), приводило к падению флуоресцентного сигнала TurboGFP с полу-временем около 2 часов.

a bc d TurboGFP TurboGFP-V205L TurboGFP-V205L TurboGFP 11EGFP EGFP 40 20 0 0 5000 10000 15000 20000 2500 1000 3000 5000 70Время, с Время, с Рисунок 10. a,b. Струкутра белка TurboGFP и кинетика его созревания. a. Показан срез поверхности белка на уровне плоскости хромофора (выделен зеленым цветом). Показан ведущий к хромофору канал, заполненный молекулами воды (выделены фиолетовым цветом) и аминокислотный остаток Val205, направленный мутагенез которого позволил сузить пространство канала. b. Показан тетрамер TurboGFP, в составе остается экспонированным канал, ведущий к хромофору белка (показан зеленым цветом). с,d. Кинетика ренатурации (c) и созревания (d) белков EGFP, TurboGFP и TurboGFP-V197L in vitro. Показаны нормированные кривые восстановления флуоресценции после тепловой денатурации (c) и тепловой денатурации в присутствии дитионита натрия, восстанавливающего хромофор белка (d).

В то же время, аналогичный белок слияния с белком дикого типа, ppluGFP2, оказался нечувствителен к деградации. Мы предполагаем, что формирование микроагрегатов делает ppluGFP2 недоступным для протеолитических систем клетки. Быстрое появление флуоресцентного сигнала, в сочетании с быстрой деградацией TurboGFPdest, является оптимальным сочетанием для слежения за экспрессией генов в живых тканях.

В совместной работе с др. А.Г. Евдокимовым (Pfizer), методом рентгеноструктурного анализа была решена трехмерная структура белка TurboGFP. Интересной особенностью этого белка оказался заполненный водой канал, ведущий к фенольному кольцу хромофора (рис. 10a). Этот канал остается открытым в составе тетрамера белка (рис. 10b), и предположительно может способствовать созреванию хромофора, облегчая доступ молекулярного кислорода. Действительно, полученный методом сайт-направленного мутагенеза мутантный вариант TurboGFP-V205L, в котором обнаруженный канал должен быть сужен за счет более объемного остатка лейцина, характеризовался относительно замедленной кинетикой созревания хромофора при сохранении высокой скорости сворачивания белка (рис. 10c,d).

Флуоресценция, отн. ед.

Флуоресценция, отн. ед.

2.2. Оранжево-красные флуоресцентные белки eqFP578 и TurboRFP.

Полученные ранее красные флуоресцентные белки, в том числе клонированный в нашей лаборатории белок DsRed и его производные, успешно применялись в различных приложениях и до настоящей работы. Однако, эти белки уступали по яркости зеленым флуоресцентным белкам, характеризовались неполным созреванием и строго тетрамерной природой, что существенно ограничивало круг их возможного применения. По этой причине, мы периодически проводили поиск новых красных флуоресцентных белков в окрашенных и флуоресцентных организмах классов Hydrozoa и Anthozoa. Основной задачей мы ставили обнаружение вариантов, характеризующихся более высокой яркостью флуоресценции, полнотой созревания красного хромофора, и меньшей степенью олигомеризации – в идеальном случае мы надеялись клонировать природный мономерный красный флуоресцентный белок для целей мечения белков слияния.

Ген наиболее близкого по совокупности желаемых характеристик варианта нам удалось клонировать из морского анемона Entacmaea quadricolor (рис. 11a), с использованием метода экспрессионных кДНК библиотек. Полученный оранжево-красный флуоресцентный белок, с максимумами возбуждения и эмиссии флуоресценции при 552 и 578 нм, соответственно, был назван eqFP578. Белок eqFP578 характеризуется молярным коэффициентом экстинкции 102 000 М-1 см-1 при 552 нм, и квантовым выходом 0.54, с результирующей расчетной яркостью в 1.5 раза превосходящей белок DsRed2. Спектр поглощения eqFP578 имеет единственный пик, что указывает на полное созревание хромофора до красной формы, без образования существенных количеств альтернативных либо промежуточных форм. Как описано выше, белок eqFP578 является слабым тетрамером, что облегчило дальнейшую работу по его мономеризации (Раздел 1.1.).

Интересно, что хромофорная группа eqFP611, ближайшего гомолога eqFP578, полученного ранее из E. quadricolor, находится в транс-конформации, что типично для нефлуоресцентных GFP-подобных хромобелков. Ключевые остатки в ближайшем окружении хромофора в белках eqFP578 и eqFP611 идентичны, и можно с большой степенью уверенности заключить, что хромофор eqFP578 также характеризуется трансконформацией.

1350 400 450 500 550 600 650 7Длина волны, нм Рисунок 11. a. Морской анемон Entacmaea quadricolor. b. Нормированные спектры возбуждения (прерывистая линия) и эмиссии (непрерывная линия) флуоресценции белка TurboRFP. c.

Флуоресценция белка TurboRFP при экспрессии в клетках HeLa.

Основным недостатком белка eqFP578 дикого типа как флуоресцентного маркера являлась относительно низкая скорость созревания хромофора при 37°C. С целью ускорения созревания, мы провели несколько раундов случайного ПЦР-мутагенеза. В ходе каждого раунда, после инкубации в течение 12-14 часов при +37°C проводился отбор индивидуальных бактериальных клонов по яркости сигнала, с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Отобранный в результате этой работы вариант, названный TurboRFP, Флуоресценция, у.е.

характеризовался увеличенной относительно eqFP578 яркостью флуоресценции и скоростью созревания хромофора.

Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции TurboRFP приходятся на 553 и 574 нм, соответственно (рис. 11b). Коэффициент молярной экстинкции TurboRFP при 553 нм составляет 92 000 M-1см-1, квантовый выход флуоресценции 0.67, и результирующая расчетная яркость в 1.7 раза превышает яркость белка DsRed2. Флуоресценция TurboRFP характеризуется высокой pH-стабильностью (кажущееся значение pKa = 4.4). Хромофор TurboRFP быстро и полно созревает при 37 °C. При продолжительной (до 7 дней) экспрессии TurboRFP в эукариотических клетках белок TurboRFP остается равномерно распределенным в цитоплазме и не формирует видимых агрегатов (рис. 11c), что свидетельствует в пользу низкой токсичности белка, необходимой для создания стабильно экспрессирующих клеточных линий и трансгенных животных. Таким образом, белок TurboRFP сочетает большинство качеств, необходимых для эффективного прижизненного мечения клеток и тканей. В дальнейшем на его основе был получен целый ряд мономерных (Раздел 1) и димерных (см. далее) флуоресцентных белков для различных приложений.

2.3. Дальнекрасный флуоресцентный белок Katushka.

Получение и характеризация. В организме млекопитающих, большая часть суммарного поглощения приходится на меланин, гемоглобин и воду таким образом, что оно остаётся минимальным в диапазоне от 650 до 1100 нм, что соответствует дальнекрасной области видимой части спектра и инфракрасной области. По этой причине, актуальной задачей для биомедицинских исследований на модельных организмах является получение ярких флуоресцентных белков с максимальным батохромным сдвигом, максимумы эмиссии которых приближались бы к 650 нм. Подобных белков до сих пор не было обнаружено в природе. По совокупности характеристик, оптимальной основой для получения яркого дальнекрасного флуоресцентного белка мы посчитали описанный выше белок TurboRFP.

Мы надеялись, что тонкая настройка окружения хромофора в белке TurboRFP позволит добиться батохромного сдвига эмиссии без существенных потерь в квантовом выходе флуоресценции и коэффициенте молярной экстинкции.

Выбор ключевых положений аминокислотных остатков для направленного мутагенеза был основан на данных рентгеноструктурного анализа близкого белка eqFP611 (PDB ID: 1UIS).

По результатам анализа структуры белка, мы провели одновременный вырожденный направленный мутагенез TurboRFP по положениям Asn148, Ser165 и Phe181, в различных сочетаниях: N148GATCS/S165GATCS/F181FLIMV (125 возможных аминокислотных комбинаций), N148FLIMV/S165GATCS/F181FLIMV (125 возможных аминокислотных комбинаций), N148NKDEQHY/ S165GATCS/F181FLIMV (175 возможных аминокислотных комбинаций). Полученные библиотеки мутантных вариантов были дополнительно подвержены случайному ПЦР-мутагенезу, который, по замыслу эксперимента, должен был помочь обнаружить аминокислотные замены, способные скомпенсировать возможные пространственные конфликты, возникшие вследствие направленного мутагенеза микроокружения хромофора. Анализ экспрессионной библиотеки в бактериях E. coli проводили с использованием стереомикроскопа, оснащенного набором светофильтров, позволяющим предпочтительно отбирать варианты, характеризующихся дальнекрасной флуоресценцией (фильтр возбуждающего света 520-620 нм, фильтр эмиссии 650LP).

Спектры эмиссии флуоресценции вариантов, характеризовавшихся наиболее яркой эмиссией флуоресценции в дальнекрасной области, регистрировались при помощи встроенного в стереомикроскоп спектрофлуориметра SMS2VIS.

В результате проведенного анализа библиотеки был отобран единственный мутантный вариант белка TurboRFP, заметно превосходящий прочие варианты по яркости дальнекрасной флуоресценции, с максимумом эмиссии при 635 нм, содержащий аминкислотные замены N148S, F181L, H199Y и H203R. Аминокислотный остаток в положении 203 находится в непосредственной близости от хромофорной группы, и полученная в результате случайного ПЦР-мутагенеза замена H203R очевидно существенно влияет на спектральные свойства флуоресцентного белка. Дополнительно, для оптимизации полученного мутантного варианта по параметрам яркости флуоресценции и скорости созревания хромофора при 37°C, было проведено 4 раунда случайного ПЦР-мутагенеза.

Оптимизированный вариант получил название Katushka (Катюша, в честь Екатерины Мерзляк, одного из основных разработчиков белка).

Максимум возбуждения флуоресценции белка Katushka приходится на 588 нм, максимум эмиссии – на 635 нм, что приближает его спектральные характеристики к желаемым для эффективной визуализации в толще живых тканей. Спектр поглощения белка Katushka характеризуется единственным пиком, максимум которого совпадает с максимумом возбуждения флуоресценции. Эти данные свидетельствуют об отсутствии в зрелом белке Katushka промежуточных либо альтернативных форм созревания хромофора. Время полусозревания хромофора in vitro составляет около 20 минут. Флуоресценция белка Katushka обладает высокой устойчивостью к изменению значения pH (кажущееся значение pKa = 5.5). Квантовый выход флуоресценции белка Katushka составляет 0.34, а коэффициент молярной экстинкции 65 000 M-1 см-1, и расчетная яркость флуоресценции в 7-10 раз превосходила известные на тот момент спектральные аналоги, белки HcRed и mPlum.

Яркость флуоресценции Katushka в области оптического окна, рассчитанная как интеграл от спектра эмиссии флуоресценции, нормированного на расчетную яркость, в пределах 650800 нм, существенно превосходит яркость известных оранжево-красных и дальнекрасных флуоресцентных белков: mPlum, eqFP611, mRaspberry, mCherry, TurboRFP, DsRed2, DsRedExpress, AQ143 и HcRed (рис. 12a,b).

Примечание: Расчет относительной яркости флуоресценции в области оптического окна был проведен по шкале длин волн, выраженной в нм. Более корректным, с учетом разницы энергий, является расчет по шкале частот. Однако, сравнение двух типов расчетных данных показало, что, в данном случае, ошибка составила не более долей процента.

Время полуобесцвечивания белка Katushka в конфокальном флуоресцентном микроскопе (лазер 543 нм) превышало время полуобесцвечивания белков Cerulean, EYFP, mCherry и mPlum приблизительно в два раза. Под воздействием облучения ртутной лампы (светофильтр 540-580 нм, мощность 200 мВт/см2) в первые 90 с наблюдалось незначительное увеличение интенсивности флуоресцентного сигнала белка Katushka, далее кинетика выгорания была близка к таковой для mCherry.

Сравнение с аналогами в живых клетках и in vivo. При экспрессии в эукариотических клеточных линиях HeLa и Phoenix Eco, яркий флуоресцентный сигнал белка Katushka появлялся через 10-14 часов после трансфекции. При экспрессии в течение 5-7 дней, белки DsRed2 и DsRed-Express преимущественно локализуются в комплексе Гольджи, а белки mCherry и mRaspberry формируют небольшие точечные агрегаты. Белковые агрегаты могут быть токсичными для клеток, что затрудняет получение стабильно экспрессирующих такие белки клеточных линий и трансгенных животных. Существенно, что даже при высоких уровнях экспрессии белок Katushka не формирует агрегатов и равномерно распределен в цитоплазме, что свидетельствует в пользу его низкой токсичности в живых клетках.

a cd Оптическое окно 1. Katushka mPlum DsRed-Express mCherry 0,5 мм 0,5 мм mRaspberry 0.5 eqFP6сомиты сомиты 0.550 600 650 700 750 8сердце сердце Длина волны, нм b сомиты сомиты 10 мм 10 мм сердце сердце Рисунок 12. Характеристики белка Katushka in vitro и in vivo. а. Спектры эмиссии избранных красных и дальнекрасных флуоресцентных белков, нормированные на расчетную яркость флуоресценции. Показано оптическое окно, оптимальное для визуализации в живых тканях. b.

Яркости флуоресценции сравниваемых флуоресцентных белков в пределах оптического окна, вычисленные как определённые интегралы в пределах 650-800 нм. c. Трансгенные эмбрионы X.

laevis, экспрессирующие белки Katushka (с, вверху) и DsRed-Express (с, внизу) под контролем промотора кардиоактина. Показаны фотографии в белом свете (1,3) и флуоресцентные изображения в родаминовом светофильтре (2,4). Показаны фотографии передней части трансгенных эмбрионов с левой стороны (с, слева) и поперечного сечения (с, справа) в плоскостях, показанных пунктиром (направление указано стрелками). d. Фотография в белом свете (вверху) и флуоресцентное изображение (внизу) 2.5-месячных лягушек X. laevis, экспрессирующих DsRed-Express (слева) и Katushka (справа) в мышечных тканях.

Для проверки возможности использования белка Katushka в экспериментах, связанных с визуализацией объектов в многоклеточных организмах, мы использовали модель лягушки X. laevis (совместно с Лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН).

Кодирующие последовательности белков Katushka, DsRed-Express и mPlum были заклонированы под контроль фрагмента промотора кардиоактина X. laevis, характеризующегося тканеспецифической активностью в скелетных мышцах и кардиомиоцитах лягушек.

В трансгенных эмбрионах, экспрессирующих Katushka, наблюдалась яркая флуоресценция в области сомитов и зачатка сердца (рис. 12с2). В то же время, в аналогичных эмбрионах, экспрессирующих сопоставимый по яркости оранжево-красный флуоресцентный белок DsRed-Express, флуоресцентный сигнал из области сердца практически не регистрировался, несмотря на яркую флуоресценцию сомитов (рис. 12с4). Различие объясняется тем, что сомиты покрыты лишь тонким слоем эпидермиса, в отличие от зачатка сердца, окружённого богатыми желтком клетками, где выраженно проявляется преимущество дальнекрасной флуоресценции при визуализации сигнала в живых тканях. Сигнал белка mPlum также не визуализировался, ввиду его низкой яркости. Впоследствии было проведено поперечное рассечение эмбрионов в области сердца. При исследовании среза, яркая флуоресценция в Флуоресценция, отн.ед.

в оптическом окне (более 650 нм) Относительная яркость флуоресценции mKate HcRed AQ1mPlum DsRedmCherry Katushka eqFP6TurboRFP mRaspberry DsRed-Express области сердечного зачатка наблюдалась у эмбрионов, экспрессирующих как белок Katushka, так и белок DsRed-Express (рис. 12с2, 12c4). В лягушках, достигших возраста 2.месяца, сигнал белка Katushka удавалось визуализировать во всем теле, в то время как сигнал DsRed-Express лишь слабо проникал через ткани лягушек (рис. 12d). Важно отметить, что трансгенные эмбрионы, экспрессирующие белок Katushka, обладали лучшей выживаемостью (18 из 48, 38%) в сравнении с эмбрионами, экспрессирующими DsRedExpress (9 из 45, 20%). Мы также успешно получили линию трансгенных рыб Danio rerio, экспрессирующих ген белка Katushka в мышечных тканях.

Примечание: кроме того, в 2010 году другими авторами была опубликована работа, описывающая трансгенных мышей, в которых ген белка Katushka заключен между LoxP сайтами рекомбинации.

Показана низкая токсичность белка при высоком уровне экспрессии во всех клетках организма, а также высокая эффективность при визуализации клеток поджелудочной железы в интактных животных.

В целом, проведенные сравнения показали, что полученный белок Katushka является предпочтительным генетически кодируемым маркером для визуализации клеток и тканей в живых модельных животных, существенно повышающим чувствительность визуализации при экспериментах на модельных животных.

2.4. Батохромные варианты белка Katushka - eqFP650 и eqFP670.

На следующем этапе этой работы мы поставили себе задачу добиться дальнейшего смещения спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции белка Katushka в длинноволновую область. Такие дальнекрасные маркеры необходимы как для задач, требующих визуализации сигнала в толще живых тканей, так и для многоцветного мечения объектов в живых системах. В экспериментах, связанных с визуализацией в живых тканях, как правило, предпочтительны высокие концентрации репортерного белка, и его потенциальная цитотоксичность становится критичным параметром. Белок Katushka в целом характеризовался достаточно низкой токсичностью при создании стабильных линий X. laevis и D. rerio (раздел 2.3.). Тем не менее, мы предприняли усилия для отбора вариантов, характеризующихся более низкой токсичностью, с использованием предложенной недавно методики отбора нетоксичных вариантов флуоресцентных белков, в которой размер растущей колонии бактерий являлся критерием токсичности экспрессируемого бактериями белка. Мы использовали описанный метод для поиска наименее цитотоксичных вариантов белка Katushka среди модификаций, полученных ранее в ходе его разработки. В результате, в качестве основы для получения новых батохромных вариантов, был выбран белок Katushka-9-5, который характеризовался наиболее низкой токсичностью и при этом обладает спектральными характеристиками, практически идентичными белку Katushka.

Основываясь на анализе известной к этому моменту трёхмерной структуры гомологичного белка mKate (PDB ID: 3BXB), был отобран ряд положений аминокислотных остатков, потенциально способных повлиять на спектральные характеристики: M14, L16, M44, T62, Y121, S148, S165, M167, R203 и L205. По этим положениям был проведен вырожденный мутагенез, при котором несколько вариантов аминокислотных замен сочетались в различных комбинациях. Дополнительно, следуя описанной выше логике мутагенеза, проведенного при получении белка Katushka, библиотеки вариантов подвергали случайному ПЦР-мутагенезу. Отбор вариантов, характеризуемых батохромным сдвигом относительно белка Katushka, проводили из более чем миллиона индивидуальных бактериальных клонов, и использованием флуоресцентного стереомикроскопа, оснащенного двумя наборами светофильтров (фильтр возбуждающего света 520-620 нм, фильтр эмиссии 650LP; фильтр возбуждающего света 590-650 нм, фильтр эмиссии 663-738 нм). В результате было отобрано два варианта, характеризующихся выраженным сдвигом спектра эмиссии в длинноволновую область. Два полученных белка, названные eqFP650 и eqFP670, характеризуются максимумами эмиссии при 650 и 670 нм, соответственно. Относительно белка Katushka-9-5, белок eqFP650 содержит аминокислотные замены N24G и M44A, а белок eqFP670 – замены M14T, N24G, M44C, S148N и S165N. Интересно, что остаток метионина в положении 44 также заменён на небольшой аминокислотный остаток в двух недавно опубликованных дальнекрасных флуоресцентных белках: mNeptune (производный от белка mKate) и E2-Crimson (производный от белка DsRed). Было показано, что образующаяся в результате такой замены полость занята молекулой воды, формирующей водородную связь с хромофорной группой. Можно предположить, что мутации M44A и M44C выполняют ту же функцию в белках eqFP650 и eqFP670, и что введение небольшого аминокислотного остатка в положение 44 может являться универсальным способом батохромного смещения спектра эмиссии флуоресценции белков, несущих DsRed-подобный хромофор.

Характеристика и сравнение с аналогами in vitro. Максимум возбуждения флуоресценции белка eqFP650 приходится на 592 нм, а максимум эмиссии – на 650 нм (против 588 и 635 нм белка Katushka, соответственно). В то же время, eqFP650 обладает самой высокой расчетной яркостью среди всех известных флуоресцентных белков с максимумами эмиссии более 635 нм: квантовый выход флуоресценции eqFP650 составляет 0.24, а коэффициент молярной экстинкции – 65 000 М-1 см-1. Таким образом, при сохранении достаточно высокой яркости флуоресценции, eqFP650 характеризуется выраженным батохромным сдвигом спектра эмиссии флуоресценции относительно белка Katushka. Белок eqFP670 первый и на сегодняшний день единственный флуоресцентный белок со столь дальнекрасной эмиссией флуоресценции, около 50% которой приходится на инфракрасную область. Несмотря на то, что eqFP670 характеризуется низкой яркостью флуоресцентного сигнала (квантовый выход составляет 0.06, коэффициент молярной экстинкции – 70 000 М-1 см-1), значительный батохромный сдвиг, как спектра эмиссии, так и спектра возбуждения флуоресценции (максимумы при 605 и 670 нм соответственно) делают eqFP670 потенциально полезным инструментом как для технологий многоцветного мечения, так и, возможно, для визуализации сигнала в толще живых тканей. Расчет яркости флуоресценции в инфракрасной области, при условии возбуждения при 635 нм (распространенная линия лазера, хорошо проникающая через живые ткани) и регистрации в пределах 700-900 нм, показывает 4-кратное превосходство eqFP670 над белком Katushka.

Насколько можно судить по спектрам поглощения, созревание обоих белков проходит полно, без формирования промежуточных либо альтернативных форм созревания хромофора. Время полусозревания хромофора eqFP650 in vitro составляет около 20 минут.

Флуоресцентный сигнал eqFP650 и eqFP670 характеризуется высокой устойчивостью к изменению значения pH: кажущееся значение pKa = 5.7 и 4.5, соответственно. Кроме того, eqFP670 характеризуется исключительно высокой для флуоресцентных белков устойчивостью к фотообесцвечиванию, что может быть важно при необходимости проведения длительных экспериментов с продолжительным облучением и для накопления флуоресцентного сигнала. Возможно, неординарная фотостабильность eqFP670 объясняется уникальной для флуоресцентных белков комбинацией аминокислотных остатков 148N и 165N, которые должны способствовать плотной упаковке аминокислотных остатков и вытеснению молекул воды из непосредственного окружения хромофора.

Характеристика и сравнение с аналогами в живых клетках и in vivo. Белки eqFP650 и eqFP670 характеризуются достаточно высокой скоростью созревания при 37°C в E. coli, так как яркие флуоресцентные сигналы наблюдаются уже после 10-12 часов роста бактериальных клонов. В эукариотических клетках линии HeLa через 14 часов после трансфекции мы наблюдали высокий уровень сигнала eqFP650, сигнал eqFP670 также детектировался. В клетках линии HEK-293T, отличающихся более высоким уровнем экспрессии, яркость флуоресценции обоих полученных белков была высокой через 14 часов после трансфекции, при этом eqFP650 и eqFP670 были равномерно распределены по эукариотическим клеткам, видимые агрегаты отсутствовали. Для определения эффективности белков eqFP650 и eqFP670 как маркеров для визуализации клеток в толще живых тканей, клетки линии HEK-293T, транзиентно трансфицированные плазмидами, кодирующими последовательности белков Katushka, eqFP650, eqFP670, mNeptune и E2Crimson, были инъецированы в ягодичную мышцу мышей. Для нормализации сигнала на эффективность трансфекции и общее число введённых клеток, последние были также котрансфицированы генетическими конструкциями, кодирующими люциферазу.

Флуоресцентные и люминесцентные сигналы регистрировали при помощи системы IVIS Spectrum. Оптимальное соотношение сигнал/шум достигалось при использовании фильтров возбуждающего света 570/30 и 605/30 нм. На рисунке 13a показаны характерные изображения мышей, полученные с использованием фильтра возбуждающего света 605/нм и фильтра эмиссии 660/20 нм.

ab c возбуждение 605/30 нм эмиссия 660/20 нм возбуждение 570/30 нм возбуждение 605/30 нм E2-Crimson mNeptune eqFP6Длина волны эмиссионного фильтра, нм Длина волны эмиссионного фильтра, нм Рисунок 13. Визуализация eqFP650 и eqFP670 в мышах. a. Типичные изображения в отражённом свете (возбуждение 605/30 нм, эмиссия 660/20 нм) после внутримышечных микроинъекций клеток линии HEK-293T, продуцирующих белки E2-Crimson, mNeptune и eqFP650. b,c. Интенсивность флуоресцентного сигнала инъецированных клеток, регистрируемого с помощью набора светофильтров эмиссии при возбуждении на 570/30 нм (b) и 605/30 нм (c). Значения интенсивности флуоресценции были нормированы на интенсивность сигнала котрансфицированной светлячковой люциферазы.

Белок eqFP650 характеризовался наиболее интенсивным флуоресцентным сигналом.

Количественные данные, полученные при детекции с помощью фильтров возбуждающего света 570/30 нм и 605/30 нм, нормированные на люминесцентный сигнал (рис. 13b,c), показывают, что на момент публикации (Shcherbo D et al., Nature Methods, 2010), eqFP6является предпочтительным генетически кодируемым маркером для визуализации в живых тканях.

В этой части работы нами также были получены быстро созревающие димерные флуоресцентные белки TurboYFP и TurboFP602. В Таблице 2 приведены основные характеристики полученных маркеров в сравнении с лучшими аналогами.

Интенсивность Интенсивность флуоресценции, отн. ед.

флуоресценции, отн. ед.

Таблица 2. Сравнение полученных в работе димерных флуоресцентных белков с аналогами, в том числе полученными позднее. Жирным шрифтом выделены флуоресцентные белки, полученные в настоящей работе.

макс. макс. расч. каж.

EC, относительные белок возб., эм., QY яркость, знач.

M-1 cm-1 характеристики нм нм от EGFP pKa ppluGFP2 482 502 70 000 0.60 1.26 4.3 T, B+, pH+, Ps+, Mat+, Ag ZsGreen 493 505 43 000 0.91 1.19 - T, B+ TurboGFP 482 502 70 000 0.53 1.12 5.2 D, B+, pH+, Ps+, Mat+ ZsYellow1 529 539 20 000 0.65 0.39 - T TurboYFP 525 538 105 000 0.53 1.69 5.9 D, B+, Ps+, Mat+ DsRed2 563 582 43 800 0.55 0.73 - T, B+ DsRed-Express 555 584 38 000 0.51 0.59 - T, Ps+, Mat+ DsRed-Express2 554 591 35 600 0.42 0.45 - T, Ps+, Mat+ DsRed-Max 560 589 48 000 0.41 0.60 - T, B+, Ps-, Mat+ AsRed2 576 592 61 000 0.21 0.39 - T dTomato 554 581 69 000 0.69 1.44 - D, B+, Ps+ eqFP611 559 611 78 000 0.45 1.06 - T, B+, Ps-, TurboRFP 553 574 92 000 0.67 1.87 4.4 D, B+, pH+, Mat+ TurboFP602 574 602 75 000 0.35 0.79 4.7 D, B+, pH+, Ps-, Mat+ Katushka 588 635 65 000 0.34 0.67 5.5 D, B+, pH+, Ps+, Mat+ Katushka2 588 633 69 000 0.37 0.77 5.5 D, B+, pH+, Ps+, Mat+ AQ143 595 655 90 000 0.04 0.11 - T, B- mNeptune* 599 649 57 500 0.18 0.31 5.8 mat-, Gr E2-Crimson 605 646 58 500 0.12 0.21 - Bl eqFP650 592 650 65 000 0.24 0.47 5.7 D, pH+, eqFP670 605 670 70 000 0.06 0.13 4.5 D, B-, pH+, B+ : высокая расчетная яркость (>0.60 от EGFP) T: тетрамер Ps+ : высокая фотостабильность D: димер pH+ : высокая pH-стабильность B- : низкая расчетная яркость (кажущееся значение pKa <5.5) Ps- : низкая фотостабильность mat+ : высокая скорость созревания хромофора Ag : выраженная агрегация Gr : остаточная зеленая флуоресценция Bl : остаточная синяя флуоресценция Mat- : низкая скорость созревания хромофора *Белок mNeptune* получен в лаборатории Р. Тсиена (США) на основе нашего белка mKate.

QY – квантовый выход флуоресценции; EC, коэффициент молярной экстинкции при максимуме возбуждения.

3. Фотоактивируемые флуоресцентные белки Фотоактивируемые флуоресцентные белки отличаются способностью к выраженному изменению спектральных свойств при облучении светом определенной длины волны. Эти изменения могут быть обратимыми либо необратимыми, и оба эффекта востребованы в различных практических приложениях. Мы приложили усилия к разработке оптимальных мономерных фотоактивируемых белков, применимых для технологий слежения за перераспределением и направленным транспортом белков слияния в живых клетках, а также для так называемых технологий сверхвысокого» разрешения, таких как PALM (Photoactivated localization microscopy, микроскопия “локализованной фотоактивации”) и RESOLFT (reversible saturable optical fluorescent transition “обратимого насыщенного оптического флуоресцентного перехода”), позволяющих методами флуоресцентной микроскопии различить объекты, находящиеся на расстоянии 10-20 нм. Кроме того, нами были отработаны оптимальные протоколы фотоактивации с использованием различных систем флуоресцентных микроскопов, и предложена технология «белковых речек», позволяющая повысить разрешение изображения при отслеживании быстрой диффузии белков в живых клетках с использованием обратимой фотоактивации.

3.1. Высококонтрастный фотоактивируемый белок PS-CFP2.

Задачей этой части работы было создание необратимо фотоактивируемого зеленого флуоресцентного белка, подобного опубликованному в 2002 белку PA-GFP, но превосходящего его по «контрасту» (выраженности изменения флуоресцентных свойств при фотоактивации), и оставляющего возможность для визуализации нефотоактивированной формы, которая в белке PA-GFP отличается низкой яркостью флуоресценции и практически мгновенно фотоактивируется при визуализации даже при малой мощности возбуждающего света. GFP-подобный хромофор в белке PA-GFP находится в протонированной форме (максимум возбуждения в области 400 нм), и переходит в депротонированную форму (максимум возбуждения в области 490 нм) при декарбоксилировании Glu222, вызываемом облучением фиолетовым (380-420 нм) светом.

В качестве основы для получения нового фотоактивируемого белка был выбран мономерный зеленый флуоресцентный белок aceGFP. Основываясь на известных структурах близких зеленых флуоресцентных белков и имеющихся на тот момент данных о белке PA-GFP, для направленного мутагенеза были выбраны аминокислотные остатки в положениях 148, 165, 220 и 222. Сочетанием различных вариантов замен по этим положениям, методом вырожденного мутагенеза были получены библиотеки мутантных вариантов aceGFP. Предварительный отбор проводился с использованием флуоресцентного стереомикроскопа, и был направлен на поиск вариантов, характеризующихся яркой флуоресценцией при возбуждении светом в фиолетовой (380-420 нм), и отсутствием флуоресценции при возбуждении светом в синей (около 450-480 нм) области спектра. На этом этапе, среди прочих, были отобраны два мутантных варианта, характеризующиеся циановой (голубой, максимум эмиссии около 470 нм) флуоресценцией и способных к необратимому переключению в зеленую флуоресцентную форму в ответ на облучение интенсивным фиолетовым светом. Циановая (а не зеленая, как в белке PA-GFP) эмиссия флуоресценции белка до фотоактивации предпочтительна, ввиду более надежного спектрального разделения с зеленой флуоресцентной формой, образующейся после фотоактивации, даже с учетом существенных отличий в спектрах возбуждения двух форм.

По этой причине эти два варианта были отобраны для дальнейшей оптимизации методом случайного ПЦР-мутагенеза. В результате оптимизации был получен вариант, названный PS-CFP (фотопереключаемый циановый флуоресцентный белок, PhotoSwitchable Cyan Fluorescent Protein), содержащий, относительно aceGFP, аминокислотные замены T62A, N121S, H148T, K158R, I167V, E172K, F221L, G222E, и K238Q. В дальнейшем белок PS-CFP был ещё существенно оптимизирован методом случайного ПЦР-мутагенеза по параметрам скорости созревания и яркости флуоресцентных сигналов обоих форм. Результирующий белок, содержащий замены S108T, M153V, T154A, был назван PS-CFP2.

Белок PS-CFP2 характеризуется циановой флуоресценцией с максимумами возбуждения и эмиссии при 400 и 468 нм, соответственно, что характерно для протонированного GFPподобного хромофора, находящегося в условиях, замедляющих эффект переноса протона при возбуждении (excited state proton transfer, ESPT). Квантовый выход флуоресценции этой формы составляет 0.2, коэффициент молярной экстинкции – 42 000 М-1 см-1. При облучении интенсивным фиолетовым светом, PS-CFP2 необратимо переходит в зеленую флуоресцентную форму, характеризующуюся максимумами возбуждения и эмиссии флуоресценции при 490 и 511 нм, соответственно. Квантовый выход флуоресценции зеленой формы составляет 0.23, коэффициент молярной экстинкции – 47 000 М-1 см-1.

При полной фотоактивации образца белка PS-CFP2 in vitro, яркость зеленой (возбуждение при 490 нм) флуоресценции возрастает более чем в 400 раз (против 100 раз для PA-GFP), в то время как яркость циановой флуоресценции снижается в 5.5 раз. Таким образом, суммарный «контраст» фотоактивации, то есть, в данном случае, результирующее изменение соотношения яркости флуоресцентных сигналов при переходе белка в новую форму, составляет более 2 000 раз. Природа этой фотоконверсии, предположительно, аналогична фотоактивации белка PA-GFP. Флуоресцентный сигнал обоих форм PS-CFPхарактеризуются достаточно высокой устойчивостью к изменению значения pH (кажущееся значение pKa = 4.3 для циановой, 6.1 для зеленой формы).

При экспрессии в клетках млекопитающих, сигнал PS-CFP2 хорошо детектируется спустя 20 часов после трансфекции, равномерно распределен по клеткам, не образует видимых агрегатов при продолжительном культивировании трансфицированных клеток. Зеленая флуоресценция практически не детектируется до фотоактивации, которую предпочтительно проводить с использованием лазера 405 нм. Под воздействием фиолетового облучения ртутной лампы умеренной интенсивности фотоактивация PS-CFP2 происходит крайне медленно, что позволяет, в отличие от PA-GFP, визуализировать белок до фотоактивации и отслеживать перераспределение исходной формы, наряду с фотоактивированной.

Белок PS-CFP2 позволяет проводить эффективное прицельное фотомечение белков слияния и отслеживать их перераспределение в течение десятков минут и даже часов.

Примечание: В последующих работах других авторов было показано, что PS-CFP2 является эффективным инструментом для микроскопии сверхвысокого разрешения PALM, и составляет предпочтительную пару для двухцветной микроскопии PALM в паре с фотопереключаемыми белками, изменяющими цвет флуоресценции с зеленого на красный. Двухцветная флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения с использованием PS-CFP2 позволяет достичь разрешения, приближенного к необходимому для идентификации непосредственного взаимодействия двух белков (Shroff H et al., PNAS 2007). Другой группой авторов было показано, что в трансгенных цыплятах, где фотоактивируемые белки могут использоваться для мечения и слежения за перемещением живых клеток, фотоактивированная форма PS-CFP2 может наблюдаться в течение нескольких суток, в отличие от всех прочих необратимо фотоактивируемых белков, сигнал которых, по тем или иным причинам, не детектируется уже через несколько часов после активации. Таким образом, белок PS-CFP2 может быть предпочтительным маркером для прицельного фотомечения живых клеток в трансгенных организмах.

3.2. Технология «белковых речек» на основе обратимо фотоактивируемых белков.

Преимуществом обратимо фотоактивируемых флуоресцентных белков является возможность многократной фотоактивации при работе с одной и той же живой клеткой, в различных её точках, на протяжении продолжительного времени, до и после интересующего внешнего воздействия. Для слежения за перераспределением белка слияния, обратимо фотоактивируемый белок можно активировать в определенной выбранной части клетки коротким локальным облучением, с использованием соответствующей линии лазера конфокального микроскопа. Для регистрации динамики быстрого перераспределения белка, последующие изображения должны быть получены максимально быстро, для чего в конфокальной микроскопии необходимо использовать высокую частоту сканирования и низкое разрешение. В то же время, для слежения за перераспределением белка, необходимо использовать низкую интенсивность возбуждающего света, ввиду того, что возбуждающий свет может привести к заметной дополнительной активации либо инактивации флуоресценции. В целом, в любой системе, время накопления сигнала и интенсивность возбуждающего света должны быть минимизированы. Таким образом, могут быть получены лишь относительно грубые изображения, описывающие быстрое перераспределение белка после локальной фотоактивации. Для решения этой проблемы, мы предложили использовать обратимо фотоактивируемые белки, позволяющие в течение короткого времени многократно повторить циклы фотоактивации и слежения за распределением белка из одной и той же точки. Полученные данные можно затем усреднить, что позволяет значительно повысить разрешение получаемых изображений, описывающих распределение белка в течение первых миллисекунд после фотоактивации.

Для экспериментальной проверки работоспособности этого подхода, мы использовали белок asFP595-A148G, способный к обратимой фотоактивации из нефлуоресцентной в яркую красную флуоресцентную форму при облучении интенсивным зеленым (530-570 нм) светом, и инактивации при облучении синим (оптимум при 450 нм) светом. Этот белок отличается высокой устойчивостью к обесцвечиванию, высоким «контрастом» фотоактивации, то есть, в данном случае, кратностью возрастания интенсивности флуоресцентного сигнала при фотоактивации, и достаточно низкой скоростью спонтанной релаксации до исходного нефлуоресцентного состояния (время полурелаксации около минуты). Циклы фотоактивации/фотоинактивации могут быть повторены сотни раз без существенного влияния на свойства белка. Слежение за перераспределением белка проводили в живых клетках HeLa. В параллельных экспериментах, использовался описанный выше необратимо фотоактивируемый белок PS-CFP2. По сравнению с asFP595A148G, PS-CFP2 характеризуется в 3 раза более высокой расчетной яркостью активированного сигнала, и значительно более высоким контрастом фотоактивации.

В рамках одной серии изображений, полученных после одиночной фотоактивации, два белка позволили получить сходные по качеству изображения. Повторная фотоактивация PSCFP2 в той же точке вела к быстрому нарастанию фоновой зеленой флуоресценции и падению контраста фотоактивации вследствие необратимого характера фотопереключения.

В то же время, asFP595-A148G можно было многократно активировать в одной и той же точке клетки, без заметного нарастания фонового сигнала и потери «контраста» фотоактивации. Это позволило получать сходные серии изображений, описывающих быструю динамику перераспределения белка. За счет усреднения полученных серий, удалось значительно поднять разрешение изображений (рис. 14).

Рисунок 14. Слежение за перераспределением необратимо фотоактивируемого белка PS-CFP2 и обратимо фотоактивируемого белка asFP595-A148G из точки активации в цитозоле клеток HeLa.

Изображения получены с интервалом в 144 мс. Показаны изображения с интервалом в 720 мс.

Показано время после фотоактивации, в секундах. Масштабная линейка, 10 мкм.

На практике, эта технология, получившая название «protein rivers» (белковые реки), может быть использована в различных экспериментальных системах, в которых требуется получить детализированную картину перераспределения белка из интересующей точки живой клетки. Кроме того, усреднение позволяет значительно снизить погрешность измерения и достоверно идентифицировать даже незначительные изменения в динамике перераспределения белка в живой клетке. В качестве примера, мы применили эту технологию для слежения за подвижностью белка Bid, вовлеченного в различные пути апоптоза. Было показано, что при активации апоптоза, вызванной добавлением в среду стауроспорина, динамика перераспределения белка Bid в цитозоле замедляется, что указывает на формирование белковых комплексов, предположительно с белком Bax и другими белками семейства Bcl-2.

3.3. Красные мономерные и «супермономерные» обратимо фотоактивируемые белки Описанный выше белок asFP595-A148G имеет тетрамерную природу и практически непригоден для работы в составе белков слияния. Мы задались целью получить аналогичный обратимо фотоактивируемый красный флуоресцентный белок на основе мономерного белка TagRFP (раздел 1.1.). Отталкиваясь от предыдущего опыта разработки фотоактивируемых флуоресцентных белков на основе тетрамерных вариантов GFPподобных белков, мы провели мутагенез TagRFP по положениям 148 и 165, которые в значительной степени определяют возможность фотоиндуцируемой цис-трансизомеризации хромофора. Мы использовали метод вырожденного мутагенеза (20 вариантов аминокислотных остатков в каждой позиции). Таким образом, полученная экспрессионная библиотека содержала 400 мутантных вариантов белка TagRFP с различным сочетанием аминокислотных остатков в положениях 148 и 165. Поиск фотоактивируемых вариантов проводился с использованием флуоресцентного стереомикроскопа, а также прямого широкопольного флуоресцентного микроскопа, позволяющего использовать полевую диафрагму для концентрированного облучения небольшого участка выбранной области колонии E. coli светом определенной длины волны. Визуальный поиск среди 5 000 колоний этой библиотеки выявил наличие красных флуоресцентных белков различной яркости, однако вариантов с выраженными свойствами фотоактивации обнаружено не было.

Основываясь на данных о трехмерной структуре близкого белка mKate (раздел 1.2.), мы предположили, что некоторые объемные аминокислотные остатки в окружении хромофора TagRFP, в частности Arg69 и Phe181, могут препятствовать цис-транс изомеризации хромофора, необходимой для проявления свойств фотоконверсии. Для преодоления этой проблемы мы обратились к белку-предшественнику TagRFP, с рабочим названием NRM14, который характеризуется несколько меньшей яркостью и скоростью созревания чем белок TagRFP. В позициях 69 и 181 в окружении хромофора, NRM14 содержит менее объемные остатки Lys69 и Leu181, аналогично природному тетрамерному фотоактивируемому белку asFP595. Действительно, поиск фотоактивируемых вариантов в библиотеке, полученной методом вырожденного мутагенеза NRM14 по положениям 148 и 165, выявил два мутантных варианта, обладающих способностью к обратимой фотоконверсии. В частности, мутантный белок, названный KFP-HC, содержал замены N148H и S165C и проявлял следующие свойства: исходная красная флуоресценция падала в 10 раз под воздействием зеленого света (530-560 нм) и была способна к восстановлению до исходного уровня при облучении синим светом (450-490 нм) или после инкубации в темноте в течение минут. При фотоинактивации происходят изменения формы спектров и положения пиков возбуждения и эмиссии, в целом характерные для цис-транс изомеризации хромофора. В «потушенном» состоянии основной пик возбуждения немного сдвигается в синюю область (максимум при 575 нм), а также появляется новый пик при 480 нм. Последний, по всей вероятности, соответствует протонированному состоянию хромофора и определяет возможность быстрого восстановления «потушенного» белка KFP-HC облучением синим светом. KFPHC проявляет способность к обратимой фотоконверсии и при экспрессии в клетках млекопитающих.

Однако, относительно низкая яркость флуоресцентного сигнала KFP-HC, а также достигнутые в этот период работы успехи по получению «супермономерного» красного флуоресцентного белка (раздел 1.3.), заставили нас подумать о получении аналогичного варианта с улучшенными характеристиками на основе близкого (высокогомологичного) белка FusionRed. Сравнение аминокислотных остатков в окружении хромофоров для белков KFP-HC и FusionRed выявило различия лишь по 3 ключевым позициям: K69R, H148S, и A179C (указаны аминокислотные остатки в KFP-HC и FusionRed, соответственно). Был проведен сайт-направленный мутагенез FusionRed с различным набором мутаций по этим позициям, в том числе: S148H; S148H/R69K; S148H/R69K/C179A. Анализ полученных мутантных вариантов показал, что FusionRed-S148H характеризуется низкой интенсивностью флуоресценции и достаточно быстро (< 1 мин) обесцвечивается под воздействием зеленого света (530–560 нм) как в широкопольном микроскопе (объектив х, 100 Вт ртутная лампа), так и во флуоресцентном стереомикроскопе при низкой интенсивности света. Флуоресценция восстанавливалась в синем свете за несколько минут либо в темноте в течение 10-15 минут.

В то же время, яркость флуоресценции колоний E. coli, экспрессирующих варианты FusionRed-148H,69K (далее mKateKFP1) и FusionRed-148H,69K,179A (далее mKateKFP2) была заметно выше, чем яркость колоний, экспрессирующих FusionRed-S148H или KFP-HC.

Интенсивность флуоресценции быстро (в течение десятков секунд) снижалась при облучении зеленым светом (530–560 нм) и восстанавливалась при облучении синим светом (450–490 нм) или за несколько минут в темноте. Для FusionRed при тех же условиях эффектов обратимой фотоактивации или фотообесцвечивания не наблюдалось. Таким образом, введения замен S148H и R69K оказалось достаточным для переноса способности к обратимой фотоконверсии на белок FusionRed, при сохранении приемлемой яркости флуоресценции. Более подробно фотоактивационные свойства белков mKateKFP1 и mKateKFP2 были изучены для очищенных белков, иммобилизованных на металлоаффинной смоле Talon, с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа.

Рисунок 15. Обратимая фотоконверсия белков mKateKFP1 на металлоаффинной смоле. Показано 100 циклов фотоинактивации/фотоактивации: 3 с облучения зеленым светом (530-560 нм), 3.5 c облучения синим светом (450-490 нм). Нижний ряд точек – потушенная флуоресценция, верхний ряд точек – восстановленная флуоресценция. Интенсивность облучения около 3 Вт/см2.

При наблюдении иммобилизованных белков под флуоресцентным микроскопом интенсивность флуоресценции быстро падала, поскольку возбуждающий зеленый свет вызывал обратимое гашение флуоресценции белков. После кратковременного облучения синим светом, происходило восстановление красного сигнала. Путем варьирования продолжительности и интенсивности облучения зеленым и синим светом нам удалось подобрать условия для проведения многократных циклов тушения/активации белков (рис.

15). Интересно, что в ходе первых циклов тушения/активации возрастает как амплитуда изменений, так и максимальная яркость флуоресцентного сигнала. При интенсивности облучения около 3 Вт/см2 необратимое фотообесцвечивание белков и, соответственно, затухание циклов фотоконверсии происходят с большей скоростью, чем при низких интенсивностях света (измерения также проводились при 340 мВт/см2). Однако, при высокой интенсивности света фотопереключение обоих белков происходит в несколько раз быстрее. Максимум возбуждения флуоресценции для активированной формы mKateKFPприходится на 572 нм, максимум эмиссии на 613 нм. Максимум эмиссии после тушения флуоресценции смещается до 602 нм. Максимум возбуждения флуоресценции для активированной формы mKateKFP2 составляет 580 нм, максимум эмиссии 605 нм. После тушения флуоресценции максимум эмиссии смещается до 603 нм.

В целом, белки mKateKFP1 и mKateKFP1 близки к белку KFP-HC по параметрам тушения и восстановления флуоресценции. Однако, mKateKFP1 и mKateKFP1 не содержат замен во внешней части бета-бочонка относительно FusionRed, и следовательно, наследуют его «супермономерные» свойства (раздел 1.3.), что делает их оптимальными фотоактивируемыми вараинтами для использования в составе белков слияния. Кроме того, mKateKFP1 и mKateKFP1 превосходят KFP-HC по яркости флуоресцентного сигнала и контрасту между активированной и потушенной формами, который достигает 30 раз для mKateKFP1 и 20 раз для mKateKFP2. Эти высококонтрастные обратимо фотоактивируемые красные «супермономерные» флуоресцентные белки могут быть использованы как для локального оптического мечения белков слияния, так и для микроскопии сверхвысокого разрешения с использованием технологии PALM (показано совместно с др. Г. Шрофф, США).

3.4. Новый тип необратимой фотоконверсии зеленых флуоресцентных белков Ещё в 1997 году было показано, что белок avGFP A. victoria и его мутантные варианты в анаэробных условиях способны к фотоконверсии в красную флуоресцентную форму.

Механизм этого явления до сих пор остаётся необъясненным, но можно предполагать, что в его основе лежит фотовосстановление avGFP, по аналогии с фотоконверсией хлорофиллов в анаэробных условиях. Исследуя этот феномен, мы обнаружили, что в присутствии окислителей многие зеленые флуоресцентные белки способны к фотоиндуцируемому переключению в красную флуоресцентную форму и в присутствии кислорода. Оказалось, что облучение синим светом (например, линия лазера 488 нм) белка EGFP иммобилизованного на частицах металлоаффинной смолы, в присутствии различных электронных акцепторов (окислителей), приводит к эффективной фотоконверсии EGFP в красную флуоресцентную форму. Подобная окислительная фотоконверсия наблюдалась в присутствии красной кровяной соли (феррицианида калия, K3[Fe(CN)6]), бензохинона и МТТ (бромида 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил тетразолия). При проведении эксперимента в присутствии МТТ на облучаемых участках наблюдалось образование характерного синего осадка восстановленного формазана, что указывает на прохождение окислительно-восстановительной реакции. В отличие от известной анаэробной фотоконверсии, не была выявлена какая-либо зависимость фотоактивации от наличия кислорода.

Для определения спектральных характеристик красной флуоресцентной формы EGFP мы провели фотоконверсию белка в водном растворе в присутствии красной кровяной соли, облучая кювету с раствором с помощью мощных светодиодов (490 нм, 0.1 Вт/см2). После минут облучения спектрофлуориметр детектировал красную флуоресценцию, характеризующуюся максимумом возбуждения при 575 нм и максимумом эмиссии при 6нм, в отличие от красной флуоресцентной формы, образующейся при фотоконверсии avGFP в анаэробных условиях, для которой характерны пики возбуждения и эмиссии флуоресценции при 525 и 600 нм, соответственно. Квантовый выход флуоресценции составил около 0.05. Эффективность окислительной фотоконверсии линейно возрастает с увеличением интенсивности облучения. Таким образом, можно предположить, что фотоконверсия является однофотонным процессом. Образующаяся в результате фотоконверсии красная флуоресцентная форма достаточно стабильна. Так, при низких концентрациях окислителя (например, в присутствии 1 мкМ бензохинона) интенсивность красного флуоресцентного сигнала не уменьшается в течение по меньшей мере одного часа.

Дальнейшие эксперименты показали, что эндогенные внутриклеточные окислители также могут способствовать фотоконверсии EGFP. Так, процесс протекает в присутствии цитохрома с (cyt c) – гем-содержащего растворимого белка, одноэлектронного акцептора, вовлечённого в электрон-транспортную дыхательную цепь практически всех организмов.

Сравнение спектров поглощения раствора, содержащего EGFP и cyt c, измеренных до и после облучения, показало сопряжённое с фотоконверсией EGFP превращение окисленной формы цитохрома (широкий пик поглощения с максимумом при 530 нм) в восстановленную (характерные узкие пики с максимумами при 520 и 550 нм). При этом контрольный образец цитохрома, облучённый в растворе, не содержащем EGFP, остался спектрально неизменным. Исходя из степени уменьшения пика поглощения EGFP при 488 нм, степени увеличения пика поглощения cyt c на 550 нм, и молярных коэффициентов экстинкции обоих белков при указанных длинах волн (55 000 и 19 000 М-1см-1, соответственно), мы рассчитали выход данной окислительно-восстановительной реакции. Он составил около 1.7, что свидетельствует о высокой эффективности реакции и том, что окисление EGFP - это скорее всего двухэлектронный процесс, в результате которого может образовываться до 2-х молекул восстановленного цитохрома на одну молекулу EGFP.

Зеленые флуоресцентные белки различного происхождения, в том числе AcGFP1, TagGFP, zFP506, amFP486 и ppluGFP2 оказались способными к аналогичной фотоконверсии. В то же время, мутантные варианты GFP, несущие аминокислотные замены непосредствееннно в структуре хромофора - циановый флуоресцентный белок ECFP (замена Y66W), и синий флуоресцентный белок EBFP (замена Y66H), не проявляли характерных признаков окислительной фотоконверсии: присутствие акцепторов электронов не приводило к ускорению фотообесцвечивания, и при фотообесцвечивании не наблюдалось образования новых спектральных форм. Таким образом, можно предположить, что структура тирозинсодержащего хромофора «дикого типа» имеет определяющее значение для способности к фотоконверсии. Дальнейшие эксперименты показали, что фотоконверсия EGFP в красную форму может проходить в живых эукариотических клетках, таких как HEK293, HeLa и 3Т3, в нормальных аэробных условиях, причем эффективность этого процесса различается для разных клеточных линий. Интересно, что эффективность процесса существенно различалась и для индивидуальных клеток, но при этом была примерно равной для дочерних клеток, образовавшихся в результате деления. Более того, эксперименты на эмбрионах рыбы D. rerio, экспрессирующих EGFP под контролем инсулинового промотора в -клетках поджелудочной железы (линия рыб предоставлена проф. Д. Онищук, Германия), а также на живых срезах мозга мыши, экспрессирующей EGFP под контролем -актинового промотора во всех клетках организма (мыши предоставлены проф. А. Терских, США), показали, что данный тип фотоконверсии может эффективно проходить в тканях трансгенных животных.

Обнаруженный эффект окислительной фотоконверсии зеленых флуоресцентных белков имеет перспективу использования в целом ряде практических приложений. В частности, относительная эффективность окислительной фотоконверсии может служить индикатором окислительно-восстановительного статуса клеток и клеточных органелл. Окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков может быть использована для светоиндуцируемого воздействия на окислительно-восстановительные процессы в живой клетке, детекции белок-белковых взаимодействий (посредством определения близости электронного акцептора, химерно слитого с потенциальным белком-партнером), а также для микроскопии сверхвысокого разрешения.

3.5. Методика повышения фотостабильности зеленых флуоресцентных белков при визуализации в живых клетках.

Фотостабильность является одним из ключевых характеристик флуоресцентных белков, как маркёров для различных применений во флуоресцентной микроскопии, в значительной степени определяющим соотношение сигнал/шум, качество изображения и возможность проведения длительных экспериментов и количественных измерений. Описанный выше эффект окислительной фотоконверсии зеленых флуоресцентных белков позволил предложить эффективный способ повышения их фотостабильности при визуализации в живых клетках. Так как присутствие окислителей повышало эффективность фотоконверсии, сопряженную с уменьшением зелёной флуоресценции, мы предположили, что, светоиндуцируемый перенос электронов в значительной степени ответственен за фотообесцвечивание. В таком случае, удаление компонентов, способных играть роль электрон-акцепторов, должно приводить к замедлению фотообесцвечивания зелёных флуоресцентных белков.

Действительно, сравнительные эксперименты показали, что использование для культивирования среды DMEM (Dulbecco's Modified Eagle’s Medium), не содержащей рибофлавина, либо среды DMEM, из которой были исключены все витамины, позволяет увеличить фотостабильность зеленых флуоресцентных белков до 5 и 9 раз, соответственно, по сравнению со стандартной средой DMEM (линия клеток HEK293T, широкопольная флуоресцентная микроскопия, объектив 63х, интенсивность облучения около 1 Вт/см2).

Этот эффект выражено проявлялся и для белков слияния с зелеными флуоресцентными белками, а также для активированных форм фотоактивируемых флуоресцентных белков PA-GFP и PS-CFP2 (Таблица 3). Другие компоненты, используемые в средах для культивирования, такие как антибиотики пенициллин и стрептомицин, зародышёвая сыворотка, L-глутамин, не оказывали существенного влияния на фотостабильность зеленых флуоресцентных белков.

Таблица 3. Увеличение фотостабильности флуоресцентных белков при изменении состава среды.

Увеличение времени полуобесцвечивания Флуоресцентный белок по сравнению с DMEM, раз среда без рибофлавина среда без витаминов TagGFP2 2.0 3.AcGFP1 1.7 2.EGFP 5.1 9.EGFP-актин 3.5 5.EGFP-тубулин 4.4 6.mitoEGFP 1.4 1.PA-GFP (активированный) 1.3 4.PS-CFP2 (активированный) 3.0 4. В то же время, продолжительное культивирование клеток в обедненных средах для культивирования не приводило к нарушению их морфологии, способности к делению, прикреплению и подвижности. Таким образом, можно заключить, что среды без витаминов и, в частности, среда без рибофлавина могут успешно применяться для экспериментов, связанных с флуоресцентной визуализацией живых клеток, длительностью до нескольких суток.

4. Генетически кодируемые сенсоры на основе флуоресцентных белков.

Генетически кодируемые сенсоры – один из самых сложных типов инструментов, которые могут быть получены на основе флуоресцентных белков. С одной стороны, разнообразие и высокая специфичность природных белковых доменов, способных изменять конформацию при связывании определенного иона или под воздействием той или иной модификации, предоставляет широкий выбор для конструирования сенсоров различной специфичности. С другой стороны, достаточно сложной задачей является преобразование этих конформационных изменений в выраженный ответ сенсора, заключающийся в детектируемых изменениях спектральных характеристик флуоресцентного белка. В настоящей работе нашей задачей являлось получение сенсоров двух основных типов - на основе пермутированных флуоресцентных белков и на основе FRET-пар флуоресцентных белков, характеризуемых максимально выраженным изменением флуоресцентных свойств при ответе на детектируемый ион или активность.

4.1. Сенсоры ионов кальция на основе пермутированных флуоресцентных белков.

Метод кольцевой пермутации (circular permutation), при котором на уровне гена нативные N- и C- концы белка соединяют с помощью пептидного линкера, с образованием новых N- и C-концов в другой части молекулы, позволяет расположить детекторные белковые домены в непосредственной близости от хромофора. Благодаря этому, происходящие в детекторных доменах конформационные изменения могут оказывать существенное влияние на флуоресцентные свойства сенсора.

Для создания кальциевых сенсоров мы использовали подход, основанный на присоединении к С- и N-концам варианта флуоресцентного белка, пермутированного по позициям 147-146, кальмодулина (СаМ) и его пептида-мишени М13 (фрагмент легкой цепи киназы миозина), соответственно (рис. 16a). При связывании ионов кальция, CaM претерпевает глубокие конформационные перестройки, что обусловливает его взаимодействие с М13 в составе химерного конструкта. В свою очередь, это вызывает конформационные изменения аминокислотного окружения хромофора и может повлиять на соотношение его нейтральной (протонированной) и заряженной (депротонированной) форм, а также на квантовый выход флуоресценции и коэффициент молярной экстинкции, что, в конечном итоге, выражается в изменении флуоресцентных свойств сенсора. Такой подход к созданию генетически кодируемых кальциевых сенсоров уже применялся ранее при создании сенсоров GCaMP и Pericam, и может называться классическим. Для нас представляла интерес возможность произвести тонкую настройку окружения хромофора, с целью повышения «контраста» срабатывания сенсора, то есть выраженности изменений в яркости флуоресцентного сигнала в ответ на связывание ионов кальция.

На тот момент ещё не было получено данных о трехмерной структуре кальциевых сенсоров на основе пермутированных флуоресцентных белков, таких как GCaMP и Pericam.

Основываясь на данных о структуре непермутированного avGFP (PDB ID:1 GFL), мы предположили, что в кальциевых сенсорах данного типа, в которых «разрыв» при пермутации проводили в районе 146 положения, аминокислотные остатки 145 и 1сохраняют контакт с хромофором, в то время как соседние аминокислотные остатки, один из которых предшествует позиции 148, а другой следует за позицией 145, оказываются «выходящими» из бета-бочонка и через короткие линкерные участки ведут к доменам Mи кальмодулина, соответственно.

Действительно, сравнение аминокислотных последовательностей опубликованных ранее кальциевых сенсоров на основе пермутированных флуоресцентных белков указывало, что аминокислотные остатки в позициях 145, 148 и 203 оказывают существенное влияние на их свойства. В надежде подобрать оптимальный вариант окружения хромофора, обеспечивающий максимальную яркость флуоресцентного сигнала и высокий «контраст» срабатывания сенсора, мы сконструировали ряд вариантов кальциевых сенсоров. В частности, было получено 9 вариантов, в которых пермутированный зеленый флуоресцентный белок содержал различные комбинации аминокислотных остатков по положениям 145 (Ser, Ala, Thr) и 148 (Asp, Glu, Asn), в то время как положение 203 занимал Phe. Полученные варианты характеризовались различными ответами на добавление ионов кальция. Так, варианты сенсора, несущие в 148 положении Asn, отвечали лишь незначительным изменением флуоресцентного сигнала. Варианты сенсора, содержащие в 148 положении Glu или Asp, характеризовались единственным пиком возбуждения (максимум при 490 нм) и эмиссии флуоресценции (максимум при 515-520 нм), и отвечали на присутствие ионов кальция выраженным увеличением относительной яркости флуоресцентного сигнала, без существенных изменений в форме спектра. Для вариантов, содержащих Glu148, увеличение яркости флуоресцентного сигнала составило до 14.5 раз.

Таким образом, нам удалось добиться изменений флуоресцентного сигнала, рекордных как для кальциевых сенсоров, так и в целом для генетически кодируемых сенсоров на основе флуоресцентных белков. Тем не менее, полученные варианты были малопригодны для реальной работы с клетками млекопитающих, так как характеризовались низкой скоростью созревания хромофора при 37°С и недостаточной яркостью флуоресцентного сигнала. Для ускорения созревания, пермутированный флуоресцентный белок в составе сенсора Thr145/Glu148 оптимизировали с использованием метода случайного мутагенеза. Среди полученных мутантных вариантов сенсора был отобран наиболее яркий и быстро созревающий, получивший название Case12 (от Calcium sensor), характеризующийся in vitro 12-кратным возрастанием эмиссии флуоресценции в ответ на добавление 10-1000 мкМ ионов кальция (рис. 16b). С целью получения варианта, аналогичного исходному Ser145/Glu148, методом сайт-направленного мутагенеза в Case12 была внесена замена Thr145Ser. Результирующий мутантный вариант, названный Case16, характеризуется меньшей скоростью созревания хромофора и несколько меньшей яркостью, однако реагирует на добавление ионов кальция даже более выраженным, 16-кратным возрастанием яркости флуоресцентного сигнала.

Сенсоры Case12 и Case16 были затем более детально протестированы in vitro и в живых клетках. Изменения в спектрах поглощения Case12 и Case16 в ответ на добавление ионов кальция отражают перераспределение между нейтральной (протонированной) и заряженной (депротонированной) формами хромофора в пользу последней. Расчетная яркость флуоресценции Case12 и Case16 в присутствии ионов кальция составляет 0.35 и 0.28 от расчетной яркости белка EGFP, соответственно, что сопоставимо с расчетной яркостью сенсора GCaMP2, характеризующегося значительно менее выраженным флуоресцентным ответом. Сенсоры Case12 и Case16 реагируют выраженным возрастанием яркости флуоресцентного сигнала на добавление ионов кальция в диапазоне от нескольких сотен нМ до 10 мкМ. Таким образом, динамический диапазон измеряемых концентраций соответствует основному интересующему исследователей диапазону физиологических концентраций ионов кальция в цитозоле. Флуоресцентный ответ достигает половины своего максимального значения при концентрации ионов кальция около 1 мкМ (рис. 16с).

Общим недостатком, характерным для сенсоров на основе пермутированных флуоресцентных белков, является высокая зависимость флуоресцентного сигнала от изменения значения рН. Так, для кальциевых сенсоров ряда Pericams кажущееся значение рКа в кальций-связанной форме варьирует от 7.9 до 8.5. Соответственно, при физиологических значениях рН (7.4 - 7.5) эти сенсоры демонстрируют достаточно низкую яркость флуоресценции, и высокую зависимость от небольших колебаний значения рН.

Кажущееся значение рКа для сенсоров Case12 и Case16 в присутствии 200 мкМ кальция составляет 7.2 (рис. 16d). Таким образом, флуоресценция полученных нами сенсоров также в значительной степени зависит от изменения значения pH, однако отличается относительно более высокой устойчивостью по сравнению с аналогами.

Рисунок 16. Характеристика сенсора Case12 in vitro и в живых клетках. a. Принцип доменной организации кальциевого сенсора Case12 и близких сенсоров на основе пермутированного флуоресцентного белка. b. Максимальный флуоресцентный ответ Case12 in vitro. Показаны спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции в присутствии 0.5 мМ EGTA и 1 мМ Са2+, при рН 7.4. c.

Кривые титрования флуоресцентного ответа Case12 на Са2+ при рН 7.4. d. Зависимость флуоресценции Case12 от рН в присутствии 0.5 мМ EGTA и 0.2 мМ Са2+. e. Cпектры поглощения Case12 в присутствии 0.5 мМ EGTA (пунктирные линии) и 0.4 мМ Ca2+ (сплошные линии) при рН 7.4. f. Характерный флуоресцентный ответ сенсора Case12 в клетках HeLa при добавлении кальциевого ионофора А23187 в присутствии 2 мМ Са2+, с последующим хелатированием Ca2+. g.

Флуоресцентный ответ сенсора Case12 в клетках М21 (клеток меланомы человека) на добавление 100 М АТР.

При экспрессии сенсора Case12 в клетках HeLa, наблюдается зеленая флуоресценция низкой интенсивности. При добавлении в среду 20-30 мкМ ионофора А23187, позволяющего ионам кальция свободно проходить в цитозоль живых клеток (концентрация кальция в стандартной среде 2 мМ), наблюдается 5-кратное возрастание интенсивности флуоресценции. Последующее добавление 20 мМ EGTA, хелатирующего ионы кальция, вызывает 10-12 кратное падение яркости флуоресцентного сигнала (Рис. 16f). Сходные результаты были получены для сенсора Case16. Для сравнения, аналогичный сенсор GCaMP2 демонстрировал лишь 2-кратное возрастание яркости флуоресцентного сигнала при добавлении ионофора А23187, и 4-кратное падение сигнала при добавлении 20 мМ EGTA. Case12 позволяет отслеживать изменения в концентрации ионов кальция в живых клетках в ответ на различные стимулы. В частности, мы показали, что Case12 позволяет надежно визуализировать характерные осцилляции концентрации ионов кальция в цитозоле, индуцируемые добавлением 100 мкМ АТФ (Рис. 16g). При экспрессии в кортикальных нейронах (совместно с Лабораторией мембранологии НЦЗД РАМН), Caseпозволял отслеживать изменения в концентрации ионов кальция в ответ на стимуляцию глутаматом (100 мкМ), и последующее добавление протонофора FCCP (1 мкМ) наравне с широко используемым химическим сенсором Fura-2FF. Для слежения за локальными изменениями в концентрации ионов кальция в клетках, мы получили два варианта сенсора Case12: мембранно локализованный, содержащий на N-конце белка сигнал мембранной локализации нейромодулина, и вариант, таргетированный в матрикс митохондрий, содержащий на N-конце белка удвоенный сигнал митохондриальной локализации из VIII субъединицы предшественника цитохромоксидазы С. При экспрессии в клетках HeLa оба варианта сенсора избирательно локализовались в соответствующих компартментах – на внутренней стороне плазматической мембраны или матриксе митохондрий, соответственно, и сохраняли функциональность.

В совместной работе с лабораторией проф. С. Каспарова (Великобритания) сенсор Caseбыл использован для исследования действия фрагмента ангиотензина (Ang1-7, 200-10нМ) на ростральную часть продолговатого мозга крысы. С использованием технологии аденовирусной трансфекции и тканеспецифичной экспрессии было показано, что в ответ на Ang1-7 в астроцитах происходят колебания концентрации кальция различной амплитуды и продолжительности, в то время как активации нейрональных клеток не наблюдалось (рис.

17). Позднее проф. С. Каспарову удалось успешно применить эту технологию для слежения за pH-индуцируемыми всплесками кальция в астроцитах стволовой области мозга в модельных животных in vivo (Gourine et al., Science 2010).

ab c 2211Рисунок 17. Флуоресцентный ответ сенсора Case12 при специфической экспрессии в астроцитах крысы. Показан участок органотипического среза мозга. При добавлении 100 мМ ATФ Caseреагировал выраженным увеличением интенсивности флуоресцентного сигнала. a. Исходная флуоресценция. b. 3 мин. после добавления ATФ. с. Изменения флуоресцентного сигнала, прослеженные для отдельных астроцитов. Увеличение яркости флуоресценции Case12 для отдельных клеток превысило 300%.

Флуоресценция (отн. ед.) В совместном исследовании с др. M. Lorenz (Novartis), методом рентгеноструктурного анализа была впервые была решена структура GCaMP-подобного кальциевого сенсора (Case16) в присутствии низкой концентрации Ca2+, при которой два из четырех Ca2+связывающих участков кальмодулина заняты ионами кальция. В то время как C-концевая пара кальций-связывающих участков характеризуется высокой аффинностью к ионам кальция (заполнены при концентрациях ниже 500 нМ), N-концевая пара заполняется при более высоких концентрациях ионов кальция (выше 500 нМ). По всей вероятности, начальная фаза кальций-зависимого флуоресцентного ответа сенсоров на основе кальмодулина, в диапазоне 100-500 нМ, определяется именно конформационными изменениями, вызванными заполнением первых двух кальций-связывающих участков.

Полученные структурные данные показали, что в этой промежуточной конформации сенсор характеризуется лишь частичным взаимодействием кальмодулина с пептидом М13 (рис.

18a). Кроме того, существенно, что окружение хромофора в этой промежуточной форме сенсора значительно отличается от такового для гомологичного кальциевого сенсора GCaMP2 в Ca2+-насыщенной форме, структура которого была описана ранее. Эти данные вносят существенный вклад в понимание механизмов действия кальциевых сенсоров на основе пермутированных вариантов флуоресцентных белков и открывают новые возможности для получения улучшенных версий кальций-чувствительных индикаторов.

Также была решена трехмерная структура кальциевого сенсора Case12 при высокой концентрации ионов кальция, которая подтвердила данные предыдущей работы других авторов, согласно которым при высоких концентрациях сенсора формируются гомодимеры, в составе которых домен кальмодулина каждой молекулы сенсора симметрично взаимодействует с М13-пептидом другой молекулы (рис. 18b). Сопоставление данных о димеризации и флуоресцентном ответе кальциевых сенсоров данного типа in vitro показало, что при формировании гомодимеров флуоресцентный ответ на связывание ионов кальция отсутствует. Таким образом, формирование гомодимеров может быть причиной нарушения функциональности сенсоров при высоких локальных концентрациях.

Рисунок 18. Полученные структуры кальциевых сенсоров. a. Структура сенсора Case16, полученная при низкой концентрации ионов кальция. Пептид M13 показан синим, пермутированный флуоресцентный белок - зеленым, N- и C-концевые участки кальмодулина – красным, 2 иона Ca2+ - желтым цветом. В составе сенсора, только С-концевой Ca2+-связанный участок кальмодулина взаимодействует с пептидом M13. b. Структура сенсора Case12, полученная при высокой концентрации ионов кальция. Две молекулы сенсора (показаны синим и красным цветом) формируют межмолекулярный комплекс, в котором пептид M13 каждой цепи взаимодействует с кальмодулином второй цепи.

В этой работе мы также показали, что высокие концентрации свободного пептида M13, но не кальмодулина, эффективно блокируют флуоресцентный ответ сенсоров Case12 и Casein vitro. Мы предполагаем, что подобные межмолекулярные взаимодействия с эндогенными субстратами кальмодулина в живых клетках могут препятствовать функциональной работе сенсоров этого типа в определенных типах клеток, в частности, в нейрональных клетках.

4.2. Высококонтрастные сенсоры на основе FRET-пар флуоресцентных белков Генетически кодируемые сенсоры с использованием эффекта FRET между двумя спектральными вариантами флуоресцентных белков активно используются в различных исследованиях на живых клетках и in vivo. В большинстве случаев, регистрируемыми параметрами при работе с FRET-сенсорами являются интенсивности флуоресценции донорного и акцепторного флуоресцентных белков при возбуждении донора. В значительной степени, ограничения метода связаны с относительно небольшими и зачастую трудно регистрируемыми изменениями в соотношении яркости флуоресценции донора и акцептора при их сближении и удалении, а также с эффективным спектральным разделением спектров эмиссии донора и акцептора FRET. Следует отметить также, что существенное влияние на эффективность FRET оказывают возможные взаимодействия между донором и акцептором энергии в составе молекулы сенсора. Вследствие этого, выбор оптимальной FRET-пары флуоресцентных белков из множества существующих вариантов, наряду с собственно дизайном конструкции, имеет важнейшее значение для разработки эффективных генетически кодируемых сенсоров. Наша работа была направлена на разработку модельных «высококонтрастных» сенсоров, FRET-пары флуоресцентных белков которых могли бы впоследствии использоваться для получения эффективных сенсоров различной специфичности.

FRET-пара PS-CFP2/phiYFP. Описанный выше (раздел 3.1.) фотоактивируемый белок PSCFP2 требует для активации облучения фиолетовым светом высокой интенсивности, как правило - локального облучения в клетке лазером 405 нм. При умеренных интенсивностях возбуждающего света фотоактивации не происходит, и этот белок может быть использован в качестве стабильного цианового флуоресцентного маркера. Положение максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции (400 и 468 нм, соответственно) делает PS-CFPпредпочтительным донором энергии для желтых флуоресцентных белков, обеспечивая одновременно высокую эффективность FRET (за счет большой области перекрывания спектров эмиссии цианового и возбуждения желтого флуоресцентных белков) и надежное разделение возбуждения и эмиссии флуоресценции. Расчетное значение радиуса Фёрстера для пары PS-CFP2/phiYFP превышает 6 нм, что говорит о потенциально высокой эффективности переноса энергии. В качестве модельного сенсора на основе этой пары, нами был сконструирован сенсор протеолитической активности, в котором пара PS-CFP/phiYFP была разделена 16-а.о. линкером, содержащим сайт узнавания фактором свертывания крови Ха. При возбуждении на 400 нм неразрезанный конструкт PS-CFP-Ха-phiYFP характеризовался преимущественно желтой эмиссией флуоресценции, которая снижалась по мере разрезания линкерной последовательности фактором Ха in vitro. Полное разрезание конструкта PS-CFP-Xa-phiYFP приводило к выраженному (до 7.8 раза) падению интенсивности желтой флуоресценции, и лишь небольшому возрастанию яркости циановой флуоресценции (1.15 раза). Для практического применения важно, что выраженность спектральных изменений в диапазоне 525-550 нм позволяет проводить измерения для FRET-пары PS-CFP/phiYFP в одном канале эмиссии. В сотрудничестве с лабораторией Биокатализа ИБХ РАН, на основе FRET пары PS-CFP2/phiYFP был получен и успешно применен в работе сенсор протеазной активности летального фактора сибирской язвы.

FRET-пара TagGFP/TagRFP. Мы провели сравнительный теоретический и экспериментальный анализ ряда пар флуоресцентных белков из палитры Tag (раздел 1), на предмет выявления оптимальных FRET-пар, которые могли бы быть использованы для детекции белок-белковых взаимодействий и при разработке генетически кодируемых сенсоров. Наибольший потенциал показали белок TagRFP, как эффективный акцептор энергии в паре с зелеными флуоресцентными белками, такими как TagGFP, и белок mKate2, как эффективный акцептор энергии в паре с желтыми флуоресцентными белками, такими как TagYFP. Расчетный радиус Фёрстера для пары TagGFP/TagRFP составляет 5.нм, что говорит о потенциально высокой эффективности резонансного переноса энергии. В то же время, максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции двух этих белков дистанцированы на 73 и 79 нм, соответственно, что позволяет надежно разделять их сигналы при регистрации.

В качестве модельного FRET сенсора для исследуемых пар белков, в том числе для пары TagGFP/TagRFP, мы получили конструкты, в которых флуоресцентные белки соединены посредством 17 а.о. линкера, содержащего сайт DEVD, узнаваемый каспазой 3. Подобные сенсоры позволяют отслеживать активность каспазы 3 в живых клетках, возникающую при апоптозе. Сенсор на основе пары TagGFP/TagRFP получил название CaspeR3-GR (репортер активности каспазы 3). Соотношение яркости флуоресценции эмиссии донора и акцептора (при возбуждении на 490 нм) после специфичного протеолиза CaspeR3-GR каспазой-3 in vitro изменяется в 4.9 раза. Достаточно выраженный (до 3.8 раз) ответ CaspeR3-GR демонстрирует и в живых клетках, при индукции апоптоза стауроспорином неселективным ингибитором внутриклеточных протеинкиназ. Позднее на основе этой FRET пары мы также получили специфичные высококонтрастные сенсоры протеазной активности гранзима B.

Сенсор мембранного потенциала на основе FRET-пары mCitrine/mKate2. Генетически кодируемые сенсоры мембранного потенциала представляют собой перспективный инструмент для мониторинга электрической активности клеток, в том числе специфичных популяций нейронов в тканях мозга. Последние из опубликованных ранее вариантов VSFPs были разработаны на основе потенциал-зависимой фосфатазы Ciona intestinalis (Ci-VSD), cоединенной с цианово-желтой донорно-акцепторной парой Cerulean/Citrine (сенсор VSFP2.3) или зелено-оранжевой донорно-акцепторной парой флуоресцентных белков mUKG/mKO (сенсор Mermaid). Совместно с лабораторией проф. Т Кнопфеля (Япония) мы разработали улучшенный вариант генетически кодируемого сенсора мембранного потенциала, названный VSFP2.4, на основе FRET-пары желтого флуоресцентного белка mCitrine и дальнекрасного белка mKate2. Для изучения потенциал-зависимого ответа VSFP2.4 был экспрессирован в клетках линии РС12, морфологическая гомогенность которых облегчает количественную флуориметрию при локальной фиксации потенциала (patch-clamp). Потенциал-зависимый ответ VSFP2.4 сравнивали с ответами сенсоров VSFP2.3 и Mermaid. Показано, что динамический диапазон VSFP2.4 сопоставим с таковым для VSFP2.3 и Mermaid (12.4, 13.3 и 12.9%, соответственно). По сравнению с VSFP2.3, VSFP2.4 является более надежным сенсором мембранного потенциала экспериментах in vivo, поскольку измерение флуоресценции акцептора (mKate2) в дальнекрасном канале позволяет элиминировать зеленую автофлуоресценцию, поглощение света гемоглобином и, следовательно, повысить уровень сигнал/шум. Спектральные свойства VSFP2.4 позволяют визуализировать его флуоресценцию в толще тканей с использованием двухфотонной микроскопии. Благодаря более быстрому ответу VSFP2.4 предпочтительнее использовать в экспериментах с быстрой кинетикой при детекции изменений флуоресценции в одном канале, поскольку изменение интенсивности флуоресценции донора энергии составляет для VSFP2.4 9.4%, что является максимальным значением для сенсоров мембранного потенциала.

В Таблице 4 приведены основные характеристики FRET пар флуоресцентных белков, использованных для создания высококонтрастных сенсоров.

Таблица 4. Избранные FRET пары флуоресцентных белков. Показаны пары, отобранные в настоящей работе (выделены жирным шрифтом), и лучшие аналоги.

Макс. возб. Макс. эм.

Макс возб. Макс эм. EC радиус флуор. флуор. QY FRET пара флуор. флуор. акцептора, Фёрстера акцептора, акцептора, донора донора, нм донора, нм M-1 cm-1 (Ro), нм нм нм EBFP2-mEGFP 383 448 489 509 0.56 57 500 4.TagBFP-TagGFP 402 457 483 506 0.63 56 500 5.ECFP-EYFP 434 477 515 527 0.40 83 400 4.PS-CFP2-phiYFP 400 468 525 537 0.20 130 000 6.EGFP-mCherry 489 509 587 610 0.60 72 000 5.TagGFP-TagRFP 482 505 555 584 0.59 100 000 5.Venus-mCherry 515 528 587 610 0.57 72 000 5.mCitrine-mKate2 516 529 588 633 0.57 62 500 5. QY – квантовый выход флуоресценции; EC - коэффициент молярной экстинкции при максимуме возбуждения.

Выводы 1. Получена палитра из 8 ярких мономерных флуоресцентных белков для мечения целевых белков, с максимумами эмиссии от 457 до 635 нм. Белки TagBFP, TagCFP, TagRFP и mKate2, максимумы эмиссии флуоресценции которых приходятся на 457, 480, 584 и 633 нм, соответственно, характеризуются самой высокой расчетной яркостью среди мономерных флуоресцентных белков своих цветовых классов. Белок FusionRed превосходит все прочие красные флуоресцентные белки по качеству работы в составе белков слияния.

2. Получена палитра из 7 димерных флуоресцентных белков с максимумами эмиссии от 502 до 670 нм, характеризующихся высокой скоростью созревания хромофора. Показано, что высокая скорость созревания белка TurboGFP обусловлена наличием специфичного канала в структуре белка, ведущего к фенольному кольцу хромофора. Показано, что белки Katushka и eqFP650, благодаря сочетанию высокой расчетной яркости и дальнекрасной флуоресценции, являются лучшими маркерами для визуализации в толще тканей в живых модельных животных. Полученный белок eqFP670 характеризуется самой длинноволновой эмиссией флуоресценции среди когда-либо разработанных флуоресцентных белков.

3. Получен ряд мономерных фотоактивируемых флуоресцентных белков, характеризуемых высокой расчетной яркостью и фотостабильностью активируемого флуоресцентного сигнала, применимых для технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Предложена технология «белковых речек», позволяющая повысить разрешение изображения при отслеживании быстрой диффузии белков в живых клетках с использованием повторных циклов обратимой фотоактивации.

4. Открыта способность зеленых флуоресцентных белков к необратимой фотоконверсии в красную форму в присутствии акцепторов электронов, в качестве которых могут выступать как неорганические, так и органические окислители. Показано, что в этой реакции зеленый флуоресцентный белок выступает в качестве эффективного свето-индуцируемого донора электронов. Показано, что окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков может быть индуцирована в живых эукариотических клетках и трансгенных животных за счет внутриклеточных акцепторов электронов.

5. Показано, что фотостабильность зеленых флуоресцентных белков в живых клетках может быть значительно (до 10 раз) повышена за счет снижения эффективности окислительной фотоконверсии, путем удаления из среды рибофлавина и некоторых других витаминов, способных выступать в качестве электрон-акцепторов.

6. Получены генетически кодируемые сенсоры ионов кальция на основе пермутированного флуоресцентного белка, характеризуемые более чем 10-кратным возрастанием яркости флуоресценции в субмикромолярном диапазоне измеряемых концентраций.

Оптимизированные варианты сенсоров, Case12 и Case16, характеризуются быстрым созреванием хромофора при 37°С и высокой расчетной яркостью флуоресценции.

Продемонстрирована высокая эффективность полученных сенсоров в живых клетках и тканях, в том числе в органотипических срезах мозга.

7. Получены данные о структурно-функциональной организации кальциевых сенсоров на основе пермутированных флуоресцентных белков. Показано, что в промежуточной конформации, в которой только два из четырех кальций-связывающих участков кальмодулина заняты ионами кальция, сенсоры характеризуются лишь частичным взаимодействием кальмодулина с пептидом М13. Показано, что при высоких концентрациях сенсора в присутствии ионов кальция формируются нефункциональные гомодимеры.

8. Получен ряд генетически кодируемых сенсоров на основе эффекта FRET между двумя флуоресцентными белками, в том числе сенсоры специфичных протеазных активностей:

фактора Xа, каспазы-3, гранзима B, а также сенсор мембранного потенциала. Показано, что полученные сенсоры характеризуются высоким изменением соотношения пиков эмиссии в ответ на детектируемые процессы. Высокая яркость флуоресценции, низкая pH-зависимость флуоресцентного сигнала, высокая фотостабильность и выраженный флуоресцентный ответ позволяют применять эти сенсоры в качестве надежных репортеров в фундаментальных и прикладных исследованиях.

Список публикаций по теме диссертации Обзоры:

1. Chudakov D.M., Matz, M.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fluorescent Proteins and their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews, 2010 Jul;90(3):1103-63.

2. Fluorescent proteins as light-inducible photochemical partners. Lukyanov KA, Serebrovskaya EO, Lukyanov S, Chudakov DM. Photochem Photobiol Sci. 2010 Oct 28;9(10):1301-6.

3. Шкроб М.А., Мишин А.С., Чудаков Д.М., Лабас Ю.А., Лукьянов К.А. Хромобелки семейства зеленого флуоресцентного белка: свойства и применение. Биоорган. химия, 2008;34(5):581–590.

4. Суcлова Е.А., Чудаков Д.М. Генетически кодируемые внутриклеточные сенсоры на основе флуоресцентных белков. Биохимия, 2007;72(7):683-97.

5. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.

Trends Biotechnol. 2005, 23, 605-613.

6. Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Lukyanov S., Verkhusha V.V. Photoactivatable fluorescent proteins.

Nature Review Mol. Cell Biol. 2005, 6, 885-891.

7. Чудаков Д.М., Лукьянов К.А. Использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его гомологов для изучения подвижности белков in vivo. Биохимия, 2003, 68, 1166-1172.

Статьи:

8. Verkhusha VV, Chudakov DM, Gurskaya NG, Lukyanov S, Lukyanov KA. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. Chem Biol. 2004, 11:845-54.

9. Bulina ME, Lukyanov KA, Yampolsky IV, Chudakov DM, Staroverov DB, Shcheglov AS, Gurskaya NG, Lukyanov S. New class of blue animal pigments based on frizzled and kringle protein domains. J Biol Chem. 2004, 279:43367-70.

10. Chudakov DM, Verkhusha VV, Staroverov DB, Souslova EA, Lukyanov S, Lukyanov KA.

Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nature Biotech. 2004, 22, 1435-1439.

11. Quillin ML, Anstrom DM, Shu X, O'leary S, Kallio K, Chudakov DM, Remington SJ. Kindling Fluorescent Protein from Anemonia sulcata: Dark-State Structure at 1.38 A Resolution. Biochemistry.

2005, 44:5774-5787.

12. Shkrob MA, Yanushevich YG, Chudakov DM, Gurskaya NG, Labas YA, Poponov SY, Mudrik NN, Lukyanov S, Lukyanov KA. Far-red fluorescent proteins evolved from a blue chromoprotein from Actinia equina. Biochem J. 2005, 392: 649-654.

13. Souslova EA, Chudakov DM. Photoswitchable cyan fluorescent protein as a FRET donor. Microsc Res Tech. 2006, 69, 207-209.

14. Bulina ME*, Chudakov DM*, Britanova OV, Yanushevich YG, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Merzlyak EM, Shkrob MA, Lukyanov S, Lukyanov KA. A genetically encoded photosensitizer. Nature Biotech. 2006, 24, 95-99. *Contributed equally.

15. Bulina ME, Lukyanov KA, Britanova OV, Onichtchouk D, Lukyanov S, Chudakov DM.

Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed.

Nature Protocols 2006, 1, 947-953.

16. Chudakov DM, Chepurnykh TV, Belousov VV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fast and precise protein tracking using repeated reversible photoactivation. Traffic 2006, 7, 1304-1310.

17. Evdokimov AG, Pokross ME, Egorov NS, Zaraisky AG, Yampolsky IV, Merzlyak EM, Shkoporov AN, Sander I, Lukyanov KA, Chudakov DM. Structural basis for the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein. EMBO Rep. 2006, 7, 1006-1012.

18. Shcherbo D, Merzlyak EM, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Ermakova GV, Solovieva EA, Lukyanov KA, Bogdanova EA, Zaraisky AG, Lukyanov S, Chudakov DM. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 2007, 4, 741-746.

19. Merzlyak EM, Goedhart J, Shcherbo D, Bulina ME, Shcheglov AS, Fradkov AF, Gaintzeva A, Lukyanov KA, Lukyanov S, Gadella TW, Chudakov DM. Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nature Methods. 2007, 4, 555-557.

20. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 2007, 42:553, 555, 557.

21. Souslova EA, Belousov VV, Lock J, Stromblad S, Kasparov S, Bolshakov AP, Pinelis VG, Labas YA, Lukyanov S, Mayr LM, Chudakov DM. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC Biotechnol. 2007, 7:37.

22. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protoc. 2007, 2, 2024-2032.

23. Плетнева Н.В., Плетнев С.В., Чудаков Д.М., Тихонова Т.В., Попов В.О., Мартынов В.И., Влодавер А.., Даутер З., Плетнев В.З. Пространственная структура желтого флуоресцентного белка zYFP538 (Zoanthus sp.) при разрешении 1.8 A Биоорган. химия. 2007, 33; 421–430.

24. Subach OM, Gundorov IS, Yoshimura M, Subach FV, Zhang J, Grenwald D, Souslova EA, Chudakov DM, Verkhusha VV. Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. Chem Biol. 2008 Oct 20;15(10).

25. Pletnev S, Shcherbo D, Chudakov DM, Pletneva N, Merzlyak EM, Wlodawer A, Dauter Z, Pletnev V.A Crystallographic Study of Bright Far-Red Fluorescent Protein mKate Reveals pH-induced cis-trans Isomerization of the Chromophore. J Biol Chem. 2008 Oct 24;283(43):28980-7.

26. М.Ю. Захарова, С.А. Дубилей, Д.М. Чудаков, А.Г. Габибов, И.Г. Шемякин, А.В. Колесников.

Субстратная специфичность летального фактора сибирской язвы. Докл. Академии Наук.

2008;418:14-7. (получен и использован сенсор на основе FRET-пары флуоресцентных белков).

27. Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, Solovieva EA, Chepurnykh TV, Shcheglov AS, Verkhusha VV, Pletnev VZ, Hazelwood KL, Roche PM, Lukyanov S, Zaraisky AG, Davidson MW, Chudakov DM. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 2009 Mar 15;418(3):567-74.

28. Mutoh H, Perron A, Dimitrov D, Iwamoto Y, Akemann W, Chudakov DM, Knpfel T. Spectrallyresolved response properties of the three most advanced FRET based fluorescent protein voltage probes. PLoS ONE. 2009;4(2):e4555.

29. Shcherbo D, Souslova EA, Goedhart J, Chepurnykh TV, Gaintzeva A, Shemiakina II, Gadella TW, Lukyanov S, Chudakov DM. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol. 2009 Mar 25;9:24.

30. Zakharova MY, Kuznetcov NA, Dubiley SA, Kozyr AV, Fedorova OS, Chudakov DM, Knorre DG, Shemyakin IG, Gabibov AG, Kolesnikov AV. Substrate recognition of anthrax lethal factor examined by combinatorial and pre-steady-state kinetic approaches. J Biol Chem. 2009 Jul 3;284(27):17902-13.

(получен и использован сенсор на основе FRET-пары флуоресцентных белков).

31. Bogdanov AM, Mishin AS, Yampolsky IV, Belousov VV, Chudakov DM, Subach FV, Verkhusha VV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nature Chem Biol. 2009 Jul;5(7):459-61.

32. Pletnev S, Gurskaya NG, Pletneva NV, Lukyanov KA, Chudakov DM, Martynov VI, Popov VO, Kovalchuk MV, Wlodawer A, Dauter Z, Pletnev V. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. J Biol Chem. 2009 Nov 13;284(46):32028-39.

33. Bogdanov AM, Bogdanova EA, Chudakov DM, Gorodnicheva TV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Cell culture medium affects GFP photostability: a solution. Nature Methods. 2009 Dec;6(12):859-60.

34. Guo F, Liu B, Tang F, Lane S, Souslova EA, Chudakov DM, Paton JF, Kasparov S. Astroglia are a possible cellular substrate of angiotensin(1-7) effects in the rostral ventro-lateral medulla. Cardiovasc Res. 2010 Aug 1;87(3):578-84. (тестирование и применение генетически кодируемого кальциевого сенсора Case12).

35. Koutsopolous OS, Laine D., Osellame LD, Chudakov DM, Parton RG, Frazier AE, Ryan MT. Human Miltons associate with mitochondria and induce microtubule-dependent remodeling of mitochondrial networks. BBA - Molecular Cell Research, 2010 May;1803(5):564-74. (тестирование и применение флуоресцентных и фотоактивируемых флуоресцентных белков).

36. Л. Чжан, Н. Г. Гурская, Е. Е. Копанцева, Н. Н. Мудрик, Л. Л. Вагнер, К. А. Лукьянов, Д. М.

Чудаков. Выявление аминокислотных остатков, ответственных за способность к обратимой фотоконверсии мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP. Биоорган. химия, 2010, 36(2); 187–192.

37. Zhdanov AV, Ward MW, Taylor CT, Souslova EA, Chudakov DM, Prehn JH, Papkovsky DB.

Extracellular calcium depletion transiently elevates oxygen consumption in neurosecretory PC12 cells through activation of mitochondrial Na(+)/Ca(2+) exchange. Biochim Biophys Acta. 20Sep;1797(9):1627-1637. (тестирование и применение генетически кодируемого кальциевого сенсора Case12).

38. Leder L, Stark W, Freuler F, Marsh M, Meyerhofer M, Stettler T, Mayr LM, Britanova OV, Strukova LA, Chudakov DM, Souslova EA. The Structure of Ca2+ Sensor Case16 Reveals the Mechanism of Reaction to Low Ca2+ Concentrations. Sensors. 2010, 10(9), 8143-8160; doi:10.3390/s100908143.

39. Shcherbo D, Shemiakina II, Ryabova AV, Luker KE, Schmidt BT, Souslova EA, Gorodnicheva TV, Strukova L, Shidlovskiy KM, Britanova OV, Zaraisky AG, Lukyanov KA, Loschenov VB, Luker GD, Chudakov DM. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 2010 Oct;7(10):827-9.

40. Teh C, Chudakov DM, Poon K, Mamedov IZ, Sek J, Shidlovsky K, Lukyanov S, and Korzh V.

Optogenetic in vivo cell manipulation in KillerRed-expressing zebrafish transgenics. BMC Developmental Biology. 2010 Nov 2;10:110.

41. M. Figueiredo, S. Lane, F. Tang, B-H. Liu, N. Marina, V. Kasymov, E. A. Souslova, D.M. Chudakov, A. Gourine, A.G. Teschemacher, S. Kasparov. Optogenetic experimentation on astrocytes.

Experimental Physiology. 2011 Jan;96(1):40-50.

42. Light-induced blockage of cell division with a chromatin-targeted phototoxic fluorescent protein.

Serebrovskaya EO, Gorodnicheva TV, Ermakova GV, Solovieva EA, Sharonov GV, Zagaynova EV, Chudakov DM, Lukyanov S, Zaraisky AG, Lukyanov KA. Biochem J. 2011 doi:10.1042/BJ20101217.

Главы в книгах:

1. Chudakov D.M., and Lukyanov K.A. (2005) Using photoactivatable GFPs to study protein dynamics and function. In Jorde, L.B., Little, P.F.R., Dunn, M.J. and Subramaniam, S. (Eds), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Bioinformatics. John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2129-2137.

2. Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Fradkov A.F., Labas Y.A., Matz M.V. and Lukyanov S.A. (2005) Discovery and properties of GFP-like proteins from non-bioluminescent Anthozoa In: Green fluorescent protein: properties, applications and protocols. 2nd edition, Chalfie, M., Kain, S., Eds., John Wiley & Sons Ltd, New Jersey, 121-138.

Патенты:

1. United States Patent 7,638,615. Fluorescent proteins and methods for using same. Issued December 29, 2009, Inventors: Lukyanov; Sergey A. (Moscow, RU), Chudakov; Dmitry M. (Moscow, RU).

2. Европейский патент EP1994149 - Novel fluorescent proteins and methods for using same. Inventors:

Lukyanov; Sergey A. (Moscow, RU), Chudakov; Dmitry M. (Moscow, RU).

3. Патент РФ № 2395581. Новые флуоресцентные белки из Entacmaea quadricolor и способ их получения. Авторы: Лукьянов Сергей Анатольевич (RU), Чудаков Дмитрий Михайлович (RU).







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.